JP2005507634A

JP2005507634A - 豚の育種改良のための豚繁殖呼吸器障害症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）に対する宿主感受性ファクターの同定と応用、およびｐｒｒｓウイルス増殖のための非サル組替型細胞系列と新規クラス抗ウイルス化合物の標的の開発

Info

Publication number: JP2005507634A
Application number: JP2002561492A
Authority: JP
Inventors: サンジェイカピル; クマールシャンムクハッパ
Original assignee: カンザスステイトユニバーシティリサーチファウンデーション
Priority date: 2001-01-29
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2005-03-24
Also published as: AU2002248394A8; US20030186236A1; US7175984B2; US20030165814A1; US6740490B2; WO2002060924A2; AU2002248394A1; WO2002060924A9; WO2002060924A3

Abstract

豚繁殖呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は豚において深刻な経済的損失を引き起こしている。本願発明は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性のない細胞系（ＢＨＫ−２１）に該細胞系列に感受性を与えるＣＤ１５１をトランスフェクトさせることにより、ＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性ファクターであることを決定する事にある。ＣＤ１５１は、血液血小板および生殖細胞質を含む細胞物質から採取できるため、本願発明は、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に関して種々の異種の豚をスクリーニングする非侵襲法を提供し、よって育種プランを改良することにある。価値のある動物の場合には、そうしたスクリーニングから得られる結果は、その動物の子孫どれもがＰＲＲＳウイルスに対する感受性を示し得る。加えて、ウイルスＲＮＡとＣＤ１５１の相互作用は高い親和性を持ち、コンビナトリアル・ケミストリーを用いることにより更に改良され得る抗ウイルス化合物を検出する１つの道具として用いられ得る。したがって、ウイルスＲＮＡとＣＤ１５１との相互作用をブロックすることができる抗ウイルス化合物が開発され得る。有利なことには、ＣＤ１５１をトランスフェクされた非サルウイルス細胞系列は、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性を獲得することができる。そして、豚からの異種移植（ｘｅｎｏｐｌａｎｔｅｄ）を受けた器官においては霊長類ウイルスの起源となり得るため避けられるサルウイルス細胞系列に対して、これら非サルの組替型細胞系列は、生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を製造するために使用され得る。最後に、本願発明はウイルスＲＮＡが標的細胞の中に入る基本的メカニズムを記述する。この新規クラスの蛋白質は、ウイルスＲＮＡエントリー蛋白質と命名されている。そして、抗ＲＮＡエントリー蛋白質と命名された新規な種類の化合物はウイルスＲＮＡの侵入をブロックするために使うことができ、それによってウイルス感染を防ぐのである。

Description

【０００１】
塩基配列リスト
本願には、タイプ打ちした塩基配列リストを載せており、またフロッピーディスクおよびＣＤＲＯＭに、コンピューターで読み取り可能なＡＳＣＩＩファイルの形式で保存したこの塩基配列リストと同一内容のものも提出した。
【０００２】
発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、ＣＤ１５１および／または豚ＣＤ１５１を用いたＤＮＡＰＣＲに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）による、異なる豚育種系統のスクリーニングに関する。ＣＤ１５１を遺伝的に僅かに含むか、もしくは含まない豚系統の選択は、豚繁殖呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染に対して感受性の低いまたは感受性の全くない子孫を生ずる。本願発明はまた、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に関して、生きた豚および豚の生殖細胞質をスクリーニングするための非侵襲性の方法にも関する。加えて、本願は非サル（ｎｏｎ−ｓｉｍｉａｎ）細胞系列におけるウイルスの不活化ワクチンおよび生ワクチンを作るための高力価ストック（ｈｉｇｈｔｉｔｅｒｓｔｏｃｋ）を増殖させるための細胞系列の開発について記載する。更に、本願発明はワクチンに用いられる力価ストックをつくるために、以前は感受性のなかった細胞系列を、感受性のある細胞系列に形質転換する際に有用な新規なプラスミドを記載する。本願は、またＣＤ１５１とＰＲＲＳウイルスの３’−非翻訳領域ＲＮＡとの間の相互作用をブロックする新規クラスの抗ウイルス化合物を発見するための１つの道具を提供することにも関する。この新規クラスの化合物は抗ＲＮＡエントリー蛋白質（ａｎｔｉ−ＲＮＡＥｎｔｒｙＰｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｔｉ−ＲＥＰｓ）と命名されている。
【０００３】
従来の技術
豚繁殖呼吸器障害症候群（ＰＲＲＳ）は豚の重要なウイルス病として１９８０年代後半に発生したＲＮＡウイルスである。ＰＲＲＳはアメリカ合衆国においてまた全世界において、最も重要な経済的に意味のある病気である。ＰＲＲＳの起源と進化については分かっていない。それゆえ、ＰＲＲＳは豚の新規に出現した（ｅｍｅｒｇｉｎｇ）ウイルスである。以前から「神秘的な豚の病（ｍｙｓｔｅｒｙｓｗｉｎｅｄｉｓｅａｓｅ）」、「豚不妊呼吸器障害症候群（ｓｗｉｎｅｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）」、あるいは「青耳病（ｂｌｕｅｅａｒｄｉｓｅａｓｅ）」として呼ばれてきたこの病気は、アメリカ合衆国およびカナダの育種中の群れに、多大な損害を生じた。同様な病気はヨーロッパの多くの地域でも現われ、ＰＲＲＳウイルスは世界中で検出されてきた。この病気は、２つの形態で明らかにされている。１つは、妊娠中の雌豚における深刻な生殖機能不全、死産児数の増加、ひからびた（ｍｕｍｍｉｆｉｅｄ）あるいは虚弱な状態での豚出生児、分娩率の減少および次の発情期への回復遅延（ｄｅｌａｙｅｄｒｅｔｕｒｎｔｏｅｓｔｒｕｓ）を引き起こし、他の形態は、感染した豚の肺中に現われる傷害によって明示づけられるように、豚に呼吸困難を生ずる。
【０００４】
ＰＲＲＳ病の生殖器系の形態は、Ｋｅｆｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｋ．，”ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＦａｉｌｕｒｅｏｆＵｎｋｎｏｗｎＥｔｉｏｌｏｇｙ”，ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＳｗｉｎｅＰｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓＮｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，１：１０９（１９８９）に記載されている。ＰＲＲＳ病の生殖器系の形態の最も顕著な臨床症状は、自発型後期堕胎、未熟児の出産（全出産の２０−３０％の高比率にもなり得る）、およびひからびた胎児の分娩、死産児、病弱な豚仔である、そのような臨床症状は、豚の群において、典型的には、４週間から１６週間あるいはそれ以上の期間観察される。皮膚の黄褐色の退色と死後自己溶解によって証拠づけられるように、ＰＲＲＳ病の影響を受けた一腹の子豚の内の死産児はしばしばミイラ化（ｍｕｍｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の初期段階に見られる。ドーム形をした、胎児の頭部の奇形はまたしばしば見られる。雌豚の感染は気づかないうちに進行し、あるいは、傷害を受けた一般症状が数日間続くことにより明らかになるだろう。例えば、雌豚は食事を取らなくなり、正常体温以上または以下の体温を経験する。分娩段階において、雌豚は機能低下、無気力、発熱、およびときどき嘔吐を発現する。病気の影響を受けた群の中には、７５％までの豚仔が死亡することもある。ＰＲＲＳ病の経済的な結果は、したがって、大損害を及ぼすことになる。
【０００５】
ＰＲＲＳ病の呼吸器の形態は、年齢３−８週の豚仔においてもっとも著しい臨床徴候を発現するが、感染した群における全ての年齢の豚に起こることが報告されている。ＰＲＲＳ病に罹った豚仔は成長が遅く、毛皮はざらざらで、呼吸困難（動悸）を起こし、死亡率（離乳前の約８０％にまで及ぶ死亡率）が増加している。ＰＲＲＳウイルスによる感染と関連した問題と闘うため、最新のＰＲＲＳ株に対する免疫を与える試みの中でワクチンが開発されてきた。現在のワクチンは、単にごくわずかに効果的であり、豚全個体群の中に、霊長類ウイルスが連続的に取り込まれる危険性を有するサル起源の細胞系列において全て生産されている。このＰＲＲＳ病の呼吸器系形態の影響を受けた、豚仔の巨視的および微視的損傷の予備的な試験における所見は、微視的な肺の損傷が、このＰＲＲＳ病の１つの重要な臨床的特徴であることを示唆している。
【０００６】
ＰＲＲＳウイルスは、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ属のＮｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目に属している。この属の他のメンバーとしては、馬動脈炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅａｒｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｅｌｅｖａｔｉｎｇｖｉｒｕｓ）、および猿出血熱ウイルス（ｓｉｍｉａｎｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ）が含まれます。一般に、ヒトのアルテリウイルス（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）は知られていない。ＰＲＲＳウイルスゲノムは、長さ約１５．１Ｋｂの＋鎖ＲＮＡである。５’末端の１５６−２２０番目ヌクレオチドおよび３’末端の５９−１１７番目ヌクレオチドの非翻訳領域（ＵＴＲ’ｓ）が、ウイルスゲノムに接している。ウイルスゲノムは、機能蛋白質および構造蛋白質をコードした８つのオーバーラッピングするオ―プンリーディングフレーム領域を有している。ＰＲＲＳウイルスは、感染した豚のマクロファージ中で、主として成長する。細胞培養中では、ＰＲＲＳウイルスは、ＣＬ２６２１，ＭＡ−１０４，ＭＡＲＣの各細胞系列の中で生育し、また豚の肺胞マクロファージ（ａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の初代培養においても生育することが知られている。これら連続した細胞系列の全てがサルに起源を有し、霊長類ウイルス（ｐｒｉｍａｔｅｖｉｒｕｓ）が豚個体群へ入り込む危険性を生ずる。ウイルスの侵入は、受容体を介したエンドサイトーシス（内向きの膜動輸送）によって起こり、そして受容体はヘパリン様分子として特徴づけられてきた。しかしながら、どのようにウイルスＲＮＡがエンドサイトーシスのあと、細胞質へ入るかのメカニズムは分かっていない。
【０００７】
アルテリウイルスの複製は、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）の複製と同様である。ゲノムおよびサブゲノムの−鎖ｍＲＮＡ（（−）ｓｅｎｓｅｍＲＮＡ）は、感染された細胞において、＋鎖ｍＲＮＡに沿って作られる。サブゲノム−鎖ｍＲＮＡは、コロナウイルスにおいてｍＲＮＡ合成の主要な鋳型として、機能していることが示されてきた。不連続な転写はアルテリウイルスの中で起こり、ｍＲＮＡは機能的にモノシストロニック（単一遺伝子様）であり、転写末端は３’末端が共通であって、かつｍＲＮＡの積み重ねセット（ｎｅｓｔｅｄｓｅｔ）の形態をもっている。遺伝子間の共通配列が、連結配列（ｊｕｎｃｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＵＣＡＡＣＣを通して、共通のリーダーをコーディング領域（ｔｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）に連結している。マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）およびコロナウイルスにおいて、リーダー、遺伝子間配列およびＲＮＡ本体の三者間の相互作用には、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓに作用する要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）が関わっている。上記ＭＨＶ、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）およびポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）のそれぞれ３’非翻訳領域（ＵＴＲｓ）は、ゲノムの転写のために必須であることが示された。３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と上流の調節配列の間には、これら二者間の相互作用のための配列相補性がほとんどなく、そのため３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と上流の調節配列の間の相互作用は、ウイルス蛋白質と細胞蛋白質の両方に関わるＲＮＡ−蛋白質− ＲＮＡ三者間相互作用を通して媒介される。
【０００８】
ウイルス蛋白質および細胞内蛋白質と、ウイルスの５ ’および３ ’非翻訳領域との間の相互作用に関しては、数多くの研究がある。シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓｖｉｒｕｓ）、ブロムモザイクウイルス（ｂｒｏｍｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）、Ｑ βファージ（Ｑβ ｐｈａｇｅ）およびポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）は、転写を進めるために、或る宿主細胞蛋白質とウイルスの非翻訳領域とが相互作用することを必要とする。数多くの蛋白質が、これらの調節領域と結合していることが示されてきたが、そのうちほんの幾つかの蛋白質についてのみ特徴が述べられてきた。Ｌａ蛋白質、ポリリボＣ結合蛋白質２（ｐｏｌｙ（ｒＣ）ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２）およびポリピリミジントラクト結合蛋白質（ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｔｒａｃｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）が、ポリオウイルスの非翻訳領域に結合することが示されてきた。ポリピリミジントラクト結合蛋白質および異種生物由来の細胞核のリボヌクレオプロテイン（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス、ｍｏｕｓｅｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）のリーダー配列に結合することが示されている。これらの蛋白質は、ｍＲＮＡのスプライシングと輸送において１つの役割を演じていると予想されている。細胞骨格蛋白質およびシャペロン蛋白質の中には、アクチン、チューブリンおよび熱ショック蛋白質のように、ＲＮＡ結合活性を持つことが示されているものがある。これらの蛋白質は、ウイルスＲＮＡ合成を行う際に、もしくはＲＮＡ複製複合体（ＲＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）を複製の場所へ方向づけして輸送する際に、構造的な役割を演じているかも知れない。
【０００９】
ウイルスＲＮＡと相互作用する宿主細胞蛋白質の研究は、いまだ揺籃期の段階であり、この相互作用に関しては重要な情報、とりわけ宿主感受性ファクターに関連した情報が欠けている。ＰＲＲＳウイルスと同様、アルテリウイルスにおいてさえ宿主感受性ファクターは研究されてこなかった。それゆえ、豚育種に際して、ＰＲＲＳウイルスに対する宿主感受性の増加を示すマーカーは、分かっていない。しかしながら、実験的感染を行ったのち、感染した豚を屠殺し、豚肺中の間質性肺炎およびＰＲＲＳウイルス抗原の存在を調べるための組織病理学（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）および免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）についての更なる検査を行い、これらの結果に基づいて育種の異なる豚は、ＰＲＲＳ感受性ウイルスに対する感受性が異なることが知られている。
【００１０】
更に、サル（ｓｉｍｉａｎ）細胞系列は、最近のＰＲＲＳウイルスワクチンの細胞培養を提供するが、これは危険な作業である。これらの細胞培養のためにサル細胞系列を使用することが、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）を目的とした、豚の種にかなりの霊長類のウイルスを偶然に取り込むことになるかも知れない。豚は、ヒトの器官移植の不足に対応するために異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）される器官の起源（ｓｏｕｒｃｅ）として現在ますます研究されつつあるために、霊長類の細胞系列を豚個体群を取り込むことは、最終的には、異種移植を受けた器官を有するヒトへのリスクを与える。それゆえ、豚ワクチンの製造の際にサル（ｓｉｍｉａｎ）細胞種の使用を避けることは賢明である。
【００１１】
したがって、当該技術において必要とされることは、ＰＲＲＳウイルス感染への感受性に関して豚をスクリーニングする方法である。好ましくは、このスクリーニングテストは、ＤＮＡを基礎（ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ）としたものであり、感受性遺伝子の重要なモチーフ（ｍｏｔｉｆ）またはドメインにおける塩基配列の多様性と、ＰＲＲＳに対する低度、中度、高度の感受性とを相互に関連づけることができる。より好ましくは、このスクリーニングは非侵襲性であり、豚の生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）および全血を含む多くの異なる動物の体液および細胞物質について実施され得る。より好ましくは、このスクリーニングはＰＲＲＳに対する低度の感受性を持った豚を検出するために耳ノッチ（ｅａｒｎｏｔｃｈ、耳の刻み目）から採取するバイオプシー（生物材料）について実施される。加えて、必要とされることは、これらのスクリーニング結果を、豚の子孫のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性が少なくなるように設計された育種プログラム（ｂｒｅｅｄｉｎｇｐｒｏｇｒａｍ）に用いる１つの方法である。当該技術において他に必要とされることは、ＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性（ウイルスに対する感染しづらさ）に有害な影響を与え、かつこの抵抗性と相互に関連するＤＮＡの一塩基多形（ＳＮＰｓ）を確認することである。更に必要とされることは、ＰＲＲＳウイルス感受性に有害な影響を与える遺伝子と、調節要素および／またＰＲＲＳウイルス感受性に関連して遺伝子の発現と調節に影響を与える他の遺伝子（ｃｉｓ− およびｔｒａｎｓ−に作用するファクター）との間の相互作用を理解することにある。更にまだ必要とされることは、染色体の構成および遺伝子の位置を理解することである。更に必要とされるものは、霊長類ウイルスが豚個体群に交差することを避けるために、高力価ＰＲＲＳウイルスワクチンストックを増殖させるための非サル細胞系列である。そのような細胞系列は、異種移植を受けた豚で用いられるワクチンにとりわけ適している。最後に、必要とされるものはウイルスＲＮＡが細胞に侵入することをブロックすることができるクラス（ｃｌａｓｓ）の化合物である。
