JP2005508885A - Dnaメチル化の阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2001年7月31日出願の米国仮出願第60/309/242号および2001年8月10日出願の米国仮出願第60/311/435号の恩典を主張し、これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる。
米国政府は、国立衛生研究所により授与された助成金(助成番号GM35690およびCA82422を含む)により、ならびに国立衛生研究所による少なくとも一人の発明者の雇用により、本出願における一定の権利を有すると考えられる。
本開示は、化合物ゼブラリン(Zebularine)および関連化合物を用いた、DNAメチル化の阻害法および高メチル化関連疾患の治療または改善法に関する。
DNAメチル基転移酵素(DNAメチラーゼとも呼ばれる)は共通のメチル供与体であるS-アデノシルメチオニンからDNA分子の特定の部位にメチル基を転移させる。いくつかの生物機能はDNAにおけるメチル化塩基によるものとされている。最も確立された生物機能は、同族の制限酵素による消化からのDNAの保護である。制限改変現象は細菌でのみ観察されている。哺乳類細胞は少なくともいくつかのメチル基転移酵素を有している:これらの一つ(DNMT1)はDNA上のグアニンの5'(上流)隣のシトシン残基(ジヌクレオチドCpGを形成している)を優先的にメチル化する。このメチル化は遺伝子の活性、細胞分化、腫瘍形成、X-染色体不活化、ゲノムインプリンティング、および他の主要な生体プロセスにおいて役割を果たすということが、いくつかの一連の証拠によって明らかにされている(RazinおよびRiggs編、DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance、Springer-Verlag、ニューヨーク、1984)。
ゼブラリンはメチル化の強力な阻害剤であり、サイレンシングされた腫瘍抑制遺伝子を特異的に再活性化しうることが今や明らかにされている。ゼブラリンはメチル化を阻害し、それによって特定の疾患(高メチル化に関連づけられている癌を含む)と戦い、植物、真菌、および動物のメチル化によりサイレンシングされた遺伝子を活性化するために用いることができる。ゼブラリンは5-アザシチジンよりも実質的に安定で、経口投与することができ、このことは臨床において非常に有益である。
添付の配列表に示す核酸およびアミノ酸配列は、37 C.F.R. 1.822の定義のとおり、ヌクレオチド塩基については標準の略語を用い、アミノ酸については3文字コードを用いて示している。各核酸配列の一方の鎖だけを示しているが、表示した鎖についていかなる言及をする場合にも相補鎖が含まれることが理解される。添付の配列表において、
配列番号:1はp16センスcDNA増幅プライマーである。
配列番号:2はp16アンチセンスcDNA増幅プライマーである。
配列番号:3はGAPDHセンスcDNA増幅プライマーである。
配列番号:4はGAPDHアンチセンスcDNA増幅プライマーである。
配列番号:5は亜硫酸水素塩処理したDNA増幅のためのp16プロモーター/エキソン1センスプライマーである。
配列番号:6は亜硫酸水素塩処理したDNA増幅のためのp16プロモーター/エキソン1アンチセンスプライマーである。
配列番号:7は亜硫酸水素塩処理したDNA増幅のためのp16エキソン2センスプライマーである。
配列番号:8は亜硫酸水素塩処理したDNA増幅のためのp16エキソン2アンチセンスプライマーである。
配列番号:9は亜硫酸水素塩処理したDNA増幅のためのp3センスプライマーである。
配列番号:10は亜硫酸水素塩処理したDNA増幅のためのp3アンチセンスプライマーである。
配列番号:11、12、および13はp16プロモーター/エキソン1 SNuPEプライマーである。
配列番号:14、15、および16はp16エキソン2 SNuPEプライマーである。
配列番号:17、18、および19はp3 SNuPEプライマーである。
配列番号:20はNが2'-デオキシ-ゼブラリンを表すゼブラリン誘導体化オリゴヌクレオチドである。
I. 略語
5-アザ-CR(5-アザ-C、5-ACも同様):5-アザシチジン
5-アザ-CdR:5-アザ-2'-デオキシシチジン
CK:シチジンキナーゼ
FdCyd:5-フルオロデオキシシチジン
GM-CSF:顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
GST:グルタチオン-S-トランスフェラーゼ
IL-2:インターロイキン2
QSAR:定量的構造活性相関
RE:制限エンドヌクレアーゼ
TNF:腫瘍壊死因子
TSA:トリコスタチンA
UK:ウリジンキナーゼ
Zeb:ゼブラリン
