JP2005509170A - 分析を行うための粒子を調整するための装置および方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】その後の検査のために、基板上に粒子、例えば細胞を置くための装置（１）において、前記装置は、多孔性基板（１１７）と、前記粒子を含有する流体のサンプルを前記多孔性基板（１１７）に配送するための配送手段とを備え、前記配送手段は、流体のための注入口（６、７ａ、７ｂ、７ｃ）と、前記注入口から前記多孔性基板（１１７）に向かう第１の方向に沿って延在する通路（１１）とを備え、前記通路（１１）は、一般に前記基板（１１７）に向かう第１の方向に沿って前記流体を流し、さらに前記第１の方向に対して横方向に前記流体を拡げるように配置されている。

Description

本発明は、分析を目的とした、流体媒質からの粒子状物質の抽出に関する。特に、本発明は、粒子状物質、特に細胞を、検査のための基板上で調整する装置および方法に関する。

サンプルは、通常、診断に用いるため、人間や動物の組織や体液より取り出される。一定のサンプルが顕微鏡用のガラスまたはプラスチック製のスライド上で調整され、その後、顕微鏡により視覚的に検査される。特に集団検診プログラムの場合には、検査室は多数のサンプルを検査する責任を負う。このような検査は、熟練者によって実行されなければならないが、本質的にはある程度主観的であり、また大きな労働力を要し、その性質からして人間の誤りを生じ易い。

細胞学的検査に依存する重要な領域の一つとして、女性の子宮頸部の癌検診がある。現在、子宮頸癌および前癌状態の検出は、パパニコローまたはＰＡＰテスト（“子宮頸部の塗抹標本試験”として広く知られている）を用いて行われており、子宮頸部より採取されたサンプルまたは塗抹標本をスライド上に注ぐ。その細胞は、適当な染料を用いて染色されており、正常かどうかを評価するために検査される。正常な塗抹標本と異常な塗抹標本を識別するという高度に熟練した作業の効率は、現状では、多くの不適切なスライドによって制限されて、診断に対する有効な基礎を形成することができない。例えば、患者から採取されたサンプルが子宮頸部の開口部の外側（子宮頸外部）に位置する偏平上皮からの細胞を含むだけではなく、子宮頸管（子宮頸内膜）に及ぶ円柱上皮からの細胞と、子宮頸外部と子宮頸内膜との間の移行帯からの細胞とを含んでいるかどうかを確かめることを目的とする。悪性腫瘍の多くは、扁平円柱上皮境界の周辺で発生しており、サンプルにおける円柱細胞と移行帯の細胞の存在は、扁平円柱上皮境界が有効にサンプルされたことを示すと考えられる。円柱細胞および移行帯細胞が観察されないか、または不十分な数でしか観察されないスライドは不適当であると考えられる。

他のスライドは、細胞が少な過ぎるかまたは多すぎることにより、または非診断対象の物質が診断対象の物質を分かりにくくするように、サンプルがスライドに正常に注がれないため、不適当とされることがある。

不適当なスライドは、視覚的検査を受ける時に確認されるのみであり、その結果、貴重な資源が浪費されることになる。

細胞学的検査の使用に伴い、現在行われている他の診断技術は、乳癌検診、甲状腺、肺または卵巣の癌に対する検診、および体液例えば唾液、胸膜や腹膜の流体、および血液の検査を含んでいる。

本発明は、粒子を基板上に置くための装置を提供し、該装置は、多孔性基板と、前記粒子を含む流体のサンプルを前記多孔性基板に配送するための配送手段とを備えており、前記配送手段は前記流体の注入口と、前記注入口から前記多孔性基板に向かう第一の方向に沿って延在する通路とを備えており、前記通路は、前記流体の流れを略第一の方向に沿って前記基板に向かうようにし、さらに前記流体の広がりを前記第一の方向に対して横方向となるように配置されている。

本発明は、後に続く光学的検査のため粒子の層を調整する装置を提供し、該装置は、スライド部材を備え、少なくとも実質的に平面状の上面が前記スライド部材の一部内で、また該一部に沿って実質的に水平に延在する多孔性基板を含む流路配列を前記スライド部材が包囲しており、前記流路配列は、さらに前記粒子を含む流体サンプルの注入口と、前記多孔性基板の前記上面への前記サンプルの配送のための前記注入口から延在する通路とを備えている。

本発明の装置は、粒子が浮遊している流体から該粒子を分離するようにし、前記粒子の薄い皮膜を運ぶ基板の調整を可能にするものである。特に、本発明の装置は、相対的に少量の流体を相対的に大きな面積の基板に接触させるようにすることが可能である。この装置によって、容易に、しかも自動的に走査可能な装填領域を有する装填された基板を発生することが可能となる。面積がより大きい基板を装填する際に発生し得る細胞の浪費を回避することも可能である。この装置により、実質的に単層に、比較的均一に、しかも都合良く細胞を置くことが可能となる。

当然のことながら、「水平に」や「上方の」という用語は、使用する際の装置とのからみで使われているものである。

粒子は適宜の標識によって印をつけた装置で使用するのが好ましく、この装置がどのような好適な視覚化技術によっても検査可能な装填基板を生成することができれば、それによって、多様な方法の中の少なくとも一つの方法で、粒子の検査、評価または特徴付けが可能になる。

ここで用いる「視覚化技術」は、光学器械、例えば光学顕微鏡を用いる技術や、ＵＶ走査、電子顕微鏡使用、写真および色識別技術等の好適な放射形態を用いた他の技術の両方を含む。

臨床領域では、本発明の装置により、採取した細胞のサンプルが適性であるかどうかに対する簡単で信頼のおける試験を行うことが可能となり、またこの試験は、従来、細胞学的検査に必要であった専門家が関与することなく迅速に行うことができる。この結果、適正でないサンプルに起因する資源の浪費を実質的に低減することが可能となる。さらに、多くの場合、例えば子宮頸癌の検診においては、サンプルを提供する患者がいる間に、サンプルの適性を評価することが可能となる。サンプルが適正でない場合には、患者を呼び戻すことなく新たな細胞を採取することが可能となり、それによって、原則として、サンプルが異常であるかどうかをより早い時期に評価することが可能となり、好適な専門家によるさらなる検査が適当であるかどうかを早めに指示することが可能となる。適正についての迅速で簡単な試験が可能となることにより、特に臨床スタッフの訓練を援助して効果的に塗抹標本を採取することが可能となるが、本発明の装置は、基本的には、子宮頸部細胞の異常を検診する基準を設け、現在広く用いられているＰＡＰテストを補うか、またはそれに取って代わることが可能になると考えられる。

