JP2005510569A - Ｉａｐ阻害カスパーゼの活性化のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、コアペプチド５〜３９および４２〜５５からなる群より選択されるコアペプチドを有する単離された因子を提供する。この因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する。図５、９、１０、１４Ｂ、および２１〜２４に示される構造のいずれかから選択されるコア構造を有する単離された因子（この因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する）もまた提供される。本発明はさらに、ＩＰＡ阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供する。この方法は、ＩＰＳ阻害カスパーゼと、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するのに有効な量の因子とを接触させる工程を包含し、この因子は、コアペプチド４〜３９および４２〜５５のいずれかに示される配列を有するコアペプチドからなる群より選択されるコアモチーフ、ならびにＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４、またはＴＰＩ９２７からなる群より選択されるコア構造からなる。

Description

本発明は、米国国立衛生研究所／国立癌研究所によって授与された研究助成金番号ＣＡ７８０４０の下に政府支持をもって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
（発明の背景）
本発明は、一般的に分子医療およびより詳細には、プログラムされた細胞死の調節に関与する分子的相互作用を変更するための組成物および方法に関連する。
体内中の正常な組織は、最終分化状態に到達し、もはや分裂しない細胞または一定の期間後に死に、そして分裂細胞のプールから置換される細胞のいずれによって形成される。例えば、神経組織は発生初期に形成され、そして神経系の細胞は、新生後すぐに最終分化状態に到達する。対照的に、体は、細胞新生および細胞死の釣り合った流れを受ける皮膚、消化管、骨髄および性器官のような多数の自己再生組織を有する。この流動（平均的な成人において１日あたり５００〜７００億個の細胞の産生、そして１年間にわたって全体重と同等の細胞質量への到達を生じる）は、同数の細胞の調節根絶によって釣り合わされる。自己再生組織において、一部アポトーシスとして公知のプログラムされた細胞死のプロセス（これは、一定期間後に死ぬように、細胞が遺伝的に「プログラム」される）に起因して、根絶は維持される。
アポトーシスは、生物体の発生の間に、特に顕著であり、一時的に機能する細胞は、その機能がもはや必要とされなくなった後に死ぬようにプログラムされる。さらに、アポトーシスは、主要な遺伝的変化を受ける細胞中で生じ得、従ってこれは、不完全な細胞および潜在的に癌を形成する細胞をそれ自身が除去するための手段を有する生物体を提供する。アポトーシスはまた、生物体を種々の外来刺激（例えば、細菌性毒素、エタノールおよび紫外線照射を含む）に曝露することに起因して誘導され得る。癌を処置するための化学治療剤はまた、アポトーシスの強力な誘導物質である。
プログラムされた細胞死の調節は、多数の経路を包含する複雑なプロセスであり、そして時折、プログラムされた細胞死の調節において欠損が生じる。このプロセスの重大な役割が、組織において定常状態の細胞数を維持することか、または生物体の発達の間適切な細胞を維持することである場合、プログラムされた細胞死における欠損は、しばしば病理学的状態と関連する。あまりにも少ない細胞死またはあまりにも多い細胞死のいずれかが、適切な治療が目下存在しない疾患の半分以上に関与すると推定される。
種々の疾患状態は、生物体におけるプログラムされた細胞死の異常な調節に起因して生じる。例えば、組織の定常状態を維持するために必要とされる正常レベルと比較して、組織においてアポトーシスのレベルの減少を生じる欠損は、組織における細胞数の増加を生じ得る。そのような細胞数の増加機構は、種々の癌において同定されてきており、癌細胞が必ず、その正常な対応物より迅速に分裂することではなく、細胞が正常な速度で死なないことに起因して、腫瘍の形成は生じない。
従って、プログラムされた細胞死経路を調節し得る因子およびプログラムされた細胞死の異常な調節と関連する個体が受けている疾患を処置するための方法に関して必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そしてまた、さらなる利点を提供する。
（発明の要旨）
本発明は、コアペプチド４〜３９および４２〜５５からなる群から選択されるコアペプチドを有する単離された因子を提供する。ここで、因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する図５、９、１０、１４Ｂ、および２１〜２４で示される構造のうちのいずれかから選択されるコア構造を有する単離された因子もまた提供され、ここで、因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する。さらに、本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供する。この方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼとＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するための有効量の因子を接触させる工程からなり、この因子は、コアペプチド４〜３９および４２〜５５のうちのいずれかに示される配列を有するコアペプチドからなる群から選択されるコアモチーフ、ならびにＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４またはＴＰＩ９２７からなる群から選択されるコア構造を有する。本発明の方法はまた、細胞中のアポトーシスを促進させ、そしてアポトーシスのレベルの減少によって特徴付けられる病理の重篤度を低減させるために使用され得る。ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するための方法もまた、提供される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、アポトーシスタンパク質のインヒビター（ＩＡＰ）がカスパーゼのプロテアーゼ活性を阻害するのを抑制するか、またはカスパーゼに結合するのを抑制する因子を提供する。本発明の因子の有利な点は、それが細胞内（アポトーシスがＩＡＰの調節活性によって防止される）でアポトーシスを生じさせるために使用され得ることである。従って、本発明は、細胞にＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を投与することによるインビトロまたはエクスビボでの細胞集団の生存能力を低減させるための方法を提供する。そのような方法において、特定のＩＡＰ阻害カスパーゼに対する特異性を有する因子の使用は、より大きな混合集団における細胞の部分集団を選択的に標的化し得、そして殺傷し得る。本発明の因子を個体に対して投与することによって、病理的なアポトーシスのレベルの減少によって特徴付けられる状態（例えば、癌または肥厚）を有する個体を処置する方法もまた提供され、ここで、因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを活性化し、それによって、アポトーシスのレベルを上昇する。
さらに本発明は、アポトーシスのインヒビターを調節する因子を同定する方法を提供する。本発明の方法の使用によって、候補因子は、カスパーゼのプロテアーゼ活性を阻害することまたはカスパーゼへ結合することからアポトーシス（ＩＡＰ）インヒビタータンパク質を抑制する能力に関して試験され得る。抑制されない場合、カスパーゼは、アポトーシスを媒介する。従って、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するために本方法によって決定される因子は、アポトーシスを負の調節成分の存在下で生じさせる因子として同定される。本発明の方法の利点は、候補因子の巨大ライブラリーがＩＡＰ阻害カスパーゼの種々の抑制解除剤の同定のために効率的にスクリーニングされ得るように高処理能力形式において、それらが実行され得ることである。
本明細書中で使用される場合、用語「カスパーゼ」は、ポリペプチドにおけるアスパラギン酸残基でＣ末端を切断するシステインアスパルチル−特異的プロテアーゼのファミリーのメンバーを意味することが意図され、そしてアポトーシスを導く細胞死経路に関与する。この用語は、例えば、ＭａｒｔｉｎおよびＧｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ ８２：３４９〜３５２（１９９５）において記載されるように当該分野における使用と一致することが意図される。以前にカスパーゼとは、そのファミリーのうちで最初に同定されたメンバーであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）変換酵素（Ｉｃｅ）（ＩＬ−１βの不活性３３キロダルトン（ｋＤａ）形態を活性１７．５ｋＤａ形態に変換する）との相同性に基づいて「Ｉｃｅ」プロテアーゼとして呼ばれた。Ｉｃｅプロテアーゼは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｃｅｄ−３遺伝子（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ発生の間のアポトーシスに関与される）と相同であることが見出され、そしてトランスフェクション実験は、繊維芽細胞におけるＩｃｅの発現が細胞におけるアポトーシスを誘導することを示した（ＭａｒｔｉｎおよびＧｒｅｅｎ（前出）、１９９５）。それゆえ、この用語は、Ｉｃｅおよびｃｅｄ−３を含む。
Ｉｃｅおよびｃｅｄ−３と相同性を共有するさらなるポリペプチドが同定され、そしてカスパーゼ（各カスパーゼは、数によって区別される）として呼ばれる。例えば、元来同定されたＩｃｅプロテアーゼは、現在、カスパーゼ−１として呼ばれ、カスパーゼ−３として呼ばれたプロテアーゼは、以前ＣＰＰ３２、ＹＡＭＡおよびアポペインとして種々に公知であり、そして現在カスパーゼ９として示されるプロテアーゼは、以前はＭｃｈ６またはＩＣＥ−ＬＡＰとして公知であった。プロテアーゼのカスパーゼファミリーは、それぞれが、アスパラギン酸残基でＣ末端を切断するシステインプロテアーゼであることで特徴付けられ、そしてそれぞれは、概してアミノ酸配列ＱＡＣＸＧ（配列番号１）（Ｘは、任意のアミノ酸であり得、そしてしばしばアルギニンである）を含む、保存された活性部位システインを有する。さらにカスパーゼは、ＤＥＶＤ（配列番号２）切断活性（カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７を含む）を有するもの、そしてＹＶＡＤ（配列番号３）切断活性（カスパーゼ１を含む）を有するものに下位区分される（ＭａｒｔｉｎおよびＧｒｅｅｎ（前出）、１９９５）。
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＡＰ」または「アポトーシスインヒビター」は、カスパーゼのタンパク質分解活性を阻害するタンパク質を意味することが意図される。この用語は、カスパーゼに結合する場合にカスパーゼのタンパク質分解活性を阻害するタンパク質を含み得る。この用語はまた、カスパーゼの前駆体を成熟形態に進める上流カスパーゼの能力を阻害することにより下流カスパーゼのタンパク質分解活性を阻害するタンパク質を含み得る。カスパーゼのユビキチン化および分解を誘導するタンパク質もまた、この用語中に含まれる。
抗アポトーシスタンパク質のアポトーシスインヒビター（ＩＡＰ）タンパク質ファミリーのメンバーは、脊椎動物種および非脊椎動物種の両方において見出されるホモログとともに、進化にわたって保存される。バキュロウイルスＩＡＰ、Ｃｐ−ＩＡＰおよびＯｐ−ＩＡＰは、細胞死インヒビターｐ３５（カスパーゼに結合し、そして阻害するバキュロウイルスタンパク質）における欠損を機能的に補完する能力に基づいて同定され得たこのファミリーの最初のメンバーであった。続いて、少なくとも７個のさらなるヒトホモログ（Ｘ染色体結合ＩＡＰ（ＸＩＡＰ、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ３２９７４）；細胞性ＩＡＰタンパク質（ｃ−ＩＡＰ−１／ＨＩＡＰ−２／ｈＭＩＨＢおよびｃ−ＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１／ｈＭＩＨＣ（Ｌｉｓｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３７９：３４９〜３５３（１９９６）；Ｒｏｔｈｅら，Ｃｅｌｌ ８３：１２４３〜１２５２（１９９５））；ニューロンアポトーシス阻害性タンパク質（ＮＡＩＰ）（Ｒｏｙら，Ｃｅｌｌ ８０：１６７〜１７８（１９９５））；ＬＩＶＩＮとしても称されるＭＬ−ＩＡＰ（Ｖｕｃｉｃら，Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．１０：１３５９〜１３６６（２０００）およびＫａｓｏｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２３８〜３２４６（２００１））；アポロン（Ａｐｏｌｌｏｎ）（Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６４：８４７〜８５４（１９９９））；およびサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：９１７〜９２１（１９９７）を含む）が同定され、そしてこれが細胞死を阻害することが証明された。２つのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログ（ＤＩＡＰ１およびＤＩＡＰ２）がまた同定され、そして細胞死を阻害することが証明された（Ｄｅｖｅｒａｕｘら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：２３９〜２５２（１９９９））。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるプログラムされた細胞死の調節におけるＩＡＰ−ファミリータンパク質の主要な役割は、ハエにおける多数のアポトーシス誘導タンパク質（リーパ（ｒｅａｐｅｒ）、ヒド（ｈｉｄ）、およびグリム（ｇｒｉｍ）を含む）が、その細胞傷害機構の一部としてＩＡＰに結合することを見出すことによって示唆される。他のＩＡＰタンパク質としては、例えば、ＣｉＩＡＰ、ＰｏＩＡＰ、ＣｐＩＡＰおよびＡＳＦＩＡＰのようなウイルス性ＩＡＰが挙げられる（Ｄｅｖｅｒａｕｘら（前出）（１９９９））。
本発明のＩＡＰタンパク質としては、カスパーゼ−３またはカスパーゼ７のようなエフェクターカスパーゼの活性を阻害するもの、およびカスパーゼ−９のようなカスパーゼインヒビターを阻害するものを含む。ヒトＩＡＰ（ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、およびｃＩＡＰ２）は、０．２〜１０ｎＭの範囲内のＫｉをともなって、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７に結合し、そして強力に阻害することが報告されている。これらのカスパーゼは、アポトーシスプロテアーゼカスケードの遠位部分で作動し、そしてアポトーシス開始剤としてよりエフェクターとして機能する。
全ＩＡＰファミリーメンバーの一般的な構造的特徴は、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）と名付けられた約７０個のアミノ酸モチーフであり、これは、例えば、Ｄｅｖｅｒａｕｘら、Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：２３９〜２５２（１９９９）に記載されるように、１〜３コピー中に存在する。ＢＩＲドメイン内で観察されるシステイン残基およびヒスチジン残基の存在およびその空間の保存は、この構造が亜鉛結合性ドメインを示すことを示す。ＢＩＲドメインは、異なる機能を示すことが示されている。例えば、ＸＩＡＰの第２ＢＩＲドメイン（ＢＩＲ２）は、カスパーゼ３のための効力のあるインヒビターであり、一方で、ＸＩＡＰの第３ＢＩＲドメイン（ＢＩＲ３）は、カスパーゼ−９を標的化する（Ｗｕら，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１００８〜１０１２（２０００）を参照のこと）。ＩＡＰのＮ末端部分および中心部分に局在化されたＢＩＲモチーフに加えて、ＲＩＮＧフィンガードメインは、ＩＡＰタンパク質ファミリーのメンバーのＣ末端部分に局在化される（Ｂｉｒｎｂａｕｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２５２１〜２５２８（１９９４））。
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＡＰ阻害カスパーゼ」は、アポトーシスタンパク質のインヒビターの存在に起因して、タンパク質分解活性から防げられるか、またはそれを抑制するシステインアスパルチル特異的プロテアーゼを意味することが意図される。この用語は、結合したアポトーシスインヒビタータンパク質に起因して活性を減少したシステインアスパルチル特異的プロテアーゼを含み得る。この用語はまた、アポトーシスインヒビタータンパク質の存在に起因して、タンパク質分解活性し得る成熟形態にプロセスされることから防げられるか、またはこれを抑制するシステインアスパルチル特異的プロテアーゼを含み得る。本発明において有用である非プロセスシステインアスパルチル特異的プロテアーゼの例は、結合したドメイン前駆体（ｐｒｏｄｏｍａｉｎ）を有するカスパーゼ前駆体（ｐｒｏ−ｃａｓｐａｓｅ）である。あるいは、本発明の組成物および方法は、ドメイン前駆体を含まないか、またはカスパーゼ前駆体でないＩＡＰ阻害カスパーゼに関し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「抑制解除」は、ＩＡＰ阻害カスパーゼに対する参照において使用される場合、ＩＡＰのカスパーゼのタンパク質分解活性を阻害する能力の減少、阻害または防止を意味することが意図される。従って、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤は、ＩＡＰのカスパーゼタンパク質分解活性を阻害する能力を阻害するか、または防止する分子である。この用語は、ＩＡＰのカスパーゼのユビキチン化および分解を誘導する能力の阻害または防止を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「因子」は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る単純有機分子または複合体化有機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質あるいはオリゴヌクレオチドのような合成または単離された生物学的分子を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、ヒトに対して使用するために十分な純度および質を有する培体を意味することが意図される。そのような培体は、ヒトの薬学的等級であり得、無菌培体（例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水、正常な生理食塩水またはリンガー溶液あるいは他の生理学的緩衝生理食塩水）、または他の溶媒あるいは媒体（例えば、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような油または注入可能な有機エステル）であり得る。薬学的に受容可能な培体は、引き続いて粒子および生物体の混入を含まない。
本明細書で使用される場合、用語「阻害」は、タンパク質活性に対する参照において使用される場合、基質に対するタンパク質の親和性を減少するか、またはタンパク質が基質を産物に転化する触媒速度を減少することによる活性の減少を意味することが意図される。例えば、この用語は、カスパーゼ基質に対するＩＡＰの親和性の減少、ポリペプチド基質に対するカスパーゼの親和性の減少、カスパーゼがアスパラギン酸残基でポリペプチドＣ末端を切断する速度の減少、またはカスパーゼがユビキチン化されるか、またはタンパク質分解性分解される速度の減少を含む。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、因子に対する参照において使用される場合、因子は１つ以上の試薬、前駆体または他の反応産物から分離されることを意味する。それゆえ、単離された因子は、因子を産生する合成反応または反応経路において見出される１つ以上の化合物を含まない因子である。天然において見出される１つ以上の化合物を含まない因子もまた、この用語において含まれる。単離された因子はまた、実質的に純粋な因子を含む。この用語は、コンビナトリアル化学方法によって産生され、そして化学精製または第２分子（第２分子とともに共精製されるように十分な安定性を有する）への結合による前駆体および他の産物を分離される分子を含み得る。この用語は、例えば、生合成反応の産物のような天然の因子または非天然の因子を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」とは、１つのアミノ酸のカルボキシルと別のアミノ基との間の共有結合によって連結される２つ以上アミノ酸を含む分子をいう。本発明のペプチドは、より大きな分子または因子（例えば、より大きなペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメント、ペプトイド、ペプチド模倣体など）中に含まれ得る。ペプチドは、非天然の分子（天然に存在しない）であり得るが、インビトロの方法の結果として産生されるか、またはｃＤＮＡライブラリーから発現されるタンパク質もしくはそれらのフラグメントのような天然の分子であり得る。ペプチドは、線状、環状または多価などのいずれかであり得、この立体配座は、当該分野で周知の方法を使用して達成され得る。この用語は、天然のタンパク新生のアミノ酸および非天然のアミノ酸（例えば、Ｄアミノ酸）ならびにアミノ酸アナログを有する分子を含み、これらのいずれかが、当該分野で公知の方法を使用してペプチドに取り込まれ得る。この定義に照らせば、当業者は、アミノ酸に関する本明細書中の参照は、他の点で特に示されない限り、例えば、天然のタンパク新生のＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、化学的に改変されたアミノ酸（例えば、アミノ酸アナログ）、天然の非タンパク新生のアミノ酸（例えば、ノルロイシン、および化学的に合成された因子）を含むことを理解する。さらに、本発明において有用な例示的アミノ酸は、以下に記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク新生」は、アミノ酸に関する参照において使用される場合、アミノ酸が周知の代謝経路を介して細胞中のタンパク質に取り込まれ得ることを示す。このアミノ酸は、α炭素での立体配置に関する参照において、ＤまたはＬとして示される。立体配置に関する特定の参照なしに本明細書中で言及されるアミノ酸は、α炭素でＬ配置を有することが理解される。タンパク新生アミノ酸は、本明細書中で、一文字コードまたは三文字コードを使用して示され、そして当該分野で使用される命名法（例えば、ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６〜７頁（１９９１）に記載される）と一致することが意図される。他のアミノ酸は、当該分野で公知の命名法を使用して示され、ここで、ｐＣｌＰｈｅとは、ｐ−クロロ−フェニルアラニンをいい、ＴｈｉＡｌａとは、２−チエニルアラニンをいい、Ｎａｌとは、３−（２−ナフチル）−アラニンをいい、３Ｉ−Ｔｙｒとは、３−ヨード−チロシンをいい、Ｃｈａとは、シクロヘキシルアラニンをいい、Ｌｙｓ−ε−Ｆｍｏｃとは、リジン（ε−フルオロエニルメトキシルオキシカルボニル）をいい、そしてＯＥｔ−Ｔｙｒとは、チロシン（Ｏ−エチル）をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「コア」は、分子の化学構造またはモチーフ、あるいはそれらの部分を意味することが意図される。化学構造またはモチーフは、例えば、ペプチドまたはペプチド含有分子のアミノ酸配列、あるいは分子内の原子の共有結合を示す化学式であり得る。この用語に含まれる化学構造またはモチーフは、さらに、キラリティについて規定され得る。コアペプチドまたは他の化学実体は、分子の中心に局在される必要はない。
本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する単離された因子を提供する。ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１は、Ｌ−ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐであり、そしてＸ２は、Ｌ−ＴｈｉＡｌａまたはＬ−ｐＣｌＰｈｅである。コアペプチド４に含まれる例示的コアペプチドは、例えば：
Figure 2005510569
 を含む。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１は、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｃｈａ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）であり；Ｘ２は、Ｄ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｄ−ＣｈａまたはＤ−ＴｈｉＡｌａであり；Ｘ３は、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）またはＤ−Ｐｈｅであり；そしてＸ４は、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｌ−ＴｈｉＡｌａ、Ｌ−３Ｉ−ＴｙｒまたはＬ−ｐＣｌＰｈｅである。コアペプチド２３に含まれる例示的コアペプチドは、例えば：
Figure 2005510569
Figure 2005510569
を含む。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１は、Ｄ−ＮａｌまたはＬ−ＴｈｉＡｌａであり；Ｘ２は、Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅまたはＬ−Ｎａｌであり；Ｘ３は、Ｄ−Ｎａｌ、Ｌ−ｐＣｌＰｈｅまたはＤ−Ｌｙｓ（Ｆｍ）であり；そしてＸ４は、Ｌｙｓ−εＦｍｏｃまたはＤ−ｐＦＰｈｅである。コアペプチド８に含まれる例示的コアペプチドは、例えば：
Figure 2005510569
Figure 2005510569