特に記載がない限り、専門用語は通常の用法に従って用いられる。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Press発行、1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.発行、1994(ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.発行、1995(ISBN 1-56081-569-8)に記載されていると考えられる。本明細書において特別な説明がなされていない化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1985)およびThe Condensed Chemical Dictionary (1981)によって例示されるとおり、当技術分野における通常の用法に従って用いられる。
本開示はDNAメチル基転移酵素の阻害法であって、DNAメチル基転移酵素をDNAメチル基転移酵素を阻害するのに有効な量のゼブラリン(または低メチル化活性を保持している、その類縁体もしくは誘導体)と接触させる段階を含む方法を提供する。そのような方法は、インビボまたはインビトロで実施することができ、方法を細胞内で実施する特定の態様において、細胞は例えば細菌細胞、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞であってもよい。いくつかの場合には、細胞が高メチル化核酸分子(例えば、少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含むもの)を含むことが知られているか、または疑われることが特に企図される。
ゼブラリン(図1)は1-β-リボフラノシル-1,2-ジヒドロピリミジン-2-オンおよび1-β-リボフラノシル-2(1H)-ピリミジノンとしても知られ、シチジンデアミナーゼ活性があるとされてきた(例えば、Kimら、J. Med. Chem. 29:1374-1380, 1986;Greerに交付され、表題が「Dramatic Simplification of a Method to Treat Neoplastic Disease by Radiation」の国際公開公報第00/51639号;McCormackら、Biochem Pharmacol. 29:830-832, 1980参照)。
*示した半減期はPBS(pH7.4)中、50℃での値;5-アザ-CRの半減期は溶液の状態(例えば、pH、温度など)に依存する;例えば、Chanら、J. Pharma. Sci. 68:807-812, 1979;ChatterjiおよびGallelli、J. Pharma. Sci. 68:822-826, 1979参照)。
ゼブラリンの低メチル化活性の同定により、高メチル化に関与する疾患および状態を改善、予防、または治療するために本化合物を使用して利益を受けることが今や可能である。
市販の中間体からのゼブラリンの化学合成法は公知である。特に、Liuら、J. Med. Chem., 24:662-666, 1981およびDriscollら、J. Med. Chem. 34:3280-3284, 1991を参照されたい。類縁体は、例えばKimら、J. Med. Chem. 29:1374-1380, 1986に記載のとおり、過去に合成されている。ゼブラリンを含むヌクレオチドの合成は、例えばBarchiら(J. Enzyme Inhib. 9:147-162, 1995)に記載されている。
ゼブラリンが有効な低メチル化剤であるとの発見により、ゼブラリンはオリゴヌクレオチドに組み込むことができ、得られる誘導体化オリゴヌクレオチドは核酸分子内の特定の標的部位でメチル化を阻害するために用いることができると考えられる。
オリゴヌクレオチドのインビトロ合成法は当業者には公知である。そのような通常の方法を用いて、開示した方法のためにオリゴヌクレオチドを製造することができる。インビトロでのオリゴヌクレオチド合成のための最も一般的な方法は、Letsingerによって考案され、Caruthersによってさらに開発されたホスホラミダイト法である(Caruthersら、Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides, in Methods Enzymol. 154:287-313, 1987)。これは段階的様式で実施される非水性固相反応で、単一のヌクレオチド(または修飾ヌクレオチド)を伸長中のオリゴヌクレオチドに付加する。個々のヌクレオチドを反応性の3'-ホスホラミダイト誘導体の形で付加する。Gait(編)、Oligonucleotide Synthesis. A practical approach, IRL Press, 1984も参照されたい。
