JP2005511093A - 被験化合物の毒性についてのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト細胞に及ぼす毒性影響について薬物候補をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、被験化合物の特異体質の毒性を測定する方法をも提供する。

Description

発明の詳細な説明

本出願は、米国仮出願番号60/336,509（2001年10月31日出願）（このものは、本明細書の一部を構成する）からの優先権を主張する。

（技術分野）
本発明は、被験化合物が細胞に及ぼすそれらの影響を測定するために、該被験化合物をスクリーニングする方法に関する。特に、本発明はヒト細胞に及ぼす毒性影響について潜在的な薬物候補をスクリーニングする方法に関する。

（背景技術）
ヒトセルラインは、様々な実験室の方法において使用されている。例えば、不死化ヒト肝臓細胞は、異なる化学的クラスの発癌物質を用いる代謝研究において使用されている。気管支の上皮細胞は、扁平上皮の分化の制御、並びに扁平上皮の分化を誘発する化学的薬物および生物学的薬物の同定の研究において使用されている。これらヒト細胞タイプの両方が、それらを試験する該化学物を含有する媒地中、インビトロで増殖し、次いで適当な曝露期間後に、例えばトリパンブルー排除(exclusion)アッセイまたは関連アッセイによって、発癌物質に曝露後に遺伝毒性、ＤＮＡ付加形成、変異誘発、細胞形質転換および／または細胞毒性が起こるかどうかおよびその大きさを測定することにより、癌および関連疾患の処置に適当な化学物をスクリーニングするのに使用されている。これらのセルラインはまた、プログラム細胞死またはアポトーシスを誘発する薬物（これは、悪性転換の防止において重要なインパクトを有し得る）を同定するためにも使用されている。プログラム細胞死は、ＤＮＡ断片化または細胞表面抗原の分析によってアッセイされる。

ヒトセルラインはまた、ＤＮＡ変異誘発を研究するためにも使用されている。変異原または変異原前駆体であると知られまたは考えられている物質を該細胞の培地に加え、次いで変異誘発を、例えば薬物耐性の突然変異細胞コロニーの出現を検出することによって、アッセイすることができる。同様に、細胞媒介性のＤＮＡ変異誘発は、該細胞を変異原性化合物を分泌することができると知られまたは考えられている細胞タイプと一緒に同時培養することによって調べられている。ヒトセルラインはまた、染色体損傷薬物の研究、悪性転換の研究、潜在的な化学療法薬物のスクリーニング、細胞生化学の研究、増殖因子に対する細胞応答および増殖因子産生の研究、細胞内情報伝達の研究、細胞表面抗原のキャラクタリゼーション、腫瘍抑制因子活性の同定のためのハイブリッド研究、並びに新規な遺伝子の同定においても使用されている。

上記の研究の全てにおいて、使用される該ヒトセルラインは、チトクロームＰ４５０を発現することができる。チトクロームＰ４５０は、生体異物（例えば、薬物、発癌物質および環境汚染物質）、並びに内部寄生物(endobiotics)（例えば、ステロイド、脂肪酸およびプロスタグランジン）を代謝することができる血液タンパク質酵素の大きなファミリーである。チトクロームＰ４５０ファミリーのいくつかのメンバーは、動物および培養細胞の両方において誘発可能であるが、一方で他の構成形態は誘発不可能である。この酵素群は、有害な活性（例えば、毒性の変異原性および発癌性の形態への生体異物の代謝的変換）、および有利な活性（例えば、生体異物の解毒）の両方を有する。

医薬産業において、毒性について薬物候補化合物をスクリーニングすることは、薬物の開発プロセスにおける重要な段階である。毒性の見込み(likelihood)が増大した化合物をできるだけ早く同定することが非常に所望される。例えば、肝臓の毒性（例えば、急性肝不全）は、現在では市場からの薬物排除の主因である。