【００１２】
発明の概要
本願発明は、上記従来技術の問題を解決し、技術状態に明確な進歩を与えるものである。とりわけ、本願発明を通して、ＰＲＲＳウイルス感受性に対する非侵襲性遺伝学テスト、更なる育種のための豚の選択、非サル細胞系列における高力価ワクチンの開発、ＰＲＲＳウイルス処置に用いられ得る化合物の開発、およびＰＲＲＳゲノムの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）ＲＮＡとウイルス感染に対して感受性を有する細胞系列との間の相互作用を検出しかつ特徴づけることができる方法が提供され、これらの方法によって、抗ＲＮＡエントリー化合物（ａｎｔｉ−ＲＮＡＥｎｔｒｙＣｏｍｐｏｕｎｄｓ）と呼ばれる新規な抗ウイルス化合物の開発につながる。加えて、本願発明は、豚ＣＤ１５１のゲノム塩基配列およびゲノム構成を規定し、豚ＣＤ１５１のＲＮＡ結合活性を明示し、異なる組織中のＣＤ１５１のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を確認し、およびトランスフェクトされた豚ＣＤ１５１遺伝子を持つ非サル細胞系列を作り出す。最後に、本願発明は、豚ＣＤ１５１の分子全体としての活性を説明し、ＲＮＡ結合活性を与えかつ非サル細胞系列であるｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ−１２（ＢＨＫ−２１）へ感受性を与えるＣＤ１５１ドメインを同定する。
【００１３】
したがって、本願発明の１つの特徴は、比較的非侵襲性である方法を用いて、豚をスクリーニングする方法を提供することである。例えば、豚から血液サンプルを採取し、血小板中にＣＤ１５１が存在することが、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／またＤＮＡＰＣＲｓを用いて検出され得る。また、ＤＮＡＰＣＲｓは豚仔から採取した耳ノッチ（ｅａｒｎｏｔｃｈ）バイオプシーまたは尻尾スニップ（ｔａｉｌｓｎｉｐ、尻尾の切れはし）バイオプシーについて実施され得る。ＣＤ１５１量が少ないか、もしくはＣＤ１５１が全く検出されない豚さえも選択して、更に育種を続けることができるので、この種のスクリーニングから得られた知識は豚の育種プランを大いに改善し得る。本願発明の強み（ａｄｖａｎｔａｇｅ）を用いた豚育種プログラムの１つの例は、個々の豚のＣＤ１５１量をＣＤ１５１の既知の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）と比較することである。この既知の標準は、豚からの細胞物質（例えば、体液または組織）の数多くのサンプルからのＣＤ１５１量を比較することによって一般に得られ、全サンプル中に検出されるＣＤ１５１量の平均を表す。同一動物由来の異なる細胞物質は異なるＣＤ１５１量を有するので、既知の起源（血液、血小板、精子細胞、生殖細胞質、精子、卵子等）の細胞物質由来のＣＤ１５１量をその特定の細胞物質に対応する既知の標準と比較することが好ましい。その上、既知の標準は、豚のＣＤ１５１量の平均を表すので、個々の豚の検出されたＣＤ１５１量をその平均値と比較することによって、１個体の豚が更なる育種のために選択される。一般に、ＰＲＲＳ感染に対して抵抗性が増加した子孫を作り出すことを意図しているので、平均より低いＣＤ１５１量を有する豚を選択することが好ましい。豚をスクリーニングする他の方法は、ＰＲＲＳの減少した感受性と相互関連性をもった望ましい一塩基多形（ＳＮＰｓ，ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を同定することを含む。このように、豚をしてＣＤ１５１量に関して特定の望まれる百分率にランクづけさせる一定量のＣＤ１５１を有する豚であって、他の望ましい育種特性を持つ豚が、更に育種を続けるために選択される。好ましくは、これらの豚は、ＣＤ１５１量に関して下位５０％にランク付けされる。より好ましくは、これらの豚はＣＤ１５１量に関して下位８０％にランク付けされる。更により好ましくは、これらの豚はＣＤ１５１量に関して下位９０％にランク付けされる。そして最も好ましくは、これらの豚はＣＤ１５１量に関して下位９５％にランク付けされる。言い換えれば、この最も好ましいグループ分けでは、全ての豚の９５％が、テストされる一匹の特定の豚よりも多いＣＤ１５１量を有することになる。もちろん、ＣＤ１５１を欠いた豚は更に育種を続けて、ＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性のある（ウイルス感染を受けづらい）豚のノックアウト系統（”ｋｎｏｃｋｏｕｔ” ｌｉｎｅ）を作り出すことができる。
【００１４】
本願発明に関連した態様においては、精子細胞のような生殖細胞質の形の細胞物質、もしくは希釈した豚の精子は、豚を育種施設に仕分ける前にＣＤ１５１が存在するかしないにつきスクリーニングされ得る。また、上記した同じ一般的手順を用いて、そのようなスクリーニングから得られた知識は、将来豚の育種プランを立て、生殖細胞質を大量に使用するために非常に貴重である。豚の、射精量は約５００ｍｌであり、射精された精子は更に希釈されるので、射精した豚がもはや農場にいず、死亡し、あるいは売却されたとしても、価値ある雄豚由来の生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）は、長年多くの雌豚のために使用され、将来数世代に渡って、望ましい遺伝子型または遺伝的性質を持った豚仔を提供し得る。そのような凍結した生殖細胞質は、人工授精の前にもＣＤ１５１量およびＰＲＲＳウイルス感受性に関しても、またスクリーニングされ得る。ＣＤ１５１量が多いことは、細胞によるウイルス生産および放出が多いことと相互に関連しているので、このスクリーニングは、また豚もしくはその子孫のＰＲＲＳウイルスによる感染に対する感受性をも示す。それゆえ、これらのテストは、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に関して、農場に生存する動物をスクリーニングするためにもまた応用され得る。生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）中に検出されるＣＤ１５１量に基づき、更に育種を行うための豚の選択は次の様に行われる。生殖細胞質のサンプルが取り出され、そのサンプル中のＣＤ１５１の量またはレベルがＲＴ−ＰＣＲによって決定される。異なるタイプの生殖細胞質が異なる量のＣＤ１５１を一般的には含むので、この結果（ＣＤ１５１の量）はそのサンプルに対する既知の標準と比較される。その既知の標準は、そのようなサンプルの数多くのサンプルを定量した結果を平均することによって決められるだろう。標準と比較して減少したレベルのＣＤ１５１を発現（し、またこれによってＰＲＲＳウイルスの感染に対して減少した感受性を有）し、更にまた他の価値ある育種の特徴を所有する豚は、更なる育種のために選択されるだろう（ｗｏｕｌｄｂｅｓｅｌｅｃｔｅｄ）。好ましくは、これらの豚は、テストされた全ての豚の内の約５０％未満のＣＤ１５１量を有する。より好ましくは、これらのレベルは少なくても約８０％以下となる。更により好ましくは、少なくとも約９０％、そしてより更により好ましくは、ＣＤ１５１量はテストされた全ての豚のうち少なくとも全ての豚の内の約９５％のものより少ない。他の言葉でいえば、これらの豚由来のサンプルにおけるＣＤ１５１量はテストされた全ての豚の下位約２０％、約１０％、約５％にランク付けされるだろう。もちろん、細胞物質のサンプル中のＣＤ１５１の量が定量され、定量された量のＣＤ１５１が育種戦略に影響を与えるとすれば、本願発明の方法を用いて、この育種プランに幅広い多様性が生まれ、よってこれらの多様性は十分に説明がつくものと考えられる。
【００１５】
本願発明は、また動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を確かめるための方法を提供する。そのような方法は、細胞物質のサンプルを得るステップ、このサンプルについてＣＤ１５１アッセイを実施するステップおよびこのアッセイの結果を使って、ＰＲＲＳウイルスに対する動物の感受性を測定するステップを含むだろう。アッセイのために選ばれた細胞物質は、検出できるレベルのＣＤ１５１を含むいかなる体液、組織、半精製した、あるいは精製した細胞標品（ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を含むいかなる細胞物質であっても良い。例えば、血液、血小板、生殖細胞質、精子細胞、卵子、および精液は全て検出できるレベルのＣＤ１５１を含む。１つの好ましいアッセイは、サンプルからＲＮＡを抽出するステップ、そして抽出したＲＮＡ上でＲＴ−ＰＣＲを実施するステップを含む。好ましくは、結果から検出されたＣＤ１５１を定量した結果として、ＣＤ１５１量が与えられる。この定量された量（ａｍｏｕｎｔｏｒｌｅｖｅｌ）は、そこでＣＤ１５１量に関して既知の標準と比較することができ、こうして、その定量化された量はその動物に関してＰＲＲＳ感染に対する感受性を示す。更により好ましくは、細胞物質サンプルは、既知の起源に由来しており、既知の標準はその同一の起源を持つ細胞物質に対する既知の標準を表す。
【００１６】
本願発明は、一匹の動物が、細胞物質においてＣＤ１５１が存在するかするかしないかに基づいて、ＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性を有するかどうかを決定するための方法を更に提供する。もしＣＤ１５１が存在しなければ、動物は一般にＰＲＲＳウイルス感染を受けつけない。もしＣＤ１５１が存在すれば、実際のＣＤ１５１量に基づき、様々な程度で典型的に（ｔｙｐｉｃａｌｌｙ）ＰＲＲＳウイルス感染を受けやすい。こういうふうに、細胞物質のいかなるサンプルにおいても、動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性は、検出されるレベルのＣＤ１５１に基づいて分類される。そのような方法は、テストされた動物から細胞物質のサンプルを得るステップ、そのサンプルのＣＤ１５１量を見いだすためにサンプル上でアッセイを実施するステップ、テストされた動物のＣＤ１５１量を既知のスケール（ｓｃａｌｅ）のＣＤ１５１量と比較する（ここで既知のスケールがＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性の一定程度に対応している）ステップ、そして最後に、既知のスケールとの比較に基づいてテストされた動物のＰＲＲＳウイルス感染を分類するステップを含む。好ましくは、細胞物質のサンプルが既知の起源のものであり、ＣＤ１５１のスケールが他の動物における同一の起源由来の細胞物質のスケールを表すことである。そのような分類としては、その動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を、百分率でランク付けすることもできる。
【００１７】
本願発明の他の態様は、野生種（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）の検出のための試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）での診断テストがＰＲＲＳウイルスに対する抗体と同様に開発されたことである。そのようなテストは、一般に一匹の動物から細胞物質のサンプルを得るステップ、組替型細胞系列におけるウイルスに対する抗体もしくはウイルスそれ自体を検出するよう設計された診断テストを実施するステップ、個々の豚あるいは豚の群がＰＲＲＳ病に罹っているのかどうかの診断が正しいことを確認するために行う実験（ｔｅｓｔｉｎｇ）の結果を用いるステップを含む。より好ましい診断テストは、ウイルス単離アッセイ（ｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｉｏｎａｓｓａｙ）、エライザ（酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ）のような免疫診断アッセイ、間接蛍光抗体テスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔ）、および間接免疫ペルオキシダーゼテスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｔｅｓｔｓ）を含む。好ましくは、用いられる組替え細胞系列はウイルスのより活発な複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を可能とし、そのテストをＰＲＲＳウイルス感染あるいは抗体の存在に対して、より感受性の高いものとすることである。
【００１８】
本願発明のもう１つの態様は、豚群の免疫を助けるためにＣＤ１５１によって形質転換された細胞系列において、より高い力価（ｈｉｇｈｅｒｔｉｔｅｒ）を持つＰＲＲＳウイルスワクチンが開発され得ることだ。本願発明に関連する態様として、他の非サル細胞系列がＣＤ１５１によって形質転換され、高力価のＰＲＲＳウイルスワクチンストックを増殖させるのに用いられ得る。異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（とりわけ豚において）が開発されればされるほど、このことはますます問題となってきた。サル細胞中で作られるワクチンを使用することは、サルのウイルスを豚に伝達することとなり、それゆえ異種移植に用いられる器官もまたこれら霊長類ウイルスのうちいくつかのものに対する感受性を持っている。それゆえ、ＰＲＲＳワクチンのために霊長類あるいはサルの腎臓細胞系列を用いることを避け、それによって、ヒトの移植レシピエント個体群へあとになって霊長類ウイルスが取り込まれるリスクを除去することが、より安全である。ＰＲＲＳ感染に既に感受性を持った細胞系列にとっての、ＣＤ１５１の更に高い生産を結果する形質転換が、本願発明の方法を用いて成される。
【００１９】
本願発明の他の態様は、形質転換された細胞系列を生産するために、非サル（ｎｏｎ−ｓｉｍｉａｎ）細胞系列が非サルＣＤ１５１によってトランスフェクトされる。この点において、霊長類ウイルスがヒト移植受容者個体群（ｔｈｅｈｕｍａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔｒｅｃｉｐｉｅｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）へ取り込まれることを完全に避けるために、非サル細胞を非サルＣＤ１５１によって形質転換することが好ましい。とりわけ好ましい、非サルＣＤ１５１塩基配列は、豚ＣＤ１５１の最初の完全ゲノム塩基配列を表すＳＥＱＩＤＮｏ．１４として与えられる。好ましくは、この塩基配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．１４）と少なくとも８４％の塩基配列相同性を有する塩基配列は、本願発明の目的のために細胞を形質転換するのに用いられる。より好ましくは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４との相同性は少なくとも９０％であり、更により好ましくは少なくとも９５％である。最も好ましくは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４との相同性は少なくとも９８％である。
【００２０】
本願発明の他の関連する態様は、非サル細胞系列において増殖する高力価ワクチンは、ＰＲＲＳに対する抗体を検出するための診断テストの開発やＥＬＩＳＡアッセイのような他の応用のために用いられ得る。
【００２１】
本願発明の他の関連する態様は、細胞系列を形質転換し、それら形質転換された細胞系列のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を強めることができるプラスミドまたはベクターの開発および使用である。この点について、とりわけ好ましいプラスミドには、ｐＫＳＵ（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＡＦ２７５６６６）という名称が与えられており、本願ではＳＥＱＩＤＮｏ．１として与えられ、図１にも記載されている塩基配列を含む。好ましくは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の相同性を有するかまたは９３％の塩基配列同一性を有する塩基配列は、その塩基配列がプラスミドにおいてまたは他の適切なベクターにおいて単離された塩基配列として出てくるかどうかに関わらず、本願発明に含まれる。より好ましくは、そうした塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の塩基配列相同性を有するか９７％の塩基配列同一性を有し、更により好ましくはＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９８％の塩基配列相同性を有するか約９９％の塩基配列同一性を有する。この塩基配列が、単離されたサルＣＤ１５１の塩基配列の最初の報告であると考えられる。もちろん、この塩基配列または類似の塩基配列に対応するアミノ酸配列も、アミノ酸配列の決定が当該技術分野における、お決まりの技術（ｒｏｕｔｉｎｅｓｋｉｌｌ）以上のものを要求しないため、本願発明に含まれると考えられる。細胞系列を形質転換する中で使用するためのベクターまたはプラスミドの開発に非サルＣＤ１５１を使用することが望まれる場合には、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の相同性を有する塩基配列が、好ましくはプラスミドまたはベクターに含まれるように選択される。より好ましくは、選択された配列は、少なくとも９０％の塩基配列相同性を有するか更により好ましくは少なくとも９５％のホモロジーを有する。最も好ましくは、相同性はＳＥＱＩＤＮｏ．１４と比較して、少なくとも９８％になる。
【００２２】
同様に、本願発明は、一匹の動物のゲノムにＣＤ１５１コーディング配列を直接に組み込む方法を提供する。この方法は一般に、そのような挿入のため意図されたベクターを用いて、染色体中へ関心のある塩基配列（例えば、ＣＤ１５１）を組み込むステップを含む。換言すれば、関心のある塩基配列はレトロウイルスのベクターに組み込まれ、このレトロウイルスベクターは、その塩基配列をゲノム中の一個の染色体中に直接組み込むのに用いられる。
【００２３】
したがって、ＰＲＲＳウイルスワクチンストックを調製する方法は、本願発明によって与えられる。一般に、ＰＲＲＳウイルスワクチンストックを調製するために、１つの細胞系列が与えられそしてＣＤ１５１によって形質転換される。この細胞系列は、形質転換前においては、ＰＲＲＳウイルス感染に対しては抵抗性であり得るか、もしくはＰＲＲＳ感染に対して感受性で有り得る。結果として生じた、形質転換された細胞系列は、そこでＰＲＲＳウイルスに感染させ、ワクチンストックに使用されるためにＰＲＲＳウイルスの子孫を作り出さしめる。上記記載のように、細胞系列は好ましくは、非サルの起源を持つ。このように、以前はＰＲＲＳ感染に対して感受性でなかった細胞系列は、ＣＤ１５１によって形質転換したあとを感受性が与えられ、以前にＰＲＲＳ感染に対して感受性であった細胞系列は、より多くの数の子孫ウイルスを作り出す。好ましくは、形質転換のステップは、ＣＤ１５１ＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドを使った安定なトランスフェクションを含む。ＣＤ１５１塩基配列は、ＣＤ１５１を含むいかなる動物由来のものであってもよい。好ましくは、ＣＤ１５１塩基配列は豚またはサルＣＤ１５１である。ＣＤ１５１塩基配列が、豚起源であるかまたは豚起源であると望まれるときは、その塩基配列はＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の塩基配列の相同性を有するべきである。より好ましくは、この塩基配列相同性は、少なくとも９０％そしてより好ましくは少なくとも９５％であるべきだ。最も好ましくは、ＣＤ１５１ＤＮＡが豚起源のものかそれと望まれるときはＣＤ１５１は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の塩基配列相同性を有するべきである。ＣＤ１５１ＤＮＡが、サル起源であるかそれと望まれるときは、ＣＤ１５１ＤＮＡ塩基配列はＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の塩基配列相同性を有する。更により好ましくは、ＣＤ１５１ＤＮＡ塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の塩基配列相同性、そして更により好ましくは少なくとも約９８％の塩基配列相同性を有する。結果として生じた、ワクチンストックは、形質転換以前に予め得られていたよりも高い力価を有する。このワクチンストックの力価が以前可能であった力価より約１００倍高くなる場合もある。
