JP2005514957A - 遺伝子発現を調節するための核膜および核ラミナ結合キメラ - Google Patents

Abstract

本発明は、核膜および／または核ラミナ結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、核酸標的特異的キメラタンパク質に関する。これらのタンパク質を、それらのタンパク質をコードする核酸と同様に、選択された遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートする方法において使用することができる。該ＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰｓ）もしくは人工のジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰｓ）に由来するものである。遺伝子調節のための分子スイッチシステムも提供される。

Description

発明の分野
本発明は、核膜および／または核ラミナ結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む、核酸標的特異的キメラタンパク質に関する。これらのタンパク質と、タンパク質をコードする核酸も同様に、遺伝子発現を調節するための方法において使用することができ、特に、選択された標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートするために有用である。該ＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰｓ）もしくは人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰｓ）由来のものである。本発明は、遺伝子抑制および抑制解除のための、分子スイッチシステムにも関する。

発明の背景
遺伝子の転写抑制は、機構の多様性によって達成されることができる。標準的な例は、ｌａｃリプレッサーであり、ｌａｃオペロン上の標的配列に結合すると、ＲＮＡポリメラーゼの結合およびそれによる転写開始を妨げるものである。真核生物において、遺伝子抑制を制御するさらなる機構が存在する。例えば、構成的なヘテロクロマチン中にある遺伝子は、転写的にサイレントである。ヘテロクロマチンは、無作為に配置されているのではなく、核の周辺部と関連しているようであり[Cohen et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:41-47]、遺伝子をヘテロクロマチンの近く、または核周辺部に持っていくことは、少なくとも部分的に、遺伝子抑制において役割を果たしていることを示唆している。

真核生物において、転写リプレッサーも、核周辺部で見いだされている。いくつかの場合において、かかるタンパク質は、核周辺部に局在するときのみ、リプレッサーとしての活性があるようである。高等真核生物（後生動物および上記）の核周辺部は、内および外膜のある核膜（ＮＥ）ならびに核ラミナから構成される。核ラミナは、内側の核膜の直下にあり、ラミンと呼ばれる中間径フィラメント、およびラミナ結合タンパク質（ＬＡＰｓ）より構成される。あるＬＡＰｓは、内側の核膜の膜タンパク質でもある。様々な種の核ラミナの組成についての議論は、Cohen et al.において行われている。

Ｏｃｔ−１は、加齢関連コラゲナーゼ遺伝子のリプレッサーである。Ｏｃｔ−１の核周辺部からの解離がコラゲナーゼ遺伝子の発現を誘導することを、実験的証拠は示す[Imai et al. (1997) Mol. Biol. Cell 8: 2404-2419]。さらに、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）活性型が、転写因子Ｅ２Ｆに結合すると、複合体はｉｎ ｖｉｖｏにおいて核周辺部にラミンＡ／Ｃと共存して、転写を抑制する[Mancini et al. (1999) Dev. Biol. 215: 288-297]。マウスジャームセルレス（germ-cell-less）タンパク質（ＧＣＬ）は、同様に遺伝子抑制に関与し[Nili et al. (2001) J. Cell. Sci. 114: 3297- 3307]、核ラミナにおいてＬＡＰ２３に結合することが報告されている(Cohen et al.)。

転写因子および他のＤＮＡ結合タンパク質は、遺伝子発現を調節するために配列特異的な方法で標的に結合し、それによって標的遺伝子の発現を促進もしくは抑制する。遺伝子発現の調節は、時間的（例えば、発生もしくは細胞周期の異なる時期に）および／または空間的に（例えば、異なる組織において）達成されうる。いくつかの例では、特定の時期または特定の細胞の種類において、望ましくない遺伝子の発現を止めることが望ましいだろう。例えば、発癌に関連し、活性化される遺伝子は、抑制の標的となってもよい。ヘテロクロマチンおよび核周辺部に局在する遺伝子が、サイレンスにされることが知られているため、遺伝子を核周辺部に結合させる配列特異的な方法によって、その標的遺伝子の発現をサイレンスにするあるいはダウンレギュレート（抑制）する方法への道が提供されるだろう。あるいは、遺伝子を抑制状態から解放する（すなわち、それらの遺伝子を抑制解除もしくは活性化する）方法も、価値があるだろう。

しかし、既知の転写因子には、限られた有用性しかない――かかるタンパク質は、本来の標的配列に関連した遺伝子の制御、または密接に関連した標的配列の限られたセットには有用である。この欠点を克服するための１つの方法は、大きく複雑なゲノム中の、特に、単一の標的配列への配列特異性があらかじめ決定された、ＤＮＡ結合タンパク質を設計し、構築することである。かかる操作に従うことが示されたタンパク質の１つの特定のクラスが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰｓ）である。

ＺＦＰは、ＺＦＰ中のそれぞれのジンクフィンガーのαヘリックスにおける特定のアミノ酸と、標的配列との相互作用によって、ＤＮＡを認識し、結合する、周知のＤＮＡ結合タンパク質である。ＺＦＰは、典型的には、３から９個、時にはそれ以上のジンクフィンガーを含み、ＺＦＰの多くのクラスが存在する；レビューのために、例えば、Laity et al. (2001) Curr. Opin. Struct. Biol. 11: 39-46を参照。ＺＦＰのＣｙｓ_２Ｈｉｓ_２クラスは、広く研究されており、特に、あらかじめ決定されたＤＮＡ標的配列に結合する、人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰｓ）の設計を許容する普遍的な認識コードの開発において、有用であることが証明されている。例えば、Wolfe et al. (2000) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29: 183-212; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416; Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2758-2763; Kim et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2812-2817; および２００１年７月２３日、タカシセラに付与された、「ジンクフィンガードメイン認識コードおよびそれらの使用（Zinc Finger Domain Recognition Code and Uses Thereof）」という名称の米国特許出願第09/911,261号を参照にする。

ＡＺＰの入手可能性によって、既知の調節配列だけでなく、あらゆるユニークな配列に結合する、標的遺伝子を調節できるタンパク質の設計が可能となった。これらのＡＺＰ（もしくは他のＤＮＡ結合タンパク質）が、１つもしくはそれ以上の、核周辺部に結合できるタンパク質ドメインと結合する場合、標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を結合するために使用できるキメラタンパク質が生成し、その標的遺伝子を、サイレンシングもしくはダウンレギュレーションのために、核周辺部に局在させる。これらのキメラタンパク質のドメインが、分子スイッチシステムに再構成される場合、遺伝子発現の活性化もしくは抑制のいずれかのための、システムを提供することが可能である。

発明の概要
本発明は、標的遺伝子に関連するヌクレオチド配列に特異的に結合できる１つもしくはそれ以上の第１ドメインを有し、核周辺部に会合もしくは結合することのできる、１つもしくはそれ以上の第２ドメインを有する、核酸標的特異的なキメラタンパク質に関する。これらのタンパク質は、遺伝子発現調節において有用である。多数の第１および第２ドメインが、好ましくは、１から５のさらなるドメインも、本発明のキメラタンパク質中に存在しうる。好ましい第１ドメインは、ＡＺＰであり、好ましい第２ドメインは、ＧＣＬタンパク質である。ある具体例において、キメラタンパク質は、細胞の取り込みおよび／または核への輸送を容易にするために、さらなるドメインを含むことができる。

本発明の他の態様は、本発明のキメラタンパク質をコードする、単離された核酸、それらの核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターで（あらゆる方法によって）形質転換されたホスト細胞を提供する。かかるホスト細胞を、例えば、キメラタンパク質を発現する条件下で、ホスト細胞を一定時間培養して、次いで、キメラタンパク質を回収することにより、キメラタンパク質を調製する方法において、使用することができる。さらに、該ホスト細胞を、発現ベクターのソースとして使用して、細胞もしくは生物への遺伝子移入法によって、キメラタンパク質を送達することができる。さらに、本発明は、これらのキメラタンパク質、核酸および発現ベクターの医薬組成物を提供する。

本発明のさらなる態様は、標的核酸（標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有する）を本発明のキメラタンパク質と、タンパク質が標的核酸に結合するのに十分な量および時間にて、接触させることによって、標的核酸を本発明のキメラタンパク質と結合させる方法に関する。好ましい具体例において、該キメラタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏ結合のために、核酸を介して、細胞へ導入される。あるいは、該方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイに使用することのできるキメラタンパク質を提供する。

本発明のさらなる態様は、標的遺伝子に関連した、もしくは十分近いヌクレオチド配列を含む核酸を、本発明のキメラタンパク質と、適切な対照に比べて標的遺伝子の発現レベルが減少するのに十分な量および時間にて接触させることを含む、標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートするための方法を提供する。ある態様において、該キメラタンパク質は、タンパク質、もしくは該タンパク質をコードする核酸として、細胞もしくは生物に導入される。

企図される標的核酸の結合方法、もしくは企図される遺伝子発現の抑制方法において、標的遺伝子は、植物遺伝子、哺乳類遺伝子、昆虫遺伝子、酵母遺伝子もしくはＤＮＡウイルスのごときウイルス由来のものをコードするか、あるいは、標的となったヌクレオチド配列部位は、それらに由来するか、それらを制御する。標的遺伝子が哺乳類に由来する場合、それは、サイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、抗血管新生因子、薬物耐性遺伝子および／または、選択された遺伝子を核周辺部の近くにもっていくことによって、サイレンスする、あるいはダウンレギュレートすることのできる、あらゆる他の所望の標的をコードする、または制御する。目的の植物遺伝子は、トマト、トウモロコシ、コメおよび穀物用植物の遺伝子を含むが、それらに限定されない。さらに、共通の核酸標的配列を共有する多数の標的遺伝子は、調和して、もしくは同時に制御されることができる。

本発明のさらなる態様は、遺伝子抑制に有用な、分子スイッチシステムに関する。これらのシステムは、（ａ）標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合することのできる第１ドメイン、および２価のリガンドの第１結合部分に特異的に結合することができる第２ドメインを含む第１の融合タンパク質であって、ここに該リガンドが細胞によって取り込まれうるものであり、かつ第１ドメインおよび第２ドメインが、それぞれ異種であり；（ｂ）核周辺部に結合できる第１ドメイン、および２価のリガンドの第２の結合部位に特異的に結合することができる第２ドメインを含む第２の融合タンパク質を含む。第１の融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第１ドメインと同じものであり；第２の融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第２ドメインと同じものである。２つの融合タンパク質の第２ドメインは、それぞれの２価のリガンドの結合部分に対する特異性のある、抗体の１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）であってもよい。

本発明の他の態様は本発明の遺伝子抑制のための、融合タンパク質をコードする単離された核酸、それらの核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターで（あらゆる方法によって）形質転換されたホスト細胞を提供する。かかるホスト細胞を、融合タンパク質を発現する条件下で、ホスト細胞を一定時間培養して、次いで、融合タンパク質を回収することにより、融合タンパク質を調製する方法において、使用することができる。さらに、該ホスト細胞を、発現ベクターのソースとして使用して、細胞もしくは生物への遺伝子移入法によって、融合タンパク質を送達することができる。さらに、本発明は、これらの融合タンパク質の医薬組成物、分子スイッチシステム、核酸および発現ベクターを提供する。

遺伝子抑制に有用な分子スイッチは、（ａ）これらの分子スイッチシステムと、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有する標的核酸を含む細胞もしくは生物を接触させること；および（ｂ）融合タンパク質間で複合体形成を可能にし、そのことによって、標的遺伝子を核周辺部に局在させることにより、前記標的遺伝子の発現を抑制することができる時間もしくは場所にて、分子スイッチシステムの２価のリガンドと、細胞もしくは生物を接触させることによって、標的遺伝子の発現を，時間的もしくは空間的に抑制する方法において使用されることができる。この分子スイッチシステムの融合タンパク質は、タンパク質として、１つもしくはそれ以上の該タンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸として、またはそれらの組み合わせとして、細胞もしくは生物へ導入されることができる。

本発明のさらにもう一つの態様は、遺伝子抑制解除、すなわち、抑制された遺伝子の活性化に有用な分子スイッチシステムに関する。これらのシステムは、（ａ）標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合することのできる第１ドメイン、および結合相手に特異的に結合することができる第２ドメインを含む第１の融合タンパク質であって、ここに第１ドメインおよび第２ドメインが、それぞれ異種であり；（ｂ）核周辺部に結合できる第１ドメイン、および前記第１の融合タンパク質の第２ドメインの結合相手を含む第２ドメインを含み、前記第１ドメインが、前記第２ドメインについて異種である第２の融合タンパク質を含む。第１の融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第１ドメインと同じものであり；第２の融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第２ドメインと同じものである。第１の融合タンパク質の第２ドメインは、Ｓ−タンパク質（S-protein）であってもよく、前記第２の融合タンパク質の第２ドメインは、Ｓ−タグ（S-tag）であってもよく、または逆であってもよい。

