JP2005510483A

JP2005510483A - 選択された細胞を標的化してそれに作用する方法及び物質

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Publication number: JP2005510483A
Application number: JP2003535705A
Authority: JP
Inventors: ページダブルフォーク
Original assignee: ページダブルフォーク
Priority date: 2001-10-17
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Publication date: 2005-04-21
Also published as: EP1444264A4; US20040220086A1; CA2463898A1; EP1444264A2; WO2003032899A2; WO2003032899A3

Abstract

複数の細胞作用単位を有する、疾病組織中の細胞に優先的に結合するタンパク質と接触させることによって、疾病組織を処置する。

Description

本発明は、一般に生物内の選択された細胞を標的化してそれに作用する方法及び物質に関し、より詳細には、このような細胞を処置する又は画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）する、あるいは、トランスフェリン受容体の出現率が比較的高い細胞に細胞作用（ｃｅｌｌ−ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）物質を優先的に送達することに関する。

癌の処置における最も困難な問題うちの２つは、患者を衰弱させる薬物毒性の問題、及び、より多くの薬物が必要となることによって薬物毒性の問題を拡大させ、多くの場合死に至らせる薬物耐性の問題である。薬物毒性の問題を解決するため評価されつつある解決法の１つは、薬物を癌細胞などの標的細胞に主に送達することである。多くの研究者らが、その標的に抗癌薬を運ぶ、癌細胞に対する抗体を開発するために研究を行っている。この手法は期待されているが、抗体に問題がないわけではない。例えば、これらは多くの場合正常な組織とも交差反応し、また血管に損傷を与え（例えば、脈管漏出症候群）、かつ危険なアレルギー反応を引き起こす（例えば、アナフィラキシー）。

薬物標的化により正常細胞には危害が加えられず、より少ない薬物が必要となり、また薬物毒性が有意に軽減される。抗癌薬を選択的に疾病細胞に送達しない場合は、その毒性は免疫系及び凝血を担っている系に特に損傷を与える。従って、癌患者における化学療法の主な合併症は感染症及び出血である。これらの合併症では、高価で多くの場合不快である医療サービス、処置、入院、集中治療、及び生命維持システムが必要となる。このような問題は、標的化した薬物送達により大部分を防ぐことができる。

薬物毒性の問題は、医者や看護士の時間を大きな単位で消費し、これは癌治療にかかる費用の大部分の原因である。例えば、癌専門医が呼ばれる７０％の場合が薬物毒性の問題によるものであることが一般的に認められている。現在では、より少ない薬物を使用すること以外は、薬物毒性を処置するに満足できる方法はない。標的化した送達により、投与した薬物の実質的にすべてが身体中に非特異的に分布されるのではなく癌細胞上の標的に特異的に送達されるので、より少ない薬物を使用することが可能になる。薬物毒性の問題に対するこの解決法により、癌患者における処置が劇的に変えられるであろう。

薬物耐性の問題も、同等に深刻である。一般にこの問題は、癌患者を処置し、何ヶ月もの間続く無症状の寛解を伴って反応したが、その後、もはや現在知られているどの薬物にも反応しない形態の癌が再発した場合に起こる。現在では、深刻な薬物毒性の問題を引き起こして多くの場合患者を死に至らす、大量のより強力な薬剤を使用すること以外、満足できる解決法はない。しかし、標的化した薬物送達により、薬物耐性の問題を克服することができる。

抗体でないタンパク質による癌細胞の標的化は、トランスフェリンに連結させた腫瘍作用剤を使用することによって期待がもたれることが最近示された。細胞を標的化することにおけるトランスフェリンの使用の背景調査は、１９７０代に、癌胎児性抗原の胚体外組織の研究を用いて始まった。これにより、胚体外栄養芽細胞（非特許文献１〜４）上にトランスフェリン受容体があることが示されたが、胚体外羊膜上皮（非特許文献５）上にあることは示されなかった。しかし、羊膜上皮細胞を培養して増殖させた場合に、これらはトランスフェリン受容体を産生した（非特許文献６）。その後、この受容体を様々な種類の培養細胞で同定したが（非特許文献７）、これらは正常（すなわち培養していない）細胞には存在していなかった。これらの発見により、Ｆａｕｌｋらは癌生検を研究することを促され、これにより１９８０年の、乳腺癌細胞上のトランスフェリン受容体に関する最初の報告に至った（非特許文献８）。これに次いで、１９８４年にリンパ腫、骨髄腫及び白血病細胞の表面上のトランスフェリン受容体に関する報告がなされた（非特許文献９）。これらの発見は何度も確認及び拡張されている（総説には非特許文献１０参照）。トランスフェリン受容体が同定されているヒト細胞を以下の表に記載する。

背景：正常細胞及び癌細胞上のトランスフェリン受容体
どの研究も、すべてのヒト癌細胞が上方制御されたトランスフェリン受容体を有するかどうか、またすべての正常細胞が下方制御されたトランスフェリン受容体を有するかどうかを問うていないが、多くの方面からのデータにより、どちらの質問の答えも括弧付きのイエスであることが示唆されている。未熟な赤血球（すなわち、正常芽細胞及び網状赤血球）はその表面上にトランスフェリン受容体を有するが、成熟赤血球は有していない（非特許文献２１）。循環している単球も上方制御されたトランスフェリン受容体を有さず（非特許文献２２）、またクッパー細胞を含めた貪食細胞は、トランスフェリン非依存性の赤血球貪食方法によってその鉄の大部分を獲得する（非特許文献２３）。実際、血漿トランスフェリンから細網内皮系に入る鉄は実質的にない（総説には参考文献２４参照）。貪食細胞のトランスフェリン受容体は、おそらくは細胞内の寄生体を死滅させるための鉄制限の機構として（非特許文献２６）、γインターフェロンなどのサイトカインによって下方制御されている（非特許文献２５）。

