JP2005515778A - 非標的核酸依存性増幅の低減:反復核酸配列の増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2002年1月31日付けで出願された米国仮特許出願第60/353,591号の利益を主張し、ここに出典明示してその全内容を本明細書の一部とみなす。
本発明は、組換えDNA技術の分野に関する。特に、本発明は、標的核酸の増幅、特に、反復核酸配列の直接的増幅のための組成物および方法を記載する。
標的核酸の存在の検出は、医学的診断法、法医学、遺伝分析および公衆衛生における多数の適用に極めて重要である。例えば、特定のDNA塩基配列の同定は、遺伝性障害の診断、疾患に対する感受性の決定、感染病の原因病原体の同定について非常に重要である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標的核酸の選択的な増幅により標的核酸の存在を検出するための高感度方法を提供する。該方法は、標的核酸セグメント、単位複製配列(amplicon)、およびポリメラーゼによる核酸セグメントの主要なコピーの反対末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの使用に依拠する。DNA合成、変性および再アニーリングの反復ラウンドは、所与の標的核酸の指数的な増幅を可能とする。
前記に概説された目的により、本発明は、非標識核酸依存性増幅を制限しつつ標的核酸を増幅する方法を提供する。好ましい具体例において、該方法は、実質的に相補的な第1および第2の鎖を含む標的核酸と、第1および第2のプライマーとを接触させ、ここに、第1のプライマーは、標的核酸の第1の鎖とハイブリダイズして、第2のプライマーは標的核酸の第2の鎖とハイブリダイズし、ここに、該ハイブリダイズしたプライマーが、それらの各々の鎖にハイブリダイズする場合にプライマー伸長できることを含むことを特徴とする。第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、その第1のプライマーの少なくとも1つのヌクレオチドを変更して、変更した残基と第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成する。その標的核酸は、引き続いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
本発明は、非標識核酸依存性増幅反応を制限しつつ標的核酸を増幅する方法および組成物を提供する。特に、本発明は、標的核酸の増幅を可能としつつ相互にハイブリダイズしたプライマーの増幅を限定するプライマーを提供する。一般的に、本発明のプライマーは、そのプライマーが相互にハイブリダイズする場合、一方のプライマーの3’末端残基が他方のプライマーの変更または変異させたヌクレオチド残基とミスマッチを形成し、かくして、プライマー伸長を防止するように変更または変異させたヌクレオチド残基を含む。本発明は、PCRバックグラウンドの低減において、および反復配列、特にテロメア反復配列を増幅および定量化するための使用を見出す。
実施例1
ヒトテロメア反復配列の直接的増幅
ゲノムDNAを標準的手順により血液試料から抽出した。定量的PCR−対−サザンブロットアプローチをテロメア測定と比較するために用いた試料は、ヒト遺伝子の連鎖マップを設立するための世界的に用いたCentre pour les Etudes du Polymorphisme Humaine (CEPH) コレクションの一部分であるユタ・ファミリーからの21名の関連性のない個人(11名の女性および10名の男性、年齢範囲61〜94歳)により提供された。精製したDNA試料は、96ウェルマイクロタイターソースプレート中で、10mM トリス−HCl、0.1mM EDTA、pH7.5中の約1.75ng/ul(最終容量 ウェル当たり300ul)まで希釈し、サーマルサイクラー中で95℃まで5分間加熱し、700×gにて短く遠心し、接着性アルミホイルで密閉し、次いで、アッセイの時まで4℃にて貯蔵した。
相対的テロメア長の決定
平均テロメア制限断片(TRF)長をSlagboomら, Am. J. Hum. Genet.55:876-882 (1994)(ここに出典明示して本明細書の一部とみなす)により記載されたごとく決定した。約0.5ugの精製した全血DNAをHaeIII制限酵素で完全に消化した。次いで、消化した試料をDNAサイズ標準と混合し、アガロースゲル上で電気泳動により分離し、次いで、ナイロン膜に移した。その膜を32P末端標識オリゴヌクレオチド(TTAGGG)7とハイブリダイズし、洗浄して非特異的に結合したプローブを除去し、1ないし5日間蛍光体プレートに曝露させ、そのプレートをPhosphorlmager (Molecular Dynamics,hic.)で走査した。次いで、テロメアプローブのブロットを取り去り、そのDNAサイズ標準のついての放射標識プローブとハイブリダイズし、洗浄し、蛍光体プレートに曝露し、次いでそのプローブを走査した。次いで、そのサイズ標準イメージおよびテロメアスメアイメージを重ねて、テロメアスメア内のサイズ間隔の位置を位置決定する。次いで、平均TRF長を平均TRF=(ΣODi)/(ΣODi/Li)[式中、Diは間隔i中のバックグラウンドを超える合計放射能であって、Liは塩基対におけるiの平均の長さである]のように計算する。この全手順は、2回行い;すなわち、各個人で決定された2つの平均TRF長の値を2つの独立した実験から得た。
Claims (30)