本発明の他の態様は、本発明の遺伝子抑制解除のための、これらの融合タンパク質をコードする単離された核酸、それらの核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターで（あらゆる方法によって）形質転換されたホスト細胞を提供する。かかるホスト細胞を、融合タンパク質を発現する条件下で、ホスト細胞をしばらく培養して、次いで、融合タンパク質を回収することにより、融合タンパク質を調製する方法において、使用することができる。さらに、該ホスト細胞を、発現ベクターの原料として使用して、細胞もしくは生物への遺伝子移入法によって、融合タンパク質を送達することができる。さらに、本発明は、これらの融合タンパク質の医薬組成物、分子スイッチシステム、核酸および発現ベクターを提供する。

遺伝子抑制解除に有用な分子スイッチは、（ａ）これらの分子スイッチシステムと、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有する標的核酸を含む細胞もしくは生物を接触させること；および（ｂ）第１および第２の融合タンパク質の複合体を分裂させ、そのことによって、前記標的遺伝子の発現を抑制解除する時間もしくは場所にて、分子スイッチシステムのリガンドと、細胞もしくは生物を接触させることによって、時間的もしくは空間的に、標的遺伝子の発現を変化させる方法において使用されることができる。この分子スイッチシステムの融合タンパク質は、タンパク質として、１つもしくはそれ以上の該タンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸として、またはそれらの組み合わせとして、細胞もしくは生物へ導入されることができる。

発明の詳細な説明
Ａ．本発明のキメラタンパク質
本発明は、標的遺伝子を核周辺部に導き、その結果、その遺伝子の発現をサイレンスもしくはダウンレギュレートすることによって、遺伝子の発現を抑制するための、標的特異的なキメラタンパク質に関する。該キメラタンパク質は、少なくとも２つの異種ドメイン：標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を特異的に結合させることのできる第１ドメイン、および核膜、核ラミナ、ヘテロクロマチン、もしくはそれら３つのいずれかの組み合わせにおいて、もしくはその中で、タンパク質に結合するもしくはタンパク質と会合することによって、核周辺部と会合することができる第２のドメインを含む。本発明のキメラタンパク質は、遺伝子発現の調節、特に、選択された遺伝子の発現の抑制もしくはダウンレギュレートにおいて、有用である。例えば、癌、細胞の増殖および再生、血管形成（腫瘍のような、望ましくない血管形成が起こる場合）に、あるいは特定の発生もしくは成長段階の植物において関与する遺伝子をダウンレギュレートもしくは停止することが、望ましいであろう。同様に、本発明のキメラタンパク質を、ウイルス遺伝子をダウンレギュレートもしくは停止するために使用することができる。

本明細書中で使用される、「核周辺部」という語は、核膜および核ラミナを含む。核周辺部の近くにある遺伝子とは、物理的に核周辺部に隣接しており、本発明に従えば、タンパク質と（共有結合的もしくは非共有結合的な）会合体を形成することによって配置され、核膜、核ラミナまたは核膜もしくは核ラミナと会合したヘテロクロマチンと結合するかそれらの１部分を形成するものである。本発明の目的のために、核周辺部に関連した遺伝子の物理的位置を決定する必要はないが、むしろ、正常な発現レベル、もしくは発現の対照レベルに対する遺伝子発現の減少を測定および使用して、遺伝子が核周辺部にあるかまたはその近くにあるかを評価することができる。

本明細書中で使用される、「キメラタンパク質」もしくは「キメラタンパク質(複数形)」という語は、本発明のタンパク質が、天然に存在しないタンパク質であることを示すために使用される。本発明のタンパク質は、核酸結合ドメインおよび核周辺部と会合できるドメインであって、異なるソースに由来する、すなわち、２つのドメインがそれぞれ異種であるものを組み合わせた人工的な構築物である。多数のドメインが存在する場合、１つの核酸結合ドメインが、核周辺部と会合できるドメインと異なるソースに由来すれば十分である。異種ドメインのソースは、いずれの組み合わせも天然のタンパク質を生じるものでなく、独立して、異なる種、生物の異なる株、単一の生物の異なるタンパク質、もしくは所望の活性を有するように設計された人工的なタンパク質に由来してもよい。

該キメラタンパク質の核酸結合ドメインは、標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列に特異的に結合する。そのドメインの同一性および特徴は、キメラタンパク質によって結合されることが望ましいヌクレオチド配列によって決定される。本明細書中で使用される、「特異的に結合する」とは、例えば、温度、イオン強度、溶媒の極性等のごとき特定の条件のセットの下での、他のヌクレオチド配列への結合または会合よりも検出可能でより大きな程度（例えば、少なくともバックグラウンドの１．５倍）での、DNA結合部分もしくはタンパク質（例えば、タンパク質全体として、ドメインとして、もしくは本発明のキメラタンパク質に存在するものとして）の特定のヌクレオチド配列との結合または会合を意味し、それに対する言及を包含し、かつ、他のヌクレオチド配列の実質的排除を意味し、それに対する言及を包含する。当業者によく知られた、ゲルシフトアッセイは、結合が特定のヌクレオチド配列に特異的であるかを評価および証明するために、有用な１つの方法である。

標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列の性質および位置を制御することが可能である。本明細書中で使用される、「標的ポリヌクレオチド」「標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列」もしくは「標的にされたヌクレオチド配列」または他の類似用語は、２本鎖ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡの部分であって、キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメインが結合するものをいう。標的ヌクレオチド配列は、その標的遺伝子の発現を抑制するのに適した場所を提供する、あらゆる場所、調節される標的遺伝子の近くもしくはその内部であってもよい。例えば、標的ヌクレオチド配列は、コード領域内、それらのすぐ上流もしくは下流であってもよく、あるいは、選択されたヌクレオチド配列が依然として遺伝子を核周辺部に十分近いところに持ってくる結果、当該遺伝子の発現をその正常または他の制御されたレベルよりも低下させる場合には、標的ヌクレオチド配列は幾分離れたところ（例えば、数百ヌクレオチド）にあってもよい。標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の既知の転写制御エレメントの全部もしくは一部であってもよい。

標的ヌクレオチド配列の長さは、６−１０ヌクレオチドから、約５０、６０、７０もしくはそれ以上のヌクレオチドにわたってもよい。適当なヌクレオチド配列の長さの例は、約８から約３０、約１０から約２５、および約１０から約２０ヌクレオチドである。約１６ヌクレオチドの長さは、ヒトのゲノムにおいて、単一の標的部位を提供するのに十分である。ＤＮＡ結合ドメインの特異性および親和性、標的となる生物および配列の性質は、全て、標的ヌクレオチド配列の適切な長さを決定する際の要素となりうる。当業者なら、かかる考察に基づいて、標的ヌクレオチド配列の長さおよび同一性を、容易に決定できる。

キメラタンパク質の核酸結合ドメインは、既知もしくは人工的なＤＮＡ結合タンパク質またはDNA結合活性を有するそれらの断片であってもよい。ＤＮＡ結合タンパク質の例は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰｓ）、人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰｓ）、転写因子のＤＮＡ結合部分、核ホルモン受容体、のごときホメオボックスドメインタンパク質、ラムダリプレッサー、ｔｅｔリプレッサー、Ｇａｌ４、ＴＡＴＡ結合タンパク質のごときヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフタンパク質、ｍｙｃおよびｍｙｏＤのごときヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎのごときロイシンジッパー型タンパク質、ならびにｍｅｔ、ａｒｃおよびｍｎｔリプレッサーのごときβ−シートモチーフタンパク質、またはそれらのタンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分を含むが、それらに限定されない。かかるタンパク質および部分は、当業者に知られている。

本発明の核酸結合ドメインに好ましいＤＮＡ結合タンパク質は、ＺＦＰおよびＡＺＰである。ＺＦＰには多くのクラスがあり、Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２クラス（例えば、ＳｐＩＣおよびＺｉｆ２６８）、Ｃｙｓ_６（例えば、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合タンパク質）ならびにＣｙｓ_４（例えば、エストロジェンホルモン受容体）を含むがそれらに限定されない；所望のヌクレオチド配列特異性を有するこれらのタンパク質のいずれかを使用することができる。

「ジンクフィンガータンパク質」「ジンクフィンガーポリペプチド」「ＺＦＰ］「人工的なジンクフィンガータンパク質」もしくは「ＡＺＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するポリペプチドを意味する。典型的に、「フィンガー」として示され、個々のＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＰもしくはペプチドが、少なくとも１つのフィンガー、典型的には２つのフィンガー、より好ましくは３つのフィンガー、またはさらに好ましくは４つもしくは５つのフィンガー、６つもしくはそれ以上のフィンガーを有する。それぞれのフィンガーは、ＤＮＡの３もしくは４塩基対を結合する。Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２クラスのＺＦＰおよびＡＺＰにおいて、それぞれのフィンガーは、典型的に、約３０アミノ酸の、亜鉛を配位した、ＤＮＡ結合部分ドメインである。Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２クラスの代表的な配列モチーフは、-Cys-(X)_2-4-Cys-(X)_l2-His-(X)_3-5-Hisであり、ここに、Xはいずれのアミノ酸でもよい（配列番号１）。２つの不変のヒスチジン残基および２つの不変のシステイン残基は、亜鉛イオンを結合する[例えば、Berg et al. (1996) Science 271:1081-1085を参照]。

本発明の１つの具体例において、該キメラタンパク質は、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むAZPである第１ドメインを有し、それぞれのフィンガーは式 -X₃-Cys-X_2-4-Cys-X₅-Z^-1-X-Z²-Z³-X₂-Z⁶-His-X_3-5-His-X₄-（配列番号２）であり、ここに、複数のフィンガーが存在する場合には、独立して、それらは０ないし１０個のアミノ酸残基でもって互いに共有結合し、Xはいずれかのアミノ酸を表し、Ｘｎはポリペプチド鎖中に存在するＸの数を表し、Ｚ^−１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^６は、表１および２に示される（そしてさらに後で説明される）認識コードによって決定される。

Ｘによって示されるアミノ酸は、ジンクフィンガーの骨格を形成し、既知のジンクフィンガー骨格、一致した骨格、これらの骨格のいずれかの配列を変化させることによって得られる骨格、またはあらゆる人工的な骨格であってもよい。好ましい既知の骨格は、それぞれのＸの同一性を決定するために使用される。ある具体例において、Ｘを決定するための骨格は、Sp1、Sp1CもしくはZif268である。好ましい具体例において、骨格は、配列が-Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Z^-1-Ser-Z²- Z³-Leu-Gln-Z⁶-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly-Glu-Lys-（配列番号３）である、Sp1C ドメイン２（すなわち、Ｓｐ１Ｃの中指）配列を有する。かかるＡＺＰは、２００１年７月２３日、セラタカシ出願の米国特許出願第09/911,261号により詳細に記載されている。

本発明のＡＺＰは、３、４、５、６、７、８もしくは９個のフィンガーを有するＺＦＰと同様に、３から４０個のジンクフィンガー、３から１５個のフィンガー、３から１２個のフィンガー、３から９個のフィンガー、もしくは３から６個のフィンガーを含むことができる。

上記の式において、Ｚ^−１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^６として設計される該ジンクフィンガーの４つの核酸接触残基は、ＤＮＡ結合の特異性および親和性の決定に主に関与する。これらの４つのアミノ酸残基は、塩基接触アミノ酸として示されてもよい。これら４つの残基は、第１のコンセンサスヒスチジンおよびコンセンサスシステインに対して同じ位置にある。第１の残基は、第１の一致したヒスチジンのＮ末端側に７残基、第２のシステインのＣ末端側に６残基のところである。第１の残基は、「−１ポジション」としても示され、ジンクフィンガー中のα−ヘリックスのＮ末端にすぐ隣接した残基を示すことから、そのように言われている（よってポジション１は、α−ヘリックスの第１のＮ末端残基である）。他の３つのアミノ酸は、αヘリックスのポジション２、３および６にあり、それぞれ「２ポジション」「３ポジション」および「６ポジション」として示される。これら４つのポジションは、Ｚ^−１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^６として、互換的に本明細書中で示される。

認識コードの表は、所定のヌクレオチド配列について、Ｚ^−１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^６の同一性を決定する方法を提供する。認識コード表（ヌクレオチド配列のそれぞれ４塩基対について）において、 塩基は常に５’から３’の順に提供される。しかし、第４の塩基は、常に、標的配列において提供される第４の塩基の相補である。例えば、標的配列が、ATCCと書かれているならば、標的配列のセンス鎖が5'-ATCC-3'であって、アンチセンス鎖が3'-TAGG-5'であることを意味する。従って、センス鎖の配列ATCCが、以下の表１のアミノ酸に翻訳された場合、第１塩基のＡは、ポジション６にグルタミンがあることを意味し、第２塩基のＴは、ポジション３にセリンがあることを意味し、第３塩基のＣは、ポジション−１にグルタミン酸があることを意味する。しかし、Ｃとして書かれた第４塩基については、表中にあるＣの相補鎖、すなわちＧが、ポジション２のアミノ酸の同定に使用される。この場合、ポジション２のアミノ酸はセリンである。

