JP2005517459A - スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
ヌクレオチド配列(調査対象のヌクレオチド配列)の発現産物の細胞内局在に対する、施用される薬剤若しくは影響、又は他の刺激の効果を測定するためのアッセイであって:(i)細胞集団に、調査対象のヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし、ここで、発現される複合ヌクレオチド配列は、発現される検出可能タグを含むように配列され;(ii)施用される薬剤若しくは影響、又は他の刺激を、トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して施用し;(iii)トランスフェクトされた細胞集団における検出可能タグの細胞内位置を観察し、観察された細胞内局在を、薬剤又は影響を施用していない細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較することを含むアッセイを開示する。
Description
発明の分野
本発明は、施用される薬剤又は影響などの刺激の、細胞に導入されたヌクレオチド配列の発現産物の細胞内局在に対する効果を測定するためのアッセイの一側面に関する。このアッセイを用いて得られる情報は、ヌクレオチド配列の機能を確立する際に有用である。刺激がこうした効果を有する場合、このアッセイを化学的化合物をスクリーニングするための基礎として使用し、ヌクレオチド配列の発現産物による刺激に対する応答を変化させる「該当(ヒット)」化合物を同定することができる。本発明のアッセイは、並行して高い処理量で実施することができる。
本発明は、施用される薬剤又は影響などの刺激の、細胞に導入されたヌクレオチド配列の発現産物の細胞内局在に対する効果を測定するためのアッセイの一側面に関する。このアッセイを用いて得られる情報は、ヌクレオチド配列の機能を確立する際に有用である。刺激がこうした効果を有する場合、このアッセイを化学的化合物をスクリーニングするための基礎として使用し、ヌクレオチド配列の発現産物による刺激に対する応答を変化させる「該当(ヒット)」化合物を同定することができる。本発明のアッセイは、並行して高い処理量で実施することができる。
発明の背景
ヒトゲノム配列の解明は、数千もの潜在的な新規医薬ターゲットを同定する際に使用するためのヒト配列の包括的なコレクションを提供する。しかし、これらのターゲットを同定するためには、はじめに、ヒトゲノムによりコード化された30,000以上の遺伝子の各々に対して機能を割り当てなければならない。機能を遺伝子配列に割り当てるアプローチとして、バイインフォマティクス、構造ゲノミクス、遺伝子アレイ及びプロテオミクスを含む多くのアプローチが提案されている。
ヒトゲノム配列の解明は、数千もの潜在的な新規医薬ターゲットを同定する際に使用するためのヒト配列の包括的なコレクションを提供する。しかし、これらのターゲットを同定するためには、はじめに、ヒトゲノムによりコード化された30,000以上の遺伝子の各々に対して機能を割り当てなければならない。機能を遺伝子配列に割り当てるアプローチとして、バイインフォマティクス、構造ゲノミクス、遺伝子アレイ及びプロテオミクスを含む多くのアプローチが提案されている。
多くの製薬会社及びバイオテクノロジー会社は、医薬発見のため細胞をベースとするスクリーニング系をますます利用するようになっている。レセプター−アゴニスト相互作用、細胞内Ca2+測定、及び蛍光又は発光レポーターを用いた遺伝子発現は、Cytofluor、LJL Analyst又はFLIPRなどの標準的なマイクロタイタープレートリーダを用いて行うことができる。すべてのそのような系は、細胞の集団内で発生している変化の測定に依拠している。
現在のところ、化合物スクリーニングを行うための最も一般的なやり方は、精製された標的タンパク質を採取し、その活性又は機能を化合物の存在下又は非存在下で96又は384穴プレートにおいて測定することである(すなわち、インビトロのスクリーニング)。そのようなスクリーニングは超高処理量(uHTS)で行うことができ、多くの場合、100,000を超える化合物をたった一日で充分に評価することができる。そのような一次スクリーニングにおいて活性を示す化合物を、次いで、完全な細胞系に対するそれらの効果について更に調査する。残念ながら、インビトロスクリーニングにより同定された化合物はのちに、(i)生存細胞に入らない、(ii)細胞内部でみられる複雑で過剰な他のタンパク質の存在下において不活性である、又は(iii)非特異的な毒性の副作用を有することが分かる場合が多い。この問題は、医薬発見において実質的な時間の遅れを生じ、価値ある資源をむだにする可能性がある。
発明の要旨
第一の側面において、本発明は、ヌクレオチド配列の発現産物に関係する機能情報を測定できるアッセイを提供する。このアッセイは、本明細書中において「一次アッセイ」とも呼ばれる。具体的には、このアッセイにおいて、ヌクレオチド配列と検出可能タグをコードする配列とを含むクローン化発現ベクターがトランスフェクトされている細胞集団を、既知の薬剤又は影響又は他の刺激に供して、検出可能タグ(及びこれによりヌクレオチド配列の発現産物)の細胞内位置を測定し、薬剤又は影響を施用していない検出可能タグの細胞内位置と比較する。施用される薬剤又は影響が、(検出可能タグにより示される)発現ヌクレオチド配列の細胞内位置に対して効果を有していた場合は、これにより、発現ヌクレオチド配列の機能の表示が提供される。
第一の側面において、本発明は、ヌクレオチド配列の発現産物に関係する機能情報を測定できるアッセイを提供する。このアッセイは、本明細書中において「一次アッセイ」とも呼ばれる。具体的には、このアッセイにおいて、ヌクレオチド配列と検出可能タグをコードする配列とを含むクローン化発現ベクターがトランスフェクトされている細胞集団を、既知の薬剤又は影響又は他の刺激に供して、検出可能タグ(及びこれによりヌクレオチド配列の発現産物)の細胞内位置を測定し、薬剤又は影響を施用していない検出可能タグの細胞内位置と比較する。施用される薬剤又は影響が、(検出可能タグにより示される)発現ヌクレオチド配列の細胞内位置に対して効果を有していた場合は、これにより、発現ヌクレオチド配列の機能の表示が提供される。
本明細書中で使用される「既知の薬剤若しくは影響又は他の刺激」という表現は、特に、細胞集団に対して故意に施用される薬剤、影響又は他の刺激をいう。普通は、薬剤、影響又は他の刺激の施用は、細胞からのある形態の応答を顕在化させることをある程度期待して行われ、施用した薬剤、影響又は他の刺激の量、並びにその施用の一般的条件が結果的に選択される。こうした応答は、科学的な観点から充分に定義されることもあり、又は比較的不十分に定義されることもある。応答機構は、科学的観点から充分に理解されることもあり、又は比較的不十分に理解されることもある。一般的に言えば、応答の科学的な定義が良好であるほど、応答機構の理解は充分となり、ヌクレオチド配列の発現産物に関して、より多くの機能情報をこのアッセイから得ることができる。これは、発現産物を、比較的多くの、又は比較的詳細な、又は比較的よく理解された細胞機能又は機能不全の諸側面、例えば、ヒト、動物又は植物の健康に関する細胞機能又は機能不全の一以上の側面に潜在的に関係しているものとして定義することができるからである。
例えば、インシュリンを施用薬剤として使用して、これが発現ヌクレオチド配列の細胞内局在に対して効果を有する(検出可能タグにより示される)場合、これにより、発現ヌクレオチド配列がインシュリンシグナル伝達経路又は代謝調節のある側面に関与しているという示唆が提供される。したがって、そのヌクレオチド配列は、「糖尿病誘発遺伝子(diabetogene)」の候補−糖尿病の治療のための有用な治療的スクリーニング標的と考えられる。糖尿病誘発遺伝子であり、スクリーニングのための良い標的であることを確認するためには、必然的に、発現されるヌクレオチド配列の更なる特徴付けを行う必要がある。
したがって、まとめると、本発明の第一の側面のアッセイは、その機能が未知であるか又はその利用可能な機能情報が限定されているヌクレオチド配列の発現産物の機能を解明するというプログラムにおいて使用するのに高度に適している。