少なくとも一つのゼブラリン残基(または低メチル化活性を維持しているその類縁体)を含むよう誘導体化されたオリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドに実質的に相同の標的核酸配列におけるメチル化を阻害することができる。本開示は標的配列のメチル化を阻害する方法であって、その配列を含む細胞を、標的配列の少なくとも一部と相補的なゼブラリン誘導体化オリゴヌクレオチドと接触させる段階を含む方法を特に企図する。特定の態様において、標的配列は一つまたは複数のCpGジヌクレオチドを含む。標的配列の具体例には、腫瘍抑制遺伝子などの遺伝子の調節領域が含まれる。
(Xは2'-デオキシ-ゼブラリンを表す)。このオリゴヌクレオチドは、Wangら(J. Am. Chem. Soc. 122:12422-12434, 2000)に記載のとおり、HhaIメチラーゼを指向する。Sheikhnejadら(J. Mol. Biol. 285,:2021-2034, 1999)およびMarquezら(Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 9:415-421, 1999)に示されているとおり、哺乳類の酵素を標的とする他の配列を合成することができる。図20に関して、このオリゴヌクレオチドを合成し、2'-デオキシ-ゼブラリンの代わりに2'-デオキシ-5-アザシチジンを有する同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較した。2'-デオキシ-ゼブラリンおよび2'-デオキシ-5-アザシチジンと対にするために5-メチルシチジンを有する相補鎖とアニーリングした二本鎖として、修飾オリゴヌクレオチドはいずれも基質オリゴヌクレオチドのメチル化を同程度に阻害した。
ヌクレオチド内のシトシンの5-メチル状態を定量および/または測定するために用いる方法の一つのクラスは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ(RE)を用いることに頼っている。各REはDNAを特定の短い(例えば4〜8ヌクレオチド)認識配列で「切断」することができる。そのような切断の位置は消化反応後に生じる断片の長さに基づいて決定することができ、これらの断片は例えばゲル電気泳動、膜への転写、およびハイブリダイゼーションによって検出される。特定のREは、消化が起こるためには認識配列内の特定の塩基が特定のアデニンおよび/またはシトシン残基でメチル化されていなければならないという点で、「メチル化感受性」である。事実、イソシゾマーと呼ばれる特定のREは同じ配列を認識するが、メチル感受性であっても、または非感受性であってもよい。メチル化感受性REの例には、Sau3AIおよびDpnIIが含まれる。メチル化感受性REによる消化後のバンドパターンは、DNAのメチル化パターンに応じて変化する。メチル化されている可能性がある多くのCpGがREの認識配列の外にあり、したがってこれらの方法を用いて調べることはできないため、メチル化感受性REに基づく技術はある程度制限されることもある。
米国特許第5,786,146号(表題「非メチル化シトシンを修飾する物質を用い、修飾されたメチル化および非メチル化核酸を識別する、メチル化核酸の検出法(Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids)」);
米国特許第5,871,917号(表題「異なるメチル化および突然変異核酸の同定(Identification of differentially methylated and mutated nucleic acids)」)
米国特許第6,017,704号(表題「非メチル化シトシンを修飾する物質を用い、修飾されたメチル化および非メチル化核酸を識別する、メチル化核酸の検出法(Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids)」);
米国特許第6,200,756号(表題「CpG含有核酸におけるメチル化パターンの同定法(Methods for identifying methylation patterns in a CpG containing nucleic acid)」);
米国特許第6,214,556号(表題「複合DNAメチル化フィンガープリント生成法(Method for producing complex DNA methylation fingerprints)」);および
米国特許第6,251,594号(表題「DNAメチル化の相違に基づく癌診断法(Cancer diagnostic method based upon DNA methylation differences)」)。
本開示は被験者における過剰増殖性疾患または障害などのメチル化仲介性疾患の治療を含む。この方法は、薬学的に適合する担体中、メチル化仲介性疾患の発生または進行を阻害するために有効な量の、類似の低メチル化作用を有する化合物ゼブラリン、またはその類縁体、模倣物質、もしくは誘導体、あるいはそのような化合物と一つまたは複数の他の医薬品との組み合わせを、被験者に投与する段階を含む。治療は、そのような疾患に対する重大なリスクを有する人口統計群のいかなる患者においても予防的に用いることができるが、被験者は疾患/状態の明確な診断またはそのような疾患発生の可能性を高める一つもしくは複数の因子(例えば、遺伝、環境、または生活様式因子)同定などの、より具体的な基準を用いて選択することもできる。