表１および２は、本発明において有効である、ＡＺＰのための、好ましい、選択的な認識コード表を、それぞれ一覧形式にて提供する：

表２において、それぞれのマスに示されたアミノ酸の順は、左から右方向に、その場所において、より好ましい−あまり好ましくないアミノ酸を示している。

これらの認識コード表は、以下のように記載されていてもよい。ＡＺＰのための好ましい認識コード表（表１に相当する）は、各４塩基標的配列のためのものであり、５’から３’の順になっている：
(i) 第１塩基がＧならば、Ｚ^６はアルギニンであり、
第１塩基がＡならば、Ｚ^６はグルタミンであり、
第１塩基がＴならば、Ｚ^６はスレオニン、チロシンもしくはロイシンであり、
第１塩基がＣならば、Ｚ^６はグルタミン酸であり
(ii) 第２塩基がＧならば、Ｚ^３はヒスチジンであり、
第２塩基がＡならば、Ｚ^３はアスパラギンであり、
第２塩基がＴならば、Ｚ^３はセリンであり、
第２塩基がＣならば、Ｚ^３はアスパラギン酸であり
(iii) 第３塩基がＧならば、Ｚ^−１はアルギニンであり、
第３塩基がＡならば、Ｚ^−１はグルタミンであり、
第３塩基がＴならば、Ｚ^−１はスレオニンもしくはメチオニンであり、
第３塩基がＣならば、Ｚ^−１はグルタミン酸であり
(iv) 第４塩基の相補塩基がＧならば、Ｚ^２はセリンであり、
第４塩基の相補塩基がＡならば、Ｚ^２はアスパラギンであり、
第４塩基の相補塩基がＴならば、Ｚ^２はスレオニンであり、および
第４塩基の相補塩基がＣならば、Ｚ^２はアスパラギン酸である。
上記の認識コード（すなわち、表１の認識コード）の好ましい具体例において、第１塩基がＴならば、Ｚ^６はスレオニンであり；第３塩基がＴならば、Ｚ^−１はスレオニンである（表１）。

別の認識コード表（表２に相当する）も、次のものとして存在しうる：
(i) 第１塩基がＧならば、Ｚ^６はアルギニンもしくはリジンであり、
第１塩基がＡならば、Ｚ^６はグルタミンもしくはアスパラギンであり、
第１塩基がＴならば、Ｚ^６はスレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであり、
第１塩基がＣならば、Ｚ^６はグルタミン酸もしくはアスパラギン酸であり
(ii) 第２塩基がＧならば、Ｚ^３はヒスチジンもしくはリジンであり、
第２塩基がＡならば、Ｚ^３はアスパラギンもしくはグルタミンであり、
第２塩基がＴならば、Ｚ^３はセリン、アラニン、バリンもしくはスレオニンであり、
第２塩基がＣならば、Ｚ^３はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり
(iii) 第３塩基がＧならば、Ｚ^−１はアルギニンもしくはリジンであり、
第３塩基がＡならば、Ｚ^−１はグルタミンもしくはアスパラギンであり、
第３塩基がＴならば、Ｚ^−１はスレオニン、メチオニン、ロイシンもしくイソロイシンはであり、
第３塩基がＣならば、Ｚ^−１はグルタミン酸もしくはアスパラギン酸であり
(iv) 第４塩基の相補塩基がＧならば、Ｚ^２はセリンもしくはアルギニンであり、
第４塩基の相補塩基がＡならば、Ｚ^２はアスパラギンもしくはグルタミンであり、
第４塩基の相補塩基がＴならば、Ｚ^２はスレオニン、バリンもしくはアラニンであり、
第４塩基の相補塩基がＣならば、Ｚ^２はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸である。

認識コード表を使用して、所定のヌクレオチド配列についてのＡＺＰを設計し、同定するために、Ｎが標的中の部分的に重複した４塩基対のセグメントの数である、３Ｎ＋１塩基対のヌクレオチド配列は、Ｎ−１のセグメントまでの、それぞれのセグメントの第４の塩基がすぐ次のセグメントの第１塩基である、部分的に重複した４塩基対のセグメントに分けられる。ジンクフィンガーにおけるＺ^−１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^６それぞれの同一性は、該認識コード表に従って決定される。

本発明に従って設計されたジンクフィンガーは、もう一方と直接共有結合的に結合するか、１−１０個のアミノ酸のリンカーによって分けられているかのいずれかである。該リンカーアミノ酸は、可動性もしくはある程度の構造的な強直性を与えることができる。リンカーの選択は、所望のＺＦＰの、同種のヌクレオチド配列への親和性によって決定されうるが、必ずしもそうではない。同種の標的配列へのＡＺＰの結合親和性を向上させるための、様々なリンカー配列を試験し最適化することは、当該技術の範囲内である。例えば、６フィンガーＺＦＰのための１つの有用な組み合わせは、アミノ酸リンカーなしで結合した始めの３つのジンクフィンガー、第３および第４フィンガー間の可動的なアミノ酸リンカー、ならびにアミノ酸リンカーなしで結合した後ろ３つのフィンガーを有するものである。この組み合わせは、他の３つのフィンガー群の結合に対する立体障害を最小化させつつ、それぞれ３つのフィンガー群が、独立してその標的配列を結合できるようにすると思われる。

１つの具体例において、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳおよびＧＧＳ（これらの配列は、ＡＺＰにおける付加的な１−１０のアミノ酸の一部となりうる；それぞれ配列番号４、配列番号４の残基２−５および配列番号４の残基３−５）を含むが、それらに限定されない可動性リンカーを用いて、他のマルチフィンガーＡＺＰに結合したマルチフィンガーＡＺＰを使用して、より長いゲノム配列が標的とされる。

さらに、本発明のキメラタンパク質の核酸結合ドメインは、単一のドメインもしくは複数のドメインのいずれかを用いて、非隣接ヌクレオチド配列に結合するように設計されてもよい。例えば、６フィンガーのＡＺＰによって結合したヌクレオチド配列は、１０塩基対の配列（３つのフィンガーによって認識される）であって、介在塩基（他の３つのフィンガーによって認識されない）を有するものであってもよい。介在塩基の数は多様であり、適切に設計されたアミノ酸リンカーで、ＡＺＰの２つの３フィンガー部分の間の介在距離を補正することができる。標的結合部位において介在する核酸塩基の範囲は、５〜１００塩基であることができ、好ましくは１０〜２０もしくはそれ以下の塩基、より好ましくは１０もしくはそれ以下であり、さらにより好ましくは６もしくはそれ以下の塩基であろう。もちろん、リンカーは、連結されたＡＺＰの部分間の読み枠を維持する。

ファージディスプレイ、ランダム変異導入法、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ／合理的設計、アフィニティーセレクション、ＰＣＲ、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築およびその類似法によって、ＺＦＰおよびＡＺＰをコードする核酸を設計し、構築する方法は既知である（例えば、米国特許第5,786,538号; Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 344-348 (1995); Jamieson et al., Biochemistry 33: 5689- 5695 (1994); Rebar & Pabo, Science 263: 671-673 (1994); Choo & Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11168-11172 (1994); Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7345-5349 (1992); Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2256-2260 (1993); Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11099-11103; Pomerantzet al., Science 267: 93-96 (1995); Pomerantz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9752-9756 (1995); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5525- 5530 (1997); Griesman & Berg, Science 275: 657-661 (1997); ２００１年７月２３日、タカシセラに付与された米国特許出願第09/911,261号(Sera出願)参照）。例えば、Sera出願には、ＡＺＰのコンビナトリアルライブラリーを得るために適応されうる、モジュラー式のＡＺＰ製造方法が記載されている。これらのＡＺＰを、標的遺伝子に、もしくはその近くに結合するＡＺＰを同定するための、スクリーニング／セレクションアッセイにおいて使用することができる。かかるＡＺＰがわかれば、それらは本発明のキメラタンパク質の第１ドメインとして働くことができる。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏの手順にかかわらず、スクリーニングもしくはセレクションの手順によって得られる、あらゆるＡＺＰ（もしくはＺＦＰ）を、ＡＺＰ（もしくはＺＦＰ）が、本発明によって意図された方法にて、標的遺伝子と特異的に結合もしくは会合するようにする、第１ドメインとして使用することができる。

本発明よると、本発明のキメラタンパク質は、多数の第１核酸結合ドメインを有することができる。かかるそれぞれのドメインは、選択されたヌクレオチド配列に特異的に結合する。かかる配列は、互いに近くても、キメラタンパク質が核周辺部に局在して、会合した標的遺伝子（gene or genes）の発現を抑制することを妨げない距離で位置していてもよい。第１ドメインが存在する場合、ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列および核周辺部の両方と、キメラタンパク質の結合体もしくは会合体が遺伝子発現を抑制する、意図された標的遺伝子に関連したあらゆる位置に存在することができる。さらなる第１ドメインを、転写抑制を促進するために、本発明のキメラタンパク質に加えることができる。該キメラタンパク質は、１つから６つの第１ドメイン、１つから３つの第１ドメイン、または１つの第１ドメインを有する。

他の転写リプレッサーの例は、ヒトＫＯＸ−Ｉタンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインを含むがそれらに限定されない(Thiesen et al., New Biologist 2: 363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22: 2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 4514-4518 (1994) )。ＫＲＡＢのコリプレッサーであるＫＡＰ−１を、ＫＲＡＢと共に使用することができる(Friedman et al., Genes Dev. 10:2067-2078 (1996))。ＫＡＰ−１もまた、単独で使用することができる。転写リプレッサーとして働く他の転写因子および転写因子ドメインは、MAD（例えば、Sommer et al., J. Biol. Chem. 273:6632-6642 (1998); Gupta et al., Oncogene 16:1149- 1159 (1998); Queva et al., Oncogene 16:967-977 (1998); Larsson et al., Oncogene :737-748 (1997); Laherty et al., Cell 89:349-356 (1997); and Cultraro et al., Mol. Cell. Biol. 17:2353-2359 (19977)参照); FKHR (横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド（forkhead in rhapdosarcoma gene）; Ginsberg et al., Cancer Res. 15:3542-3546 (1998); Epstein et al., Mol. Cell. Biol. 18:4118-4130 (1998)); EGR- I (初期成長応答遺伝子産物−１（early growth response gene product- 1）; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8298-8303 (1998); and Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)); ets2リプレッサー因子リプレッサードメイン (ERD; Sgouras et al., EMBO J. 14:4781- 4793 ((19095)); および MAD smSIN3相互作用ドメイン(SID; Ayer et al., Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781 (1996))を含む。

本発明のキメラタンパク質の第２ドメインは、核周辺部と会合することができる。この会合は、直接もしくは間接でもよく、典型的には、第２ドメインおよび１つもしくはそれ以上の核膜、核ラミナ、ヘテロクロマチンまたはそれらいずれかの組み合わせのタンパク質成分間の、タンパク質―タンパク質相互作用によってもたらされる。例えば、第２ドメインは、（１）核ラミナの成分であるタンパク質、または（２）核ラミナの成分であるタンパク質と会合したタンパク質と会合もしくは結合することができる。よって、第２ドメインは、核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質（あるいは、ラミナ会合ポリペプチドとして知られたもの）、ヘテロクロマチン結合タンパク質、これらいずれかの結合部分、前記のいずれかと会合もしくは結合できるタンパク質、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。

核膜および核ラミナ結合タンパク質（もしくはそれらの適切な結合部分）は、それぞれ、核の構造成分に直接的または間接的に結合することによって、核膜（特に核膜の内膜）または核ラミナと相互作用することが知られているか、あるいはそのように操作される。いくつかの場合、キメラタンパク質の第２ドメインは、核膜の内膜および核ラミナの両方と相互作用してもよい。好ましい核膜および／または核ラミナ結合タンパク質（またはそれらの結合部分）は、ラミン（例えば、ラミンＡ、ＢおよびＣ）およびＬＡＰ ２βのごときラミナ結合タンパク質、ＬＡＰ ２β相互作用領域（１３８−５２４アミノ酸）を含むが、それらに限定されない[Nili et al., 2001]。第２ドメインに好ましい他のタンパク質は、５２４アミノ酸のマウスＧＣＬタンパク質[Leatherman et al. (2000) Mech. Dev. 92: 145-153]、またははドロソフィラ（Drosophila）もしくは他のあらゆる哺乳類種に由来するような、他のあらゆるＧＣＬタンパク質を含む。ＧＣＬタンパク質は、ラミナ会合タンパク質（ＬＡＰ）を介して、核ラミナに間接的に結合するようである。第２ドメインに有用な他のタンパク質（もしくはそれらの結合部分）は、Ｒｂ、Ｏｃｔ−ａおよびインスリンアクチベーターＩＰＦ／ＰＤＸ１（低グルコース時に核膜に局在する）の過剰リン酸化型を含む。全ての第２ドメインについて、標的遺伝子と同種由来のドメインを選択することは有用であるかもしれない。ヘテロクロマチン結合タンパク質（もしくは結合活性を有するそれらの部分）も、本発明のキメラタンパク質における第２ドメインとして使用することができる。有用なヘテロクロマチン結合タンパク質は、ＨＰ１およびポリコーム（polycomb）群タンパク質を含むが、それらに限定されない。
).