休止期のリンパ球では、トランスフェリン受容体の遺伝子は測定すらできないが（非特許文献２７）、刺激したリンパ球はＧ_１後期にトランスフェリン受容体を上方制御した（非特許文献２８）。受容体の発現はｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子の発現の後に、かつＩＬ−２受容体の上方制御に続いて起こり（非特許文献２９）、トランスフェリン受容体のｍＲＮＡを安定化する（非特許文献３１）鉄調節タンパク質の結合活性の測定可能な増大（非特許文献３０）を伴う。このことはＴリンパ球及びＢリンパ球のどちらもで事実であり（非特許文献３２）、これはＩＬ−２依存性の応答である（非特許文献３３）。

正常細胞及び腫瘍細胞におけるトランスフェリン受容体の上方制御及び下方制御は、抗原又はレクチン刺激の研究（すなわち、受容体の上方制御）、ならびにレチノイン酸を使用した分化モデル（非特許文献３４〜３７）の研究によって（すなわち、受容体の下方制御）によって示されている。これら実験モデルからのベースラインデータは、これら受容体がヒトの正常細胞、成体細胞及び休止細胞の原形質膜より下方制御されていることを示唆している（非特許文献３８）。例外は、トランスフェリン受容体に富んだ合胞体栄養細胞層を含む母体胎児関門を含めた循環系の関門（非特許文献３９）；トランスフェリン受容体に富んだ毛細血管上皮細胞を含む血液脳関門（非特許文献４０）；及びトランスフェリン受容体に富んだセルトリ細胞を含む血液精巣関門（非特許文献４１）である。

これら固有（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）組織の生物分子学についてはあまり知られていないが、これらが他の組織と同じ方法では細胞内鉄を輸送しないことが分かっている。例えば、セルトリ細胞上のトランスフェリン受容体に結合した後、トランスフェリン−鉄複合体は他の細胞と同様に内部に取り入れられるが、その後、鉄はセルトリ細胞に産生される別のトランスフェリンに移動され、精母細胞上のトランスフェリン受容体に輸送される（非特許文献４２）。通常は上方制御されているこれらのトランスフェリン受容体がトランスフェリン−薬物コンジュゲートの毒性に寄与しているかどうか、あるいはこれらが睾丸癌、栄養芽細胞癌又は脳癌の処置において特権的なアクセス（ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄａｃｃｅｓｓ）を提供するかどうかは分かっていない。

背景：トランスフェリン−薬物コンジュゲート
抗癌薬を送達するためにトランスフェリンを使用するという概念は１９８０年に提案された（非特許文献８）。トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートの調製方法は１９８４に発表され、これは、ヒトＨＬ６０及びＤａｕｄｉ細胞を死滅させること（非特許文献４３）、ならびに白血病患者由来の末梢血及び骨髄の単核細胞を死滅させること（４４）における感度及び特異性に関するデータを提示している。これらの報告により、トランスフェリン−薬物コンジュゲートの調製方法に関する他の報告が促され、それらのうち一部を以下の表に記載する。

ドキソルビシンのトランスフェリンコンジュゲートは、トランスフェリンのε−アミノリジン基とドキソルビシンの３’アミノ位との間に酸耐性結合が形成されるグルタルアルデヒド媒介のシッフ塩基形成によって調製することができる（非特許文献６２、６３）。しかし、ドキソルビシンが、ヒドラゾンリンカーを使用することによって形成されるものなど酸感受性結合を介して抗体にコンジュゲートされる場合は、標的化したドキソルビシンは細胞毒性がより強い（非特許文献６４、６５）。これらの観察により、酸感受性結合により担体に結合された薬物は細胞内で薬物を放出し、酸耐性結合によりその担体に結合された薬物より効果的であるという考えが導かれた（非特許文献６４〜６６）。この考えはドキソルビシンの細胞毒性のＤＮＡインターカレーション機構と矛盾していないが（非特許文献６７）、原形質膜に媒介されるドキソルビシン細胞毒性の機構と矛盾している（総説には非特許文献６８参照）。

ＤＮＡインターカレーションはドキソルビシンによる細胞死に関して確立された機構であるが、デキストランなど担体上に固定したドキソルビシンは、原形質膜に媒介される細胞を死滅させる機構を活性化させる（非特許文献６９、７０）。この点で、固定したドキソルビシンとグルタルアルデヒドを用いて調製したトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートとの間にいくつかの特筆すべき生化学的な類似点がある。第１に、これらはどちらも酸耐性である（非特許文献７１）。第２に、これらはどちらも原形質膜及びシグナル伝達の反応を開始させる（非特許文献７２）。第３に、これらはどちらも非常にゆっくりとエンドサイトーシスを受ける（非特許文献７３）。第４に、これらはどちらも核内にドキソルビシンを運ぶことができない（非特許文献７４）。従って、トランスフェリンを有するドキソルビシンのコンジュゲートは、ドキソルビシン受容体及びトランスフェリン受容体のどちらもが関与する、原形質膜に媒介される機構を活性化させることによって細胞を死滅させると考えられる。これらの機構は以下のセクションで論じる。