本発明の装置の使用が特に考えられる他の臨床領域は、血球計算、乳癌検診、甲状腺、肺または卵巣の癌に対する検診、および体液、例えば唾液、胸膜や腹膜の流体、および血液の検査を含んでいる。しかし、この装置は、臨床上関連する情報が人間または動物の細胞から得られるどのような臨床領域においても使用することが可能である。

この装置はまた、非臨床領域、例えばポリマー製造、食品製造（例えば小麦やジャガイモの澱粉食品の分析）、飲料水製造（例えば酵母菌の生育性の分析）、製薬産業（例えば細胞の生育性の分析）、石油化学産業、様々な製造工程や廃物処理における濾過方法における粒子の除去の有効性のモニタリング、土壌、鉱物、鉱石および地熱流体の分析、並びに水（例えば、藻、プランクトンおよび海洋沈殿物の懸濁液）の分析における品質管理にも使用できる。一般に、この装置は、粒径２ｍｍ以下の粒子を、それらが浮遊している流体から分離するのに適する。しかし、多くの場合には、分離される粒子は、より小さく、例えば５０μｍ以下である。

好適には、通路の少なくとも一部を外向きに広がるようにする。通路は、サンプルを配送するために多孔性基板と通じる流出口を備え、少なくとも、該流出口の付近の通路部分が外向きに広がっているのが好ましい。

好適には、多孔性基板を装置の上面に実質的に平行に延在させれば、その配置によって、通路がサンプルを上から多孔性基板に配送することが可能となる。この配置によって、上面から基板がより良く観察できるようになるという点で都合良い。そのために、当然のことながら、上面の全ての部分ではなく、単に基板付近の部分が基板に対して平行であることが重要である。少なくとも基板付近では、平行な上面の光透過率が優れていることが好ましい。

多孔性基板は、好適な観察装置では、実質的に水平に置くことが望ましい。

もし過剰な圧力が流体にかからないならば、実質的に水平な表面では、流体がその表面張力の影響で横方向に広がって、通路の広がり部分の幅を横切って延在し、少なくともその長さの大部分に沿って分岐した壁面と接触することがわかっている。

本発明の一形態では、流体は、装置に侵入し、装置の注入口に押さえつけられている流体サンプルの多量の残存物によって加わる力で装置を通過する。これにより、細胞を置くための装置を使用する際に、外圧を加えることが不必要であることがわかっている。しかし、望ましい場合または必要に応じて、正または負の圧力を加えることにより装置を介して流体を搬送することも可能である。例えば、多孔性基板の孔の大きさおよび／または数が小さい場合、流体内の粒子の大きさおよび／または濃度が高い場合、または粒子が多量に集積することになる場合に、このような印加圧力がサンプルに好ましいか、または必要となる可能性もある。

上記のように、配送手段において流体が通過する通路は、少なくとも外向きに広がる部分を備えている。この配置は、通路の壁面が各々、通路の縦軸に対して少なくとも４０°の角度で外向きに延在するのが好ましく、すなわち２つの広がった壁面に対する角度は、少なくとも８０°であってもよい。実際、広がりの角度は、装置の動作を損なうことなく広範囲に亘って変化することが可能であることがわかっている。しかし、一般には、２つの広がった壁面のなす角度は１６０°以下となる。

ここで使われている「広がった」という用語は、その各々が直線である分岐壁面を有するために広がっている配置と、一直線ではない、例えば曲線であるか、または各々が連続せずに分離している２つ以上の部分（その各々は直線または曲線であってもよい）分岐壁面を有するために広がっている配置との両方を含んでいる。

通路の広がり部分の長さは、装置の用途次第である。その長さは、一般に５ｃｍ以下である。細胞を置くために使用する装置に対しては、３ｃｍ以下、例えば、１ｃｍから３ｃｍまでが好適である。

広がりの適当な角度および長さは、装置で使用する流体および粒子の性質や、粒子が配送される多孔性基板の形状および寸法を顧慮する日常的な実験から選択されるものである。

流出口は、装置を使用する際に多孔性基板の上方に位置するのが好適である。該流出口は、装置を使用する際に多孔性基板の上方で、実質的に垂直に位置するのが好ましい。流体の通路は、多孔性基板に向けて延在する壁面を含み、それによって多孔性基板は、使用する際に壁面を介して通路から流れる流体を受けることが可能となるのが望ましい。壁面は、装置を使用する際に下向きに延在するのが好適である。好ましくは、該壁面は、横寸法よりも大きい縦寸法を有する長手形状であり、その縦寸法が壁面を下る流体の流れの方向に対して一般に左右方向に延びるように配置される。通路は、壁面で終端となる基部を備えるのが好適である。通路は、使用する際に流体が流れる方向に、通路の少なくとも一部に沿って互いに分岐する対向する側壁をさらに備えるのが好適である。配送手段は包囲されているのが好ましい。多孔性基板を通過した流体を受けるための排水容器を設けるのが好適である。この装置は、試薬が配送手段に配送可能である試薬配送チャネルをさらに備えるのが好適である。装置は、試薬がその各々を介して配送手段に配送可能な２個から６個の試薬配送チャネルを備えるのが好ましい。その、または各々の試薬配送チャネルは、試薬が装置に導入可能なそれぞれのアクセス開口部と通じるのが好適である。

細胞を置くための装置を使用する際に、細胞は、被検者である人間または動物から採取した他の随伴する内生物質と共に、組織学分野で良く知られた種類の固定試薬に導入することも可能である。典型的な固定試薬は、およそ４０：６０の比率でアルコールと水とを含有するものを含み、他の化合物の存在は任意である。本発明の装置を使用する際には、さらなる成分、例えば界面活性剤を含んでも良い。