本発明のもう１つの態様において、核コンパートメントへのタンパク質の輸送を補助するために、核局在性ポリペプチドを、本発明のキメラタンパク質に結合させることができる。核局在性ポリペプチドは、細胞質にあるタンパク質の核への輸送を容易にする。核局在性ポリペプチドを、単独で、もしくは他のドメインと連結して使用することができる。核局在性ポリペプチドの１つの例は、配列Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val（配列番号９）を有する、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のポリペプチドである。

さらに、該キメラタンパク質は、細胞へのタンパク質の輸送を補助するために、単独、もしくは核局在性ポリペプチドと連結するかのいずれかで、細胞取り込みシグナルを有することができる。かかる細胞取り込みシグナルは、ヒト免疫不全ウイルスＴａｔタンパク質の４７〜５７残基である、最小Ｔａｔタンパク質伝達ドメイン：YGRKKRRQRRR（配列番号５）；アンテナペディア（ｐＡｎｔｐ）ホメオドメインの４３〜５８残基：Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp- Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys（配列番号１０）(Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 10444-10450)；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ２２タンパク質の２６７〜３００残基：Asp-Ala-Ala-Thr- Ala-Thr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-SerAla-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu（配列番号１１）(Elliott et al. (1997) Cell 88: 223- 233)； Tyr-Ala- Arg-Ala-Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala（配列番号１２） (Ho et al. (2001) Cancer Res. 61: 474-477)、Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg（配列番号１３）、Ｒ９として知られているもの(Jin et al. (2001) Free Rad. Biol. Med. 31: 1509-1519)、および全てのＤ−アルギニン型のＲ９(Winder et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13003-13008)のごとき報告された細胞取り込みシグナル活性を有する様々な塩基性ペプチド；ならびに、血液脳関門を超えて物質を運ぶことのできるWO00/32236のポリペプチド、WO00/32237に記載の癌細胞へ抗ガン剤を運ぶことのできるポリペプチド、W002/02595の抗生ポリペプチドの両親媒性ペプチド部分、W002/053583に記載の細胞内もしくは細胞核へ負電荷の物質を輸送する両親媒性ポリペプチド、ならびに、W002/067994の鎮痛性分子のペプチドベクター部分を含むTemsamaniのグループによって記載されたポリペプチドを含むがそれらに限定されない。Temsamaniによって記載されたポリペプチドは、Ｄ−ペネトラチン（D-penetratin）（rqikiwfqnrrmkwkk；全てのアミノ酸がＤ型である）（配列番号１４）、ｐＡｎｔｐおよびそれらの活性型変種、ＳｙｎＢ１（RGGRLSYSRRRFSTSTGR）（配列番号１５）、Ｌ−ＳｙｎＢ３（RRLSYSRRRF）（配列番号１６）、およびＤ−ＳｙｎＢ３（rrlsysrrrf ；全てのアミノ酸がＤ型である）（配列番号１７）を含むが、それらに限定されない。

精製、発現の測定、細胞および細胞内局在の測定を容易にするために、本発明のキメラタンパク質は、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、およびＦＬＡＧエピトープAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（配列番号１８）のごときタンパク質もしくはタンパク質部分との融合タンパク質として発現させることができる。

本発明のキメラタンパク質は、あらゆる多くの当業者に広く知られた方法を用いて、合成的もしくは組み換え的のいずれか、好ましくは組み換え的に、調製されることができる。タンパク質が組み換え的に、例えば、キメラタンパク質をコードするＤＮＡを介して調製される場合、コドン使用頻度を、タンパク質を発現する生物における高い発現のために最適化することができる。かかる生物は、細菌、真菌、酵母、動物、昆虫および植物を含む。より詳細には、該生物は、ヒト、マウス、イー・コリ（E. coli）、穀物用植物、コメ、トマトおよびトウモロコシを含むが、それらに限定されない。核酸を用いて本発明のキメラタンパク質を送達する場合、コドン使用頻度を、核酸構築物を受け取る真核生物向けに最適化することができる。

当業者に知られた適当なタンパク質の精製方法のいずれも、本発明のキメラタンパク質を精製するために使用できる[例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York 参照]。さらに、あらゆる適当なホスト、例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞およびそれらの類似物を、タンパク質の発現のために使用できる。

本発明のキメラタンパク質およびそれをコードする核酸を、酵母、動物、植物を含むあらゆる真核生物において、（特定のヌクレオチド配列との会合によって決定される）標的遺伝子の発現を抑制する、ダウンレギュレートするもしくは減少させるために使用される。標的遺伝子は、発現の抑制が望まれるあらゆる真核生物遺伝子をコードすることができる。例えば、標的遺伝子は、サイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、血管形成因子、抗血管形成因子、薬物耐性遺伝子、成長因子および／または腫瘍サプレッサーをコードすることができる。標的遺伝子は、ウイルス遺伝子、特にＤＮＡウイルス遺伝子由来のものでもよい。標的遺伝子は、植物遺伝子をコードするものでもよい。好ましい植物遺伝子源は、トマト、トウモロコシ、コメおよび穀物植物である。

標的遺伝子は、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーのメンバーまたはそれらの関連因子および修飾因子を含むが、それらに限定されない癌遺伝子であることができる。癌遺伝子は、例えば、Cooper,Oncogenes, 2nded., The Jones and Bartlett Series in Biology, Boston, MA, Jones and Bartlett Publishers, 1995に記載されている。ｅｔｓ転写因子は、Waslylk et al., Eur. J. Biochem. 211: 7-18 (1993)に概説されている。Ｍｙｃ癌遺伝子は、例えば、Ryan et al., Biochem. J. 314: 713-21 (1996)に概説されている。ＦｏｓおよびＪｕｎファミリーは、例えば、The Fos and Jun Families of Transcription Factors, Angel & Herrlich, eds. (1994)に記載されている。ｍａｘ癌遺伝子は、Hurlin et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 109-16に概説されている。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Kanei-Ishii et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 89-98 (1996)に概説されている。ｍｏｓファミリーは、Yew et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 19-25 (1993)に概説されている。

本発明のキメラタンパク質を、疾患関連遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。１つの例において、疾患関連遺伝子は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合癌遺伝子もしくはｒａｓ癌遺伝子のごとき癌遺伝子であり、ＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ配列GCAGAAGCC （配列番号６）に結合するように設計して、核周辺部にターゲティングすること、および転写過程に必要な配列に結合することにより発現を阻害することのいずれもによって、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合癌遺伝子の発現を阻害することができる。疾患に関連する転写因子は、Aso et al., J Clin. Invest. 97: 1561-9 (1996)に概説されている。

Ｂ．使用方法
本発明のもう１つの態様は、遺伝子を核周辺部に局在させることによる、標的遺伝子の発現の抑制もしくはダウンレギュレートの方法に関する。この方法は、標的遺伝子と会合した、もしくは標的遺伝子の十分近くにあるヌクレオチド配列を含む標的核酸を、本発明のキメラタンパク質と接触させることを伴う。該核酸は、細胞もしくは生物に存在することができ、好ましくはゲノムＤＮＡである。しかしながら、核酸は、核に存在する染色体外のＤＮＡであってもよい。該ヌクレオチド配列および標的遺伝子は、前に記載されている。ヌクレオチド配列および標的遺伝子の近さは、本発明のキメラタンパク質にさらされた後の、測定可能な標的遺伝子の抑制もしくはダウンレギュレーションに十分なものである。

本発明に従って、該キメラタンパク質を、タンパク質として、もしくはそのタンパク質をコードする核酸として、細胞に導入することもできる。タンパク質が使用される場合、該キメラタンパク質は、細胞によるタンパク質の取り込みとその核への輸送を容易にするために、細胞取り込みシグナルおよび／または核局在シグナルを有していてもよい。標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートするのに必要なキメラタンパク質の量は、当業者によって容易に決定されることができる。ＲＮＡもしくはＤＮＡのごとき核酸を使用する場合、裸のプラスミドもしくは他のＤＮＡとして、リポソーム中に処方されたもの、およびウイルスベクター（ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルス）中、ＤＮＡもしくはＲＮＡを用いたPowderject（商標）のごとき注入装置を介して、あるいは他の好都合な手段によるものを含む、様々な形式のいずれかにて送達されることができる。さらに、標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートするのに必要な核酸の量は、標的細胞もしくは生物、送達処方および形式に基づいて、当業者によって容易に決定されることができ、核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかである。好ましくはＤＮＡを使用する。

本発明によると、該キメラタンパク質は、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列において、標的核酸に結合する。結合が生じたか否か、および標的遺伝子の抑制もしくは目的のタンパク質が生成する効率を決定するアッセイは、知られている。要するに、１つの具体例において、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）もしくはＧＦＰを、プロモーターを制御する標的遺伝子と作動可能に結合させ、形質転換ベクターに連結し、動物もしくは植物細胞へ形質転換する。キメラタンパク質の導入後（タンパク質として、もしくは翻訳して該タンパク質を生じる核酸として、いずれでも）、レポーター遺伝子のレベルを、適切な対照に対して、評価することができる。もう１つの選択肢として、ノザンブロットもしくは他の方法によってＲＮＡのレベルを測定することができる。この後者の方法は、レポーター構築物が実用的でない場合に有効である。

本発明は、組織特異的もしくはそうでなくても、誘導可能もしくはそうでなくてもよい、および動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、あるいは培養細胞もしくは完全な植物体いずれかの植物細胞において生じる遺伝子調節を意図している。有用な抑制レベルは、通常どの程度緊密に調節されているのか、調節変化の影響、および他の類似の因子によって変化しうる。望ましくは、遺伝子発現における変化は、少なくとも１．５倍ないし２倍；約３倍ないし５倍、約８ないし、１０ないし１５倍；もしくはそれ以上、例えば、２０ないし、２５ないし３０倍；およびさらに４０、５０、７５もしくは１００倍、またはそれ以上に変わる。遺伝子発現における変化の程度は、系ごとに異なる。

使用される「生物」とは、酵母、動物、鳥類、昆虫、植物もしくはその類似物を含むあらゆる真核生物のことである。動物は、哺乳類（ヒト、霊長類等）、商業もしくは農業動物（魚、ニワトリ、乳牛、畜牛、ブタ、ヤギ、七面鳥等）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ等）およびペット（イヌ、ネコ、インコおよび他のペットとなる鳥、魚等）を含むがそれらに限定されない。本明細書で企図されるように、特定の動物は、複数の動物群のメンバーであってもよい。

本発明のキメラタンパク質（もしくはそれらのタンパク質をコードする核酸）を、例えば、様々な植物の種類および植物組織、好ましくは形質転換技術に敏感な高等植物綱、特に単子葉および双子葉植物に対して、遺伝子発現を抑制、ダウンレギュレートまたは減少させるために、使用することができる。

「植物」とは、あらゆる植物、もしくは、種子、懸濁培養、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子、あらゆる発生段階の植物の部分およびそれらの子孫をいう。切断物、および細胞もしくは組織培養も同様に含まれる。本発明と関連して使用される、「植物組織」という語は、植物細胞、植物器官（例えば、葉、茎、根、成長点）、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養、あるいは構造的および／または機能的単位にまとまった植物細胞の群のいずれかを含むがそれらに限定されない。

特に好ましくは、ソルガム・ビコロ（Sorghum bicolor）およびジー・メイズ（Zea mays）を含むイネ科の種のごとき単子葉植物である。本発明の単離された核酸およびタンパク質は、以下の属：キュキュルビタ（Cucurbita）、ローサ（Rosa）、ヴィティス（Vitis）、ジュグランス（Juglans）、フラガリア（Fragaria）、ロータス（Lotus）、メディカゴ（Medicago）、オノブリチス（Onobrychis）、トリフォリウム（Trifolium）、トリゴネラ（Trigonella）、ヴィグナ（Vigna）、シトルス（Citrus）、リナム（Linum）、ジェラニウム（Geranium）、マニホット（Manihot）、ダウカス（Daucus）、アラビドプシス（Arabidopsis）、ブラシカ（Brassica）、ラファナス（Raphanus）、シナピス（Sinapis）、アトパ（Atropa）、カプシカム（Capsicum）、ダチュラ（Datura）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、ニコチアナ（Nicotiana）、ソラナム（Solanum）、ペチュニア（Petunia）、ジギタリス（Digitalis）、マジョラナ（Majorana）、シアホリウム（Ciahorium）、ヘリアンタス（Helianthus）、ラクツカ（Lactuca）、ブロムス（Bromus）、アスパラガス（Asparagus）、アンチリヒナム（Antirrhinum）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ネメシス（Nemesis）、ペラルゴニウム（Pelargonium）、パニウム（Panieum）、ペニセタム（Pennisetum）、ラナンキュラス（Ranunculus）、セネシオ（Senecio）、サルピゴロシス（Salpiglossis）、ククミス（Cucumis）、ブロワーリア（Browaalia）、グリシン（Glycine）、ピサム（Pisum）、ファセオラス（Phaseolus）、ロリウム（Lolium）、オリザ（Oryza）、アベナ（Avena）、ホルデウム（Hordeum）、セカル（Secale）、およびトリチカム（Triticum）の種においても使用することができる。