背景：トランスフェリン−薬物コンジュゲートによる細胞死滅の機構
トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートは、２つの機構を連続的に利用することによって原形質膜に結合する。すなわち、まずトランスフェリン成分がトランスフェリン受容体に結合し、その後、主にカルジオリピン及び帯電したリン酸基と相互作用することによってドキソルビシン成分が脂質二重層に結合される（非特許文献６８）。これらの一連の事象は、コンジュゲートが正常細胞及びトランスフェリン受容体陰性細胞のどちらにも結合しないという観察によって（非特許文献４５）、また、受容体陽性細胞からのトランスフェリンを置き換えるのに比べてトランスフェリン−ドキソルビシンを置き換える方が、実質的により多くのトランスフェリンが必要であることによって（非特許文献７５、７６）支持されている。従って、タンパク質及びリン脂質受容体を介して結合されたコンジュゲートは、受容体の二量体化、側方移動、及び細胞質内のカルシウム移動によってシグナル伝達経路を活性化するように配置されている（非特許文献７７）。

トランスフェリンにおいて、最も研究されているリガンド−受容体相互作用によって活性化される経路はエンドサイトーシスであるが（非特許文献７８及び７９参照）、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートによって癌細胞を選択的に死滅させるのに重要な、いくつかの他の経路も活性化される。これらのうち最も重要なのは、原形質膜内に位置する主要な酸化還元酵素であるＮＡＤＨオキシダーゼである（非特許文献８０）。この酵素は、トランスフェリン受容体がそのリガンド（すなわち、トランスフェリン）を結合する際に活性化される（非特許文献８１）。ＮＡＤＨオキシダーゼの阻害により細胞死が引き起こされ（非特許文献８２）、ドキソルビシンはこの酵素の有効な阻害剤である（非特許文献８３、８４）。トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートは、ＮＡＤＨオキシダーゼだけでなく（非特許文献８５）、ナトリウム−水素の逆輸送による電子の損失やプロトンの交換など、ＮＡＤＨの酸化によって開始される下流の反応（非特許文献７２）を阻害する。従って、原形質膜の酸化還元酵素、特にＮＡＤＨオキシダーゼの阻害は、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートによる腫瘍細胞の死滅に関与している一機構である（非特許文献８６）。

トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートによる細胞死滅の別の機構は、トランスフェリン受容体の分子制御を含む。これは、制限された微小環境中の鉄に対する正常細胞及び癌細胞が示す明確に異なる反応によって例示されている。例えば、微小環境中の鉄のキレート化により腫瘍細胞ではアポトーシスが開始されるが、正常な休止細胞では開始されず（非特許文献８７）、このようなキレート化はシトシンアラビノシドの細胞毒性効果を有意に増強する（非特許文献８８）。また、薬物耐性細胞がトランスフェリン受容体ｍＲＮＡを安定化することができないこと（発表されていない結果）、及び、過剰の鉄が、薬物感受性細胞に比べて薬物耐性細胞でより効果的にトランスフェリン受容体ｍＲＮＡを不安定化させることにより、薬物耐性細胞は鉄制限に対してはるかに感受性が高い（非特許文献８９）。薬物耐性のこの分子モデルに関するさらなる研究により、鉄調節タンパク質の鉄−硫黄クラスターをニトロシル化するニトロプルシドナトリウムがトランスフェリン受容体ｍＲＮＡの不安定化を媒介し、また、薬物耐性細胞が薬物感受性細胞に比べて、この鉄非依存性機構に有意により影響されやすいことが明らかとなった（非特許文献８９）。

トランスフェリン受容体の翻訳後調節の分子機構を制御している別の鉄非依存性スイッチは、酸化的ストレスからの酸化還元活性生成物である（総説には非特許文献９０参照）。例えば、一酸化窒素は鉄−硫黄クラスターを分解し、鉄調節タンパク質が鉄応答要素に結合して保護することを可能にし（非特許文献９１）、この反応の速度論は、鉄に媒介される鉄調節タンパク質内の鉄−硫黄クラスターの制御に非常によく似ている（非特許文献９２）。また、過酸化水素も同じ効果（すなわち、トランスフェリン受容体の上方制御）を引き起こすが、過酸化水素反応は一酸化窒素によって開始される反応より有意に速い（非特許文献９３）。同様に、トランスフェリン受容体はニトロシウム（ｎｉｔｒｏｓｉｕｍ）イオンによって下方制御され、これにより鉄−硫黄クラスター内のチオール基のニトロシル化が引き起こされる（非特許文献９４）。従って、鉄依存性経路の調査では、ヒト癌でなぜトランスフェリン受容体が上方制御されているのかは明らかにならないかもしれない。確かに、サイトカイン（非特許文献９５、９６）、フリーラジカル（非特許文献９０、９３）及びニトロシル化（非特許文献９７）によって活性化される鉄非依存性の経路は、受容体の調節及び細胞毒性のどちらにも作用する。

背景：実験動物におけるトランスフェリン−薬物コンジュゲート
トランスフェリン−薬物コンジュゲートの有効性は、いくつかの動物モデルで調査されている。例えば、ヌードマウス内のヒトグリオーマ細胞を死滅させることにおけるトランスフェリン−ジフテリア毒素コンジュゲートの能力が研究されており、１４日目にグリオーマは９５％減少され、３０日目までにはグリオーマが再発しないことが見出されている（非特許文献９８）。別の調査では、ヌードマウスをヒト中皮腫細胞による死から救命することにおけるグルタルアルデヒドを用いて調製したトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートの有効性を調査し、このコンジュゲートにより、ドキソルビシンのみで処置した動物に比べて寿命が有意に延びたことが見出されている（非特許文献９９）。また、細胞溶解性ウイルスをトランスフェリンのコンジュゲートとして、腫瘍細胞の標的にする報告もなされている。例えば、ビオチン−ストレプトアビジンの技術を用いてトランスフェリンを単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼにコンジュゲートさせ、これらコンジュゲートにより、転移性Ｋ５６２腫瘍細胞を接種した免疫不全マウスの寿命が延びた（非特許文献１００）。

