JP2005521055A - 胃炎のスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

本発明は、血液サンプルを測定することによって人体における胃炎の有無を診断するための方法に関し、上記測定はＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに特異性のある抗体、ヘリコバクターピロリに特異性のある抗体の有無、そしてペプシノゲン１濃度を測定するための血液サンプルの検査から構成され、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体の有無、及びペプシノゲン１濃度はソフトウェア関連システムを用いて、相互に比較が行われ、またＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクター抗体及びペプシノゲン１濃度は、正規母集団における各数値レベルと比較され、サンプルにおける数値レベルの変化は胃炎の指標となり、これによって数値レベルの変動を検出することは、好適には胃炎に関連したさらなる究明のための介助につながる。

Description

消化不良は初期健康管理において一般的な診断であるが、その管理法は明確に定義されていない。イギリスにおける消化不良の年間有病率は約２５％であり、これは初期健康管理における診察の３〜４％を占める（Harris, A., Eur J Gastroenterol Hepat 1999; 11 (Suppl 1) : S31-5)。上部胃腸管における慢性疾患の中には、一般的に胃炎に分類されるような疾患が属する。胃炎とは胃が粘膜の炎症を起こすことで、消化不良、胸焼けや過剰なおくびなどを含む広範囲の不明瞭な症状を呈する。症状の性質及び重度、個人の総体的な健康状態、患者の病歴、それ相当の成功する可能性のある治療を施すための特定の診断の必要性、そして診断装置の利用の可能性などによって胃腸の疾患を診断するために用いられる一般的な方法は異なる。

生体の組織病理学検査を伴う上部消化管検査（ＥＧＤ）は、胃及び十二指腸の粘膜の状態を特定する上で最も基準となる検査である。この検査は安全で正確であり、また、例えば高齢層の患者や特に体重の減少、拒食症、嚥下障害または胃腸失血などの危険な症状が見られる患者の場合に時として不可欠となる。上部内視鏡検査の要求は高まっており、イギリスにおいては毎年人口の約０．５％はこの検査を受診している（Working Party of the Clinical Services Committee of the British Society of Gastroenterology, Provision of gastrointestinal endoscopy and related services for a district general hospital. Gut 1991; 32: 95-105; Gear, M.W.L., and Wilkinson, S.P., Br J Hosp. Med 1989; 41: 438-44)。

上部消化管検査や粘膜の目視検査を行わずに胃炎を診断するのは困難である。しかしながら、上部消化管検査に要する費用は高額で、また患者にとって不都合であり、通常では子供や重度の心肺疾患を持つ患者には推奨できない。よって重度の症状のない患者には、胃腸疾患の精密な診断は行われない場合もある。このような患者には、例えば制酸剤や胃酸の分泌を抑える薬物などによる通常の治療が施される。このような治療によって、症状は一時的に緩和されるかもしれないが、多くの場合完治には至らない。より効果的な治療は、主に胃腸疾患の実際の基礎症状のより正確な診断によるものである。例えば、多くの胃腸疾患は粘膜の細菌感染によって引き起こされ、このような場合、発症した胃腸疾患を効果的に治療するために最も必要とされるのは、細菌感染を治療することである。

内視鏡検査の作業負荷を軽減するために、胃鏡検査の事前に容易に行うことのできる方法が求められており、この方面で幾つかの試行が行われ、重度ではない単純な消化不良を患う患者においてある程度の成功を示した(Bodger, K., et al., Scand J Gastroenterol 1999; 34: 856-63; and Moayyedi, R, et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999; 11: 1245-50)。４０歳以下の若年齢の消化不良の患者において、ヘリコバクターピロリ（Ｈ．ピロリ）感染の検査や感染の有無に基づいた治療法を用いることで、内視鏡検査の作業負荷が軽減する。この治療法は消化不良症状、消化不良診察率及び分泌抑制薬剤の処方を減少するうえで、内視鏡による方法と同等の効果が見られた(Moayyedi, P., et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999; 11: 1245-50)。しかし、消化不良を患う高齢者には、胃炎とその結果となる病理の患者数は比較的多く、第１診断工程としてＥＧＩＤが挙げられる。

炎症を起こした胃粘膜は、血清学分析による胃炎の診断が可能となるある特定の情報を血流に伝達する。粘膜の形態的、細胞的構成は酸分泌スコア及び前庭部によって異なる。これは、スコアや胃体部胃炎（pangastritis）を前庭部胃炎から見分ける介助となる。多数の血清標識（マーカー）の説明がされてきた。Ｈ．ピロリによる感染は、慢性胃炎、粘膜関連のリンパ系組織（ＭＡＬＴ）のリンパ腫及び胃がんの主要な原因となり（Chiba, N., et al., Can Fam Physician 1998.; 44: 1481-8; Genta, R.M., Gut 1998; 43: 35-8; Coyle, W.J., et al., Gastrointest Endosc 1998; 48: 327-8; Lee, B.M., et al., Jpn J Cancer Res 1998; 89: 597-603）、様々なＨ．ピロリ抗原に対する抗体は血液中で簡単に検出することができる（Bodger, K., et al., Scand J Gastroenterol 1999; 34: 856-63; and Moayyedi, R, et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999; 11: 1245-50）。このような感染は、時として粘膜スコアの萎縮につながる自己免疫反応に関係する（Ozasa, K, et al., DIg Dis Sci 1999; 44: 253-6)。胃の自己免疫性及び、例えば甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病や時に関節リューマチなどのしばしば他の自己免疫疾患の一般的な特徴は、壁細胞抗体の発生によるものであることだ（Bech, k, et al., Acta Endocrinol. 1991, 124: 534-9; Barrio, R., et al., Pediatr Endocrinol Metab 1997, 10: 511-6; Datta, A., at el., Indian J Med Res 1990, 92: 228-32; Mardh, S., et al., Scand J Gastroenterol 1991, 26: 1089-96）。壁細胞Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼａ−及びＲサブユニットが、自己免疫の萎縮性胃炎における主要な自己抗原であることが判明した(Karlsson, A., et al., J Clin Invest 1988, 81A75-9; Song, Y.H., et al., Scand J Gastroenterol 1991, 29: 122-7; Ma, J.Y., et al., Scand J Gastroenterol 1994, 20: 790-4)。壁細胞の通常のターンオーバーにより、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼの抗体は健康な人間において通常低い力価で存在する。粘膜スコアに炎症を起こした患者においては、力価はそれより増加することがある。