【００２４】
本願発明の他の態様として、ＣＤ１５１塩基配列の多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて同定し、続いて塩基配列決定および特別にデザインされたテストを行う。これらの異なる多形はそこでＰＲＲＳウイルス感受性におけるこれら多形の効果を決定するために解析される。この点について、一塩基多形の使用は、非常に助けとなり、そうした方法は、病気に対する感受性を決め育種中の豚を評価、選択する方法として広く受け入れられてきた。その上、ＣＤ１５１のレベルは、遺伝子のプロモーターのような調節配列によって影響を受けるかも知れない。調節配列はそこで、組織特異的な差異および豚仔個体間での差異を知るために解析される。加えて、染色体上の位置決めおよび遺伝子の位置決めから得られる情報は、ＰＲＲＳ病に対する抵抗性に関して豚の系統を選択するために用いられ得る。もちろん、病気に対する抵抗特性に関する選択をすることによって生ずる正の効果と負の効果の間のバランスを得るために、重要な生産特性に及ぼす付帯的効果がモニターされるべきである。
【００２５】
本願発明の更に他の態様は、ノースウェスタン法（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｓｔｒａｔｅｇｙ）による抗ＲＮＡエントリー蛋白質（ａｎｔｉ−ＲＥＰｓ）の開発と使用である。抗ＲＥＰｓは、出現してくるウイルスに対抗するための薬物群にさらに重要な追加事項となるであろう。新規に発生したウイルスは、全てＲＮＡであり、野生生物の生息地を人間が侵略することが原因となって、野生生物の個体群において発生するとするのが一番もっともらしいと考えられている。これらの抗ＲＮＡエントリー蛋白質（ａｎｔｉ−ＲＮＡＥｎｔｒｙＰｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｔｉ−ＲＥＰｓ）は、（家畜および野生の）動物および将来人間に発生するかもしれないウイルス病に対して使用され得る即座に手に入る方法を与えるがために極めて有用である。ＰＲＲＳウイルスに対するＣＤ１５１のようなＲＮＡ結合蛋白質の同定とメカニズムを理解することが重要であり、また抗ＲＮＡエントリー化合物（抗ＲＮＡエントリー蛋白質）のカテゴリーに属する化合物の発見が重要である。細胞にＰＲＲＳウイルスが侵入することを防げる１つの潜在的な方法は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡがＣＤ１５１と相互作用するのをブロックするステップを含んでいる。このブロック（妨害）は、好ましくは、細胞が抗ウイルス化合物、好ましくは抗ＲＮＡエントリー化合物と接触することを伴う。これら抗ウイルス化合物は、ＣＤ１５１の結合サイトを占めるようにデザインされており、これによってウイルスＲＮＡ −ＣＤ１５１間相互作用をブロックする。好ましくは、これら抗ウイルス化合物は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡよりも、これら結合サイトに対してより大きな結合力（アビディティー）とともにより大きな親和性（アフィニティー）を有する。
【００２６】
本願発明の他の態様は、ＣＤ１５１のＲＮＡに結合する能力であり、そしてこれは、ＲＮＡ結合活性を有するテトラスパン分子（ｔｅｔｒａｓｐａｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）についての最初の報告である。この発見は、ＰＲＲＳウイルスまたはウイルスＲＮＡがこのテトラスパンに結合し、そうすることによりエンドソーム（細胞のエンドサイトーシスによって形成された小胞構造）から細胞の細胞質へと放たれることを防ぐ、新規クラスの化合物を開発するために用いられる。コンビナトリアル・ケミストリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）およびハイスループット・スクリーニングシステム（ａｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）によるスクリーニングとを用いることにより、ＰＲＲＳウイルスを処置するための母核となる化合物（ｌｅａｄｃｏｍｐｏｕｎｄ）を見つけることができ、また強力な抗ＲＥＰ化合物が改変ノースウェスタンアッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎａｓｓａｙ）により見出され得る。
【００２７】
豚ＣＤ１５１に関連して、本願発明は豚ＣＤ１５１のゲノム塩基配列を規定し、豚ＣＤ１５１ｍＲＮＡがサル、マウス、ラットおよびヒト由来の既知のＣＤ１５１と約８４％以下の塩基配列相同性を有することを結論づけた。しかしながら、豚ＣＤ１５１のイントロン部分は他の既知のＣＤ１５１イントロン塩基配列との相同性がほとんどないか全くないということが結論づけられた。豚ＣＤ１５１の塩基配列は本願に、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４として与えられている。豚ＣＤ１５１とＣＤ１５１の他の既知の塩基配列の間で共有される部分はより低い相同性を持つことから、豚ＣＤ１５１塩基配列と８４％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列は、既知のＣＤ１５１の中にはそのような高い程度の相同性を有するものがないため、本願発明に含まれると考えられる。好ましくは、本願発明を実施する際に用いられる塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の塩基配列相同性を有し、あるいは更により好ましくはＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の塩基配列相同性を有する。より好ましくは、選択された塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の塩基配列相同性を有する。そのうえ、ＣＤ１５１を構築する際に、ここにＳＥＱＩＤＮｏ．１５−２９としてリストされた塩基配列と同様な相同性を有するエクソンおよびイントロンを用いることが望ましい。換言すれば、ＣＤ１５１の全ての部分がＳＥＱＩＤＮｏｓ１５−２９と一定程度の相同性を共有することが好ましい。ＣＤ１５１のエクソンの場合に、相同性は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６，および２８のようにリストされた不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）エクソンの各々に対して少なくとも８４％であることが好ましい。より好ましくは、相同性は、少なくとも９０％であることが好ましく、更により好ましくは少なくとも９５％であることが好ましい。もっとも好ましくは、各々のＣＤ１５１塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６，および２８の各々と少なくとも９８％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含むべきである。イントロンの場合には、豚ＣＤ１５１イントロンが既知のいかなる塩基配列とも相同性を全く有していないため、相同性はそれほど高い必要はない。
【００２８】
豚ＣＤ１５１は心臓、筋肉および内皮細胞において高レベルで発現することが結論づけられた。そのうえ、耳切り欠き生物材料（ｅａｒｎｏｔｃｈｂｉｏｐｓｉｅｓ）、あるいは精液および卵子の各サンプルについてのよりユーザーフレンドリーな（使いやすい）ＰＣＲにより豚における豚ＣＤ１５１をスクリーニングすることを可能とする方法を提供する。
【００２９】
豚ＣＤ１５１は、またＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域とＲＮＡ結合活性を有することが、ノースウェスタンアッセイ（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎａｓｓａｙ）によって示され、この活性はノースウェスタンｍｏｂｉｌｉｔｙｓｈｉｆｔａｓｓａｙにより、ＣＤ１５１のエキソドメインである、エクソドメイン１および２（ｅｘｏｄｏｍａｉｎ１ａｎｄｅｘｏｄｏｍａｉｎ２）中に位置づけられることが示された。最後に、本願発明は豚ＣＤ１５１の量とアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）とが、組織のタイプ、豚の年齢および豚の交配に拠る、異なる豚の組織によって変化することを示す。
【００３０】
ＰＲＲＳウイルスは、豚における深刻な経済的損失を引き起こす＋鎖ＲＮＡウイルスである。これまでの研究は、アンテリウイルスの３’非翻訳領域が細胞蛋白質との相互作用を通してウイルスの複製において重要な役割を演じているということを示してきた。ＭＡＲＣ細胞のｃＤＮＡライブラリーがλ ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓベクター中に構築され、そのライブラリーは、［α−^３２Ｐ］ＵＴＰで放射性標識したＰＲＲＳウイルスの＋鎖３’非翻訳領域ＲＮＡでスクリーニングされた。１．４ｋｂの挿入を持ったＲＮＡ結合クローンが見出され、塩基配列決定の後、その１．４ｋｂの挿入の塩基配列は、テトラスパンファミリーの蛋白質に属する膜透過蛋白質である、ＣＤ１５１との相同性を示していた。ＭＡＲＫおよびＢＨＫ−２１細胞は、ＣＤ１５１プラスミドによってトランスフェクトされ、その融合蛋白質は抗−ＬａｃＺおよび抗ＣＤ１５１抗体と免疫沈降した。ノースウェスタンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）において、その沈降した２９ｋＤの蛋白質が放射性標識した３’非翻訳領域と相互作用した。ＣＤ１５１の正確な機能は分かっていないが、ＣＤ１５１が細胞間接着（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ）、血管透過の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）および膜透過のシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）においてそれぞれ役割を演じていることが示された。ＢＨＫ−２１細胞系列は、ＣＤ１５１を欠いており、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性がない。しかし、ＢＨＫ−２１細胞系列がＣＤ１５１プラスミドによってトランスフェクトされたときには、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性となった。同様に、非サル細胞系列がＣＤ１５１によって形質転換され、ＰＲＲＳウイルスを増殖させて高力価にするために用いられる。
【００３１】
ＰＲＲＳウイルス３’ 非翻訳領域に結合する細胞蛋白質を同定するために、ＭＡＲＫ細胞発現ライブラリーのＲＮＡリガンドスクリーニング（ＲＮＡｌｉｇａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が実施された。更に、この報告は、１つのテトラスパン分子であってＣＤ１５１とも称される、ＰｌａｔｅｌｅｔＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＴｅｔｒａｓｐａｎＡｎｔｉｇｅｎ−３（ＰＥＴＡ−３）のＲＮＡ結合特性およびＰＲＲＳウイルス感染におけるこのＰＥＴＡ−３の役割についての最初の報告である。ウイルスが受容体に結合し（蛋白質−蛋白質相互作用）、エンドソームにおいて細胞に入り込むということが知られている。低いｐＨ条件において、ウイルスは構造的な非組織化（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を行い、ウイルスＲＮＡをエンドソームに放出する。しかしながら、ウイルスＲＮＡがエンドソームにおいて細胞質へ侵入する方法は分かっていない。本願発明は、ＣＤ１５１のようなＲＮＡ結合蛋白質が、ウイルスの複製を活発にするため、ＰＲＲＳウイルスが細胞質へ入るのを助けることを明示する（図９）。
【００３２】
本願発明は、また、豚ＣＤ１５１のｍＲＮＡ塩基配列につながるＤＮＡ塩基配列をも決定するが、この配列は本願でＳＥＱＩＤＮｏ．３８として与えられている。本願発明の目的のために、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８と少なくとも８４％の塩基配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列に対応するｍＲＮＡ塩基配列を用いることが好ましい。そのＤＮＡ塩基配列はＳＥＱＩＤＮｏ．３８と少なくとも９０％の塩基配列相同性を持つことがより好ましく、少なくとも９５％の相同性を持つことが更により好ましく、少なくとも９８％の塩基配列相同性を有することが最も好ましい。
【００３３】
本願発明は、またＣＤ１５１をコードするＤＮＡ塩基配列をも与える。起源が非サルであるＣＤ１５１をコードするＤＮＡ塩基配列を用いる場合には、そのような塩基配列は豚ＣＤ１５１由来のものであることが好ましく、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と塩基配列相同性が少なくとも８４％であることが好ましい。より好ましくは、そのＤＮＡ塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１４との塩基配列相同性として少なくとも９０％を有していること、より好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％の塩基配列相同性を有しているものであること。豚ＣＤ１５１のゲノム塩基配列は、表２に要約されたイントロンとエクソンの組み合わせである。上記述べたように、その豚ＣＤ１５１のエクソンは、他の既知のＣＤ１５１塩基配列と８４％以下の塩基配列相同性を共有し、豚ＣＤ１５１のイントロンはいかなる既知の塩基配列とも相同性を共有していなかった。したがって、非サル起源のＣＤ１５１塩基配列を構築し使用することが望まれるときには、そのイントロンを少なくとも１つ有するＤＮＡ塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１６，１８，２１，２３，２５，２７および２９からなるグループから選択される塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有するイントロンを少なくとも１つを有していることが好ましい。同様に、そのＤＮＡ塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６および２８からなるグループから選択された塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有するエクソンを少なくとも１つ有していることが好ましい。
【００３４】
本願の他の態様として、ＰＲＲＳウイルスに対する有効な免疫を誘発するワクチンが与えられる。ワクチンは非サルＣＤ１５１により形質転換された非サル細胞系列において作り出されるウイルスの子孫を含む。好ましくは、ＣＤ１５１は豚を起源とするものであること。さらにより好ましくは、ＣＤ１５１は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の塩基配列相同性を有するものであること。
【００３５】
本願発明の他の態様として、一塩基多形（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）がＰＲＲＳウイルスに対する感受性に及ぼす効果を決定する方法がある。その方法は一般に、少なくとも二つのＣＤ１５１ゲノム塩基配列を得るステップ、その塩基配列間で一塩基多形を比較するステップおよび一塩基多形をＰＲＲＳウイルスに対する感受性と相互に関連づけするステップを含む。
【００３６】
最後に、本願発明は個々の豚の間でＰＲＲＳウイルス感受性ファクターを比較する方法を与える。その方法は、一般に、少なくとも二匹の豚の遺伝子塩基配列を得るステップ、ＣＤ１５１遺伝子をコードする塩基配列の量を解析するステップおよびＣＤ１５１遺伝子をコードする塩基配列の量を比較するステップを含む。豚の遺伝子塩基配列は、耳ノッチまたは尻尾スニップからのバイオプシーを採取し、ＣＤ１５１塩基配列を決定するためそのバイオプシー上でＰＣＲを実施することにより得られる。そのような方法を用いて得られた情報は、発現量をＰＲＲＳウイルスに対する感受性と相互に関連づけるためにも、用いられ得る。
【００３７】
発明の実施の形態
次の実施例は、本願発明の好ましい形態を示す。しかしながら、これらの実施例は、例示の方法により示したが、それら実施例のいかなるものも本願発明の全範囲の内にいかなるに制限を加えるものと考えてはならない、と理解されるべきである。
【００３８】