トランスフェリン−薬物コンジュゲートの毒性や薬物動態学に関する包括的な研究はなされていないが、ヒトトランスフェリンがマウス、ラット、サル、及びヒトトランスフェリン受容体に、同様の親和性で結合するというデータがある（非特許文献１０１）。これを考慮して、遊離薬物を与えたマウスは死亡し、コンジュゲートを与えたマウスは生存したことから、マウスで調査したヒトトランスフェリン−クロラムブシルコンジュゲートの毒性は、遊離クロラムブシルより毒性が小さいことが見出された（非特許文献５１）。同様に、ヌードマウスにおける、ヒトトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲート中のドキソルビシンの最大許容用量は、コンジュゲートでは２０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）であるが、遊離薬物では８ｍｇ／ｋｇ（静脈内）でしかなかった（非特許文献４７）。ヌードマウスにおけるヒトトランスフェリン−ネオカルジノスタチンの研究により、この半減期は５５分間であり、一方、遊離ネオカルジノスタチンの半減期は７分間であり、また、このコンジュゲートは肝臓又は腎臓の機能に対して有害効果を全く生じなかったことが明らかとなった（非特許文献１０２）。

ヒトの患者におけるトランスフェリン−薬物コンジュゲート
ヒトの癌患者におけるトランスフェリン−薬物コンジュゲートの臨床報告は２件しかない。第１の論文は１９９０年に発表され、これは、グルタルアルデヒドを用いて調製したトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲート１ｍｇ／日を５日間静脈内に処置した、７人の急性白血病患者の予備研究であった。これらの低用量では、毒性効果はなく、７人の患者の末梢血における白血病細胞の数は治療後１０日以内に８６％まで減少した（非特許文献１０３）。さらに、処置の前後の骨髄生検の検査によって評価したところ、疾病の拡大は見られなかった（非特許文献１０３）。同じトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートが、白血病患者の末梢血及び骨髄由来の白血病細胞を選択的に死滅させることが示されている（非特許文献４４）。

第２の臨床報告は、１９９７年に米国立神経疾患及び脳卒中研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＳｔｒｏｋｅ）から発表されており、再発性の脳癌を羅漢しているジフテリア毒素の遺伝的変異体のトランスフェリンのチオエーテル結合のコンジュゲートを用いて処置した１５人の患者が関わっていた（非特許文献５０）。コンジュゲートは、高速の間質内微量インフュージョンによって送達させ、これは、霊長類の脳で、最小限の炎症性応答を伴って放射標識したトランスフェリンの灌流が有効に行われることが示されている（非特許文献１０４）。磁気共鳴画像法により、１５人中９人の患者で腫瘍体積が少なくとも５０％減少し、そのうち２つの症例では完全に寛解したことが明らかになった（非特許文献５０）。

現在は未発表であるが、試験群（１２人の患者）及び偽薬群（１１人の患者）に無作為に分けた、進行卵巣癌を羅漢している２３人の患者についての別の臨床研究がある。試験群には、月毎の処置サイクルの１５日目から１９日目に、１日あたり１ｍｇのドキソルビシンに等価のトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートを与えた。診断と無作為に分けた時との間の時間が１８ヶ月である場合、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートで処置した患者の生存率のＣｏｘ回帰推定値によって有意な差が明らかとなった（原稿は準備中）。

トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートに関する唯一の他の臨床調査も、まだ発表されていない。これは、２０００年８月の初旬に従来のプロトコルを使用して処置した、右心房の肉腫からの転移性疾病を羅漢している２２歳の男性に関する。この患者は従来の化学療法に失敗し、医者である彼の父親がＦＤＡからトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートを使用するためのＩＮＤを取得した時、２０００年１１月には薬物毒性に苦しんでおり、肺が転移性病変に満ちており、血痰を吐いており、処置は２０００年１１月に始められた。２０００年１月には、患者の肺から実質的に転移性病変が消えており、放射線によって腫瘍の証拠は見られなかった。彼は現在（２００１年８月）生存しており、トランスフェリン−ドキソルビシンのみを受けている（症例報告は準備中）。

標的化した薬物の送達は、患者により少ない薬物を送達し、それにより有効性を増大させ、コストを低下させ、正常細胞への付随的な損傷をより少なくすることによって毒性を最小限にするという著しい利点を有する。標的化した送達は、薬物毒性の中心的な問題に対処しているが、癌の処置における別の中心的な問題は薬物耐性である。薬物耐性のいくつかの機能が知られているが（例えば、流出ポンプ）、これらは、細胞内へ薬物が非特異的に入ることによって活性化されるという共通の特徴を共有している（非特許文献１０５）。この点で、トランスフェリンは受容体に特異的な経路を利用して細胞内に入るので、これは特に興味深い担体である（非特許文献７８）。従って、トランスフェリン−薬物コンジュゲートは、耐性細胞において流出ポンプなど薬物耐性機構を避けて輸送されるかもしれない（非特許文献８５）。