本発明のこの一次アッセイ又はスクリーニングは、非常に数多くのヌクレオチド配列をスクリーニングするために、異なるヌクレオチド配列に関して同じ施用薬剤又は影響を用いて、複数回(連続的か又は同時に)繰り返してもよい;これにより、その細胞内局在が刺激の存在下で影響を受ける産物についてコードする配列を同定することができる。このようにして同定されるクローンは、更なるアッセイ又はスクリーニングにおいて使用することができ、ここで、候補医薬のシリーズ(典型的には、化合物ライブラリー中に含有される)の効果を、一次アッセイにおいて使用される薬剤/影響の存在下で調査することができる。そのような更なるアッセイにより、一次アッセイにおいて使用される薬剤/影響の存在下でクローンの発現産物の転座又は細胞内局在に影響を与える「該当」化合物を同定することができる。「該当」化合物は、この該当化合物の特異性を測定するため、他のクローンに対する該当化合物の効果を調査するいわゆる「二次スクリーニング」において更にスクリーニングしてもよい。
発明の具体的な説明
本発明をはじめに本発明の一次スクリーニングに関してここでより詳細に説明する。
A.一次スクリーニング
上述のように、本発明の一次スクリーニングは、遺伝子機能のためのスクリーニングであり、それについての機能情報が殆ど又はまったく入手できないヌクレオチド配列(調査対象のヌクレオチド配列(単数又は複数))に関して実施される。本発明の一次スクリーニングは以下の基本的工程を有する:
(a)細胞集団に、調査対象のヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし、ここで、発現される複合ヌクレオチド配列の産物が、発現される検出可能タグを含むように配列され;
(b)トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に、既知の薬剤又は影響又は他の刺激を施用し;そして
(c)トランスフェクトされた細胞集団において検出可能タグの細胞内位置を観察して、観察された細胞内局在を、薬剤又は影響を施用していない細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較すること。
本発明をはじめに本発明の一次スクリーニングに関してここでより詳細に説明する。
A.一次スクリーニング
上述のように、本発明の一次スクリーニングは、遺伝子機能のためのスクリーニングであり、それについての機能情報が殆ど又はまったく入手できないヌクレオチド配列(調査対象のヌクレオチド配列(単数又は複数))に関して実施される。本発明の一次スクリーニングは以下の基本的工程を有する:
(a)細胞集団に、調査対象のヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし、ここで、発現される複合ヌクレオチド配列の産物が、発現される検出可能タグを含むように配列され;
(b)トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に、既知の薬剤又は影響又は他の刺激を施用し;そして
(c)トランスフェクトされた細胞集団において検出可能タグの細胞内位置を観察して、観察された細胞内局在を、薬剤又は影響を施用していない細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較すること。
したがって、本発明のこの側面にしたがえば、施用される薬剤若しくは影響又は他の刺激の存在下又は非存在下において、検出可能タグの細胞内位置が測定される。施用される刺激が、検出可能タグの細胞内局在に対して効果を有すると観察されると(これは、ヌクレオチド配列の発現産物に対するその効果に起因する)、これにより、ヌクレオチド配列に対して機能を割り当てるという課題において有用な情報が提供される。加えて、ヌクレオチド配列の発現産物の初期の又は基礎的な局在により、遺伝子機能の解明のための情報を提供することができる。
本発明を用いて得ることができる情報は、バイオインフォマティクスなどの他の方法により得られる知見とともに、遺伝子配列の産物の機能に対する有意な洞察を与えることができる。遺伝子の産物の機能の知識があれば、それらの機能の領域が任意の所与の疾病又は条件により影響を受けるものである場合に、それらを治療的介在について目標とする可能性が生ずる。
ヌクレオチド配列
本発明の第一の側面の一次スクリーニングは、単一のヌクレオチド配列に関して実施してもよい。しかし、以下により詳細に説明するように、本発明の主要な利点は、ヌクレオチド配列のライブラリーから得ることができるような異なるヌクレオチド配列に関して、(好ましくは、並列した操作において、又は並列した操作のバッチにおいて)一次スクリーニングを繰り返し使用することから生ずる。
本発明の第一の側面の一次スクリーニングは、単一のヌクレオチド配列に関して実施してもよい。しかし、以下により詳細に説明するように、本発明の主要な利点は、ヌクレオチド配列のライブラリーから得ることができるような異なるヌクレオチド配列に関して、(好ましくは、並列した操作において、又は並列した操作のバッチにおいて)一次スクリーニングを繰り返し使用することから生ずる。
本発明の理論においてはRNA配列に関して使用することができるが、主として、DNA配列に関して使用することを意図している。
本発明の一次スクリーニングに供されるヌクレオチド配列は、それについて殆ど又はまったく機能情報が知られていない配列であってもよい。別の態様では、ヌクレオチド配列は、それについて一部の機能情報が知られている配列であってもよい。例えば、(ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチド構造における)ホモロジーから、一定のタンパク質ファミリー又はドメインファミリーのメンバーをコードすると考えられる配列であってもよい。
本発明の一次スクリーニングに供されるヌクレオチド配列は、それについて殆ど又はまったく機能情報が知られていない配列であってもよい。別の態様では、ヌクレオチド配列は、それについて一部の機能情報が知られている配列であってもよい。例えば、(ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチド構造における)ホモロジーから、一定のタンパク質ファミリー又はドメインファミリーのメンバーをコードすると考えられる配列であってもよい。
ヌクレオチド配列(又は異なるヌクレオチド配列のシリーズに関してスクリーニングを実施する配列)は、全長cDNA、又はタンパク質ドメインをコードする一部長配列であってもよい。また、ヌクレオチド配列は、発現配列タグ(EST)、又はそれについて配列ホモロジー又は他の方法からは殆ど知られていない別の配列であってもよい。
これまで説明したように、ヌクレオチド配列は、ホモロジークローニング又は他の生化学をベースとする手段に基づいて同定されるEST又はcDNA配列のコレクションから誘導されてもよい。具体的に規定されるEST又はcDNA配列のコレクションの利点は、これらにより、スクリーニングを必要とする配列の数が限定され、重要であろう候補配列の発現に対するスクリーニング手順に焦点があてられるので、無作為に発生する又は非特異的なライブラリーの使用と比較して、必要とするスクリーニング時間が短くなるということである。例えば、本発明の一次スクリーニングは、例えば、ホモロジークローニング又は多くの生化学をベースとする手段に基づいて同定されたPHドメイン(pleckstrinホモロジー)、SH2ドメイン、PDZドメインなどの具体的なタンパク質ドメインについてコードすることが知られているESTのコレクションに関して使用することができる。
ESTは、内部コード配列(internal coding sequences)を表しているので、開始コドン及び終止コドンのいずれか又は両方を欠いていることから、EST配列は、検出可能タグをコードしている配列のN−又はC−末端のいずれかに融合させることができる。
更に、ESTは単なる部分的な配列であることから、例えば、調節配列の削除の結果として、構成的に活性な又は優性阻害の特徴を示すように、一部調節が解除されていてもよい。これにより、観察される発現配列の特徴に影響を与える活性調節分子を複雑にすることなく、発現配列のスクリーニングが可能となる。
本発明の一次スクリーニングにおいてcDNAを使用すると、ほぼ完全長のcDNA配列を含有するタグ付融合体から発現されるペプチドが、長さの短いESTより正しく折り重なり適切に標的とするという利点がある。更に、これらのcDNAは実質的に完全長であることから、発現ペプチドは生理活性を保持しやすい。しかし、cDNA配列中に終止コドンが存在する可能性があるため、一般的には、cDNA配列は、検出可能タグをコードしている、又は3’タグが望ましい場合は、除去されるべき終止コドンについてコードしてる配列の5’末端には融合されないことが好ましい。