好ましい植物および植物組織は、トウモロコシ(Zea mays）、キャノーラ(Brassica napus, Brassica rapa ssp. ）、アルファルファ（Medicago sativa）、コメ（Oryza sativa）、ライ麦（Secale cereale）、ソルガム（Sorghumbicolor, Sorghum vulgare）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、コムギ（Triticum aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum）、サツマイモ Qpomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cqfea spp. ）、ココナッツ（Cocos nucijra）、パイナップル（Ananas comosus）、citrus trees （Citrus spp.）、ココア（Theobroma cacao）、チャ（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp. ）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グァバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイア（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integr~fblia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum spp.）、ウキクサ（Lemna spp.）、エンバク、オオムギ、野菜、観賞植物および針葉樹に由来するものを含む。

好ましい野菜は、トマト（Lycopersicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuca sativa）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、ライマメ（Phaseolus limensis）、エンドウ（Lathyrus spp.）、さらに、キュウリ（C. sativus）、カンタロープ（C. cantalupensis）、およびマスクメロン（C. mero）のごとき（Cucumis）属のメンバーを含む。

好ましい観賞植物は、アザレア（Rhododendron spp.）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（Hibiscus rosasanensis）、バラ（Rosa spp.）、チューリップ（Tulipa spp.）、スイセン（Narcissus spp.）、ペチュニア（Petunia hybrida）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）およびキクを含む。

本発明を実施する際に使用してもよい針葉樹は、例えば、テーダマツ（Pinus taeda）、スラッシュマツ（Pinus elliotii）、ポンデローサマツ（Pinus ponderosa）、ロッジポールマツ（Pinus contorta）、およびモントレーマツ（Pinus radiata)のごときマツ；ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）；アメリカツガ（Isuga canadensis）；ベイトウヒ（Picea glauca）；セコイア（Sequoia sempervirens）；ヨーロッパモミ（Abies amabilis）およびバルサムモミ（Abies balsamea）のごときモミ；ならびにベイスギ（Thuja plicata）およびアラスカヒノキ（Chamaecyparis nootkatensis)のごときシーダーを含む。

最も好ましくは、本発明の植物および植物組織は、農作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、キャノーラ、ダイズ、ワタ、ピーナッツ、ソルガム、コムギ、タバコ等）であり、さらにより好ましくはトウモロコシおよびダイズであり、さらにいっそう好ましくはトウモロコシである。

本明細書中で使用される、「遺伝子組み換え植物」もしくは「遺伝的に改変された植物」は、ゲノム中に異種のポリヌクレオチド（すなわち、受け手の生物以外のソースに由来するポリヌクレオチド）を含む植物との関連を含む。通常、および好ましくは、異種のポリヌクレオチドは、ゲノム中に安定して組み込まれるため、ポリヌクレオチドは以後の世代に受け継がれる。異種のポリヌクレオチドは、単独もしくは組み換え発現カセットの一部としてゲノム中に組み込まれてもよい。本明細書中の、「遺伝子組み換えの」という語は、最初に変化した組み換え体だけでなく、最初の遺伝子組み換え体から優性交配もしくは無性繁殖によって生じたものも含む、遺伝子型が異種の核酸の存在によって変化した、あらゆる細胞、細胞株、カルス、組織、植物の部分もしくは植物体に対して使用される。本明細書中で使用される「遺伝子組み換えの」という語は、従来の植物育種法、または他家受精（crossfertilization）、非組み換え型ウイルスの感染、非組み換え型細菌の形質転換、非組み換え型遺伝子転移、もしくは自然発生的な変異のごとき自然発生の事象による、ゲノムの変化（染色体もしくは染色対外の）を包含しない。

Ｃ．発現系
本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸を含む組み換え発現カセットも提供する。本発明の所望のポリペプチドをコードする核酸配列を使用して、所望のホスト細胞へ導入できる組み換え発現カセットを構築することができる。組み換え発現カセットは、典型的に、目的のホスト細胞、例えば、形質転換植物の組織において、ポリヌクレオチドの転写を誘導するであろう、翻訳開始調節配列に作動可能に連結した、本発明のポリヌクレオチドを含むであろう。発現ベクターは、哺乳類発現ベクター、昆虫発現ベクター、酵母発現ベクターもしくは植物発現ベクターであってもよい。タンパク質が、タンパク質の調製および生成のために発現される場合（タンパク質を次に使う場合、例えば、本発明の方法において）、発現ベクターは、細菌発現ベクターであってもよい。発現ベクターは当業者によく知られており、所望の目的により容易に選択されることができる。

転写因子は、真核生物中で活性のあるプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルもしくはポリＡトラクト（poly A tract）を含む転写終結シグナル、核原形質性輸送を容易にするエレメント等を含むが、それらに限定されない。適当な転写終結エレメントは、ＳＶ４０転写終結領域もしくはそれらに由来するターミネーターを含む。

本発明において、あらゆる哺乳類、酵母、細菌、昆虫、ウイルス、他の真核発現ベクター、もしくは発現カセットを使用することができ、例えば、Invitrogen Corporation (San Diego, Calif.)より販売される、pCEP4もしくはpRc/RSV、Stratagene (La Jolla, Calif.)より販売される、pXT1、pSG5、pPbacもしくはpMbac、ClonTech (PaloAlto, Calif. )より販売される、pPURもしくはpMAM、ならびにPromega Corporation (Madison, Wis. )より販売されるpSVβ-galのごとき多くの商業的に入手可能なベクターもしくはカセットのいずれか、あるいは、ｄｅ ｎｏｖｏまたは公にもしくは商業的に入手可能な真核発現系の改変のいずれかから合成されたものより選択することができる。

発現カセット内の個々のエレメントは、複数のソースに由来してもよく、活性部位における特異性を与えるため、もしくは受け手側の細胞でのカセットの寿命を延ばすために選択されてもよい。かかる発現カセットの操作を、あらゆる通常の分子生物学の手法によって行うことができる。

植物の発現ベクターは、（１）５’および３’調節配列の転写制御下でクローン化された植物遺伝子、ならびに（２）優性選抜可能なマーカーを含んでいてもよい。かかる発現ベクターは、必要であれば、プロモーター調節領域（例えば、誘導可能もしくは構成的な、環境的もしくは発生的に調節される、または細胞もしくは組織特異的／選択的発現をさせるもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルも含んでよい。

高等植物において、遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは、当業者によく知られており、Rogers et al., Meth. in Enzymol. , 153: 253-277 (1987)に記載の、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド由来のベクターを含む。これらのベクターは、形質転換時に、ベクターＤＮＡの一部をホスト植物のゲノム中に組み込むことから、植物組み込みベクターである。本明細書中で有用なエー・チュメファシエンス（A. tumefaciens）ベクターの例は、Schardl et al., Gene, 6 1 : 1-11 (1987)およびBerger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 86: 8402-8406 (1989)の、pKYLX6およびpKYLX7である。もう１つの有用なベクターは、プラスミドpBI101.2である。

細胞形質転換技術および遺伝子送達方法（例えば、遺伝子を送達してｉｎ ｖｉｖｏで使用するための方法）は、当業者によく知られている。本発明のキメラタンパク質をコードする核酸を、細胞に、もしくはｉｎ ｖｉｖｏで被験者の細胞に、それぞれ送達するために、かかるあらゆる技術を使用することができる。

本明細書中で使用される「発現カセット」という語は、適切なホスト細胞において、特定のヌクレオチド配列を発現させることのできるＤＮＡ配列であって、終止シグナルに作動可能に連結した目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含むものを意味する。それは、典型的に、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、目的の機能的なＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡもしくは非翻訳ＲＮＡを、センスもしくはアンチセンス方向にコードしていてもよい。目的ヌクレオチド配列を含む発現カセットは、少なくともその１つの構成成分が、少なくとも１つの他の構成成分に対して異種であるような、キメラであってもよい。該発現カセットは、天然に存在するものであるが異種発現に有効な組み換え型となったものでもよい。しかし、典型的に、発現カセットは、ホストに対して異種である。すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、ホスト中に本来的に存在しないものであり、形質転換によって、ホスト細胞もしくはホスト細胞の祖先へ導入されていなければならない。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、もしくはホスト細胞がいくつかの特定の外部刺激にさらされた場合のみ転写を開始させる、誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。植物のごとき、多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織もしくは器官もしくは発生段階に特異的であってもよい。

動物細胞において、遺伝子の発現を駆動するのに有効であることがよく知られている様々なプロモーターは、例えば、ウイルスに由来するSV40、ごく初期のCMVおよび、RSVプロモーターもしくは真核生物由来のβ−カゼイン、ウテログロブリン、β−アクチンもしくはチロシナーゼプロモーターである。特定のプロモーターは、時期もしくは組織特異的な発現を得ることが目的でない限り、本発明に重要ではない。例えば、所望の組織もしくは選択された細胞型においてのみ活性のあるプロモーターを選択することができる。組織特異的プロモーターの例は、乳腺組織に特異的なαＳ１−およびβ−カゼインプロモーター(Platenburget al., Trans. Res. , 3: 99-108 (1994); and Maga et al., Trans. Res. , 3: 36-42 (1994) )；肝臓、腎臓、脂肪、空腸および乳腺組織にて活性のある、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター(McGrane et al., J. Reprod. Fert., 41:17 23 (1990))；肺および脾臓にて活性があるが、精巣、脳、心臓、肝臓もしくは腎臓において活性のないチロシナーゼプロモーター(Vile et al., Canc. Res., 54:6228 6234 (1994))；扁平上皮の分化しているケラチノサイトにおいてのみ活性のあるインボルクリンプロモーター(Carroll et al., J. Cell Sci., 103:925 930 (1992))；ならびに肺および子宮内膜において活性のあるウテログロブリンプロモーター(Helftenbein et al., Annal. N.Y. Acad. Sci., 622:69 79 (1991))を含むがそれらに限定されない。

あるいは、細胞特異的エンハンサー配列を、発現を制御するために使用することができる。例えば、ヒト向神経性パポバウイルスＪＣＶエンハンサーは、グリア細胞のみにおいて、ウイルスの転写を調節する(Remenick et al., J. Virol., 65:5641 5646 (1991))。組織特異的な発現を制御するさらにもう１つの方法は、どの細胞系譜でプロモーターが活性であるかを特定するために、ホルモン応答性エレメント（ＨＲＥ）を使用することであり、例えば、ＭＭＴＶプロモーターは、プロゲステロン受容体のごときホルモン受容体の、活性化前のＨＲＥの上流への結合を必要とする(Beato, FASEB J., 5:2044 2051 (1991); and Truss et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 41:241 248 (1992))。

植物プロモーター断片を、再生された植物の全ての組織において、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる。かかるプロモーターは、本明細書中で、「構成的な」プロモーターと呼ばれており、ほとんどの環境状態および発生もしくは細胞分化状態の下で活性がある。構成的なプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に由来するＰ−もしくは２’−プロモーター、ユビキチンＩプロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(米国特許第5,683,439号)、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ルビスコプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、および他の当業者に知られた様々な植物遺伝子に由来する転写開始領域を含む。

あるいは、植物プロモーターは、特定の組織における本発明のポリヌクレオチドの発現を指令することができるものであるか、さもなくば、より正確な環境的もしくは発生的制御下にあるものであってもよい。かかるプロモーターは、本明細書中で、「誘導性の」プロモーターと呼ばれる。誘導性プロモーターによって転写に影響を及ぼす環境の状態は、病原体の攻撃、嫌気条件、もしくは光の存在を含む。誘導性プロモーターの例は、低酸素もしくは低温ストレスによって誘導可能なＡｄｈＩプロモーター、熱ストレスによって誘導可能なＨＳＰ７０プロモーター、および光によって誘導可能なＰＰＤＫプロモーターを含む。発生の制御下のプロモーターの例は、葉、根、果実、種子もしくは花のごとき、ある組織のみで、または選択的に、転写を開始させるプロモーターを含む。典型的なプロモーターは、葯特異的プロモーター５１２６（米国特許第5,689, 049号および第5,689,051号）である。プロモーターの作用は、ゲノムにおけるその位置によって異なるかもしれない。よって、誘導性プロモーターは、ある位置では、完全もしくは部分的に構成的になるかもしれない。

異種および非異種（すなわち、内在性）プロモーターのいずれもを、本発明の核酸の発現を導くために使用することができる。これらのプロモーターを、例えば、所望の組織における本発明のタンパク質の濃度および／または組成を、減少させる、増加させる、または変化させるために、アンチセンスの核酸の発現を駆動するための組み換え体発現カセットにも使用することができる。よって、いくつかの具体例において、核酸構築物は、ジー・メイズ（Zea mays）のごとき植物細胞において、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結した機能的なプロモーターを含むだろう。これらの具体例において有用なプロモーターは、本発明のポリペプチドの発現を駆動する、内在性プロモーターを含む。