肝臓への化学的損傷は、例えば毒性薬物の性質、損傷の機構、曝露の性質および宿主の感受性などの因子を含む多面的な現象である。様々な薬物が肝臓の損傷を引き起こし得るが、通常様々な種におけるほとんどのレシピエントの肝臓を損傷可能な化合物は、「真の(true)」または「内因性の(intrinsic)」肝臓毒物と呼ばれる。それらの損傷可能性をアンマスクする宿主の特異な感受性に依存する薬物は、「特異体質の(idiosyncratic)」肝臓毒と呼ばれる。該化学品の損傷影響に対する宿主肝臓の感受性の増大は、２個の広範な分類の機構と関連付けることができる。第１の分類は、免疫応答の関与を示唆する臨床的および生理学的な症状を有し、そしてこのものは通常「薬物過敏性」と示される。第２の分類は、付随する免疫反応の非存在下で出現する肝臓損傷から成り、そしてこのものは「代謝上の特異体質」と呼ばれる（Zimmerman, H.によるHepatoxicity, 2版, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (1999)）。「代謝上の特異体質」の理論が根底にある仮説とは、薬物代謝の産物は肝臓細胞へ成す損傷の原因であるが、それら代謝産物は大部分の個体群中では表立った肝臓損傷を与えるのに十分な量では産生しない、というものである。しかしながら、ある患者においては、該薬物の代謝経路は毒物種の産生に有利であり、そのことにより肝臓損傷が生じる。

医薬品における代謝産物関連の肝臓毒性を予想するには多数の障害が存在する。臨床的トライアルにおける肝臓毒性の予測は、多数の因子（例えば、個体群中での高い多型、動物モデルおよびヒトの間での代謝の差違、並びに性別および年齢によるチトクロームＰ４５０発現の差違を含む）の為に乏しい。加えて、インビボ研究は高価であって、且つ時間を費やす。

薬物開発プロセスにおける大きな障壁の１つは、どの薬物候補が特異体質の毒性を示すかを予測することである。代謝上の特異体質を予測する際の大きな問題は、大部分の個体群を代表するモデルを見つけることではなく、むしろ代謝が毒性の方向に向いているほとんどいない被験者を代表するモデルを見つけることである。内因性の毒性と比較して、特異体質の毒性は、その毒性の性質のために予測することはかなりより困難である。内因性の毒性は、（１）典型的に該薬物の性質であり；（２）絶え間なく出現し；（３）用量に依存し；（４）毒性の明白な発生を特徴とし；そして、（５）動物モデルによって予測される。一方で、特異体質の毒性は、（１）典型的に、薬物および患者の特異的因子の間での相互作用の結果であり；（２）かなり出現（＜１／１０,０００）することはまれであり；（３）通常、用量には独立しており；（４）発生の遅れを特徴とし；そして、（５）動物モデルを用いて予測することは困難である（不可能でないが）。

従って、毒性について化合物をスクリーニングする、速くて、入手可能で、正確な方法に対する要求が存在する。具体的には、薬物候補の特異体質の毒性を予測するための方法に対する要求が存在する。特に、薬物開発プロセスにおいて早期に特異体質の毒性を同定するための方法に対する要求が存在する。ヒトの代謝を反映しておりそして多種多様なヒト個体群を代表する毒性について化合物をスクリーニングする方法に対する要求もまた存在する。

（発明の概要）
本発明は、化合物が細胞に及ぼす毒性影響を測定するために、化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。第１の態様において、本発明は、第１相酵素を発現する細胞と被験化合物とを接触させ；該被験化合物が毒性代謝産物を生成するかどうかを測定するために（ここで、該毒性代謝産物の生成は該被験化合物が特異体質の毒性を示すことを示唆する）、該細胞を細胞生存度指標薬と接触させることによって、化合物が特異体質の毒性を示すかどうかを測定する方法を提供する。好ましい態様において、該指標薬は色素原化合物であり、テトラゾリウム化合物がより好ましく、該指標薬は３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−５−(３−カルボキシメトキシフェニル)−２−(４−スルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩であることが最も好ましい。本発明の方法において使用する最も好ましいセルラインは、ＴＨＬＥ−５Ｂセルライン（このものはまた、「ＴＨＬＥ−５」とも呼ばれる）である。好ましいチトクロームＰ４５０は、３Ａ４、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、１Ａ１、１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ１１および２Ｅ１を含む。これらのうちで、３Ａ４、２Ｃ９、２Ｃ１９および２Ｄ６は本発明について使用するのに最も好ましいチトクロームＰ４５０である。