ペプシノゲン１（ＰＧ１）は、粘膜スコアの主細胞及び胃腺頚部粘液細胞によって胃の内腔に分泌されるが、そのうち約１％の僅かな量が血流の中に流出する（Baron, JR, Clinical tests of Gastric secretion: History, Methodology and Interpretation, (1978) London: Macmillan）。十二指腸潰瘍を発症した患者は、多くの場合ＰＧ１の血清濃度が高い数値レベルで観測される（Samloff, I.M., et al., Gastroenterol 1975 Jul, 69(1). 83-90）。粘膜スコアの激しい萎縮による悪性貧血を患う患者においては、ＰＧ１の血清濃度は著しく低下する（Salmoff, I.M., et al., Gastroenterol 1982 Jul, 83(1 Pt 2): 204-9)。

胃腸疾患を検出するための存在する非侵襲的方法には、炎症を検出するために影響された区域までの血流を観測する方法が含まれる（ＵＳ5;524,622）。この方法の非常に不利な点は、ガンマ線カメラによって検出した後に、複数の物質を患者に注射する必要があることだ。それに加えて、この方法で検出できるのは炎症のみであり、炎症を引き起こしている原因の検出には対応しない。胃腸疾患を検出するその他の方法には、ペプシノゲン（ＵＳ5,879,897）やヘリコバクターピロリ（ＵＳ5,814,455; 6,067,989; 6,068,985; 6,090,611）などの個々の検体を測定する方法がある。その他の血清標識としては、ガストリン(Borch, K, et al., Scand J Gastroenterol 1997, 32: 198-202)、ペプシノゲン１１(Carmel, R., Am J Pathol 1998, 90: 442-5)、坑内因子抗体(Waters, H.M., et al., J Clin Pathol 1989, 42: 307-12)、そしてペプシノゲン抗体(Mardh, S., et al., Acta Physiol Scand 1989, 136: 581-7)がある。これらの標識を、胃の粘膜における変化を診断するのにそれぞれ用いることも可能だが、健常者と患者との間で一致する部分が多く、患者の様々なサブグループにおける一致はさらに多くなる。このため、これらの全ての標識は、それだけでは信頼のおける診断のためには十分とはならない。

本発明は、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、Ｈ．ピロリ抗体、そして血清ペプシノゲン１濃度の測定結果の鑑定を含む、胃炎をその様々な形態において検査する方法を提供する。胃炎に関連する複数の検体を分析することで、胃炎の様々なサブグループの信頼のおける指標となる。

ある具体案においては、本発明は血液サンプルを測定することによって人間の体内における胃炎の有無を診断するための方法を包含し、その方法はＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに特異的な抗体とヘリコバクターピロリに特異的な抗体の有無、及びペプシノゲンＩ濃度を調べる工程から構成され、そのそれぞれは、ソフトウェア関連のシステムを用いて正規母集団におけるＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲンＩ濃度のそれぞれの数値レベルと比較され、サンプルにおいて変化が検出されると胃炎の指示となり、好ましくはこれによって変化レベルの検出は、ひいては胃炎に関するさらなる調査のための介助となる。

好適な具体案は、上記指標の数値レベルを測定するための工程には指標を検出する免疫検査が含まれることを特徴とする方法に関する。

また別の好適な具体案は、指示のグループの中にヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルを乗じたペプシノゲンＩの数値レベルから構成される付加的な指標を含み、この付加的な指標の数値レベルが標準と比較されることを特徴とする方法に関する。

さらなる別の好適な具体案は、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体とヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルが正規母集団における数値レベルよりも著しく高ければ胃炎の指標となることを特徴とする方法に関する。

さらなる別の好適な具体案は、ペプシノゲンＩ濃度の数値レベルが低ければ萎縮スコアの指標となることを特徴とする方法に関する。

さらに好適な具体案は、ペプシノゲンＩ濃度の上昇した数値レベルは胃炎スコア、随意的には自己免疫性に関連しない胃炎スコアの指標となることを特徴とする方法に関する。

さらなる好適な具体案は、Ｈ、Ｋ―ＡＴＰアーゼ抗体の数値レベルがその正規母集団の数値レベルと異なれば自己免疫萎縮スコアの指標となることを特徴とする方法に関する。

さらなる好適な具体案は、ヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルがその正規母集団の数値レベルと異なれば前庭部胃炎または胃体部胃炎（pangastritis)の指標となることを特徴とする方法に関する。

さらなる好適な具体案は、ヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルが高く、ペプシノゲンＩ濃度が通常よりも低い場合、萎縮の指標となることを特徴とする方法に関する。

さらに別の好適な具体案は、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体の高い数値レベルを伴った非常に低い数値レベルレベルのペプシノゲンＩ濃度は萎縮スコアの指標となることを特徴とする方法に関する。

本発明のさらなる態様は、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲンＩ濃度を検出するのに適した試薬を含む、胃炎を選別するためのキットに関する。

上記の態様の好適な具体案は、上記試薬にはペプシノゲンＩ抗体、Ｈ、Ｋ―ＡＴＰアーゼ及びヘリコバクターピロリの蛋白質またはそれらのペプチドが含まれることを特徴とするキットに関する。

上記の態様のまた別の好適な具体案は、上記試薬には固定支持の上に固定化されたペプシノゲンＩ、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ及びヘリコバクターピロリの抗原が含まれることを特徴とするキットに関する。