本開示はゼブラリン化合物と高メチル化関連疾患の治療において有用な一つまたは複数の他の物質との併用も企図する。例えば、本開示の化合物を有効な量の他の医薬品と組み合わせて投与することができる。いくつかの態様において、一つまたは複数の公知の抗癌剤がゼブラリンとともに含まれている。「組み合わせて投与」なる用語は活性物質の同時および逐次投与の両方を意味する。
本明細書に開示するゼブラリンおよび関連化合物は、DNAメチル基転位酵素阻害に用いるためのキット、核酸のメチル化低減に用いるためのキット、ならびに障害、状態または疾患(例えば、新生物などの過剰増殖性障害、特に一つまたは複数の遺伝子配列のメチル化によって仲介される過剰増殖性障害)の予防および/または治療のためのキットの形で供給することができる。そのようなキットにおいて、一つまたは複数の容器内で低メチル化に有効な量の一つまたは複数の化合物が提供される。化合物は、例えば水溶液中に懸濁して、または凍結乾燥(freeze-dried)もしくは凍結乾燥(lyophilized)粉末として提供することもできる。特定の態様において、化合物は薬学的組成物の形で提供することになる。
実施例1:パンカビ属(Neurospora)におけるDNAメチル化の阻害
本実施例は、アカパンカビ(Neurospora crassa)におけるゼブラリンまたは関連化合物の低メチル化/脱メチル化活性を評価する方法であって、DNAメチル化研究の通常の実験系として役立つ方法を提供する。
菌株および培養
アカパンカビ(N. crassa)N644、N242およびN613株、ならびに培養条件は過去に記載されている(Selker、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9430-9435, 1998)。
7×104分生子/mlを接種した液体培養物から単離したDNA試料(〜1μg)でサザンハイブリダイゼーションを実施した。DNAをDpn II(D)またはSau3AI(S)で消化し、ゲル電気泳動で分画し、ナイロン膜に転写し、amRIP(図4A)またはψ63(図4B)配列について調べた。制限エンドヌクレアーゼDpn IIおよびSau3AIはいずれも配列GATCを認識するが、Sau3AIはC残基がメチル化されていると切断することができない。薬物濃度は5-ACでは12および24mM、TSAでは0.33および3.3μM、ならびにゼブラリンでは0.19、0.39、0.78、1.6および3.1μMであった。
プレート試験を過去に記載されたものと基本的に同様の固化培地で実施した(Selker、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9430-9435, 1998)。要するに、表示のアカパンカビの分生子約2000個を各プレートに播種した。播種後直ちに、各プレートの中央においた直径4mmのWhatman(商標)1番ペーパーディスクから薬物を投与した。
ゼブラリンによる処理はアカパンカビにおけるメチル化を低減した
代表的実験の結果を図4に示す。選択したサイズ標準(kb)および開始点(ori)を示している。対照ハイブリダイゼーション(図には示していない)から、消化が完全であることが示された。SおよびDレーンの間の差はDNAメチル化の指標である。
アカパンカビを用いて、メチル化の低減または逆転におけるゼブラリンの有効性を調べた(Selker、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9430-9435, 1998)。アカパンカビN644株は、am遺伝子の隣接直接繰返し配列(flanking direct repeat)に対するRIPの作用の結果起こったシトシンのメチル化によりサイレンシング(抑制)された大腸菌hph遺伝子の単一コピーを有する(IrelanおよびSelker、Genetics 146:509-523, 1997参照)。活性hph遺伝子はハイグロマイシン(hyg)耐性を与える。したがって、ハイグロマイシンを含むプレート上でのコロニーの増殖は、メチル化消失によるhph遺伝子の再活性化を示す。
dim-2に突然変異を有する菌株はすべての検出可能なメチル基転移酵素活性を欠いている(KouzminovaおよびSelker、「Dim-2 encodes a DNA-methyltransferase responsible for all known cytosine methylation in Neurospora」、EMBO J. August 1, 2001)。ゼブラリン毒性がそのメチル基転位酵素阻害活性によって仲介されているかどうかを調べるために、dim-s菌株(N613)および野生型対照(N242)を高濃度(400nmol)のゼブラリンで攻撃した。これらのプレートにハイグロマイシンは適用しなかった。