本発明の方法は、手動で行なうことができる、本発明の方法は、ハイスループットを達成するために、自動化システムを用いて行なうことが好ましい。

（発明の詳細な記載）
本発明の１態様は、肝臓細胞による化学的な化合物の代謝を利用する。一般的に言えば、肝臓による化学的な化合物の排出は通常、２個の段階を含む。第１の段階では、該化合物の化学構造のある部分を改変して、「化学的に反応性の」末端を形成する。第２の段階では、大きな親水性基が該反応性部分に付加して、親化合物の３次元構造を乱して、そして生物学的液体中でのその排出を促進する。これらの段階は薬物代謝の２個の「相」を形成し、そしてこれらは各々、特定の酵素ファミリーによって触媒される。チトクロームＰ４５０は、「第Ｉ相」反応または反応物の生成に関与する酵素の１つである。

ある場合に、第Ｉ相酵素反応による反応種の産生と、続く第ＩＩ相反応の間の接合(conjugation)による排出との間に脱同期化(desynchronization)が存在し得る。例えば、第Ｉ相酵素の量が増大し、そのことにより反応代謝産物が増大するが、第ＩＩ相酵素においてはそれに対応する増大が存在しない場合には、脱同期化が生じる。あるいは、脱同期化は、例えば多型由来の結果として第ＩＩ相酵素の非存在または欠失から生じ得る。しかしながら、第ＩＩ相酵素の欠失はまた、別物質（例えば、血液をさらさらにする(blood-thinning)化合物および生サプリメント(herbal supplement)）を用いて処置される被験者においても生じ得る。これらの被験者において、該別物質の代謝産物は、別に該第Ｉ相酵素によって生成する反応代謝産物に作用すると示される第ＩＩ相酵素を競合し得る。脱同期化の結果として、反応種は細胞質内部に蓄積され得て、そしてこのものは高分子（すなわち、細胞構造または代謝に関与するタンパク質）と結合し得る。これらの高分子の変化は、重要な機能の低下および細胞毒性を生じ得る。

１態様において、本発明はあるタイプの第Ｉ相酵素の量を増大させ、一方で宿主細胞中での第ＩＩ相酵素の産生の低下を利用することによって、毒性について化学的な化合物をスクリーニングする方法を提供する（図１を参照）。好ましい態様において、細胞中での第Ｉ相酵素の量は、発現ベクターの使用によって増大する。本発明の方法によれば、該形質移入した細胞は、それらの細胞質中で直接的に反応代謝産物を生成しそしていずれの毒性影響を示す能力も非常に大きく増大した。この方法において、本発明の方法は、特異体質の毒性を受け易い個体の肝臓中で生じ得る病気をシミュレートする。好ましい態様において、本発明の方法は、第Ｉ相酵素の発現レベルが増大した細胞を含む。例えば、第１相酵素の発現の増大は、原発性ヒト肝細胞（ＰＨＨ）中での同一酵素の発現の少なくとも約２０倍大きく、より好ましくは少なくとも約５０倍大きく、最も好ましくは少なくとも約１００倍大きい。別の好ましい態様において、本発明の方法は、第ＩＩ相酵素の発現が低下した細胞を含む。例えば、第ＩＩ相酵素の発現の低下は、ＰＨＨ中での同一酵素の発現の少なくとも約７０％低く、より好ましくは少なくとも約８０％低く、最も好ましくは少なくとも約９０％低い。