ここに使用されるように、つぎの諸定義が適用される。「配列の同一性（ＳｅｑｕｅｎｃｅＩｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、当該技術において知られているように、二つまたは三つ以上のポリペプチド配列の間の関係、あるいは二つまたは三つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係、すなわち参考配列（ａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）とその参考配列と比較されるべき特定の配列（ａｇｉｖｅｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）との関係を指している。配列の同一性は、比較される配列同士を、それら配列のひとつながり（ｓｔｒｉｎｇ）の間で対（ｍａｔｃｈ）を作ることによって決定されるような、配列の程度が最大となるように最適に並べられたのち、特定の配列を参照配列と比較することによって決定される。そのように並べると、配列の同一性が、１つ１つの位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）ごとに、確かめられる。すなわち、特定の位置で両者の配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であるならば、その配列はその特定位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、そこで参考配列中のヌクレオチドあるいはアミノ酸残基の総数で割り、百分率にて配列同一性を得る。配列同一性は、以下の文献に記載されている公知の方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって即座に計算され得る。ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｎ．，ｅｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８），Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ（１９９４）；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎＨｅｉｇｅ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８７）；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）；ａｎｄＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。これらの文献に開示されている内容は、参照として本明細書の内容とする。配列同一性を決定する好ましい方法は、テストされる配列間で最大の対（ｍａｔｃｈ）を生ずるようにデザインすることだ。配列の同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公共に手に入るコンピュータープログラムにおいて、体系化されている。そのようなプログラムの例は、次のものを含むがこれらに限定されるものではない。ＧＣＧｐｒｏｇｒａｍｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）．ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の出所から公けに入手できる。（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＮＣＶＩＮＬＭＮＩＨＢｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）。これらの文献に開示されている内容は、本願で参考として取り込まれている。これらのプログラムは、特定の配列と参考配列の間の配列間同一性が最も高くなるようにｄｅｆａｕｌｔｇａｐｗｅｉｇｈｔを用いて、配列を最適に並べる。１つの実例として、１つの参考ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有する１つのポリヌクレオチドとは、その特定のポリヌクレオチド配列がその参考ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド毎に最大で５個までの点突然変異を含むという事以外は、その特定のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列はその参考配列と同一となるということを意味している。換言すれば、その参考ヌクレオチド配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいては、その参考配列におけるヌクレオチドの５％までが、削除されるかもしくは他のヌクレオチドで置き換えられるか、あるいはその参考配列における総ヌクレオチド数の５％までの数のヌクレオチドがその参考配列中に挿入されるということだ。その参考配列のこれらの突然変異は、その参考配列中のヌクレオチドに沿って突然変異が１つづつ個別に散在するか、もしくはその参考配列の内部で１箇所または２箇所以上隣接する位置に突然変異の群（ｇｒｏｕｐ）を作って散在するかして、その参考配列の５’もしくは３’末端位置で起こることがあり、あるいはこれら両末端位置の間のどこかの場所で起こることもある。これに類似して、１つの参考アミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する特定のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドとは、その特定のポリペプチド配列がその参考アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に最大５個までのアミノ酸の変化を含むことがあるという点を除いては、そのポリペプチドのその特定のアミノ酸配列はその参考配列と同一であることを意味している。換言すれば、１つの参考アミノ酸配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有するある特定のポリペプチド配列を得るために、その参考配列におけるアミノ酸残基の５％までが、削除されることがあるか、もしくは他のアミノ酸で置き換えられることがある、あるいは、その参考配列における総アミノ酸残基数の５％までの数のアミノ酸がその参考配列中に挿入されることがあるということだ。参考配列のこれらの変化は、参考配列の残基中に個々に散在するか、もしくは、その参考配列内部の１つあるいはそれ以上の連続する群として散在して、その参考アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置、あるいはこれら両末端位置の間のどこかの位置で起こるだろう。同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なることが好ましい。しかしながら、保存的置換は、配列の同一性を決定するときに対（ｍａｔｃｈ）として含まれるものではない。
【００３９】
同様に、「配列の相同性」は、本願で使用されているように、二つの配列の関連性を決定する方法をも指している。配列相同性を決定するために、二つもしくは三つ以上の配列が上記に述べたように最適に並べられ、必要ならばギャップが挿入される。しかしながら、「配列の同一性」に比較すると、保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換が配列相同性を決定するときに対として数えられる。換言すれば、１つの参考配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るために、その参考配列における９５％のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドは、他方の配列のアミノ酸またはヌクレオチドと対を作らなければならないか、あるいは他方の配列のアミノ酸またはヌクレオチドに対する対（ｍａｔｃｈ）の保存的置換を含まなければならない。または、その参考配列における全アミノ酸残基あるいは全ヌクレオチド数の最大５％のアミノ酸数もしくはヌクレオチド数が、保存的置換の数を含まずに、その参考配列に挿入されることがある。
【００４０】
「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｉｖｅｓｕｂｓｔｉｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが、サイズ、疎水性等を含む類似の特徴または性質を有する他のアミン酸残基もしくはヌクレオチドと、全般的な機能性が有意には変化しないような置換を指す。
【００４１】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、その自然の状態から「人の手によって」変化したという事を意味する。すなわち、もし「単離」が自然の中で起こるのであれば、もともとあった自然環境から変えられたもしくは持ち去られた、あるいはその両者であるということを意味している。例えば、生きている生物体中に自然に存在しているポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、「単離された」ものではない。しかしその自然の状態で共存している物質から分離された同一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、「単離」と言う言葉が本願において使用されているように、「単離されて」いるのである。
【００４２】
「細胞物質」とは、細胞、組織、および細胞起源の物質を含む体液を指す。
【００４３】
「抗ＲＮＡエントリー蛋白質（ＡｎｔｉＲＮＡＥｎｔｒｙＰｒｏｔｅｉｎｓ）」もしくは「抗ＲＥＰｓ（ＡｎｔｉＲＥＰｓ）」とは、ウイルスＲＮＡが１つのＲＮＡ蛋白質に結合することを防ぐ新規クラスの化学薬品（ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）もしくは化学薬品類似物（ｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｏｇｕｅｓ）を指す。これらの抗ＲＥＰｓは哺乳動物細胞に対して毒性はないが、しかし細胞がＲＮＡウイルスに感染することを防ぐことができる。
【００４４】
実施例１
この実施例は、あとの実験で用いられる、細胞、ウイルスおよびモノクローナル抗体を同定し、記述し、λ Ｚａｐ発現ライブラリーを調製し、ＰＲＲＳウイルスゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のクローニングおよびプローブ調製を詳述し、ＣＤ１５１を含む細胞のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを記載し、ＣＤ１５１を含むプラスミドでの細胞によるトランスフェクションを記載し、そのトランスフェクションが成功し、ＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合すると言うことを証明する。
【００４５】
材料と方法：
ＭＡＲＫ、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＬ２６２１、ＭＡ−１０４（アフリカミドリザルの腎臓細胞に由来する）およびＢＨＫ−２１（Ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ）細胞系列が本研究で用いられた。ＭＡＲＫ細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ユタ州）を補充したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）で成育された。１０％牛胎児血清を補充したダルベッコの最小必須培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）は、ＢＨＫ−２１細胞を培養するのに用いられた。ＰＲＲＳウイルスのＡＴＣＣＶＲ２３３２株が本研究で用いられた。他に記載されていない限りは、ウイルスは、ＭＡＲＫ細胞中で増殖した。抗ＣＤ−１５１モノクローナル抗体クローンである１４Ａ２．Ｈ１は、カリフォルニア州ＳａｎＤｉｅｇｏにあるＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。抗βーガラクトシダーゼモノクローナル抗体クローンであるＤ１９−２Ｆ３−２（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，インディアナ州）および抗ＰＲＲＳウイルスヌクレオプロテインモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＰＲＲＳＶｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎＭＡｂ）であるＳＲ３０（ＲｕｒａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ，サウスダコタ州）が本研究において使用された。
【００４６】
λ Ｚａｐ発現ライブラリーを調製するために、ＺＡＰ発現ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア州）を製造者の指示に従って用いて、ＭＡＲＫ細胞系列ｃＤＮＡライブラリーを調製した。全細胞ＲＮＡは、酸フェノール−グアニジニウムイソチオシアネート法（ｔｈｅａｃｉｄｐｈｅｎｏｌ−ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｍｅｔｈｏｄ）によって全細胞から抽出した。ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア州）を用いて全細胞ＲＮＡから単離し、そこで、５μｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、λ ＺＡＰ発現ベクター中に直接クローンした。ｃＤＮＡライブラリーは、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニア州）を用いてパッケージされた。そのライブラリーの品質は、青色／白色の発色スクリーニングにより、また挿入部分のサイズを確認することにより検証された。
【００４７】
ＰＲＲＳウイルスゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をクローンし、かつプローブを調製するために、フォワードプライマー（ｔｈｅｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＧＡＣＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ．３１）およびリバースプライマー（ｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＣＡＡＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ．３２）を用いたＴＡクローニングにより、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅によってｐＣＲＩＩベクター中にクローニングされた。［α−^３２Ｐ］ＵＴＰＲＮＡトランスクリプトは、ｉｎｖｉｔｒｏ転写により調製された。ｃＤＮＡはＢａｍＨＩで切断され線状とされ（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）、Ｒｉｂｏｓｃｒｉｂｅ^ＴＭ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）のＴ７ＲＮＡ合成キットを用い、製造者の指示に従ってｉｎｖｉｔｒｏで転写された。ＤＮＡの鋳型は、１ＭＢＵのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅＤＮａｓｅで、３７℃で１５分間切断された。ＱｕｉｃｋＳｐｉｎ^ＴＭカラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，インディアナ州）がフリーのヌクレオチドを除去するために使用された。プローブは、０．３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量の１００％エタノールで、−２０℃で３０分間沈澱させた。プローブの活性は、放射能カウンター（Ｂｉｏｓｃａｎｅ，Ｉｎｃ．，ワシントンＤ．Ｃ．）で測定した。
【００４８】
次に、ｃＤＮＡライブラリーがノースウェスタンブロッティングにより、前に記載された方法に多少の修正を加えて、スクリーニングされた。スクリーニングの全ての手順を一巡する中で、プラークを、１０ｍＭＩＰＴＧを用いて、最初のリフト（ｌｉｆｔ）中に１．５時間誘導し、２度目のリフト中に２時間誘導した。プラークリフト（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔｓ）から移し取ったニトロセルロース膜は、３０分間、６Ｍの塩酸グアニジニウム中で変性し、１０分毎に、等量のＳＢ緩衝液（ｓｉｎｇｌｅｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ：１５ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］；５０ｍＭＫＣｌ，０．０１％［Ｖ／Ｖ］ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０；０．１％［ｗ／ｖ］Ｆｉｃｏｌｌ４００−ＤＬ；０．１％［ｗ／ｖ］ＰＶＰ−４０；０．１ｍＭＭｎＣｌ_２；０．１ｍＭＺｎＣｌ_２；０．１ｍＭＥＤＴＡ；０．５ｍＭＤＴＴ）を交換し徐々に再変性した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの間、２５０ μｌの一本鎖ＤＮＡと５μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）の酵母ｔＲＮＡが、非特異的結合をブロックするために５ｍｌのＳＢ緩衝液に加えられた。ハイブリダイゼーションは、５００，０００ｃｐｍ／ｍｌの比活性の^３２Ｐで放射性標識した、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡプローブで、一晩実施された。ＲＮＡ結合活性はオートラジオグラフィーによって検出された。
【００４９】
対応する陽性プラークは、円筒形に抜き取り、４０μｌクロロホルムを加えた１ｍｌのＳＭ緩衝液で、抽出した。クローンの挿入部分は、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩｇｏｌｄｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔを用いて切除した。今やｐＢＫ−ＣＭＶベクター中にある、その挿入部分は、ＳｅｑｕｉｔｈｅｒｍＥＸＣＥＬＩＩＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）を使い、Ｔ７およびＴ３プライマーを用いて、手仕事で塩基配列を決定した。塩基配列決定は、また、アイオワ州Ａｍｅｓにあるアイオワ州立大学ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙ（配列研究機関）で実施された。同様な蛋白質を確認するためにＢＬＡＳＴｈｏｍｏｌｏｇｙｓｅａｒｃｈを実施した。
【００５０】
ＢＨＫ−２１およびＭＡＲＫ細胞系列をトランスフェクトするために、製造者の指示（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）に従ってリポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅｒｅａｇｅｎｔ）を用い、ＣＤ１５１を含むｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドを使用した。瞬間的なトランスフェクションに対して、細胞はトランスフェクションから２４時間後にハーベストされた。安定なトランスフェクションは、ＢＨＫ−２１細胞については１ｍｇ／ｍｌの細胞濃度、ＭＡＲＫ細胞については０．７ｍｇ／ｍｌの細胞濃度の生育培地中で、Ｇ４１８（ＯｍｅｇａＳｃｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｔａｒｚａｎａ，カリフォルニア州）選択によってなされた。選択の後、細胞は、ＢＨＫ−２１細胞に対しては０．５ｍｇ／ｍｌの細胞濃度のＧ４１８の存在下で、ＭＡＲＫ細胞に対しては０．３５ｍｇ／ｍｌの細胞濃度Ｇ４１８の存在下で維持される。ＣＤ１５１の発現を、免疫沈降によって測定した。
【００５１】
次に、ＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合することを証明するために、免疫沈降したＣＤ１５１蛋白質のノースウェスタンブロットを実行した。２４穴プレート中でトランスフェクトされた細胞は、１００ μｌのｓｉｎｇｌｅｄｅｔｅｒｇｅｎｔｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８］，１５０ｍＭＮａＣｌ，ＰＭＳＦ１００μ／ｍｌａｎｄ１％［ｖ／ｖ］ＮＰ−４０）中で溶解した。５０μｌの細胞溶解物に対して、１μｌのモノクローナル抗体（抗ＣＤ１５１および抗βガラクトシダーゼ抗体）が加えられ、４℃で一晩振盪した。免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘ）は、ホルマリン固定した４μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓを加え、２時間氷上で沈殿させ、１０分間４，０００×ｇにて遠心した。続いて行う洗浄は全て、１０分間１２，０００ ×ｇにて遠心した。ペレットは冷やしたＴＳＡ（０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］；０．１５ＭＮａＣｌ；０．０２５％ＮａＮ３）と１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１％ＳＤＳで、１回洗った。２度目の洗いは、冷やしたＴＳＡ中でのみで行い、続いて１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］中で２回洗った。ペレットは、２０μｌの２×ＳＤＳｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ中に懸濁させ、１０％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル上で電気泳動を行った。蛋白質は、ニトロセルロース膜上にブロットされ、ノースウェスタンブロットが上記に記載されたように実行された。
