JP2005510199A - ミスマッチ修復の化学阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
Bronner,C.E.et al.(1994)Nature 368:258−261 Papadopoulos,N.et al.(1994)Science 263:1625−1629 Leach,F.S.et al.(1993)Cell 75:1215−1225 Nicolaides,N.C.et al.(1994)Nature 371:75−80 Bronner,C.E.et al.(1994)Nature 368:258−261 Papadopoulos,N.et al.(1994)Science 263:1625−1629 Leach,F.S.et al.(1993)Cell 75:1215−1225 Nicolaides,N.C.et al.(1994)Nature 371:75−80 Harfe B.D.,and S.Jinks−Robertson(2000)An.Rev.Genet.34:359−399 Modrich,P.(1994)Science 266:1959−1960 Peinado,M.A.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10065−10069 Perucho,M.(1996)Biol.Chem.377:675−684 Harfe B.D.,and S.Jinks−Robertson(2000)An.Rev.Genet.34:359−399 Modrich,P.(1994)Science 266:1959−1960 Peinado,M.A.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10065−10069 Perucho,M.(1996)Biol.Chem.377:675−684 Wheeler,J.M.et al.(2000)J.Med.Genet.37:588−592 Hoang,J.M.et al.(1997)Cancer Res.57:300−303
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも1個のヘテロ原子を含有し;そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、CN、NO2、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり;
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または1〜3個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよく;
もしくはここで、R1−R10の任意の二つは一緒になってポリエーテルを形成することができ;
もしくはここで、R1−R10の任意の二つはアントラセンコアの介在する炭素原子と一緒になってクラウンエーテルを形成することができる、
を有する。
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも1個のヘテロ原子を含有し;そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、CN、NO2、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり;
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または1〜3個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよく;
もしくはここで、R1−R10の任意の二つは一緒になってポリエーテルを形成することができ;
もしくはここで、R1−R10の任意の二つはアントラセンコアの介在する炭素原子と一緒になってクラウンエーテルを形成することができる、
を有するアントラセンが包含されるが、これらに限定されるものではない。
一つの態様として、アンチセンス核酸分子は、MMRタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」にアンチセンスである。コーディング鎖はまた、MMR配列の調節領域を含むこともできる。「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域をさす(例えば、ヒトPMS2のタンパク質コーディング領域は、コーディング領域配列番号:17に相当する)。別の態様として、アンチセンス核酸分子は、MMRタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する5’および3’配列をさす(すなわち、5’および3’非翻訳領域(UTR)とも呼ばれる)。
MMR欠損の特質は、宿主細胞のゲノムにおける不安定なマイクロサテライト反復の生成である(Peinado,M.A.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10065−10069;Strand,M.et al.(1993)Nature 365:274−276;Parsons,R.et al.(1993)Cell 75:1227−1236)。この表現型は、マイクロサテライト不安定性(MI)と呼ばれる(Harfe,B.D.and S.Jinks−Robertson(2000)Ann.Rev.Genet.34:359−399;Modrich,P.(1994)Science 266:1959−1960;Peinado,M.A.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10065−10069;Perucho,M.(1996)Biol.Chem.377:675−684;Hoang,J.M.et al.(1997)Cancer Res.57:300−303;Strand,M.et al.