ヌクレオチド配列がドメインを含む場合は、このドメインは、ドメイン特異的なコンセンサス配列に対して設計された、ゲノムテンプレートDNA又はcDNAとプライマーとを用いて得ることができる。次いで、PCR産物は、当業者によく知られている標準的な手法を用いてクローンしてもよい。ドメイン配列の本質により、発現ペプチドは、細胞中で正しく折り重なり、それらが通常一部を形成するタンパク質について代表的な様式で転座する。
本明細書中で使用する「ドメイン」の語は、構造的に規定されたタンパク質ヌクレオチドの小球部を意味する。タンパク質は、単一のドメインからなるものもあり、ポリペプチド鎖の小構造部により接合された二種以上のドメインからなるものもある。
スクリーニングをヌクレオチド配列のシリーズに関して実施する本発明の一次スクリーニングの態様においては、ヌクレオチド配列は、関連した機能をもつ産物をコードするように選択してもよい。これまでに説明したように、そのファミリーについてすでに知られている情報は、一次スクリーニングにおいて使用される一次薬剤又は影響を選択する助けとなり得ることから、未知のヌクレオチド配列の機能に関するスクリーニングは、スクリーニングするヌクレオチド配列が、例えば、チロシンキナーゼ、セリン/スレオニンリン酸塩、PHドメイン、SH2ドメインなどのメンバーであるか又はそう考えられる場合により焦点があてられる。
検出可能タグ
本発明のアッセイは、発現ヌクレオチド配列が検出可能タグを用いて適切に標識付けされていることを必要とする。この検出可能タグは、任意のポリペプチドタグであることができ、細胞中のその位置は適する検出法で検出することができる。
本発明のアッセイは、発現ヌクレオチド配列が検出可能タグを用いて適切に標識付けされていることを必要とする。この検出可能タグは、任意のポリペプチドタグであることができ、細胞中のその位置は適する検出法で検出することができる。
使用することができる検出法の例としては、適切なタグと関連して、次の方法が挙げられる:蛍光顕微鏡を用いた蛍光検出法(広域、共焦、2光量子などのタイプであってもよい)又は蛍光プレートリーダなどの非顕微鏡的方法。使用することができる他の方法としては、分光光度計で検出することができる、比色読み出し情報を与えるものが挙げられる。
検出可能タグは、例えば、蛍光的に標識付けされたプローブ(例えば、抗原配列及び蛍光標識付けされた抗体)により容易に検出される、蛍光ポリペプチド、又はタンパク質配列であってもよい。適する蛍光ポリペプチドの例は、GFP、EGFP、及びCFPである。蛍光標識付けされたプローブにより容易に検出されるタンパク質配列の例は、ヘマグルチニン、myc、FLAG及びGST(その特異的な例は、特異的な、蛍光標識付けされた抗体についてのエピトープとして機能することにより作用する)、ならびにアビジン/ビオチンである。
また、タグは蛍光をベースとしない方法を用いて検出してもよい。比色読み出し情報を使用してもよい。タグは、分光光度計により容易に検出される着色化合物に共役させたプローブにより検出してもよい。
信号増幅が必要な場合、使用することができる手法は、酵素に共役させたプローブによりタグを検出するものである。次いで、この酵素は、基質分子を検出不可能な形態から検出可能な形態へと転化させる。基質分子は、比色又は蛍光読み出し情報を与えることができる(電子顕微鏡による検出のための高電子密度化合物を堆積させるなどの、他の読み出し情報も可能である)。固相酵素免疫アッセイ(ELISA)は、このタイプの広く使用されている方法である。広く使用されている酵素共役体は、Horse Raddish Peroxidase(HRP)及びアルカリフォスファターゼであるが、他にも数多くある。基質としては、蛍光定量計及び比色定量計により検出することができるAmplex Red(Mol. Probes)などの分子が挙げられる。このタイプの信号増幅の別の例は、Tyramide Signal amplification(Mol. Probes)である。
それらの検出については他の検出可能タグ及び方法を使用してもよい。
GFPなどの検出可能タグの発現ヌクレオチド配列への融合が、この発現ヌクレオチド配列のタンパク質/ポリペプチド産物の特徴を変化させることは稀であるが、ある環境においては、タグが、検出可能タグをコードしている配列に融合された発現ヌクレオチド配列の融合産物により示される生理活性に有意に寄与しないことを確認するため、本発明の一次スクリーニングを実施する前に、発現ヌクレオチド配列に対して異なる検出可能タグを並行して試験することが望ましい。
GFPなどの検出可能タグの発現ヌクレオチド配列への融合が、この発現ヌクレオチド配列のタンパク質/ポリペプチド産物の特徴を変化させることは稀であるが、ある環境においては、タグが、検出可能タグをコードしている配列に融合された発現ヌクレオチド配列の融合産物により示される生理活性に有意に寄与しないことを確認するため、本発明の一次スクリーニングを実施する前に、発現ヌクレオチド配列に対して異なる検出可能タグを並行して試験することが望ましい。
更なるヌクレオチド配列の修飾
ある環境においては、その細胞内局在又はその細胞内局在における変化を良好に検出するため、ヌクレオチド配列に更なる付加、削除又は他の修飾をするのが有用な場合がある。なし得る修飾の例は、ヌクレオチド配列を付加して、発現ヌクレオチド配列の産物が細胞の核へ侵入する(これは、発現ヌクレオチド配列の産物が小さい場合に起こり得ることが多い)のを防ぐことである。これは、発現ヌクレオチド配列が通常核の中に存在しない場合に望ましいであろう。そのような核の蓄積を防ぐために付加されたヌクレオチド配列は、発現ヌクレオチド配列の産物を核に侵入できないほど大きくするため、多数の検出可能タグを発現ヌクレオチド配列に付け加えることを含む。別の態様では、核輸送配列を使用する。核輸送配列は、数多くのタンパク質、例えば、Histone Deacetylase 6(HDAC6)、タンパク質キナーゼ阻害剤(PKI)、Adenomatous Polyposis Coli(APC)などにおいて同定されている。これらの配列はすべて、それらが存在するポリペプチドの核からの輸送を媒介する。
ある環境においては、その細胞内局在又はその細胞内局在における変化を良好に検出するため、ヌクレオチド配列に更なる付加、削除又は他の修飾をするのが有用な場合がある。なし得る修飾の例は、ヌクレオチド配列を付加して、発現ヌクレオチド配列の産物が細胞の核へ侵入する(これは、発現ヌクレオチド配列の産物が小さい場合に起こり得ることが多い)のを防ぐことである。これは、発現ヌクレオチド配列が通常核の中に存在しない場合に望ましいであろう。そのような核の蓄積を防ぐために付加されたヌクレオチド配列は、発現ヌクレオチド配列の産物を核に侵入できないほど大きくするため、多数の検出可能タグを発現ヌクレオチド配列に付け加えることを含む。別の態様では、核輸送配列を使用する。核輸送配列は、数多くのタンパク質、例えば、Histone Deacetylase 6(HDAC6)、タンパク質キナーゼ阻害剤(PKI)、Adenomatous Polyposis Coli(APC)などにおいて同定されている。これらの配列はすべて、それらが存在するポリペプチドの核からの輸送を媒介する。
クローニング
本発明の一次アッセイにおいて、ヌクレオチド配列及び検出可能タグは(核輸送シグナルについてコードしているものなどの任意の他の追加のヌクレオチド配列とともに)、適する発現ベクターへとクローンしてもよい。ある環境においては、検出可能タグを含む予め形成された発現ベクターは、単にヌクレオチド配列をベクターへとクローンする必要がある場合に、商業的に入手可能である。必要なクローニング手順は、当業界において非常によく知られている。
本発明の一次アッセイにおいて、ヌクレオチド配列及び検出可能タグは(核輸送シグナルについてコードしているものなどの任意の他の追加のヌクレオチド配列とともに)、適する発現ベクターへとクローンしてもよい。ある環境においては、検出可能タグを含む予め形成された発現ベクターは、単にヌクレオチド配列をベクターへとクローンする必要がある場合に、商業的に入手可能である。必要なクローニング手順は、当業界において非常によく知られている。
トランスフェクション
本発明の一次スクリーニングにおいて、トランスフェクトされた細胞集団は、細胞集団に、発現されるタグ付産物をコードしているタグ付ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトすることにより得られる。発現クローンは、組織培養細胞へとトランスフェクトしてもよい。トランスフェクション方法は、脂質媒介系(例えば、Fugene(Roche))、塩化カルシウム媒介法、及びウイルス発現系(例えば、AdenoX及びRetroX(Clontech))を含んでもよい。他のトランスフェクション系を適する場合に使用してもよい。使用される細胞は多種多様であることができ、通常、粘着性であるものとする。例えば、細胞は、例えばコラーゲン、ポリリシン、抗体などの培養プレートコーティングの使用により、粘着性とされていてもよい。理想的には、選択される細胞は上述の系の一つによりトランスフェクトするのが容易であり、それらの生理的特徴は実施されるスクリーニングに適している。適していることが分かっている細胞には、HeLa、NIH 3T3、VERO、CHO及びPC12が含まれる;異なるスクリーニングに適している他の細胞タイプも使用してもよい。