上記態様のさらに別の好適な具体案は、さらに標識抗ヒト抗体を含むことを特徴とするキットに関する。

上記態様のさらに別の好適な具体案は、上記試薬がＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲンＩ濃度を検出するのための検査と概ね同数の検査を行うのに十分な量で含まれることを特徴とするキットに関する。

胃炎及び消化不良は、初期健康管理においてよく見られる要素ではあるが、その管理法はきちんと定義されていない。本発明の目的は、胃炎の血清学的な選別法を提供することである。生体及び組織学検査を伴う上部消化管検査（ＥＧＤ）は、高度で熟練したスタッフを必要とし、現在において胃炎、良性潰瘍及び新生組織形成を診断する唯一の信頼できる技術である。後記した２つの分類は、大体において慢性胃炎と密接に関連している。従来の調査においては、血清学は診断価値が制限されるとしばしば結論付けられていた。しかしながら、血清学上のデータを分析するための本発明による評価理論は、患者の年齢に関係なく胃鏡検査の事前に行う消化不良の診断として有益であり、これは従来の調査報告と比べて目を見張る進歩である(Bodger, K, et al., Scand J Gastroenterol 1999, 34: 856-63; Moayyedi, R, et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999, 11: 1245-50)。免疫システム及び炎症を起こした胃粘膜から送られる化学信号は、血清検体及び胃炎を検出する診断可能性を提供する。

Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲン１濃度の数値レベルを測定するための検査法は周知である。本発明の好適な具体案において、生検の数値レベルを測定する方法は免疫学的検査によるものである。この免疫学的検査とは、酵素免疫測定吸着検査（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、放射線免疫測定（ＲＩＡ）、免疫沈降（ＩＰ）そして光学または電気化学的方法による免疫配位子の相互反応の検出などを含むが、これらに制限するものではない。好適な具体案において、免疫学的検査とは抗原が固定支持上で固定され、サンプルが加えられると、それに次いで標識抗体が加えられるという方法である。

本発明の具体案の１つは、胃炎をスクリーニングするためのキットである。このキットは、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体と、ヘリコバクターピロリ抗体と、ペプシノゲン１の数値レベルとから構成されるグループから選ばれた、少なくとも２種類の指示物質に検査を行うために必要な試薬からなる。好適な具体案において、測定は免疫学的検査で行われ、これに用いるキットは例えばマイクロタイタープレート、一切れの紙、ニトロセルロースまたはその他の適した素材などの１つまたは複数の固定支持上に固定された生検からなる。検出を行うために、標識抗体を含む。上記キットには、好適には異なる測定を同じ回数で検査を行うのに十分な量の試薬が含まれることとする。例を挙げると、キットにはＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼの測定を１０回、ヘリコバクターピロリの測定を１０回、そしてペプシノゲンの測定を１０回行うのに十分な試薬を含まれる。さらに、キットには生検に特異的な抗体、標識試薬、正負の対照、そして洗浄液が含まれてもよい。

免疫学的検査方法は、患者から採取した血液サンプル（または血漿あるいは血清）の分析に基づいており、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに対する自己抗体、ヘリコバクターピロリに対する抗体及びペプシノゲン濃度が測定される。これらの全ての検体は、胃の粘膜における炎症状態の指標となる。免疫学的測定などの生検を検出するための方法は、当技術分野において周知である。

この測定結果は、正規母集団における健常な個人から得られた参考数値レベルと比較するという新しい分類分け法によって分析される。数式（ヘリコバクターピロリ抗体の力価を乗じたペプシノゲン濃度の生成物）は、ある特定の患者のグループを特定するためには不可欠である。胃炎の患者の有益な分類を特定することが可能であれば、その他の数学的方法も用いることができる。この方法において、従来では高額で複雑な胃鏡検査や粘膜から採取した生体の組織病理学検査が必要とされていた胃の粘膜の炎症状態を診断することが可能となる。

正規母集団における健常な個人から得られた参考数値レベルは、めいめいの検査において標準化されてもよい。この具体案においては、患者が胃炎を発症している可能性を特定するために、検査結果は標準化された参考数値レベルと比較される。キットには、それぞれの検査のための標準化された参考数値レベルのリストも含む。また別の具体案においては、参考数値レベルは患者のサンプルと共に通常の対照を検査することによって得ることができる。この具体案において、キットは正常な対照と標準を有する。検査を行う際、患者のサンプルが測定されるのと同時に対照及び標準の測定を行う。そして対照及び標準の検査結果は、患者のサンプルから得られた結果と比較された。

胃鏡検査によって調べられた対象からの血清及び生体は、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲン1の分析が行われた。その診断は、正常な位粘膜（ｎ＝５０）、十二指腸潰瘍（ｎ＝５３）及び悪性貧血を伴う（ｎ＝５０）または伴わない（ｎ＝４６）萎縮性胃炎であった。（フローチャートの）評価理論は、血清学と胃粘膜の形態学との間の診断上の一致を最適化するために作成された。９８％（１４６／１４９）（９５％Ｃｌ９４−１００％）の胃炎を検出する総合的感度と８４％（４２／５０）（９５％Ｃｌ７１−９３％）の特異性で、４つの主要な血清学上のグループ及び１３のサブグループが得られた。

一般集団からの４８３の対象物から得られたさらなる血清は血清学的に分類された。この集団において胃炎を検出するための総合的感度は８８％（２１１／２４０）（９５％Ｃｌ８３−９２％）であり、特異性は８１％（１９６／２４３）（９５％Ｃｌ７５−８５％）であった。評価理論を作るのに用いたグループと一般集団のサンプルの両方において、血清学と胃粘膜の形態学との間には十分な一致が見られた。このことから、血清学は正常な胃の粘膜を有する対象の初期特定のために、ヘリコバクターピロリの根絶治療を必要とする人、悪性腫瘍が存在する可能性があるために胃鏡検査を必要とする人に適切となる。