通常、チトクロームＰ４５０を発現したりまたは発現させるために調製するいずれかのセルラインを、本発明において使用することができる。ヒト肝臓柔細胞由来のセルラインは、肝臓毒性の予測にとって好ましい。本発明の方法において使用するための不死化ヒトセルラインは、当該分野において知られる方法によって得ることができる。例えば、ヒト肝細胞セルラインは、Pfeifer, A.M.らによる「Simian virus 40 large tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte characteristics and metabolize chemical carcinogens」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 5123-5127 (1993)（これは、本明細書の一部を構成する）に記載する通り、サルウイルス４０ラージＴ抗原を用いる形質転換によって不死化することができる。該不死化ヒト細胞は、静止状態の正常なヒト肝細胞に似ており、そしてこのものはヌードマウス中に注射した場合に非腫瘍原性であって、複相(diploid)に近い核型を有し、アルファ−胎児タンパク質を発現せず、そしてＢ型肝炎ウイルスまたはヒト免疫不全症ウイルスがないことが報告されている（Pfeiferらによる、1993）。ＴＨＬＥ−５セルライン（このものはまた、「ＴＨＬＥ−５Ｂ」とも呼ばれる）は、ブダペスト条約の条件および規約の下、アメリカンタイプカルチャーコレクションに１９９２年４月２３日に受託され、そして寄託番号ＣＲＬ１１１１３と指定されている。親セルラインであるＴＨＬＥ−５Ｂ−ｃ１５（Ｔ５−ｃ１５）は第Ｉ相代謝活性を発現しないが、ほとんどの第ＩＩ相代謝酵素（例えば、グルタチオンＳ−転移酵素、エポキシド加水分解酵素、Ｎ−アセチル転移酵素Ｉ型、アルデヒド還元酵素、およびキノン還元酵素、並びに解毒系（例えば、スパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ)およびカタラーゼ））の正常な発現を保持する。

好ましい態様において、各々異なるチトクロームＰ４５０を発現する複数の細胞を、本発明の方法において使用する。それらの命名によって示す通り異なるチトクロームＰ４５０（それぞれ、３Ａ４、２Ｃ９、２Ｃ１９および２Ｄ６）を発現する４つの別個のセルライン、ＴＨＬＥ−５Ｂ−３Ａ４、ＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｃ９、ＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｃ１９およびＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｄ６を、当該分野において知られる方法を用いて、ＣＭＶ発現ベクターを含有するプラスミド、特異的なＰ４５０イソ酵素をコードするヒトｃＤＮＡ、および選択マーカーによるＴＨＬＥ−５Ｂ−ｃ１５の形質移入によって誘導化した。

これら４つのセルラインを使用することにより、毒性代謝産物の生成または親化合物の解毒におけるこれら各酵素の具体的な役割の測定が可能となる。従って、本発明の別の態様において、本発明の本方法によって集められる情報を用いて、ある個体群の毒性の見込みを予測することができる。例えば、ＣＹＰ ２Ｄ６のみによる親化合物の解毒は、細胞生存度の低下、併せて親ＴＣ５セルライン、および２Ｄ６セルラインを除く３個の他の娘ライン中での薬物濃度の増大によって示され得る。これらの結果は、この酵素が欠乏している個体群において、肝臓の責務(liability)の見込みの増大を示唆する。

本発明は、チトクロームＰ４５０多型が薬物代謝において有し得る影響に幾分基づく。チトクロームＰ４５０の６個のイソ酵素（２Ｅ１、２Ｃ１９、２Ｃ９、３Ａ４、２Ｄ６、１Ａ１および１Ａ２）は、全てのチトクロームＰ４５０媒介性反応の約９５％を説明する。これらのうち、２Ｄ６、２Ｃ９および２Ｃ１９は、薬物影響における臨床関連の変化に関係する大部分の多型を説明する、チトクロームＰ４５０である。Evans, W.E.およびRelling, M.V.による「Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics」, Science 286(5439): 487-91 (1999年10月15日)を参照。

図１は、原発性ヒト肝細胞（ＰＨＨ）と比較した、鍵第１相酵素（左）および第２相酵素（右）についてのｍＲＮＡ発現レベルを示す。図１において、該代謝酵素の発現レベルは、原発性ヒト肝細胞中での同一酵素のレベルに規格化した。左図に示す通り、該細胞は原発性ヒト肝細胞よりも個々のＰ４５０について何倍も大きいｍＲＮＡを発現する。加えて、第ＩＩ相酵素（例えば、ＵＤＰＧＴ）は、約１０倍低く発現した。この差次的な発現は、潜在的な反応代謝産物の生成、並びにそのものが重要な細胞成分と反応する可能性を増大する。