さらに、細胞を置くための装置を使用する際には、基板に支持された細胞の評価を援助するための1個以上の物質が存在することも可能であり、例えば、この装置が選択的結合成分を備えても良く、その配置は、使用する際に流体が多孔性基板に配送される前に選択的結合成分に接触できるようなものである。選択的結合成分は、標的細胞の1個以上の集団に選択的に結合し、それによって標的細胞を基板上に存在する他の細胞と区別できる部分であるのが好ましい。使用できる選択的結合成分としては、特に抗体、とりわけ単クローン抗体を含み、さらには抗体断片、誘導体、抗体の機能的同等物および相同物を含む抗体と、抗原と、ホルモンと、１個以上の標的細胞を認識してそれに結合することが可能な他のタンパク質、または１個以上の標的細胞に対して特殊な結合能力を有する非タンパク質化合物とを含む。好適な成分としては、例えば、ＷＯ９８/０５９６７に記載されている免疫グロブリン結合ドメインを備えるいずれかのポリペプチドがある。

選択的結合成分は、装置を使用する際に多孔性基板に保持されている選択的に結合された結合成分の指示器として作用するための標識手段と組み合わされるのが好適である。これにより、選択的結合成分の反応性（およびこれに関連するサンプルの特徴、例えばある種の細胞の割合）をモニタすることが可能である。好適な標識手段は以下を含む：
（１） 分光的に明瞭な吸収および放出特性を有する染料（色素原）、例えば蛍光色素、蛍光体またはレーザー染料に結合すること。
（２） 粒子状物質、例えば、色づけされた磁性または常磁性のラテックスビーズ上で該成分を支持すること。
（３） 検出可能であり、且つ好ましくは測定可能である信号を直接または間接的に生成するレポータ分子で標識を付けること。レポータ分子は、共有または非共有結合により、結合成分に直接または間接的に結合してもよい。

上記（１）ないし（３）で述べた標識手段は、一般に、結合成分が装置に導入される前に結合成分と組み合わされる。選択的結合成分、例えば抗体を使用することによって、結合の量的評価が可能になり、それによって有益な診断情報を提供することができる。２個以上の望ましい選択的結合成分およびそれに関連するそれぞれの標識を使用する場合、その各々が異なる集団の標的細胞に結合するのに好適であり、しかも、その集団の標的細胞を互いに、また他の細胞からも区別することができる。好適な標識手段を選択すると、支持された細胞を有する基板の画像を記録し、これを保存し、その後、その結果を再評価することが可能となる。標識手段により、基板上の細胞の画像を好適な撮像手段を用いて走査することが可能であり、また好ましくは電子的に記憶することが可能となるのが望ましい。当然のことながら、基板を覆う装置の一部が、選り抜きの検査技術で利用されている放射線を伝達する物質から構成されるべきである。例えば、装置が顕微鏡の下で検査される場合、この装置は、少なくとも一部が光学的に適した材料で構成されるべきである。ポリカーボネートが好適な材料であることがわかっている。

支持された細胞の評価を援助するための選択的結合成分および他の物質、またはそのいずれかは、サンプルを導入する前に装置内に導入してもよい。例えば、それらは装置の製造中に装置内に導入されてもよい。その場合、上記試薬配送チャネルに導入してもよい。上記に加えてまたは上記に代えて、結合成分または他の物質を、サンプルと同時に、またその後、いずれかの時期に装置内に導入することも可能である。

一般に、この装置は、２０ｍｌ以下の全内部空隙量を有することになる。この装置は、４ｍｌ以下の全内部空隙量を有するのが好適である。多孔性基板よりも装置上流の内部空隙量は１ｍｌ以下であるのが好ましく、さらに０．５ｍｌ以下であるのが好ましい。さらに好ましくは、多孔性基板よりも装置上流の内部空隙量は０．４ｍｌ以下である。配送手段は、１０ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ以上の幅の流出口を備えるのが都合良い。配送手段の流出口は、４ｍｍ以下、好ましくは３ｍｍ以下の高さである。

この装置は、流体容器をさらに備えることも可能であり、配送手段および基板は、流体容器に装着可能な部材内に配置することも可能である。その場合の配置は、容器からの流体サンプルが容器および部材を部分的に、または全体的に反転させることにより配送手段に導入することが可能であるのが好ましい。

この装置は、流体サンプルを装置内に注入可能な膜を備えることも可能である。

多孔性基板は、直径が５０μｍ以下、例えば２５μｍ以下の微細孔を有するのが好適である。微細孔の大きさは、０．０５μｍから２０μｍの範囲であるのが好ましい。多くの臨床応用例の場合、微細孔の大きさは１μｍから１５μｍの範囲、特に２μｍから１０μｍの範囲であるのが好ましい。子宮頸部塗抹標本サンプルから細胞を分離するためには、好適な孔の大きさは約５μｍから約１０μｍ、例えば約８μｍであることがわかっている。微細孔の大きさが１０μｍから２０μｍの範囲であるのが好ましい応用例もある。

少なくとも装置が通路を含む装置部分と、細胞を置く多孔性基板部分とは、放射線に対して透過性であるのが望ましい。好適には、この装置は、少なくとも使用時に多孔性基板を装填する部分が、放射線を用いた細胞分析用器具のサンプル空洞に挿入できるような大きさであり、且つ形状である。望ましくは、この装置は、少なくとも使用時に多孔性基板を装填する部分が、例えば顕微鏡など目視検査用装置の観察領域に挿入できるような大きさであり、且つ形状である。この装置は、配送手段に侵入するべき流体のサンプルを濾過するためのフィルタを備えることが都合良い。このフィルタは、粒径が２００μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上の粒子を流体から除去するのに適しているのが望ましい。場合によっては、フィルタが直径２０μｍ以上の粒子を除去するのに好適である。その場合、多孔性基板の微細孔の大きさはより小さい、例えば１０μｍ以下である。

本発明はさらに、流体から粒子を分離するために使用するスライドを提供し、該スライドは分離迷路を包囲し、該分離迷路は、粒子を含有する流体のサンプルを受けるための流体注入口と、多孔性基板と、流体注入口と流体が通過するための多孔性基板との間をつなぐ流体通路とを備えている。

さらに本発明は、粒子を置く方法を提供し、該方法は、外向きに広がった経路に沿って流体のサンプルを通過させて、それによって得られる流体の流れを多孔性基板の上面に落下させ、通過した残りの流体を多孔性基板の下面から排出する。さらに本発明は、基板上に粒子を置く方法を提供し、０．５ｍｌ以下の量の流体サンプルが、少なくとも２０ｍｍ^２の領域上で多孔性基板と接触する。