いくつかの具体例において、プロモーターもしくはエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸は、非異種型のポリペプチドの適切な部位（通常は上流）において、それの発現のアップまたはダウンレギュレートするために導入される。例えば、内在性プロモーターを、ｉｎ ｖｉｖｏで、変異、欠失、および／または置換によって変えることができ（米国特許第5,565,350号; PCT/US93/03868）、あるいは、遺伝子の発現を制御するために、単離されたプロモーターを、本発明の遺伝子からの適切な方向および距離にて、植物細胞へ導入することができる。植物細胞中の本発明のポリペプチドの全濃度を変えるおよび／または組成を変えるために、遺伝子発現を、植物の成長に適した条件下で、変化させることができる。

本発明において、特に、キメラタンパク質の発現を制御するために、様々なプロモーターが有効であるとされ、その選択は、部分的に、所望のタンパク質発現レベル、所望の組織特異的、時期特異的、もしくは環境の合図特異的な制御が植物細胞にあるならば、それらに依存するだろう。構成的および組織特異的プロモーターは、特に重要である。かかる構成的プロモーターは、例えば、Ｒｓｙｎ７のコアプロモーター、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812)、コメアクチン(McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171)；ユビキチン(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689)、ｐＥＭＵ(Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588)、ＭＡＳ(Veltenet al. (1984) EMBOJ. 3: 2723- 2730)ならびに、例えば、米国特許第5,608,149号; 第5,608,144号; 第5,604,121号; 第5,569,597号; 第5,466,785号; 第5,399,680号; 第5,268,463号; および第5,608,142号に記載の構成的プロモーターを含む。

組織特異的プロモーターを、特定の植物組織内の増大した発現を標的にするために使用することができる。組織特異的プロモーターは、Yamamoto et al. (1997) PlantJ. 12 (2) 255-265、Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803、Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3): 337)、Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2): 15 7-168、Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3):1331、Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): 525-535、Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): 513-524、Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778、Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196、Orozcoet al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129-113 8、Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90 (20): 9586-9590およびGuevara-Garcia et al. (1993) PlantJ. 4 (3):495-505に記載のものを含む。かかるプロモーターを、弱い発現のために、必要であれば、変えることができる。

葉特異的プロモーターは、当業者に知られており、例えば、Yamamoto et al. (1997) PlantJ. 12 (2): 255-265, Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105: 357- 67, Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778, Gotor et al. (1993) Plant J. 3: 509-18,Orozcoet al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129-1138, and Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (20): 9586-9590に記載のものを含む

構成的もしくは誘導性および非組織特異的もしくは組織特異的なもののあらゆる組み合わせを、本発明のキメラタンパク質の発現を制御するために使用してもよい。所望の制御は、適当なプロモーターを用いて、時間的、発生的もしくは環境的に制御されてもよい。環境的に制御されたプロモーターは、病原体、病原性の毒物、もしくは他の外部の化合物（例えば、意図的に用いられた小分子誘導物質）の攻撃に応答するものである。時間的もしくは発生的なプロモーターの１例は、果実の成熟依存的なプロモーターである。特に好ましいものは、誘導性ＰＲ１プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、およびＯＲＳである。

例えば、組織の種類、細胞の種類、発生の段階、および／または環境の状態に関して、特定の発現様式を有するプロモーターを同定する方法は、当業者によく知られている。例えば、The Maize Handbook, Chapters 114-115, Freeling and Walbot, Eds. , Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, Pedition, Chapter 6, Sprague and Dudley, Eds. , American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988)参照。

植物の形質転換のプロトコールは、ヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコールと同様に、形質転換の標的となる植物もしくは植物細胞の種類、すなわち、単子葉もしくは双子葉によって異なっていてもよい。植物細胞にヌクレオチド配列を導入した後、植物のゲノムに挿入する適当な方法は、マイクロインジェクション (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334)、エレクトロポーレーション(Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:5602- 5606）、アグロバクテリウムを介した形質転換(Townsend et al., 米国特許第5,563,055号)、直接遺伝子転移(Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722)、弾道粒子の高速化（例えば、Sanford et al., 米国特許第4,945,050号; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, "in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); and McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926参照)を含む。Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (タマネギ); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671- 674 (ダイズ); McCabe et al. (1988) BioTechnology 6: 923-926 (ダイズ); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 2 7P: 175-182 (ダイズ); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (ダイズ); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736- 740 (rice); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 4305-4309 (トウモロコシ); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (トウモロコシ); Tomes, 米国特許第5,240,855号; Buising et al., 米国特許第5,322,783号および第5,324,646号; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, "in Plant Cell Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (トウモロコシ); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (トウモロコシ);Frommet al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (トウモロコシ); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bowen et al., 米国特許第5,736,369 (穀物); Bytebieret al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:5345-5349 (ユリ科); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pollen); Kaeppleral. (1990) Plant Cell Reports 9: 415- 418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560- 566 (ウィスカーを介した形質転換); D'Halluinet al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (エレクトロポーレーション); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 and Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (コメ); Osjodaet al : (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介したトウモロコシ)も参照とし、それらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。

改変された植物を、従来の方法によって植物体に生育させてもよい。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell. Reports: 81-84参照。次いで、これらの植物は、生育し、同じ形質転換株もしくは異なる株のいずれかと受粉し、同定された所望の表現型的な特性を有するハイブリッドを生じてもよい。２つもしくはそれ以上の世代を生育させて、目的の表現型的な特性が安定して保持され、継承されるようにしてもよく、この時、収穫された種子は、所望の表現型的もしくは他の特性を確保する。

Ｄ．遺伝子抑制のために分子スイッチシステム
本発明のもう１つの態様は、遺伝子発現を制御するための分子スイッチシステム、特に、本発明のキメラタンパク質中のドメインを用いた、遺伝子発現を抑制もしくはダウンレギュレートするための分子スイッチシステムに関する。かかるシステム（「化学スイッチ」とも呼ばれる）は、遺伝子発現が調節されているもしくは制御されている、時期もしくは場所を操作するための、さらなる道具を提供する。簡単に、分子スイッチシステムは、１つが核酸結合ドメインを有するものであり、もう１つが核周辺部結合ドメインを有するものである２つの融合タンパク質を、細胞もしくは生物へ導入する。これらの２つの融合タンパク質は、それぞれ、１つもしくはそれ以上の２価のリガンドに特異的に結合する第２のドメインを有する。２つの融合タンパク質を有する細胞もしくは生物へ、２価のリガンドが導入されると、該リガンドは、その３つのものの間の複合体の形成を誘発するスイッチとして働く。その後、この複合体は、一度形成されると、標的遺伝子を核周辺部と会合させて、遺伝子発現を抑制もしくはダウンレギュレートできることから、本発明のキメラタンパク質と同様の機能をする。

一例は、部分ＡおよびＢを有する２価の化学リガンド、ＡＺＰおよび部分Ａに特異的な抗体（もしくはかかる抗体の活性断片）をコードする第１の融合タンパク質、ならびに核周辺部と会合できるドメインおよび部分Ｂに特異的な抗体（もしくはかかる抗体の活性断片）をコードする第２の融合タンパク質によって形成された複合体である。２つの融合タンパク質を、同じ細胞において、別々に、もしくは協調して発現させることができる。互いに結合した部分Ａと部分Ｂを含む２価の化学物質を細胞または生物に添加すると、部分Ａまたは部分Ｂのいずれかに対する各融合タンパク質のアフィニティーにより複合体の形成がもたらされる。

従って、本発明のこの態様の第１の融合タンパク質は、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合しうる第１のドメイン、および２価のリガンドの第１の結合部分に特異的に結合しうる第２のドメインを含み、前記リガンドが細胞によって取り込まれうるものであり、前記第１および第２のドメインは互いに異種のものである。融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第１ドメインと同じものである。例えば、第１の融合タンパク質の第１ドメインは、ＺＦＰ、ＡＺＰ、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、ホメオボックスタンパク質、それらのタンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分、またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。

同様に、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列、および標的遺伝子は、本発明のキメラタンパク質について記載されたものと同じである。

本発明のこの態様の第２の融合タンパク質は、核周辺部と会合することのできる第１ドメイン、および２価のリガンドの第２の結合部分に特異的に結合することのできる第２ドメインを含み、前記第１ドメインは、前記第２ドメインに対して異種のものである。これらの融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第２ドメインと同じものである。よって、前記第２の融合タンパク質の第１ドメインは、核周辺部、核ラミナ、ヘテロクロマチン、もしくはそれらのいずれかの組み合わせと結合するもので、好ましくは核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質、ヘテロクロマチン結合タンパク質、それらのタンパク質のいずれかの結合部分、もしくはそれらのいずれかの組み合わせである。

この分子スイッチシステムの第１および第２融合タンパク質の第２ドメインは、それぞれ、２価のリガンドの１つの結合部分に特異的に結合することができる。第１の融合タンパク質は、２価のリガンドの結合部分の１つ（例えば、部分Ａ）に結合し、第２の融合タンパク質は、２価のリガンドの他の結合部分（例えば、部分Ｂ）に結合する。１つの具体例において、それぞれの融合タンパク質の第２ドメインは、２価のリガンドのそれぞれの結合部分に対する特異性を有する抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦＶ）であってもよい。

部分ＡおよびＢについては、多くの候補が存在する。基準は、該部分が、十分に抗原性があり、当該部分に特異的な抗体の選抜ができること、および２つの部分が互いに結合して、細胞内に入って作用して、複合体の形成を媒介しうる化合物を形成することである。１つの具体例において、部分Ａは、例えば、以下に示す構造：

を有していてもよく、部分Ｂは、例えば、以下に示す構造：

を有していてもよく、部分ＡおよびＢは、あらゆる適当な長さの、例えば、以下に示すユニット：

を有するリンカーによって連結されていてもよい。

細胞へ入ることができて、かつ抗体を産生させることのできる部分を有するあらゆる化合物が、本発明の２価のリガンドの態様に適当である。本発明のこの具体例は、２価のリガンド存在下にて複合体を形成させることによって、核周辺部への標的遺伝子ドメインの配列特異的局在を許容する。２価のリガンドの不在の場合、三次構造は形成されない。

好ましい具体例において、２つの連結した化合物を含む二価の化学物質である、化学スイッチが使用される。これらの化合物は、短いリンカー、例えば、CH₂CH₂によって連結された、抗体を産生させることのできるあらゆる化合物であってもよい。１つの好ましい具体例において、一本鎖抗体（例えば、一本鎖Ｆ_ｖ（ｓｃＦｖ））は、二価の化学物質の１部分に結合して、それを核酸結合ドメインに連結する。二価の化学物質の他の部分は、核周辺部と会合もしくは結合することのできるタンパク質のドメインを認識して結合する、第２の１本鎖抗体、例えば、一本鎖Ｆ_ｖ（ｓｃＦ_ｖ）に結合する。

もう１つの具体例において、２つの融合タンパク質の第２ドメインは、変異型Ｓ−タグおよびＳ−タンパク質（以下に記載）であって、小さな分子もしくは化学物質の存在下でのみ、それぞれと結合できるものであってもよい。従って、この小分子は、２価のリガンドとして働き、２つの融合タンパク質を、核周辺部に局在する単一の複合体にして、遺伝子抑制もしくはダウンレギュレーションを引き起こす。

この分子スイッチシステムを、時間的もしくは空間的な様式で、標的遺伝子の抑制を調節するための方法において使用することができる。特に、該方法は、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有する標的核酸を含む細胞または生物を、本発明の分子スイッチシステム（本セクションにおいて記載されている）と接触させること、次いで、融合タンパク質との複合体の形成を可能にする時期または位置において、細胞または生物を適当な２価のリガンドと接触させ、そのことにより、核周辺部へのその局在によって標的遺伝子の発現を抑制またはダウンレギュレートすることを包含する。キメラタンパク質と同様に、分子スイッチシステムの融合タンパク質は、タンパク質として、１つもしくはそれ以上のタンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸として、もしくはそれらの組み合わせとして、細胞または生物に導入されてもよい。１つの核酸が融合タンパク質の送達のために使用される場合、それぞれのタンパク質の発現は、協調してもしくは独立して制御されることができる。同様に、該方法は、本発明のキメラタンパク質を使用する方法について企図されたものと同じ標的遺伝子に有効である。

キメラタンパク質について前に説明したように、該融合タンパク質を、発現、単離および生成させることができる。同様に、キメラタンパク質について前に説明したように、それらを細胞または生物へ導入することができる。