図２は、ヒト肝臓ミクロソーム、３Ａ４スーパーソーム(Supersomes)（登録商標）およびＴＣ５セルラインによるブスピロンの代謝を比較する。３Ａ４セルラインの代謝プロフィールは、ヒト肝臓または昆虫セルラインから抽出したミクロソームについて得られた結果と密接に一致し、このことは該試験系中で産生する代謝産物はおそらく被験者の肝臓中においてもまた産生しているであろうことを示す。予想通り、親セルラインは、４４時間インキュベート後でさえも該被験化合物のいかなる代謝を示さない。

図３は、本発明のハイスループットアッセイにおいて使用するコントロール試料についての結果を示す。細胞のみおよび媒地のみのコントロールを、全てのプレートにおいて含み得る。加えて、２つの化合物、例えばペルヘキシリン(perhexiline)（毒性の正の対照−公知のヒト肝臓毒物）およびテオフィリン(theophylline)（毒性の負の対照）を、各試験において含み得る。プレート間の変動係数を、各プレートに存在する細胞のみおよび媒地のみのウェルから算出する。

図４は、本発明の方法から得られる試料データを示す図面である。左図の化合物は、ＴＣ５セルライン、並びに全ての形質移入セルラインにおいて毒性を示した。従って、そのものは内因性の肝臓毒物であると予想される。右図の化合物は、臨床上の肝臓の責務の見込みが増大するとは予測されない。

図５は、ＣＹＰ ２Ｃ１９代謝による親化合物の毒性の低下を示す図面である。該アッセイは、チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９による代謝後に、親化合物の毒性の顕著な軽減を示す。本化合物は、多数の個体群について無害となり得る。しかしながら、肝臓毒性の増大が、低ＣＹＰ ２Ｃ１９代謝群の亜集団において見られ得る。

図６は、ＣＭＰ ２Ｃ１９代謝後の毒性の増大を示す。この場合、それは、薬物候補の全代謝における２Ｃ１９経路の重要性を評価するために原発性ヒト肝細胞について該化合物を試験するのに役立ち得る。

以下の溶液および試薬を調製し、そしてこれらを本明細書中に記載する実験において使用した。

媒地（ＣＭ）
低カルシウム媒地、ＰＭＦＲ−４（このものは、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシン、１．７５μＭ インスリン、０．２μＭ ヒドロコルチゾン、５ｎｇ／ｍＬ 上皮成長因子、１０μｇ／ｍＬ トランスフェリン、５００ｎＭ ホスホリルエタノールアミン(phosphoryethanolamine)／エタノールアミン、５０ｎＭ トリヨードチロニン、１５μｇ／ｍＬ ウシ下垂体エキス、０．３３ｎＭ レチノイン酸および３％ 胎児ウシ血清（Biofluids社製）を用いて補足）。

トリプシンＥＤＴＡ １×（０．０５％）（Life Technologies社製）。

３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−５−(３−カルボキシメトキシフェニル)−２−(４−スルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩（「ＭＴＳ」）およびフェナジンメトサルフェート(phenazine methosulfate)（ＰＭＳ）の溶液は、以下の通り製造した。ＭＴＳ溶液は光感受性であるので、そのものは該アッセイの実験毎に新たに製造した。

ＭＴＳ溶液
２ｍｇ／ｍＬ ＭＴＳ溶液は、ダルベッコ(Dulbecco製)ＰＢＳ（Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋なし；Life Technologies社製）（１２０ｍＬ）中にＭＴＳ（Promega Corp.社製）粉末（２４０ｍｇ）を溶解することによって調製した。該溶液は必要時に加温して該粉末を溶解し、次いで０．２２μｍフィルターを通してろ過した。

ＰＭＳ溶液
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ、シグマ製）のＰＢＳ溶液（０．９２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、そしてこのものを０．２２μｍのフィルターを通してろ過した。該２個の溶液を、使用のために、ＰＢＳ（１ｍＬ）に対してＭＴＳ（２０ｍＬ）の比率で混合した。