本発明の一次スクリーニングにおいて、トランスフェクトされた細胞集団は、細胞集団に、発現されるタグ付産物をコードしているタグ付ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトすることにより得られる。発現クローンは、組織培養細胞へとトランスフェクトしてもよい。トランスフェクション方法は、脂質媒介系(例えば、Fugene(Roche))、塩化カルシウム媒介法、及びウイルス発現系(例えば、AdenoX及びRetroX(Clontech))を含んでもよい。他のトランスフェクション系を適する場合に使用してもよい。使用される細胞は多種多様であることができ、通常、粘着性であるものとする。例えば、細胞は、例えばコラーゲン、ポリリシン、抗体などの培養プレートコーティングの使用により、粘着性とされていてもよい。理想的には、選択される細胞は上述の系の一つによりトランスフェクトするのが容易であり、それらの生理的特徴は実施されるスクリーニングに適している。適していることが分かっている細胞には、HeLa、NIH 3T3、VERO、CHO及びPC12が含まれる;異なるスクリーニングに適している他の細胞タイプも使用してもよい。
トランスフェクトしたら、細胞集団を刺激の施用前に適する増殖培地中で維持してもよい。別の態様では、安定な細胞系を、トランスフェクトされた細胞集団から発生させてもよく、それにより、関心をもたれているヌクレオチド配列を発現する細胞の貯蔵と将来の使用とが可能となる。また、望ましい場合は、すべての細胞が関心をもたれているヌクレオチド配列を同様な発現のレベルで発現する、細胞集団を達成する手段として、安定な細胞系を発生させてもよい。安定な細胞系を発生させる際に必要な手法は、当業者によく知られている。
施用される刺激
本発明の一次スクリーニングにおいては、既知の薬剤又は影響又は他の刺激が、トランスフェクトされた細胞集団又はその一部に施用される。通常、この刺激は、外来的に施用される;しかし、ある環境においては、薬剤は、細胞内で、例えば、調査対象のヌクレオチド配列に加えて、別のタンパク質の細胞内部での共発現により生成されてもよい。
本発明の一次スクリーニングにおいては、既知の薬剤又は影響又は他の刺激が、トランスフェクトされた細胞集団又はその一部に施用される。通常、この刺激は、外来的に施用される;しかし、ある環境においては、薬剤は、細胞内で、例えば、調査対象のヌクレオチド配列に加えて、別のタンパク質の細胞内部での共発現により生成されてもよい。
まったく存在すら知られていない機能をもつヌクレオチド配列をスクリーニングする場合、(もしあれば)どの刺激が応答を顕在化させるかを予測することができないことから、ある範囲の「一次刺激」を試験するのが好ましい場合がある。
一方、スクリーニングするヌクレオチド配列が、所与のタンパク質又はドメインファミリー、例えば、チロシンキナーゼ、セリン/スレオニンフォスファターゼ、PHドメイン、SH2ドメインなどのすべての可能性のあるメンバーである場合、そのファミリーについて既に知られている情報は、使用すべき適する「一次刺激」の選択において助けとなり得る。
特異的な機能の領域において、新規な遺伝子を探索することが望まれる場合は、関心をもたれている機能領域と関係していることが知られている限定された範囲の「一次刺激」を、数多くの遺伝子配列のスクリーニングについて各々使用する。例えば、関心をもたれている機能領域が、EGFレセプターからのシグナルを変換することに関与しているタンパク質である場合、使用する候補「一次刺激」は、EGF若しくはEGF擬態、又はEGFレセプターからの信号変換経路の「上流端」を刺激すると知られている化合物であろう。
「一次刺激」に対する応答が、一次アッセイを用いて、発現遺伝子配列の産物から得られる場合、遺伝子配列の機能の領域をより正確に描写しようとするため、更に、関連している「一次刺激」を試験するのが望ましい場合がある。例えば、遺伝子配列の産物が、数多くの細胞表面レセプターを活性化することにより刺激することができる、信号変換の経路におけるある点で機能する場合、応答はある範囲の異なる「一次刺激」によるスクリーニングにおいて得られると予測されうる。一方、遺伝子配列の産物が、一の特定の細胞表面レセプターの下流で機能する場合は、ただ一種又は非常に少ない「一次刺激」により応答が顕在化されるであろうことが予測されうる。異なる「一次刺激」に対する発現遺伝子配列の応答は、このやり方において、関与している信号変換経路及びその経路上のおよその位置などの発現遺伝子配列の機能の特徴を描写するのを助けるために使用することができる。
施用される薬剤に加えて、一次刺激には、例えば、細胞の増殖条件などの、細胞に対して施用される影響、又は例えば、光強度、温度、浸透性(osmorality)、CO2レベルなどの変化;例えば、血清レベル;ストレスなどの細胞の増殖培地における変化;又は細胞周期状態における変化などの外部環境における変化が含まれてもよい。
本発明の一次スクリーニングある態様においては、遺伝子配列の産物の機能の領域を描写するために、一次刺激とともに、更なる刺激を使用してもよい。例えば、更なる刺激には、種々の細胞内シグナル伝達経路の(特異的な又は別の方法による)阻害剤、又はそれら経路の成分が含まれる。
イメージング
本発明の一次スクリーニングにおいては、施用される刺激の効果を測定するため、刺激を施用する前後に、検出可能タグの細胞内位置を観察する。イメージング操作を改良するためには、本明細書の「高処理量」に関して以下に詳細に説明するように、細胞内区画の既知のマーカーを導入することが望ましい場合がある。
本発明の一次スクリーニングにおいては、施用される刺激の効果を測定するため、刺激を施用する前後に、検出可能タグの細胞内位置を観察する。イメージング操作を改良するためには、本明細書の「高処理量」に関して以下に詳細に説明するように、細胞内区画の既知のマーカーを導入することが望ましい場合がある。
蛍光検出の使用に関与する検出可能タグの検出に関する手法としては、光顕微鏡法、共焦顕微鏡法、及び顕微鏡法をベースとしない蛍光定量法が挙げられる。好ましくは、使用される手法は、例えば、核、原形質膜、細胞質、ゴルジ装置、ミトコンドリア、小胞体などの細胞の主要なオルガネラに関して、タグ付ヌクレオチド配列の細胞内局在を測定するのに充分に高い分離能を有する。しかし、例えば、細胞の細胞外表面上の、明らかにされるタグ付けされた発現ヌクレオチド配列を検出しようとするときに、そのような高い分離能が必要とされない場合が時々ある。そのような場合においては、タグを細胞外表面にて曝露する場合は、信号(蛍光であるか又は他のものである)を検出する必要があるだけである。そのようなアッセイは、分離能の低い顕微鏡法、蛍光定量法、ELISA又は使用されるタグのタイプに適している別のそのようなアッセイを使用してもよい。曝露されるタグの細胞外検出のそのような方法は、当業者にとっては明らかである。
通常、トランスフェクション及び適するインキュベーション期間の後、トランスフェクトされた問題の発現クローンにより生成される検出可能タグを観察するため、細胞を処理する。これは、固定化、透過、抗体の添加などの工程を必要としうる。そのような手順は、当業者に対してよく知られている。刺激(単数又は複数)を施用した後にタグの位置を観察する場合、この刺激は、イメージング工程の前に施用するものとし、観察の前に適する期間インキュベーションするものとする。その後、検出すべきタグのタイプに適する系を用いて細胞をイメージングしてもよい。
イメージングは細胞が生存している間に行ってもよい。したがって、生存細胞に対する刺激の効果をリアルタイムで観察してもよい。この場合においては、関心をもたれているヌクレオチド配列を発現する生存細胞を、適する装置を用いて顕微鏡ステージ上に載せる。次いで、細胞を観察したり、イメージングしたり、この観察の間に刺激を施用してもよい。次いで、任意の応答をリアルタイムで起こっているときに観察したりイメージングしたりすることができる。このアプローチは、GFPのようにそれら自身が蛍光である検出可能タグによって、又は、完全細胞に侵入することができる、タグを検出するためのプローブによってのみ実施可能である。抗体などの蛍光プローブによる検出を必要とする非蛍光タグによっては実施可能ではないであろう。