１９９２年に発表されたデータは、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートが、ドキソルビシンに耐性のあるＫ５６２細胞及びＨＬ６０細胞を死滅させるのに有効であったことを示している（非特許文献１０６）。これらの発見は、独立して１９９３年に薬物耐性Ｋ５６２細胞で確認され（非特許文献１０７）、１９９４年（非特許文献１０８）、１９９６年（非特許文献１０９）及び２０００年（非特許文献１１０）に再確認かつ他の薬物耐性細胞に拡張された。興味深いことに、デキストラン（非特許文献７０）やナノ粒子（非特許文献１１１）など固体の担体上に固定化したドキソルビシンも、ドキソルビシン耐性細胞に対して有効であることが示された。実際、複数のペプチドベクターのうち１つを用いてドキソルビシンをベクター化することが、多剤耐性を克服するのに有効であるという概念が出現しつつある（非特許文献１１２）。要約すると、ベクター化／固定化したドキソルビシン及びトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートのどちらもが、細胞死をもたらす、シグナル伝達経路を活性化させる原形質膜に媒介される反応を活性化させることによって、薬物耐性癌細胞を死滅させる（非特許文献６８、６９、１０６、１０９、１１２）。

国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１８９１号国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０４４４号国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１８９３号国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１８９２号米国特許第５，１０８，９８７号

標的化したドキソルビシンなど細胞作用物質の、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートによる送達では、従来技術の多くの問題が回避されるが、薬剤耐性癌細胞の処置における効率及び有効性の改良は常に歓迎される。このような改良が、本発明によって提供されている。

本発明は、一態様では、癌細胞など特定の細胞に選択的に誘引されるタンパク質であって、複数の異なる細胞作用単位を一緒に有するように適応されているタンパク質を含む。現時点で好ましいタンパク質は、比較的高い濃度で癌細胞に誘引されるのでトランスフェリンであるが、選択された細胞上で比較的高い数見つかる受容体に誘引される他のタンパク質も使用し得る。細胞作用単位は、好ましくは異なる作用機構で標的化した細胞に作用する。例えば、タンパク質が有する１種の細胞作用単位はドキソルビシンなどの薬剤であり得、一方、第２の細胞作用単位はビスマスなどの金属の放射性同位元素、又は標的化した細胞に所望の作用を及ぼすことで知られている非放射性金属であり得る。この第２の細胞作用単位は、やはり標的化した細胞の画像化に有用なガリウムなどの物質であり得る。さらにコンジュゲートは、幅広い組み合わせで２種以上の細胞作用単位を有するように適応していてもよい。

別の態様では、本発明はこのようなタンパク質を作製する方法を含む。
さらに別の態様では、本発明は、複数の異なる細胞作用単位を有するタンパク質の選択的施用によって疾病を処置する方法を含む。

コンジュゲートの合成
金属結合（ｍｅｔａｌ−ｌｏａｄｅｄ）トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートの合成は、まず金属を有さないトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートを調製することによってなされるが、タンパク質の操作に精通している者には、まずトランスフェリン−金属コンジュゲートを調製することもできることは容易に理解されよう。最初の方法ではトランスフェリン及びドキソルビシンと２価リンカーであるグルタルアルデヒドとの混合物を使用したが（非特許文献４３）、この方法では二量体及び凝集体が生じた。この方法はその後、凝集体が形成されないように改良されたが（非特許文献４５）、この方法で使用したクロマトグラフィーによって同種コンジュゲートの収率が低下した。グルタルアルデヒドをリンカーとして使用して、１分子のトランスフェリンあたり定義された一貫性のある数のドキソルビシン分子を含む同種コンジュゲートを、クロマトグラフィーを使用せずに高収率で生成することが好ましい。トランスフェリン（純度９９％）はＫａｍａｄａ，Ｌｔｄ．（イスラエル国レホボト（Ｒｅｈｏｖｏｔ））から購入することができ、ドキソルビシンはＢｅｎＶｅｎｕｅ，Ｉｎｃ．（米国オハイオ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））から購入することができる。コンジュゲートを作製する好ましい方法は、その開示が参照として本明細書に組み込まれる本発明者の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１８９１号に開示されている。

金属を有さないトランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートを調製した後、トランスフェリンの金属結合部位に、トランスフェリンのＮ末端及びＣ末端のドメイン間の間隙に配置されている２つの金属結合部位のための、安定な結合定数を有することで知られている金属を結合させた（非特許文献１１３）。上述のように、金属の結合は、タンパク質にドキソルビシンなどの薬物を添加する又は連結させる前に行うこともできる。さらに、タンパク質に、薬物を含まない複数の細胞作用単位を結合させることも、本発明の範囲内にある。例えば、細胞作用単位は、１つ又は複数の癌を死滅させる金属、癌を死滅させる同位体、画像化単位、あるいはこのような単位の様々な組合せであることができる。

トランスフェリン分子への金属の結合は、患者の安全性には問題でない。通常、血漿中のトランスフェリン分子の３０％のみが鉄を運ぶのに従事しているので、トランスフェリンによる金属の結合には余剰の能力がある（非特許文献１１５）。鉄では、これは一般に鉄結合能として知られている（非特許文献４１）。血漿中には遊離鉄は存在しないので（非特許文献２４）、より低い結合親和力の金属はｉｎｖｉｖｏでトランスフェリンから追放されない。また、アルブミンはある種の金属を結合することができるが、その結合親和力はトランスフェリンの結合親和力より弱く（非特許文献１２３）、従ってｉｎｖｉｖｏで金属をトランスフェリンからアルブミンに失う危険性はない。

３０種の金属が、トランスフェリンによって輸送されることで知られている（非特許文献１１４）。熱力学的なデータにより、これらのうち非常に数少ないものが６を超え８までの安定定数（すなわち、ｌｏｇＫ値）を有しており（例えば、ニッケル及び亜鉛のｌｏｇＫ値はそれぞれ４．１及び７．８である）、一方で鉄は約２０のｌｏｇＫ値を有することを示している（非特許文献１１５）。３０種の金属のうちどれが、トランスフェリンの金属結合部位に結合されることが可能になるような物理化学的特性を有しているかを定義するための研究により、ガリウム、ビスマス、アルミニウム及びルテニウムが、ドメイン間の間隙にはまる適切なイオン半径を有することが明らかになった。また、金属結合部位に結合される際に、これらの金属は、分子がトランスフェリン受容体によって結合されることを可能にするコンホメーションのシフトを生じる。このような金属のうち４種に関する参考文献を以下の表に示す。