【００５２】
ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡに結合するＭＡＲＫ細胞蛋白質を同定するために、ＭＡＲＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーが作成され、放射性標識された３’非翻訳領域を用いてノースウェスタンブロッティングによりスクリーニングされた。ＭＡＲＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーは、平均挿入サイズが１−４ｋｂで、１０^８ｐｆｕの力価を有していた（データを示してはいない）。約６ ×１０^６のプラークがノースウェスタンブロッティングによりスクリーニングされた。５回繰り返してプラークの精製と再スクリーニングを行うと、１つだけ反するクローンが得られた。スクリーニングの最後の一巡において、１つだけ単離されたプラークが円柱状に抜き取られ、摘出された。制限酵素による切断において、挿入サイズが１．５ｋｂであることが分かった（データは示されていない）。マニュアルに沿った塩基配列決定の後、ＢＬＡＳＴｓｅａｒｃｈを行い、その挿入部分が、１つのテトラスパン分子（ａｔｅｔｒａｓｐａｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるＣＤ１５１／ＰＥＴＡ−３と９８％の相同性を有することが示された。その挿入の完全長の塩基配列決定も、またアイオワ州Ａｍｅｓにあるアイオワ州立大学ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙ（配列研究機関）で実施された。その挿入は、開始コドンと終止コドンおよび更にｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌを有する完全長ｃＤＮＡであった。本願は、サルＣＤ１５１の完全な塩基配列の最初の報告である。その塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＦ２７５６６６）は、推定上の（ｐｕｔａｔｉｖｅ）膜透過領域に下線を付けて、図１に示した。与えられた塩基配列はサルのものであるが、他の動物種（例えば、豚）から単離されたＣＤ１５１の塩基配列も、またこのサルＣＤ１５１塩基配列との相同性が予想されるため使用され得る。肺胞マクロファージ中に豚ＣＤ１５１が存在することは、ウェスタンブロットによって証明された（図５参照）。
【００５３】
ＣＤ１５１がＲＮＡ結合活性を有すると言う見解を検証するために、免疫沈降に続いて、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇを実行した。ＢＨＫ−２１細胞およびＭＡＲＫ細胞の両者は、ＣＤ１５１の挿入を含むｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドでトランスフェクトされた（ライブラリースクリーニングで得られた）。ＣＤ１５１は、ＬａｃＺ融合蛋白質として発現されるので、トランスフェクトされた細胞の溶解物は、抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体および抗β− ガラクトシダーゼモノクローナル抗体の両者により免疫沈降した。図２及び図３で示されるように、対照が陰性であるのに対して、^３２Ｐで放射性標識したＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡをプローブとして用いたとき、両モノクローナル抗体で免疫沈降した蛋白質は、ＲＮＡ結合活性を発現した。このことは、発現蛋白質であるＣＤ１５１はＰＲＲＳウイルスＲＮＡを結合する活性を有し、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合すると言うことを証明した。図２において、レーン１はＭＡＲＫ細胞溶解物（免疫沈降なし）を含み、レーン２はトランスフェクトされたＭＡＲＫ細胞を含み、レーン３は、トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞を含み、レーン４はトランスフェクションを受けていないＭＡＲＫ細胞を含み、レーン５はトランスフェクションを受けていないＢＨＫ−２１細胞を含む。図３については、レーン１はトランスフェクトを受けていないＢＨＫ−２１細胞を含み、レーン２はトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞を含み、レーン３は、トランスフェクトされたＭＡＲＫ細胞を含み、レーン４はトランスフェクトを受けていないＭＡＲＫ細胞を含み、図３のレーン５はＭＡＲＫ細胞溶解物（免疫沈降なし）である。
【００５４】
実施例２
この実施例は、ＢＨＫ−２１細胞によるＣＤ１５１の発現が、細胞にＰＲＲＳ感染に対する感受性を与えることを決定した。
【００５５】
材料と方法：
（安定なトランスフェクションによって得られた）ＣＤ１５１を発現するＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性となるかどうかを決定するために、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施した。細胞を、２４穴プレート中に播き、ＰＲＲＳウイルスを感染多重度（ＭＯＩ；ａｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）０．０１で３７℃、１時間かけて感染させた。感染度は、感染から２４時間後に免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって決定される。細胞は、アセトン− ＰＢＳ（３：１，ｖ／ｖ）中で、４℃で１０分間固定され、５分間空気乾燥した。一次抗体および抗ＰＲＲＳウイルス核蛋白質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）モノクローナル抗体（ＰＢＳで１０００倍に希釈）が加えられ、３７℃で１時間インキュベートした。細胞は、そこでＰＢＳ中で１回１０分間洗浄し、そして室温で３０分間、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧビオチン化抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カリフォルニア州）でインキュベートした。ＰＢＳ中で１回１０分間洗浄した後、アビジン− ビオチン酵素複合体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を加え、室温で３０分間インキューベートした。細胞を、そこでＰＢＳ中で１回１０分間洗浄し、１回５分間蒸留水で洗浄し、そこでＤＡＢ基質を加えて、１０分間暗室でインキュベートした。細胞を、５分間蒸留水中で洗浄し、３０秒間Ｇｉｌｌ’ｓ−１ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで対比染色し、水道水で洗浄し、光学顕微鏡によって検査した。
【００５６】
結果：
この実施例の結果は、図７ａおよび図７ｂに示した。図７ａに描かれた親ＢＨＫ−２１細胞系列は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性ではないが、図７ｂに描かれたＣＤ１５１によって形質転換された組替型ＢＨＫ−２１は、ＰＲＲＳウイルス抗原に対して陽性であり、これによりＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を示している。それゆえＣＤ１５１を取り込むと、以前はＰＲＲＳウイルス感染に非感受性であったサル細胞系列がＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性となった。図２に示されるように、トランスフェクションを受けていないＭＡＲＫ細胞はＣＤ１５１を含むが、しかるにトランスフェクションを受けていないＢＨＫ−２１はＣＤ１５１を含んでいない。興味深いことに、トランスフェクションを受けていないＭＡＲＫ細胞は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性があり、しかるにトランスフェクションを受けていないＢＨＫ−２１細胞はＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性がない。
【００５７】
実施例３
この実施例は、ＣＤ１５１を過剰に発現する、ＭＡＲＫ細胞の効果を評価するためウイルスバーストアッセイ（ｖｉｒｕｓｂｕｒｓｔａｓｓａｙ）を活用した。
【００５８】
材料と方法：
ＣＤ１５１（実施例１において記述されているような安定なトランスフェクションによって得られる）を過剰に発現する、ＭＡＲＫ細胞の単層に、感染多重度０．１で３７℃、１時間、ＰＲＲＳウイルスを感染させた。細胞は、ＭＥＭ中で２回洗い、１％牛胎児血清（ＦＣＳ）を補充した１ｍｌのＭＥＭで表面を覆った。１８時間インキュベートして、細胞は凍結融解（ｆｒｅｅｚｅａｎｄｔｈａｗ）により溶解し、細胞破砕物（ｃｅｌｌｄｅｂｒｉｓ）は、５分間１２，０００×ｇの遠心によって取り除かれた。上清中のウイルスの量は、親ＭＡＲＫ細胞を用いたプラークアッセイによって滴定した。ＣＤ１５１過剰発現がＰＲＲＳウイルス複製に与える効果が少しでもあるか無いかを決定するために、ＭＡＲＫ細胞が、感染量（ｌｅｖｅｌ）に与える効果について調べられた。ＭＡＲＫ細胞（両親の細胞系列、およびＣＤ１５１を過剰発現するトランスフェクションを受けた子孫細胞系列の両方）は、プラークから精製した等しい量のＰＲＲＳウイルスを感染させ、１回の完全な複製周期の間（１８時間）成長させた。ＰＲＲＳウイルスの量は親ＭＡＲＫ細胞を用いたプラークアッセイによって測定される。プラークアッセイにおいては、上清を１０回繰り返して連続希釈して得た１００ μｌの希釈液が上記に記載したように感染用に用いられた。感染後、単層がＰＢＳ中で１回、ＭＥＭ中で１回洗浄され、そして１％ＦＣＳおよび１％寒天を含む１ｍＭＭＥＭでその単層の表面を覆った。プラークは、０．０１％のｎｅｕｔｒａｌｒｅｄで染色することにより、３７℃で１日インキュベーションしたのちに可視化した。
【００５９】
結果：
親ＭＡＲＫ細胞に比較して、ＣＤ１５１を過剰に発現するトランスフェクションを受けたＭＡＲＫ細胞中で、ウイルスの量が約１００倍に増加した。これらの結果は、図８に示した。これらの結果とが、ウイルスの侵入に関する以前の実験から得られる結果とを組み合わせて考慮すると、ＣＤ１５１は、ウイルスＲＮＡもしくはウイルスの侵入を促進することにより、ＰＲＲＳウイルス感染の量を増加させたのかも知れないと考えられている。それゆえ、ＣＤ１５１を取り込むことは、ＰＲＲＳウイルスのより高い力価材料（ｓｔｏｃｋ）を作るために用いられ得る。同様に、一匹の特定の豚でＣＤ１５１の発現量を決定することは、標準と比較して、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性についての、１つの指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を与える。このようにして、その組織もしくは体液に対する平均もしくは標準を確立するために、異なる組織および体液由来の数多くのサンプルが、ＣＤ１５１量についてアッセイされる。同一の組織もしくは体液から得られるＣＤ１５１の個体ごとの量は、そこで、動物個体毎のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を決定するために、この平均もしくは標準と比較され得る。
【００６０】
実施例４
この実施例は、ＭＡＲＫ細胞におけるＣＤ１５１ｍＲＮＡを検出するために、ＲＴ−ＰＣＲを活用した。
【００６１】
材料と方法：
ＲＮＡは、酸フェノールグアニジニウムイソチオシアネート法を用いて、ＰＲＲＳウイルスが感染したＭＡＲＫ細胞から抽出された。ＲＮＡの品質は、アガロースゲル電気泳動により評価された。ＲＴ−ＰＣＲは、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ３３）およびリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）５’−ＡＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＧＡ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ３４）を有するＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，カリフォルニア州）を用いて実施された。逆転写反応は、４２℃で４５分間、９５℃で１０分間および５℃で５分間の条件で実施された。ＰＣＲは９４℃で２分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１５秒間の条件で行い、これを２５回繰り返した。それから、７２℃で３０分間の条件で反応させた。生成物は、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した２％アガロースゲル中で解析された。
【００６２】
結果：
１４９塩基対（ｂｐ）の増幅単位（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の増幅を示すＲＴ−ＰＣＲの予想される結果を、図４に示す。この図中で、ＣＤ１５１蛋白質のｉｎｖｉｖｏ結合活性が、感染を受けたＭＡＲＫ細胞溶解物中のＣＤ１５１モノクローナル抗体と免疫沈降させた後、ＲＴ−ＰＣＲによって証明された。この図中で、レーンＭは１２３塩基対のラダーであり、レーン１はＰＣＲベクター対照であり、レーン２は感染を受けていないが免疫沈降したＭＡＲＫ細胞系列、レーン３は関連のないｗａｓｐ（Ｃｏｔｅｓｉａｆｏｌｅｐｉｓ）モノクローナル抗体である、レーン４はＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ（ＵＶ− 架橋）を実施しなかったＣＬ２６２１細胞系列とともに電気泳動した、ＣＤ１５１モノクローナル抗体で免疫沈降した感染を受けたＭＡＲＫ細胞であり、レーン５はＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇを１５分間実施したのち、ＣＤ１５１モノクローナル抗体で免疫沈降した、感染を受けたＭＡＲＫ細胞であり、レーン６はＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇを３０分間実施したのち、ＣＤ１５１モノクローナル抗体で免疫沈降した、感染を受けたＭＡＲＫ細胞であり、レーン７はＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇを４５分間実施したのち、ＣＤ１５１モノクローナル抗体で免疫沈降した、感染を受けたＭＡＲＫ細胞である。
【００６３】
実施例５
この実施例は、ｉｎｖｉｖｏｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇを活用することによりＣＤ１５１がｉｎｖｉｖｏＲＮＡ結合活性を有するかどうかを決定した。
【００６４】
材料と方法：
２４穴プレート中のＭＡＲＫ細胞単層は、ＰＲＲＳウイルスを、感染多重度０．１、３７℃で１時間の条件で感染させた。単層は、ＰＢＳ中で３回、ＭＥＭで２回洗い、そして１％胎児牛血清（ＦＣＳ）を補充したＭＥＭに置き換えた。感染から１８時間経過後、細胞はＰＢＳ中で２回洗い、そこで新しいＰＢＳ中に表面を覆われ、そしてＵＶｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ペンシルベニア州）に入れて氷上に保持し、３００λの光源から１０ｃｍの距離において、１５分間、３０分間、４５分間ＵＶ照射した。照射の後、ＰＢＳは取り除かれ、全細胞は５０μｌのｓｉｎｇｌｅｄｅｔｅｒｇｅｎｔｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加えて溶菌させ、そこで氷結および溶解させた。ホルマリン固定したＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞の替わりにＩｇＧが結合したセファロースビーズ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅｂｅａｄｓ）を用いた以外、上記記載のように、抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。蛋白質の性質を有する物質は、プロテイナーゼＫ（４μｇ／ｍｌ）で、３７℃で１５分間切断し、そしてＲＮＡをフェノール−グアニジニウム法を用いて抽出した。フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ）５’ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＡＧＧＣ’３（ＳＥＱＩＤＮｏ３５）およびリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）５’ＴＴＣＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣ’３（ＳＥＱＩＤＮｏ３６）を用いて、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡが存在するかどうかを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００６５】
結果：
ＣＤ１５１がｉｎｖｉｖｏＲＮＡ結合活性を有するかどうかを決定するために、ＵＶｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇに続いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。その原理は、ＣＤ１５１蛋白質と、細胞中のＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡの間に何らかの相互作用があるとすれば、その組成物（ＣＤ１５１蛋白質と、細胞中のＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡ）は、抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体を加えることによって免疫沈降を起こすはずだと言うものである。ＭＡＲＫ細胞を、ＰＲＲＳウイルスに感染させ、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡとＣＤ１５１の間の相互作用を強めるために、方法の項目中に記載したようにＵＶｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇが実施された。免疫沈降した組成物は、蛋白質性物質を取り除くためにプロテイナーゼＫで処理された。ＰＲＲＳウイルスの３’ 非翻訳領域ＲＮＡが、図４に示す様に、ＲＴ−ＰＣＲによる免疫沈降物中に検出された。ＣＤ１５１蛋白質およびＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域の間の相互作用は強く、ＵＶ誘導した１５分間のｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇは、ＲＮＡをＣＤ１５１とともに免疫沈降させるのに十分であったが、しかるに非特異的モノクローナル抗体を有する対照は陰性であった。それゆえ、ＣＤ１５１はｉｎｖｉｖｏＲＮＡ結合活性を有している。
【００６６】
実施例６
この実施例は、ＭＡＲＫ細胞蛋白質、ＢＨＫ−２１細胞蛋白質およびＶｅｒｏ細胞蛋白質においてＣＤ１５１を検出するためにウェスタンブロッティングを活用した。
【００６７】
材料と方法：