GFPタグ付発現クローンの場合においては、典型的な配列イベントは次のものであってもよい:
1.刺激の添加(及び必要であれば任意の更なる刺激−これは予めインキュベーションを必要とする場合がある)。
1.刺激の添加(及び必要であれば任意の更なる刺激−これは予めインキュベーションを必要とする場合がある)。
2.一次刺激に対する任意の応答について適する時間が経過した後の細胞の固定化。
3.標準的な光顕微鏡又は共焦顕微鏡での細胞のイメージング。
また、代替的なアプローチを生のイメージングを用いてこれまでに説明したように実施してもよく、その場合においては、イベントの順序は工程(3)から始まり、観察又はイメージングの間に刺激を添加する。
3.標準的な光顕微鏡又は共焦顕微鏡での細胞のイメージング。
また、代替的なアプローチを生のイメージングを用いてこれまでに説明したように実施してもよく、その場合においては、イベントの順序は工程(3)から始まり、観察又はイメージングの間に刺激を添加する。
高処理量一次スクリーニング
本発明の一次スクリーニングは単一のヌクレオチド配列に関して実施してもよいが、好ましくは、アッセイは、異なるヌクレオチド配列のシリーズに関して、所与の刺激を用いて、並行して、又は並行若しくは連続のバッチで実施する。次いで、ヌクレオチド配列の同じシリーズを、複数の異なる刺激に対してこのやり方でスクリーニングすることができる。必要であれば、そのような手順を自動化して、非常に多くのヌクレオチド配列及び異なる刺激を迅速に処理できるようにすることが好ましいであろう。そのような手順は、典型的には、例えば、96又は384穴の独立したウェルを有するものなどのマルチウェルプレートを使用する。
本発明の一次スクリーニングは単一のヌクレオチド配列に関して実施してもよいが、好ましくは、アッセイは、異なるヌクレオチド配列のシリーズに関して、所与の刺激を用いて、並行して、又は並行若しくは連続のバッチで実施する。次いで、ヌクレオチド配列の同じシリーズを、複数の異なる刺激に対してこのやり方でスクリーニングすることができる。必要であれば、そのような手順を自動化して、非常に多くのヌクレオチド配列及び異なる刺激を迅速に処理できるようにすることが好ましいであろう。そのような手順は、典型的には、例えば、96又は384穴の独立したウェルを有するものなどのマルチウェルプレートを使用する。
したがって、例えば、本発明の一次スクリーニングは、少なくとも50の異なるヌクレオチド配列に関して所与の刺激を用いて並行して実施してもよい。適する自動化により、
この一次スクリーニングを、少なくとも500のヌクレオチド配列に関して、更には数千のそのような配列について、並行して、又は並行スクリーニングから並行若しくは連続のバッチで、比較的短い時間(2、3日)で実施することにより、大規模な発現ペプチド配列の機能分析を可能としてもよい。
この一次スクリーニングを、少なくとも500のヌクレオチド配列に関して、更には数千のそのような配列について、並行して、又は並行スクリーニングから並行若しくは連続のバッチで、比較的短い時間(2、3日)で実施することにより、大規模な発現ペプチド配列の機能分析を可能としてもよい。
本発明の一次スクリーニングを高処理量で実施すべき場合は、次の考慮事項を適用してもよい。
高処理量クローニング及びトランスフェクション
本発明の一次スクリーニングにおいて使用するためのcDNAライブラリーは、例えば、現存するライブラリーを、検出可能タグを含有するベクター(例えば、Stratageneからの)へとサブクローニングすることにより、又は当業者に熟知されることになる標準的な手法を用いて、検出可能タグを含有するベクターにおいてライブラリーを生成させることにより、生成させてもよい。ある環境においては、哺乳動物の発現ベクターにおいてよく特徴付けられたcDNA配列のライブラリーは商業的に入手可能である場合がある。これらのライブラリーが、インサートの組換移入のために設計されたベクター(例えば、Invitrogenから入手可能)を使用する場合、次いで、単なる組替工程により、これらの配列を検出可能タグベクターへと導入することができる。
高処理量クローニング及びトランスフェクション
本発明の一次スクリーニングにおいて使用するためのcDNAライブラリーは、例えば、現存するライブラリーを、検出可能タグを含有するベクター(例えば、Stratageneからの)へとサブクローニングすることにより、又は当業者に熟知されることになる標準的な手法を用いて、検出可能タグを含有するベクターにおいてライブラリーを生成させることにより、生成させてもよい。ある環境においては、哺乳動物の発現ベクターにおいてよく特徴付けられたcDNA配列のライブラリーは商業的に入手可能である場合がある。これらのライブラリーが、インサートの組換移入のために設計されたベクター(例えば、Invitrogenから入手可能)を使用する場合、次いで、単なる組替工程により、これらの配列を検出可能タグベクターへと導入することができる。
例えば、発現ベクターへのヌクレオチド配列のクローニングを大規模で実施すべき場合、これは、Invitrogenから商業的に入手可能なGateway(登録商標)クローニングシステムのような高性能クローニングシステムを用いて行ってもよい(Walhout et al(2000), Science 287, 116-122)。このシステムにより、組換えによりオープンリーディングフレーム(ORF)などの増幅されたヌクレオチド配列のクローニングが可能となり、それにより、クローニングベクターのクローニング部位内部に存在するがヌクレオチド配列自体には存在しない、制限部位についてのスクリーニングに対する必要性は回避される。クローンヌクレオチド配列を増幅し、相同組換えにより発現ベクターへとクローニングする。これら配列を、正確な最終リーディングフレームを達成することを可能とする様式でクローニングすることは重要である。このことは、当技術分野において利用可能であり、当業者により理解されている、発現ベクタークローニングストラテジを用いれば簡単である。高速組換えクローニングのための別の既知のシステムは「Creator」システム(Clontech Inc.)である。
これらのクローニング系は、Tecan、Xymark、Robbins(Hydraのブランド名で売られている)を含む会社により売られているものなどのロボット取扱いシステムと組合わせて、数多くのヌクレオチド配列を非常に迅速かつ殆どマンパワーを必要とせずにクローンすることが可能となる。
関心のもたれているヌクレオチド配列及び検出可能タグをコードする配列を含有する発現ベクターを細胞集団にトランスフェクトする工程は、大規模トランスフェクションが可能な自動化された装置を用いて実施してもよい。そのような装置も、Tecan、Xymark及びRobbinsなどの会社から容易に入手可能であり、当業者に知られている。
高処理量イメージング
観察又はイメージング工程を高処理量で行うために、各々のスクリーニングは、マルチウェルプレート(96又は384穴プレート)のウェル中で実施してもよい。顕微鏡技術は、現在商業的に入手可能であり、これにより、例えば、(Cellomics Inc.からの)Arrayscanのようなフォーマット並びにAmersham Bioscience及びAccumenから入手可能なシステムにおいて、細胞の迅速なイメージングが可能となる。タグ付けされた発現ヌクレオチドを位置付けるために顕微鏡法を必要としないスクリーニングについては、蛍光定量及び比色定量読み出し情報を伴うスクリーニングについてマルチウェルプレート判読技術が充分に確立されている。
観察又はイメージング工程を高処理量で行うために、各々のスクリーニングは、マルチウェルプレート(96又は384穴プレート)のウェル中で実施してもよい。顕微鏡技術は、現在商業的に入手可能であり、これにより、例えば、(Cellomics Inc.からの)Arrayscanのようなフォーマット並びにAmersham Bioscience及びAccumenから入手可能なシステムにおいて、細胞の迅速なイメージングが可能となる。タグ付けされた発現ヌクレオチドを位置付けるために顕微鏡法を必要としないスクリーニングについては、蛍光定量及び比色定量読み出し情報を伴うスクリーニングについてマルチウェルプレート判読技術が充分に確立されている。
スクリーニングデータの分析及び編集を自動化してもよい。タグ付けされた発現ヌクレオチド配列の細胞内局在の自動的な検出を可能とするために、適するコンピュータソフトウェアを編集してもよい。そのようなコンピュータソフトウェアは、一般的には、タグ付けされた発現ヌクレオチド配列の局在と、例えば、核、原形質膜、細胞質ゾル、ゴルジ、E.Rなどの、具体的な細胞内局在を区別する一以上の「マーカー」の局在とを比較することにより働く。そのような「マーカー」は、例えば、Molecular Probesから容易に商業的に入手可能である。次の表は、使用することができる適するマーカーの例を提供する。