を含む。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１は、Ｌ−ＴｈｉＡｌａまたはＰｈｅであり；Ｘ２は、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅまたはＤ−ＯＥｔ−Ｔｙｒであり；Ｘ３は、Ｄ−Ｎａｌ、またはＤ−ＯＥｔ−Ｔｙｒであり；そしてＸ４は、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅまたはＤ−ｐＮＯ２Ｐｈｅである。コアペプチド３５に含まれる例示的コアペプチドは、例えば：
Figure 2005510569
 を含む。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１は、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＴｈｉＡｌａであり、そしてＸ２およびＸ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｕｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｎ−Ｎｌｅ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｌ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｌ−ＰｙｒＡｌａ、Ｄ−ＰｙｒＡｌａ、Ｌ−ＴｈｉＡｌａ、Ｄ−ＴｈｉＡｌａ、Ｌ−Ｔｉｃ、Ｄ−Ｔｉｃ、Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｌ−ｐＩＰｈｅ、Ｄ−ｐＩＰｈｅ、Ｌ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｄ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、β−Ａｌａ、ｅ−アミノカプロン酸、Ｌ−Ｍｅｔ［Ｏ２］、Ｌ−ｄｅｈｙｄＰｒｏ、またはＬ−３Ｉ−Ｔｙｒから選択される。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１およびＸ２は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｎｌｅ、Ｌ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｌ−ＰｙｒＡｌａ、Ｄ−ＰｙｒＡｌａ、Ｌ−ＴｈｉＡｌａ、Ｄ−ＴｈｉＡｌａ、Ｌ−Ｔｉｃ、Ｄ−Ｔｉｃ、Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｌ−ｐＩＰｈｅ、Ｄ−ｐＩＰｈｅ、Ｌ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｄ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、β−Ａｌａ、ｅ−アミノカプロン酸、Ｌ−Ｍｅｔ［Ｏ２］、Ｌ−ｄｅｈｙｄＰｒｏ、またはＬ−３Ｉ−Ｔｙｒから選択される。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
 ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＴｙｒから選択され、そしてＸ４は、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌから選択される。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、以下のいずれかに対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有し得る：
Figure 2005510569
Figure 2005510569
ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＴｙｒから選択され、そしてＸ３は、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒから選択される。
本発明のコアペプチド配列は、分子または分子の一部のコアぺプチド配列であり得る。例えば、４つの位置を有する上述の配列は、テトラペプチド分子であり得、そして４つまたは６つの位置を有する上述の配列は、ヘキサペプチド分子であり得る。本発明のコアペプチドはまた、より大きな分子（例えば、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸または少なくとも２５個のアミノ酸を有する分子を含む）中に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドを含む分子のアミノ酸長は、ペプチドがＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る限り、最大の長さ（例えば、長さが約４個以下、約５個以下、約６個以下、約７個以下、約８個以下、約９個以下、約１０個以下、約２０個以下、約２５個以下、約５０個以下、約１００個以下、約１５０個以下、または約２００個以下あるいはそれ以上の個数以下のアミノ酸を含む）によって規定され得る。本発明のコアペプチドを有する分子はまた、上述される最小および最大の長さのうちのいずれかの組み合わせによって定められたサイズ範囲内に規定され得る。
さらに、本発明は、非ペプチドベースのコア構造をを有するＩＡＰ阻害カスパーゼの効果的な抑制解除剤である因子を提供する。従って、本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除する因子を提供し、そしてこの因子は、図８において示されるＴＰＩ７５９のようなＮ−ベンジル−１，４，５−三置換−２，３−ジケトピペラジンに対応するコア構造を有する。ＴＰＩ７５９コア構造を有する因子は、例えば、図８において示されるように、ノルロイシン、ＮａｐＡｌａ、シクロヘキシルアラニン、Ｌｙｓ、ノルバロイシンまたはバリンのアミノ酸側鎖基に由来するＲ１位置で；Ｌｅｕ、ＮａｐＡｌａ、Ｐｈｅ、ＩｌｅまたはＶａｌのアミノ酸側鎖基に由来するＲ２位置で；そして４−イソブチル−α−メチルフェニル酢酸、３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル酢酸、ヘプタン酸、（α−α−α−トリフルオロ−ｍ−トリル）酢酸、４−ｔｅｒｔ−ブチル−シクロへキサンカルボン酸、ｍ−トリル酢酸、３，４−ジクロロフェニル酢酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸、ジクロロヘキシル酢酸、シクロヘプタンカルボン酸、ｐ−トリル酢酸またはシクロへキサン酪酸に由来する官能基によってＲ３位置で、置換され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、図７において示されるＴＰＩ８８２のような、Ｃ−６−アシルアミノ二環式グアニジンに対応するコア構造を有し得る。ＴＰＩ８８２コア構造を有する因子は、例えば、図７において示されるように、Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−２−クロロＰｈｅ、Ｏ−エチル−Ｄ−Ｔｙｒ、ｐ−ヨード−Ｌ−Ｐｈｅ、ｐ−ヨード−Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−ホモ−Ｐｈｅ、Ｌ−ホモ−Ｐｈｅ、Ｌ−ナフチルＡｌａ、Ｄ−ナフチルＡｌａまたはＬ−４，４−ビフェニルアラニンのアミノ酸側鎖基に由来するＲ１位置で；２−フェニル酪酸、３−フェニル酪酸、ｍ−トリル酢酸、３−フルオロフェニル酢酸、ｐ−トリル酢酸、４−フルオロフェニル酢酸、３−メトキシフェニル酢酸、４−メトキシフェニル酢酸、４−エトキシフェニル酢酸、４−ビフェニル酢酸、フェニル酢酸、４−フェニル酪酸、ヘプタン酸、４−メチル吉草酸、ｔｅｒｔ−酪酸、シクロヘキシルカルボン酸、シクロヘキシル酢酸、シクロヘキシル酪酸、シクロヘプタンカルボン酸、シクロブタンカルボン酸、シクロペンチルカルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸、シクロヘキシルプロピオン酸、４−メチル−１−シクロヘキシルカルボン酸、４−ｔ−ブチルシクロヘキシルカルボン酸、２−ノルボルナン酢酸、１−アダマンタン酢酸、２−エチル酪酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸またはシクロペンチル酢酸に由来する官能基によってＲ２位置で；そして３−フルオロフェニル酢酸、４−エトキシフェニル酢酸、４−ビフェニル酢酸または３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸に由来する官能基によってＲ３位置で、置換され得る。図１０で示されるように、ＴＰＩ８８２コア構造を有する因子は、フェニル酢酸に由来する官能基によってＲ２およびＲ３で、そしてＬ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ｐ−クロロ−Ｐｈｅ、Ｄ−ｐ−フルオロ−Ｐｈｅ、Ｌ−ｐ−フルオロ−Ｐｈｅ、Ｄ−２−クロロ−Ｐｈｅ、Ｏ−エチル−Ｌ−Ｔｙｒ、Ｏ−エチル−Ｄ−Ｔｙｒ、Ｏ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ、３，５−ジヨード−ＴｙｒまたはＬ−ナフチルＡｌａのアミノ酸側鎖基に由来するＲ１で；Ｐｈｅのアミノ酸側鎖によってＲ１で；フェニル酢酸に由来する官能基によってＲ３で、そしてｐ−トリル酢酸、４−フルオロフェニル酢酸、３−メトキシフェニル酢酸、４−メトキシフェニル酢酸、４−エトキシフェニル酢酸、４−ビフェニル酢酸、フェニル酢酸、４−フェニル酪酸、ヘプタン酸、３−メチル吉草酸または４−メチル吉草酸に由来する官能基によってＲ２で；あるいは、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖によってＲ１で；フェニル酢酸に由来する官能基によってＲ２で；そして４−ビフェニル酢酸、シクロへキサンカルボン酸、シクロヘキシル酢酸、シクロヘキシル酪酸、シクロペンタンカルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸または３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸に由来する官能基によってＲ３で、置換され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、図６において示されるように、ＴＰＩ９２７のようなポリフェニルウレアに対応するコア構造を有し得る。図６において示されるように、ＴＰＩ９２７コア構造を有する因子は、例えば、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｍｅ）、Ｌ−３−（２Ｎａｐ）Ａｌａ、Ｄ−Ｃｈａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＬｅｕまたはＳｅｒのアミノ酸側鎖基に由来するＲ１位置で；ε−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｎｌｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ）、Ｇｌｎ、Ｌ−３−（２−Ｎａｐ）ＡｌａまたはＤ−Ｔｈｒのアミノ酸側鎖基に由来するＲ２位置で；そして４−メトキシフェニル酢酸、１−アダマンタン酢酸、シクロへキサン酪酸、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロフェニル酢酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸、４−エトキシフェニル酢酸、１−フェニル−１−シクロプロパンカルボン酸、１−ナフチル酢酸、またはシクロブタンカルボン酸に由来する官能基によってＲ３位置で、置換され得る。図９において示されるように、ＴＰＩ９２７コア構造を有する因子は、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基によってＲ１およびＲ２で、そしてトリメチル酢酸、ヒドロ桂皮酸、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサンカルボン酸、４−メチル−１−シクロへキサンカルボン酸、シクロペンチル酢酸、１−フェニル−１−シクロプロパンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、フェニル酢酸、シクロヘプタンカルボン酸、シクロブタンカルボン酸、シクロヘキサン酪酸、１−アダマンタン酢酸、シクロペンタンカルボン酸、イソ酪酸、シクロヘキシル酢酸；３−メトキシフェニル酢酸、酪酸、３−（３，４，５）−トリメトキシフェニルプロピオン酸；ヘプタン酸；２−ノルボルナン酢酸、シクロヘキサンプロピオン酸、ｔｅｒｔ−酪酸、４−エトキシフェニル酢酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸、４−メトキシフェニル酢酸、酢酸、メチル吉草酸ｐ−トリル酢酸または４−イソブチル−α−メチルフェニル酢酸に由来する官能基によってＲ３で、置換され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、図４において示されるように、ＴＰ９１４のようなＮ−アシルトリアミンに対応するコア構造を有し得る。ＴＰＩ９１４コア構造を有する因子は、図４において示されるように、例えば、Ｎａｐ−Ａｌａまたは４−フルオロ−フェニルアラニンのアミノ酸側鎖基に由来するＲ１位置で；Ｌ−Ｔｒｐ、Ｎａｐ−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｒｐ、４−クロロフェニルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニンまたはＴｙｒのアミノ酸側鎖基に由来するＲ２位置で；および４−ビニル安息香酸、４−エチル−４−ビフェニルカルボン酸、３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル酢酸、４−ビフェニルカルボン酸、４−ビフェニル酢酸または３，５−ビス−（トリフルオロメチル）−安息香酸に由来する官能基によってＲ３で、置換され得る。ＴＰＩ９１４コア構造を有する因子は、それぞれ図５において示されるように、Ｌｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ１で、Ｄ−Ｔｒｐのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ２で、そしてメチルを有するＲ３で；Ｌｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ１で、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ２で、そして３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル酢酸に由来する官能基によってＲ３で；Ｌｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ１で、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ２で、および４−ビニル安息香酸に由来する官能基によってＲ３で；またはＬｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ１で、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基に由来する官能基によってＲ２で、そして４−エチル−４−ビフェニルカルボン酸に由来する官能基によってＲ３で置換され得る。
当業者は、ＴＰＩ９１４、ＴＰＩ９２７、ＴＰＩ７５９またはＴＰＩ８８２のコア構造を有するライブラリーが、１つ以上の位置でコンビナトリアル化（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｉｚｅ）され得ることを認識する。コンビナトリアル化された位置とは、その位置でコンビナトリアル化された分子のライブラリーが、その位置での化学的構造が異なる分子の混合物であるように、異なる部分によって種々に置換されている位置をいう。そのようなライブラリーは、例えば、実施例ＶＩにおいて記載されるようなポジショナルスキャニングを利用するスクリーンニングにおいて、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するために使用され得る。従って、Ｒ１位置、Ｒ２位置またはＲ３位置のいずれか１つは、別個の部分に対して固定されたままであり得る一方で、残りの２つの位置はコンビナトリアル化され、それゆえ位置の固定化をベースにしたサブライブラリーを生成する。そのうえ、コンビナトリアル化され得るか、または不変に保たれ得るコア構造に対してさらなる位置を付加し得る一方で、１つ以上の他の位置がコンビナトリアル化される。従って、異なるライブラリーまたはより多様なライブラリーが、特定のコア構造またはＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得るとしてライブラリーから同定された種に基づいて、創られ得る。
当業者は、ＴＰＩ９１４、ＴＰＩ９２７、ＴＰＩ７５９またはＴＰＩ８８２に対応するコア構造を有する本発明の因子が、さらに、ペプチド部分のような１つ以上の結合部分を含み得ることを理解する。結合部分がＴＰＩ９１４、ＴＰＩ９２７、ＴＰＩ７５９またはＴＰＩ８８２に対応する１つ以上のコア構造；上述される配列を有するコアペプチド；または１つ以上のこれらのコア構造およびコアペプチドの組み合わせであり得る場合、本発明の因子は、上述されるように多価であり得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る因子（ペプチドコア構造に基づこうと、非ペプチドコア構造に基づこうと）は、生物学的タンパク質において天然に存在することが公知である部分を含み得る。タンパク質の部分である場合、そのような部分は、一般的にアミノ酸Ｒ基として称される。これらのＲ基は、種々の物理的または化学的特性によって特徴付けられ得る。例として必須アミノ酸を取り上げた場合、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅに見出されるＲ基は、非極性であるという特徴を有する；極性Ｒ基としては、Ｃｙｓのスルフヒドリル部分、Ｍｅｔのチオエーテル、ＳｅｒおよびＴｈｒのヒドロキシル部分、ならびにＡｓｎおよびＧｌｎのアミド部分が挙げられる；ＡｓｐおよびＧｌｕは、カルボン酸部分の存在に起因して、極性の酸性基として特徴付けられる；極性の塩基性Ｒ基としては、アミノ部分を有するＬｙｓ、グアニジノ部分を有するＡｒｇおよび第二級アミンを有するイミダゾールを有するＨｉｓが挙げられる；そしてＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓは、フェニル環またはヘテロ環式環の存在に起因して、芳香族アミノ酸として特徴付けられる。本発明の因子は、１つ以上のこれらの部分または特徴を含み得、それによって、この因子を、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除させ得るようにする。
存在する場合、この因子を、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除させ得るようにする他の部分または部分の組み合わせによって、本発明の因子は、記載または特徴付けされ得る。本発明の因子中に存在し得る種々の部分についての定義は、以下に示される。
本明細書中で使用される場合、用語「アルキル」は、単独または組み合わせで、飽和性の、直鎖または分枝鎖の炭化水素部分（１個〜１０個、好ましくは１個〜６個、そしてより好ましくは１個〜４個の炭素原子を含む）をいう。そのような部分の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソ−アミル、ヘキシル、デシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルケン」は、単独または組み合わせで、合計２個〜１０個、好ましくは２個〜６個、そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子において、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素部分をいう。そのような部分の例としては、エチル、Ｅ−プロペニルおよびＺ−プロペニル、イソプロペニル、Ｅ−ブテニルおよびＺ−ブテニル、Ｅ−イソブテニルおよびＺ−イソブテニル、Ｅ−ペンテニルおよびＺ−ペンテニル、デセニル、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、プロピリデン（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）などが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルキン」は、単独または組み合わせで、合計２個〜１０個、好ましくは２個〜６個、そしてより好ましくは２個〜４個の炭素原子において、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素部分をいう。そのような部分の例としては、エチニル（アセチレニル）、プロピニル（プロパルギル）、ブチニル、ヘキシニル、デシニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせで、炭素原子の飽和性の環状整列（３個〜８個、そして好ましくは３個〜６個の炭素原子を数える）をいう。そのようなシクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アリール」とは、フェニル、ナフチル、インデニル（ｉｎｄｅｎｙｌ）、インダニル（ｉｎｄａｎｙｌ）、アズレニル（ａｚｕｌｅｎｙｌ）、フルオロレニル、およびアンスラセニルからなる群から選択される炭素環（全体が炭素および水素からなる）芳香族基；または、フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌｙ）、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、１，３，５−トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリニル、ベンゾ［ｂ］フラニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、１Ｈ−インダゾリル、ベンズムイミダゾリル、ベンズチアゾイル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、およびフェノキサジニルからなる群から選択されるヘテロ環芳香族基をいう。
本明細書中で定義されるように、「アリール」基は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシまたはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、脂肪族アシルもしくは芳香族アシル、アルコキシ−カルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、モルホリノカルボニルアミノ、チオモルホリノカルボニルアミノ、Ｎ−アルキルグアニジノ、アラルキルアミノスルホニル；アラルコキシアルキル；Ｎ−アラルコキシウレア；Ｎ−ヒドロキシウレア；Ｎ−アルケニルウレア；Ｎ，Ｎ−（アルキル、ヒドロキシル）ウレア；ヘテロシクリル；チオアリールオキシ置換アリール；Ｎ，Ｎ−（アリール、アルキル）ヒドラジノ；Ａｒ’置換スルホニルヘテロシクリル；アラルキル置換へテロシクリル；シクロアルキルおよびシクロアケニル置換ヘテロシクリル；シクロアルキル縮合アリール；アリールオキシ置換アルキル；ヘテロシクリルアミノ；脂肪族または芳香族アシルアミノカルボニル；脂肪族または芳香族アシル置換アルケニル；Ａｒ’置換アミノカルボニロキシ；Ａｒ’、Ａｒ’二置換アリール；脂肪族または芳香族アシル置換アシル；シクロアルキルカルボニルアルキル；シクロアルキル置換アミノ；アリールオキシカルボニルアルキル；ホスホロジアミジル酸またはエステルからなる群から独立して選択される１個〜４個の置換基を独立して含み得る。
「Ａｒ’」は、上で定義されるような炭素環またはヘテロ環アリール基（水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、１，２−ジオキシメチレン、１，２ージオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アルキルカルボニロキシ、脂肪族または芳香族アシル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルスルフォニルアミノ、Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキルウレアからなる群から選択される１個〜３個の置換基を有する）である。
用語「アルコキシ」とは、単独または組み合わせで、アルキルエーテル部分をいい、ここで、用語「アルキル」は上で定義された通りである。適切なアルキルエーテル部分の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルケノキシ」とは、単独または組み合わせで、式アルケニル−Ｏ−の部分をいい、ここで、用語「アルケニル」は、上で定義された通りである。適切なアルケノキシ部分の例としては、アリールオキシ、Ｅ−およびＺ−３−メチル−２−プロペノキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「チオアルコキシ」とは、式アルキル−Ｓ−のチオエーテル部分をいい、ここでアルキルは、上で定義された通りである。
用語「アルキルアミノ」とは、単独または組み合わせで、モノ−またはジアルキル置換アミノ基（例えば、式アルキル−ＮＨ−または（アルキル）２−Ｎ−の基）をいい、ここで、用語「アルキル」は、上で定義された通りである。適切なアルキルアミノ部分の例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アミド」とは、−Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）のいずれかをいい、ここで、（Ｒ１）は、本明細書中で水素および他の基を含むように定義される。用語「置換アミド」とは、（Ｒ１）が水素でない状態をいい、用語「非置換アミド」とは、（Ｒ１）は水素である状態をいう。
用語「アリールオキシ」とは、単独または組み合わせで、式アリール−Ｏ−の部分をいい、ここで、アリールは、上で定義された通りである。アリールオキシ部分の例としては、フェノキシ、ナフトキシ、ピリジルオキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アリールアミノ」とは、単独または組み合わせで、式アリール−ＮＨ−の部分をいい、ここで、アリールは上で定義された通りである。アリールアミノ部分の例としては、フェニルアミノ（アニリド）、ナフチルアミノ、２−、３−および４−ピリジルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アリール縮合シクロアルキル」とは、単独または組み合わせで、２つの近接の原子をアリール部分と共有するシクロアルキルをいい、ここで、用語「シクロアルキル」および「アリール」は上で定義された通りである。アリール縮合シクロアルキル部分の例は、ベンゼン縮合シクロブチル基である。