(1993)Nature 365:274−276)。MIは、宿主細胞の全ゲノムにわたる反復的モノ、ジおよび/もしくはトリヌクレオチド反復配列内の欠失および/もしくは挿入からなる。真核細胞の詳細な遺伝子分析により、MIをもたらすことができる唯一の生化学的欠損は欠損MMRであることが見出されている(Harfe,B.D.and S.Jinks−Robertson(2000)Ann.Rev.Genet.34:359−399;Modrich,P.(1994)Science 266:1959−1960;Peinado,M.A.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10065−10069;Perucho,M.(1996)Biol.Chem.377:675−684;Hoang,J.M.et al(1997)Cancer Res.57:300−303;Strand,M.et al.(1993)Nature 365:274−276)。マイクロサテライト不安定性を促進することに対して欠損MMRが有するこの独特な特徴を考慮して、現在、内因性MIは、宿主細胞内のMMR活性の欠如を調べるための生化学マーカーとして用いられる(Hoang,J.M.et al(1997)Cancer Res.57:300−303)。
表1.pCAR−OFレポーターベクターでトランスフェクションしたH36空ベクターおよびHB134細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現。細胞をpCAR−OFレポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション細胞をHYGおよびG418において選択し、増やし、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性(青色に着色した細胞)を測定するためにX−gal溶液で染色した。各200個の細胞の3視野を顕微鏡検査によって分析した。以下の結果は、これらの実験の平均+/−標準偏差を示す。
実施例2:MMRの化学阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本実施例では、実施例1に記述するH36pCAR−OF細胞系を用いて化学物質ライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。この細胞系は、MMRを特異的に阻害する化学物質の自動スクリーニングのための96ウェルマイクロタイタープレートに体裁を整えることができる強く安定な系である。スクリーニング方法の概要を図2に示すが、しかしながら、この方法は本実施例内の仕様に限定されるものではない。簡潔に言えば、全容量0.1mlの増殖培地(RPMI1640に加えて10%のウシ胎仔血清)中10,000個の細胞を任意の様々な化合物を含有する96ウェルマイクロタイタープレートに加える。細胞を5%CO2において37℃で14−17日間増やす。次に、0.1M Trisバッファー(pH8.0)、0.1% Triton X−100、45mM 2−メルカプトエタノール、1mM MgCl2、0.1M NaPO4および0.6mg/mlクロロフェノール−レッド−β−D−ガラクトピラノシド(CPRG,Roche)を含有する50μlの溶解バッファーで増殖培地において細胞を溶解させる。反応物を1時間インキュベーションし、50μlの0.5M Na2CO3の添加によって終結させ、そして576nmで分光測光により分析する。
実施例3:MMRを阻害する化学物質を特定すること
MMRの化学阻害剤の同定は、MMRの阻害によってゲノムの不安定性を誘発するものから標準的な突然変異誘発物質であるものを決定することにおいて困難であり得る。本実施例は、より一般的な突然変異誘発物質からMMRの阻害剤を決定する方法を教示する。いったん化合物が上記のアッセイにおいて同定されると、MMRに堪能な細胞およびMMR欠損であるコントロールサブクローンにおける突然変異率をモニターすることにより化合物が一般的な突然変異誘発物質か特異的MMR阻害剤かを決定することができる。MMR欠損の一つの特徴は、突然変異誘発物質にさらした際に高められた突然変異率を与えるDNAアルキル化剤の毒性に対する増大した耐性である(Liu,L.,et al.Cancer Res(1996)56:5375−5379)。この独特な特徴は、MMR欠損系に対するMMRに堪能な系における突然変異を誘発する化合物の高められた活性を測定するためのMMRに堪能な細胞およびコントロール系の使用を可能にする。化合物がMMRの真の阻害剤である場合、MMRに堪能な細胞では遺伝子突然変異が起こるはずであり、一方、すでにMMR欠損の細胞では「高められた」突然変異率は見出されない。これらの規準を用いて、哺乳動物細胞においてフレームシフト突然変異を誘発するICR191のような化学物質は、すでにMMR欠損の細胞系において高められた突然変異率をもたらすその能力のためにMMR阻害化合物とみなされない(Chen,W.D.,et al.J Natl Cancer Inst.(2000)92:480−485)。これらのスクリーニング系には、実施例1に記述するもののような優性ネガティブMMR遺伝子が導入されているものもしくは記述されているように(Chen,W.D.,et al.J Natl Cancer Inst.(2000)92:480−485)HCT116のような生来MMR欠損の細胞が相補MMR遺伝子の導入によって回復されているものが包含されるがこれらに限定されるものではない。
実施例4:インビボにおけるMMRの化学阻害剤の同定
MMRは、細胞分裂後に反復配列における点突然変異および挿入/欠失を修復する保存された複製後DNA修復機構である。MMRは、開始複合体認識およびDNA転座にATPアーゼ活性を必要とする。インビボアッセイにより、AMP−PNPおよびATP[ガンマ]SのようなATPの非加水分解性形態の使用はMMR活性を阻害することが示されている(Galio,L.et al.(1999)Nucl.Acids Res.27:2325−2331:Allen,D.J.et al.(1997)EMBO J.16:4467−4476;Bjornson K.P.et al.(2000)Biochem.39:3176−3183)。