幾つかの異なる細胞内局在に関して、タグ付けされた発現ヌクレオチド配列の共通の局在を検出するための適するアルゴリズムを編集してもよい。そのようなアルゴリズムは既に、例えば、細胞の細胞質と核との間の転座イベントを分析するためのCellomics Inc.により開発された専売ソフトウェアである、Cellomics Cytoplasm to -Nucleus Applicationを効果的に働かせることが示されている。タグ付けされた発現ヌクレオチド配列の産物の位置を自動的に検出し、その結果として、その局在における任意の変化を検出することにより、マルチウェルプレート形式において、多くの異なるスクリーニング条件を迅速に判読することができる。
また、マーカーに関する共通の局在に基づいて働かないイメージ分析ソフトウェアも使用してもよい。したがって、ソフトウェアは、タグ付けされた発現ヌクレオチド配列からの信号分布及び強度分布を考察して、この情報だけを用いて転座イベントを検出することができるように設計されていてもよい。
B.化合物ライブラリースクリーニング
これまで既に説明したように、本発明の一次アッセイ又はスクリーニングを使用して、その細胞内位置に特定の刺激の存在下で影響を及ぼす産物についてコードするヌクレオチド配列を同定することができる。次いで、このやり方で同定されるクローンは、更なるアッセイ又はスクリーニングにおいて使用することができ、ここで、候補医薬のシリーズ(典型的には、化合物ライブラリー中に含有される)の効果を、一次アッセイにおいて使用される薬剤/影響の存在下で、調査することができる。そのような更なるアッセイにより、一次スクリーニングにおいて使用される薬剤/影響の存在下で、クローンの発現産物の転座又は細胞内局在に影響を及ぼす「該当」化合物又は薬剤を同定することができる。
B.化合物ライブラリースクリーニング
これまで既に説明したように、本発明の一次アッセイ又はスクリーニングを使用して、その細胞内位置に特定の刺激の存在下で影響を及ぼす産物についてコードするヌクレオチド配列を同定することができる。次いで、このやり方で同定されるクローンは、更なるアッセイ又はスクリーニングにおいて使用することができ、ここで、候補医薬のシリーズ(典型的には、化合物ライブラリー中に含有される)の効果を、一次アッセイにおいて使用される薬剤/影響の存在下で、調査することができる。そのような更なるアッセイにより、一次スクリーニングにおいて使用される薬剤/影響の存在下で、クローンの発現産物の転座又は細胞内局在に影響を及ぼす「該当」化合物又は薬剤を同定することができる。
したがって、本発明の第二の側面にしたがえば、発現されるタグ付産物が施用薬剤の影響下で細胞集団のなかの細胞内部で転座する予め確立された能力に、化合物が影響を及ぼすかどうかを決定するため、化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。かかるアッセイは:
トランスフェクトされた細胞集団を提供し、その際、それら細胞は、施用される刺激の影響下で転座することが予めわかっている発現されるタグ付産物をコードする、タグ付けされたクローン化発現ベクターを含有し;
前記刺激の存在下で、前記化合物をその細胞集団に施用し;そして、
その化合物の存在が、細胞内部の発現されたタグ付産物の転座に影響を及ぼすかどうかを観察することを含む。
トランスフェクトされた細胞集団を提供し、その際、それら細胞は、施用される刺激の影響下で転座することが予めわかっている発現されるタグ付産物をコードする、タグ付けされたクローン化発現ベクターを含有し;
前記刺激の存在下で、前記化合物をその細胞集団に施用し;そして、
その化合物の存在が、細胞内部の発現されたタグ付産物の転座に影響を及ぼすかどうかを観察することを含む。
発現されたタグ付産物の細胞内部の転座に対して化合物が影響を及ぼすことがわかれば、これは、発現産物が存在する経路上の点に対して刺激が影響を与える点から延びている、シグナルトランスダクションの経路に沿った点で、この化合物が干渉していることを示すので、この化合物は更なる調査のための候補化合物であり得る。
本発明のこの側面においては、はっきりと局在しているが転座していないタンパク質に対する化合物の効果、並びに転座しないタンパク質に対する効果を測定することが望ましい場合がある。これにより、使用者は、転座しないがはっきりと局在しているタンパク質に対する化合物の効果についてスクリーニングすることができる。したがって、タンパク質の転座に対する化合物の効果を調べるのではなく、使用者は、タンパク質の明瞭な局在に対する化合物の効果を調べてもよい。
本発明のこのアッセイは、化合物を生存細胞中の標的に対して試験するので、応答を顕在化する際に化合物は細胞に侵入できなければならないことから、特に有利である。そのうえ、試験される化合物は、生存細胞内部に存在するタンパク質及び他の複合分子の複雑性に直面し、そして試験化合物の任意の毒性の効果が、細胞の増殖、形態学、生命力などにおける欠陥から明らかになる。したがって、このアッセイにより、活性のある製薬物質としての使用について更にスクリーニングすることができる化合物の同定が可能となる。特に、これら化合物は、このアッセイにおいて使用されるヌクレオチド配列の発現産物と関係する、医療条件又は病気の処理について、活性のある製薬物質であってもよい。
本発明のこのアッセイにおいては、前記施用刺激の影響下で発現産物が転座する能力が、詳細に上述した本発明の一次アッセイを用いて確立された。
刺激の施用の様式及びタイミング、並びにこのアッセイにおいて細胞をイメージングするために使用されるアプローチは、本発明の一次アッセイについて上述したものであってもよい。スクリーニングする化合物は、刺激と共にではなく刺激の前に添加する場合が多い。これは、殆どの化合物は、細胞に浸透して効果を有するのに時間を必要とするからである。刺激を施用する前に、数分〜数時間の間化合物で細胞を化合物と共に前保温するのが通常である。ある環境においては、化合物を同時に又は刺激の後に施用することができる;しかし、これは、刺激自体が細胞の環境における変化のように長期間/遅い場合に可能である。
刺激の施用の様式及びタイミング、並びにこのアッセイにおいて細胞をイメージングするために使用されるアプローチは、本発明の一次アッセイについて上述したものであってもよい。スクリーニングする化合物は、刺激と共にではなく刺激の前に添加する場合が多い。これは、殆どの化合物は、細胞に浸透して効果を有するのに時間を必要とするからである。刺激を施用する前に、数分〜数時間の間化合物で細胞を化合物と共に前保温するのが通常である。ある環境においては、化合物を同時に又は刺激の後に施用することができる;しかし、これは、刺激自体が細胞の環境における変化のように長期間/遅い場合に可能である。
このアッセイは、同じヌクレオチド配列及び刺激を用いるが、各々の回で異なる化合物を用いて複数回実施してもよい。好ましくは、アッセイは、複数回並行して、本発明の一次アッセイの高処理量操作に類似した様式で実施する。このやり方において、アッセイを非常に多くの化合物の高処理量スクリーニングについて使用してもよい。
本発明のこの側面のアッセイにおいて使用される化合物(単数又は複数)は、化合物ライブラリーの一部を含んでもよい。化合物ライブラリーは、種々の供給者(例えば、Asinex(Rissua), SPECS(Holland), Camgenix(USA), Contact Services(USA))から商業的に入手可能である。これら化合物は、化合物コレクション又は個々の化合物のいずれかとして入手可能であり、化合物の選択は、望ましい場合は、規定される化学的特性及び/又は構造の基づいていてもよい。
C.二次スクリーニング
潜在的な医薬リードを検査する最も重要な段階の一つは、その特異性を測定することである。一次スクリーニングにおいて、「標的」発現ヌクレオチド配列に対して所望の効果を有する「該当」化合物又は薬剤が同定されたら、次いで、他の発現ヌクレオチド配列に関してどのような効果を有するかをみる試験が行われる。化合物が他の発現ヌクレオチド配列の機能に作用する場合は、機能において、おそらくもとの「標的」発現ヌクレオチド配列と似ていることが予想される。したがって、「該当」化合物の効果を、その産物が機能において、もとの「標的」発現ヌクレオチド配列のものに似ていることが知られているか又は予想される発現ヌクレオチド配列に対して、さらなる「二次」スクリーニングにおいて試験してもよい。これらは、幾つかの基準を評価することにより、同定することができる。例えば:
1.もとの「標的」発現ヌクレオチド配列に関するヌクレオチド配列ホモロジー;
2.「標的」発現ヌクレオチド配列の産物に関するタンパク質配列又は構造のホモロジー;
3.例えば、同じリガンドに結合するなどの「標的」発現ヌクレオチド配列に関する既知の機能の類似性;
4.これまでに説明したような、同定される機能の類似性。
C.二次スクリーニング
潜在的な医薬リードを検査する最も重要な段階の一つは、その特異性を測定することである。一次スクリーニングにおいて、「標的」発現ヌクレオチド配列に対して所望の効果を有する「該当」化合物又は薬剤が同定されたら、次いで、他の発現ヌクレオチド配列に関してどのような効果を有するかをみる試験が行われる。化合物が他の発現ヌクレオチド配列の機能に作用する場合は、機能において、おそらくもとの「標的」発現ヌクレオチド配列と似ていることが予想される。したがって、「該当」化合物の効果を、その産物が機能において、もとの「標的」発現ヌクレオチド配列のものに似ていることが知られているか又は予想される発現ヌクレオチド配列に対して、さらなる「二次」スクリーニングにおいて試験してもよい。これらは、幾つかの基準を評価することにより、同定することができる。例えば:
1.もとの「標的」発現ヌクレオチド配列に関するヌクレオチド配列ホモロジー;
2.「標的」発現ヌクレオチド配列の産物に関するタンパク質配列又は構造のホモロジー;
3.例えば、同じリガンドに結合するなどの「標的」発現ヌクレオチド配列に関する既知の機能の類似性;
4.これまでに説明したような、同定される機能の類似性。
また、二次スクリーニングは、その機能がもとの「標的」のものと必ずしも関係しないか又は類似しない、あるいはその機能が未知である、広い範囲の発現ヌクレオチド配列を包含してもよい。
特に、本発明の二次スクリーニングは、次の工程を含んでもよい:
(a)本発明の第二の側面にしたがって「該当」化合物を同定し、ここで、「該当」化合物は、標的ヌクレオチド配列の発現産物の刺激に対する応答を変化させることがわかっている化合物であり;
(b)細胞集団に、標的ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし;
(c)トランスフェクトされた細胞集団に対して、前記刺激の存在下で前記該当化合物を施用し;そして、
(d)トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に前記刺激を施用し;
(e)該刺激の施用後に、トランスフェクトされた細胞集団における検出可能タグの細胞内位置を観察して、観察される細胞内局在を、刺激の存在下だが該当化合物の不存在下で、細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較する。
(a)本発明の第二の側面にしたがって「該当」化合物を同定し、ここで、「該当」化合物は、標的ヌクレオチド配列の発現産物の刺激に対する応答を変化させることがわかっている化合物であり;
(b)細胞集団に、標的ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし;
(c)トランスフェクトされた細胞集団に対して、前記刺激の存在下で前記該当化合物を施用し;そして、
(d)トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に前記刺激を施用し;
(e)該刺激の施用後に、トランスフェクトされた細胞集団における検出可能タグの細胞内位置を観察して、観察される細胞内局在を、刺激の存在下だが該当化合物の不存在下で、細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較する。
本発明のこの側面においては、スクリーニングする化合物は、刺激と共にではなく刺激の前に添加する場合が多い。これは、殆どの化合物は、細胞に浸透して効果を有するのに時間を必要とするからである。刺激を施用する前に、数分〜数時間の間化合物で細胞を化合物と共に前保温するのが通常である。ある環境においては、化合物を同時に又は刺激の後に施用することができる;これは、刺激自体が細胞の環境における変化のように長期間/遅い場合に可能である。
したがって、既にこれまでに詳細に説明したように、該当化合物が発現標識産物の細胞内局在に対していずれかの効果を有するかどうかを測定するため、細胞集団をイメージングしてもよい。そのような効果は、例えば、該当化合物の不存在下で当初観察される局在の変化、又はその発現タンパク質が位置する細胞内部位の変化の、該当化合物の存在下における、阻害又は増強であってもよい。
本発明の二次スクリーニングアッセイの操作は、これまでに詳細に説明した一次アッセイと類似している。
本発明の二次スクリーニング法は、異なるヌクレオチド配列のシリーズに関して(しかし、基本的な刺激及び該当化合物は同じである)、これまでに説明した様式において、高処理量で、並行して実施してもよい。これにより、該当化合物を、その機能がもとの標的ヌクレオチド配列と関係しているか又は類似しているものを含む、他の発現ヌクレオチド配列のシリーズに対して迅速に試験することができる。
本発明の二次スクリーニング法は、異なるヌクレオチド配列のシリーズに関して(しかし、基本的な刺激及び該当化合物は同じである)、これまでに説明した様式において、高処理量で、並行して実施してもよい。これにより、該当化合物を、その機能がもとの標的ヌクレオチド配列と関係しているか又は類似しているものを含む、他の発現ヌクレオチド配列のシリーズに対して迅速に試験することができる。
代替的アッセイ
これまでに説明したアッセイ及びスクリーニング(一次スクリーニング、化合物スクリーニング及び二次スクリーニング)は各々、調査対象のヌクレオチド配列及び検出可能タグをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターを、細胞集団にトランスフェクトする工程を含む。次いで、発現されるタグ付産物が所与の刺激のもとで細胞中に局在する変化を観察する。このアプローチに対する別法として、細胞集団に直接、検出可能タグでタグ付けされた、関心をもたれているタンパク質をトランスフェクトしてもよい。したがって、タグ付タンパク質を細胞集団外部で合成してから、本質的に知られている様式で細胞へと導入する。したがって、例えば、タグ付タンパク質は、タグ付タンパク質を抽出してから、検討すべき細胞中にトランスフェクトする前に、例えば、バクテリア又は昆虫細胞などの別の細胞タイプにおいて生成するか、あるいは合成して生成してもよい。この代替的なアプローチにしたがえば、関心をもたれているタンパク質は、これまでに詳細に説明したアッセイにしたがう。タグ付タンパク質の細胞へのトランスフェクションの方法は、本質的にはヌクレオチド配列を細胞へとトランスフェクトするために使用されるものと同じである。使用することができる商業的なトランスフェクション試薬の例は、immunofect(Immunoporation ltd.)、ProVectin(Imgenex)及びChariot(ActiveMotif)である。
これまでに説明したアッセイ及びスクリーニング(一次スクリーニング、化合物スクリーニング及び二次スクリーニング)は各々、調査対象のヌクレオチド配列及び検出可能タグをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターを、細胞集団にトランスフェクトする工程を含む。次いで、発現されるタグ付産物が所与の刺激のもとで細胞中に局在する変化を観察する。このアプローチに対する別法として、細胞集団に直接、検出可能タグでタグ付けされた、関心をもたれているタンパク質をトランスフェクトしてもよい。したがって、タグ付タンパク質を細胞集団外部で合成してから、本質的に知られている様式で細胞へと導入する。したがって、例えば、タグ付タンパク質は、タグ付タンパク質を抽出してから、検討すべき細胞中にトランスフェクトする前に、例えば、バクテリア又は昆虫細胞などの別の細胞タイプにおいて生成するか、あるいは合成して生成してもよい。この代替的なアプローチにしたがえば、関心をもたれているタンパク質は、これまでに詳細に説明したアッセイにしたがう。タグ付タンパク質の細胞へのトランスフェクションの方法は、本質的にはヌクレオチド配列を細胞へとトランスフェクトするために使用されるものと同じである。使用することができる商業的なトランスフェクション試薬の例は、immunofect(Immunoporation ltd.)、ProVectin(Imgenex)及びChariot(ActiveMotif)である。