用語「アルキルカルボニルアミノ」とは、単独または組み合わせで、式アルキル−ＣＯＮＨの部分をいい、ここで用語「アルキル」は、上で定義された通りである。
用語「アルコキシカルボニルアミノ」とは、単独または組み合わせで、式アルキル−ＯＣＯＮＨ−の部分をいい、ここで用語「アルキル」は、上で定義された通りである。
用語「アルキルスルホニルアミノ」とは、単独または組み合わせで、式アルキル−ＳＯ２ＮＨ−の部分をいい、ここで用語「アルキル」は、上で定義された通りである。
用語「アリールスルホニルアミノ」とは、単独または組み合わせで、式アルキル−ＳＯ２ＮＨ−の部分をいい、ここで用語「アリール」は、上で定義された通りである。
用語「Ｎ−アルキルウレア」とは、単独または組み合わせで、式アルキル−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−の部分をいい、ここで用語「アルキル」は、上で定義された通りである。
用語「Ｎ−アリールウレア」とは、単独または組み合わせで、式アリール−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−の部分をいい、ここで用語「アルキル」は、上で定義された通りである。
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、ホウ素およびヨードを意味する。
上の定義に照らせば、この明細書を通して使用される他の化学的用語は、当業者によって容易に理解され得る。用語は、単独または組み合わせで使用することで、認知された化学命名法に従って部分の組み合わせを記載する。
本発明の因子は、予測可能な部分または特徴を有する産物を生じることが周知の因子および条件を使用して合成され得る。例えば、ペプチドは、比較的低コストで多数で合成され得、そしてそれらは、多様な特性を示すように容易に改変され得る（例えば、Ｒｅｅｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２）を参照のこと）。ＩＡＰ阻害カスパーゼのペプチド性抑制解除剤は、固相ペプチド合成方法の改変（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６４）；１９８６年１２月２３日に発行されたＨｏｕｇｈｔｅｎ、米国特許第４，６３１，２１１号）または当該分野で周知の標準的溶液方法（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第２編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８８および１９９３（前出））を参照のこと）を使用して合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法によって調製されたペプチドは、自動ペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ−０１ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）または手作業のペプチド合成方法（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（前出），１９８６）を使用して合成され得る。
さらに、以下に記載されるような組み合わせ方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を作るために使用され得る。ライブラリーは、特定の部分（例えば、上で定義されたもの、または以下で示される実施例において記載されるもの）を持つ候補因子を有するように合成され得る。さらに、合成条件は、本明細書中で記載される１つ以上の部分において固有な特定の特徴（例えば、アミノ酸Ｒ基について上述された特徴）を有する候補化合物のライブラリーを産生するために選択され得る。例えば、ライブラリーは、ＳＭＡＣ（天然に存在するＩＡＰインヒビター）の特徴を有するように合成され得る。ＳＭＡＣのＮ末端領域は、ＩＡＰへの結合およびＩＡＰの阻害を媒介することが示されている（Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａら，Ｎａｔｕｒｅ ４１０：１１２〜１１６（２００１），Ｗｕら，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１００８〜１０１２（２０００），Ｌｉｕら，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１００４〜１００８（２０００）を参照のこと）。従って、このＮ末端ドメインは、反応物および条件が、ライブラリーにおける候補因子に類似の部分および特徴を選択的に組み込むために選択されるようなライブラリー合成を導くために使用され得る。類似のストラテジーが、本明細書中に記載の因子を使用して用いられ得るか、または本発明の方法によって同定され得、ここで、ライブラリーは、特定の因子において見出されるか、または複数の因子に共通の特徴または部分を選択的に含むよう作られる。そのように設計されたストラテジーは、効果的なＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤が同定される確率を増加させる。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る本発明の因子は、スクリーニングにおいて同定され得るか、またはそうでなければ、本明細書中で記載された種々の機能的特性のいずれかによって特徴付けられる。１つの実施形態において、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤が同定されるか、またはそうでなければ、ＩＡＰの存在下においてカスパーゼの活性を可能にする能力に基づいて特徴付けられる。例えば、本発明の化合物の効果は、本発明の因子の存在下および非存在下におけるＩＡＰ阻害カスパーゼに対するカスパーゼ活性の比率によって決定され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する化合物を同定するための例示的なアッセイは、実施例１において提供され、そしてそのような抑制解除化合物を同定するためのアッセイの使用は、実施例Ｉ〜ＶＩにおいて証明される。以下の実施例においてで記載されるように、ＩＡＰ阻害カスパーゼのための因子の存在下および非存在下におけるＶｍａｘの比率（少なくとも約１．７である）は、アッセイ条件に依存して、ＩＡＰ阻害カスパーゼの効果的な抑制解除剤であることを示す。当業者は、効果を示すこの比率についての値は、使用される因子の濃度および因子のＩＣ５０に依存することを理解する。従って、より高濃度の因子が使用される場合、因子の存在下および非存在下におけるＶｍａｘの比率についての閾値は、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、または少なくとも約４であり得るか、あるいはより高くあり得る。より低濃度の因子が使用される場合、この比率は、少なくとも約１．５、少なくとも約１．３、少なくとも１．０と同じほど低くあり得るか、またはより低くあり得る。従って、アッセイ中に存在するＩＡＰに対する因子の相対量（例えば、ＩＡＰ当たり１モル濃度当量、ＩＡＰ当たり２モル濃度当量、ＩＡＰ当たり５モル濃度当量、ＩＡＰ当たり１０モル濃度当量またはＩＡＰ当たり５０モル濃度当量、あるいはより高量）との組み合わせで、比率を表すことが理解され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子はまた、例えば結合アッセイにおいて、ＩＡＰに対する親和性またはそれらのカスパーゼ結合フラグメントに対するそ親和性によって決定され得る。ＩＡＰの機能フラグメント、カスパーゼまたは両方が、結合アッセイにおいて、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定するために使用され得ることが理解される。望ましくは、結合アッセイを使用して決定されるＩＡＰに対する因子の親和性は、平衡解離定数（Ｋｄ）または平衡結合定数（Ｋａ）によって定量され得る。ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除因子は、マイクロモル濃度の範囲（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、または１×１０−８Ｍ未満を含む）にあるＫｄを有する因子として同定され得る。より高い親和性因子（約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ未満のＫｄのようなナノモル濃度の範囲の親和性を有する因子を含む）がまた、同定され得る。本発明の因子はまた、ピコモル濃度の親和性（例えば、１×１０−１２Ｍ未満であるＫｄを含む）を有し得る。
あるいは、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除に対する因子の効果は、ＩＡＰとカスパーゼとの間の結合の阻害（例えば、阻害結合アッセイ）に基づいて決定され得る。ＩＡＰの機能的フラグメント、カスパーゼまたは両方が、阻害結合アッセイにおいて使用され得ることが理解される。あるいは、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤は、ＩＡＰと別のインヒビター（例えば、ＳＭＡＣ）との間の結合を阻害する能力に基づいて同定され得る。ＳＭＡＣへのＩＡＰ結合の阻害を決定するための例示的なアッセイは、実施例ＶＩＩにおいて提供される。望ましくは、阻害は、平衡阻害定数（例えば、Ｋｉ）によって定量化され得る。Ｋｉに関する値は、本明細書中で記載されるような、漸増濃度の因子および各結合パートナーの固定濃度をもって抑制解除アッセイを実行することによって決定され得る。結合または阻害は、上述される平衡定数を、Ｓｅｇｅｌ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）において記載されるような周知の運動分析を使用して決定するために分析され得る。ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、マイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度範囲（例えば、Ｋｄに関して上述される範囲および値）にあるＫｉを有するものとして同定され得る。
従って、本発明は、因子（本発明のコアペプチドまたはコア構造（例えば、上述されたコア構造を含む）を有する因子）に結合したＩＡＰを有する複合体を提供する。複合体は、通常ＩＡＰとともに天然に生じる少なくとも１つの他の細胞成分から分離され得る。例えば、複合体は、通常ＩＡＰとともに天然に生じる他の細胞成分が実質的に無い精製された状態であり得る。複合体はまた、通常ＩＡＰを発現しない組換え細胞中に生じ得る。
本発明はさらに、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子と結合する部分を含む結合体を提供する。本発明の結合体は、因子を特定の細胞に対して標的化させるために、あるいはＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子の安定性または生物学的半減期を増加するために有用な部分を含み得る。例えば、部分は、特定の抗体、それらの機能性フラグメント、またはアポトーシスを促進することが望ましい特定の細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する特異性を有する他の結合性ポリペプチドであり得る。因子を、ＩＡＰ阻害カスパーゼが抑制解除され得る細胞に対して標的化させ得る任意の部分は、結合体として使用され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子の結合体はまた、因子を、細胞の細胞質ゾルに導入し得るか、またはそうでなければ細胞膜を通る因子の通過を助成し得る部分であり得る。因子は、例えば異種標的ドメインによって、または脂質ベースのキャリアを使用して細胞へ導入され得る。従って、本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子の細胞質送達を提供する。
部分はまた、チャンバー式マイクロデバイス、細胞、リポソームまたはウイルスなどの安定性、またはそうでなければＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子の投与に有利な特性を提供する薬物送達ビヒフルであり得る。一般的に、そのようなマイクロデバイスは、非毒性であるべきであり、そして望ましくは、生体分解性であるべきである。因子を含み得る種々の部分（マイクロカプセルを含む）および部分（チャンバー式マイクロデバイスを含む）を治療因子に結合するための方法は当該分野において周知であり、そして市販されている（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８編（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９０）、第８９〜９１章；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）を参照のこと；また、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（前出）、１９９６を参照のこと）。
さらに、ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除処方物は、化合物の徐放性を可能にする生体分解性ポリマー（薬物送達が所望される付近に（例えば、腫瘍部位に）移植されるポリマー）に組み込まれ得るか、または移植され得、その結果、薬物は経時的に全身に放出される。浸透性のミニポンプはまた、カニューレを介した目的の部位に対する特定の濃度のＩＡＰ阻害カスパーゼ種の抑制解除剤および処方物の制御化送達（例えば、腫瘍成長または腫瘍の血管供給へ直接）を提供するために使用され得る。生体分解性ポリマーおよびその使用は、例えば、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１〜４４６（１９９１）において詳細に記載される。
本発明の結合体は、標識である部分を含み得る。ＩＡＰおよび／またはカスパーゼに結合する標識化因子は、ＩＡＰおよび／またはカスパーゼの細胞下局在を同定するために、あるいは以前に同定されてなかったＩＡＰまたはカスパーゼを同定するために使用され得る。ＩＡＰおよび／またはカスパーゼに結合する標識化因子はまた、ＩＡＰおよび／またはカスパーゼと相互作用する他の分子を同定するために使用され得る。以下にさらに記載されるように、そのような結合競合アッセイは、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するために使用され得る。部分として組み込まれ得る標識としては、例えば、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、常磁性スピン標識、放射性ヌクレオチドまたは検出され得る別の分子に対する特異性を有する結合基が挙げられる。
本発明の標識化因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼによってアポトーシスが阻害される組織内の細胞を同定するために有用であり得る。従って、この標識化因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤の投与がアポトーシスの発生を可能にする細胞を同定するための診断方法において使用され得る。この方法は、本発明の標識化因子を組織に投与するステップおよび標識化因子を組み込む１つ以上の細胞を同定するステップを包含し得る。標識化因子は、上述されるようなインビボ送達のための方法を使用して投与され得る。診断方法は、種々の解決法で使用され得る。例えば、この方法は、因子によって標識された細胞を含む組織を同定するために実行され得る。あるいは、より高度な解決方法としては、ＩＡＰ阻害カスパーゼの存在下で標識される組織内の特定細胞または細胞型を同定するために使用され得る。診断方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除の投与が非標識化細胞からアポトーシスを発生させる細胞を識別するために使用され得ることに起因して、この方法は、本発明の治療方法において使用するための標的結合体または送達結合体の選択における基準として有用であり得る。
標識化因子が、注射または組織を標識化因子を含む溶液中に浸すことによって投与され得る場合、診断方法は、インビトロで実行され得る。ここでも、この方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを有する細胞と、この方法ではアポトーシスを阻害しないものとを組織内で区別するために十分な分解能で使用され得る。そのような分解は、例えば、顕微鏡ベースの技術の使用によって達成され得る。さらなる分解は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの細胞下局在化を提供する。細胞下局在化は、適切な細胞質ゾル送達結合体を決定するために、または研究中の特定の組織または細胞におけるアポトーシスの役割をさらに同定するために使用され得る。
本発明はまた、ＩＡＰ阻害カスパーゼおよび薬学的キャリアの抑制解除剤を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、アポトーシスの病的に減少したレベルによって特徴付けられる病的状態の重症性を阻害するか、処置するかまたは減少するような本発明のアポトーシス促進方法において使用され得る。例えば、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤は、薬学的に受容可能な培体とともに溶液または懸濁液として投与され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除処方物としては、皮下、腹腔内、筋内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜投与のような非経口投与に適用可能なものが挙げられる。同様に、経口投与、直腸投与、眼（ガラス体またはレンズ）投与、鼻投与、局所（頬および舌下）投与、子宮内投与、または膣投与に適用可能なものが挙げられる。ＩＡＰ阻害カスパーゼ処方物の抑制解除剤は、単回用量形態で存在し得、そして当業者に周知の薬学的技術によって調製され得る。そのような技術は、活性成分および薬学的なキャリアまたは賦形剤との関連を導く工程を包含する。
経口投与に適切な処方物としては、上述される薬学的に受容可能な培体のような水性および非水性無菌注射溶液が挙げられる。溶液は、さらに、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および処方物を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質が挙げられる。他の処方物としては、例えば、懸濁剤および濃化剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。処方物は、単回用量（ｕｎｉｔ−ｄｏｅｓ）または複数用量（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｅｓ）コンテナー（例えば、封鎖性アンプルおよびバイアル）において存在し得、そして例えば、使用直前に無菌の液体キャリアの添加を必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁剤は、以前記載された種の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
薬学的に受容可能な培体は、さらに、例えば、ＩＡＰ阻害カスパーゼ因子の抑制解除剤を安定にするように作用する生理学的に受容可能な化合物を含み得る。そのような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、ショ糖またはデキストランのような炭水化物；アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤；微生物の膜を破壊するＥＤＴＡのようなキレート剤；カルシウムまたはマグネシウムのような二価の金属イオン；低分子量のタンパク質；脂質またはリポソーム；あるいは他の安定化剤または賦形剤が挙げられる。以前に記載されるように、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除処方物はまた、生体分解性ポリマーのような薬学的に受容可能な培体で処方され得る。上述される薬学的キャリアおよび培体の全ては、当該分野において、それらがヒトにおいて使用するために十分な純度および質であり、研究等級の処方物における相当する試薬と区別可能であることを意味する薬学的等級と呼ばれるものであり得る。
本発明はまた、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤および治療活性を有する分子を含む組成物を提供する。本発明の抑制解除剤とともに含まれる分子は、アポトーシスの病的に減少したレベルによって特徴付けられる状態に対して活性を有する化合物であり得る。例えば、化合物は、癌に対する活性を有し得る。前立腺癌に対して活性を有し、そして本発明の抑制解除化合物との組み合わせで使用され得る例示的な化合物は、ＶＰ−１６（エトポシド）である。実施例Ｘの結果によって証明され得るように、ＴＰＩ７９２−３３またはＴＰＩ７９２−３５のいずれかとともにＶＰ−１６を投与することは、これらの化合物のいずれか単独よりも癌細胞の殺傷に関してより効力のある効果を有した。
他の抗癌剤はまた、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤との組み合わせで使用され得、この抗癌剤としては、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）のようなアルキル化剤；メトトレキサート、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシルまたはシタラビンのような抗代謝産物；Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、またはＭａｂＴｈｅｒａのような抗体；ビンブラスチンまたはビンクリスチン、あるいはエトポシドのような植物アルカロイド；ドクソルビシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、またはマイトマイシンのような抗生物質；カルムスチンまたはロムスチンのようなニトロ素尿素類；シスプラチンのような無機イオン；インターフェロンのような生物学的応答改変体；アスパラギナーゼのような酵素；あるいはタモキシフェンまたはフルタミドのようなホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの、および他の抗癌性化合物は、当該分野において公知であり、そして薬学的な使用に適切な処方物は、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ 第１６編、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ．、Ｒａｈｗａｙ Ｎ．Ｊ．（１９９２）において記載されるように公知である。
本発明はさらに、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として活性を有する本発明の少なくとも１つの化合物および治療活性を有する第２の化合物を含むキットを提供する。キットに含まれ得る本発明の化合物としては、例えば、コアペプチド４〜３９および４２〜５５からなる群から選択されるコアペプチドを有するか、または図５、９、１０、１４Ｂ，および２１〜２４において示される構造のいずれかから選択されるコア構造を有する化合物が挙げられ、ここで、この化合物は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する。そのようなキットは、例えば、アポトーシスが減少したレベルによって特徴付けられる状態の処置において有用である。例えば、ＶＰ−１６をＴＰＩ７９２−３３またはＴＰＩ７９２−３５とともに含むキットは、前立腺癌を処置するために使用され得る。
化合物が、各化合物の少なくとも１回の投与に続く治療効果を有するために十分な量で提供される限り、適切なキットは、別個にパッケージされた処方物としてまたは混合処方物において化合物を含む。処方物は、上述されるもののいずれかであり得るか、またはそうでなければ、特定の化合物および投与様式のために適切であることが公知のもののいずれかであり得る。
本発明のキットの中身は、好ましくは無菌の混入の無い環境を提出するために、パッケージ品または他の適切な物理的構造において保存される。さらに、このパッケージ品は、病的なアポトーシスのレベルの減少によって特徴付けられる状態の処置のために、どのようにキット内の物質が投与され得るかを示す指示書を含む。使用のための指示書は、代表的に、投与経路、必要ならば、投与のための処方物を調製するための方法を示す具体的な表現を含む。この指示書はまた、キットの中身の使用による潜在的な効果の同定またはキットの中身の不適切な使用に関する警告を含み得る。
本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＩＡＰおよびカスパーゼを、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得ることが予測される因子と接触させる工程（ここで、カスパーゼはＩＡＰによって阻害されるＩＡＰ阻害カスパーゼであり、ここで、この接触はＩＡＰの非存在下でのカスパーゼ活性を可能にする条件下で生じる）；そして（ｂ）ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除を検出する工程を包含する。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除は、例えば、タンパク質分解活性を含むＩＡＰ阻害カスパーゼ活性における増加として検出され得る。タンパク質分解活性は、特異的な基質を使用するインビトロアッセイにおいて測定され得る。例えば、連続蛍光比色アッセイは、Ｃ末端のアミノメチルクマリンで誘導体化されたＤＥＶＤ（配列番号２）、Ｃ末端のアミノメチルクマリンで誘導体化されたＹＶＡＤ（配列番号）（Ｔｒｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−アミノメチルクマリン）に由来する７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリン（ＡＦＣ）またはカルボベンゾキシ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−アミノメチルクマリンのいずれかの放出に引き続く加水分解速度；または米国特許番号第６，２２８，６０３ Ｂ１号において記載されるように、類似のペプチド（ｐＮＡで標識された）からのｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の放出に引き続く加水分解速度を測定するために使用され得る。