ミスマッチ修復の生化学アッセイ
酵素修復アッセイ:
核抽出物におけるMMR活性は、24fmolの基質を用いて、記述されているように実施する(Nicolaides,N.C.et al.(1998)Mol.Cell.Biol.18:1635−1641)。相補性アッセイは、100μgの核抽出物に〜100ngの精製されたMutLaもしくはMutSa成分を加え、最終KCl濃度を100mMに調整することにより行う(Nicolaides,N.C.et al.(1998)Mol.Cell.Biol.18:1635−1641)。これらの実験に使用する基質は、ミスマッチの181ヌクレオチド5’もしくは125ヌクレオチド3’に鎖切断を含有する。
生化学活性アッセイ:
MMRタンパク質に対する小分子の直接的影響を実証するために、ミスマッチ結合およびMMR複合体形成のような分子アッセイを薬剤の有無で行う。簡潔に言えば、以前に記述されているように(Nicolaides,N.C.et al.(1998)Mol.Cell.Biol.18:1635−1641)T7プロモーターおよびコザック翻訳シグナルを含有するセンスプライマーと任意の種からの既知のMMRタンパク質MSH2(配列番号:20)、GTBP(配列番号:26)、MLH1(配列番号:22)、ヒトPMS2(配列番号:16)、マウスPMS2(配列番号:14)、PMS1(配列番号:18)およびMHS3((配列番号:28)の全コーディング領域を包含するプライマーを用いてMMR遺伝子cDNAをPCR増幅する。既知のMMRタンパク質のコーディング領域には、マウスPMS2(配列番号:15)、ヒトPMS2(配列番号:17)、ヒトPMS1(配列番号:19)、ヒトMSH2(配列番号:21)、ヒトMLH1(配列番号:23)およびヒトMSH3(配列番号:29)の表3に示す配列が包含される。TNT系(Promega)を用いて生成物を転写しそして翻訳する。PCRプライマーおよびインビトロ転写−翻訳反応の例を以下に記載する。
インビトロ転写−翻訳:
hPMS2(配列番号:17)およびhMLH1(配列番号:23)cDNA配列を含有する線状DNAフラグメントをPCRによって製造し、インビトロ転写および翻訳のための配列をセンスプライマーに導入した。全長hMLH1フラグメントは、野生型hMLH1 cDNAクローンを鋳型として用いて、センスプライマー5’−ggatcctaatacgactcactatagggagaccaccatgtcgttcgtggcaggg−3’(配列番号:1)(コドン1−6)およびアンチセンスプライマー5’−taagtcttaagtgctaccaac−3’(配列番号:2)(3’非翻訳領域、nt2411−2433に位置する)を用いて製造した。全長hPMS2フラグメントは、クローン化されたhPMS2 cDNAを鋳型として用いて、センスプライマー5’−ggatcctaatacgactcactatagggagaccaccatggaacaattgcctgcgg−3’(配列番号:3)(コドン1−6)およびアンチセンスプライマー5’−aggttagtgaagactctgtc−3’(配列番号:4)(3’非翻訳領域、nt2670−2690に位置する)を用いて製造した。これらのフラグメントを共役転写−翻訳系(Promega)によってタンパク質を生産するために用いた。反応物に35Sで標識したメチオニンもしくは標識していないメチオニンを補足した。低分子量のバンドは、分解産物および/もしくは代わりの内部メチオニンから翻訳されたポリペプチドであると推測される。
免疫沈降:
免疫沈降は、400μlのEBCバッファー(50mM Tris,pH7.5,0.1M NaCl,0.5% NP40)において1μgのMLH1特異的モノクローナル抗体(mAB)MLH14(Oncogene Science,Inc.)、上記のhPMS2のコドン2−20に対して作製したポリクローナル抗体、もしくはhPMS2のコドン843−862に対して作製したポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)と翻訳反応物とを混合することによってインビトロ翻訳タンパク質に対して行う。4℃で1時間インキュベーション後に、プロテインAセファロース(Sigma)を10%の最終濃度に加え、そして反応物を4℃で1時間インキュベーションする。プロテインAに結合したタンパク質をEBCにおいて5回洗浄し、そして4−20% Tris−グリシンゲル上で電気泳動によって分離し、次にこれらを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーを行う。
実施例5:化学MMR阻害剤の使用は、ヒト細胞においてマイクロサテライト不安定性をもたらす
宿主細胞および生物体におけるMMRの化学阻害剤の広範囲の能力を実証するために、ヒトHEK293細胞(293細胞と称する)をDMAで処理し、そしてBAT26診断マーカー(Hoang J.M.et al.(1997)Cancer Res.57:300−303)を用いて内因性遺伝子座のマイクロサテライト不安定性に関して測定した。簡潔に言えば、105個の細胞をコントロール培地もしくは無毒であることが判明している濃度の50μMのDMAにおいて14〜17日間増やした。次に、細胞を採取し、そして塩析法(Nicolaides,N.C.et al.(1991)Mol.Cell.Biol.11:6166−6176)を用いてゲノムDNAを単離する。
実施例6:MMRの化学阻害剤は、植物におけるDNA超突然変異性および新しい表現型をもたらす。
nga280:
nga280−F:5’−CTGATCTCACGGACAATAGTGC−3’(配列番号:5)
nga280−R:5’−GGCTCCATAAAAAGTGCACC−3’(配列番号:6)
nga128:
nga128−F:5’−GGTCTGTTGATGTCGTAAGTCG−3’(配列番号:7)