検査結果を見ると、正常な対照数値レベルと比較して患者のサンプルにおける生検の数値レベルの変化は、患者が胃炎を発症している指標となっている。ここで用いる「変化」とは、正常な実験対照における数値レベルと比べて数値レベルが著しく高く、または低くなることを意味する。重要な事項は実施される特定の検査の正確性により判明し、必要以上の実験を行わずに経験的に特定することもできる。

付加的に、患者が胃炎を発症しているか否かをより正確に特定するために、患者のサンプルにおける複数の生検の数値レベルは正常な対照の数値レベルと比較される。例を挙げると、一般的に、検出されたＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体及びヘリコバクターピロリ抗体が正常対照の数値レベルより高い数値レベルの患者は胃炎であることを表し、一方でペプシノゲン濃度が正常対照の数値レベルより著しく高い（十二指腸潰瘍）または低い（粘膜スコアの激しい萎縮）数値レベルの患者は胃炎の可能性がある。ヘリコバクターピロリ抗原力価を乗じたペプシノゲン濃度が、正常対照より著しく低ければ胃炎の可能性を示す。患者が胃炎を発症している可能性を見極めるため及び／または患者の胃炎のサブグループを特定するために、複数の検査結果は正常対照数値と比較される。一部の生検は正常対照の数値レベルより低いにも係わらず胃炎を示す場合があるので、患者サンプルにおいて複数の生検の数値レベルを同様の生検の正常対照値と比較することで、胃炎をより正確に特定することができる。

組織形成学的検査を最も基準となる検査として、血清学的検査を組み合わせて用いることで、本発明は一般集団のサンプルにおける正常な胃粘膜の対象を８７％（１９６／２２５、図２におけるグループ１Ａ；表２）検出し、試験群におけるそれは８４％（４２／５０、グループ２）であった。試験群においては、血清学的検査によって十二指腸潰瘍を有する対象の９１％（４８／５３、グループ２）、悪性貧血を伴う、あるいは伴わない主要な萎縮性胃炎スコアを有する対象の８４％（８１１９６、グループ３と４）が検出された。グループ４においては、悪性貧血の全ての対象を検出した。一般集団のサンプルにおいてグループ２Ａ−Ｄは１５％であった。これらのうち、正常な粘膜であったのは僅か３％で、萎縮及び胃体部胃炎(pangastritis)を含む前庭部胃炎は８８％を構成する。グループ２Ａ−Ｄの全ての対象はＨ．ピロリ陽性を示した。これによって、グループ２Ａ−Ｄにおいて得られた４０から５０歳、またはそれ以下の対象(Bodger, K, et al., Scand J Gastroenterol 1999, 34: 856-63; Moayyedi, R, et al., Eur J Gastroenterol Hepatol 1999, 11: 1245-50)は、現在推奨されている消化性潰瘍の治療を施されてよいと提言できる。

グループ４Ａ、４Ｃでは、一般集団のサンプルにおいてたったの１２の対象しか得られず、そのうちの１つは非萎縮性の優勢胃炎スコア(corpus predominant gastritis)を有し、残りの１１は萎縮性の優勢胃炎スコアを有していた。このように、グループ４に属する対象は悪性腫瘍の可能性が高いのでＥＧＩＤを受けることが薦められる。

一般集団のサンプルにおいて、１２％（２９／２２５）は正常な胃粘膜を有していたが、血清分析の結果においては異常を示した。この矛盾の説明としては幾つか挙げられ、一部の血清検体は過去の炎症状態を反映することがあったり、または熟練した検査官の多くよりもＥＬＩＳＡは粘膜における微細な変化に対して敏感に反応したりすることが説明に挙げられる。

結果として、生検を用いたＥＧＩＤは引き続き胃粘膜の状態の正確な診断のための最も基準となる検査であり続ける。しかし、以下の例が示すように、血清学は患者の症候学や病歴と組み合わせて用いると有効な補助となる。すなわち「血清学的生検」として機能するのである。このため、血清学的検査は（ａ）正常な胃粘膜を有する患者（グループ１Ａ）、（ｂ）高い数値レベルの血清ＰＧ１及び高い「Ｈ．ｐ．×ＰＧ１要素」を有する患者（グループ２）、（ｃ）優勢萎縮性胃炎スコア(corpus predominant atrophic gastritis)を有する患者（グループ３と４）を特定するために消化不良の胃鏡検査の事前に行うスクリーニングに適している。（ａ）に属する患者はさらに酸に関連しない疾患の検査を受け、（ｂ）に属する４０から５０歳以下の患者は消化性潰瘍のための推奨される治療を受け、その治療が成功しなかった場合、患者はＥＧＤによって検査される。（ｃ）に属する患者は胃に悪性腫瘍が出来ているリスクが高いのでＥＧＤで検査される。

上記で説明した血清学的検査及び測定法は容易に行えるため、免疫検査においてある程度の経験があるどのような臨床検査室でも行うことができる。これらは内視鏡検査に伴う作業負荷を軽減し、患者のためにもなり、医者にとって貴重な診断法となり、そして経済的でもある。

（実験例１）
血清学的検査の初期評価のために、内視鏡的及び組織学的に検査された以下の４つの対象グループから採取した血清が選択された。それは正常な胃粘膜を有する対象５０名（Ｎ）（男性３８名と女性１２名、平均年齢６３歳、年齢幅３７から８０歳）、急性十二指腸潰瘍の対象５３名（ＤＵ）（男性３９名と女性１４名、平均年齢５２歳、年齢幅２０から７９歳）、軽度から重度の優勢萎縮性胃炎スコア(corpus predominant atrophic gastritis)を有すると診断された対象４６名（ＡＧ）（男性２３名と女性２３名、平均年齢６８歳、年齢幅４０から８２歳）、そして悪性貧血を伴った優勢萎縮性胃炎スコアを有する対象５０名（ＰＡ）（男性２３名と女性２７名、平均年齢６８歳、年齢幅４０から８３歳）であった。坑内因子の欠乏を示すシリングテストなどを含む悪性貧血を診断するための基準は、すでに説明されている(Borch, K, et al., Scand J Gastroenterol 1984, 19: 154-60)。