本発明の装置は、比較的簡単な構造であり、単独での使用に好適である。

本発明の２つの実施の形態を例として、添付図面を参照して以下で述べる。

図１を参照すると、基板上に細胞を置くための装置１が示されている。装置１は、第１の部材２と第２の部材３とを備える。第１の部材２は、一般に矩形であり、２個の対向する側縁２ａと２個の対向する端縁２ｂとを有する。第１の部材２の一端部の付近には、上向きに延在する環状壁面４が設けられており、その内面にはねじ山（図示せず）が設けられている。環状壁面４は、部材２の外面の円形部分５を包囲する。円形部分５の中央には、円形孔６が設けられている。円形部分５には、さらに３個の円形孔７ａ、７ｂおよび７ｃが偏心的に設けられている（孔７ｃは、図１には示されていないが、図２には示されている）。

第２の部材３は、一般に矩形であり、２個の対向する側縁３ａと２個の対向する端縁３ｂとを有する。部材３から下向きに環状壁面８が延在しており、その外側にねじ山（図示せず）が設けられている。第１の部材２と第２の部材３は、以下で述べるように、協働して内部検査迷路を定める。

装置１は、スライド形状である。これは、顕微鏡や他の好適な視覚化器具を用いた基板の検査に適する。さらに、図１５を参照して以下でさらに述べるように、対応するねじ蓋式容器と共に使用するのに好適である。

図２は、図１の装置の平面図であり、内部検査迷路の特徴を破線で示す。検査迷路は、一般に３つの部分、すなわち、サンプル配送部Ｘと、流体サンプルから浮遊した細胞を分離するのが主たる機能である中央部Ｙと、細胞を除去した後に残った流体を蓄積および／または排出する濾過処分部Ｚとに分割することができる。配送部Ｘで開始すると、孔７ａ、７ｂおよび７ｃは、フィルタ９ａ、９ｂおよび９ｃならびにチャネル１０ａ、１０ｂおよび１０ｃを介して、通路１１と通じる。孔６はまた、フィルタ１２を介して通路１１と通じており、その高さはおよそ１ｍｍであり、幅はおよそ２ｍｍである。通路１１は、装置に沿って縦方向に、中央部Ｙに向けて延在する。支流チャネル１３ａ、１３ｂ、１３ｃおよび１３ｄは、中央部Ｙの上流で通路１１と合流する。第２の部材３におけるチャネル１３ａ、１３ｂ、１３ｃおよび１３ｄは、オリフィス１４ａ、１４ｂ、１４ｃおよび１４ｄにより、第２の部材３の外側と通じる。オリフィス１４ａないし１４ｄは各々、自己封止膜によって封鎖される。

中央部Ｙにおいて、通路１１は、端縁１６に向けて外向きに急激に広がる部分１５を備え、これは、通路を横切って延在しており、通路の底壁面の境界を定めている。この広がり部分の幅は、端縁１６ではおよそ２５ｍｍであり、高さは１ｍｍである。端縁１６の下流には、多孔性基板１７部分が設けられている。図２には示していないが、この基板は、端縁１６からわずかに引っ込んでいる。基板１７の下側から貯蔵部１９まで、さらなる通路１８が通じている。通路１８は、基板から濾過液を集めるためのテーパ状部分を、その上流端部に有する。第２の部材３の配送部Ｘにある貯蔵部１９から第２の部材３の配送部Ｘにある流出口２０ａまで、流出口通路２０が通じている。必要に応じて、押圧して一時的に通路２０が封鎖できるように、流出口通路２０の一部の部材２に可撓性の膜を設けることも可能である。もしこれが存在するならば、流出口通路２０内のこのような一時的封鎖手段によって、装置のユーザが、装置を介する流体の流れを停止することも可能である。

さて、図３を参照する。この図は、図２のＡ−Ａに沿った断面図であり、第１の部材２と第２の部材３との間に、第１の挿入部材２１と、第２の挿入部材２２と、フィルタシート２３と、長手部分１７を含む多孔性膜であるシート３２とが設けられている。第１の挿入部材２１は、図１１および図１２を参照して以下で詳細に述べるが、一般に平面状であり、３個の円形貫通孔を備えて、チャンバ２４ａ、２４ｂおよび２４ｃを形成しており、これらは、組み立てた装置内では、孔７ａ、７ｂおよび７ｃ、６と同軸であるが、それらとは軸方向に離れている。図３には、チャンバ２４ｂのみが示されている。挿入部材２１はまた、さらに他のチャンバ２５も備えており、これは、組み立てた装置内では孔６とは同軸であるが、離れている。チャンバ２４ａ、２４ｂ、２４ｃおよび２５は、第１の部材２の内面と挿入部材２１の対向面とにより所定位置に保持されるフィルタシート２３の部分９ａ、９ｂ、９ｃおよび１２によって、孔７ａ、７ｂおよび７ｃと分離される。挿入部材２１の対向面２１ｂにおけるチャンバ２４ａ、２４ｂ、２４ｃおよび２５の開口部は、第２の部材３の当接内面によって封鎖される。フィルタシートは、侵入する流体から比較的大きな粒径の粒子を分離するのに好適である。フィルタシートは、直径５０μｍ以上、好ましくは２００μｍ以上の微細孔を有するのが望ましく、多孔性基板を封鎖する可能性がある大きな粒子または粒子の集団を流体から除去するのに役立つ。チャンバ２４ａ、２４ｂ、２４ｃおよび２５は、（通路１１と比較して）拡大された領域を提供して、効果的な濾過を可能にしている。チャネル１０ｂ（図１にも示されている）は、チャンバ２４ｂを貫通孔２５と連結している。チャネル１０ａの流出口も、図３において、チャンバ２５の壁面に示されている。通路１１は、チャンバ２５から装置に沿って縦方向に、中央部Ｙに向けて延在し、その壁面は、チャネル１３ａ、１３ｂ、１３ｃおよび１３ｄ（図２に示すが、１３ｃおよび１３ｄのみが図３に示されている）によって途切れている。