免疫ブロットまたは他のクロマトグラフィーベースのアッセイは、基質と比較して変更された分子量の産物に従って、カスパーゼによる基質のタンパク質分解を検出するために使用され得る。例えば、米国特許第６，２２８，６０３ Ｂ１号において記載されるような免疫ブロットアッセイにおいてカスパーゼ−９のような上流のイニシエーターカスパーゼのタンパク質分解活性は、プロカスパーゼ−３のような下流のエフェクタープロカスパーゼへのプロセシングに基づいて決定され得る。本発明の因子の存在および非存在におけるＩＡＰ阻害カスパーゼについてのそのようなアッセイの結果の比較は、因子の存在下でカスパーゼ活性における相対的な増加に従って、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定するために使用され得る。
カスパーゼのタンパク質分解活性はまた、アポトーシスに特徴的な細胞または細胞の核における形態学的変化を同定することによって決定され得る。アポトーシスに特徴的なそのような変化としては、例えば、クロマチン濃縮、核断片化、細胞収縮、または細胞水胞化が挙げられ、これらは、アポトーシス体と称されるフラグメントを取り囲む小膜内で結果として生じる破損を導く。従って、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤である因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼによるアポトーシスを被ることから保護される細胞に対して添加された場合に特徴的なアポトーシス変化を引き起こす能力に従って同定され得る。類似のアッセイは、クロマチン濃縮または核断片化のようなアポトーシス性変化がこの添加された因子の存在および非存在において区別され得る限り、そのような細胞に由来する無細胞抽出物に対して実行され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除はまた、ＩＡＰカスパーゼ種の分解として検出され得る。ＩＡＰ阻害カスパーゼは、当該分野で公知の結合アッセイを使用して関連するＩＡＰを有するカスパーゼとして同定され得る。そのような複合体は、例えば、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、または分析遠心分離を使用する分子量またはサイズに従って同定され得る。ＩＡＰカスパーゼ複合体はまた、共沈殿析出技術を使用して同定され得る。例えば、ＩＡＰカスパーゼ複合体は、抗体の、両方のパートナーと共沈殿するが、一方または他方単独とは共沈殿しない能力に起因して同定され得る。同様に、組換えＤＮＡ方法によって改変される場合、ＩＡＰまたはカスパーゼのいずれかが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）（グルタチオンビーズとともに沈殿され得る）；ポリヒスチジンタグ（Ｑｉａｇｅｎ ；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）（ニッケルＮＴＡセファロースとともに沈殿され得る）；フラッグペプチド（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のような抗体エピトープ（免疫沈降され得る）のような親和性タグ；または他の公知の親和性タグを組み込む技術が使用され得る。ＩＡＰカスパーゼ複合体形成を防止する、またはそうでなければ、複合体の分離を引き起こす因子は、そのようなアッセイにおいてＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定され得る。
カスパーゼは、プロカスパーゼと称される前駆体ポリペプチドとして細胞内に存在する。カスパーゼの活性化は、プロカスパーゼのタンパク質分解プロセッシングに起因して生じる。例えば、カスパーゼ−３は、３２ｋＤａのポリペプチド前駆体（プロカスパーゼ−３）のタンパク質分解によって形成される、おおよそ１７〜２０ｋＤａのポリペプチドおよび１１ｋＤａのポリペプチドからなるヘテロテトラマーである。プロカスパーゼ−３の切断は、２つの工程で進行する。第１の切断は、以前としてプロドメインを含む部分的にプロセシングされた大きいサブユニット（２２〜２４ｋＤａ）およびより小さくて十分にプロセシングされた約１１ｋＤａのサブユニットを産生する。第２の工程において、このプロドメインは、おそらく自己触媒反応工程によってカスパーゼ−３酵素の１７〜２０ｋＤａの成熟した、十分にプロセシングされた大きなサブユニットを産生するために、部分的に重合した大きいサブユニットから切断される。しかし、部分的にプロセシングされたカスパーゼはまたカスパーゼ活性を有するので、プロドメインの除去は、必ずしもプロテアーゼ活性を必要としない。
ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するための本発明の方法は、ＩＡＰの存在に起因して成熟した十分なタンパク質分解活性形態へのプロセシングを防止するカスパーゼを同定するために使用され得る。例えば、この方法は、ＩＡＰがプロカスパーゼからカスパーゼへのプロセシングを阻害するのを防止するかまたは抑制する因子を同定するために使用され得る。プロカスパーゼからカスパーゼへのプロセシングは、カスパーゼタンパク質分解活性における増加と一致するので、タンパク質分解活性を同定するための上述される方法は、ＩＡＰがプロカスパーゼからカスパーゼへのプロセシングを阻害するのを防止するかまたは抑制する因子を同定するための方法において使用され得る。同様に、上述されるような結合アッセイは、組み合わされたパートナーの分子量に従ってプロカスパーゼ−ＩＡＰ複合体を同定するために使用され得る。複合体形成を阻害するか、または複合体を分解させる因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤のようなアッセイにおいて同定され得る。ＩＡＰの存在に起因して成熟した十分なタンパク質分解活性形態へのプロセシングを防止する因子はまた、成熟形態およびプロカスパーゼ形態の分子量またはサイズにおける違いに従って同定され得る。従って、抑制性のＩＡＰの存在下でプロカスパーゼと接触された場合に成熟形態であることを示す分子量またはサイズにおける変化を引き起こす因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定され得る。
本発明の方法は、特定のＩＡＰまたはカスパーゼあるいは特定のＩＡＰおよびカスパーゼの組み合わせに対して特異性を有するＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定するために使用され得る。例えば、本発明は、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１またはｃ−ＩＡＰ−２のような真核生物ＩＡＰおよびカスパーゼ−３、カスパーゼ−７またはカスパーゼ−９のようなカスパーゼの特異的結合を変化させる因子と同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。任意の真核生物ＩＡＰを含む任意のＩＡＰは、本発明の方法において、適切なカスパーゼとの組み合わせで使用され得る。特定のカスパーゼの調節に関与する他のＩＡＰタンパク質は、本明細書中で開示される方法を使用して同定され得、次いで、カスパーゼとＩＡＰの特定の組み合わせが、ＩＡＰによるカスパーゼ活性の調節を調節するか、またはＩＡＰおよびカスパーゼの特異的関連を変化させる因子の同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
本明細書中で開示されるように、本発明のコアペプチドは、コアテトラペプチドおよびヘキサペプチド構造を有するコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。開示された方法に照らせば、当業者は、６個を超えるアミノ酸または４個未満のアミノ酸を有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーもまた、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する他のコアペプチドを同定するためにスクリーニングされ得ることを認識する。さらに、この開示された方法がＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するコアペプチドを最初に同定するために使用され得る一方で、当業者は、この方法が以下で記載されるようなＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するさらなるコアペプチドを最適化するか、または同定するために反復の様式で使用され得ることを知るだろう。
当業者が、ＩＡＰに対する増加した結合親和性またはＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除における増加した活性を有するさらなる抑制剤を最適化しそして同定するための迅速なスクリーニング方法と組み合わせたコンビナトリアル合成方法を使用し、その結果、高められた治療法の可能性を保有し得ることが推測される。
反復アプローチは、当該分野において周知であり、そして一般的に、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８４〜８６（１９９１）；およびＤｏｏｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６、２０１９〜２０２２（１９９４）（両方とも本明細書中で参考として援用される）において記載される。例えば、反復アプローチにおいて、３つの変化群を有する分子のサブライブラリーが作られ、第１の変化が規定される。この規定された変化群を有する各化合物は、他の２つの変化群での他の可能性の全てと反応する。これらのサブライブラリーは、それぞれ、選択のスクリーニングにおいて最高活性を有するサブライブラリーにおける第２の変化の同定を規定するために試験される。規定された第１の２つの変化位置を有する新たなライブラリーは、再度残りの未規定の変化位置での他の可能性全てと反応される。前記のとおり、最大活性を有するサブライブラリーにおける第３の変化位置の同定が決定される。さらなる変化が存在する場合、このプロセスは、全ての変化に対して繰り返され、そしてスクリーニングプロセスにおける最大の所望の活性に寄与するそれぞれの変化を有する化合物を生じる。このプロセスから見込まれる化合物は、次いで、さらなる生物学的調査のために従来の単一化合物合成方法においてより大きなスケールで合成され得る。
ポジショナルスキャンニングアプローチは、種々の有機ライブラリーおよび種々のペプチドライブラリーに関して記載される（例えば、Ｒ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４および米国特許第５，５５６，７６２号（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ポジショナルスキャンニングアプローチにおいて、ライブラリーは、各サブライブラリーのセットを有する１つの変化のみを規定して作られ、そして規定された各単一変化（および全ての他の変化位置での他の可能性全て）を有する全ての可能なライブラリーが作られ、そして試験される。この簡単な説明から、当業者はライブラリーを合成し得、そして２個の固定位置が同時に規定される。ライブラリーを規定する各単一の変化の試験から、その位置での最適な置換が決定され、最大の所望の生物学的活性を有する最適化合物または少なくとも一連の化合物を示す。従って、規定された単一の位置を有する化合物についてのサブライブラリーの数は、その位置での所望される異なる置換であり、そして各サブライブラリーにおける全ての化合物の数は、他の変化位置それぞれでの置換の数の産出である。
ファージディスプレイ方法は、無作為ペプチドまたは選択的に無作為化されたペプチドの種々の集団を発現するための方法を提供する。ファージディスプレイの種々の方法およびペプチドの種々の集団を産生するための方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｌａｄｎｅｒら（１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号）は、ファージの表面上の結合ドメインの種々の集団を調製するための方法を記載する。特に、Ｌａｄｎｅｒらは、ファージディスプレイライブラリーを産生するために有用なファージベクター、および可能な結合ドメインを選択し、そして無作為にまたは選択的に突然変異された結合ドメインを産生する方法を記載する。
ペプチド部分を含む本発明のＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤は、アミノ酸（例えば、必要とされる場合、ｔ−ブチルジ炭酸塩（ｔ−ＢＯＣ）基またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基を使用して保護される活性基）を使用して合成され得る。アミノ酸およびアミノ酸アナログは、購入され得る（Ｓｉｇｍａ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ）か、または当該分野で公知の方法を使用して合成され得る。固相方法を使用して合成されるペプチドは、例えば、４−メチルベンジルドリルアミン（ＭＢＨＡ）、４−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチルおよび４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ ジビニルベンゼン（Ｗａｎｇ樹脂）を含む種々の樹脂（これらの全ては、市販されている）、またはｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムポリマー（オキシム樹脂）（Ｄｅ ＧｒａｄｏおよびＫａｉｓｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：３２５８（１９８２）によって記載されるように合成され得る）に結合し得る。
本発明のペプチドに組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸アナログの選択は、部分的に、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤に必要な特定の物理的、化学的または生物学的特徴に依存する。例えば、ペプチドがインビボまたはインビトロで使用されるべきであるか否かによって、そしてインビボで使用される場合、本発明のペプチドが投与される経路またはペプチドが指向される被験体における位置によって、そのような特徴は決定される。例えば、本明細書中で例示されるＩＡＰ阻害カスパーゼコアペプチドの抑制解除剤は、Ｌ−アミノ酸のみを使用して合成され得る。しかし、当業者は、ペプチドがＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制し得る場合、本発明のペプチド中の任意のアミノ酸または全てのアミノ酸は、天然のＬ−アミノ酸、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり得ることを理解する。
本発明のペプチドにおいてＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸を含むことの選択は、部分的に、このペプチドの所望される特徴に依存する。例えば、１つ以上のＤ−アミノ酸の取り込みは、インビトロまたはインビボでのペプチドに対して増加した安定性を付与する。１つ以上のＤ−アミノ酸の取り込みはまた、例えば、本明細書中の実施例ＶＩＩにおいて記載されるようなアッセイまたは特定のペプチドの特定のタンパク質への結合親和性を決定するための、他の周知の方法を使用して決定されるようなペプチドの活性（例えば、ＩＡＰ結合親和性）を増加または減少し得る。
上で示されるように、本発明のペプチドは、線状、環式または多価性などのいずれかでであり得、その立体配座は、当該分野で周知の方法を使用して達成され得る。本明細書中で使用される場合、「環式」ペプチドとは、構造を環式形態に化学的に転化することによって作られ得る合成線状ペプチドのアナログをいう。線状ペプチドの環状化は、標的タンパク質への結合能力を増加するか、または減少することによって生物活性を調節し得る（Ｐｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：２３６〜２３９）。線状ペプチドは非常に柔軟であり、そして溶液中で多くの異なる立体配座を選択する傾向にある。環状化は、溶液中で利用可能な立体配座の数を抑制するように作用し、従って、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として、ＩＡＰに対するより高い親和性またはより強力な活性を有する立体配座を与え得る。
線状ペプチドの環状化は、遊離のＮ末端とＣ末端との間のペプチド結合を形成すること（ホモデティックシクロペプチド）またはアミノ酸のバックボーンおよび／あるいはＮ−末端またはＣ−末端の近くに位置する側鎖基との間の新たな共有結合を形成すること（ヘテロデティックシクロペプチド）のいずれかによって達成される（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｎ．，１９８４（前出））。後者の環状化は、共有結合（例えば、ジスルフィド、ラクトン、エステル、またはチオエステル）を形成するような代替の化学ストラテジーを使用する。本明細書中で示されるように、５個以上のアミノ酸残基の線状ペプチドは、比較的容易に環状化される。中心の４個の残基におけるβ回転立体配座を形成するようなペプチドの傾向は、ホモデティックおよびヘテロデティックシクロペプチドの両方の形成を容易にする。Ｎ末端またはＣ末端におけるプロリン残基またはグリシン残基の存在はまた、シクロペプチドの形成、特に長さが６個の残基より短い線状ペプチドからの形成を容易にする。
本発明の因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼ配列または部分が１分子ごとに存在する抑制解除剤の数に関して多価であり得る。多価の因子中に存在する配列または部分は、同じまたは異なる配列または部分のいずれかであり得る。例示的な多価性ペプチドは、周知の複数抗原ペプチドシステム（ＭＡＰＳ；例えば、Ｂｒｉａｎｄら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．、１５６（２）：２５５〜２６５；Ｓｃｈｏｔｔら、１９９６、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎ．、１７４（２）：１９９〜２０９などを参照のこと）を使用して産生され得る。存在する抑制解除性ＩＡＰ阻害カスパーゼ配列または部分の数に関して多価である因子は、１つを超えるＢＩＲドメインを有するＩＡＰと相互作用するために有用であり得る。例えば、単一の因子は、同じＩＡＰ上に別個のＢＩＲドメインと相互作用する２つ以上の配列または部分を含むように作られ得る。多価の因子およびＩＡＰにおける複数の相互作用するパートナーの存在は、その相互作用の親和性または特異性を増加し得る。
いくつかの場合、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤を短期間のみ活性なままにさせておくことが望ましい。その場合、因子中の１つ以上のＬ−アミノ酸の取り込みは、例えば、被験体における内因性ペプチダーゼがインビボで因子を消化することを可能にし得、その結果、この抑制解除剤に対する被験体の曝露を制限する。１つの実施形態において、因子（ペプチドバックボーンまたは他の構造に基づくか否か）は、Ｌ−アスパラギン酸塩部分または残基を介したペプチド結合を含み得る。Ｌ−アスパラギン酸塩を含む因子のカスパーゼ（因子が抑制解除する）による分解は、因子によって可能にされるアポトーシスの範囲を最小にするフィードバック制御機構を提供し得る。当業者は、本発明の因子に必要とされる望ましい特徴を、例えば被験体の年齢および一般的な健康状態などを考慮して決定し得る。例えば、対応するＬ−アミノ酸と置換される１つ以上のＤ−アミノ酸を有する被験体におけるペプチドの半減期は、薬学分野の当業者に周知の方法を使用して決定され得る。
ペプチド中の反応性基の選択的な修飾はまた、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤に対して所望の特徴を与え得る。本発明のペプチドは、樹脂へ付着されたままま、例えば、Ｎアセチル化ペプチドのような、Ｎ末端修飾ペプチドを得るために操作され得る。あるいは、ペプチドは、フッ化水素または等価な切断試薬を用いて樹脂から除去され得、次いで修飾され得る。Ｃ末端カルボキシ基を含有して合成された物質（Ｗａｎｇ樹脂）は、樹脂からの切断後に修飾され得るか、または、いくつかの場合では、液体相合成の前に修飾され得る。ペプチドのＮ末端またはＣ末端を修復するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｎ末端のアセチル化のための方法およびＣ末端のアミド化のための方法がある。
ペプチドアナログもまた、発明範囲内に包含される。本明細書で使用される場合、「ペプチドアナログ」という用語は、本明細書に具体的に示される配列（例えばコアペプチド１〜５５）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、任意のペプチドを含み、ここで、一つ以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換され、そして本明細書に記載されているように、本発明のレクチン結合ペプチドを機能的に模倣する能力を表す。保存的置換の例としては、一つの非極性（疎水性）残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別の残基での置換、一つの極性（親水性）残基の別の残基での置換（例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間）、一つの塩基性残基（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）の別の残基での置換、または一つの酸性残基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）の別の残基での置換が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という語句はまた、このようなペプチドが、必要とされたＩＡＰ結合または抑制活性を示すという条件で非誘導体化残基に代わり、化学的に誘導体化された残基の使用を包含する。化学的な誘導体は、例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように誘導体化されている分子を包含し得る。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、もしくは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ―ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。また、化学的誘導体としては、２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を一つ以上含むペプチドが挙げられる。例えば：４−ヒドロキシプロリンは、プロリンで置換され得る；５−ヒドロキシリジンは、リシンで置換され得る；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンで置換され得る；ホモセリンは、セリンで置換され得る；およびオルニチンは、リジンで置換され得る。本発明のペプチドはまた、必要とされるＩＡＰ結合または阻害活性が保持される限りペプチド配列（これらの配列は本明細書に示されている）に対して、一つ以上の付加、欠失または残基の付加および欠失の組み合わせを有する任意のペプチドを含む。
当業者は、本明細書で提供された指針から、本発明の因子がＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る限り、本発明の因子は、アナログまたは誘導体を用いて修飾され、誘導体化されるかもしくは置換される、コアペプチドまたはコア構造を含み得ることを認識する。コアペプチドまたはコア構造におけるこのような変化は、本明細書に記載される方法のような周知の合成方法により作製され得る。そのように変化された因子は、実施例Ｉに記載される抑制解除アッセイまたは実施例ＶＩＩに記載される分極結合アッセイのような、本明細書に記載される方法を用いて活性を試験され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定された因子は、例えば、上記に記載されたアッセイを包含する、カスパーゼタンパク分解性活性または因子の存在または非存在におけるＩＡＰおよびカスパーゼの結合を決定するアッセイするアッセイを用いて試験され得る。このようなアッセイを用いて、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得るとして同定された因子は、上記に記載された相互作用アプローチを用いて一つ以上の位置で、さらに組み合わ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｉｚｅｄ）され得る。あるいは、同定された抑制解除剤または複数の抑制解除剤は、第２世代因子の合理的な設計のための基礎として使用され得る。例えば、複数の確認された因子の間において共通の構造の特徴は、これらの共有された特徴を取り込む一般構造の合成を導くために使用され得る。ＩＡＰまたはカスパーゼと結合された場合、因子に関しての構造情報はまた、第２世代因子（有利な相互作用を提供する一方で、カスパーゼまたはＩＡＰとの不利な相互作用を導く成分を除去するものとして同定された成分を、保持または改良する）を設計するために使用され得る。
本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＩＡＰまたはカスパーゼに結合されるＩＡＰ阻害カスパーゼの標識化抑制解除剤を検出する工程；（ｂ）この結合されたＩＡＰまたはカスパーゼを候補因子と接触させる工程であって、この候補因子がＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得ることが憶測される、工程；および（ｃ）ＩＡＰおよびカスパーゼからのＩＰＡ阻害カスパーゼの標識抑制解除剤の解離を検出する工程であって、それによりこの候補因子が、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子として同定される、工程、を包含する。この方法で使用されるＩＡＰ阻害カスパーゼの標識化抑制解除剤は、本発明のコアペプチド（例えば、コアペプチド４〜３９および４２〜５５またはＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４もしくはＴＰＩ９２７から選択されるコア構造）から選択されたコアモチーフを有し得る。この方法は、上記に記載されたスクリーニング形式および実施例においてＩＡＰ阻害カスパーゼのすぐれた抑制解除剤を同定するために使用され得る。