コーティング媒地
ＬＨＣ基底媒地（Biofluids製、番号118；５００ｍＬ）に、ヒトフィブロネクチン（Collaborative Biomedical Products、番号40008A；５ｍｇ）、ビトロゲン(Vitrogen)１００（精製ウシコラーゲン；Collagen Corp社製、番号PC0701；５ｍＬ）、ＢＳＡストック液（Biofluids社製、番号343；０．１％、５０ｍＬ）を加えた。該溶液を０．２２μｍのフィルターを通してろ過した。

十分な量のコーティング媒地を加えて、該ウェルまたはフラスコを覆い、続いて３７℃で少なくとも１５分間インキュベートした。フラスコまたはウェルに播種する前に、コーティング媒地を除いた。

細胞の調製および培養
細胞を、５％ＣＯ_２下、３７℃で培養した。該細胞を、１７５ｃｍ^２培養フラスコ中で連続的に継代させ、７日毎に１：１０に分割した。およそ第５の継代毎に、Ｇ４１８（１５０μｇ／ｍＬ）を加えることによって、細胞を選択した。周期的に、娘ラインの代謝活性を、Ｐ４５０特異的蛍光基質の使用によって確認した。細胞継代のために、該細胞をＰＢＳを用いてすすぎ、トリプシン（トリプシンＥＤＴＡ １×（０．０５％）、Life Technologies社製）と一緒に５分間インキュベートし、そして媒地中で収集した。実験的な処置のために、細胞を、１００μＬ容量の９６ウェル培養皿（Falcon社製）中に１．５×１０^４細胞／ウェルで播種した。

被験化合物の製造および投与
全ての被験化合物を、２５ｍｇ／ｍＬ（２５,０００μｇ／ｍＬ）および５ｍｇ／ｍＬ（５,０００μｇ／ｍＬ）でＤＭＳＯ中に溶解し、そしてこのものを媒地に加えて、最終濃度を１容量％とした。試験前に、出発濃度：２５０および５０μｇ／ｍＬをSPECTRAmax（登録商標）分光光度計で読み取って、溶解度を評価した。化合物が５０μｇ／ｍＬで可溶でない場合には、連続希釈物を調製し、そして試験して最大可溶濃度を測定した。ロボットシステムで試験する場合には、母プレート中の初期濃度は２５０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬ（２×濃度）とした。これらの２個の初期濃度は重なり曲線(overlapping curves)を与える。試験した第１希釈で且つ最大の濃度は、０．５％ＤＭＳＯ中、１２５μｇ／ｍＬまたは２５μｇ／ｍＬとし、そして最終容量は１００μＬとした。更なる連続希釈物は、２倍で、６２．５、３１．２５、１５．６および７．８μｇ／ｍＬ（１２．５、６．２５、３．１２５．１．６２５μｇ／ｍＬ）とし、そして該ＤＭＳＯを同一パターンで２倍に希釈した。集密単層を形成後に、被験化合物（１００μＬ）を含有する媒地を該細胞に加えた。正（例えば、ペルヘキシリン）および負（例えば、テオフィリン）の参照薬物を、各試験に含めた。

自動化または「ロボット」法において、試験する最大濃度（２５ｍｇ／ｍＬ）を２倍とした三組の被験物含有の「母プレート」（９６ウェル）は、該アッセイのための化合物の供給として供する。この母プレートから、５個の連続的な２倍の段階希釈物（１００μＬ）を、ロボットアーム（CRS Robotics, Burlington, Ontario）および各セルラインについてQuadraピペッター(pipettor)を用いて調製した。例えば、該母プレート中に濃度が２００μＭで調製した化合物を、該細胞がプレート１中では１００μＭで、プレート２中では５０μＭで、プレート３中では２５μＭで、プレート４中では１２．５μＭで、そしてプレート５中では６．２５μＭで試験した。これらの５個の異なる濃度を、５個のセルラインの各々について、総計で２５個の異なるプレートについて反復する。該プレートを、Hotpackインキュベート中、５％ＣＯ_２下、３７℃で２０時間インキュベートした。該インキュベート期間後に、混合したＰＭＳ−ＭＴＳ溶液（２２μＬ）を、ロボットアームおよびQuadraピペッターを用いて加えた。該試験プレートを、該インキュベーターに再び移した。ＭＴＳと一緒に更に２時間インキュベート後に、該プレートをプレートリーダー（Wallac Victor 1420）に個別に運び、そして吸光度の強度を４９０ｎｍで測定した。