Ｅ．遺伝子抑制解除のための分子スイッチシステム
分子スイッチシステムは、標的遺伝子の抑制解除のための、すなわち、現在抑制されている標的遺伝子の発現を活性化するための、制御された調節を許容する、もう１つの形式にて提供されることができる。本発明のこの態様において、「スイッチ」は、２つの融合タンパク質感の相互作用をなくす（セクションＤにあるように、相互作用を促進するよりもむしろ）ために使用される。さらに、これらのシステム（「化学スイッチ」とも呼ばれる）は、遺伝子発現が調節もしくは制御される時期または場所を操作するための、もう１つの道具を提供する。簡単には、該分子スイッチシステムは、一方が核酸結合ドメインを有するものであり、他方が核周辺部結合ドメインを有するものである、２つの融合タンパク質を、細胞または生物へ導入する。これらの２つの融合タンパク質は、それぞれ、互いに特異的に結合する第２ドメイン、例えば、互いの結合パートナーである第２ドメインを有する。このシステムにおいて、融合タンパク質の導入によって、核周辺部に局在して、会合した標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートする複合体が形成される。化学スイッチが、所望の時期の細胞もしくは生物に（もしくは特定の細胞の種類に）導入されると、複合体を分裂させ、抑制状態を解く働きをする、すなわち、該化学スイッチの存在が、標的遺伝子の抑制解除を引き起こす。

従って、本発明のこの態様の第１の融合タンパク質は、標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を特異的に結合することのできる第１ドメイン、および２価のリガンドの第二の結合部分に特異的に結合することのできる第２ドメインを含み、前記第１ドメインは前記第２ドメインに対して異種である。これらの融合タンパク質は、セクションＤに記載されたものとは異なる。

融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第１ドメインと同じものである。例えば、第１の融合タンパク質の第１ドメインは、ＺＦＰ、ＡＺＰ、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、ホメオボックスタンパク質、それらのタンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分、またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。同様に、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列、および標的遺伝子は、本発明のキメラタンパク質について記載されたものと同じものである。

本発明のこの態様の第２の融合タンパク質は、核周辺部と会合することのできる第１ドメイン、および前記第１の融合タンパク質の第２ドメインの結合パートナーを含む第２ドメインを含み、前記第１ドメインは前記第２ドメインに対して異種である。これらの第２の融合タンパク質の第１ドメインは、本発明のキメラタンパク質の第２ドメインと同じものである。よって、前記第２の融合タンパク質の第１ドメインは、核周辺部、核ラミナ、ヘテロクロマチン、もしくはそれらのいずれかの組み合わせと結合するもので、好ましくは、核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質、ヘテロクロマチン結合タンパク質、それらのタンパク質のいずれかの結合部分、もしくはそれらのいずれかの組み合わせである。

この分子スイッチシステムの第１および第２の融合タンパク質の第２ドメインは、それぞれ、互いに特異的に結合することができる。第２ドメインの一例は、Ｓ−タグ／Ｓ−タンパク質系[Kim et al.(1993) Protein Sci. 3: 348- 356]によって示される。Ｓ−タグは、短いペプチド（１５アミノ酸）であり、Ｓ−タンパク質は小さなタンパク質（１０４アミノ酸）であり、２つの融合タンパク質のいずれかの第２ドメインとして、互換的に使用されることができる。Ｓ−タグとＳ−タンパク質複合体の親和性は、高い（Ｋｄ＝１ｎＭ）。その場合、化学スイッチもしくはリガンドは、Ｓ−タグおよびＳ−タンパク質間の相互作用をなくすことのできる分子である。例えば、遊離もしくは抱合化されたＳ−タグタンパク質は、化学スイッチとして働くかもしれない。

この分子スイッチシステムを、時間的もしくは空間的な様式で、標的遺伝子の抑制を調節するための方法において使用することができる。特に、該方法は、本発明の分子スイッチシステム（本セクションにおいて記載されている）と、標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を有する標的核酸を含む細胞または生物を接触させること、ついで、第１および第２の融合タンパク質の会合を分裂させる時期もしくは位置において、細胞または生物をリガンドと接触させ、そのことにより、標的遺伝子の発現の抑制を解除することを包含する。キメラタンパク質と同様に、分子スイッチシステムの融合タンパク質は、タンパク質として、１つもしくはそれ以上のタンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸として、もしくはそれらの組み合わせとして、細胞または生物に導入されてもよい。１つの核酸が融合タンパク質の送達のために使用される場合、それぞれのタンパク質の発現は、協調してもしくは独立して制御されることができる。同様に、該方法は、本発明のキメラタンパク質を使用する方法について企図されたものと同じ標的遺伝子に有効である。

該融合タンパク質も、キメラタンパク質について前に記載されたように、発現、単離および生成することができる。同様に、それらを、キメラタンパク質について前に記載されたように、細胞または生物へ導入することができる。

Ｆ．医薬製剤
キメラタンパク質、分子スイッチシステム（セクションＤもしくはＥにおいて提供される）、様々な（セクションＤもしくはＥの）融合タンパク質、または本発明の他のタンパク質もしくはシステムのいずれかをコードする核酸の治療製剤は、所望の純度を有するそれらの実体を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤もしくは安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980) )と混合することによって、凍結乾燥された製剤もしくは水性溶液の形にて、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤もしくは安定剤は、使用される用量または濃度にて、レシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸もしくは他の有機酸のごときバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム，塩化ベンゼトニウム；フェノール，ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンのごときアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくはイムノグロブリンのごときタンパク質；ポリビニルピロリドンのごとき親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンのごときアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む炭水化物；ＥＤＴＡのごときキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのごとき糖；ナトリウムのごとき塩形成対イオン（salt-forming counter-ions）；金属複合体（例えば、Zn−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき非イオン性界面活性剤を包含しうる。

本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候に必要な、１つより多くの化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない、相補的な活性を有するものも含んでもよい。かかる分子は、適当には、企図された目的を達成するために効果的な量の組み合わせにて存在する。

活性のある成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または、界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、それぞれによって、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにて、調製されたマイクロカプセル中に閉じこめてもよい。かかる技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌される。これは、滅菌フィルターを通したろ過によって容易に達成されるが、活性成分の活性が消失もしくは変化しないのであれば、他の滅菌方法を使用することができる。

徐放性製剤が、調製されてもよい。徐放性製剤の適当な例は、マトリクスが成形物の形であるポリペプチド変種を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含む。徐放性製剤の例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、もしくは、ポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第3,773, 919号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）のごとき分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸共重合体のごとき重合体は、１００日間以上分子を放出することができるが、あるヒドロゲルは、短い時間タンパク質を放出する。合理的な戦略を、必要な機構に依存した安定化について考案することができる。例えば、集合機構が、チオール−ジスルフィドの互換を介した、分子内のＳ−Ｓ結合であることが発見されるならば、安定化は、メルカプト残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分量の制御、適当な添加物の使用、および特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されるかもしれない。

当業者であれば、あらゆる医薬組成物中に含まれる、キメラタンパク質、分子スイッチシステム（セクションＤもしくはＥに記載）、様々な融合タンパク質（セクションＤもしくはＥの）または本発明のそれらのタンパク質もしくはシステムのいずれかをコードする核酸の量、ならびに企図された使用のための適正投与量を、容易に決定することができる。

この出願の中で、様々な出版物、特許および特許出願が参照されている。これらの出版物、特許および特許出願の教示および開示は、参照により、全体として、本出願に組み込まれる。

本明細書に開示された発明の本質における変化が行われうることが当業者によって理解され、期待されるが、かかる修正、変化および置換は、本発明の範囲内に含まれるとされる。

実施例１
ヒトＶＥＧＦ−Ａの抑制
ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）遺伝子の発現をダウンレギュレートするために、５２４アミノ酸のマウスＧＣＬタンパク質[Leatherman et al.(2000)]を含むキメラタンパク質（ＣＰ１−ｖｅｇｆ）、および配列5'-GTG TGG GTG AGT GAG TGT G-3'（配列番号７）を標的としたＡＺＰをコードする組み換え構築物を調製する。もう１つのキメラタンパク質（ＣＰ２−ｖｅｇｆ）をコードする第２の構築物を、同じマウスＧＣＬタンパク質および配列5'-GGG GCT GGG GGC GGT GTC T-3'（配列番号８）を標的としたＡＺＰを用いて調製する。標的ヌクレオチド配列は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子のプロモーター配列に由来する[Tischer et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:11947-11954]。ＡＺＰは、６つのジンクフィンガーを有し、それぞれがフレームワーク配列-Pro-Tyr-Lys-Cys-Pro-Glu-Cys-Gly-Lys-Ser-Phe-Ser-Z^-1-Ser-Z²-Z³-Leu-Gln-Z⁶-His-Gln-Arg-Thr-His-Thr-Gly-Glu-Lys-（配列番号３）を伴っている；それぞれのフレームワークは、アミノ酸残基の付加なく、次に結合している。ＣＰ１−ｖｅｇｆおよびＣＰ２−ｖｅｇｆへのＤＮＡ結合特異性を決定する残基（Ｚ^−１、Ｚ^２、Ｚ^３およびＺ^６）の同定を表３に示す。

抑制活性を試験するために、キメラタンパク質構築物を、組織球性リンパ腫細胞株Ｕ−９３７へ、ヒトＶＥＧＦ−Ａネイティブプロモーター調節下のルシフェラーゼ遺伝子レポーターを含むルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドと共に、同時トランスフェクト（co-transfect）する。このルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の−２２７９から＋１０４１までのヌクレオチドを含む[Liu et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:11323-11334]。正の対照については、Ｕ−９３７細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド単独でトランスフェクトするか、またはルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド、ならびにＧＣＬおよび関連しない標的配列のためのＡＺＰ（もしくは他のＤＮＡ結合ドメイン）のキメラタンパク質構築物（タンパク質として、もしくは核酸として）で同時トランスフェクトする。対照のレベルに比べてルシフェラーゼ活性が減少することは、ＣＰ１−ｖｅｇｆおよびＣＰ２−ｖｅｇｆがＶＥＧＦ−Ａプロモーター活性をダウンレギュレートすることを示す。

あるいは、ＣＰ１−ｖｅｇｆもしくはＣＰ２−ｖｅｇｆタンパク質で細胞を処理することによって、または、ＣＰ１−ｖｅｇｆもしくはＣＰ２−ｖｅｇｆタンパク質をコードする核酸でＵ−９３７細胞をトランスフェクトして、ノーザンブロット技術により内在性ＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、抑制活性を測定することができる。

図１は、１つもしくはそれ以上の標的遺伝子を核周辺部の近傍に導くための、本発明のキメラタンパク質を用いた、単量体および重合体の遺伝子抑制を図示する。

【配列表】

Claims (68)