本発明の方法で使用されたＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤は、例えば、上記に記載される方法を包含する、任意の多様な標識を用いて標識化され得る。ＩＡＰまたはカスパーゼに結合された標識化抑制解除剤は、公知の測定可能な標識特性に従って、検出され得る。例えば、発蛍光団は、発蛍光団の励起波長または発光波長、発蛍光団の蛍光偏光または発蛍光団から放出された蛍光強度に基づいて検出され得る。あるいは、検出は、結合状態および非結合状態について、測定可能な標識特性における相違に基づき得る。例えば、実施例ＶＩＩに示されるように、非結合基質と比較してＩＡＰに結合された基質の遅い循環に起因する蛍光偏光における相違は、会合を検出するために使用され得る。ＩＡＰまたはカスパーゼとの発蛍光団標識化因子の会合を決定するために使用され得る、他の測定可能な相違は、例えば、クエンチング因子の存在または非存在に起因する異なった発光強度、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーまたはアクセプターの存在または非存在に起因する発光波長における相違、あるいは発蛍光団立体配座または環境における相違に起因する発光波長における相違、を包含する。
ＩＡＰまたはカスパーゼからＩＡＰ阻害カスパーゼの標識化抑制解除剤の解離は、競合結合候補因子の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼからの標識の非存在もしくは標識量の減少として、または競合結合候補因子の存在下におけるカスパーゼもしくはＩＡＰとの標識因子の会合の際に生じる変化の反転として検出され得る。従って、解離は、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅ）標識化抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼの放射能の減少もしくは消失、発色団標識化抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰもしくはカスパーゼに特異的な波長での電磁吸光度の減少もしくは消失、常磁性のスピン標識化抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰもしくはカスパーゼに特異的な磁場強度もしくは高周波数での磁気シグナルの減少もしくは消失、または、第２標識のために結合基で標識化される抑制解除剤の存在下でＩＡＰまたはカスパーゼと会合した第２標識の減少もしくは消失として、非標識候補因子の存在下で検出され得る。会合の際に生じる変化の反転により測定される解離の例は、実施例ＶＩＩに提供され、ＩＡＰ結合基質と比較して速い解離基質循環に起因する偏光における相違が、解離を検出するために使用される。
適切な標識抑制解除剤とＩＡＰまたはカスパーゼとの結合あるいは解離を決定するために検出し得る標識の特性における他の変化としては、例えば、熱の吸収および放出、電磁放射の吸収および放出、レセプターに対する親和性、分子量、密度、質量、電荷、伝導率、核磁気モーメント、電子のスピン状態、極性、分子の形状、または分子の大きさが挙げられる。適切な標識抑制解除剤とＩＡＰまたはカスパーゼとの結合あるいは解離の際に変化し得る周囲の環境の特性としては、例えば、周囲の溶媒の温度および屈折率が挙げられる。ＩＡＰまたはカスパーゼからの抑制解除剤の結合および解離は、周知の方法を用いて、抑制解除剤とＩＡＰまたはカスパーゼとの間における標識抑制解除剤の任意の多様な特性、または、複合体の任意の多様な特性に基づいて計測され得、これらの方法としては、例えば、Ｓｅｇｅｌ、ＥｎｚｙｍｅＫｉｎｅｔｉｃｓ Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）、およびＫｙｔｅ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＧａｒｌａｎｄ Ｐｕｂ．（１９９５）に記載されるような、平衡結合分析、競合アッセイおよび動力学的アッセイが挙げられる。
さらに本発明は、データベースにおいてＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定する方法を提供する。ペプチドまたは低分子のような分子のデータベースは、クエリー構造に対して同一部分または類似部を有する、候補因子を同定するために、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤の構造を用いて検索され得る。データベース検索において同定された候補因子は、合成され得るか、単離され得るか、または公知の方法を用いて他の方法で得られ得、次いで、上記および実施例に記載されるアッセイを用いて、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤としての活性のそのレベルについて試験され得る。
ペプチドベースの抑制解除剤に対して、クエリーは、アミノ酸配列（一次構造）または三次元構造（三次構造）、あるいは同一の構造または実質的な類似構造を有する、ペプチドあるいはタンパク質を同定するために両方の組み合わせに基づいたデータベースで作製され得る。二つの配列が実質的に同一であるということを決定するために使用され得る一次配列構造を比較する方法は、データベースにあるように、当該分野において周知であり、これらの方法としては、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＧｅｎＰｅｐｔが挙げられる。例えば、二つの配列が実質的に同一かどうかを決定するための一つの方法はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）であり、これは、Ｔａｔｉａｎａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７―２５０（１９９９）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブページに記載されたように、デフォルトパラメーターに従って使用され得る。ＢＬＡＳＴは、全ての利用可能な配列データベースを試験するために設計された同様の検索プログラムのセットであり、そしてアミノ酸または核酸配列において類似点を検索するために機能を果たし得る。ＢＬＡＳＴ検索は、十分に規定された統計学的な解釈を有する検索スコアを提供する。さらに、ＢＬＡＳＴは、局所的なアライメントを捜す発見的アルゴリズムを使用し、従って、類似性の単離された領域（例えば、タンパク質ドメイン（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―４１０（１９９０））が挙げられる）のみを共有する配列間の関係を検出し得る。
初めに記載されたＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出、１９９０）に加えて、アルゴリズムに対する改変がなされている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。第１の改変は、ギャップ（ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴであり、これは、アライメントへ導入されるような、挿入または欠失のいずれかにギャップを可能にする。アライメント中のギャップを可能にすることは、より密接な生物学的関係を示す傾向がある。例えば、ギャップＢＬＡＳＴは、２つ以上のポリペプチドの類似のドメイン内での配列同一性を同定するために使用され得る。第２の改変は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴであり、これは、配列相同性について検索するための感度のよい方法である。ＰＳＩ―ＢＬＡＳＴは、初回ギャップＢＬＡＳＴ検索を実施し、そして、位置特異的スコアマトリクス（これは、データベース調査の次のラウンドのためのクエリー配列を置き換える）を構築するために任意の有意なアライメントからの情報を使用する。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索は、しばしば弱いが、生物学的に関連する配列類似性に対してより感受性である。
二つの配列が実質的に同一であるかどうかを決定するために使用され得る第２のリソースは、ＰＲＯＳＩＴＥであり、ＥｘＰＡＳｙでのｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｗｅｂで利用可能である。ＰＲＯＳＩＴＥは、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列から翻訳された特性のないポリペプチドの機能を決定する方法である（Ｂａｉｒｏｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２１７−２２１（１９９７））。ＰＲＯＳＩＴＥは、公知のポリペプチドのファミリー、たとえあるとしても、新しい配列がどこに属するかを同定するために使用され得る生物学的に有意な部位およびパターンのデータベースからなる。このアルゴリズムまたは類似のアルゴリズムを使用して、別のポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドは、アミノ酸残基の特定のクラスター（これは、パターン、モチーフ、特徴、またはフィンガープリントと呼ばれ得る）のその配列中の存在により同定され得、参照ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の特定のクラスターと実質的に同一であり、例えば、これらとしては、類似のドメインにおいて見られるこれらが挙げられる。ＰＲＯＳＩＴＥは、ファミリーメンバーとしてポリペプチドを同定するモチーフを検索するために、コンピューターアルゴリズムを使用する。ＰＲＯＳＩＴＥはまた、以前に同定されたモチーフの編集を維持し、これは、新しく同定されたポリペプチドが公知のファミリーのメンバーであるかどうかを決定するために使用され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤の三次構造は、当該分野で公知のアルゴリズムを用いるａｂｉｎｉｔｉｏタンパク質折りたたみのような理論的な方法により決定され得るか、あるいは、構造決定に基づくＸ線結晶構造解析または核磁気共鳴のような実験的な方法により決定され得る。抑制解除剤の構造モデルは、ポリペプチド構造、例えば、ＨａｄｌｅｙおよびＪｏｎｅｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：１０９９―１１１２（１９９９）により総説されるＳＣＯＰ、ＣＡＴＨまたはＦＳＳＰを含む、および、実質的に類似の領域を同定するための第２のポリペプチドとの配列比較のための領域として使用される特定の折りたたみまたは特定のコンフォメーションを有する領域を比較するアルゴリズムにおいて使用され得る。
類似のデータベースを検索する方法は、非ペプチドベースの抑制解除剤化に対して使用され得るか、または、構造に基づいた非ペプチドベースの候補因子のデータベースを検索するために使用され得る。データベースは、例えば、化学的特性情報または構造的情報に基く検索により検索され得る。後者のアプローチにおいて、テンプレートとのマッチの発見に基づくアルゴリズムは、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、「Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５―２１５４（１９９２）に記載されるように使用され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤はまた、クエリーとして、位置的スキャニングの合成コンビナトリアルライブラリーの結果を用いるデータベース中で同定され得る。このような結果は、モチーフとして表され得、そしてこのモチーフは、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤について、データベースで検索するために使用される。モチーフ検索は、位置的スキャニングの合成コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング結果から作製され、そして、特定された値より大きい活性閾値を有する混合物に一致するアミノ酸は、各々の位置に含まれる。活性閾値の例は、実施例Ｉに記載されるように、候補因子の存在および非存在において、カスパーゼ活性に対するＶｍａｘの割合である。データベース検索に基づくモチーフは、例えば、Ｈｅｍｍｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１３７５−１３８２（１９９９）、Ｈｅｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１６５１−１６５９（１９９７）およびＨｅｍｍｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９：１６３−１６８（１９９８）に記載されるように、当該分野において公知である。
あるいは、位置的スキャニングの合成コンビナトリアルライブラリーからの結果は、スコアマトリクスとして表され得、そして、そのスコアマトリックスは、配列データベースにおけるＩＡＰ阻害カスパーゼの他の抑制解除剤について検索するために使用される。データベースのスコアマトリクスベースの検索に基づいて候補ペプチドまたは候補タンパク質を同定するための方法は、Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２１３０−２１４１（２００１）に記載される。簡単には、マトリクスは、列が位置を表し、行が２０アミノ酸を表し、そして各々がスコアに関連するマトリクスにおいて構築される。特定の位置およびアミノ酸に対するスコアは、その位置で規定されたアミノ酸に対応する、位置的スキャニングの合成コンビナトリアルライブラリーの混合物に対するアッセイ結果に基づく。例えば、各スコアは、特定の位置において規定されるアミノ酸に対応する混合物の存在または非存在において、カスパーゼ活性に対するＶｍａｘの割合に対応し得る。次いで、スコアリングマトリックスは、１アミノ酸増加において、スコア化マトリックスをデータベース登録へ移すことにより、ＩＡＰ阻害カスパーゼの候補抑制解除剤を検索するために使用される。スコアは、検索されたデータベース登録について計算され、各々は区別される。予め決定されたカットオフより上のスコアを有する候補抑制解除剤は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの候補抑制解除剤として同定される。
本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供し、この方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するような有効量の因子とＩＡＰ阻害カスパーゼとを接触することにより、そして、因子は、本発明のコアペプチド（例えば、４〜３９と４２〜５５のコアペプチド、またはＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４またはＴＰＩ９２７のような本発明のコア構造）から選択されたコアモチーフを有する。
アポトーシスタンパク質インヒビター（ＩＡＰ）のカスパーゼ阻害活性を阻害するために、ＩＡＰ阻害カスパーゼは、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するのに、有効量の抑制解除剤とを接触させる。従って、有効量の因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼについてカスパーゼ活性と比較して、抑制解除されたＩＡＰ阻害カスパーゼから、カスパーゼタンパク分解活性の増加をもたらすために十分な量である。抑制解除されたＩＡＰ阻害カスパーゼからのタンパク分解活性の増加は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定するための方法を参照して、上記の任意の方法を用いて決定され得る。
本発明の因子は、カスパーゼ活性に対して適切な条件下で、ＩＡＰ阻害カスパーゼと接触させ得、カスパーゼを阻害することから阻害されるＩＡＰを一旦生じる。このような条件としては、実施例Ｉに記載される条件が挙げられる。ＩＡＰ阻害カスパーゼと接触させる因子は、化合物の混合物、単離された形成または実質的に純粋な形成で存在され得る。上記のように、化合物の混合物は、位置的スキャニングまたは反復を使用するスクリーニング方法で、ＩＡＰ阻害カスパーゼと接触され得る。このような混合物は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する能力を有するので、同定され得る。混合物は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するために、本発明の方法において使用され得る。あるいは、このような活性を有する混合物における特定の種は、混合物において個々の種を単離し、そして抑制解除アッセイを繰り返すか、またはＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除のために第２のアッセイを実施することにより、さらに規定され得る。ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、実質的に純粋な形態（結合体として）、または上記のような処方物において、ＩＡＰ阻害カスパーゼと接触され得る。
本発明のさらなる実施形態において、ＩＡＰ阻害カスパーゼは、細胞内において本発明の因子と接触され得る。従って、本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するための有効量の因子と細胞とを接触することにより、細胞中のアポトーシスを促進する方法を提供し、この因子は、本発明のコアペプチド（例えば、コアペプチド４〜３９およびコアペプチド４２〜５５、または例えば、ＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４もしくはＴＰＩ９２７のような本発明のコア構造）から選択されたコアモチーフを有する。
ＩＡＰ阻害カスパーゼの細胞質ゾルの送達（例えば、結合体の一部の結合）について本明細書中に記載される方法は、細胞中のアポトーシスを促進する方法で使用され得る。有効量の因子は、アポトーシスが細胞内に生じるのに十分な量で同定され得る。アポトーシスの特徴である細胞または核中の形態学的な変化を決定する方法（例えば、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤の同定に関する上記の方法）は、細胞中のアポトーシスを促進する方法を実施する間、アポトーシスをモニターするために使用され得る。
本発明はまた、細胞集団がエキソビボで生存する能力を減少するための方法を提供する。この方法は、本発明の因子と細胞とを接触する工程を包含し得、ここで、この因子はＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する。細胞は、細胞中のアポトーシスを促進するための上記の方法を用いて、因子と接触され得る。この方法は、上記の標的化方法（例えば、因子への標的化部分の結合）を使用して、サンプル内の細胞の特定の亜集団を除去するために使用され得る。
本発明の方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼが抑制解除された場合アポトーシスが生じ得る任意の生物由来の細胞中で実施され得、これらの細胞としては、例えば、真核生物細胞（例えば、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、または他の動物細胞）；無脊椎動物細胞（例えば、ハエまたは線虫細胞、もしくは酵母細胞）が挙げられる。種々の細胞型は、本発明の方法において使用され得、これらとしては、例えば、腫瘍細胞、幹細胞、神経細胞、脂肪細胞、造血細胞、肝細胞または筋細胞が挙げられる。特定の場合において、この方法は、異常に調節された細胞におけるアポトーシスを誘発するのに有用であり、これらの細胞としては例えば、非制御細胞増殖を示す細胞ならびに細胞周期の特定の相において機能障害を示す細胞が挙げられ、これは、改変された増殖性の特徴または形態学的な表現型を引き起こす。異常に調節された細胞型の特定の例としては、腫瘍性細胞（例えば、癌および組織過形成の過形成性細胞の特徴）が挙げられる。別の特定の例としては、異常に活性化されるようになる免疫細胞、または刺激後にダウンレギュレーションできない免疫細胞が挙げられる。自己免疫疾患は、このような異常に調節された免疫細胞により媒介される。異常に調節された細胞はまた、生物化学的な機能障害または生理学的な機能障害の細胞を含む。細胞機能異常調節または増殖異常調節の他の型は、当業者に公知であり、同様に本発明の方法を用いるアポトーシスの破壊に対して適用できる本発明の標的細胞である。
細胞のアポトーシスに関連する多くの特徴的な変化は、カスパーゼのタンパク分解活性に起因するので、この方法は、アポトーシスの特徴的な変化を誘導するために使用され得る。例えば、ラミンＢのカスパーゼ誘導性タンパク分解は、核膜へのクロマチンの付着に関係し、アポトーシスに関連するクロマチンの崩壊の原因である（ＭａｒｔｉｎおよびＧｒｅｅｎ、前出、１９９５）。ＤＮＡフラグメント化因子（ＤＦＦ―４５）の４５ｋＤａサブユニットのカスパーゼ誘導性タンパク分解は、ヌクレオソームフラグメントへのゲノムＤＮＡのフラグメント化を引き起こす経路を活性化する（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ ８９：１７５−１８４（１９９７））。さらに、ＰＡＲＰのカスパーゼ誘導性タンパク分解は、ＰＡＲＰがＤＮＡ損傷を修復する能力を妨げ得、さらに、アポトーシスに関連する形態学的変化に寄与する。従って、本発明の方法は、クロマチンの崩壊およびアポトーシスに関連するゲノムＤＮＡのフラグメント化を誘導するために使用され得る。他のカスパーゼ標的タンパク質としては、ステロール調節エレメント結合タンパク質；網膜芽細胞腫（ＲＢ）タンパク質；ＤＮＡ依存キナーゼ；Ｕ１ ７０−Ｋキナーゼ；およびＤＮＡ複製複合体の大サブユニットが挙げられ（Ｗａｎｇら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１０１２−１０２０（１９９６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ９３：８３９５−８４００（１９９６）；Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１９５７−１９６４（１９９６）；およびＵｂｅｄａおよびＨａｂｅｎｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９５６２−１９５６８（１９９７））、各々は、本発明の方法によりタンパク分解されるよう誘導され得る。
哺乳細胞において、カスパーゼの活性化は、少なくとも二つの独立したメカニズムを通じて達成され、それは、別個のカスパーゼにより開始されるが、共通の「実行者（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ)」カスパーゼ活性化を生じる。Ｆａｓレセプターに結合するリガンドにより開始されたアポトーシスは、細胞死の経路でよく記載される一つである。この経路において、Ｆａｓとリガンドの結合は、Ｆａｓの細胞内ドメインを細胞内ＭＯＲＴ１（ＦＡＤＤ）タンパク質に結合させ、それは、次に、カスパーゼ８（ＭＡＣＨ；ＦＬＩＣＥ；Ｍｃｈ５；Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５：８０３−８１５（１９９６）；Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５：８１７−８２７（１９９６）参照）と結合する。これらの結果は、Ｆａｓ細胞死の経路に含まれる上流カスパーゼとして、カスパーゼ８を規定する。さらに、カスパーゼ３は、Ｆａｓ細胞死経路で活性化され、それは、例えば、カスパーゼ８、またはカスパーゼ８により活性化されたプロテアーゼのような上流プロテアーゼが、カスパーゼ３活性化に含まれていることを示している。従って、本発明の方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼ８を直接的に抑制解除するために使用され得、それにより下流カスパーゼ３プロテアーゼを効果的に抑制解除する。
カスパーゼ活性化はまた、シトクロムＣを含み、それは、哺乳細胞内において、アポトーシスの間、ミトコンドリアから細胞質ゾルへしばしば放出される（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ ８６：１４７−１５７（１９９６）；Ｋｈａｒｂａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ９４：６９３９−６９４２（１９９７）；Ｋｌｕｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１１３２−１１３６（１９９７）；およびＹａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１１２９−１１３２（１９９７）。細胞質ゾルに入ると、シトクロムＣは、タンパク質複合体のＡＴＰ依存性形成またはｄＡＴＰ依存性形成を誘導し、プロカスパーゼ３のタンパク分解性活性化および核のアポトーシス破壊という結果となる（Ｌｉｕら、前出、１９９６）。この複合体のメンバーのうちでもとりわけ、ＣＥＤ−４相同体Ａｐａｆ−１およびカスパーゼ９である。（Ａｐａｆ−３；Ｌｉｕら、前出、１９９６；Ｌｉら、Ｃｅｌｌ ９１：４７９−４８９（１９９７）；Ｚｏｕら、Ｃｅｌｌ ９０：４０５−４１３（１９９７））。ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１およびｃ−ＩＡＰ−２は、ミトコンドリアからのシトクロムＣの放出を引き起こすことが公知の刺激によって誘導されたアポトーシスを抑制し、インビトロにおいてシトクロムＣによって誘導されるカスパーゼ活性化を阻害し得る。従って、本発明の因子および方法は、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１またはｃ−ＩＡＰ−２によるカスパーゼの阻害を抑制することにより、ミトコンドリアからのシトクロムの放出に応答してアポトーシスを起こすために、使用され得る。
さらに本発明は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するために有効な量の因子を、病理学的に減少したアポトーシスのレベルにより特徴付けられた病的状態を有する個体へ投与することにより、個体における病的状態の重症度を和らげる方法を提供する。本発明の方法において処置され得る、病理学的に減少したアポトーシスレベルにより特徴付けられた状態の例は、非制限であるが、以下；再狭窄、狼瘡または慢性関節リウマチのような自己免疫疾患；同種移植拒絶、湿疹のような皮膚増殖性病変；あるいは良性前立腺肥大症、が含まれる。因子は、本発明のコアペプチド（例えば、コアペプチド４〜３９およびコアペプチド４２〜５５）、または本発明のコア構造（例えば、ＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４もしくはＴＰＩ９２７）から選択されたコアモチーフを有し得る。