nga128−R:5’−ATCTTGAAACCTTTAGGGAGGG−3’(配列番号:8)
ATHACS:
ATHACS−F:5’−AGAAGTTTAGACAGGTAC−3’ (配列番号:9)
ATHACS−R:5’−AAATGTGCAATTGCCTTC−3’ (配列番号:10)
サイクリング条件は、これら2つのマーカーを効率よく増幅することが実証されている条件(個人的観察、Morphotek)、94℃15秒間、55℃15秒間そして72℃30秒間である。PCR産物をTris−アセテート−EDTAバッファーにおいて3.5%メタファー(metaphor)アガロースゲル上で分析し、続いて臭化エチジウムで染色する。
1.pGUS−IFのセンスプライマー(uidA−ATG−ポリA−IF):
5’−CCC GGA TCC ATG TTA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CGT CCT GTA GAA ACC−3’(配列番号:11)
2.pGUS−OFのセンスプライマー(uidA−ATG−ポリA−OF):
5’−CCC GGA TCC ATG TTA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACG TCC TGT AGA AAC C−3’(配列番号:12)
3.アンチセンスプライマー(Nos−term):
5’−CCC GAA TTC CCC GAT CTA GTA ACA TAG ATG−3’(配列番号:13)
である。
GUSレポーターを発現するアラビドプシス・サリアナトランスジェニック植物の作製
植物にバイナリー発現ベクターを往復させるためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)細菌を用いる。β−グルクロニダーゼを発現するアラビドプシス・サリアナ(A.thaliana)植物を作製するために、当業者が既知である方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞(株GV3101)をCMV−OF−GUS−HPTもしくはCMV−IF−GUS−HPTバイナリーベクターで電気穿孔した。簡潔に言えば、5%ショ糖、0.05%シルウェット(silwet)およびバイナリーベクターで形質転換したアグロバクテリウム細胞を含有する溶液に10秒間浸すことによって一ヶ月齢のアラビドプシス・サリアナ(生態型コロンビア)植物を感染させた。次に、これらの植物を16時間の昼および8時間の闇の光周期下で25℃で育てた。4週後に、種子(T1と称する)を採取し、そして5日間乾燥させた。CMV−OF−GUS−HPTもしくはCMV−IF−GUS−HPTで形質転換した10植物からの30,000個の種子を20μg/mlのハイグロマイシン(HYG)の存在下で固体ムラシゲ・スクーグ(MS)培地プレートにまいた。300の植物がHYG耐性であることが見出され、そしてGUSを発現する植物に相当した。これらの植物を300のコントロール植物と一緒にMS培地において2週間育て、そして次に土壌に移した。植物を標準的な条件下でさらに4週間育て、この時点でT2種子を採取した。
実施例7:化学MMR阻害剤の使用は、微生物におけるマイクロサテライト不安定性をもたらす。
実施例8:インビボでMMRを阻害することができる他の化学物質の種類
アントラセン化合物の発見は、インビボで宿主生物体のMMR活性を阻害する新しい方法を提示する。9,10−ジメチルアントラセン(DMA)は、細胞宿主においてMMRを阻害することが見出されたが、この種類からの同様の化学組成を有する他の類似体もまた本発明において請求する。これらには、アントラセン並びに9,10−ジフェニルアントラセンおよび9,10−ジ−M−トリルアントラセンのような関連類似体が包含される。Myers et al.((1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.151:1441−1445)は、高濃度で、DMAは有力な弱い突然変異誘発物質として働き、一方、DMAの代謝された形態は突然変異を促進することにおいて「有効な」成分であることを開示した。この発見は、アントラセンに基づく化合物の代謝産物もまたインビボでMMRの有効な阻害剤として働き得ることを示唆する。例えば、ミクロコッカス種(Micrococcus sp.)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)およびバチルス・マセランス(Bacillus macerans)微生物によるアントラセンおよび9,10−ジメチルアントラセンの代謝により、多数のアントラセンおよび9,10−ジメチルアントラセン代謝産物が形成されることが見出されている。これらには、アントラセン並びに9,10−ジメチルアントラセンシス−ジヒドロジオール、ヒドロキシ−メチル誘導体および様々なフェノール化合物が包含される。細菌は、哺乳動物のシトクロムP−450モノオキシゲナーゼと異なるジオキシゲナーゼ酵素系を用いて炭化水素を代謝する。これらの発見は、さらなるMMR阻害化合物のためのアントラセンおよびDMAを生体内変化させる細菌の使用を示唆する(Traczewska,T.M.et al.(1991)Acta.Microbiol.Pol.40:235−241)。ラット肝臓ミクロソーム調製物によるDMAの代謝研究により、この分子は9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン(9−OHMeMA)および9,10−ジヒドロキシメチル−アントラセン(9,10−DiOHMeA)に転化されることが見出されている(Lamparczyk,H.S.et al.(1984)Carcinogenesis 5:1405−1410)。さらに、DMAのトランス−1,2−ジヒドロ−1,2−ジヒドロキシ誘導体(DMA1,2−ジオール)は、クロマトグラフィー、紫外線(UV)、核磁気共鳴(NMR)および質量スペクトル性質によって決定する場合に主要な代謝産物であることが見いだされた。DMA1,2−ジオールはまた、アスコルビン酸−硫酸鉄−EDTA系におけるDMAの酸化によっても生じた。代謝によりDMAから形成される他のジヒドロジオールは、9−OHMeMAのトランス−1,2−および3,4−ジヒドロジオール(9−OHMeMA1,2−ジオールおよび9−OHMeMA3,4−ジオール)であり、一方、DMA1,2−ジオールのさらなる代謝はこれらのジヒドロジオールの両方をもたらすことができる。最後に、9−OHMeMAがさらに代謝されると、2種の主要な代謝産物が形成され;一方は9,10−DiOHMeAと同定され、そしてもう一方は9−OHMeMA3,4−ジオールであるようであった。