ＭＡＲＫ、ＢＨＫ−２１およびＶＥＲＯ細胞蛋白質は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル中で電気泳動され、ニトロセルロース膜上にブロットされた。ＰＢＳ中の５％ノンファットドライミルク（ｎｏｎ−ｆａｔｄｒｉｅｄｍｉｌｋ）中で一晩ブロッキングした後、その膜は室温で５時間、抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体（ＰＢＳ−Ｔ中で、１：２，０００の比率）中でインキュベートした。その膜は、２回、ＰＢＳ−Ｔ中で１５分間洗浄し、抗マウスＨＲＰＯ複合抗体（１：１０，０００）中で室温で２時間インキュベートした。洗浄後全蛋白質は、製造業者の指示（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）に従い３’，３’，５’，５’−ｔｅｔｒａ−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質によって検出された。
【００６８】
結果：
感受性細胞においてＣＤ１５１が存在することを、抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロッティングにより決定した。図５および図６に示すように、ウイルス感受性のＭＡＲＫ細胞はＣＤ１５１蛋白質を有するが、しかるに非感受性のＢＨＫ−２１細胞はその蛋白質を欠いている。その上、トランスフェクションを受けたＢＨＫ−２１細胞（図５、レーン１３）は、ＣＤ１５１を有しており、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性がある。ＣＯＳ−７細胞のＰＲＲＳウイルスに対する感受性については何も報告されていないが、しかるに、Ｖｅｒｏ細胞においては、ＰＲＲＳウイルスが細胞に入るが、生産的なウイルス感染を結果するものではない。Ｖｅｒｏ細胞は、ＰＲＲＳ感染に要求される他の細胞ファクターを欠いているかも知れない。これらの結果は、ＣＤ１５１が（ＣＤ１５１以外に）付加的な細胞内ファクターが関与していた場合に、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を決定する上でのファクターの１つであるということを示す。
【００６９】
実施例７
この実施例は、ＣＤ１５１蛋白質が存在することと、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性との間の相互関連を決定する。
【００７０】
材料と方法：
ＣＤ１５１蛋白質が存在することと、ＰＲＲＳウイルス感染への感受性との間で考えられる関係を決定するため、ＣＤ１５１特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲが感受性のある細胞系列および感受性がない細胞系列をスクリーニングするため実施された。これらの細胞系列は、ＭＡ１０４、ＭＡＲＫ，Ｖｅｒｏ、ＣＯＳ−７を含むが、これら細胞のうちの３つは全てアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｃｅｌｌｓ）の細胞であるＳＴ，ＢＨＫ−２１、ＭＤＢＫおよびＨＲＴ（Ｈｕｍａｎｒｅｃｔａｌｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ）に由来している。全ＲＮＡが、実施例４に記載されたように抽出され、ＣＤ１５１の存在が実施例４に記載された手順とプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された。
【００７１】
結果：
ＭＡ１０４，ＭＡＲＫ１４５，Ｖｅｒｏ，ＣＯＳ−７およびＳＴ細胞系列において、期待されるサイズである１０５塩基対の増幅単位（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が存在した。ＣＬ２６２１，ＶｅｒｏおよびＣＯＳ−７細胞系列においては、ＣＤ１５１の代わりのスプライスされた形態によると考えられる、より高い位置の付加的なバンドがある。ＣＤ１５１は、ＢＨＫ−２１，ＭＤＢＫ（図５を参照）およびＨＲＴ細胞系列中には存在しない。興味あることに、ＭＡＲＫ１４５、ＭＡ１０４およびＣＬ２６２１は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性のある細胞系列であるが、しかるに、ＢＨＫ−２１細胞系列は、感受性がない。過去において、ＰＲＲＳウイルスに感受性の唯一の細胞は、サル細胞系列ＣＬ−２６２１およびＭＡＲＫ−１４５豚肺胞マクロファージであると考えられていた。それゆえ、本願発明は、アクセサリーファクター（ａｃｃｅｓｏｒｙｆａｃｔｏｒ）であるＣＤ１５１によってトランスフェクトを受けた後も非サル細胞系列はＰＲＲＳウイルスに対して感受性を有するがゆえに、サル細胞系列のみがＰＲＲＳウイルス（Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，８４６，８０５参照）感染に対して感受性を有するとの以前の主張に異議を唱えるものである。ＢＨＫ−２１、ＭＡ１０４、ＣＯＳ−７、ＳＴ、ＭＤＢＫおよびＨＲＴ１８細胞系列は、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，メリーランド州２０８５２から入手できる。代表的な受託番号は、ＢＨＫ−２１がＡＴＣＣ＃ＣＲＬ８５４４、ＭＡ１０４がＡＴＣＣ＃ＣＲＬ２３７８、ＣＯＳ−７がＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１、ＳＴがＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７４６、ＭＤＢＫがＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２およびＨＲＴ１８がＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２４４である。ＭＡＲＫ１４５細胞系列は、アイオワ州ＡｍｅｓにあるＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＶＳＬ）から得られ、ＣＬ２６２１はアイオワ州Ａｍｅｓにある上記同じＮＶＳＬが専売している細胞系列である。Ｖｅｒｏ細胞系列は、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１と一致していた。それゆえ、この実施例はＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルス感染において重要な役割を演じているとの更なる証拠を与える。
【００７２】
実施例８
この実施例は、ＣＤ１５１蛋白質とＰＲＲＳウイルス蛋白質の間に直接の蛋白質− 蛋白質相互作用が無いことを決定し、ＣＤ１５１がアクセサリー蛋白質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）であり、ＰＲＲＳウイルスの受容体ではないと言うことを証明した。
【００７３】
材料と方法：
ＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルス感染のために必須であるということを確立した後に、ＰＲＲＳウイルス蛋白質とＣＤ１５１との間に、直接の相互作用があると言う可能性が共免疫沈降法（ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により決定された。感染を受けたＭＡＲＫ細胞は、ＣＤ１５１モノクローナル抗体と免疫沈降し、免疫沈降物におけるＰＲＲＳウイルス蛋白質の存在が、一次抗体としてのＰＲＲＳウイルスポリクローナル抗体および二次抗体としての抗豚ＨＲＰＯによって検出され、ＥＣＬウェスタンブロット検出システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｅａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージ州）によって検出された。共免疫沈降法は、最初にＰＲＲＳウイルスポリクローナル抗体で免疫沈降させ、一次抗体としてのＣＤ１５１モノクローナル抗体および二次抗体としての抗マウスＨＲＰＯにより免疫沈降物中にＣＤ１５１が存在するか否かをチェックすることによっても実施された。
【００７４】
結果：
ＣＤ１５１とＰＲＲＳウイルス蛋白質との間に直接の相互作用はない。このことは、ＣＤ１５１の受容体としての可能性を除去する。しかしながら、このことは、ＣＤ１５１とＰＲＲＳウイルスとの間に間接的相互作用があると言う可能性を除くものではない。間接的な相互作用があるとすれば、ＣＤ１５１とＰＲＲＳウイルスの蛋白質の間に相互作用を備え、かつこれを完了することができる更にもう１つの別の蛋白質を確認することが必要になるだろう。それゆえ、ウイルスＲＮＡ−蛋白質相互作用が検証されてきた。しかし、ＣＤ１５１とＰＲＲＳウイルス蛋白質の間には、直接的な蛋白質− 蛋白質間相互作用はない。したがって、ＣＤ１５１は、ＰＲＲＳウイルス力価を上げ、そしてこれによってウイルスＲＮＡの侵入を増進しかつ媒介するがゆえに、アクセサリー蛋白質であって、受容体蛋白質ではない。
【００７５】
実施例９
この実施例は、ウイルスＲＮＡとＣＤ１５１の間の相互作用を止めるために使われる化合物を発見するための方法を説明し、抗ＲＮＡエントリー蛋白質と呼ばれる新規クラスの抗ウイルス化合物を規定する。
【００７６】
材料と方法：
本願発明に基づくと、ウイルスＲＮＡの細胞への侵入が、ウイルスＲＮＡとＲＮＡ結合蛋白質との間の相互作用によって媒介されているようである。このテストはｉｎｖｉｔｒｏで簡単に実施され得る。ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｙｓｔｅｍ処理によって、ＣＤ１５１もしくは完全長ＣＤ１５１それぞれの中心部分（ｍｏｔｉｆ）は、ニトロセルロース上に、もしくは何らかの固体を結合したマトリックス中に、自動化装置を使ってスポットされる。薬剤が存在しない陰性対照において、一本鎖ＤＮＡの形態のＲＮＡの結合ａｐｔａｍｅｒ（低分子化合物）は、蛍光標識をしたのち、引き続いて電気泳動のウェル中に加えることができる。薬剤が存在しなければ、蛍光の最大レベル（１００％）もしくは結合活性が観察される。どんな種類の未知化合物をプレートに加えるてもよい。オリゴヌクレオチドとＲＮＡに結合するａｐｔａｍｅｒとの結合をブロックする化合物は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡが細胞中へ侵入することをブロックするために使用され得る、有効でかつ無毒性の化合物を見出すために、更に改変される。同様な原理が、非常に多用な動物ウイルスに対する処置法を発見するために用いられ得る。この新規なクラスの薬剤は、今まで文献中に記載されていなかったと考えられる。
【００７７】
その代わりに、酵母のハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ）が発見されたため、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域ＲＮＡおよびＣＤ１５１蛋白質は、これら二者間の相互作用をブロックする化合物を発見するために酵母トリハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔｔｒｉ−ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ）に適用され得る。
【００７８】
実施例１０
本実施例は、ＣＤ１５１ｍＲＮＡおよび生存する豚から生まれ得る子孫のＰＲＲＳウイルスに対する感受性の程度（ｌｅｖｅｌ）に関して、その生存する豚および貯蔵された生殖細胞質をスクリーニングする中で、本願発明を活用するための非侵襲性方法を示す。加えて、本実施例は実施例４に類似しており、生きた雄豚の精液をスクリーニングする中で本願発明の応用を例示的に説明し、かつ本願発明の応用を、ＰＲＲＳウイルス感染に対する豚の抵抗性を改良するための豚育種プログラムの中で、未来世代の次のリッター（同腹子、ｌｉｔｔｅｒ）へと進展する。
【００７９】
材料と方法：
本願発明に基づくと、標的細胞のＰＲＲＳウイルスに対する感受性を決定する中でＣＤ１５１の量が１つの重要なファクターであることは明らかである。豚の異なる育種系統が、肺胞マクロファージ、精液、生殖細胞、卵子および血小板のような細胞物質におけるＣＤ１５１量に関して、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってスクリーニングされる。標的器官において少ない量のＣＤ１５１を有する豚の系統は、ＰＲＲＳウイルスに対してより感染しづらいと期待され、よってＰＲＲＳ感染による有害な効果の影響をより受けにくいと期待されている。現状は、感染後の屠殺に基づいて、豚を選択し交配を行っている。比較的少ない量のＣＤ１５１を有していることが分かった動物を、ＰＲＲＳウイルスに感染しづらくなるよう選択的に交配する。このことが、豚をチェックする非侵襲方法を可能にする。ＣＤ１５１ノックアウト実験の助けを借りることにより、ＰＲＲＳウイルスに全く感染しない豚系統を開発することが可能となる。
【００８０】
結果：
本実施例は、本願発明がＰＲＲＳウイルスで実験的に感染させた後に豚の感染しやすさを決定するためには豚の種々の系統を屠殺すると言う現在の限界を克服するものであると言うことを、説明する。末梢血液の血小板、貯蔵された生殖細胞質、もしくは希釈された豚生殖細胞質および希釈なしの豚生殖細胞質のような非侵襲性の診断方法を用いて、豚育種操作により、ＰＲＲＳウイルスに感染しづらくなった動物を選択することができるはずである。
【００８１】
実施例１１
本実施例は、異なる豚育種系統におけるＣＤ１５１の定量を可能とする。
【００８２】
材料と方法：
本実施例は、プラスミドｐＫＳＵが定量的な目的で用いられるということを除き、実施例４に類似している。このプラスミドは、ＣＤ１５１の完全長オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ）を含む。既知の量（例えば、０．０５μｇ）のこのプラスミドがＰＣＲチューブに入れられ、異なる豚組織中に予想されるＣＤ１５１量の範囲をカバーするように希釈された、所定のサンプルの希釈溶液が加えられ、これによってあらかじめ定量された既知の標準を与える。未知の豚サンプル中のＣＤ１５１の量が、既知の標準曲線と比較することにより定量される。加えて、豚組織中のＣＤ１５１の正確な量を見出すために、ＣＤ１５１に対する定量的ＴａｑＭａｎを実施することができる。これによって、生殖細胞質および末梢血血小板において、既知の豚組織の１ｍｌあたりもしくは１ｇあたり、生殖細胞質１ｍｌあたり、または１００万の豚血小板あたりもしくは１００万の豚精子（ｓｐｅｒｍａｔａｚｏａ）あたりのピコグラムからナノグラムの量で、ＣＤ１５１の正確な定量を得られる。
【００８３】
結果：
定量的ＣＤ１５１ＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＤ１５１が少ない豚育種系統が、ＰＲＲＳウイルスに感染しづらくなる豚を育種するために選択される。
【００８４】
実施例１２
本実施例は、ＰＲＲＳウイルスを管理しもしくは防ぐためにより高い力価を持ちよりかつ安全なワクチンの生産を行うための非サル、組替型細胞系列の使用を例示的に説明する。
【００８５】
材料と方法：
本願発明に基づいて、ＣＤ１５１によって形質転換された、非サル細胞系列は、ＰＲＲＳウイルスに感染し易いのみではなく、親細胞系列以上により高い力価になるようＰＲＲＳウイルスを増殖させる。最初に、本願発明の属する分野において公知の方法を用いて、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、豚パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、およびＢＶＤウイルスのような混入に対してチェックされる。一旦その細胞系列について、これらの雑菌混入がないと分かれば、細胞系列はフラスコもしくはローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒｂｏｔｔｌｅ）中で培養され、プラークから精製したＰＲＲＳウイルスを感染させた。米国産単離株であるＬｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓもしくは他のいずれかのＰＲＲＳウイルスの分離株が用いられた。細胞培養は６０時間の間、ウイルス感染を受け、−８０℃で凍結され、凍結溶解を３回繰り返した。細胞物質を取り除き、澄んだ上清を、滴定を行った後にワクチンとして用いる。１００万ＰＦＵｓ／ｍｌでワクチンを使用することが薦められ、そのワクチンの投与量は非経口アジュバント（ｔｈｅｐａｒｅｎｔｅｒａｌａｄｊｕｖａｎｔｓ）の存在の下で、筋肉注射用に１ｍｌである。このワクチンは高い力価を持つために、１バイアルあたりの特定の投与量を決めるために、更に希釈され得る。別法として、本願発明の技術分野において既知となっている多様な組み合わせが適用され得る。本願発明に含まれる全ての操作と改変は、動物ワクチンの生物学的製剤（ｂｉｌｏｇｉｃｓ）を調製する分野において、おきまりの手順（ｒｏｕｔｉｎｅ）である。
【００８６】
結果：
前述の材料と方法で、非サル細胞系列におけるＰＲＲＳウイルスに対する、安全で高力価の不活化ワクチンもしくは改変生ワクチンが生成される。
【００８７】
実施例１３
本実施例は、ｉｎｖｉｔｒｏ診断アッセイの開発を目的としてＰＲＲＳウイルスを増殖させるために非サル細胞系列を応用することを示す。
【００８８】
材料と方法：
有利なことに、鼻から綿棒で分泌物を採集したサンプル（ｎａｓａｌｓｗａｂ）、肺もしくはリンパ節のような組織、またはＰＲＲＳウイルス感染、堕胎もしくは呼吸器系疾患が疑われる各症例を有する豚由来組織のプールのような臨床サンプル由来の野生型ウイルスを増殖させるために、非サル細胞系列がウイルス感染に対するより高い感受性を有すると言う理由によって、これら非サル細胞系列をＰＲＲＳウイルスを増殖させるために使用することができる。これらの細胞は、約７２時間経過して単層がコンフルエントになるまで培養され、サンプルが接種され、そして細胞系列がＳＤＯＷ１７ＦＩＴＣ複合抗体（ＳＤＯＷ１７ＦＩＦＣｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた蛍光抗体テストによりウイルスが存在するか否かがチェックされている。実施例１２で生産されたような、増殖したウイルスは、エライザプレート（ＥＬＩＳＡ，ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）をコートするために用いられ、ＰＲＲＳウイルス抗体の検出のための酵素免疫測定技術の開発のための標準手順が、Ｗｉｔｔｅｅｔａｌ．，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＮｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ−ＢａｓｅｄＥｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙｆｏｒＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ，７ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７００−７０２，（２０００）の手順を用いて記載されてきたが、これらの文献に開示されている内容は、引用して本明細書の内容とされる。最近、酵素免疫測定法が、豚ＰＲＲＳウイルスをモニターするための最高の標準（ｇｏｌｄ−ｓｔａｎｄａｒｄ）であるとみなされている。
【００８９】
結果：
野生型ＰＲＲＳウイルスは、ウイルス単離によりｉｎｖｉｔｒｏで検出され得る。加えて、ＰＲＲＳ抗生物質の存在と品質が、これらの免疫診断アッセイを用いて検出され得る。野生型ＰＲＲＳウイルスと抗体を検出し豚の群中にＰＲＲＳ診断を検証するためのｉｎｖｉｔｒｏ診断テストを与える他のアッセイは、間接的な蛍光抗体テストおよび間接的免疫ペルオキシダーゼテスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｔｅｓｔｓ）とを含む。そのようなテストは、本願発明が属する技術分野において公知であり、従来技術のみを用いて開発され得る。