アルブミンは多くの金属の静脈内輸送において主要な役割を果たしているが、ガリウム、アルミニウム、ビスマス及びルテニウムの主な輸送体はトランスフェリンであると考えられる。これらの金属の細胞毒性特性（非特許文献１３２−１３８）も利用することができ、これは、これらがトランスフェリンで誘導するコンホメーション変化が空間的に適切であり、トランスフェリン−金属複合体によって認識されてトランスフェリン受容体によって結合されるのを可能にするからである。これら医用特性により、癌患者における標的化された治療手段としての選択されたトランスフェリン−金属複合体の、制限された臨床研究が促された。これらの記述を支持している発表された論文の参照番号を以下の表に記載する。

金属を、炭酸水素塩の存在下、酸性ｐＨ（例えば４．９）で、クエン酸で弱くキレート化した金属の提示を含むｐＨ依存性の反応によってトランスフェリンの２つの結合部位に別々に結合させ、ｐＨをゆっくりと数時間（例えば３時間）かけて生理的条件に上昇させる。この方法は、酸性ｐＨで結合するための開いた間隙、及び、生理的なｐＨでの安定性のための閉じた間隙を保証している。この間隙内で、挿入された各金属が２つのチロシン残基のフェノールの酸素、１つのヒスチジン残基の１つのイミダゾールの窒素、１つのアスパラギン酸残基の１つのカルボン酸の酸素、及び、協同的炭酸水素アニオンの２つの酸素によって入れ子状態になっている（非特許文献１４７）。溶液中のコンジュゲートは、６〜９ヶ月の間安定かつ活性があることが見出され、凍結乾燥させたコンジュゲートは少なくとも１年間の間安定かつ活性があることが見出されている。他の金属をタンパク質結合部位に結合させること、あるいはトランスフェリン又は他のタンパク質に他の金属を連結させることが、様々なｐＨ値で、又は様々な手順を用いて行い得ることは、当分野の技術者には容易に理解されよう。これらはすべて、本発明の範囲内にあることが意図される。

金属の同位体も、その細胞作用特性又はその画像化性質、あるいはそのどちらに関しても使用することができ、金属の組合わせ又は金属と同位体の組合わせを使用することができる。例えば、ビスマス同位体の細胞死滅特性及びルテニウム同位体の画像化性質を利用するために、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートにルテニウム原子及びビスマス同位体原子を結合させることができる。従って、本発明中で使用する金属は、同位体であっても、非同位体であっても、又は、それらの組合わせであってもよい。薬物をトランスフェリンなどのタンパク質に結合させる場合、通常０．５〜２．５分子の薬物をタンパク質１分子に結合させる。タンパク質１分子あたり１〜２分子の薬物が複合体中に存在することが好ましく、最も好ましくはタンパク質１分子あたり１．５分子の薬物が存在する。

同位体であれ非同位体であれ、金属がタンパク質内に存在する場合に、その量は、選択された具体的なタンパク質及びタンパク質上又は内に金属を配置する方法に応じて変動し得る。トランスフェリンの場合は、２つの利用可能な鉄結合部位があり、トランスフェリン１モルあたり１又は２分子の金属が存在するが、容易に理解されるように、金属１原子を含むトランスフェリン及び金属２原子を含むトランスフェリン分子の混合物を使用することもできる。トランスフェリンの鉄結合部位内の金属は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、結合部位の１つにその抗癌効果のためにビスマスを含むことができ、他方の鉄結合部位はその画像化能のためにガリウムを含むことができる。

同位体又は他の金属がトランスフェリンの鉄結合部位の１つに捕捉されている場合、これは、同位体の量に基づいて、以下の量で腫瘍の処置に使用されることが好ましい。

ガリウム−６７＝５〜１５ｍＣｉ
ビスマス−２１３＝０．２〜０．６ｍＣｉ／ｋｇ、全用量１０〜４５ｍＣＩ
ルテニウム２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日
シスプラチン＝７５ｍｇ／平方メートル
鉄同位体−５２としての鉄＝５０〜６５ｍＣｉ

上記の同位体では、ガリウムの同位体を画像化又は診断に使用し、一方、ビスマス及び鉄を処置のために同位体として使用し、ルテニウムを処置のために同位体でない形態で使用した。上で同定されたシスプラチンは、処置のために白金の同位体でない形態で使用された。シスプラチンは、鉄結合部位内にあると考えられているアミノ酸を介してトランスフェリンに結合しており、これは、上述のドキソルビシンの結合機構とはかなり異なった結合機構である。シスプラチンは、例えばガリウムで行われるように鉄結合部位内に単に入り込むだけでない、異なった機構によって結合していると考えられる。プラチナと、適切なエネルギーレベルにある電子を有するアミノ酸との特異的な相互作用を示すデータがある。これにより、シスプラチンの結合はタンパク質−金属結合であると考えられており、従ってこれはプラチナに起因しているものである。

本発明の処置及び画像化用コンジュゲートは、キレート剤によって結合されたトランスフェリン−同位体コンジュゲートも含む。本明細書の目的では、キレート剤とは、トランスフェリンに付着する反応性部位を提供するのに十分な反応性部位を含み、かつ、別の、特定の同位体を選択的に結合する強力なカチオン結合部位である反応性部位を含む分子である。遊離した同位体は免疫系を抑制し、また、患者を命にかかわる感染症に羅患しやすくさせる可能性があるので、これらの付着が安定であることが重要である。