インビボでMMRを阻害することができる低分子量化合物の他の種類
MMRは、ミスマッチ塩基もしくは改変された反復配列を見つけ、そして突然変異体塩基を分解しそして正しいヌクレオチドでDNAを修復する酵素とこれらの突然変異とを連結するタンパク質複合体の形成を伴う多段階プロセスである。第一に、ミスマッチDNAは、MSH2およびGTBPタンパク質からなるmutSへテロ二量体複合体によって認識される。次に、DNAに結合したmutS複合体は、PMS2およびMLH1タンパク質からなるmutLへテロ二量体複合体によって認識される。mutL複合体は、ミスマッチDNA部位とエキソヌクレアーゼとを連結し、このようにして、この特殊化したDNA修復プロセスを開始すると考えられる。ミスマッチ塩基が取り除かれた後、DNAはポリメラーゼで修復される。
ATPアーゼ阻害剤:
ATPの非加水分解性形態はインビトロでMMRを抑制することができるという発見もまた、このタイプの化合物の使用がインビボにおけるMMRの阻害および宿主生物体のゲノムの変異変異をもたらすことができることを示唆する(Galio,L.et al.(1999)Nucl.Acids Res.27:2325−2331;Allen,D.J.et al.(1997)EMBO J.16:4467−4476;Bjornson,K.P.et al.(2000)Biochem.39:3176−3183)。インビボでミスマッチ修復のATP依存性工程を阻害するATP類似体を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。
ヌクレアーゼ阻害剤:
ミスマッチ塩基の除去は、有効なMMRに必要とされる工程である(Harfe,B.D.and S.Jinks−Robertson(2000)Ann.Rev.Genet.34:359−399)。これは、この工程を阻害することができる化合物がインビボにおけるMMRの阻害および宿主生物体のゲノムの突然変異をもたらすことができることを示唆する。インビボでミスマッチ修復のヌクレアーゼ工程を阻害するヌクレアーゼ阻害剤類似体を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。ヌクレアーゼ阻害剤のタイプの例は、N−エチルマレイミドの類似体、エンドヌクレアーゼ阻害剤(Huang,Y.C.et al.(1995)Arch.Biochem.Biophys.316:485)、ヘテロダイマー型アデニン−チェーン−アクリジン化合物、エキソヌクレアーゼIII阻害剤(Belmont,P.et al.,Bioorg Med Chem Lett(2000)10:293−295)、並びにヘリカーゼ阻害活性を有する(Chino,M,et al.J.Antibiot.(Tokyo)(1998)51:480−486)ヘリキノマイシンのような抗生物質化合物であるが、これらに限定されるものではない。
ポリメラーゼ阻害剤:
短いおよび長いパッチ修復は、有効なMMRに必要とされる工程である(Modrich,P.(1994)Science 266:1959−1960)。これは、MMRに関連する重合を阻害することができる化合物がインビボにおけるMMRの阻害および宿主生物体のゲノムの突然変異をもたらすことができることを示唆する。インビボでミスマッチ修復の重合工程を阻害するポリメラーゼ阻害剤類似体を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。MMR活性を阻害することにおいて有用なDNAポリメラーゼ阻害剤の例には、アクチノマイシンD(Martin,S.J.,et al.(1990)J.Immunol.145:1859)、アフィジコリン(Kuwakado,K.et al.(1993)Biochem,Pharmacol.46:1909)の類似体、1−(2’−デオキシ−2’−フルオロ−ベータ−L−アラビノフラノシル)−5−メチルウラシル(L−FMAU)(Kukhanova M,et al.,Biochem.Pharmacol(1998)55:1181−1187)、および2’,3’―ジデオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸(ddNTPs)(Ono,K.,et al.,Biomed Pharmacother(1984)38:382−389)が包含されるが、これらに限定されるものではない。
ミスマッチ修復遺伝子発現の化学阻害剤
MMRは、mutS相同物、MSH2、MSH3、MSH6、GTBP;mutL相同物、PMS1、PMS2、MLH1;並びにMutHおよびMutYのようなエキソヌクレアーゼおよびヘリカーゼのようなしかしこれらに限定されるものではないいくつかのタンパク質の協調を必要とする複数タンパク質プロセスである(Harfe,B.D.and S.Jinks−Robertson(2000)Ann.Rev.Genet.34:359−399;Modrich,P.(1994)Science 266:1959−1960)。これらの遺伝子の発現を阻害することができる化学物質は、MMRの阻害をもたらすことができる。MMR遺伝子発現を阻害することができる化学物質の例は、Chauhan DP,et al.(Clin Cancer Res(2000)6:3827−3831)によって記述されているようなMMR遺伝子メッセージおよびタンパク質生産に特異的に結合しそして壊すことができるオリゴデオキシヌクレオチドである。インビボでMMR遺伝子の発現および/もしくは機能を阻害する阻害剤を同定するために本願内に記述する様々なスクリーニング方法を用いることができる。