病的状態を処置するために使用される場合、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子の有効量は、個体に投与される場合において、アポトーシスの増加を与えるための必要量である。治療効果的であるために必要とされる本発明の因子の投与量は、例えば、処置される病的状態、投与経路および投与形態、個体の体重および個体の状態、ならびに以前の治療歴および最近の治療に依存する。この方法の特定の適用のために、効果的な量と考えられる適切な量は、本明細書で提供される指針を用いて、当業者によって決定され得る。例えば、その量は、上述されたようにインビトロアッセイまたはインビボアッセイから推定され得る。当業者は、患者の状態が、一連の段階的治療にわたり監視され得るということを認識し、そして投与される因子の量はそれに従って調節され得ることを認識する。
病的状態を処置するかもしくはこの重症度を和らげるために、有効量は、病理学的に減少されるアポトーシスを増大し得る因子の有効（ｅｆｆｉｃｉｏｕｓ）量である。有効量は、治療レジメに依存して、例えば約１０μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重または好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。例えば、因子または因子を含む処方物が、１日１回〜数回投与された場合、処方物が週単位または月単位、もしくは少ない頻度で投与された場合、より低用量が必要とされる。同時に、因子の経時的放出を可能にする処方物は（例えば上述の通り）、単一ボーラス量として投与されるというより、より少量のアポトーシス抑制解除剤の連続的な放出を提供する。例えば、本発明の因子は、約１〜５ｍｇ／ｋｇ／週の間で投与され得る。
ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の処方物は、改変体およびその組合せで、時間を通じてアポトーシスを増大させる効果を組み合わせるように、交互の投与で送達され得る。例えば、本発明のコアペプチドまたは構造を有する因子は、単一ボーラス量の後に、一つ以上のこのような因子の種類もしくは改変体単独の多様な投与により投与され得、または、このような因子の異なる処方物もしくは異なる因子の処方物との組合せで投与され得る。因子処方物（改変体もしくはその組合せ）の同時送達であっても交互送達であっても、投与方法は、上記に記載される任意の投与の型であり得、そして、目的に対して選択されるＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤において、特定の治療の必要性および効能に依存する。一時的な投与レジメにおいて結合する因子、処方物、種類および改変体を決定することは、治療される病的状態および疾患を有する個々の調子の特定の身体特徴に依存する。当業者は、特定の病的状態の当該分野内における公知の診断基準および臨床基準と共に、本明細書で提供される教示および指針を用いて、特定の適用に対して有効である特定の投与のレジメを知っているか、または決定し得る。
さらに病理学的に減少したアポトーシスにより特徴付けられた病的状態を処置する方法は、他の治療に関連して実施され得る。例えば、癌を処置するために、本発明の方法は、従来の癌処置（例えば、手術、化学療法（サイトカインならびに増殖因子の投与が挙げられる）、放射線または当該分野で公知の他の方法）の前、間、または後に実施され得る。上に記載され、実施例Ｘの結果によって示されているように、ＴＰＩ７９２−３３またはＴＰＩ７９２−３５は、癌を処置するためのＶＰ−１６に関連して投与され得る。
同様に、感染症を含む病的状態を治療するために、本発明の方法は、従来の処置（例えば、抗生物質投与、抗感染症因子または当該分野で公知の他の方法）の前、間、または後に実施され得る。自己免疫障害の病的状態の処置はまた、特定の自己免疫疾患に対する従来の処置と、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するための本発明の方法とを結合することによって実行され得る。従来の処置としては、例えば、化学療法、ステロイド療法、インスリンおよび他の増殖因子ならびにサイトカイン療法、受動免疫、Ｔ細胞レセプター結合の阻害剤、ならびにＴ細胞レセプター予防接種が挙げられる。本発明の方法は、本方法または当該分野において公知の他の方法に関連して投与され得、そして、従来の処置の開始の前、間、または後に何回も投与され得る。異常な細胞増殖により特徴付けられた病的状態に対する処置の記載に対して、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ、第１６版、（Ｂｅｒｋｏｗ、Ｒ．編）Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２を参照。さらに、抗癌剤は、例えば、組成物の組合せに関して上述の任意のものが挙げられ、処置方法におけるＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤の投与の、前、間、または後に投与され得る。
上記に記載されるように、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子の処方物の投与は、例えば、従来の治療と同時に用いられ得るか、または従来の治療との交互投与に送達され得、多様な投与が挙げられる。同時投与は、例えば、同一の処方物と共に、または同時にかもしくはすぐ連続して送達される異なる処方物中であり得る。交互投与は、例えば、一時的な分割投与において、本発明の因子および従来の治療処置を送達し得る。前記に記載されているように、本発明の因子および従来の治療の一時的な分割投与は、異なる送達方法および異なる経路を同様に使用し得る。
本発明の因子および方法を用いて処置され得る、病理学的に減少したアポトーシスレベルにより特徴付けられた状態としては、例えば、癌、過形成、自己免疫疾患ならびに再狭窄が挙げられる。ヒト疾患の発生数は、自己免疫として分類されており、例えば、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、グレーヴズ病、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜強膜炎、多発性筋炎ならびに糖尿病が挙げられる。病理学的に減少したアポトーシスのレベルにより特徴付けられた多くの状態に対する動物モデルが開発され、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を使用する治療処置の予測的評価のために使用され得る。さらに、ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の薬学的な組成物は、このような動物モデルからこれらの状態の処置に対して、確実に推定され得る。
当業者は、適切な動物モデルにおける慣用的試験の結果に基づいて、投与するための、本発明の因子の効能または量をどのように決定するか知っている。投与される因子の量は、治療される個体の応答に基づき、臨床背景で決定され得る。効能の調節は、病的状態に依存し、病的状態の処置または重症度の緩和のためにアポトーシスの進行が所望される程度に依存する。調節は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するために使用された特定因子、処方物、または投与戦略を調節することにより、実行され得る。本明細書で提供される指針に基づいて、当業者は、処置中の特定状態の重症度の、周知の適応症に対する応答において、効能を調節し得る。本明細書に記載される多様な病的状態に対する適応症の記載、または病理学的に減少したアポトーシスレベルによって特徴付けられた公知の病的状態に対する適応症については、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ、第１６版、（Ｂｅｒｋｏｗ，Ｒ．編）Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２を参照。
以下の実施例は、例示を意図し、本発明を限定しない。
（実施例Ｉ：ヘキサペプチドライブラリーからのＩＡＰ阻害カスパターゼ抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＩＡＰ抑制解除アッセイを示す。さらに本実施例は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る因子を同定するために、ポジショナルスキャニングアプローチを示す。
ヘキサペプチドの１２０混合物からなるＤＣＲ３９０ライブラリーを、Ｒ．ＨｏｕｇｈｔｅｎらＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４および米国特許第５，５５６，７６２号に記載されるように、当該分野で公知の方法を用いて合成した。各混合物を、全てが規定位置での同一アミノ酸および残りの５位置にある２０必須アミノ酸の任意の組み合わせを有するヘキサペプチドの集合から完成した。各混合物は、規定アミノ酸が存在する位置番号（ヘキサペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かってナンバー１〜６の番号が付けられる）、および規定アミノ酸の一致によって同定される。従って、表Ｉの第１欄に示すように、位置１でトリプトファンならびに位置２〜５で２０アミノ酸の全組み合わせを有する混合物は、「位置１、Ｗ」として同定される。
ＤＣＲ３９０ライブラリーを、以下に記載のアッセイを用いてスクリーンした。ＤＣＲ３９０ライブラリースクリーンから、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得ると同定された混合物に基づいて、さらに規定位置を、ＴＰＩ１２３９およびＴＰＩ１３２８サブライブラリーへ取り込みし、そしてこのサブライブラリーを、同一アッセイを用いてスクリーンした。
カスパーゼ活性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ３４０（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７７９７−７８００（１９９７）を参照）を用いて、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ合成ペプチドからの７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリン（ＡＦＣ）の放出によりアッセイした。候補混合物を、候補因子の存在下および非存在下において、精製組換えカスパーゼ−３、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣおよびＧＳＴ−ＸＩＡＰを含む混合物について、ＡＦＣ加水分解率を計測することにより、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する能力をスクリーンした。候補混合物の存在下および非存在下において、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解に対するＶｍａｘの割合を計算し、そして、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を含むものを同定するために使用した。その割合＝（Ｖmax（候補混合物、カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合）／（Ｖｍａｘ（カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合））。
上記に記載されるアッセイを用いて、ＤＣＲ３９０、ＴＰＩ１２３９またはＴＰＩ１３２８ライブラリー各々から各混合物のスクリーニングを、以下のように実施した。各混合物を、２５マイクロリットル量でアリコートし、９６ウェルマイクロタイタープレートの１ウェルに二連でアリコートした。まず、二連ウェルの第１セットには、２５マイクロリットルのカスパーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ショ糖、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ＣＨＡＰＳ）を添加し、ウェルの第２セットには、カスパーゼアッセイ緩衝液中４０ｎＭ ＸＩＡＰの、２５マイクロリットルのストック溶液を添加した。各マイクロタイタープレートはまた、以下のコントロールを有した：（1）２５マイクロリットルのカスパーゼアッセイ緩衝液および２５マイクロリットルのペプチドキャリア溶媒を添加した緩衝液ブランクウェル、（２）２５マイクロリットルのペプチドキャリア溶媒および２５マイクロリットルのカスパーゼアッセイ緩衝液中４０ｎＭ ＸＩＡＰストック溶液を添加したＸＩＡＰコントロールウェル、および（３）２５マイクロリットルのカスパーゼアッセイ緩衝液中４０ｎＭ ＸＩＡＰストック溶液を添加し、そして２．５マイクロリットルの４ｍＭ ＳＭＡＣペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、配列番号５）を添加したＳＭＡＣコントロールウェル。各々のサンプルウェルおよびコントロールウェルにおいて、２５マイクロリットルの０．６４ｎＭ カスパーゼ−３溶液を添加し、その後２５マイクロリットルの０．４ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を添加した。遊離したＡＦＣの蛍光を、３０秒間隔で３０分間、各ウェルから即座に検出した。各ウェルからのＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解に対するＶｍａｘを、ソフトマックスソフトウェアパッケージを用いて計測した。
ＤＣＲ３９０ライブラリーに対するスクリーン結果は、表Ｉに示した。同一位置に固定された異なる各々のアミノ酸を有する混合物のセットは、位置数で同定された６つのセクションにアレンジされる。各々の６つのセクションは、３つの欄であり、（１）固定されたアミノ酸の同定、（２）候補混合物、カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合、応答の見かけの速度、ならびに（３）候補混合物、およびカスパーゼ３が存在した場合、応答の見かけの速度、を示す。各セクションにおいて、ＸＩＡＰコントロール応答の結果が示される。各セクションの混合物は、第２欄での見かけの速度に従って、次数を下げることでアレンジされる。ＸＩＡＰコントロール反応と比較して、かなり高い見かけの速度を有する混合物は、水平線より上にリストされ、それにより、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る因子を含むとして同定される。
Figure 2005510569
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Figure 2005510569
ＤＣＲ３９０スクリーンの結果に基づいて、ＴＰＩ１２３９ライブラリーを合成し、上記に記載されるカスパーゼアッセイを用いてスクリーンした。特に、トリプトファンとして規定された位置５および位置６、様々に規定された位置３および／または位置４を有し、そして表ＩＩに示される２０の必須アミノ酸でランダム化された残りの位置は混合物を合成した。表ＩＩに示したように、ＸＩＡＰの非存在下において、この混合物は、カスパーゼ活性に対してする有意な効果はなかった。ＸＩＡＰの存在下において１．９またはそれ以上の割合を有する混合物を、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る因子と同定した。
Figure 2005510569
 ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得る因子を含むと、ＴＰＩ１２３９ライブラリーから同定された混合物を、用量応答に対してさらに分析した。用量応答データを、図１１（この混合物はカスパーゼ活性に影響が無いということを示す）に提供する。最も活性な化混合物は、位置４においてアラニン、リジンまたはスレオニン、位置５および位置６においてトリプトファン、そして位置１〜位置３においてその混合物を有することを見出した。
ＤＣＲ３９０ライブラリースクリーンおよびＴＰＩ１２３９ライブラリースクリーンの結果に基づいて、ＴＰＩ１３２８ライブラリーを合成し、上記に記載されるカスパーゼアッセイを用いてスクリーンした。ＴＰＩ１３２８ライブラリーの各混合物に対して、３〜４位置を規定し、そして残りの位置を、全２０の必須アミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＴｙｒが挙げられる）を用いて無作為配列化した。位置４を、Ａｌａ、ＬｙｓまたはＡｌａ、ＬｙｓおよびＴｈｒの混合物（この混合物は、「３Ｘ」または「Ａ、Ｋ、Ｔ」といわれる）を用いて規定した。
スクリーンされた各種のＴＰＩ１３２８サブライブラリー、および各混合物の存在下および非存在下において、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ加水分解のＶｍａｘの割合について得た値を、図１にプロットする。図１および表ＩＩＩにおいて、「Ｘ」は、全２０の必須アミノ酸の混在を表し、そして「Ｏ」は、規定位置の場所を表す（規定位置の同一アミノ酸のアイデンティティーがＸ軸にプロットされている）。１．７以上の割合を有する候補を、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３抑制解除剤である場合、同定した。ＴＰＩ１３２８ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３抑制解除剤のリストを、表ＩＩＩに提供する。
Figure 2005510569
 （実施例ＩＩ：ＴＰＩ１３３２およびＴＰＩ１３５２の個々のテトラペプチドライブラリーからのＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３を抑制解除し得る、ＴＰＩ１３３２およびＴＰＩ１３５２テトラペプチドライブラリーからの因子の同定を示す。
ＴＰＩ１３３２テトラペプチドライブラリーおよびＴＰＩ１３５２テトラペプチドライブラリーを、トリプトファン上のホルミル保護基を異なる手順により除去したことを除いて、同様に合成した。ＴＰＩ１３３２ライブラリーに使用された脱保護工程は、スクリーンで使用された候補化合物に存在するいくつかのトリプトファン残基が、ホルミル保護基を保持している可能性を完全に残さなかった。ＴＰＩ１３５２ライブラリーに対して使用された脱保護化学的は、実質的には完全であったが、ライブラリーにおける種類のサブセットに対して、重合体構造の形成という結果となった。
ＴＰＩ１３３２およびＴＰＩ１３５２ライブラリーからの候補を、実施例Ｉに記載される抑制解除アッセイを用いてスクリーンした。ＴＰＩ１３３２ライブラリーおよびＴＰＩ１３５２ライブラリーの各種の存在下および非存在下において、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ加水分解に対するＶｍａｘの割合を決定し、そして、２．４以上の値を持つものは、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定した。
ＴＰＩ１３３２テトラペプチドライブラリーおよびＴＰＩ１３５２テトラペプチドライブラリーから同定されたＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストを、表ＩＶに提供する。双方のライブラリーで同定された因子は、「１３３２／１３５２」として示す。
Figure 2005510569
 （実施例ＩＩＩ：ＴＰＩ７９２ライブラリーからのＩＡＰ阻害カスパーゼの個々のペプチド抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３を抑制解除し得るＴＰＩ７９２ライブラリーからの因子の同定を示す。
ＴＰＩ７９２ライブラリーは、テトラペプチド骨格に基づく。ＴＰＩ７９２ライブラリーの種類を、実施例Ｉに記載される抑制解除アッセイでスクリーンした。ＴＰＩ７９２ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストを、表Ｖに提供する。試験されたＴＰＩ７９２コアペプチドに対する構造を、図２０に示す。
Figure 2005510569
 ＴＰＩ７９２ライブラリーから同定された因子の用量応答を、因子の各種の濃度を用いて、抑制解除アッセイを繰り返すことにより決定した。４つの濃度を選択した：０．４マイクログラム／ミリリットル、２マイクログラム／ミリリットル、１０マイクログラム／ミリリットルおよび５０マイクログラム／ミリリットル。このデータから、抑制解除アッセイ（ＬＣ）において、２以上の割合有する最も低い濃度を決定し、表Ｖに示した。ＴＰＩ７９２ライブラリーから決定された最も低いＬＣ値は、ＴＰＩ７９２−３３に対して０．４マイクログラム／ミリリットルであった。
（実施例ＩＶ：ＴＰＩ１３１３ライブラリーからのＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３を抑制阻害し得るＴＰＩ１３１３ライブラリーからの因子の同定を示す。
ＴＰＩ１３１３ライブラリーは、テトラペプチド骨格に基づく。ＴＰＩ１３１３ライブラリーの種類（図２にリストし、そして図３に示す）を、実施例Ｉに記載される抑制解除アッセイでスクリーンした。ＴＰＩ１３１３ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３抑制解除剤のリストを、表ＶＩに提供する。
Figure 2005510569
 ＴＰＩ１３１３ライブラリーから同定された因子の用量応答を、因子の各種の濃度を用いる抑制解除アッセイを繰り返すことにより決定した。４つの濃度を選択した：０．４マイクログラム／ミリリットル、２マイクログラム／ミリリットル、１０マイクログラム／ミリリットルおよび５０マイクログラム／ミリリットル。このデータから、みかけのＩＣ５０を決定した。ＴＰＩ１３１３ライブラリーから決定された最も低いＩＣ５０値は、ＴＰＩ１３１３−７に対して、３．９マイクログラム／ミリリットル〜６．３マイクログラム／ミリリットルの範囲である。
（実施例Ｖ：ＴＰＩ１３２５ライブラリーからのＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３を抑制解除し得るＴＰＩ１３２５ライブラリーからの因子の同定を示す。
ＴＰＩ１３２５ライブラリーを、実施例Ｉに記載される抑制解除アッセイでスクリーンした。アッセイでアリコートされた各種に対して、１位置を固定し（例えば、単一の公知アミノ酸Ｒ基を有する）、そして３つの位置を無作為配列化した。従って、ＴＰＩ１３２５ライブラリーから同定された各「混合物」は、化合物の混合物（Ｘ１およびＸ２は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＴｙｒから選択され、Ｘ３はＡｌａ、ＬｙｓおよびＴｈｒの任意の一つを含む）を表す。
ＴＰＩ１３２５ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３抑制解除剤のリストを、表ＶＩＩに提供する。
Figure 2005510569
 ＴＰＩ１３２５ライブラリーから同定された因子の用量応答を、因子の各種の濃度を用いる抑制解除アッセイを繰り返すことにより決定した。４つの濃度を選択した：０．４マイクログラム／ミリリットル、２マイクログラム／ミリリットル、１０マイクログラム／ミリリットルおよび５０マイクログラム／ミリリットル。このデータから、みかけのＩＣ５０を決定した。ＴＰＩ１３２５ライブラリーから決定された最も低いＩＣ５０値は、ＴＰＩ１３２５−１５に対して、１２マイクログラム／ミリリットルであった。
（実施例ＶＩ：ＴＰＩ９１４ライブラリー、ＴＰＩ９２７ライブラリー、ＴＰＩ７５９ライブラリーおよびＴＰＩ８８２ライブラリーからのＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３を抑制解除し得るライブラリーに基づく非ペプチドからの因子の同定を示す。
ＴＰＩ９１４ライブラリー、ＴＰＩ９２７ライブラリー、ＴＰＩ７５９ライブラリーおよびＴＰＩ８８２ライブラリーを、実施例Ｉに記載される抑制解除アッセイと組み合せて、ポジショナルスキャニング（米国特許第５，５５６，７６２号に記載されるように）を用いてスクリーンした。
分析は、少なくとも一つの位置が規定されたコンビナトリアルライブラリーを用いて開始した。ヒットを、２以上の混合物／ＸＩＡＰ割合を産生する混合物と同定した。第１ライブラリーの分析後、全ての位置が規定された別個ライブラリーが調製されるまで、増加する規定のライブラリーをスクリーンした。次いで、この規定されたライブラリーからのヒットを、以下にリストされたＩＣ５０値を生じた用量応答について、チェックした。
ＴＰＩ９１４Ｎ−アシルトリアミンライブラリーは、１２５，０００種の全変化に対して、位置Ｒ１において５０アミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２において５０アミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３において５０酸誘導体を含有した。Ｒ位置の１つにおいて規定された官能基を有し、抑制解除アッセイにおいて２５マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、ＴＰＩ９１４ライブラリーのポジショナルスキャニングにより約１．８以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有すると同定された混合物を同定し、これを図４に示す。抑制解除アッセイにおいて６．２５マイクログラム／ミリリットルまたは１２．５マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、約１．８以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有するコントロール因子を同定し、これを図５に示す。
ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素ライブラリーは、８９，８５６種の全変化に対して、位置Ｒ１において４８アミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２において４８アミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３において３９酸誘導体を含有した。Ｒ位置の１つにおいて規定された官能基を有し、抑制解除アッセイにおいて４マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、ＴＰＩ９２７ライブラリーのポジショナルスキャニングにより約１．８以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有すると同定された混合物を同定し、これを図６に示す。抑制解除アッセイにおいて２５マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、約１．８以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有するコントロール因子を同定し、これを図９に示す。