以下でさらに述べるように、チャネル１３ａないし１３ｄには、装置を使用する前に、標的細胞に標識付けをするための少なくとも１個の標識付け材料を充填してもよい。標識付け材料は、例えば、製造する際に、調合剤をチャネル壁面に付着させる形でチャネルに導入されてもよい。チャネルは各々、同じか、または異なる材料を含むことも可能である。当然、サンプルの調整または視覚化に有用となり得るいかなる他の物質も、標識付け材料と同様に、またはその代わりにチャネル１３ａないし１３ｄに含むことが可能である。

装置の中央部Ｙにおける第１および第２の部材間には、第２の挿入部材２２が設けられており、この第２の挿入部材２２は、第２の部材３に固定的に装着されるが、第１の部材２の内面からは離れている。挿入部材２２の上流部は、使用の際に、流体が流れる方向に上向きになだらかに傾いた表面２６を有する。（このように上向きに傾いた床領域は不可欠のものではなく、通路の床が平坦であるのが好ましい。上記の装置における挿入部材２２は、単に基板にとって便利な位置として役立っているに過ぎない。）挿入部材２２はまた、水平部分２７も有する。装置に沿って横方向に延在する長手の孔２８は水平部２７に設けられ、使用する際に細胞を受けるべき多孔性基板の部分１７を構成する。該孔は、挿入部材２２の上面の上縁２９によって、その上流端で境界を定められている。上縁２９は、図２を参照して上述した端縁１６に対応する。上縁２９では、壁面３０が下向きに延在する。第２の部材３には、対応する垂直壁面３１が内向きに設けられている。壁面３０および３１は、第２の挿入部材２２および第２の部材３によって所定位置に保持される多孔性膜３２のシートによって中断されることを除いては、実質的に連続する垂直面を形成するように構成されている。多孔性膜３２は、孔の大きさが、１ｃｍ^２あたり約１００，０００個につき約８μｍ以上である。膜３２に好適な材料は、ポリカーボネート、ニトロセルロースおよびポリエステルを含む。孔は、比較的均一に配分されているのが好ましいが、必ずしもその必要はなく、ランダムに孔を配分した膜によって良い結果を得ることができる。通路１８は、その上流端に、孔２８の下方に位置する横方向に延在する長手部分３３を有し、テーパ状の部分がそこから下流に、通路１８の主要部分まで延在しており、その一部のみが図３に示されている。濾過液を受けるための貯蔵部１９が、部材２および３における凹部を協働させて定められている。

図４を参照すると、孔６、７ａ、７ｂおよび７ｃは、流体サンプルのための注入口手段を提供する。図４に見られるように、孔６、７ａ、７ｂおよび７ｃを介して侵入する流体は、挿入部材２１におけるそれぞれのチャンバ２５、２４ａ、２４ｂまたは２４ｃを介して通路１１に入る前に、フィルタ１２、９ａ、９ｂおよび９ｃによってそれぞれ濾過される。

図５は、図１の装置を示す分解図である。図５では、簡単にするために、環状壁面４および８は含まれない。

図６は、第１の部材２の内面の形状を示す。その形状の特徴は、図１または図３を参照して上で述べており、その特徴に対しては、図１、図３および図６において同じ参照符号が用いられている。

図７を参照すると、部材２の内面の特徴である構造を破線で示してある。図８は、部材２を上から見た平面図であり、下面の特徴は破線で示してある。

図９および図１０は、それぞれ部材３を示す側面図および平面図であり、隠れた特徴部分は破線で示されている。

図１１および図１２は挿入部材２１を示すが、図１３および図１４は挿入部材２２を示す。上記のように、挿入部材２２は長手孔２８を定め、その長さは通路１１の広がり部分１５の流出口の幅に対応する。孔２８は、流体サンプルを受ける多孔性基板の部分１７を構成する。実際、該孔は長さ２５ｍｍ、幅２ｍｍであり、このように構成された多孔性基板部分は、微細孔の数がおよそ５０，０００個である。当然のことながら、ここでは、孔２８の長さとは、装置を横切って左右に延在する方向の寸法である。

図１５ａを参照すると、本発明の特に好ましい実施の形態は、図１の装置を、容器３３およびその容器３３の首部と螺合可能な蓋３４と組み合わされたものが含まれる。装置１と容器３３と蓋３４とは各々、容器から蓋を取り外した場合、蓋が環状壁面４と螺合可能であり、容器が環状壁面８と螺合可能であるような大きさおよび形状である。図示した実施の形態において、容器は、２０ｍｌのサンプルを受けるのに好適な大きさである。

図１５ｂは、細胞分離を開始するために反転する前の、図１５ａの装置を示す。細胞学的サンプルを含有する流体が、まず最初に容器３３内で用意されて、その後ねじ蓋式の蓋３４によって封鎖される。その後、蓋は取り外されて装置１によって置き換わり、装置１の対向する側に蓋３４を装着することが可能である。容器および装置を反転させて、装置１の横方向に延在する部分３５に配置された基板に細胞を置く。その延在部分３５は、顕微鏡を用いて、または他の好適な視覚化技術によって検査することが可能である。

図１ないし図１４の装置を使用する際に、粒子を含有する流体サンプル（図示した装置の場合には細胞）を孔６、７ａ、７ｂおよび７ｃに導入する。例えば、図１５を参照して述べたような装置の場合、（環状壁面４に装着された）容器を反転することも可能である。あるいは、アクセス孔は、例えば注入器を用いてサンプルを注入可能な封止可能な膜によって、またはいずれかの好適な手段によってサンプルを導入できるように取り外し可能な蓋によって被覆することも可能である。

流体は、粒径の大きな混入物を濾過するフィルタ１２、９ａ、９ｂおよび９ｃを介してチャンバ２５、２４ａ、２４ｂおよび２４ｃに侵入する。粗く濾過された流体は、その後、通路１０ａ、１０ｂおよび１０ｃならびに通路１１を介して、装置の中央部Ｙに向かって流れる。選択した粒子に標識付けするのに好適な材料は、対応するチャネル１３ａないし１３ｄを介してサンプルに導入することが可能である。必要に応じて、チャネル１３ａないし１３ｄの内壁面は、流体がチャネル１３ａないし１３ｄを通過すると、そのチャネルから引き出される可能性がある好適な標識付け組成物を、装置を使用する前に、充填することも可能である。望ましい場合または必要に応じて、それぞれのオリフィス１４ａないし１４ｄを封鎖する自己封止膜を介して、好適な洗浄液を注入して、事前に装填された標識付け組成物を洗浄することも可能である。さらに、チャネル１３ａないし１３ｄにおいて事前に装填された材料に対して、またはその代わりに、オリフィス１４ａないし１４ｄを封鎖する自己封止膜を介して、注入器または同様の装置を用いて好適な標識付け材料を注入することも可能である。好適な標識付け材料は、例えば、色原体、色付けされたビード、磁性ビード、常磁性ビードおよびレポータ分子から選択された少なくとも１個の物質等の標識手段を組み合わせた抗生物質でも良い。サンプルは、通路１１に沿って通過すると、いずれかの添加材料とうまく混合される。流体が通路１１の広がり部分１５に沿って流れると、その流体は横方向に広がって、外見上、通路の全幅を満たし、その流体の進入面が最終的に端縁２９に到達し、そこで基板上に流出する。