説明
本明細書に記述する結果は、遺伝子突然変異をもたらすためのインビボで宿主生物体のミスマッチ修復を阻害することができる化学物質の使用を実証する。これらの結果はまた、宿主生物体のMMRを阻害することができる化学物質をスクリーニングすることに有用な宿主細胞および生物体におけるレポーター系の使用も実証する。さらに、これらの結果は、新しいアウトプット形質を有する生物体を製造するための哺乳動物細胞、微生物および植物におけるMMRを阻害する化学阻害剤の使用を実証する。本明細書に提示するデータは、化学物質でMMRを阻害することによって商業用途のためのアウトプット形質を有する遺伝子的に改変された植物、微生物および哺乳動物細胞を製造する新規な方法を提供する。この方法は、MMRを阻害するためにもしくは外来遺伝子の発現によって新しいアウトプット形質をもたらすために組換え技術の使用を必要とするものより優れた利点を与える。
Claims (71)
- 細胞をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことを含んでなる超突然変異性(hypermutable)細胞を製造する方法であって、ここで、該阻害剤がアントラセン、ATPアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、もしくはミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである方法。
- 該阻害剤がアントラセンである請求項1の方法。
- 該アントラセンが式:
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも1個のヘテロ原子を含有し;そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、CN、NO2、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり;
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または1〜3個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよい、
を有する請求項2の方法。 - R5およびR6が水素である請求項3の方法。
- R1−R10が独立して水素、ヒドロキシル、アルキル、アリール、アリールアルキルもしくはヒドロキシアルキルである請求項3の方法。
- R1−R10が独立して水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トリル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルもしくはヒドロキシブチルである請求項3の方法。
- 該アントラセンが1,2−ジメチルアントラセン、9,10−ジメチルアントラセン、7,8−ジメチルアントラセン、9,10−ジフェニルアントラセン、9,10−ジヒドロキシメチルアントラセン、9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−1,2−ジオール、9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン−1,2−ジオール、9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン−3,4−ジオールおよび9,10−ジ−m−トリアントラセンよりなる群から選択される請求項3の方法。
- R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9およびR10が水素である請求項3の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が水素である請求項3の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が水素である請求項3の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9およびR10が水素である請求項3の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が水素である請求項3の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR10が水素である請求項3の方法。
- 該ATPアーゼ阻害剤がAMP−PNPのようなATPの非加水分解性形態である請求項1の方法。
- 該ヌクレアーゼ阻害剤がN−エチルマレイミドの類似体、ヘテロダイマー型のアデニン−チェーン−アクリジン(adenine−chain−acridine)化合物、もしくはヘリキノマイシン(Heliquinomycin)のようなキニロンである請求項1の方法。
- 該ポリメラーゼ阻害剤がアフィジコリンの類似体、1−(2’−デオキシ−2’−フルオロ−ベータ−L−アラビノフラノシル)−5−メチルウラシル(L−FMAU)もしくは2’,3’−ジデオキシリボヌクレオシド5’−三リン酸である請求項1の方法。
- 該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ミスマッチ修復タンパク質のコーディング鎖に相補的な約15個の連続したヌクレオチドを含んでなり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが生理的条件下で該ミスマッチ修復タンパク質の該コーディング鎖に特異的に結合し、そして該ミスマッチ修復タンパク質のミスマッチ修復活性を阻害する請求項1の方法。
- 該アンチセンスオリゴヌクレオチドが該ミスマッチ修復タンパク質の該コーディング鎖上の調節部分に特異的に結合する請求項17の方法。