ＴＰＩ７５９ Ｎ−ベンジル−１、４、５−ｔｒｉｓｕｓｂｓｔｉｔｕｔｅｄ−２、３−ジケトピペラジンライブラリーは、３１，３２０種の全変化に対して、位置Ｒ１において２９アミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２において２７アミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３において４０酸誘導体を含有した。Ｒ位置の１つにおいて規定された官能基を有し、抑制解除アッセイにおいて２５マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、ＴＰＩ７５９ライブラリーのポジショナルスキャニングにより約２．０以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有する（または、Ｒ３が固定されたサブライブラリーの場合、１．９以上）と同定された混合物を同定し、これを図８に示す。
ＴＰＩ８８２ Ｃ−６−アシルアミノバイサイクリックグアニジンライブラリーは、７２，２８３種の全変化に対して、位置Ｒ１において４３アミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２において４１アミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３において４１酸誘導体を含有した。Ｒ位置の１つにおいて規定された官能基を有し、抑制解除アッセイにおいて５マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、ＴＰＩ８８２ライブラリーのポジショナルスキャニングにより約２．０以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有すると同定された混合物を同定し、これを図７に示す。抑制解除アッセイにおいて８マイクログラム／ミリリットルで存在する場合、約２．０以上のペプチド／ＸＩＡＰ割合を有するコントロール因子を同定し、これを図１０に示す。
（実施例ＶＩＩ：ＳＭＡＣ競合アッセイ）
本実施例は、ＩＡＰに対するＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤、または機能的フラグメントのアフィニティー結合を決定するために役立つアッセイを記載する。
偏光に基づいた結合アッセイを、ローダミン標識ＳＭＡＣ（ローダミン−ＳＭＡＣ）とＸＩＡＰフラグメントＢＩＲ２またはＸＩＡＰフラグメントＢＩＲ３ＲＩＮＧとの間の結合を検出するために使用した。遊離（非結合性）ローダミン−ＳＭＡＣと比較して、結合性ローダミン−ＳＭＡＣに対して偏光の減少として検出されるＸＩＡＰまたはその機能性フラグメントと関連する場合、このアッセイは、ローダミン−ＳＭＡＣに対して生じる移動性の減少に基づく。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＢＩＲ２融合タンパク質（ＧＳＴ−ＢＩＲ２）またはＢＩＲ３ＲＩＮＧに対するローダミン−ＳＭＡＣの結合アフィニティーを、以下のように決定した。１ミリリットル反応カクテルを、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、０．０１％ ウシガンマグロブリン、および２０ｎＭ ローダミン−ＳＭＡＣを含んで作成した。反応カクテルから取られた０．１ｍｌのアリコートを、９６ウェルアッセイプレートにおける８ウェルのカラムへ移しかえた。このような１２のカラムを、０〜４９５ｎＭの範囲におけるＧＳＴーＢＩＲ２の異なる濃度で、各々設定した。各ウェルにおけるローダミンの偏光を、ＬＪＬ Ａｎａｌｙｓｔ ＨＴ（５３０nmでの励起および５８０nmでの放射）で読み取った。データを、同一濃度のＧＳＴ−ＢＩＲ２を有する８つのサンプル間で平均し、次いで、ミリ極性 対 ＧＳＴ−ＢＩＲ２濃度の関数としてプロットした。同一手順は、ＢＩＲ３ＲＩＮＧについて行った。２０ｎＭでのローダミン−ＳＭＡＣは、１００ｎＭのＧＳＴ−ＢＩＲ２に対するＫｄを有し、８０ｎＭのＢＩＲ３ＲＩＮＧに対するＫｄを有した。
ＸＩＡＰへの結合に対してＳＭＡＣと競合し得る因子を同定するために、偏光アッセイを使用した。
非標識ＳＭＡＣを、２０ｎＭ ローダミン−ＳＭＡＣおよび２２５ｎＭ ＧＳＴ−ＢＩＲ２を含む溶液に対して滴定した。非標識ＳＭＡＣを、４μＭの増分内で、０〜２０μＭの範囲で適定した。８〜０．１ｍｌサンプルを、各濃度の非標識ＳＭＡＣに対して再度計測し、標準誤差を決定した。データを、ミリ極性 対 ＳＭＡＣおよび決定されたＩＣ５０値の関数としてプロットした。ＳＭＡＣ適定のＩＣ５０値は、１２μＭであった。同一手順を、ローダミン−ＳＭＡＣ含有溶液およびＢＩＲ３ＲＩＮＧ含有溶液に対する非標識ＳＭＡＣの滴定について行った。この場合、ＳＭＡＣのＩＣ５０値は、８μＭであった。
ライブラリーからの候補因子は、２０ｎＭ ローダミン−ＳＭＡＣおよび２２５ｎＭ ＧＳＴ−Ｂｉｒ２を含む溶液へ添加される。蛍光偏光は、各サンプルで決定され、そして２０ｎＭ ローダミン−ＳＭＡＣおよび２２５ｎＭ ＧＳＴ−Ｂｉｒ２を含むコントロール反応と比較して偏光の減少を示す候補は、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定される。コントロールとして、蛍光偏光はまた、ＧＳＴ−ＢＩＲ２の存在下でライブラリーサンプルに対して決定される。
ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤として同定された因子を、ローダミン−ＳＭＡＣおよびＧＳＴ−ＢＩＲ２溶液に対して滴定する。偏光を、上記に記載される因子の各濃度で決定する。データを、上記に記載されるように、ミリ極性 対 ＳＭＡＣおよび決定された結合定数の関数としてプロットされる。
（実施例ＶＩＩＩ：ＴＰＩ９１４ライブラリー、ＴＰＩ９２７ライブラリー、ＴＰＩ７５９ライブラリーおよびＴＰＩ８８２ライブラリーからの個々の化合物のスクリーニング）
本実施例は、ＴＰＩ９１４ライブラリー、ＴＰＩ９２７ライブラリー、ＴＰＩ７５９ライブラリーおよびＴＰＩ８８２ライブラリーに由来する個々の因子のスクリーニングを記載し、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する個々の因子の同定を記載する。
個々の因子を、実施例ＶＩで同定された活性因子に基づいて合成した。図５に示されたＴＰＩ９１４抑制解除剤に基づく選択因子を合成し、そして、図２１で因子ＴＰＩ１３４９−１〜ＴＰＩ１３４９−３４として同定する。図９に示されたＴＰＩ９２７抑制解除剤に基づく選択因子を合成し、そして、図２２で因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５として同定する。図８に示されたＴＰＩ７５９抑制解除剤に基づく選択因子を合成し、そして、図２３で因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６として同定する。図１０に示されたＴＰＩ８８２抑制解除剤に基づく選択因子を合成し、そして、図２４で因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８として同定する。
ＳＭＡＣ競合アッセイを、図２１−２４に示される因子を評価するために使用した。各化合物を、実施例ＶＩＩに記載される条件下で、ローダミン標識ＳＭＡＣテトラペプチド、ＡＶＰＩ（配列番号４）、および全長ＸＩＡＰの溶液に対して滴定した。偏光を、各濃度のＩＡＰアンタゴニストで決定し、データを、ミリ極性 対 化合物濃度の関数としてプロットした。プロットから決定された１．８以上の割合を有する、各因子の最も低い濃度は、図２１−２４に示される表の最後のカラムに示される（「最も低い」μｇ／ｍｌ）。
（実施例ＩＸ：インビトロにおけるＩＡＰ阻害カスパーゼのペプチジル化合物復旧カスパーゼ活性および非ペプチジル化合物復旧カスパーゼ活性）
本実施例は、インビトロにおけるＩＡＰ阻害カスパーゼのペプチジル抑制解除剤および非ペプチジル抑制解除剤の能力を決定するためのアッセイを示す。本実施例はまた、インビトロにおけるＩＡＰ阻害カスパーゼの復旧カスパーゼ活性において能力を有するペプチジル化合物および非ペプチジル化合物を同定する。
ＳＭＡＣ競合アッセイを、ＴＰＩ７２９ライブラリーのスクリーンから同定されたペプチジルＩＡＰアンタゴニスト、ならびにＴＰＩ１３９１ライブラリーおよびＴＰＩ１３９６ライブラリーのスクリーンから同定された非ペプチジルＩＡＰアンタゴニストを評価するために使用した。各化合物を、実施例ＶＩＩに記載される条件下で、ローダミン標識ＳＭＡＣテトラペプチド、ＡＶＰＩ（配列番号４）、および全長ＸＩＡＰの溶液に対して滴定した。偏光を、各濃度のＩＡＰアンタゴニストで決定し、データを、ミリ極性 対 化合物濃度の関数としてプロットし、そして、ＥＣ５０結合定数をプロットから決定した。非標識ＳＭＡＣテトラペプチドをコントロールとして、ＡＶＰＩ（配列番号４）もまたアッセイした。
表ＶＩＩＩは、ＴＰＩ７９２ライブラリー、ＴＰＩ１３９１ライブラリーおよびＴＰＩ１３９６ライブラリーから同定されたＩＡＰアンタゴニストに対する、ＳＭＡＣ競合アッセイの結果を要約する。最大速度（Ｖｍａｘ）の５０％までカスパーゼ−３活性を復旧するのに必要な化合物量を計測することにより、ＥＣ５０を決定した。最も効力あるテトラマーペプチドの２つは、インビトロで酵素抑制解除活性（各々、ＳＭＡＣペプチドの２．５倍〜５．２倍）を表したＴＰＩ７９２−２３およびＴＰＩ７９２−３５であった。最も効力あるジケトピペラジンに基づく化合物として、ＴＰＩ１３９１−２１、ＴＰＩ１３９１−２８およびＴＰＩ１３９１−３４（ＳＭＡＣペプチド活性の３．４倍〜４．８倍以上の能力を表す）が挙げられる。最も効力あるフェニル尿素化合物としては、ＴＰＩ１３９６−２２、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９６−２８（ＳＭＡＣペプチド活性の３．８倍〜５．２倍以上の潜在能力を表す）が挙げられる。
Figure 2005510569
 これらの結果は、ペプチジル化合物ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５；ジケトピペラジンに基づく化合物ＴＰＩ１３９１−２１、ＴＰＩ１３９１−２８およびＴＰＩ１３９１−３４；およびフェニル尿素化合物ＴＰＩ１３９６−２２、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９６−２８がインビトロにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除したことを示し、そして、ＳＭＡＣ ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号４）以上の能力も有した。
（実施例Ｘ：ペプチジル化合物ＴＰＩ７９２−３３キラー腫瘍細胞およびＴＰＩ７９２−３５キラー腫瘍細胞）
本実施例は、細胞培養において、ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の能力を決定するためのアッセイを示す。本実施例はまた、ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５が、培養において、腫瘍細胞の成育能力を減らすことを示す。
ＴＰＩ７９２−３３化合物およびＴＰＩ７９２−３５化合物を、腫瘍細胞生育能力への効果を決定するためにアッセイした。図１２に示されるように、ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５は、第３位置でアミノ酸配列に相違がある非天然アミノ酸から構成されるテトラペプチドである。ＴＰＩ７９２−３３化合物およびＴＰＩ７９２−３５化合物の双方は、位置１（Ｎ末端）、位置２および位置４各々で、Ｌ−３−（２−チエニル）−アラニル、Ｌ−（２−ナフチル）−アラニル、およびＬ−（ε−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リジン部分を有するが、ＴＰＩ７９２−３３がＬ−ｐ−クロロ−フェニルアラニルを有し、そしてＴＰＩ７９２−３５がＤ−（ε−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リジン部分を有する位置３は異なる。
前立腺癌細胞株由来の細胞、ＡＬＶＡ３１は、他のＩＡＰファミリータンパク質に加えて、ＸＩＡＰを発現する。ＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除およびＡＬＶＡ３１細胞の成育能力に対する、ＴＰＩ７９２−３３またはＴＰＩ７９２−３５のインビボの効果を、単独でか、細胞障害性抗癌剤ＶＰ−１６（エトポシド）との組み合せのいずれかにおいて、以下のように決定した。ＡＬＶＡ３１前立腺癌細胞を、２．５％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含む１００μＬ ＲＰＭＩを９６ウェルプレートに播種した（１０４細胞／ウェル）。２４時間後、ＩＡＰアンタゴニストＴＰＩ７９２−３３、ＴＰＩ７９２−３５またはＳＭＡＣ ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号４）を、ＶＰ−１６（１００μＭ最終濃度）を含んでかまたは含まずに最終濃度が４０μＭになるように添加した。さらに２４時間インキュベーションした後、細胞生育能力を、ＸＴＴ染色退縮（ｄｙｅ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）およびトリパンブルー染色除外アッセイにより計測した。
抗癌剤ＶＰ−１６（エトポシド）は、ＡＬＶＡ３１細胞に単独で投与された場合、ＸＴＴ染色退縮アッセイ（図１３）およびトリパンブルー染色除外アッセイにおいて、細胞の成育能力に決定的な影響を与えなかった。ＳＭＡＣ ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号４）はまた、ＡＬＶＡ３１細胞に単独で投与された場合、細胞生育能力に影響を与えなかった。対照的に、ＴＰＩ７９２−３３ペプチドおよびＴＰＩ７９２−３５ペプチドは、これらの前立腺癌細胞の成育能力をほぼ半分に減らした。さらに、ＶＰ−１６とこれらのペプチドとの組み合せは、ＶＰ−１６単独と比較して、より効果的に腫瘍細胞を障害する結果となった。比較として、ＳＭＡＣペプチドを不活性化すると、同様の培養条件下で、生存腫瘍細胞の相対的な数を十分には減らし得なかった。
これらの結果は、ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５が、ＳＭＡＣ（配列番号４）からの野生型ＡＶＰＩペプチドと比較して、顕著に改善した細胞活性を表すことを示す。さらに、これらの結果は、ＴＰＩ７２９−３３およびＴＰＩ７９２−３５が、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除することにより、腫瘍細胞におけるアポトーシスを増加する効果を有するということを表す。これらの結果はまた、ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５が、抗癌剤ＶＰ−１６に対して前立腺癌を感作するということを示す。
（実施例ＸＩ：非ペプチジル化合物ＴＰＩ３９６−３４キラー腫瘍細胞およびＴＰＩ１３９６−２８キラー腫瘍細胞）
本実施例は、ＴＰＩ１３９６ライブラリーから同定されたフェニル尿素化合物およびＴＰＩ１３９１ライブラリーから同定されたジケトピペラジン化合物が、培養腫瘍細胞の成育活性を減らすことを示す。本実施例はさらに、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８に対する細胞キラー活性が、腫瘍細胞に対して特異的であることを示す。
以下のアッセイを、培養腫瘍細胞株のアポトーシスを誘導させるための、ＴＰＩ１３９６ライブラリーおよびＴＰＩ１３９１ライブラリーからの個々の化合物の能力を試験するために使用した。表ＩＸにリストされた各々の化合物を、２０時間、各種の濃度で、２．５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩにＪｕｒｋａｔ白血病細胞（６．２５×１０５細胞／ｍＬ）を個々に添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして、ＦＩＴＣ結合Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ抗体とヨウ化プロピジウム（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）とで染色した。細胞を、遮光して室温で２０分間インキュベーションし、そして、蛍光をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により計測した。Ａｎｎｅｘｉｎに対してポジティブな染色細胞は、生育不可能と考えた。
表ＩＸに示すように、これらの化合物は、濃度依存的な様式で細胞死を誘導し得た。ＳＭＡＣは、５０μＭ存在する場合、約１６％だけ細胞生育能力を減らし得たが、いくつかのＴＰＩ１３９６−３４化合物およびＴＰＩ１３９１−２８化合物は、約８５〜９４％まで細胞生育能力を減らす。従って、ＴＰＩ１３９６−３４ライブラリーおよびＴＰＩ１３９１−２８ライブラリーから同定された化合物は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するＳＭＡＣの約５倍〜６倍以上の効力であった。
Figure 2005510569
 ＴＰＩ１３９６−３４化合物およびＴＰＩ１３９１−２８化合物を、以下に示されたようにさらに試験した。図１４（パネルＢ）は、フェニル尿素ＴＰＩ１３９６−３４およびジケトピペラジンＴＰＩ１３９１−２８の構造を示す。これらの両化合物は、化合物が０〜２０μＭの範囲で添加されたことを除いて、上記に記載されるアッセイを用いて、濃度依存的な様式で、培養腫瘍細胞株のアポトーシスを誘導することが示された。
図１５に示すように、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８は、約６．５μＭのＥＣ５０値で、１日の曝露後、Ｊｕｒｋａｔ白血球細胞を傷害した。ＸＩＡＰとの結合を妨げるＲ基において異なる置換基を有するが、同一のコア薬物団構造を用いるコントロール化合物は、アッセイ条件下では、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞の生育能力を十分に減らさなかった。
ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８によって傷害する細胞と、各々のコントロール化合物との比較は、図１６に示す。５μＭ〜８μＭのＴＰＩ１３９６−３４を用いるＪｕｒｋａｔ白血病細胞の１日処理は、約７５％および約８５％の細胞を各々傷害した。５μＭ〜８μＭのＴＰＩ１３９１−２８を用いるＪｕｒｋａｔ白血病細胞の１日処理は、約４５％および約８０％の細胞を各々傷害した。対照的に、コントロール化合物は、処理されていない細胞と比較して、これらの白血病細胞の成育能力に対して有意な効果を有さず、これは、これらの化合物の細胞傷害性活性が特異的であることを表している。同一のアッセイの条件下で、５μＭ ＳＭＡＣ ＡＶＰＩテトラペプチドまたは８μＭ ＳＭＡＣ ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号４）は、これらの白血病細胞の成育能力に十分な効果を有さず、これは、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８が、ＳＭＡＣ以上の大きな効力をさらに有したことを確証している。
正常骨髄細胞 対 Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞におけるＴＰＩ１３９６−３４の効果の比較を、以下のようにして実施した。ＴＰＩ１３９６−３４（５μＭ）を、２０時間２．５％ＦＢＳおよびＲＰＭＩ中で、Ｊｕｒｋａｔ細胞または正常骨髄単核細胞（６．２５×１０５／ｍＬ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合性Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ抗体およびヨウ化プロピジウムを用いて染色し、そして、上記に記載されるように、フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。
図１７に示すように、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８は、白血病の激しい傷害性が認められたのと同じ培養条件下で、正常骨髄細胞に対しほとんど毒性を生じなかった。これらの結果は、ＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８が正常細胞とを比較して選択的に腫瘍細胞を死滅させることを示す。
（実施例ＸＩＩ：ＸＩＡＰにより媒介されたＴＰＩ１３９６−３４による腫瘍細胞の傷害性）
本実施例は、ＴＰＩ１３９６−３４により傷害する腫瘍細胞上の野生型ＸＩＡＰおよび変異型ＸＩＡＰの過剰発現の効果を示す。
Ｎｅｏコントロールプラスミド（Ｕ９３７−Ｎｅｏ細胞）またはＸＩＡＰをコードするプラスミド（Ｕ９３７−ＸＩＡＰ細胞）のいずれかを用いて安定的にトランスフェクトしたＵ９３７白血病細胞（６．２５×１０５細胞／ｍＬ）を、２０時間、ＲＰＭＩおよび２．５％ＦＢＳ中の５μＭ ＴＰＩ１３９６−３４または８μＭ ＴＰＩ１３９６−３４を用いて処理した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合性Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ抗体およびヨウ化プロピジウムで染色し、そして、実施例Ｘに記載されるようにフローサイトメトリーにより蛍光を測定した。
図１８に示すように、ＸＩＡＰの過剰発現は、ＴＰＩ１３９６−３４に対する耐性をＵ９３７細胞に与えた。Ｕ９３７−Ｎｅｏ細胞およびＵ９３７−ＸＩＡＰ細胞に対するＴＰＩ１３９６−３４の効果の比較は、ＸＩＡＰの過剰発現が、この因子によるアポトーシス誘導に対する耐性と相互関係があったことを示した。ＸＩＡＰを過剰発現する細胞の場合の、ＴＰＩ１３９６−３４のアポトーシス効果に対する腫瘍細胞の増加した耐性は、ＸＩＡＰへ結合することにより、ＴＰＩ１３９６−３４がアポトーシスを誘導することを示す。
ベクターをトランスフェクトしたコントロール細胞と比較して、Ｕ９３７−ＸＩＡＰ細胞におけるＸＩＡＰ過剰発現を、免疫ブロット法により確認した（右上パネル）。これらの細胞は、ＸＩＡＰを内因性に発現することが公知であるので、Ｋ５６２細胞におけるＸＩＡＰの発現をコントロールとして挙げた。等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＩＳＣ ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓからの４−２０％勾配ゲル、Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ、ＵＴ）に供し、その後、ニトロセルロース膜へ移した。膜を、モノクローナルマウス抗ヒトＸＩＡＰ（０．２５μｇ／ｍＬ）（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）またはモノクローナルマウス抗βアクチン（１：３０００ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を用いてプローブした。二次抗体は、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合性ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）からなった。検出は、増強させた化学発光（ＥＣＬ）方法により実施した。
さらに、全長ＸＩＡＰを用いてトランスフェクトした細胞に対して、類似のアッセイを、各種のＸＩＡＰ変異体を過剰発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞を用いて実施した。Ｈｅｌａ細胞を、全長をコードするプラスミド、野生型ＸＩＡＰ 対 ＢＩＲ２（カスパーゼ−３／７抑制）ドメイン、ＢＩＲ３（カスパーゼ−９抑制）ドメインのみを有する欠失変異体をコードするプラスミド、またはカスパーゼに結合しないように推定ＳＭＡＣ結合ポケットのＢＩＲ２およびＢＩＲ３においての両方に変異体をコードするプラスミドを用いて、一過性にトランスフェクトした。この変異体を、アラニンを含むよう位置１４８、２１９、２２３、３１４および３２３を修飾するために、部位特異的変異誘発により産出した。Ｈｅｌａ細胞をまた、Ｂｃｌ−ＸＬ（ミトコンドリアからのシトクロームＣ放出を抑制するカスパーゼ上流をオペレートする抗アポトーシスタンパク質）をコードするプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。Ｈｅｌａ細胞（２．５×１０５）を、５％ＦＢＳの２ｍＬ ＤＭＥＭ Ｈ２１中の６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞をプラスミドを用いてトランスフェクト（Ｇｅｎｅ Ｐｏｒｔｅｒ）した。トランスフェクション後４８時間で、細胞を、２０時間、５μＭ ＴＰＩ１３９６−３４で処理した。次いで、浮遊細胞および接着細胞の両方を、培養から回収し、洗浄し、そしてアポトーシスをフローサイトメトリーを用いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色により決定した。
図１９に示すように、ＴＰＩ１３９６−３４は、コントロールベクターを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞において、アポトーシスを誘導した。ＴＰＩ１３９６−３４により誘導されたアポトーシスは、過剰発現するＢｃｌ−ＸＬによって、ブロックされなかった（Ｂｃｌ−ＸＬが、ＸＩＡＰ上流にオペレートするという事実と一致する）。対照的に、全長ＸＩＡＰを過剰発現するＨｅＬａ細胞は、ＴＰＩ１３９６−３４から保護された。さらに、ＸＩＡＰのＳＭＡＣ結合ポケットが変異した、ＸＩＡＰ変異体を発現する細胞は、化学化合物から保護されておらず、ＢＩＲ２ドメインのみを含む変異体を発現する細胞もそうであった。ＢＩＲ３ドメインを発現する細胞を、ＴＰＩ−１３９６−３４のアポトーシス活性から保護した。まとめると、これらの結果は、ＴＰＩ１３９６−３４が、ＸＩＡＰを標的化することにより、培養腫瘍細胞株のアポトーシスを誘導することを表す。
（実施例ＸＩＩＩ：ＸＩＡＰ以外でＩＡＰを抑制する化合物の同定）
本実施例は、他のＩＡＰｓでのＸＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤の効果を決定するために使用され得るアッセイを記載する。