- a)実質的に相補的な第1および第2の鎖を含む標的核酸を第1および第2のプライマーと接触させ、ここに、該第1のプライマーは該第1の鎖にハイブリダイズして、該第2のプライマーは該第2の鎖にハイブリダイズし、ここに、該ハイブリダイズしたプライマーはそれらの各々の鎖にハイブリダイズした場合にプライマー伸長でき、かつ、ここに、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第1のプライマーの少なくとも一つのヌクレオチド残基を変更して、該変更した残基と該第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し;次いで、
b)ポリメラーゼ連鎖反応により標的核酸を増幅することを含むことを特徴とする標的核酸を増幅する方法。 - 第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第2のプライマーの少なくとも一つのヌクレオチド残基を変更して、該第2のプライマーの該変更した残基と該第1のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基間のミスマッチを生成させることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 標的核酸の反復領域内の反復ユニットを増幅する方法であって、
a)実質的に相補的な第1および第2の鎖を含む標的核酸を第1および第2のプライマーと接触させ、ここに、該第1のプライマーは該第1の鎖の少なくとも一つの反復ユニットにハイブリダイズして、該第2のプライマーは該第2の少なくとも一つの反復ユニット鎖にハイブリダイズし、ここに、該ハイブリダイズしたプライマーはそれらの各々の鎖にハイブリダイズした場合にプライマー伸長でき、かつ、ここに、該第1のプライマーの少なくとも一つのヌクレオチド残基を変更して、該変更した残基と該第1の鎖の少なくとも一つの反復ユニットのヌクレオチド残基との間にミスマッチを生成し、ここに、該変更した残基は、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合に、該第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基とミスマッチも生成し;次いで、
b)ポリメラーゼ連鎖反応により標的核酸を増幅することを含むことを特徴とする該方法。 - 該第2のプライマーの少なくとも1つのヌクレオチド残基を変更して、該第2のプライマーの該変更した残基と該第2の鎖の少なくとも1つの反復ユニットのヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し、ここに、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第2のプライマーの該変更した残基は該第1のプライマーの3’末端ヌクレオチドとミスマッチも生成することを含むことを特徴とする請求項3記載の方法。
- 標的核酸の反復領域内の反復ユニットを増幅する方法であって、
a)実質的に相補的な第1および第2の鎖を含む標的核酸を第1および第2のプライマーと接触させ、ここに、該第1のプライマーは該第1の鎖の1を超える反復ユニットにハイブリダイズして、該第2のプライマーは該第2の鎖の1を超える反復ユニットにハイブリダイズし、ここに、該ハイブリダイズしたプライマーはそれらの各々の鎖にハイブリダイズした場合にプライマー伸長でき、かつ、ここに、該第1のプライマーのヌクレオチド残基を変更して、該変更した残基と該第1の鎖の各反復ユニットの同一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し、ここに、該変更した残基は、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合に、該第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基とミスマッチも生成し;次いで、
b)ポリメラーゼ連鎖反応により標的核酸を増幅することを含むことを特徴とする該方法。 - 該第2のプライマーのヌクレオチド残基を変更して、該第2のプライマーの該変更した残基と該第2の鎖の各々の反復ユニットの同一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し、ここに、該第2のプライマーの該変更した残基は、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第1のプライマーの3’末端ヌクレオチドとミスマッチも生成することを含むことを特徴とする請求項5記載の方法。
- 該第1および第2のプライマーが、該反復ユニットにハイブリダイズしない5’末端配列をさらに含むことを特徴とする請求項3、4、5または6のいずれか1記載の方法。
- 該ミスマッチが、該反復ユニットの隣接するヌクレオチド位置にあることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 該ミスマッチが、該反復ユニットの隣接しないヌクレオチド位置にあることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 該反復ユニットが6ヌクレオチドリピートを含むことを特徴とする請求項3、4、5または6のいずれか1記載の方法。
- 該反復ユニットが5ヌクレオチドリピートを含むことを特徴とする請求項3、4、5または6のいずれか1記載の方法。
- 該反復ユニットが4ヌクレオチドリピートを含むことを特徴とする請求項3、4、5または6のいずれか1記載の方法。
- 該反復ユニットがテロメア反復ユニットを含むことを特徴とする請求項4または6記載の方法。