- 該アンチセンスオリゴヌクレオチドがMMR遺伝子メッセージの最初の6個のコドンに対して向けられる請求項17の方法。
- ミスマッチ修復の該阻害剤がインビトロで真核細胞の増殖培地に導入される請求項1の方法。
- ミスマッチ修復の該阻害剤がインビトロで原核細胞の増殖培地に導入される請求項1の方法。
- ミスマッチ修復の該阻害剤が植物の成長培地に導入される請求項1の方法。
- 対象遺伝子を含んでなる細胞を化学ミスマッチ修復阻害剤にさらすことおよび該対象遺伝子が突然変異を含んでなるかどうかを決定するために該細胞を試験することを含んでなる対象遺伝子における突然変異を生成する方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項23の方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項23の方法。
- 該試験することが、該細胞の表現型を分析することを含んでなる請求項23の方法。
- 該細胞が哺乳動物細胞であり、そして該哺乳動物細胞をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことによって該哺乳動物細胞をミスマッチ修復欠損にする請求項23の方法。
- 該対象遺伝子が突然変異を含んでなることを決定した後にミスマッチ修復の化学阻害剤(chemical inhibitor)を取り除くことをさらに含んでなる請求項27の方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項27の方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項27の方法。
- 該試験することが、該細胞の表現型を分析することを含んでなる請求項27の方法。
- 動物をミスマッチ修復の化学阻害剤にさらすことおよび対象遺伝子が突然変異を含んでなるかどうかを決定するために該動物を試験することを含んでなる対象遺伝子における突然変異を生成する方法。
- 該動物が哺乳動物である請求項32の方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項32の方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項32の方法。
- 該試験することが、該細胞の表現型を分析することを含んでなる請求項32の方法。
- 該哺乳動物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことによって該哺乳動物をミスマッチ修復欠損にする請求項33の方法。
- 該対象遺伝子が突然変異を含んでなることを決定した後にミスマッチ修復の該阻害剤を取り除くことをさらに含んでなる請求項37の方法。
- 請求項33の方法によって作製される超突然変異性トランスジェニック哺乳動物。
- 植物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことを含んでなるミスマッチ修復欠損植物を作製する方法。
- 対象遺伝子を含んでなる植物を育てること、該植物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすこと、および該対象遺伝子が突然変異を含んでなるかどうかを決定するために該植物を試験することを含んでなる対象遺伝子における突然変異を生成する方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子のポリヌクレオチド配列を分析することを含んでなる請求項41の方法。
- 該試験することが、該対象遺伝子によってコードされるタンパク質を分析することを含んでなる請求項41の方法。
- 該試験することが、該植物の表現型を分析することを含んでなる請求項41の方法。
- 該植物をミスマッチ修復の阻害剤にさらすことによって該植物をミスマッチ修復欠損にする請求項41の方法。
- 請求項40の方法によって作製される超突然変異性植物。
- 該植物が単子葉植物である請求項46の植物。
- 該植物が双子葉植物である請求項46の植物。
- 生物体を候補化合物にさらすことおよびマイクロサテライト不安定性に関して該生物体のDNAをスクリーニングすることを含んでなるミスマッチ修復の化学阻害剤をスクリーニングする方法。
- 該生物体が哺乳動物である請求項49の方法。
- 該生物体が微生物である請求項49の方法。
- 該生物体が植物である請求項49の方法。
- 該スクリーニングが、内在性マイクロサテライトをモニターすることを含んでなる請求項49の方法。
- 該スクリーニングがレポーター発現遺伝子の使用を含んでなり、該レポーター発現遺伝子が該レポーター遺伝子のコーディング領域内にポリヌクレオチド反復を含んでなる請求項49の方法。
- 該レポーター遺伝子がβ−グルクロニダーゼである請求項54の方法。
- 細胞をアントラセン化合物にさらすことを含んでなるインビボでミスマッチ修復活性を阻害する方法。
- 該アントラセンが式:
ここで、該ヘテロアルキル、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールは、酸素、硫黄、金属原子、リン、ケイ素もしくは窒素である少なくとも1個のヘテロ原子を含有し;そして
ここで、該置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールの該置換基は、ハロゲン、CN、NO2、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルキルオキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり;
そしてここで、該アミノ基はアシル基、または1〜3個のアリールもしくは低級アルキル基で場合により置換されていてもよい、
を含んでなる請求項56の方法。 - R5およびR6が水素である請求項57の方法。
- R1−R10が独立して水素、ヒドロキシル、アルキル、アリール、アリールアルキルもしくはヒドロキシアルキルである請求項57の方法。