【００９０】
実施例１４
本実施例は、血小板溶解物（ｐｌａｔｅｌｅｔｌｙｓａｔｅ）、精子溶解物および豚肺胞マクロファージ溶解物を含む豚体液サンプルをモニターするために使用され得るＣＤ１５１に、免疫診断用の道具（例えば、定量的エライザ）を応用することを示す。
【００９１】
材料と方法：
蛋白質は、Ｗｉｔｔｅｅｔａｌ．，２０００の方法を用いて定量的に検出される。例えば、豚サンプルにおけるＣＤ１５１の量は、これらの方法を用いて検出される。サンプルは、凍結融解される。蛋白質の量は、モニターされる。
【００９２】
結果：
本実施例は、定量的ＣＤ１５１エライザを用いた豚サンプルの大量スクリーニングを可能にする。加えて、１ｍｌの豚サンプルあたりもしくは１ｇの組織あたりの量のＣＤ１５１蛋白質が、これらの方法を用いて検出される。
【００９３】
実施例１５
本実施例は、サル起源以外の起源からのＣＤ１５１を、以前はＰＲＲＳウイルス感染しなかった細胞系列にＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を与えるために使うことができると言うことを例示的に説明する。
【００９４】
材料と方法：
ＣＤ１５１を含む細胞物質のサンプルは一匹の豚から得られる。ＲＮＡは、前に記載のようにこのサンプルから抽出され、そこで豚ＣＤ１５１はＲＴ−ＰＣＲを用いて単離される。単離されたＣＤ１５１はそこで、以前ＰＲＲＳウイルスに感染しなかった細胞系列にＰＲＲＳウイルスに対する感受性（感染し易さ）を与えるために使用され得る適切な哺乳動物発現ベクトルの中に入れられる。加えて、そのベクターを予め感受性のあった細胞系列に入れることにより、これらの細胞系列はＣＤ１５１を過剰発現するために用いられ得る。
【００９５】
結果：
予めＰＲＲＳウイルスに感染しなかった細胞系列は、豚ＣＤ１５１を含むベクターをその細胞系列に入れた後、ＰＲＲＳウイルスの感染を受け易くなる。予めＰＲＲＳウイルス感受性を有していた細胞系列は、挿入されたＣＤ１５１を過剰発現できる。それゆえ、いかなる起源由来のＣＤ１５１であっても非サル細胞系列を含む細胞系列をＣＤ１５１を発現するように形質転換するのに使われ得る。このことは、ＣＤ１５１（サル、豚等）の起源は本願発明の実施に関連せず、豚もしくは他の同様なＣＤ１５１配列を用いて、サルＣＤ１５１を用いた発明の全ての態様もまた成され得る、ということを証明する。
【００９６】
実施例１６
本実施例は、テトラスパンＣＤ１５１もしくは馬ＣＤ１５１のような他の生物種における関連したホモローグ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ、相同物）は、馬および他の生物種からのアルテリウイルスを増殖させるために使われ得ると言うことを証明する。
【００９７】
材料と方法：
異種生物由来の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ＣＤ１５１配列が、単離され、そして前に記述されたような組替型細胞系列を作成するために用いられる。この細胞系列は、そこで前に記載したようにそのウイルスを単離しかつ増殖させるために用いられる。
【００９８】
結果：
ＰＲＲＳウイルスと同様に、他のアルテリウイルスが単離され、非サル細胞系列を含む同種生物由来（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のおよび異種生物由来の細胞系列の中で高力価に増殖され得る。それゆえ、他のアルテリウイルスは、アルテリウイルスによる感染に対して予め抵抗性のあった（感染しにくい）細胞系列中に高力価ワクチンを生産し、およびアルテリウイルスに予め感受性のあった（感染し易い）細胞系列におけるウイルス産生を増加させることを確認する方法において、ＰＲＲＳウイルスと同一の方法で研究され得る。
【００９９】
実施例１７
本実施例は、ＣＤ１５１のＤＮＡ塩基配列とゲノム構成を決定する。
【０１００】
材料と方法：
豚ＣＤ１５１の完全な塩基配列を決定するために、各々のイントロンの塩基配列を決定するために、各々のエクソンの終端から次のエクソンの開始までのプライマーが設計された。プライマーの対は、下の表１に示される。
【０１０１】
【表１】

【０１０２】
ゲノムＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ抽出キットを使いかつ製造業者の指示（ＤｎｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔｃａｔａｌｏｇ＃６９５０４，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、豚肺胞マクロファージ（ＰＡＭ細胞）から抽出された。ＰＣＲは、次のように準備された。ゲノムＤＮＡ２００μｇ，１０×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭＭｇＣｌ_２、ＤＭＳＯ２．５ μｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎＭおよび各プライマー２０ｐｍｏｌである。９５℃で５分間最初の変性を行った後、２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，カリフォルニア州）がＰＣＲ反応液に加えられ、次にこれを９５℃で３０秒間、３５サイクル繰り返したのち、各々の遺伝子内領域に特異的なアニーリング温度で１５秒間、７２℃の伸長温度（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１分間、７２℃で４５分間最終伸長の反応を行った。各々の遺伝子内領域に対するアニーリング温度は、次のようである。遺伝子内領域１に対しては５７℃、遺伝子内領域２に対しては５８℃、遺伝子内領域３に対しては５９℃、遺伝子内領域４に対しては５５℃、遺伝子内領域５に対しては５３℃、遺伝子内領域６および７に対しては５７℃である。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動中で電気泳動され、ＰＣＲのバンドは切断され、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）にクローンされる。その塩基配列は、そこで、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍＥＸＣＥＬＩＩ塩基配列キット（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＥＭ７９１００，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）を用いおよび製造業者の指示に従って手作業により決定した。
【０１０３】
結果：
豚ＣＤ１５１の塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４で与えられる。イントロンの塩基配列は、ＣＤ１５１のヒト、ラットおよびマウスのホモローグ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）の塩基配列解析で決定されたように、生物種間で変化することが知られており、この生物種間で変化することは、豚ＣＤ１５１のイントロンとＣＤ１５１を有する他の動物のイントロンの間に相同性がほとんどないかもしくは全くないと言うことを示した豚ＣＤ１５１に対しても当てはまると言うことも今や分かった。
【０１０４】
豚ＣＤ１５１のゲノム構成は、表２に表されている。イントロンとエクソンはまた、特定のＳＥＱＩＤＮｏを有するものとして次のように与えられる。ＳＥＱＩＤＮｏ１５はエクソン１、ＳＥＱＩＤＮｏ１６はイントロン１、ＳＥＱＩＤＮｏ１７はエクソン２、ＳＥＱＩＤＮｏ１８はイントロン２、ＳＥＱＩＤＮｏ１９はエクソン３、ＳＥＱＩＤＮｏ２０はエクソン４、ＳＥＱＩＤＮｏ２１はイントロン４、ＳＥＱＩＤＮｏ２２はエクソン５、ＳＥＱＩＤＮｏ２３はイントロン５、ＳＥＱＩＤＮｏ２４はエクソン６、ＳＥＱＩＤＮｏ２５はイントロン６、ＳＥＱＩＤＮｏ２６はエクソン７、ＳＥＱＩＤＮｏ２７はイントロン７、ＳＥＱＩＤＮｏ２８はエクソン８、ＳＥＱＩＤＮｏ２９はイントロン８である。イントロン３を除く全てのイントロンが下記のように同定され、イントロン３の塩基配列は、残りのイントロン配列を得るために用いられる方法に類似した方法を用いて決定される。もちろん、イントロン３の配列がないという場合も有り得る。しかしながらもしイントロン３が存在すれば、豚ゲノムＤＮＡを用いてその塩基配列が得られる。
【０１０５】
【表２】

【０１０６】
【表３】

【０１０７】
発見された豚ＣＤ１５１塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されたＥＳＴ塩基配列由来の部分的豚ＣＤ１５１クローン（受託番号：クローン１− ＢＥ２３３２６５、クローン２− ＡＷ３１４２０９、クローン３− ＡＷ７８６３７９）とランダムに符号し、ヒトＣＤ１５１の公表されたゲノム塩基配列と比較された。本願発明までは、これらの前に公表されたランダムなＣＤ１５１塩基配列は、単に発現研究のためにのみ用いられてきた。そのため、完全長豚ＣＤ１５１はこれまで決して塩基配列決定がなされなかった。更に、これらのランダム部分ＥＳＴ配列は、いかなる既知の蛋白質、遺伝子、もしくは機能とも比較されなかった。寄託されたＥＳＴ配列を使用しても、本質的にＣＤ１５１の完全な配列ができるようにはならないと言うことに注意することもまた重要である。このことは、豚ＣＤ１５１の全てのイントロン塩基配列で符合するものがなかったという事実を考慮すると、とりわけ正しい。それゆえ、本願は完全な豚ＣＤ１５１のｍＲＮＡおよびゲノム塩基配列の最初の報告である。
【０１０８】
図１０は、豚ＣＤ１５１塩基配列の、模式的な説明である。この図の上部の番号１−８は、ＣＤ１５１エクソンの位置を表す。エクソンは、またこの図中の垂直方向の長方形で表され、この図で長方形内部に水平線が引いてある。イントロンは、各々のエクソンを結ぶ薄い線で表されている。対角線を持った長方形は、翻訳されない塩基配列を表す。開始コドンはＡＴＧで表され、終止コドンはＴＧＡで表されている。完全な配列は、ポリＡテイル（ｐｏｌｙ−Ａｔａｉｌ）で終わる。
【０１０９】
実施例１８
本実施例は、ＣＤ１５１の一塩基多形（ＳＮＰｓ）を確認する。
【０１１０】
材料と方法：
各々のイントロンが、ＳＮＰｓにおける差異を決定し、これらのＳＮＰｓをＰＲＲＳウイルス感染に対する細胞の感受性と相互に関連づけるために、ＰＣＲクローニングにより解析される。ＰＡＭ細胞由来の各々のイントロンからの塩基配列データは、実施例１７に記述されるようして得られ、プライマーはただ各々のイントロンを増幅するために設計され、そしてそこで様々な感受性のおよび非感受性の細胞系列における対応する各々のイントロンを増幅するのに用いられる。得られたデータは、そこでＧＣＧプログラム（ウィスコンシン大学、マヂソン、ウィスコンシン州）を用いて解析される。
【０１１１】
結果：
いかなる遺伝子のイントロンおよびエクソンにおける一塩基多形（ＳＮＰｓ）であっても、遺伝子発現において重要な役割を演じているかも知れない。イントロンの塩基配列多様性の全体（ｓｕｍ）も、細胞中の遺伝子の発現において重要な役割を演じるかも知れず、これによってＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性の多様性につながるかも知れない。
【０１１２】
実施例１９
本実施例は、豚ＣＤ１５１の染色体上の位置決め（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を決定する。
【０１１３】
材料と方法：
染色体上の位置決めは、蛍光Ｉｎ−Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により実施された。染色体のスプレッド（ｓｐｒｅａｄｓ）が標準的方法によって調製された。白血球がヘパリン処理された血液から採取され、赤血球（ＲＢＣｓ）が溶解されて、染色体がスライド上に広げられた。スライドは２×ＳＳＣ、７０％ホルムアミド中で７０℃で変性された。スライドはそこで、ビオチン標識したプローブ（ｇｅｎｏｍｉｃＣＤ１５１）でインキュベートされた。ハイブリダイゼーション後の洗浄が標準方法により実施され、その結合は、ＲｏｌａｎｄＭ．ＮａｄｏｒｅｉｎＦｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎ−ＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＷｈｏｌｅＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＬｉｂｒａｒｙＰｒｏｂｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；ｅｄｉｔｅｄｂｙＬｏｒｅｔｔｅＪａｖｉｓ（ｐａｇｅｓ３７１−３７７）によって記載されている様に、フルオレセイン標識したアビジンを用いた標準的方法によって検出されたが、これらの文献に開示されている内容は、引用して本明細書の内容とされる（Ｎａｄｏｒｅ，ＲｏｌａｎｄＭ．１９９９ＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄｅｄ．），ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ３７１−３７７）。
【０１１４】
結果：
豚ＣＤ１５１の染色体上の位置を確認することに加えて、本実施例はまた、この染色体と関連している他の病気の位置を特定するために助けとなる。このことは、ＣＤ１５１遺伝子が他の病気に対して抵抗性の遺伝子、もしくは肉質特性（ｍｅａｔｃａｒｃａｓｓｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓ）のような育種状態に影響を与える生産特性と結びつくかも知れないと言う点で、従来技術を超える明確な進歩を与えるだろう。遺伝子の位置特定はＣＤ１５１を選択すると言う付帯的効果を予想するのを助ける。一旦、この染色体に関連した他の病気が、ＣＤ１５１と相互に関連しているならば、育種のための戦略を開発することができる。もちろん、ＰＲＲＳウイルス抵抗性を選択し、なおかつ肉質を維持することができることが最も望ましい。
【０１１５】
実施例２０
本実施例は、豚ＣＤ１５１遺伝子の転写特性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｆｉｌｅ）を与える。
【０１１６】
材料と方法：
いろいろな感受性のおよび非感受性の組織が豚から採取され、その組織は、そのＲＮＡがＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉａｎｄＳａｃｃｈｉ，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐｍｅｔｈｏｄｏｆＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｂｙＡｃｉｄＱｕａｄｎｉｄｉｎｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．６２Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６−１５９．（１９８７）によって記述されている酸グアニジニウムおよびフェノールクロロホルム法（ｔｈｅａｃｉｄｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍａｎｄｐｈｅｎｏｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｍｅｔｈｏｄ）を用いて抽出されるようにすりつぶされたが、これらの文献に開示されている内容は、引用して本明細書の内容とされる。総ＲＮＡは、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜に移された。ＣＤ１５１転写物はそこで、標準プロトコールに従い、放射性標識したＣＤ１５１ｍＲＮＡプローブを用いた、ノザンブロッティング（ＮｏｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）により検出された。等しい量のＲＮＡが各々のウェル（ｗｅｌｌ）に乗せられた。転写物のサイズは、既知の放射性標識されたＲＮＡマーカーを用いることによって比較された。その転写物の量は、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡプローブを対照として用いることにより定量された。ハイブリダイゼーション後に洗浄とオートラジオグラフィーを行ってから、結果を記録した。
【０１１７】
結果：
本実施例は、ＣＤ１５１の二つの転写物を確認した。これらの転写物のサイズは特定されていない。しかしながら、最初の転写物はより大きく／上の方にあり、そして二番目の転写物はより低く／より下の方にある。最初の実験において、上の方にある転写物および下の方にある転写物は感受性のある組織（脾臓、肺、腎臓および心臓）に存在していた。しかしながら、感受性のない組織は（筋肉および肝臓）は上のほうにある転写物のみを有している。それゆえ、より小さな（より下の方にある）転写物のみがではＰＲＲＳウイルス感受性を示し、しかるに、より大きな（より上の方にある）転写物のみが非感受性組織に存在する。
【０１１８】
実施例２１
本実施例は、豚ＣＤ１５１のＲＮＡ結合活性を立証する。
【０１１９】
材料と方法：
豚組織（１００ｍｇ）を液体窒素中に凍結し、３０秒間マイクロディスメンブレイネイター（ｍｉｃｒｏｄｉｓｍｅｍｂｒａｎａｔｏｒ）ですりつぶした。組織ペレットは、１００ μｌの０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）と９００ μｌＲＩＰＡ溶解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０，０．１４ＭＮａＣｌ_２），１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１％ＳｏｄｉｕｍＤｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％ＳＤＳ，および０．２／ｍＬのＡｐｒｏｔｉｎｉｎ）に再懸濁し、ボルテックスミキサーで撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートした。組織サンプルは、そこで細胞破砕物を取り除くため、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離を行った。上清が集められ、抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，カリフォルニア州、ＣａｔａｌｏｇＮｏ．５５６０５６）と免疫沈降を行うため用いられ、続いて、上述したように、放射性標識したＰＲＲＳウイルス３’非翻訳領域ＲＮＡを用いたノースウェスタンアッセイ（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎａｓｓａｙ）を行った。
【０１２０】
結果：
豚ＣＤ１５１は図１１のノースウェスタンブロット（ｔｈｅｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）に示されたようにＲＮＡ結合活性を有する。このブロットは筋肉由来であり、豚ＣＤ１５１のＲＮＡ結合活性を明らかに表示している。このことは、豚ＣＤ１５１はサルＣＤ１５１と同様に機能し、ＲＮＡの侵入の原因であり、それゆえ、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性ファクターの原因であるということを証明している。
【０１２１】
各々の転写物の正確なサイズおよび量が解析され、各々の組織のＰＲＲＳウイルスに対する病気感受性と相互に関連づけられた。
【０１２２】
実施例２２
本実施例は、豚ＣＤ１５１によってトランスフェクトされた非サル細胞系列における細胞病理学（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）とウイルス力価を決定する。
【０１２３】
材料と方法：