前立腺癌の免疫組織学的分析は、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２が、これらの腫瘍で共通に過剰発現されることを示す。ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２の両方は、カスパーゼ阻害剤（Ｒｏｙ、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６９１４−６９２５（１９９７））であり、そして、それらは各々ＳＭＡＣへ結合する（Ｄｕら、Ｃｅｌｌ １０２：３３−４２（２０００）；Ｃｈａｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４０６：８５５−８６２（２０００））。さらに、分子モデル試験は、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２のいくつかのＢＩＲｓが、ＸＩＡＰに類似の大きな構造を有する、ＳＭＡＣへ結合する可能性があるということを示す。これらの観察は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤が、これらの他のＩＡＰによって阻害されるカスパーゼに対して、活性を有し得るということを表す。
ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤が、これらの他のＩＡＰにより阻害されるカスパーゼに対する活性を有するということを確認するために、以下のアッセイが実施される。ＸＩＡＰにおけるＢＩＲへのを結合について、ＳＭＡＣペプチドと化合物との競合が、アッセイされる。これを実行するために、この化合物は、ＳＭＡＣ競合アッセイ（ＦＩＴＣ結合性ＳＭＡＣテトラペプチドＡＶＰＩ（配列番号４）またはＦＩＴＣ結合性ＨｔｒＡ２テトラペプチドＡＶＰＳ（配列番号６）は、ＸＩＡＰからのＢＩＲに結合する）で試験する。全長ＸＩＡＰの発現というよりむしろ、ＢＩＲ２ドメインまたはＢＩＲ３ドメインのみを含むＸＩＡＰフラグメントを、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７７８７−７７９０（１９９８）およびＤｅｖｅｒａｕｘら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２２１５−２２２３（１９９８）に記載されるように、発現する。これらのアッセイは、その化合物がＳＭＡＣ模倣物として機能するかどうかを決定し、そして、その化合物がＢＩＲ２（カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７を抑制するドメイン）を標的とするか、ＢＩＲ３（カスパーゼ−９を抑制するドメイン）を標的とするか、またはその両方を標的とするか、またはこれらのドメインのいずれも標的としないかどうかもまた決定する。
さらに、酵素抑制アッセイを、化合物によって標的化されたＸＩＡＰにおけるドメインの位置を示すために、ＢＩＲ２ドメインまたはＢＩＲ３ドメインを用いて実施する。組換え精製ＢＩＲ２はカスパーゼ−３を混合し、そして、組換え精製ＢＩＲ３をカスパーゼ−９と混合し、次いで、これらのプロテアーゼ活性は、この化合物が、ＸＩＡＰタンパク質において、ＢＩＲ２を標的とするか、ＢＩＲ３を標的とするか、その両方を標的とするか、またはこれらのドメインのいずれも標的としないかどうかを示すための努力において、化合物の存在下および非存在下で、特定の蛍光基質ペプチド（カスパーゼ−３に対するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ 対 カスパーゼ−９に対するＡｃ−ＬＥＨＤ−ＡＦＣ）に対して計測する。これらの結果は、ＸＩＡＰの公開された構造、ＢＩＲ２（Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：８１８−８２１（１９９９）およびＲｉｅｄｌら、Ｃｅｌｌ １０４：７９１−８００（２００１））、ならびにＢＩＲ３（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：１００４−１００８（２０００））の分子モデルを用いて、化合物の構造に基づいた最適化のために使用し得る。
ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２に関係して、類似の酵素抑制解除アッセイおよびＳＭＡＣ競合アッセイを、全長ｃＩＡＰ１および全長ｃＩＡＰ２、ならびに各々のＢＩＲドメインを含むフラグメントを用いて実施される。従って、この化合物は、ＩＡＰファミリーのこれらの他のメンバーを交差抑制するかどうかを決定する。
次いで、化合物が、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２またはこれらのタンパク質の両方を抑制する場合、この化合物の能力は、医薬品および無作為配列の化学物質を通じて改善され得る。アッセイは、細胞ベースのアッセイにおいて、化合物の活性を用いたインビトロｃＩＡＰ１／ｃＩＡＰ２活性の残留 対 欠失を対照して実施され得る。この型の構造活性関連性試験は、最適な化合物が、ＸＩＡＰ 対 いくつかのＩＡＰに対する汎活性に対して、選択的な特異性を有するかどうかを表す。これらの異なるプロフィール（選択活性 対 広範囲スペクトル活性）を有する化合物は、毒性結果との関係（有効性と安全性の間で所望されたバランスを有する化合物を得るため）を対照される。
本出願を通して、各種の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、それらの全体が、本発明の属する当該分野をより十分に記載するために、本出願において参考として援用される。
本発明は、上記に提供される実施例を参照して記載されているが、各種の改変が本発明の意図から逸脱することなくなされ得る、ということを理解されるべきである。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみに限定される。
図１は、ＴＰＩ１３２８ライブラリー（ヘキサペプチドの混合物から構成される）の各種の存在下および非存在下における、アセチル−ＤＥＶＤ−７−アミノ−４−アミノ−トリフルオロメチル−クマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ）の加水分解についてのＶｍａｘ（ここで、Ｖｍａｘは、ＲＦＵ／分と同等である）の比に関して得られた値のプロットを示す。 図２は、ＴＰＩ１３１３ライブラリーの個々のテトラペプチドおよび各ペプチド種の存在下および非存在下におけるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比を列挙する表を示す。比＝（ペプチド、カスパーゼ ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ／カスパーゼ ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）。 図３ａは、ＴＰＩ１３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種に関する構造を示す。 図３ｂは、ＴＰＩ１３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種に関する構造を示す。 図３ｃは、ＴＰＩ１３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種に関する構造を示す。 図３ｄは、ＴＰＩ１３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種に関する構造を示す。 図３ｅは、ＴＰＩ１３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種に関する構造を示す。 図３ｆは、ＴＰＩ１３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種に関する構造を示す。 図４は、ＴＰＩ９１４ Ｎ−アシルトリアミンポジショナルスキャンニングコンビナトリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが見出される混合物において規定された官能基の構造を示す。各ボックスの下に列挙される最初の化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして各ボックスの下に列挙される第２の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それらが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。 図５は、ＴＰＩ９１４ Ｎ−アシルトリアミンライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが見出される個々の化合物についての構造を示す。各表の記載要項に列挙される第２の化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして列挙される第２の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。 図６は、ＴＰＩ９２７ポリフェニルウレアポジショナルスキャンニングコンビナトリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの活性剤であることが見出される混合物において規定された官能基の構造を示す。各ボックス中の化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして各ボックスの下の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。分子のコア構造が改変される構造２５、７３、８６および８８に関して、生じる改変コア構造およびＲ基が示される。 図７は、ＴＰＩ８８２ Ｃ−６−アシルアミノ二環式グアニジンライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが見出される混合物において規定された官能基の構造を示す。各ボックスにおける化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして各ボックスの下の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。 図８は、ＴＰＩ７５９Ｎ−ベンジル−１，４，５−三置換−２，３−ジケトピペラジンポジショナルスキャンニングコンビナトリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが見出される混合物において規定された官能基の構造を示す。各ボックスの下に列挙される最初の化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして各ボックスの下に列挙される第２の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。 図９は、ＴＰＩ９２７ポリフェニルウレアライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが見出される個々の化合物についての構造を示す。各ボックスにおける化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして各ボックスの下の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。 図１０は、ＴＰＩ８８２ Ｃ−６−アシルアミノ二環式グアニジンライブラリーにおけるＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが見出される個々の化合物についての構造を示す。各ボックスにおける化学名は、Ｒ基が由来する試薬に対してであり、そして各ボックスの下の化学名は、それぞれのＲ位置での官能基の名前である。各官能基は、それが由来する試薬と同じ立体化学（ｓｔｅｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を有する。 図１１は、ＴＰＩ１２３９ライブラリーに由来するＸＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定された混合物の用量応答を示す。示される値は、各混合物の存在下および非存在下でのＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比についてである。カスパーゼまたはＸＩＡＰは、各カラムの上で列挙される用量で存在した。 図１２は、Ｌ−３−（２−チエニル）−アラニル−Ｌ−（２−ナフチル）−アラニン−Ｌ−ｐ−クロロ−フェニルアラニル−Ｌ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リジン（ＴＰＩ７９２−３３；コアペプチド１６）およびＬ−３−（２−チエニル）−アラニル，Ｌ−（２−ナフチル）−アラニル−Ｄ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リシル−Ｌ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リジン（ＴＰＩ７９２−３５；コアペプチド１７）の構造を示す。 図１３は、前立腺癌細胞の生存可能性に対するＶＰ−１６（エトポシド）、ＴＰＩ７９２−３５、ＴＰＩ７９２−３３およびＳＭＡＣ ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号４）の効果を示す。 図１４Ａは、ＴＰＩ１３９６ライブラリーにおけるフェニルウレア化合物およびＴＰＩ１３９１ライブラリーにおけるジケトピペラジン化合物についての一般化構造（パネルＡ）ならびに化合物ＴＰＩ１３９１−２８、ＴＰＩ１３９１−２１、ＴＰＩ１３９６−３４、ＴＰＩ１３９６−２２、ＴＰＩ１３９６−１１、ＴＰＩ１３９６−１２についての構造（パネルＢ）を示す。 図１４Ｂは、ＴＰＩ１３９６ライブラリーにおけるフェニルウレア化合物およびＴＰＩ１３９１ライブラリーにおけるジケトピペラジン化合物についての一般化構造（パネルＡ）ならびに化合物ＴＰＩ１３９１−２８、ＴＰＩ１３９１−２１、ＴＰＩ１３９６−３４、ＴＰＩ１３９６−２２、ＴＰＩ１３９６−１１、ＴＰＩ１３９６−１２についての構造（パネルＢ）を示す。 図１５は、ＴＰＩ１３９１−２８およびＴＰＩ１３９６−３４によるＪａｒｋａｔ白血病細胞の濃度依存性殺傷を示す。 図１６は、それぞれ類似するコア薬理作用団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｓ）を有するが、異なるＲ基を有するコントロール化合物と比較して、ＴＰＩ１３９１−２８およびＴＰＩ１３９６−３４によるＪａｒｋａｔ白血病細胞の殺傷を示す。 図１７は、正常な骨髄細胞 対 Ｊａｒｋａｔ白血病細胞に対するＴＰＩ１３９６−３４およびＴＰＩ１３９１−２８の効果の比較を示す。 図１８は、ＴＰＩ１３９６−３４のアポトーシス作用性活性に対する野生型ＸＩＡＰの過剰発現の効果を示す。 図１９は、ＴＰＩ１３９６−３４のアポトーシス作用性活性に対する野生型ＸＩＡＰの過剰発現の効果を示す。 図２０は、ＴＰＩ７９２−３、ＴＰＩ７９２−９、ＴＰＩ７９２−１５、ＴＰＩ７９２−１７、ＴＰＩ７９２−１９、ＴＰＩ７９２−２２、ＴＰＩ７９２−２７、ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５についての構造を示す。 図２１Ａは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３４９−１〜ＴＰＩ１３４９−３４の構造を示す。 図２１Ｂは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３４９−１〜ＴＰＩ１３４９−３４の構造を示す。 図２１Ｃは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３４９−１〜ＴＰＩ１３４９−３４の構造を示す。 図２１Ｄは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３４９−１〜ＴＰＩ１３４９−３４の構造を示す。 図２２Ａは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｂは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｃは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｄは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｅは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｆは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｇは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｈは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｉは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｊは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２２Ｋは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９６−１〜ＴＰＩ１３９６−６５の構造を示す。 図２３Ａは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６の構造を示す。 図２３Ｂは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６の構造を示す。 図２３Ｃは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６の構造を示す。 図２３Ｄは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６の構造を示す。 図２３Ｅは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６の構造を示す。 図２３Ｆは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１３９１−１〜ＴＰＩ１３９１−３６の構造を示す。 図２４Ａは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｂは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｃは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｄは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｅは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｆは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｇは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｈは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｉは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｊは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｋは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。 図２４Ｌは、それぞれの分子量、質量およびＳＭＡＣ競合アッセイにおける１．８以上の高い比を有する各因子の最低濃度とともに、因子ＴＰＩ１４００−１〜ＴＰＩ１４００−５８の構造を示す。
【配列表】
Figure 2005510569
Figure 2005510569

Claims (26)

  1. コアペプチド５〜３９および４２〜５５からなる群から選択されるコアペプチドを含む単離された因子であり、ここで該因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する、因子。
  2. 図５中で示される構造のいずれか、図９中で示される構造のいずれか、図１０中で示される構造のいずれか、および図１４Ｂ中で示される構造のいずれかから選択されるコア構造を含む単離された因子であり、ここで、該因子は、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する、因子。
  3. 請求項１または２に記載の因子であり、ここで前記因子は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する、因子。
  4. 請求項１または２に記載の因子であり、ここで前記因子は、ＸＩＡＰ阻害カスパーゼ−３を抑制解除する、因子。
  5. 請求項１または２に記載の因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
  6. コアペプチド４〜３９および４２〜５５のうちのいずれかに示される配列を有するコアペプチドからなる群から選択される因子、およびＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２，ＴＰＩ９１４またはＴＰＩ９２７からなる群から選択されるコア構造を有する因子に結合するＩＡＰを含む複合体。
  7. 請求項６に記載の複合体であり、ここで前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、およびサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）からなる群から選択される、複合体。
  8. ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する方法であり、該方法は、ＩＡＰ阻害カスパーゼと、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するための有効量の因子を接触させる工程を包含し、該因子は、コアペプチド４〜３９および４２〜５５のうちのいずれかに示される配列を有するコアペプチドからなる群から選択されるコアモチーフ、およびＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４またはＴＰＩ９２７からなる群から選択されるコア構造を有する方法。
  9. 請求項８に記載の方法であり、ここで前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、およびサービビンからなる群から選択される、方法。
  10. 請求項８に記載の方法であり、ここで前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９からなる群から選択される、方法。
  11. 請求項８に記載の方法であり、ここで前記接触工程がインビトロで実行される、方法。
  12. 請求項８に記載の方法であり、ここで前記接触工程が細胞内で生じる、方法。
  13. 細胞内でのアポトーシスを促進する方法であり、該方法は、細胞と、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するための有効量の因子を接触させる工程を包含し、該因子は、コアペプチド４〜３９および４２〜５５のいずれかに示される配列を有するコアペプチドからなる群から選択されるコアモチーフ、およびＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４またはＴＰＩ９２７からなる群から選択されるコア構造を有する方法。
  14. 請求項１３に記載の方法であり、ここで前記細胞が、真核生物細胞である、方法。
  15. 請求項１３に記載の方法であり、ここで前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２およびサービビンからなる群から選択される、方法。
  16. 請求項１３に記載の方法であり、ここで前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９からなる群から選択される、方法。
  17. 個体における病理学的状態の重症度を減少する方法であり、病理学的に減少したアポトーシスのレベルによって特徴付けられる病理学的状態を有する個体に、ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除するための有効量の因子を投与する工程を包含し、該因子は、コアペプチド４〜３９および４２〜５５のうちのいずれかに示される配列を有するコアペプチドからなる群から選択されるコアモチーフ、およびＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４またはＴＰＩ９２７からなる群から選択されるコア構造を有する方法。
  18. 請求項１７に記載の方法であり、ここで前記病理学的状態は癌である、方法。
  19. 請求項１７に記載の方法であり、ここで前記病理学的状態が、乾癬、肥厚、自己免疫疾患および再狭窄からなる群から選択される、方法。
  20. 請求項１７に記載の方法であり、ここで前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２およびサービビンからなる群から選択される、方法。
  21. 請求項１７に記載の方法であり、ここで前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９からなる群から選択される、方法。
  22. ＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法であり、以下：
    （ａ）ＩＡＰまたはカスパーゼに結合したＩＡＰ阻害カスパーゼの標識抑制解除薬を検出する工程であり、該ＩＡＰ阻害カスパーゼの標識抑制解除薬が、コアペプチド４〜３９および４２〜５５のうちのいずれかに示されるコア配列から選択されるコアモチーフ、またはＴＰＩ７５９、ＴＰＩ８８２、ＴＰＩ９１４およびＴＰＩ９２７からなる群から選択されるコア構造を含む、工程；
    （ｂ）結合ＩＡＰまたはカスパーゼを候補因子と接触させる工程であり、該候補因子はＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し得ることが予測される、工程；および
    （ｃ）該ＩＡＰまたはカスパーゼからの該ＩＡＰ阻害カスパーゼの標識抑制解除剤の分離を検出する工程であり、これによって該候補因子が、ＩＡＰ阻害カスパーゼを活性化させる因子として同定される、工程
    が含まれる、方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であり、ここでＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、およびサービビンからなる群から選択される、方法。
  24. 請求項２２に記載の方法であり、ここで前記ＩＡＰ阻害カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９からなる群から選択される、方法。
  25. 請求項２２に記載の方法であり、ここで、前記接触工程が、インビトロで実行される、方法。
  26. 請求項２２に記載の方法であり、ここで、前記接触工程が細胞中で生じる、方法。
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