（実験例２）
スウェーデンにおける一般集団からランダムに選択された対象４８３名（男性２６６名と女性２１７名、平均年齢６５歳、年齢幅３７から８５歳）は、生検及び血液サンプルからＥＷによって検査された。この研究の結果は、近年公開された(Borch, K, et al., Dig Dis Sci, 2000, 45: 1322-29)。生検標本において胃炎は、シドニーシステムによって前庭部優勢、スコア優勢、萎縮を伴うまたは伴わない胃体部胃炎、そしてＨ．ピロリが存在するまたは存在しない胃体部胃炎に分類された(Price, A., J Gastroenterol Hepatol 1991, 6: 209-22; Dixon, M.F., et al., Am J Surg Pathol 1996, 20: 1161-81)。ＥＷは、すでに上記で説明したように行われる(Borch, K, et al., Dig Dis Sci, 2000, 45: 1322-29)。３つの生検が胃の組織（主部、前部及び後部）と幽門部の３ｃｍ以内の前庭部から採取された。

（実験例３）
抗原の生成
Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼは、前述したような方法で豚の胃粘膜より生成された（(Mardh, S., et al., Scand J Gastroenterol 1991, 26: 1089-96)。この豚の抗原生成において、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに対する自己抗体の結合は、人間の抗原におけるそれと類似していた(Song, Y.H., et al., Scand J Gastroenterol 1994, 29: 122-7; Ma, J1. Y., et al., Scand J Gastroenterol 1994, 20: 7904; Karlsson, F.A., et al., Clin exp Immunol 1987, 70: 604-10)。Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼが強化された小胞状膜は、低濃度の洗浄液（０．１３％（ｗ／ｖ）のｎ−オクチルグルコンド、または０．０６％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム）において、例えばペプシン／ペプシノゲンなどの緩く付着した蛋白質を除去するために処理され、−７０Ｔでサッカロース／ヘペス‐トリスバッファ、ｐＨ７．４にて緩衝される。Ｈ．ピロリの抗体は５つの菌株(CCUG 17874, 25, 66, 1139 及び253)から、マー及びその他によって説明されたように生成された(Ma, J. Y., et al., Scand J Gastroenterol 1994, 29: 961-6)。

（実験例４）
酵素免疫測定吸着検査（ＥＬＩＳＡ）
すでに説明されたように(Ma, J. Y., et al., Scand J Gastroenterol 1994, 29: 961-6)、ＥＬＩＳＡは本質的には５０ｐｌの生成された抗原（５ｐｇ／ｍｌ）で覆われたＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）プレート（Maxisorp（登録商標）, Nunc, ロスキレ、デンマーク)を用いて、５０ｍＭのｐＨ９．８の炭酸ナトリウムバッファにおいて４０℃で培養された。次いでこのウェルは、０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（ＰＢＳ−Ｔ）、ビオチニル化されたヤギ抗ヒト１９Ｇ（Amersham International PLC、アメルシャム、イギリス）、ストレプトアビジン（Amersham International PLC、アメルシャム、イギリス）及びアルカリ性ホスファターゼ(Boehringer-Mannhelm Biochemicals、マンハイム、ドイツ）を含むリン酸緩衝された生理食塩水に１：１００で希釈された血清にて培養された。最後に、５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファに１ｍｇ／ｍｌで含まれたｐＨ９．８の１００ｐｌのｐ−ニトロフェニルリン酸（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）が加えられた。吸収度は、コンピューター化されたＥＬＩＳＡ読取機（Vmax（登録商標）, Molecular Devices, カリフォルニア、アメリカ合衆国）を用いて４０５リム（キネティックＥＬＩＳＡ）で継続的に読み取られた。全ての培養は絶え間なく攪拌され続け、それぞれの培養工程の間にＰＢＳ−Ｔによって３回洗浄された。それぞれの血清サンプルは２度ずつ分析され、それぞれの免疫プレートには陽性と陰性の標準が含まれていた。それぞれのサンプルの光密度（毎分ｍＯＤ）の読み取りは、それぞれの免疫プレートにおける陽性の標準と関連し、そのデータは抗体の相対力価として表示される。陽性及び陰性の標準の変動係数はそれぞれ５．７：ｔ２．９及び８．１±３．５（Ｍ＋ＳＤ）であった。

（実験例５）
血清ペプシノゲン１（ＰＱ１）の分析
この検査は、ＰＧ１に特異性のある西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識の抗体を用いて、静的抗体（stationary antibodies）に結合されたＰＧ１を検出するための非競合的サンドイッチ技法(sandwich technique)に基づいて行われた。上記静的抗体はマイクロタイタープレート上に固定され、酵素標識の抗体よりもＰＧ１における多様な抗原部位に対して親和性を有していた。

血清ペプシノゲン１（ＰＧ１）の測定は、ガストロセット（Gastroset）PG１(Gastroset PG1 Cat, No. 67882, Orion Diagnostica,エスポー、フィンランド)を製造者の指示に基づいて用いて行われた。標準、対照及び血清のサンプルが２０μLのアリコートで、静的ペプシノゲン１抗体で覆われたマイクロタイタープレートにおける各ウェルに２度ずつ加えられた。測定バッファ（１００μL）が加えられ、マイクロタイタープレートのウェルは３０分間培養された後に２度洗浄され、測定バッファで１：１００に希釈された西洋わさびペルオキシターゼ標識PG１（HRP-PG1）抗体と共にさらに３０分間培養された。各ウェルは４度洗浄され、基質液と共に３０分間培養され、反応を中断しＥＬＩＳＡ読取機を用いて着色が測定された。