本実施例は、哺乳類細胞におけるDNAメチル化に対するゼブラリン有効性を解析するために用いられている方法を提供する。
細胞株
継代数7から15の間の10T1/2細胞の保存培養物を75cm2のプラスティックフラスコ(Falcon)内、10%熱不活化ウシ胎児血清および100U/mlペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Inc.、カリフォルニア州パロアルト)を加えたEagle基本培地中で増殖させた。培養物を空気中5%CO2、37℃の加湿インキュベーター内で増殖させた。
細胞を播種(3×105細胞/100mm皿)し、24時間後、表示の濃度の化合物で処理した。培地を薬物処理後24時間または48時間のいずれかの時点で変えた。
10T1/2細胞で筋小管形成を過去に記載されているとおりにアッセイした(Constantinidesら、Nature 267:364-366, 1977)。
DNAおよびRNAを処理の三日後にNucleoBond RNA/DNAミディキット(Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト)を用いて単離した。
全RNA(約10μg)を下記の試薬を用いて逆転写した:100単位のRNAsin(Promega Corp.、ウィスコンシン州マディソン)、0.1M DTT(Life Technologies, Inc.)、1000単位のMML V-RT(Life Technologies, Inc.)、1mMデオキシヌクレオチド三リン酸(Boehringer Mannheim、ドイツ)、75μg/ml BSA、1×MMLV-RT緩衝液(Life Technologies, Inc)、および0.025 ODUランダムへキサマー(Random Hexamers)(Amersham-Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)。反応混合物を25℃で10分間、42℃で45分間、90℃で3分間インキュベートした後、4℃で5分間冷却し、その間に1.25μlのMMLV-RT(200U/μl)を加え、次いで試料を42℃で45分間、75℃で10分間インキュベートし、-20℃で保存した。
10T1/2細胞における筋原性表現型の誘導
環の5つの位置で修飾されたシチジン類縁体(例えば、5-アザ-CRおよび5-アザ-CdR)は、胚細胞の非筋原性C3H 10T1/2 C18株における横紋筋細胞の形成を誘導しうる強力なDNAメチル化阻害剤である(JonesおよびTaylor、Cell 20:85-93, 1980)。したがって、10T1/2細胞に筋原性スイッチを受けさせるゼブラリンの能力を試験した(図7)。
T24膀胱癌由来細胞株は転写的にサイレントな高メチル化p16遺伝子を含み、これは5-アザ-CdRによって脱メチル化されて、p16遺伝子発現を再活性化しうることが明らかにされている(Gonzalgoら、Cancer Res. 58:1245-1252, 1998)。5-アザ-CdRは以前にp16発現を用量依存的様式で誘導することが明らかにされている(Benderら、Cancer Res. 58:95-101, 1998)ため、二つのリボヌクレオシド類縁体5-アザ-CRおよびZebをp16発現を誘導する能力を評価するために試験した(図8)。Zebは水溶液中で安定であるため、これらの細胞を異なる濃度のゼブラリンで24時間または48時間処理することによって、p16発現におけるゼブラリン処理延長の効果を試験した。次いで、RT-PCRを実施し、p16遺伝子が薬物治療によって誘導されるかどうかを評価した。
実施例2に記載のものと基本的に同様の方法を用いて、T24細胞の低濃度のゼブラリンによる持続的長期(40日間)処理の効果も試験した。
本実施例はゼブラリンによる処理が哺乳類の細胞株における腫瘍抑制遺伝子発現を再活性化するのに有効であるとの証拠を提供する。
Ms-SNuPEによるDNAメチル化の定量
規定のCpG部位の平均メチル化を、GonzalgoおよびJones(Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997)ならびに米国特許第6,251,594号に記載のとおりにMs-SNuPEアッセイ法を用いて定量した。要するに、ゲノムDNA(〜4μg)を4単位のEcoRI(Boehringer Mannheim)(p16プロモーター/エキソン1およびp16エキソン2;図9A)または4単位のRsaI(Boehringer Mannheim)(p3;図9B)で終夜消化して目的領域の外側を切断した。
p16プロモーター/エキソン1:94℃で3分間と、94℃で45秒間、67℃で45秒間、および72℃で45秒間を40サイクル、ならびに72℃で10分間の最終伸長段階。