いくつかのキレート剤が、同位体と抗体などタンパク質担体とを結合する２官能性試薬として報告されている。しかし、トランスフェリンを標的化試薬として結合するキレート剤の報告は非常に数少ない。この観点から、キレート剤はトランスフェリン及び様々な同位体用の二官能性試薬として研究された。この研究により、安定なトランスフェリン−同位体コンジュゲートをもたらす２種類のキレート剤が同定された。これらの分子は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−三酢酸（ＤＯＴＡ）である。従って、これらキレート剤のどちらもがキレート剤を用いて結合されたトランスフェリン−同位体コンジュゲートの調製に使用されていた。

上記キレート剤のうち、ＤＴＰＡはインジウム−１１１の良好な結合剤であり、これはγ線を放出することにより良好な診断用又は画像化用の同位体である。他方で、ＤＯＴＡはイットリウム−９０の良好な結合剤であり、これはβ線を放出することにより処置目的のための良好な同位体である。

知られている限りでは、すべての腫瘍が上方制御されたトランスフェリン受容体を有しており、本発明は、癌患者の診断、予後及び経過観察において腫瘍を画像化するため、疾病ベクター又は感染した細胞のどちらかがトランスフェリン受容体を表示するある種の感染性疾病の処置／診断のため、又は、自己免疫疾患における攻撃的なＴ−リンパ球もしくはＢ−リンパ球の同定及び／又は除去、あるいは移植した細胞又は臓器を有する患者における拒絶細胞の排除に使用することができる。

本発明の複合体を抗腫瘍剤として使用することに加えて、この複合体は、移植組織の拒絶の原因である活性化されたリンパ球に細胞毒性薬を標的化して送達すること、及び高濃度の放射線増感剤を癌細胞に輸送することに使用でき、また、これらの使用、ならびに選択された細胞上の特異的受容体に結合する結合部分（ｍｏｉｅｔｙ）としてのトランスコバラミンの使用は、その開示がそれに含まれるこのような教示について参照として本明細書に組み込まれている本発明者の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０４４４号に記載されている。寄生体による感染症の処置におけるコンジュゲートの使用は、その開示がそれに含まれるこのような処置の教示について参照として本明細書に組み込まれている本発明者の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１８９３号に記載されている。

ストレスを受けた細胞、特にウイルス感染の結果ストレスを受けた細胞への薬物の標的化した送達は、その開示がそれに含まれるこのような教示について参照として本明細書に組み込まれている本発明者の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１１８９２号に記載されている。本発明のコンジュゲートは、これらの処置すべてで使用し得る。

癌を処置するための本発明の物質の使用は、本発明の処置態様の方法の好ましい実施形態であるが、細胞集団に選択的に結合するタンパク質を細胞画像化剤及び／又は細胞死滅剤と共に使用することによって、ある種の細胞集団を同定及び／又は排除することに本発明を広範に使用することができることが明らかであろう。

本発明の材料の投与方法及び用量は、その開示がそれに含まれるこのような投与方法及び用量の教示について参照として本明細書に組み込まれている、本発明者の米国特許第５，１０８，９８７号に記載のように、ドキソルビシン−トランスフェリンコンジュゲートで使用されるものに類似している。

本発明は、本明細書中で以下に引用する参考文献の教示に依存することによって補われる。これらの参考文献の開示は、本明細書中で引用された教示について参照として明細書に組み込まれている。

コンジュゲートの検証
（非特許文献４５）に記載のようにＨＰＬＣ及び／又はポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによって、金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートの均一性が決定される。同様に、吸光度測定法を使用することにより、ドキソルビシンとトランスフェリンのモル比が決定される（非特許文献７１）。さらに、ドキソルビシンとトランスフェリンの比は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）用格子の金表面上に沈着させたドキソルビシンに対する抗体を使用することによって決定することができる。ＳＰＲは変則的に、金表面上の抗ドキソルビシン抗体に結合するドキソルビシンの質量に比例する波長で移動する。ＴｅｘａｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓがＳＰＲ測定システムを製造しており、その改良が本出願に必要な解像度及び感度を有する。この方法の興味深い態様は、これにより、金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートで処置している癌患者の血液中のドキソルビシン濃度をモニターするのに使用することができることである。実験データは、ドキソルビシンとトランスフェリンの有用な比は２対１であることを示している。

金属とトランスフェリンとの比は、紫外分光法によって決定した。さらに、金属とトランスフェリンとの比は、２つの平行な金属プレートを備えたフローセル中で測定した。定量する金属に適切な周波数の交流シグナルをプレートに適用した場合、プレート間で測定されたインピーダンスは、トランスフェリンドキソルビシンコンジュゲートのトランスフェリン成分に結合された金属の量の関数として変動する。実験データは、金属とトランスフェリンの有用な比がトランスフェリン１分子あたり金属２原子であることを示している。

コンジュゲートについて、さらに、特異的な細胞に結合して死滅させるその能力を検証した。結合の研究は、ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞及び正常な末梢血リンパ球を用い、蛍光活性細胞分類分析を使用して、コンジュゲートが癌細胞に結合するが正常細胞に結合しないかどうかを決定するために行った。（非特許文献４５）に記載のｉｎｖｉｔｒｏの培養技法を使用することによって、細胞死滅の研究は、同じ癌細胞及び正常な末梢血リンパ球を用いて、コンジュゲートが癌細胞を死滅させるが正常細胞を死滅させないことを検証した。これらの検証手順は、コンジュゲートの品質制御としての役割も果たす。