統計的分析
結果は、メディアン及び四分位範囲（２５から７５バーセンタイル値）として表示される。適切と思われる場合には、比率（百分率）は９５％の信頼区間（Ｃｌ）で表される。２組の患者グループの相違を調べるためにウィルコクソンの符号順位検定が用いられる。有意性水準はｐ＜０．０５であった。

（実験例６）
研究グループＮ、ＤＵ、ＡＧ及びＰＡから採取した血清の測定
酵素免疫測定吸着検査
生検の内視鏡的及び組織学的検査によって診断された４つのグループの対照から採取した血清は、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体（図１Ａ）、Ｈ．ピロリ抗体（図１Ｂ）及びペプシノゲン（ＰＧ１）（図１Ｃ）の分析が行われた。生成物ｆ（Ｈ．ピロリ抗体×ＰＧ１の相対力価）が図１Ｄにおいて示されている。上記グループには、正常な胃粘膜保有者（Ｎ、ｎ＝５０）、十二指腸潰瘍保有者（ＤＵ、ｎ＝５３）、軽度から重度の優勢萎縮性胃炎スコア保有者（ＡＧ、ｎ＝４６）及び悪性貧血保有者（ＰＡ、ｎ＝５０）の患者が含まれる。この結果は、メディアン及び四分位範囲（２５から７５パーセンタイル値、Ｈspread）と共に箱ひげ図にて示される。内側及び外側の枠の外にある数値はそれぞれ星印または円によって描画され、上枠はそれぞれ＋１．５から＋３ＨSpreadの四分位範囲と定義される（SYSTAT（登録商標）マニュアル）。ｙ軸の外にある数値は括弧で表示される。有意性は**（ｐ＜０．０１）及び***（ｐ＜０．００１）、有意でない場合はｎ．ｓ．で示される。

H、K−ＡＴＰアーゼ抗体
正常な胃粘膜を持つ対照で構成された研究グループ（Ｎ）において、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体力価のメディアンは２．０（範囲０．７―９．０；図１Ａ）であった。これに対応するＤＵ、ＡＧ及びＰＡグループにおける数値は、それぞれ９．３（範囲１．６−８２．７）、３．８（範囲０．８−１３７）、そして３２．３（範囲１．４−１２８）であった（ｐ＜０．００１ｖｓ正常）。

ヘリコバクターピロリ抗体
グループＮにおけるＨ．ピロリ抗体のメディアン力価は１．０（範囲１．０−４．５；図１Ｂ）であった。これに対応するＤＵ、ＡＧ及びＰＡのグループにおける数値は、それぞれ４７．５（範囲４．１−１３６）、１８．０（範囲１．０−５３．０）、そして３．５（範囲１．３−２７．２）であった（ｐ＜０．００１ｖｓ正常）。

血清ペプシノゲン１
グループＮにおける血清ＰＧ１のメディアン値はリットル当たり６６．３ｐｇ（範囲２１３−１６３；図１Ｃ）であった。これに対応するＤＵ、ＡＧ及びＰＡグループにおける数値は、それぞれリットル当たり１４９ｐｇ（範囲４２．７−５００）、３１．８ｐｇ（範囲２．６−１２７）、そして４．４ｐｇ（範囲０−６１．０）であった（ｐ＜０．００１ｖｓ正常）。

要素ｆ＝（Ｈ．ピロリ抗体力価×血清ペプシノゲン１）
３種類の血清学的パラメータを用いた結果、患者グループは相互に大きな相違も見られたが一致する部分もあった。Ｈ．ピロリ抗体力価及びＰＧ１濃度が、ＤＵグループにおいては高く観測され、ＰＡグループにおいては低く観測された。このため、それぞれの異なるグループをより正確に識別するためにＥＬＩＳＡの分析結果、Ｈ．ピロリ抗体が乗じられたＰＧ１の生成物ｆが測定された（図１Ｄ）。全てのグループはお互いに全く違っていた（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．００１、図１Ｄ）。グループＮにおけるｆのメディアン値は７７．５（範囲２４．０−３４４）であった。ＤＵグループにおいては８１０５（範囲１９３−４０３０３；ｐ＜０．００１ｖｓ正常）、ＡＧグループにおいては５００（範囲５．０−３９０１；ｐ＜０．００１ｖｓ正常）、そしてＰＡグループにおいては１２．０（範囲０−９１５；ｐ＜０．０１ｖｓ正常）であった。

（実験例７）
血清学的診断のための評価理論（フローチャート）
胃粘膜の状態は、生検の一部の組織形態学的検査によって特定される。これによって、最も基準となる検査を血清学的分析の結果と比較することが可能となった。よって診断的な評価理論が作られた（図２）。この理論の識別数値レベルは、研究グループＮ、ＤＵ、ＡＧ及びＰＡにおける（外れ値を排除した後の）血清学的分析の結果を用いて最適化された。患者グループ間において最大の解像度を達成するために、ＳＹＳＴＡＴ（登録商標）ソフトウェアが使用された。「生検」はＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体（ＨＫ）、Ｈ．ピロリ抗体（ＨＰ）、ｓ−ペプシノゲン１（ＰＧ１）及びｆ＝（Ｈ．ピロリ抗体力価×血清ペプシノゲン１）（ＨＰ*ＰＧ１）であった。この理論において、それぞれの血清は血清学的グループ１から４及びその他のサブグループに分類された。

評価理論はそれぞれの血清から得られた分析結果に適用され、分類及びグループ分けが行われた。表１には、正常（Ｎ）、十二指腸潰瘍（ＤＵ）、優勢萎縮性胃炎スコア（ＡＧ）及び悪性貧血（ＰＡ）の４つの研究グループの血清学的グループ分けが示されている。図２で説明された血清学的診断のための理論は血清学的データに適用された。