p16エキソン2:94℃で3分間と、94℃で1分間、62℃で45秒間、および72℃で45秒間を40サイクル、ならびに72℃で10分間の最終伸長段階。
p3:95℃で2分間と、95℃で1分間、50℃で50秒間、および72℃で1分間を40サイクル、ならびに72℃で10分間の最終伸長段階。
コロニー形成アッセイ法のために10T1/2(250/60mm皿)およびT24細胞(100/60mm皿)を三組ずつ播種した。10T1/2細胞およびT24を表示濃度の化合物で処理した。いったん細胞コロニーが認識されれば(12〜14日後)、細胞を100%メタノール中で固定し、10%ギムザ染色剤で染色した。細胞の生存パーセンテージを、処理プレート上の平均コロニー数を未処理プレート上の平均コロニー数で割って100をかけることにより評価した。
10T1/2細胞株のDNAメチル化および細胞毒性に対するゼブラリンの効果
10T1/2細胞は5-アザ-CRまたは5-アザ-CdRいずれかの脱メチル化作用によって筋肉に分化するよう誘導されうるため、ZebのDNAメチル化を阻害する能力を調べ、これら二つの薬物と比較した。Ms-SNuPEにより分析した、これら三つの薬物によるDNAメチル化の阻害を表2に示している。0.3μMの5-アザ-CdRによる処理により、有効なメチル化は対照の86%に比べて54%を示したが、3μMの5-アザ-CRでは有効なメチル化は59%、30μMのゼブラリンでは58%となった(表2)。
10T1/2細胞を表示のシチジン類縁体で24時間処理し、9〜10日後に筋肉細胞について+から+++として採点した(+は最小の筋肉形成を表し、+++は最大の筋肉形成を表す)。DNAメチル化の阻害を定量するために、Ms-SNuPE分析を用いてp3遺伝子座のメチル化パーセントを分析した。細胞死滅は、同様に処理し、14〜16日後にギムザ染色剤で染色した、250細胞を含む培養物におけるコロニー形成率の低下によって決定した。結果は二つの異なる実験における三組のプレートで得た平均値である。
膀胱癌細胞株および腫瘍において、p16プロモーターおよびエキソン2遺伝子座はいずれもメチル化されることが多く、p16プロモーターの脱メチル化はp16発現に直接対応することが以前に見いだされている(Gonzalez-Zuluetaら、Cancer Res. 55:4531-4537, 1995;Benderら、Cancer Res. 58:95-101, 1998)。p16遺伝子発現が試験した三つの薬物すべてによって誘導されうる(図8)ことを考慮して、p16プロモーターおよびp16エキソン2両方の脱メチル化におけるこれらの薬物の有効性をMs-SNuPE分析によりさらに調査した。
T24細胞をゼブラリンで処理すると、DNMT1およびDNMT3b3のレベルの有意な低下が起こった。DNMT3b3のmRNAはT24細胞で発現される唯一の3b転写物で、DNMT3aレベルはこれに対する適当な抗体が得られないために評価することができなかった。したがって、図12に関して、タンパク質抽出物を処理および未処理両方のT24細胞から単離し(300万細胞群、処理は500μMのゼブラリンで48時間)、図12に示すとおりDNMT1およびDNMT3b3の得意抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。β-アクチンを導入対照として含め、各タンパク質の分子量を示す。
図10Bは、コロニー形成率の低下により測定した、三つのすべての薬物の培養T24細胞に対する細胞毒性について示している。3μM用量の5-アザ-CdRは非常に細胞毒性が高い(コロニー形成率75%低下)。5-アザ-CRは用量依存的細胞毒性を示し、最高レベルは100μM用量でみられた(コロニー形成率54%低下)。一方、ゼブラリンは用量依存的細胞毒性を示したが、時間依存的細胞毒性はわずかであった。すなわち、処理時間を延長しても、ゼブラリンのいかなる用量でも細胞毒性を有意に増大させることはなかった。最高の細胞毒性は1mMのゼブラリンで48時間処理したT24細胞で観察され(コロニー形成率23%低下)、これは5-アザ-CRまたは5-アザ-CdRのいずれと比べても有意に低い毒性である。
本実施例はウリジン-シチジンキナーゼ活性について組織を試験するための代表的方法を提供する。ウリジン-シチジンキナーゼはゼブラリン活性化に関与する第一の酵素であると考えられているため、腫瘍組織におけるその増加は、DNAメチル化の低減(または逆転)を最も必要としている組織での薬物の選択的活性に関する機構を提供する。
ヒト肺腫瘍からの臨床生検組織試料、および並行正常組織試料を、50mMトリスHCl、pH7.5、5mMベンズアミジン、20%グリセロール、および5%H2Oを含む緩衝液に懸濁した。抽出直前に緩衝液を2mM DTTおよび0.5mM PMSFにとった。組織試料をこの混合物中でホモジナイズし、次いで5秒パルスで3回超音波処理して細胞を破壊した。細胞抽出物を4℃、14,000gで10分間遠心分離し、上清を除去した。