手動方法において、試験する最大濃度を２倍にした試験化合物は、該アッセイのための化合物の供給として供した。この母プレートから、５個の連続的な２倍の段階希釈物を、各セルラインについて調製した。例えば、母プレート中に濃度が２００μＭで調製した化合物を、該細胞がプレート１中では１００μＭで、プレート２中では５０μＭで、プレート３中では２５μＭで、プレート４中では１２．５μＭで、およびプレート５中では６．２５μＭで試験した。これらの５個の異なる濃度を、５個のセルラインの各々について、総計で２５個の異なるプレートについて反復する。ハンドヘルドマルチピペッター(hand-held multi-pipettor)を用いて、手動アッセイにおける工程を行なった。該プレートを、標準的な実験室用インキュベータ中、５％ＣＯ_２下、３７℃で２０時間インキュベートした。該インキュベート期間後に、混合したＰＭＳ−ＭＴＳ溶液（２２μＬ）を各ウェルに加えた。更に２時間インキュベート後に、吸光度の強度を、Wallac Victor 1420プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで測定した。

細胞生存度の評価
ＭＴＳは、ミトコンドリアの機能の指標物質である。従って、該アッセイは増殖中の生存細胞の数を測定するための比色方法とする。電子カップリング試薬（フェナジンメトサルフェート）の存在下でのＭＴＳは、細胞によって組織媒地に可溶なホルマザンにバイオ還元(bioreduced)される。ＭＴＳの水溶性ホルマザンへの変換は、代謝活性な細胞中に見られるデヒドロゲナーゼ酵素によって達成される。４９０ｎｍでの吸光度の量によって測定されるホルマザン生成物の量は、培養中の代謝活性な細胞の数に正比例する。

結果の分析
実験の確証は、３個の基準（ペルヘキシリンＩＣ_５０、テオフィリンＩＣ_５０、およびプレート間変異係数）を従来の参照と比較することによって行なった。試験を拒絶する場合には、次いでこの特定の実験由来の全データを廃棄し、そして全試験物を再実験した。有効な試験からのデータを、バックグラウンドの吸光度（これは、「媒地のみのウェル」によって定義される）、並びにプレート間変異（これは、細胞のみのウェル中で観察される生存度のパーセントとして表す）で調節し、そして測定する終末点に関する有意な濃度関連の変化について調べた。該被験化合物の各反復毎に、濃度−反応曲線を異なるセルラインについてプロットし、４個のパラメータのロジスティック回帰モデルを用いてＩＣ_５０を測定した。該ＩＣ_５０を、回帰直線上の５０％生存度に相当する濃度と定義する。平均偏差および標準偏差（ＳＤ）(ａ mean and standard deviation)を、反復から得られる３個のＩＣ_５０から算出する。これらのデータを、各被験化合物、並びに正の対照および負の対照について報告する。

結果の解釈
最大溶解度が５０μＭより大きい化合物の場合
いずれかのセルライン中のＩＣ_５０が５０＋ＳＤよりも低い被験化合物は、臨床上の肝臓の責務の見込みが増大すると予想された。全セルライン中のＩＣ_５０が５０＋ＳＤμＭよりも大きい被験化合物は、臨床上の肝臓の責務の見込みが低下すると予想された。

最大溶解度が５０μＭより低い化合物の場合
いずれかのセルライン中でＩＣ_５０を有する被験化合物は、臨床上の肝臓の責務の見込みが増大すると予想された。用量応答曲線を５０μＭにまで外挿することが可能である場合には、全セルライン中の外挿ＩＣ_５０が５０＋ＳＤμＭよりも大きい被験物は、臨床上の肝臓の責務の見込みが低下すると予想され、そしていずれかのセルライン中の外挿ＩＣ_５０が５０μＭよりも低い被験物は、臨床上の肝臓の責務の見込みが増大すると予想された。該アッセイにおいて得られる最大溶解度を５０μＭにまで外挿することができない場合には、該臨床上の肝臓の責務の見込みは予測できない。