- R1−R10が独立して水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トリル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルもしくはヒドロキシブチルである請求項57の方法。
- 該アントラセンが1,2−ジメチルアントラセン、9,10−ジメチルアントラセン、7,8−ジメチルアントラセン、9,10−ジフェニルアントラセン、9,10−ジヒドロキシメチルアントラセン、9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−1,2−ジオール、9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン−1,2−ジオール、9−ヒドロキシメチル−10−メチルアントラセン−3,4−ジオールおよび9,10−ジ−m−トリアントラセンよりなる群から選択される請求項57の方法。
- R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9およびR10が水素である請求項57の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が水素である請求項57の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が水素である請求項57の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9およびR10が水素である請求項57の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が水素である請求項57の方法。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR10が水素である請求項57の方法。
- 該細胞を突然変異誘発物質にさらすことをさらに含んでなる請求項23の方法。
- 該動物を突然変異誘発物質にさらすことをさらに含んでなる請求項32の方法。
- 該突然変異誘発物質がN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸、ジメチルスルホン酸、O−6−メチルベンザジン、エチルメタンスルホン酸、メチルニトロソ尿素およびエチルニトロソ尿素よりなる群から選択される請求項68もしくは69の方法。
- 化学物質が、MMRに堪能な(proficient)細胞ではマイクロサテライト不安定性を誘発するがMMR欠損細胞では高められたマイクロサテライト不安定性を誘発しないMMR阻害剤である請求項49の方法。
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WO2006099141A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Morphotek, Inc. | Anti-mesothelin antibodies |
CA2607455A1 (en) | 2005-04-22 | 2006-11-02 | Morphotek, Inc. | Antibodies with immune effector activity and that internalize in endosialin-positive cells |
AU2006241099B2 (en) | 2005-04-22 | 2012-04-19 | Eisai, Inc. | Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells |
AU2008237296B2 (en) | 2007-04-05 | 2013-07-04 | Eisai, Inc. | Methods for inhibiting the binding of endosialin to ligands |
WO2010074562A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Keygene N.V. | Use of double stranded rna to increase the efficiency of targeted gene alteration in plant protoplasts |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2240609C (en) * | 1998-04-14 | 2009-02-03 | The Johns Hopkins University | A method for generating hypermutable organisms |
Family Cites Families (3)
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US6191268B1 (en) * | 1993-12-17 | 2001-02-20 | Dana-Farber Cancer Institute | Compositions and methods relating to DNA mismatch repair genes |
US5907079A (en) * | 1996-01-18 | 1999-05-25 | Amgen Canada Inc. | MSH2 disrupted mice develop lymphomas |
AUPO974597A0 (en) * | 1997-10-10 | 1997-11-06 | Rhone-Poulenc Agro | Methods for obtaining plant varieties |
-
2001
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Patent Citations (1)
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