多孔性基板の長手部分１７に衝突すると、液体媒質および例えば８μｍ未満の小さい粒子が多孔性膜を通過し、直径が８μｍ以上の粒子は、そこに保持される。実際、各微細孔の開口部に１個の粒子が保持される傾向があることがわかっている。さらに、壁面付近の微細孔が、保持された粒子の存在のために液体の流れに対して実質的に封鎖された状態になり、サンプル流体が、その保持された粒子を共にする膜部分を越えて流れ、次の実質的に妨げられていない膜部分によって同様に濾過されると考えられている。細胞を分離するための上記装置を使用する際に、単層または実質上単層である細胞の層を、多孔性の膜の部分１７上で得られることが重要である。その結果、そのまま膜状で支持された細胞を検査することが可能である。これらの細胞は、いずれかの好適な視覚化技術を用いて観察され、また関連の特性を測定することも可能である。好適な視覚化技術としては、例えば、光学または電子技術を含むことも可能である。

上記装置の内部容積は、２０００ｍｍ^３をわずかに下回り、膜１７の上流では３８４ｍｍ^３であり、膜１７の下流では１５４６ｍｍ^３である。約２００ｍｍ^３の流体サンプルの容積は、検査用として十分対応した細胞サンプルを得るために好適である。

図１５に示す実施の形態では、流体サンプルは、重力の結果として装置を介して流される。代わりに、またはその上、装置は、その装置にサンプルを吹き付けるか、または装置を介して吸引する手段を備えても良い。

疑問を回避するために、ここでは、「下向きに」は、装置を使用する際の配向を意味するものであると理解するべきである。図１５を参照して述べたような、装置のある一定の形状では、この装置が、細胞を分離したり置いたりするために配置された位置に関して反転される位置に通常、維持されてもよい。これは、ここで使用する下向きという用語を解釈する際には無視するべきものである。

本発明の装置１００の別の形態が、図１６ないし図２１ａに示されており、図１ないし図１４の装置の部品に対応する部品には、同じ参照符号が使用されている。

図１６を参照すると、装置の外観は、図１ないし図１４の装置とは以下の点で異なる。すなわち、孔６、７ａ、７ｂおよび７ｃを包囲する壁面がなく、その代わりに、円形領域５が、部材２の包囲部分に関して僅かに引っ込んでいる、装置の下側に付随的な環状壁面が存在しない、また装置が第１および第２の対向する窪み３６および３７を有し、これらは、顕微鏡等の好適な視覚化装置の読み出し部分に正確に装置を配置するものである。装置１００の第１の部材２および第２の部材３は、光学的に透過可能な材料から成り、装置１００はスライド形状である。

図１７および図１８を参照すると、装置１００内の検査迷路のサンプル配送部Ｘは、装置１００内に、試薬を配送するための符号１３ａおよび１３ｂで示す２個のチャネルのみが設けられることを除いては、装置１の検査迷路と同じ構造である。チャネル１３ａおよび１３ｂは、対応するオリフィス１４ａおよび１４ｂを有する。

図１７を参照すると、中央部Ｙの構造は、図１ないし図１４の装置とは異なり、図２０、図２１および図２１ａを参照して以下でより詳細に述べる環状支持装置１３８を横切って相対的に張られた状態で多孔性膜１７が延在している。第２の部材３には、底部１４０を有する四角形凹部１３９が設けられており、さらに円形凹部１４１がその底部１４０に設けられている。環状支持装置１３８は、組み立てた装置内では、円形凹部１４１内にぴったりの状態で受けられる。四角形部材１４２は四角形凹部１３９にぴったりと適合し、その部材１４２の下面は、多孔性膜１１７の上面と、また凹部１３９の周囲底部１４０と当接する。長手孔２８は、使用する際に細胞を受けるべき膜１１７の一部に適合する部材１４２に設けられている。円形凹部１４１の底部には、排水チャネル１４５を介して貯蔵部１９と通じるさらなる半円形凹部１４４が設けられている。

図２０を参照すると、多孔性膜１１７は、２個の環状プラスチックリング１４３および１４４から成る環状支持装置１３８で支持することにより、比較的均一の張力で維持される。リング１４４は、膜１１７の周辺が図２１、詳細には図２１ａに示すようにリング１４４および１４３の間に締め付けられた状態で、リング１４３にスナップ式で嵌合される方法で収容可能となるような外径を有する。

膜１１７は、１ｃｍ^２あたり約１０００００の分散密度で、約８μｍ以上の大きさの微細孔を有する。好適な材料は、装置１の膜１７を参照して上述したものである。

装置１００の動作は、本質的には装置１と同じである。流体サンプルを導入するには、反転したスライド１００を流体の容器上において、該容器の開口部が円形凹部領域５（これは、容器リムとの封止に具合が良い材料で適宜カバーすることができる）に対向するような状態にして、該容器とスライド１００を共に反転させて流体がスライド１００に配送されるようにする。装置１００の膜支持構造１３８は、多孔性膜の張力を再生する点、また製造を簡素化する点で、利点があることがわかっている。

通路１１ならびに基板１７および１１７は各々、装置を使用する際に実質的に水平に延在するように配置されている。「実質的に水平に」の意味は、例えば全く水平な状態から１５°まで、好ましくは１０°以下の僅かな傾きを含むものと理解するべきである。実際、このような僅かな傾きは、多孔性基板の下で蓄積する可能性がある気泡を逃す際に都合の良いものとなる。使用する際に通路が実質的に水平に延在する装置は、通路が、垂直も含み、水平に対してより大きい角度で延在するように配置される場合にも、細胞を置くために使用することが可能であるが、これによって一般には、基板上に粒子が不均等に分散される結果となり、より高い吸引力または圧力を装置に与えて、装置を介して流体を流す必要があるために余分の装置が要求されるという点では、不都合な場合もある。