実施例
実施例１
不死化ヒト肝細胞を、コーティングしたプレート上の媒地（１００μＬ）中に、各ウェル当たり１．５×１０^４細胞でプレートした。これらの細胞を、５％ＣＯ_２下、３７℃で終夜インキュベートした。このインキュベートの間に、集密単層が生成した。被験化合物（１００μＬ）を試験する濃度の２×で細胞に加えることによって、細胞を被験化合物に曝露させた。低濃度の場合には、段階希釈を行なった（プレート当たり１濃度）。次いで、細胞を５％ＣＯ_２下、３７℃で２０時間インキュベートした。ＭＴＳ試薬を、各ウェルに容量２２μＬで加えた。次いで、細胞を２時間インキュベートし、そして４９０ｎｍでの吸光度を測定した。

本明細書中に記載する全ての刊行物、特許および特許出願は、引用によって包含する各々の独立した刊行物、特許または特許出願を具体的に且つ個別的に示すのと同じ範囲まで、引用によって本明細書中に包含する。

図１は、原発性ヒト肝細胞（ＰＨＨ）と比較して、鍵第Ｉ相酵素（左）および鍵第ＩＩ相酵素（左）について、ＴＨＬＥ−５細胞中でのｍＲＮＡ発現レベルを示す図面である。 図２は、ヒト肝臓ミクロソーム、３Ａ４スーパーソーム（登録商標）、３Ａ４およびＴＣ５のセルラインによるブスピロンの代謝の比較を示す図面である。 図３は、本発明のハイスループットアッセイにおいて使用するコントロール試料についての結果を示す図面である。 図４は、本発明の方法から得られる試料データを示す図面である。 図５は、ＣＹＰ ２Ｃ１９代謝による親化合物の毒性の低下を示す図面である。 図６は、ＣＹＰ ２Ｃ１９代謝後の毒性の増大を示す図面である。

Claims (13)

1. 化合物の特異体質の毒性を測定する方法であって、
   ａ）被験化合物を第１相酵素を発現する細胞と接触させ；
   ｂ）該細胞を細胞生存度指標薬と接触させて、該被験化合物が毒性代謝産物を生成するかどうかを測定し；
   ｃ）該毒性代謝産物の生成は該被験化合物が特異体質の毒性を示すことを示唆する、
   ことを含む、該方法。
2. 細胞が、ＴＨＬＥ−５Ｂ−３Ａ４、ＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｃ９、ＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｃ１９またはＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｄ６である、請求項１記載の方法。
3. 第Ｉ相酵素はチトクロームＰ−４５０である、請求項１記載の方法。
4. チトクロームＰ−４５０は３Ａ４、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、１Ａ１、１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ１１または２Ｅ１である、請求項３記載の方法。
5. 更に多数の細胞を含有し、ここで各細胞は異なる第Ｉ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。
6. 多数の細胞はＴＨＬＥ−５Ｂ−３Ａ４、ＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｃ９、ＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｃ１９およびＴＨＬＥ−５Ｂ−２Ｄ６を含む、請求項５記載の方法。
7. 指標薬は、３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−５−(３−カルボキシメトキシフェニル)−２−(４−スルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩である、請求項１記載の方法。
8. 細胞は、原発性ヒト肝細胞中の第Ｉ相酵素の発現レベルの少なくとも約２０倍大きいレベルで第Ｉ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。
9. 細胞は、原発性ヒト肝細胞中の第Ｉ相酵素の発現レベルの少なくとも約５０倍大きいレベルで第Ｉ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。
10. 細胞は、原発性ヒト肝細胞中の第Ｉ相酵素の発現レベルの少なくとも約１００倍大きいレベルで第Ｉ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。
11. 細胞は、原発性ヒト肝細胞中の第ＩＩ相酵素の発現レベルの少なくとも約７０％低いレベルで第ＩＩ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。
12. 細胞は、原発性ヒト肝細胞中の第ＩＩ相酵素の発現レベルの少なくとも約８０％低いレベルで第ＩＩ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。
13. 細胞は、原発性ヒト肝細胞中の第ＩＩ相酵素の発現レベルの少なくとも約９０％低いレベルで第ＩＩ相酵素を発現する、請求項１記載の方法。

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