このグループ分けの結果として、サブグループ１Ａから４Ｃができた。識別数値レベルは、それぞれのサブグループにおける選択経路（selecton pathway）のために示されており、それぞれのグループのメディアン値は括弧で示されている。それぞれの血清学的グループにおける研究グループ、性別及び年齢の分配は示されている。グループ１においては、グループＮにおける対照の８４％（４２／５０）が得られた。グループＮの対照から採取された一部の血清は血清額的な外れ値であった（例：グループ１１３−１Ｄ、３Ａ及び４Ａ）。グループ２Ａから２Ｄでは、９１％（４８／５３）のＤＵを保有する対照が得られた。グループ３Ａ及び３Ｂでは、５７％（２６／４６）のＡＧ保有者と１８％（９／５０）のＰＡと診断された患者が得られた。ＡＧグループとＰＡグループとの間で見受けられる一致は、それらが時間尺度の異なる時点での同じ疾患を表しているため驚くべきことではない。さらに、グループ２において発見されたＡＧを保有する対照の１４％において個々の一致が見られた。その他の点では微々たる一致しか見られなかった。胃炎を検出する総合的な感度は９８％（１４６／１４９）（９５％Ｃｌ ９４−１００％）で、特異性は８４％（４２／５０）（９５％Ｃｌ ７１−９３％）であった。

図３Ａから３Ｄは、血清学によって特定された組織形態学的に診断された４つの主要グループの分布形状を示す。グループ１Ａは９４％のＮ、４％のＤＵ、そして２％のＰＡから構成され、グループ２（Ａ−Ｄ）は８６％のＤＵと１４％のＡＧから構成され、グループ３（Ａ−Ｂ）は６６％のＡＧ、２３％のＰＡ、８％のＤＵ、そして３％のＮから構成され、グループ４（Ａ−Ｃ）は７７％のＰＡ、２１％のＡＧ、そして２％のＮから構成される。グループ４及び３は、総合するとグループＡＧ及びＰＡ（それぞれ４２％と５３％）の対照の９５％、Ｎのうち２％、そしてＤＵのうち３％を構成する。表１においてグループ１Ｂ−Ｄによって表された小グループは、その５０％がＮグループに属する１２の対照を含んでなるが、血清学的にそれらは外れ値であった。これらのサブグループにおける残りの６つの対照は、ＡＧ（１７％）またはＰＡ（３３％）のいずれかを保有していた。

（実験例８）
一般集団のサンプルにおける血清学的診断
スウェーデンの一般集団からランダムに選択された４８３の対照（年齢３７から８５歳）のサンプルが、事前に生検及び血液サンプルによってＷＤを用いて検査された。その５０％（２４３／４８３）は正常な胃粘膜を有し、残りは胃炎を発症していた(Borch, K, et al., Dig Sci, 2000, 45: 1322-29)。本研究において、正規母集団から採取された血清は分析され、図２における構想に基づいてグループ分けされ、その結果は組織形態学的診断の結果と比較された。図２には、正規母集団のサンプルにおける血清学的なグループ分けが示される。図２において示された血清学的診断の構想が、血清学的データに適応された。そしてそのグループ分けの結果、１Ａから４Ｃの血清学的サブグループに分けられた。分別数値レベルは、それぞれのサブグループにおいて選択経路として適応され、それぞれのグループのメディアン値は括弧で示されている。それぞれの血清学的サブグループにおける組織形態的診断によるグループ、性別及び年齢の分布が示される。形態的診断は、正常（０）、非萎縮性前庭部優勢胃炎（１）、萎縮性前庭部優勢胃炎（２）、非萎縮性胃炎（３）、萎縮性胃炎（４）、非萎縮性優勢胃炎スコア（５）、萎縮性優勢胃炎スコア（６）であった。

グループ１Ａにおいて、対照の８７％（１９６／２２５）は正常な胃粘膜を表す血清学的数値レベルを示した。正常な胃粘膜を有する対照の７％（１６／２４３）は、低いＰＧ１数値レベルが観測され、グループ１Ｂにおいて得られ、一方では８％（２０／２４３）がＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体数値レベルの増加によりグループ１Ｄにおいて得られた。なんらかの種類の胃炎を有するとして診断された一般集団のうち６％（２９／４８３）は、グループ１Ａにおいて得られた。

グループ２Ａ―２１Ｄにおいて、その１５％（７３／４８３）は血清学的グループ分けの工程（表２）によって得られた。グループ２Ａから２Ｄにおいて、正常な胃粘膜を有するのは２つの対照のみであった。グループ２Ａ−２１Ｄにおける優勢な形態的診断は、萎縮を伴う前庭部優勢胃炎（２４対照）、萎縮を伴わない胃体部胃炎（３３対照）であった。
３Ａ−３１３における対照は、Ｈ．ピロリに対して血清的に陽性を示した。集団のうち２０％（９５／４８３）がグループ３Ａにおいて得られ、その組織形態的診断は萎縮を伴う前庭部優勢胃炎（３９対照）、萎縮を伴わない胃体部胃炎（２６対照）、萎縮を伴う胃体部胃炎または優勢萎縮性胃炎スコア（１７対照）であった。グループ４Ａから４Ｄにおいて、ＰＧ１値は概ね低く、これはより顕著な萎縮スコアを示している。これらのグループには１２の対照しか発見されず、それらは萎縮を伴う優勢胃炎スコアを有していた。集団において血清額的に胃炎を検出する全体的な感度は８８％（２１１／２４０）（９５％Ｃｌ８３−９２％）で、特異性は８１％（１９６／２４３）（９５％Ｃｌ７５−８５％）であった。