以下の実施例は、本発明を例示する：

標準的な方法で採取された子宮頸部塗抹標本サンプルを、採取直後に、保存液２０ｍｌが入ったガラス瓶（サイティック（Cytyc）製造のCYTOLYT）に送った。赤血球計を用いて溶液の濃度を推定し、溶液１ｍｌあたり細胞がおよそ５×１０^５個であることがわかった。この溶液を０．２ｍｌ（およそ１００，０００個の細胞）を実験に使用するために採取し、これをさらに１ｍｌの保存液に添加した。その後、特に扁平上皮細胞への結合に好適であり且つ蛍光マーカを保持した抗体を添加し、その混合物を１時間保温した。その後、サンプル０．２ｍｌを本発明のスライドを介して吸引した。

使用したスライドは、本質的には図１ないし図１５を参照して上で述べた中央部を含むが、注入手段と流出手段とを変更している。注入手段としては、通路１１に直接サンプルを注入するために、そのプランジャを取り外した状態の第１の注入器（注入器Ａ）を設けた。流出手段としては、通路１８の下流部分の出力孔を介して残りの液体を引き出すために、第２の注入器（注入器Ｂ）を設けた。

サンプルを導入する前に、注入器Ｂのプランジャを封鎖位置に配置した。その後、ピペットを用いて、上記のようにプランジャのついていない注入器Ａにサンプルを導入した。流体は、注入器Ｂ内のプランジャを引き抜くことにより、スライドを介してゆっくりと引き出された。

倍率１０倍の蛍光顕微鏡を用いて膜を観察した。個々の細胞は、膜上にはっきりと見えた。大部分の細胞は、隣接する細胞と接触しておらず、これによって細胞の単層が生成されたと考えられる。この細胞はまた、膜全体に亘って均一に分散していた。膜の孔は、顕微鏡でも見ることができた。

この実施例では、単層細胞を置くことを例示するために、特に扁平上皮細胞に結合するための抗体を用いた。当然、臨床上使用するためには、上記に加えてまたは上記に代えて、特定の細胞を柱状細胞に結合し且つ特に移行帯の細胞に結合し、またはそのいずれかにより、これらの細胞の存在を量的にまたは質的に決定する可能性と、さらに子宮頸部の塗抹標本サンプルの適正を変える可能性とを提供するのに適する抗体を用いることになる。

図１は、装置を上から見た斜視図である。 図２は、上から見た平面図である。 図３は、図２のＡ−Ａに沿った断面図である。 図４は、一部切り欠いた、上から見た斜視図である。 図５は、装置の分解図である。 図６は、装置の第1の部材を下から見た斜視図である。 図７は、装置の第1の部材の側面図である。 図８は、装置の第1の部材の平面図である。 図９は、装置の第２の部材の側面図である。 図１０は、装置の第２の部材の平面図である。 図１１は、第1の部材と第２の部材との間に介在される第1の挿入部材の平面図である。 図１２は、第1の挿入部材を示す、一部切り欠き側面図である。 図１３は、上部片と下部片との間に含む第２の挿入部材の平面図である。 図１４は、第２の挿入部材を示す、一部切り欠き側面図である。 図１５ａは、容器および蓋を有する図1の装置の斜視図である。 図１５ｂは、図１５ａの装置および容器をさらに示す図である。 図１６は、本発明の第２の実施の形態を上から見た斜視図である。 図１７は、図１６の装置の分解図である。 図１８は、図１６の装置の第１の上部部材を上から見た平面図である。 図１９は、図１６の装置の第２の下部部材を上から見た平面図である。 図２０は、図１６の装置で使用するための多孔性膜および支持構造を示す分解断面図である。 図２１は、図２０の膜および支持構造を組み立てた形態で示す断面図である。 図２１ａは、図２１の組み立て体の端縁部分を詳細に示す図である。

Claims (43)