1U/CK:ウリジン/シチジンキナーゼpmol/分/mgタンパク質;腫瘍の値を正常組織の値の上に示す。
2腫瘍における活性/隣接する対の正常組織における活性の比。
本実施例はBALB/c nu/nuマウスのEJ6腫瘍に対するゼブラリンのインビボ効果について記載する。さらに、実施例6はヒト腫瘍細胞に対するゼブラリンの有効性も示す。
4〜6週齢の雄BALB/c nu/nuマウス(Harlan、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能)の左右の側腹部にEJ6細胞(5×105/注射)を皮下接種した。肉眼的(50〜200mm3)腫瘍形成(4〜6週間後)後にゼブラリン処置を開始した。ゼブラリン(500mg/kgまたは1000mg/kg)を18日間毎日腹腔内注射または経口胃管栄養法にて投与した。対照マウスには0.45%食塩水を18日間腹腔内注射または経口胃管栄養法にて投与した。マウス(n=30)を5群(対照群、500mg/kg腹腔内注射、500mg/kg経口、1000mg/kg腹腔内注射、および1000mg/kg経口)に分類した。各処置群は最低5匹のマウス(1群につき少なくとも6腫瘍)からなっていた。
対照および処置マウス群の腫瘍切片を摘出し、H&E染色により分析した。各群から採取した腫瘍切片の全領域の代表的画像を比較した。染色した切片を調べることにより、未処置の腫瘍切片に対して処置腫瘍切片では支質に対する腫瘍細胞の比は低いことが明らかとなった。
BALB/c nu/nuマウスで増殖中のEJ6腫瘍細胞において、ゼブラリン処置後のp16遺伝子再活性化がヒトp16 cDNAに特異的なプライマーを用いたRT-PCRにより検出された。GAPDH mRNAレベルを投入RNAの量および完全性の対照とするために測定した。対照群は0.45%NaClの腹腔内注射または経口胃管栄養法いずれかにて擬似処置したマウスから得た腫瘍である。各群について、類似の独立した腫瘍6つのうちの1つから得た結果を図15に示している。
ヒト膀胱癌細胞(T24)を抗生物質含有DMEM+10%FCS培地中でインキュベートした後に、ゼブラリンの代謝を同定した。これらの実験では比活性200DPM/pmolのゼブラリン(10μM、1μCi)を用いた。インキュベーション終了時に、細胞を60%メタノールで抽出し、一定量をSAX-10 HPLCで次のメタノール/水勾配を用いて分析した:1〜5分は1%MeOH、5〜25分は25%MeOHまでの勾配、25〜35分は25%MeOHの定濃度、および10分後に1%MeOHに戻る。リン酸化代謝物を標準合成試料との比較により同定した。この方法を用いて、6時間インキュベーション後の濃度の関数としての代謝物生成を調べた(図17)。生成した主代謝物は5'-三リン酸塩であった。一方、24時間のインキュベーション期間後にゼブラリン(10μM、1μCi)を一回投与すると、薬物作用の仲介において重要であると考えられる不明の代謝物(?2、図18)の生成がみられた。
Claims (55)
- 細胞中の核酸メチル化を低減、防止または逆転する方法であって、低メチル化に有効な量の2-ピリミジノン誘導体を細胞に投与し、それにより細胞中のDNAメチル化を低減、防止または逆転する段階を含む方法。
- 2-ピリミジノン誘導体またはその代謝物がDNAメチル基転位酵素を阻害する、請求項1記載の方法。
- 細胞が細菌細胞、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項1記載の方法。
- 細胞に高メチル化核酸分子を含むことが知られているか、または疑われる、請求項1記載の方法。
- 既知の、または疑いがある高メチル化核酸分子がCpGジヌクレオチドを含む、請求項4記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体が炭水化物誘導体を含む、請求項1記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体がゼブラリンまたはゼブラリン誘導体である、請求項6記載の方法。
- DNAメチル化を低減、防止または逆転することが細胞の腫瘍形成状態を改善する、請求項7記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体がオリゴヌクレオチドに組み込まれる、請求項6記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体がオリゴヌクレオチド中で細胞に投与される、請求項9記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体がRNAに組み込まれる、請求項9記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体がDNAに組み込まれる、請求項9記載の方法。
- 細胞中の核酸が高メチル化されていると知られているか、または疑われる、請求項9記載の方法。