一般集団のサンプルの、４つの主要なグループの血清学による分布形状は図４Ａから４Ｄにおいて示されている。血清学的グループ１Ａ、２（Ａ−Ｄ）、３（Ａ−）及び４（Ａ−Ｃ）における組織形態的に診断されたグループが示されている。形態的診断は。正常（０）、非萎縮性前庭部優勢胃炎（１）、萎縮性前庭部優勢胃炎（２）、非萎縮性胃体部胃炎（３）、萎縮性胃体部胃炎（４）、非萎縮性優勢胃炎スコア（５）及び萎縮性優勢胃炎スコアであった。

グループ１Ａにおいて、形態的に正常と判断されたのは８７％（１９６／２２５）であった。グループ２において、３３％（２４／１７３）を構成する萎縮を伴う前底部胃炎と、４５％（３３／７３）を構成する胃体部胃炎とが優勢グループであった。グループ３（Ａ−Ｂ）において、萎縮を伴う前庭部胃炎４０％（５０／１２３）、胃体部胃炎２８％（３５／１２３）、そして萎縮性胃炎スコア１５％（１８／１２３）が優勢グループであった。グループ４（Ａ−Ｃ）において、萎縮性胃炎スコアは９２％（１１／１２）を構成し、非萎縮性胃炎スコアは残りの８％（１／１２）であった。

グループ３と４の合計における優勢な形態的診断は、萎縮性前庭部優勢胃炎３５％（５０／１４５）、胃体部胃炎（２４％３５／１４５）、そして優勢萎縮性胃炎スコア２０％（２９／１４５）であった。これら３つのサブグループはグループ３と４の合計における対照の７９％（１１４／１４５）を構成する。萎縮性優勢胃炎スコアの有病率は、集団において７％（３２／４８３）を占め、これらのうちの９１％（２９／３２）はグループ３及び４において得られた。

本発明による方法及びキットの好適な具体案は、上記においてある程度の具体性をもって説明されたが、具体案の多様性は当業者にとっては容易に判る事項であると思慮されたい。本発明による方法及びキットの説明は、本発明を制限するものではなく、好ましい具体案を示す一例として挙げたにすぎない。

Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、Ｈ．ピロリ及びペプシノゲン１の数値レベルを示し、正常な胃粘膜（Ｎ）、十二指腸潰瘍（ＤＵ）、萎縮性胃炎（ＡＧ）及び悪性貧血を伴った胃炎（ＰＡ）を持つ個人において、それぞれのペプシノゲン１濃度を乗じたＨ．ピロリ抗体数値レベルの結果を示したグラフである。 評価理論の図式を示したフローチャートである。 Ｎ、ＤＵ、ＡＧ及びＰＡの実験グループにおいて、本発明によるスクリーニング法によって特定された４つの主要グループを示した円グラフである。 一般集団において、本発明によるスクリーニング法によって特定された４つの主要グループを示した円グラフである。

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Claims (16)

1. 血液サンプルを測定することによって人体における胃炎の有無を診断するための方法であって、
   上記測定はＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに特異的な抗体とヘリコバクターピロリに特異的な抗体の有無、及びペプシノゲンＩ濃度を調べるための血液サンプルの分析から構成され、
   上記Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに特異的な抗体とヘリコバクターピロリに特異的な抗体の有無、及びペプシノゲンＩ濃度はソフトウェア関連のシステムを用いて、相互に比較が行われ、
   正規母集団におけるＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼに特異的な抗体、ヘリコバクターピロリに特異的な抗体、及びペプシノゲンＩ濃度の各数値レベルとの比較が行われ、サンプルにおける数値レベルの変化を胃炎の指標とすることを特徴とする人体における胃炎の有無を診断するための方法。
2. 上記のように数値レベルの変化を検出することは、胃炎に関するさらなる調査のための介助につながることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 上記指標の数値レベルを特定するための工程には、指標を検出するための免疫学的測定が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 上記指標のグループには、ヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルを乗じたペプシノゲンＩの数値レベルからなる付加的な指標を含み、該付加的な指標の数値レベルは標準値と比較が行われることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
5. 上記Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体及びヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルが、正規母集団におけるそれぞれの数値レベルよりも著しく高い場合には胃炎を示す指標となることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
6. 上記ペプシノゲンＩ濃度の数値レベルが低い場合は萎縮スコアを示す指標となることを特徴とする請求項１から３のいずれか１に記載の方法。
7. 上記ペプシノゲンＩ濃度の数値レベルが高い場合は胃炎スコア、随意的には自己免疫が関連しない胃炎スコアを示す指標となることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
8. 上記Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体の数値レベルが正規母集団におけるその数値レベルと異なる場合は、自己免疫性萎縮スコアを示す指標となることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
9. 上記ヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルが正規母集団におけるその数値レベルと異なる場合は、前庭部胃炎または胃体部胃炎(pangastritis)を示す指標となることを特徴とする請求項１から３のいずれかＩに記載の方法。
10. 上記ヘリコバクターピロリ抗体の数値レベルが高く、上記ペプシノゲンＩの濃度が正常であるかより低い場合は、萎縮を示す指標となることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
11. 上記ペプシノゲンＩの濃度の非常に低い状態がＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体の数値レベルの高い状態と組み合わさると、萎縮スコアを示す指標となることを特徴とする請求項１から３にいずれか１項に記載の方法。
12. Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲンＩ濃度を検出するのに適した試薬を含む、胃炎をスクリーニングするためのキット。
13. 上記試薬にはペプシノゲンＩ抗体、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ及びヘリコバクターピロリ蛋白質またはそれらのペプチドが含まれることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
14. 上記試薬にはペプシノゲンＩ、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ及びヘリコバクターピロリの抗原が固体支持上に固定されて含まれることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
15. 上記キットには、標識抗ヒト抗体がさらに含まれることを特徴とする請求項１３に記載のキット。
16. 上記試薬はＨ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体、ヘリコバクターピロリ抗体及びペプシノゲンＩ濃度を検出するための検査と、概ね同数の検査を行うのに十分な量が備えられることを特徴とする請求項１１に記載のキット。

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