コンジュゲートのＩｎＶｉｔｒｏにおける研究
各金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートを、薬物感受性及び薬物耐性のＫ５６２及びＨＬ６０細胞を死滅させるその能力について研究した。薬物耐性細胞は薬物感受性細胞より有意に多くのトランスフェリン受容体を有することに注意されたい（非特許文献１４８）。従って、各実験のＬＤ_５０を、金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲート、ドキソルビシンにコンジュゲートされていない金属結合トランスフェリン、遊離金属、及び遊離ドキソルビシンと共に培養した薬物感受性及び薬物耐性細胞を使用することによって得られたＬＤ_５０値と比較した。（非特許文献１０６）に記載の多剤耐性ヒト癌細胞の培養物を使用することにより、薬剤耐性Ｋ５６２及びＨＬ６０細胞に対して、金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートが遊離ドキソルビシンより実質的に低い（すなわち、多くの場合１桁低い）ＬＤ_５０値を生じ、また金属結合トランスフェリンドキソルビシンコンジュゲートが金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートよりさらに低いＬＤ_５０値で薬物耐性細胞を死滅させたことが判明した。

コンジュゲートの動物における研究
薬物耐性腫瘍を化学的に誘発させたＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットは、トランスフェリンの金属結合部位で複合体となる（非特許文献１２９）ルテニウムで処置した場合に長期に渡って生存する（非特許文献１４２）。他の研究では、薬剤耐性ヒト腫瘍を保有するヌードマウスは、遊離ドキソルビシンで処置した場合に比べて、グルタルアルデヒドを用いて調製したトランスフェリンドキソルビシンコンジュゲートで処置した場合の方がより長く生存することが報告されており（非特許文献９９）、これは、トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートがマウスモデルにおいて薬物耐性ヒト癌細胞を死滅させる原理の根拠を提供した。同様に、薬物耐性腫瘍を保有するラットにおけるルテニウムを用いた上記結果は、トランスフェリン−金属複合体が薬物耐性腫瘍に対して有効であることを示唆している。

致死量の腫瘍細胞を接種し、金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートで処置した動物が（ドキソルビシンの量として測定）、何も接種しない、又は、遊離ドキソルビシン、遊離金属、金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシン、及び、金属結合トランスフェリンを接種した動物より有意に長く（すなわち、ｐ値が０．０５以下）生存するかどうかを試験するために、ヌードマウスにおいて薬物感受性及び薬物耐性のヒト癌細胞を調査した。これらの実験では、帰無仮説は、金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンは金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシン、金属結合トランスフェリン、遊離金属又は遊離ドキソルビシンのように有意に寿命を延ばさないことであり、代替仮説は、金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートを接種した動物は金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシン、金属結合トランスフェリン、遊離金属又は遊離ドキソルビシンを接種した動物と比べて有意に長く生存することである。さらに、４種の金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲートのそれぞれについて用量範囲を探すための実験を行い、金属非結合トランスフェリン−ドキソルビシン、金属結合トランスフェリン、遊離金属又は遊離ドキソルビシンを与えた平行実験の動物と比較した金属結合トランスフェリン−ドキソルビシンコンジュゲート中のドキソルビシン濃度の範囲を介して最大生存率を決定した。

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Claims

複数の異なる細胞作用物を有する、選択された細胞に選択的に結合するタンパク質を含む物質。
選択された細胞が腫瘍細胞である請求項１に記載の物質。
タンパク質がトランスフェリンであり、腫瘍細胞が上方制御されたトランスフェリン結合部位を有する請求項２に記載の物質。
細胞作用物が薬物、金属、放射性同位元素、画像化補助剤、及び、これらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の物質。
細胞作用物の少なくとも１つが抗腫瘍剤である請求項１に記載の物質。
抗腫瘍剤がドキソルビシンである請求項５に記載の物質。
細胞作用物の少なくとも１つが腫瘍細胞を死滅させる金属である請求項１に記載の物質。
金属がビスマスである請求項７に記載の物質。
細胞作用物の少なくとも１つが画像化金属である請求項１に記載の物質。
画像化金属がガリウムである請求項９に記載の物質。
少なくとも第２の細胞作用物が金属である請求項６に記載の物質。
金属が腫瘍細胞を死滅させる請求項１１に記載の物質。
金属が選択された細胞を画像化する請求項１１に記載の物質。
細胞作用物の少なくとも１つがリンカーを介してタンパク質に結合している請求項１に記載の物質。
細胞作用物の少なくとも１つがキレート剤を介してタンパク質に結合している請求項１に記載の物質。
疾病細胞を処置及び／又は画像化する方法であって、該疾病細胞と、タンパク質が該疾病細胞に選択的に結合する請求項１の物質とを接触させることを含む方法。
方法を、このような処置を必要としている患者においてｉｎｖｉｖｏで行う請求項１６に記載の方法。
疾病細胞が腫瘍細胞である請求項１７に記載の方法。
細胞作用物の少なくとも１つが疾病に対して活性である請求項１７に記載の方法。
細胞作用物の少なくとも１つが疾病細胞を画像化する請求項１７に記載の方法。
処置を必要としている患者の疾病を処置する方法であって、該処置が、選択された細胞が疾病状態にあり、細胞作用物の少なくとも１つが該疾病に対して活性である請求項１に記載の物質を該患者に疾病に対抗するのに有効な量で投与することを含む方法。
細胞作用物の少なくとも１つがドキソルビシン又はシスプラチンである請求項２１に記載の方法。
患者において選択された細胞を画像化する方法であって、細胞作用物の少なくとも１つが画像化剤である請求項１に記載の物質を該患者に画像化に有効な量で投与することを含む方法。