この代替的なアプローチにおいて、本発明の一次アッセイは、ヌクレオチド配列(調査対象のヌクレオチド配列)の発現産物の細胞内局在に対する、施用される薬剤若しくは影響又は他の刺激の効果を測定するためのアッセイであって:
(i)細胞集団に、ヌクレオチド配列の発現産物をトランスフェクトし、ここで、その発現産物は検出可能タグを含み;
(ii)施用薬剤、影響又は他の刺激を、トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して施用し;
(iii)トランスフェクトされた細胞集団における検出可能タグの細胞内位置を観察し、観察された細胞内局在を、薬剤又は影響を施用していない細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較することを含む。
(i)細胞集団に、ヌクレオチド配列の発現産物をトランスフェクトし、ここで、その発現産物は検出可能タグを含み;
(ii)施用薬剤、影響又は他の刺激を、トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して施用し;
(iii)トランスフェクトされた細胞集団における検出可能タグの細胞内位置を観察し、観察された細胞内局在を、薬剤又は影響を施用していない細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較することを含む。
この代替的なアプローチにおいて、本発明の化合物スクリーニングは次のように定義される:
化合物又は薬剤をスクリーニングして、化合物又は薬剤が、発現されるヌクレオチド配列の産物の施用される刺激に対する予め確立された応答に影響を与えるかどうかを測定するためのアッセイであって:
(i)細胞集団に、ヌクレオチド配列の発現産物をトランスフェクトし、ここで、その発現産物は検出可能タグを含み;
(ii)前記刺激を、前記化合物又は薬剤の存在下で、トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して施用し;そして、
(iv)前記化合物又は薬剤の存在が、発現されるタグ付産物の細胞内の転座又は細胞内局在に影響を与えるかどうかを観察し;
その際、該発現産物が前記施用される刺激の影響下で転座する能力が、上述のアッセイを用いて確立される、アッセイ。
化合物又は薬剤をスクリーニングして、化合物又は薬剤が、発現されるヌクレオチド配列の産物の施用される刺激に対する予め確立された応答に影響を与えるかどうかを測定するためのアッセイであって:
(i)細胞集団に、ヌクレオチド配列の発現産物をトランスフェクトし、ここで、その発現産物は検出可能タグを含み;
(ii)前記刺激を、前記化合物又は薬剤の存在下で、トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して施用し;そして、
(iv)前記化合物又は薬剤の存在が、発現されるタグ付産物の細胞内の転座又は細胞内局在に影響を与えるかどうかを観察し;
その際、該発現産物が前記施用される刺激の影響下で転座する能力が、上述のアッセイを用いて確立される、アッセイ。
Claims (18)
- ヌクレオチド配列(調査対象のヌクレオチド配列)の発現産物の細胞内局在に対する、施用される薬剤若しくは影響、又は他の刺激の効果を測定するためのアッセイであって:
(i)細胞集団に、調査対象のヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし、ここで、発現される複合ヌクレオチド配列の産物は、発現される検出可能タグを含むように配列され;
(ii)施用される薬剤若しくは影響、又は他の刺激を、トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して施用し;
(iii)トランスフェクトされた細胞集団における検出可能タグの細胞内位置を観察し、観察された細胞内局在を、薬剤又は影響を施用していない細胞集団における検出可能タグの細胞内局在と比較することを含むアッセイ。 - 一群のヌクレオチド配列を用いて複数回実施され、その細胞内局在が刺激により影響を受ける産物をコードするヌクレオチド配列(単数又は複数)を同定するため、各々の回において、同じ刺激を用いるが該群のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を用いる、請求項1記載のアッセイ。
- 一群のヌクレオチド配列を用いて第一の複数回実施され、その細胞内局在が該第一の刺激により影響を受ける産物をコードするヌクレオチド配列(単数又は複数)を同定するため、各々の回において、第一の刺激と、それぞれ該群のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列とを用い;そして、前記群のヌクレオチド配列を用いて第二の複数回繰り返され、その細胞内局在が該第二の刺激により影響を受ける産物をコードするヌクレオチド配列(単数又は複数)を同定するため、各々の回において、該第一の刺激とは異なる第二の刺激と、それぞれ該群のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列とを用いる、請求項1記載のアッセイ。
- アッセイが1回又は異なる刺激を用いて更に複数回繰り返される、請求項3記載のアッセイ。
- ヌクレオチド配列の発現産物の細胞内局在に対して効果を有する刺激(単数又は複数)を同定するため、各々の回で異なる刺激を用いるが同じヌクレオチド配列を用いて複数回実施される、請求項1記載のアッセイ。
- アッセイの繰り返しの少なくとも一部が並行して実施される、請求項2、3又は4に記載のアッセイ。
- 化合物又は薬剤をスクリーニングして、化合物又は薬剤が、発現されるヌクレオチド配列の産物の施用される刺激に対する予め確立された応答に影響を与えるかどうかを測定するためのアッセイであって:
(i)細胞集団に、ヌクレオチド配列と検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列を含むクローン化発現ベクターをトランスフェクトし、ここで、発現される複合ヌクレオチド配列の産物は、発現される検出可能タグを含むように配列され;
(ii)トランスフェクトされた細胞集団の少なくとも一部に対して、化合物又は薬剤の存在下で刺激を施用し;そして、
(iv)化合物又は薬剤の存在が、細胞内の発現タグ付産物の転座又は細胞内局在に影響を与えるかどうかを観察し;
その際、発現産物が施用刺激の影響下で転座する能力が、請求項1記載のアッセイを用いて確立される、アッセイ。 - アッセイが、各々の回において異なる化合物を用いて複数回実施され、更に刺激に応答してヌクレオチド配列の発現産物の細胞内局在に影響を与える化合物(単数又は複数)を同定する工程を含む、請求項7記載のアッセイ。
- アッセイの少なくとも一部が、異なる化合物を用いて、並行して実施される、請求項8記載のアッセイ。
- 各々の化合物が化合物ライブラリーの一部を含む、請求項8又は9記載のアッセイ。
- (a)請求項8、9又は10記載のアッセイにしたがって化合物を同定し、そして(b)該化合物を合成することを含む、化合物を得るための方法。
- 請求項8、9又は10記載のアッセイにしたがって同定される化合物。
- 請求項8において同定される化合物を、請求項7のアッセイにおいて使用される刺激を用いて、異なる発現ヌクレオチド配列に対してスクリーニングする、スクリーニングアッセイ。
- 化合物を、請求項7のアッセイにおいて使用される刺激を用いて、複数の異なる発現ヌクレオチド配列に対してスクリーニングする、請求項13記載のスクリーニングアッセイ。
- 個々のアッセイの少なくとも一部が並行して実施される、請求項14記載のスクリーニングアッセイ。
- 薬剤、影響又は他の刺激が、細胞集団又はその一部に対して、該細胞から予想される応答を顕在化させることができる量及び条件下で施用される、請求項1〜10及び13〜15のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 発現産物が、ヒト、動物又は植物の健康に関連する細胞の機能又は機能不全の一以上の側面に潜在的に関係していることを同定できるように、薬剤、影響又は他の刺激及び予想される応答を選択する、請求項17記載のアッセイ。
- 細胞トランスフェクション(i)が、検出可能タグでタグ付けされたタンパク質を用いて実施され、該タグ付タンパク質が、調査対象のヌクレオチド配列と該検出可能タグとをコードする複合ヌクレオチド配列の予め形成された発現産物である、請求項1〜10及び13〜17のいずれか1項に記載のアッセイの修飾。
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