- 該第1のプライマーが配列番号:1よりなり、かつ該第2のプライマーが配列番号:2よりなることを特徴とする請求項13記載の方法。
- 該第1のプライマーが配列番号:8よりなり、かつ該第2のプライマーが配列番号:9よりなることを特徴とする請求項13記載の方法。
- さらに増幅産物の量(T)を測定することを含む、請求項3、4、5または6のいずれか1記載の標的核酸の反復領域内の反復ユニット数を決定する方法。
- 該測定が、リアルタイム定量的PCRによることを特徴とする請求項16記載の方法。
- さらに、a)既知のコピー数(S)の標的核酸を増幅し;次いで
b)T/S比を測定して、反復ユニットコピー数を決定する
ことを含むことを特徴とする請求項16記載の方法。 - 癌を診断するための請求項18記載の方法。
- 細胞老化を診断するための請求項18記載の方法。
- 第1および第2のプライマーを含み、ここに、該第1のプライマーは該第1の鎖にハイブリダイズして、該第2のプライマーは該第2の鎖にハイブリダイズし、ここに、該プライマーは、それらの各々の鎖にハイブリダイズした場合にプライマー伸長でき、かつ、ここに、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第1のプライマーの少なくとも一つのヌクレオチド残基を変更して、該変更した残基と該第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成する、実質的に相補的な第1および第2の標的鎖を含む標的核酸を増幅するための組成物。
- 第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第2のプライマーの少なくとも一つのヌクレオチド残基を変更して、該第2のプライマーの該変更した残基と該第1のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基間のミスマッチを生成させる請求項21記載の組成物。
- 第1および第2のプライマーを含み、ここに、該第1のプライマーは該第1の鎖の少なくとも一つの反復ユニットにハイブリダイズして、該第2のプライマーは該第2の少なくとも一つの反復ユニット鎖にハイブリダイズし、ここに、該プライマーはそれらの各々の鎖にハイブリダイズした場合にプライマー伸長でき、かつ、ここに、該第1のプライマーの少なくとも一つのヌクレオチド残基を変更して、該変更した残基と該第1の鎖の少なくとも一つの反復ユニットとの間のミスマッチを生成し、ここに、該変更した残基は、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基とミスマッチも生成する、実質的に相補的な第1および第2の標的鎖を含む標的核酸の反復領域内の反復ユニットを増幅するための組成物。
- 該第2のプライマーの少なくとも1つのヌクレオチド残基を変更して、該第2のプライマーの該変更した残基と該第2の鎖の少なくとも1つの反復ユニットのヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し、ここに、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第2のプライマーの該変更した残基は該第1のプライマーの3’末端ヌクレオチドとミスマッチも生成する、請求項23記載の反復領域内の反復ユニットを増幅するための組成物。
- 第1および第2のプライマーを含み、ここに、該第1のプライマーは該第1の鎖の反復ユニットにハイブリダイズして、該第2のプライマーは該第2の鎖の反復ユニットにハイブリダイズし、ここに、該プライマーはそれらの各々の鎖にハイブリダイズした場合にプライマー伸長でき、かつ、ここに、該第1のプライマーのヌクレオチド残基を変更して、該変更した残基と該第1の鎖の各反復ユニットの同一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し、ここに、該変更した残基は、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第2のプライマーの3’末端ヌクレオチド残基とミスマッチも生成する、実質的に相補的な第1および第2の標的鎖を含む標的核酸の反復領域内の反復ユニットを増幅するための組成物。
- 該第2のプライマーのヌクレオチド残基を変更して、該第2のプライマーの該変更した残基と該第2の鎖の各々の反復ユニットの同一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド残基との間のミスマッチを生成し、ここに、該第2のプライマーの該変更した残基は、第1および第2のプライマーが相互にハイブリダイズする場合、該第1のプライマーの3’末端ヌクレオチドとミスマッチも生成する、請求項25記載の反復領域内の反復ユニットを増幅するための組成物。
- 該第1および第2のプライマーが、該反復ユニットにハイブリダイズしない5’末端配列をさらに含む請求項21、22、23、24、25または26のいずれか1記載の組成物。
- 該反復ユニットがテロメア反復ユニットを含む請求項24または26記載の反復領域内の反復ユニットを増幅させるための組成物。
- 該第1のプライマーが配列番号:1よりなり、かつ該第2のプライマーが配列番号:2よりなる請求項28記載の該テロメア反復ユニットを増幅させるための組成物。
- 該第1のプライマーが配列番号:8よりなり、かつ該第2のプライマーが配列番号:9よりなる請求項28記載の該テロメア反復ユニットを増幅させるための組成物。
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