- 細胞が細菌細胞、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項9記載の方法。
- 細胞が過剰増殖細胞である、請求項9記載の方法。
- 過剰増殖細胞が哺乳類腫瘍細胞である、請求項15記載の方法。
- シチジンデアミナーゼ阻害剤を細胞に事前または同時投与する段階をさらに含む、 請求項1記載の方法。
- シチジンデアミナーゼ阻害剤がテトラヒドロウリジンである、請求項17記載の方法。
- 2-ピリミジノン誘導体が4,6-ジフルオロピリミジノン誘導体である、請求項1記載の方法。
- 4,6-ジフルオロピリミジノン誘導体が4,6-ジフルオロ-ゼブラリン誘導体である、請求項19記載の方法。
- 被験者の高メチル化関連疾患、状態、または障害を治療または改善する方法であって、被験者に低メチル化に有効な量のゼブラリン、または低メチル化活性を保持しているその類縁体もしくは誘導体を投与する段階を含む方法。
- 疾患が過剰増殖性疾患である、請求項21記載の方法。
- ゼブラリンが薬学的組成物の形で投与される、請求項21記載の方法。
- ゼブラリンがオリゴヌクレオチドに組み込まれる、請求項21記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがRNAである、請求項25記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがDNAである、請求項25記載の方法。
- ゼブラリンがオリゴヌクレオチド中で提供される、請求項21記載の方法。
- 細胞の腫瘍形成状態を改善する方法であって、細胞内のCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化を低下させるため、低メチル化に有効な量のゼブラリンを細胞に投与し、それにより細胞の腫瘍形成状態を改善する段階を含む方法。
- 抗癌剤を細胞に投与する段階をさらに含む、請求項29記載の方法。
- 抗癌剤がイフォスファミド、シスプラチン、メトトレキセート、プロカリジン、エトポシド、BCNU、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、パクリタキセル、ドキソルビシン、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項30記載の方法。
- ゼブラリンが薬学的組成物の形で提供される、請求項29記載の方法。
- 細胞が被験者の細胞である、請求項29記載の方法。
- 標的配列のメチル化阻害法であって、配列を標的配列の少なくとも一部に相補的な誘導体化オリゴヌクレオチドと接触させる段階を含み、誘導体化オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの2-ピリミジノン部分を含む方法。
- オリゴヌクレオチドがDNAを含む、請求項34記載の方法。
- オリゴヌクレオチドがRNAを含む、請求項35記載の方法。
- 標的配列がCpGジヌクレオチドを含む、請求項34記載の方法。
- 標的配列が腫瘍抑制遺伝子の調節領域を含む、請求項34記載の方法。
- 接触が細胞内で起こる、請求項34記載の方法。
- 細胞が細菌細胞、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項39記載の方法。
- 誘導体化オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのゼブラリン残基を含む、請求項38記載の方法。
- ゼブラリンに比べ生体系における低メチル化活性を保持している、ゼブラリンの誘導体。
- ゼブラリンに比べてより強い低メチル化活性を有する、請求項42記載の誘導体。
- リン酸化ゼブラリン誘導体である、請求項42記載の誘導体。
- 2'-デオキシ-ゼブラリン誘導体である、請求項44記載の誘導体。
- 核酸メチル化を低減、防止または逆転するためのキットであって、有効な量の2-ピリミジノン誘導体を含むキット。
- 2-ピリミジノン誘導体が4,6-ジフルオロ-ゼブラリン誘導体である、請求項47記載のキット。
- 阻害を必要としていることが疑われる被験者の高メチル化仲介性疾患または障害を治療するための、請求項47記載のキット。
- 説明書をさらに含む、請求項47記載のキット。
- 治療を必要とする被験者に少なくとも一回用量の治療物質を投与するための用法を説明書に含む、請求項50記載のキット。
- 2-ピリミジノン誘導体がゼブラリンである、請求項47記載のキット。
- 2-ピリミジノン誘導体およびテトラヒドロウリジンを含む薬学的組成物。
- 2-ピリミジノン誘導体がゼブラリン類縁体である、請求項53記載の組成物。
- 2-ピリミジノン誘導体がゼブラリンである、請求項54記載の組成物。
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