1. 基板上に粒子を置くための装置であって、多孔性基板と、前記粒子を含有する流体のサンプルを前記多孔性基板に配送するための配送手段とを備え、前記配送手段は、前記流体のための注入口と、前記注入口から前記多孔性基板に向かう第１の方向に沿って延在する通路とを備え、前記通路は、一般に前記基板に向かう第１の方向に沿って前記流体を流し、さらに前記第１の方向に対して横方向に前記流体を拡げるように配置されていることを特徴とする、装置。
2. 請求項１記載の装置であって、前記多孔性基板が、前記装置の上面に対して実質的に平行に延在し、前記配置においては、前記通路が前記サンプルを前記多孔性基板上に上から配送することを特徴とする、装置。
3. 続いて光学的検査を行うために単一粒子層を生成する装置であって、スライド部材を備え、前記スライド部材は流路配列を包囲し、前記流路配列は、少なくともその平面状の上面が、前記スライド部材内で、しかもその一部に沿って実質的に水平に延在する多孔性基板を備え、前記流路配列は、前記粒子を含有する流体サンプルのための注入口と、前記多孔性基板の前記上面に前記サンプルを配送するための前記注入口から延在する通路とをさらに備えることを特徴とする、装置。
4. 請求項１ないし３のいずれかに記載の装置であって、前記通路の少なくとも一部が外向きに広がることを特徴とする、装置。
5. 請求項１ないし４のいずれかに記載の装置であって、前記装置を使用する際には、前記通路が実質的に水平に延在することを特徴とする、装置。
6. 請求項１ないし５のいずれかに記載の装置であって、前記通路が、サンプルを配送するための前記多孔性基板と通じる流出口を備え、前記流出口付近の、少なくとも前記通路のその部分が外向きに広がることを特徴とする、装置。
7. 請求項６に記載の装置であって、前記装置を使用する際に、前記流出口が前記多孔性基板の上方に位置することを特徴とする、装置。
8. 請求項７に記載の装置であって、前記装置を使用する際に、前記流出口が前記多孔性基板の上方で実質的に垂直に位置することを特徴とする、装置。
9. 請求項６ないし８のいずれかに記載の装置であって、前記流体用流出口が、前記多孔性基板に向けて延在する壁面を含み、それによって前記多孔性基板が、使用する際に、前記壁面を介して前記流出口から流れる流体を受けることが可能であることを特徴とする、装置。
10. 請求項９に記載の装置であって、前記装置を使用する際に、前記壁面が下向きに延在することを特徴とする、装置。
11. 請求項９または１０に記載の装置であって、前記壁面は、縦寸法が横寸法よりも長い長手の形状であり、その縦寸法が、前記壁面を前記流体が流れ落ちる方向に対して一般に横方向に延在するように前記壁面が配置されることを特徴とする、装置。
12. 請求項９ないし１１のいずれかに記載の装置であって、前記通路が、前記壁面で終端となる基部を備えることを特徴とする、装置。
13. 請求項９ないし１２のいずれかに記載の装置であって、前記通路が、使用する際に、流体が流れる方向に、少なくとも前記通路の一部に沿って互いに分岐する対向する側壁面をさらに備えることを特徴とする、装置。
14. 請求項１ないし１３のいずれかに記載の装置であって、前記通路が包囲されていることを特徴とする、装置。
15. 請求項１ないし１４のいずれかに記載の装置であって、前記多孔性基板を通過した流体を受けるための排水容器を備えることを特徴とする、装置。
16. 請求項１ないし１５のいずれかに記載の装置であって、前記配送手段に試薬を配送することが可能な試薬配送チャネルをさらに備えることを特徴とする、装置。
17. 請求項１６に記載の装置であって、その各々を介して前記配送手段に試薬を配送することが可能な２個から６個の試薬配送チャネルを備えることを特徴とする、装置。
18. 請求項１６または１７に記載の装置であって、前記または各々の試薬配送チャネルが、前記装置に試薬を導入することが可能なそれぞれのアクセス開口部と通じることを特徴とする、装置。
19. 請求項１ないし１８のいずれかに記載の装置であって、選択的結合成分を備え、前記配置によって、使用する際に、流体サンプルが前記多孔性基板に配送される以前に前記選択的結合成分と接触することが可能であることを特徴とする、装置。
20. 請求項１９に記載の装置であって、前記装置を使用する際に、前記多孔性基板上に保持された、いずれかの選択的に結合された結合成分の指示器として作用するための標識手段と組み合わせた選択的結合成分を備えることを特徴とする、装置。
21. 請求項１ないし２０のいずれかに記載の装置であって、全内部空隙量が２０ｍｌ以下であることを特徴とする、装置。
22. 請求項２１に記載の装置であって、全内部空隙量が４ｍｌ以下であることを特徴とする、装置。
23. 請求項１ないし２２のいずれかに記載の装置であって、前記多孔性基板の上流での前記装置の内部空隙量が０．７５ｍｌ以下であることを特徴とする、装置。
24. 請求項２３に記載の装置であって、前記多孔性基板の上流での前記装置の内部空隙量が０．４ｍｌ以下であることを特徴とする、装置。
25. 請求項１ないし２４のいずれかに記載の装置であって、幅が少なくとも１０ｍｍである流出口を前記通路が有することを特徴とする、装置。
26. 請求項１ないし２５のいずれかに記載の装置であって、流体容器をさらに備え、前記通路および前記基板が、前記流体容器に装着可能な部材内に配置されることを特徴とする、装置。
27. 請求項２６に記載の装置であって、前記配置により、前記容器からの流体サンプルが、前記容器と部材を部分的に、または全体的に反転させることにより通路内に導入されることが可能であることを特徴とする、装置。
28. 請求項１ないし２７のいずれかに記載の装置であって、それを介して流体サンプルが前記装置に注入されることが可能な膜を備えることを特徴とする、装置。
29. 請求項１ないし２５のいずれかに記載の装置であって、前記多孔性基板が直径５０μｍ以下の微細孔を有することを特徴とする、装置。
30. 請求項２９に記載の装置であって、前記微細孔の大きさが０．０５μｍから２０μｍの範囲であることを特徴とする、装置。
31. 請求項３０に記載の装置であって、前記微細孔の大きさが１μｍから１５μｍの範囲であることを特徴とする、装置。
32. 請求項３１に記載の装置であって、前記微細孔の大きさが２μｍから１０μｍの範囲であることを特徴とする、装置。
33. 請求項２９に記載の装置であって、前記微細孔の大きさが１０μｍから２０μｍの範囲であることを特徴とする、装置。
34. 請求項１ないし３３のいずれかに記載の装置であって、少なくとも、前記通路を含む装置部分と、細胞を置くための前記多孔性基板部分とが、放射線を透すことを特徴とする、装置。
35. 請求項１ないし３４のいずれかに記載の装置であって、少なくとも使用する際に前記装填された多孔性基板を含む装置部分が、放射線を用いて細胞を分析するための器具のサンプル空洞に挿入されることが可能となるように構成されていることを特徴とする、装置。
36. 請求項１ないし３５のいずれかに記載の装置であって、少なくとも使用する際に前記装填された多孔性基板を含む装置部分が、視覚検査のための装置の観察領域に挿入されることが可能となるように構成されていることを特徴とする、装置。
37. 請求項１ないし３６のいずれかに記載の装置であって、前記通路に進入するべき流体のサンプルを濾過するためのフィルタを備えることを特徴とする、装置。
38. 実質的にここで述べた装置。
39. 粒子を置く方法であって、外向きに広がる実質的に水平の通路に沿って流体のサンプルを通過させ、こうして得られた流体の流れを多孔性基板の上面に落下させ、前記多孔性基板の下面から、そこを通過した残りの流体を排出することを特徴とする、方法。
40. 請求項３９に記載の方法であって、０．５ｍｌ以下の量の流体のサンプルを、少なくとも２０ｍｍ^２の領域上で多孔性基板と接触させることを特徴とする、方法。
41. 請求項３９または４０に記載の方法であって、前記粒子が細胞であることを特徴とする、方法。
42. 請求項４１に記載の方法であって、前記流体サンプルに存在する標的細胞を標識することが可能な少なくとも１個のマーカを、注入前、または通路内で前記流体サンプルと組み合わせることを特徴とする、方法。
43. 請求項４０に記載の方法であって、前記マーカが抗体を備えることを特徴とする、方法。

Images