1. 標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を特異的に結合することのできる、１つもしくはそれ以上の第１ドメイン、および核周辺部と会合することのできる、１つもしくはそれ以上の第２ドメインを含む核酸標的特異的キメラタンパク質であって、少なくとも１つの前記第１ドメインが、少なくとも１つの前記第２ドメインに対して異種であるキメラタンパク質。
2. 前記の１つもしくはそれ以上の第１ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰ）、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、ホメオボックスドメインタンパク質、前記のタンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１のキメラタンパク質。
3. 前記ＡＺＰが、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むものであって、該フィンガーは、さらなるフィンガーが存在する場合には、独立して、０ないし１０個のアミノ酸残基でもってそれらに共有結合し、ジンクフィンガーのα−ヘリックスの−１、２、３および６位のアミノ酸が、以下のもの：
   −１位において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
   ２位において、アミノ酸は、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸；
   ３位において、アミノ酸は、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸；および
   ６位において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である；
   より選択されるものである、請求項２のキメラタンパク質。
4. 前記ＡＺＰが、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むものであって、それぞれのジンクフィンガーは、独立して、式：−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_２−４−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｚ^−１−Ｘ−Ｚ^２−Ｚ^３−Ｘ_２−Ｚ^６−Ｈｉｓ−Ｘ_３−５−Ｈｉｓ−Ｘ_４-
   ［式中：
   Ｘは、独立して、あらゆるアミノ酸であり、Ｘ_ｎは、ポリペプチド鎖におけるＸの存在数を示し；
   Ｚ^−１は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
   Ｚ^２は、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
   Ｚ^３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
   Ｚ^６は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である］
   によって示されるものであり、該フィンガーは、さらなるフィンガーが存在する場合には、独立して、０ないし１０個のアミノ酸残基でもってそれらに共有結合したものである、請求項２もしくは３のキメラタンパク質。
5. Ｚ^−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸であり；
   Ｚ^２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
   Ｚ^３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
   Ｚ^６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
   請求項４のキメラタンパク質。
6. 前記ジンクフィンガーの少なくとも１つのＸ位が、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガー、Ｓｐ１フィンガーもしくはＳｐ１Ｃフィンガーに由来する対応アミノ酸を含む、請求項４または５のキメラタンパク質。
7. 前記の１つもしくはそれ以上の第１ドメインが、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むものであって、それぞれのジンクフィンガーが、式：−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｚ^−１−Ｓｅｒ−Ｚ^２−Ｚ^３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｚ^６−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
   によって示されるものであって、前記フィンガーは互いに直接結合しているものであって、ここに、
   Ｚ^−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
   Ｚ^２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
   Ｚ^３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
   Ｚ^６が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である、
   請求項１のキメラタンパク質。
8. Ｚ^−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、もしくはグルタミン酸であり；
   Ｚ^２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
   Ｚ^３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
   Ｚ^６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
   請求項７のキメラタンパク質。
9. 前記ＡＺＰが、３から１５個のジンクフィンガーを含み、そのいずれか１つもしくはそれ以上が前記式によって示されるものである、請求項３〜８のいずれか１項のキメラタンパク質。
10. 前記ＡＺＰが、７、８もしくは９個のジンクフィンガーを含むものである、請求項９のキメラタンパク質。
11. 前記ＡＺＰが、６個のジンクフィンガーを含むものである、請求項１０のキメラタンパク質。
12. 前記の１つもしくはそれ以上の第２ドメインが、直接的または間接的に、核膜、核ラミナ、ヘテロクロマチンもしくはそれらいずれかの組み合わせと会合する、または結合する、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
13. 前記第２ドメインの１つがＧＣＬタンパク質もしくはＧＣＬタンパク質の結合部分である、請求項１２のキメラタンパク質。
14. 前記の１つもしくはそれ以上の第２ドメインが、核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質、ヘテロクロマチン結合タンパク質、前記タンパク質のいずれかと会合もしくは結合することのできるタンパク質、前記タンパク質のいずれかの結合部分、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１２のキメラタンパク質。
15. 前記核ラミナ結合タンパク質、もしくは前記核ラミナ結合タンパク質の結合部分が、ラミンもしくはラミナ結合タンパク質である、請求項１４のキメラタンパク質。
16. 前記ヘテロクロマチン結合タンパク質、もしくは前記ヘテロクロマチン結合タンパク質の結合部分が、ＨＰ１およびポリコーム群タンパク質（polycomb-group protein）からなる群より選択されるものである、請求項１４のキメラタンパク質。
17. １から６個の第１ドメイン、および１から６の第２ドメインを含む、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
18. さらに、核局在シグナルを含む、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
19. さらに、細胞取り込みシグナルを含む、前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質。
20. さらに、核局在シグナルを含む、請求項１９のキメラタンパク質。
21. 治療上有効量の前記請求項のいずれか１項のキメラタンパク質を、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
22. 請求項１〜２０のいずれか１項のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
23. 請求項２２の核酸を含む発現ベクター。
24. 請求項２３の発現ベクターを含むホスト細胞。
25. キメラタンパク質を調製する方法であって、
    （ａ） 前記キメラタンパク質を発現する条件下で、請求項２４のホスト細胞を一定時間培養すること；および
    （ｂ） 前記キメラタンパク質を回収すること
    を含む方法。
26. 前記ベクターが、調節のための標的遺伝子を含む細胞へのトランスフェクトに適合した真核細胞発現ベクターである、請求項２３の発現ベクター。
27. 治療上有効量の請求項２２、２３もしくは２６のいずれか１項の核酸または発現ベクターを、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
28. 標的核酸をキメラタンパク質と結合させる方法であって、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を含む標的核酸を、請求項１−２０のいずれかのキメラタンパク質と、前記タンパク質が前記核酸に結合するのに十分な量および時間にて、接触させることを含む方法。
29. 標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートする方法であって、標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を含む標的核酸を、請求項１−２０のいずれかのキメラタンパク質と、前記キメラタンパク質が前記標的遺伝子の発現を抑制もしくはダウンレギュレートするのに十分な量および時間にて、接触させることを含む方法。
30. 前記キメラタンパク質が、タンパク質として、または前記タンパク質をコードする核酸として、細胞もしくは生物に導入される、請求項２８もしくは２９の方法。
31. キメラタンパク質が、さらに、核局在シグナルを含むものである、請求項２８〜３０のいずれか１項の方法。
32. キメラタンパク質が、さらに、細胞取り込みシグナルを含むものである、請求項２８〜３１のいずれか１項の方法。
33. 前記標的遺伝子が、哺乳類遺伝子、昆虫遺伝子もしくは酵母遺伝子をコードするものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
34. 前記標的遺伝子が、哺乳類に由来するものであって、サイトカイン、インターロイキン、癌遺伝子、血管形成因子、抗血管形成因子、薬物耐性遺伝子、成長因子または腫瘍サプレッサーをコードするものである、請求項３３の方法。
35. 前記標的遺伝子が、ウイルス遺伝子をコードするものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
36. 前記ウイルス遺伝子が、ＤＮＡウイルスに由来するものである、請求項３５の方法。
37. 標的遺伝子が、植物遺伝子をコードするものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
38. 前記植物遺伝子が、ジャガイモ、トマト、トウモロコシ、コメもしくは穀物用植物に由来するものである、請求項３７の方法。
39. 前記標的遺伝子が、商業用動物に由来するものである、請求項２８〜３２のいずれか１項の方法。
40. （ａ） 標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合することのできる第１ドメイン、および２価のリガンドの第１の結合部分に特異的に結合することのできる第２ドメインを含む、第１の融合タンパク質であって、前記リガンドが、細胞によって取り込まれることのできるものであって、前記第１ドメインが、前記第２ドメインに対して異種である第１の融合タンパク質；ならびに
    （ｂ） 核周辺部と会合することのできる第１ドメイン、および前記の２価のリガンドの第２の結合部分に特異的に結合することのできる第２ドメインを含む、第２の融合タンパク質；
    を含む分子スイッチシステム。
41. それぞれの融合タンパク質の前記第２ドメインが、２価のリガンドのそれぞれの結合部分に対する特異性を有する抗体の１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である、請求項４０の分子スイッチシステム。
42. （ａ） 標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列に特異的に結合することができる第１ドメイン、および結合相手に特異的に結合することができる第２ドメインを含み、前記第１ドメインが前記第２ドメインに対して異種である、第１の融合タンパク質、ならびに
    （ｂ） 核周辺部と会合することができる第１ドメイン、および前記前記第１の融合タンパク質の第２ドメインの結合相手を含む第２ドメインを含み、前記第１ドメインが前記第２ドメインに対して異種である、第２の融合タンパク質
    を含む分子スイッチシステム。
43. 第１の融合タンパク質の前記第２ドメインが、Ｓ−タンパク質であって、前記第２の融合タンパク質の第２ドメインが、Ｓ−タグであるか、あるいはその逆である、請求項４２の分子スイッチシステム。
44. 前記第１の融合タンパク質の第１ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、人工的なジンクフィンガータンパク質（ＡＺＰ）、ロイシンジッパータンパク質、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質、ホメオボックスドメインタンパク質、前記タンパク質のいずれかのＤＮＡ結合部分、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むものである、請求項４０〜４３のいずれか１項の分子スイッチシステム。
45. 前記ＡＺＰが、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むものであって、それぞれのジンクフィンガーは、独立して、式：−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_２−４−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｚ^−１−Ｘ−Ｚ^２−Ｚ^３−Ｘ_２−Ｚ^６−Ｈｉｓ−Ｘ_３−５−Ｈｉｓ−Ｘ_４-
    ［式中：
    Ｘは、独立して、あらゆるアミノ酸であり、Ｘ_ｎは、ポリペプチド鎖におけるＸの存在数を示し；
    Ｚ^−１は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
    Ｚ^２は、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
    Ｚ^３は、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
    Ｚ^６は、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である］
    によって示されるものであり、該フィンガーは、さらなるフィンガーが存在する場合には、独立して、０ないし１０個のアミノ酸残基でもってそれらに共有結合したものである、請求項４４の分子スイッチシステム。
46. Ｚ^−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸であり；
    Ｚ^２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
    Ｚ^３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
    Ｚ^６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
    請求項４５の分子スイッチシステム。
47. 前記ジンクフィンガーの少なくとも１つのＸ位が、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガー、Ｓｐ１フィンガーもしくはＳｐ１Ｃフィンガーに由来する対応アミノ酸を含む、請求項４５または４６の分子スイッチシステム。
48. 前記の第１の融合タンパク質の第１ドメインが、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むものであって、
    それぞれのジンクフィンガーが、式：
    −Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｚ−^１−Ｓｅｒ−Ｚ^２−Ｚ^３−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｚ^６−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
    によって示されるものであって、前記フィンガーは互いに直接結合しているものであって、ここに、
    Ｚ^−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、メチオニンもしくはグルタミン酸であり；
    Ｚ^２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
    Ｚ^３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
    Ｚ^６が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、チロシン、ロイシンもしくはグルタミン酸である、
    請求項４０〜４３のいずれか１項の分子スイッチシステム。
49. Ｚ^−１が、アルギニン、グルタミン、スレオニン、もしくはグルタミン酸であり；
    Ｚ^２が、セリン、アスパラギン、スレオニンもしくはアスパラギン酸であり；
    Ｚ^３が、ヒスチジン、アスパラギン、セリンもしくはアスパラギン酸であり；および
    Ｚ^６が、アルギニン、グルタミン、スレオニンもしくはグルタミン酸である、
    請求項４８の分子スイッチシステム。
50. 前記ＡＺＰが、３から１５個のジンクフィンガーを含み、そのいずれか１つもしくはそれ以上が前記式によって示されるものである、請求項４４〜４９のいずれか１項の分子スイッチシステム。
51. 前記ＡＺＰまたは前記第１ドメインが、６、７、８もしくは９個のジンクフィンガーを含む、請求項５０の分子スイッチシステム。
52. 前記第２の融合タンパク質の第１ドメインが、核膜、核ラミナ、ヘテロクロマチン、もしくはそれらのいずれかの組み合わせと、直接もしくは間接的に、会合または結合するものである、請求項４０〜５１のいずれか１項の分子スイッチシステム。
53. 前記第２の融合タンパク質の前記第１ドメインが、ＧＣＬタンパク質もしくはＧＣＬタンパク質の結合部分である、請求項５２の分子スイッチシステム。
54. 前記第２の融合タンパク質の前記第１ドメインが、核膜結合タンパク質、核ラミナ結合タンパク質、ヘテロクロマチン結合タンパク質、前記タンパク質のいずれかと会合もしくは結合することのできるタンパク質、前記タンパク質のいずれかの結合部分、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項５２の分子スイッチシステム。
55. 前記核ラミナ結合タンパク質、もしくは前記核ラミナ結合タンパク質の結合部分が、ラミンもしくはラミナ結合タンパク質である、請求項５４の分子スイッチシステム。
56. 前記ヘテロクロマチン結合タンパク質、もしくは前記ヘテロクロマチン結合タンパク質の結合部分が、ＨＰ１およびポリコーム群タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項５４の分子スイッチシステム。
57. 治療上有効量の請求項４０〜５６のいずれか１項のキメラタンパク質を、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
58. 請求項４０〜５６のいずれか１項の分子スイッチシステムの第１もしくは第２の融合タンパク質、またはその両方をコードする核酸。
59. 前記第１および第２の融合タンパク質が、協調して調節されるものである、請求項５８の核酸。
60. 前記第１および第２の融合タンパク質が、独立して調節されるものである、請求項５８の核酸。
61. 請求項５８の核酸を含む発現ベクター。
62. 請求項６１の発現ベクターを含むホスト細胞。
63. １つもしくはそれ以上の融合タンパク質を調製する方法であって、
    （ａ） 前記の１つもしくはそれ以上の融合タンパク質を発現する条件下で、請求項６２のホスト細胞を一定時間培養すること；および
    （ｂ） 前記の１つもしくはそれ以上の融合タンパク質を回収すること
    を含む方法。
64. 前記ベクターが、調節のための標的遺伝子を含む細胞へのトランスフェクションに適合した真核生物発現ベクターである、請求項６１の発現ベクター。
65. 治療上有効量の請求項６４の発現ベクターを、医薬上許容される担体との混合物中に含む、医薬組成物。
66. （ａ） 標的遺伝子に関連したヌクレオチド配列を有する標的ヌクレオチド配列を含む細胞もしくは生物を、請求項４０、４１または４４〜５６のいずれか１項の分子スイッチシステムと接触させること、ついで、
    （ｂ） 前記融合タンパク質間の複合体の形成を可能にする時期または位置において、前記細胞または生物を、前記分子スイッチシステムの２価のリガンドと接触させ、そのことにより、前記標的遺伝子の発現を抑制すること
    を含む、時間的もしくは空間的な様式で、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
67. （ａ） 標的遺伝子と関連したヌクレオチド配列を有する標的ヌクレオチド配列を含む細胞もしくは生物を、請求項４２〜５６のいずれか１項の分子スイッチシステムと接触させること、ついで、
    （ｂ） 第１および第２の融合タンパク質の会合を分裂させる時期または位置において、前記細胞または生物をリガンドと接触させ、そのことにより、前記標的遺伝子の発現を抑制解除すること
    を含む、時間的もしくは空間的な様式で、標的遺伝子の発現を活性化する方法。
68. 前記分子スイッチシステムの融合タンパク質が、タンパク質として、１つもしくはそれ以上の前記タンパク質をコードする１つもしくはそれ以上の核酸として、またはそれらの組み合わせとして、細胞もしくは生物へ導入されるものである、請求項６６もしくは６７の方法。
    
    

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