ＢＨＫ−２１細胞は、実施例１に記載したように、豚ＣＤ１５１によって安定にトランスフェクトされた。本実験で用いられた豚ＣＤ１５１の構成体は、オープンリーディングフレームの９アミノ酸を欠いている。このクローンは、そこでＰＲＲＳウイルス感受性に対してテストされた。ＰＲＲＳウイルス力価は、そこで力価実験によりテストされた。ＰＲＲＳウイルスは、１時間、３７℃で連続希釈（１０培希釈、そこで更にこの１０倍希釈を１０回繰り返す）する中で感染させた。単層はそこで、ＰＢＳ中で洗浄され、１ｍｌのＭＥＭで置き換えられた。上清１００ μｌが、感染後の、０時間、２４時間、３６時間、４８時間、および７２時間の各時点で採取された。７２時間経過後は、全細胞は、ＳＤＯＷ−１７核蛋白質モノクローナル抗体を用いた直接蛍光抗体テスト（ＦＡ）によってＰＲＲＳウイルスに対して染色された。異なる時間間隔で採取されたウイルスは、ＭＡＲＫ細胞中で力価測定された。
【０１２４】
結果：
期待されたように、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔｓ）はＢＨＫ−２１細胞中に観察されなかった。しかしながら、ＭＡＲＫ細胞がＣＤ１５１によって安定にトランスフェクションされても、ＰＲＲＳウイルスの生産が高められた。このことは、豚ＣＤ１５１の機能は他のすでに確認されたＣＤ１５１塩基配列と同様に機能すると言うことを更に証明する。しかしながら、最初の９アミノ酸を欠く構成体は全く同じようには機能しなかった。それゆえ、豚ＣＤ１５１が非サル細胞系列においてＰＲＲＳウイルスを生産するために同様に用いられ得る。
【０１２５】
実施例２３
本実施例は、異なる生物種で発現するＣＤ１５１の量を決定し比較した。
【０１２６】
材料と方法：
様々な感受性組織および非感受性組織が豚から採取され、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｉにより記載された酸グアニジニウムおよびフェノールクロロフォルム法（ｔｈｅａｃｉｄｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍａｎｄｐｈｅｎｏｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｍｅｔｈｏｄ）を用いてＲＮＡが抽出され得るように、組織がすりつぶされた。総ＲＮＡがそこで、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動され、ナイロン膜へ移された。放射性標識したＣＤ１５１ｍＲＮＡをプローブとして用い、かつ標準プロトコールに従ってＣＤ１５１転写物が、ノザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）により検出された。等しい量のＲＮＡが各々のウェル中へ乗せられ、そしてそこで既知の放射性標識したＲＮＡマーカーが転写物の大きさを比較するために用いられた。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡプローブを対照として用いて、転写物の量が定量された。ハイブリダイゼーション後に洗浄とオートラジオグラフィーを行った後、結果を記録した。
【０１２７】
結果：
いかなる遺伝子のＣＤ１５１ｍＲＮＡに対して豚組織のノザンブロットアッセイ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｓ）を行っても、その組織において発現された蛋白質の量を示した。正しいサイズおよび量を持った転写物が存在すると言うことはその組織中で蛋白質の発現を決定する上で非常に重要である。前に議論されたように２つの転写物が観察された。各々の組織がＣＤ１５１に対して独自の転写特性を持っている。
【０１２８】
実施例２４
本実施例は、実施例２０によって示される細胞の転写特性を比較し、豚の異なる品種に対する結果を比較する。
【０１２９】
材料と方法：
転写特性は実施例２０に記載されたように与えられる。しかしながら、これら特性における差異は豚の多様な感受性および非感受性の品種と相互に関連性を持つ。
【０１３０】
結果：
豚の異なる品種由来の異なる組織における各々の転写物の量は、各々の品種の相対的ＰＲＲＳウイルス感受性との間で相互に関連を有する。非感受性の品種もしくはＰＲＲＳウイルスに対して感受性が減少した品種が、これら同一の組織由来であるが他の生物種起源由来のＣＤ１５１の量と比較したときに、その組織中のＣＤ１５１の量が減少していることを示していた。異なる品種の豚における個々の豚の転写特性は、改良された豚の品種に対する選択の判断基準を開発するために使われる。
【０１３１】
実施例２５
本実施例は、豚ＣＤ１５１の組織分布を決定した。
【０１３２】
材料と方法：
異なる豚組織を採取し、その組織の１００ｍｇを液体窒素中に凍結し、３０秒間のパルスでｍｉｃｒｏｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを用いてすりつぶした。すりつぶされた組織は、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁した。サンプルはそこで、シェーカー中、室温で３０分間インキュベートされた。蛋白質サンプルは、そこで５分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離された。上清は、そこで１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。次に全蛋白質は、１０％馬血清中でブロックされたニトロセルロース膜に移され、ＣＤ１５１抗体がブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で、１／５００量加えられた。膜は、そこで二次抗体である抗マウスＨＲＰＯ複合抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カリフォルニア州）を１／１０，０００量加えてインキュベートする前に、１５分間で３回洗浄した。膜は、そこで膜ＴＭＢ複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅＴＭＢｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）中で展開された。
【０１３３】
豚ＣＤ１５１のゲノム構成を決定するために、ヒトＣＤ１５１に対して産生された抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体１４Ａ２．Ｈ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，カリフォルニア州）が使用された。ウェスタンブロットアッセイ（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙ）がそこで実施され、その結果がＣＤ１５１発現量に対して解析された。豚ＣＤ１５１の２つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が定量され、ＰＲＲＳウイルス感受性と相互に関連づけられた。これらのパラメータはまた、豚の品種選択の際に助けとなるために使用される。最終的には、その判断基準は、品種と選択のための異なる重さに割り当てられる。
【０１３４】
結果：
２つのバンドがウェスタンブロットアッセイを用いて確認されたので、豚の筋肉および心臓組織は大量のＣＤ１５１を持つことが示された。１つのバンドは、約６０ｋＤであり、他のバンドは約３０ｋＤである。ＣＤ１５１遺伝子の細胞内での発現は、その遺伝子のゲノム構成によって決定されるため、ＣＤ１５１の大量もしくは少量の発現は、その構成に直接関係している。その構成は、また、豚のＰＲＲＳ病に対する異なる感受性につながる遺伝子発現のエンハンサーもしくはインヒビターのような他のファクターがあるかないかをも示している。
【０１３５】
実施例２６
本実施例は、ＰＲＲＳウイルスの生態におけるＣＤ１５１のカルボキシ末端に存在するＹＲＳＬドメインの本質的役割を示す。
【０１３６】
材料と方法：
ＰＲＲＳウイルスＲＮＡの侵入におけるＣＤ１５１の細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔａｉｌ）の突然変異の効果を研究するために、これらの突然変異の効果が、ＰＲＲＳウイルス感染に対する突然変異の効果によってチェックされる。ウイルスの存在は、免疫蛍光アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）によってチェックされる。端的に言えば、ＰＣＲに基づく突然変異は、ＰＲＲＳウイルス感染に与えるこれら突然変異の効果を研究するために、ＣＤ１５１（サルおよび豚）の２つの構成について実施される。
【０１３７】
結果：
ＣＤ１５１分子は、細胞質側末端においてＹＲＳＬ（ＳＥＱＩＤＮｏ２９）配列を含む。この配列はＹＸＸＬ（ＳＥＱＩＤＮｏ３６）モチーフ（ｍｏｔｉｆ、中心的図形）もしくはドメインの中にあると考えられている。このモチーフおよびとりわけＹＲＳＬ配列は、カルボキシ末端に位置している既知のＲＮＡ結合ドメインである。そのようなドメイン中で、ＸＸ残基は、内面化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）における何らかの変化なしで、突然変異を受けるかも知れない。Ｌ（ｌｅｕｃｉｎｅ）残基は、重要な疎水性の残基である。ＣＤ１５１の細胞質側末端が、ＰＲＲＳウイルス侵入において重要な役割を演じているならば、突然変異したＣＤ１５１はＢＨＫ−２１細胞系列におけるＰＲＲＳウイルス感染性を回復することができる。Ｙ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）もしくはＬが突然変異を受けたのならばこの場合が当てはまると考えられている。しかしながら、Ｒ（ａｒｇｉｎｉｎｅ）もしくはＳ（ｓｅｒｉｎｅ）が突然変異を受けたのならば細胞質側末端のＲＮＡ結合能に対して何ら影響を及ぼさないと考えられる。従って、そのような突然変異したＣＤ１５１配列はＢＨＫ−２１細胞系列においてＰＲＲＳウイルス感染性を回復することができる。そのような状況では、ＹＲＳＬ配列がＣＤ１５１のカルボキシ末端における１つのシグナルとして作用すると言うことが考えられている。このことは、カルボキシル末端にシグナルを有する、エンドサイトーシスのサイクルの末期に細胞内に入る他の既知物質と相互に関連を有するだろう。エンドサイトーシスは、細胞膜から細胞へと芽を出すクラスリン被覆小孔（ｃｌａｔｈｒｉｎｃｏａｔｅｄｐｉｔ）を形成することを含む。ＰＲＲＳウイルス細胞はクラスリン被覆小孔を通って入る。ＣＤ１５１が、内皮細胞のような標的器官のエンドソームの中に局在し、ＰＲＲＳウイルスのエンドソームを通って侵入することに参加しているかも知れないということが分かっている。ＰＲＲＳは多くの遺伝子型と７５以上の免疫型（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ）があるが、しかし、全ての分離株は共通の侵入通路（ｅｎｔｒｙｐａｔｈｗａｙ）を用いている。従って本実施例から明らかになった情報は、何らかの系統の豚がＣＤ１５１のこの重要な配列において突然変異を有しているかどうかを見出すために用いられるだろう。
【０１３８】
議論
ウイルスは、複製のためには限定的な遺伝物質を有し必然的に（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）内部パラサイト（内部寄生物、ｉｎｔｅｒｎａｌｐａｒａｓｉｔｅ）である。ウイルスはしばしば、ＲＮＡ結合蛋白質、転写因子、プロテアーゼ、および自己のＤＮＡ複製のための膜因子の形で、宿主細胞のファクターを活用する。ＲＮＡ結合蛋白質は、転写、翻訳、位置づけ（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）、およびウイルスＲＮＡの輸送において役割を演じることができる。どのようにウイルスＲＮＡ複製が進行するかを理解するために、これらの蛋白質を同定し特徴づけることが重要である。ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合する宿主細胞蛋白質の同定についての報告はない。
【０１３９】
本願で、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合する新規２９ｋＤの糖蛋白質であるサルＣＤ１５１の同定について報告する。ＣＤ１５１は、細胞蛋白質のテトラスパンもしくは４回膜貫通蛋白質スーパーファミリーに属する膜透過糖蛋白質である。テトラスパンは脂質二重層および２つの細胞外領域をまたぐ４つの高度に保存された疎水性領域を有する。Ｎ末端とＣ末端が細胞質の中に見出される。サルＣＤ１５１は、内皮細胞膜、血小板、巨核球、上皮、肺、筋肉、シュバン細胞、および糸球体（ｇｌｏｍｅｒｕｌｉ）に主に見出されるＰＥＴＡ−３と９８％の相同性を共有する。この蛋白質は、Ｔ細胞白血病ウイルスＩ型によって形質転換されるヒトＴ細胞において、上向き調節を受ける（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことが示されてきており、ＳＦＡ−１と命名されてきた。ＰＥＴＡ−３のかなりの量は、細胞内コンパートメント（区画）中に存在しており、核周囲（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ）の顆粒に局在化し、内皮細胞に存在するＰＥＴＡ−３蛋白質の総量の６６％を占める。テトラスパンであるＣＤ１５１は、癌の転移における初期のステップで要求され、造血細胞系列におけるインテグリンとの相互作用、細胞− 細胞吸着（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｓ）の調節、および蛋白質− 蛋白質相互作用を通しての膜透過の信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に関与する。
【０１４０】
ＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合することを証明した後に、ＣＤ１５１の存在とＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性との間の相互作用がテストされた。全て腎臓細胞由来である、ＭＡ１０４、ＭＡＲＫ，ＣＯＳ−７およびＶｅｒｏ細胞系列は、ＣＤ１５１を有することが見出された。しかしながら、ＢＨＫ−２１およびＭＤＢＫ細胞もまた腎臓細胞由来であるが、しかしＣＤ１５１細胞を欠いている。それゆえ、ＣＤ１５１は、腎臓特異的蛋白質であるとはいえない。ＰＲＲＳウイルスは、ＢＨＫ−２１細胞に入らないが、しかし、これらの細胞をＰＲＲＳウイルスＲＮＡまたは感染性のｃＤＮＡクローンによってトランスフェクトすることは、近隣の細胞に広がることなしに豊富なウイルス感染をさせることができる。それゆえ、ＢＨＫ−２１細胞は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡの複製を支持するがウイルスもしくはウイルスＲＮＡの侵入のために要求される細胞ファクターを欠くと結論される。ＣＤ１５１が膜透過蛋白質であることが見出されたので、ＰＲＲＳウイルスおよび／またウイルスＲＮＡの侵入に役割を有しているかも知れないと言うことは筋が通っている。もう１つのテトラスパンであるＣＤ９がＭＤＢＫを非感受性細胞系列に変え、イヌジステンパーウイルス感染に対して感受性を与え、１つのエントリー分子として機能すると言うことが先に報告されている。ＣＤ１５１がＰＲＲＳウイルス感染の１つの感受性ファクターであると言うことを証明するために、ＣＤ１５１を発現するＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルスによって感染を受けたが、しかるに、ＣＤ１５１を欠く親細胞系列は感染を受けないと言うことが決定された。それゆえ、ＣＤ１５１は膜透過分子であるので、ＢＨＫ−２１細胞へのウイルスの侵入もしくはＲＮＡの侵入においてＣＤ１５１が１つの役割を演じているかも知れない。
【０１４１】
ウイルスの細胞への侵入は、ウイルス蛋白質と細胞膜上に存在する特定のウイルス受容体との相互作用によって起こる。これらの受容体は、ウイルス感染に対する感受性の非常に重要な抗原決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）である。以前の研究は、ＰＲＲＳウイルスがヘパリン様分子に結合し、そしてウイルスの侵入が受容体を媒介としたエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって起こると言うことを証明してきた。これらの小胞中の低いｐＨは、豊富な感染のために必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）である。共免疫沈降法が、ＰＲＲＳウイルス蛋白質とＣＤ１５１の間に何らかの相互作用があるかどうかを決定するために実施された。しかしながら、両者の間の直接の蛋白質− 蛋白質相互作用の証拠は無かった。このことは、もう１つのテトラスパンであるＣＤ９がイヌジステンパーに対する感受性ファクター（ｆａｃｔｏｒ）であるが、しかし、ＣＤ９はそのウイルス蛋白質とは直接結合しないと言う従来の観察と一致するものだ。受容体である蛋白質ならば、そのウイルス蛋白質と相互作用するに違いない。それゆえ、ＣＤ１５１は、その受容体としては機能しない。ＣＤ１５１は小胞中にそしてまた膜中にも存在するので、ＲＮＡを輸送する分子（ＲＮＡｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）としての役割が二つの観察に基づいて予想されている。１つは、ＣＤ１５１が非感受性の（ウイルス感染を受けない）ＢＨＫ−２１細胞をウイルス感染に対する感受性を与える（ウイルスに感染し易くする）、そして二番目に、（安定なトランスフェクションにより）ＣＤ１５１を過剰発現するＭＡＲＫ細胞が自然のままの（ｎａｔｉｖｅ）細胞系列に比較してウイルス生産において１００倍増加した発現をする。ウイルスの複製におけるＣＤ１５１のこの効果は、ＲＮＡ輸送分子として機能するＣＤ１５１を有するウイルスを侵入させる間に、ウイルスＲＮＡの細胞による取り込みが増加することによって説明される。このプロセスは図９に模式的に示される。ＲＮＡ結合蛋白質が、ＲＮＡ輸送分子として機能することが予想されると言う以前のデータがある。精巣および脳のＲＮＡ結合蛋白質は、ｍＲＮＡの３‘非翻訳領域と相互作用し、ｍＲＮＡを、それが翻訳される細胞内の場所まで輸送する。この蛋白質はまた、細胞と細胞の間で全ｍＲＮＡを輸送するとも報告されている。タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）においては、３０ｋＤの移動蛋白質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）が細胞間連絡（原形質連絡、ｐｌａｓｍｏｄｅｓｍａｔａ）経由で細胞から細胞へのウイルスＲＮＡの輸送に関わっている。ｂｅｅｔｎｅｃｒｏｔｉｃｙｅｌｌｏｗｖｉｒｕｓにおいては、蛋白質ｐ４２、ｐ１４およびｐ１３がウイルスＲＮＡとの相互作用により細胞間連絡を通してウイルスＲＮＡの運動に関わっている。動物ウイルスにおいては、ＲＮＡ輸送分子の報告は何もない。ＰＲＲＳウイルス感染において、ＣＤ１５１は、単独でもしくは他の蛋白質と結合して、ウイルスが小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）中で殻を取った後、細胞質ヘ侵入するＲＮＡ輸送分子（ＲＮＡｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）として活動するだろう。それゆえ、本願発明は、ＣＤ１５１が主としてウイルスＲＮＡエントリー蛋白質としてＰＲＲＳウイルスの複製に関わっていると言うことを証明する。
【０１４２】
ＣＤ１５１膜透過蛋白質がウイルスおよびウイルスＲＮＡの細胞への侵入に１つの役割を演じているかどうかを決定するために、ＢＨＫ−２１細胞が、ＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性がある（ウイルスに感染しづらい）と言う理由から、実験のために選択された。しかしながら、ＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルスＲＮＡもしくはＰＲＲＳウイルスの感染性のｃＤＮＡクロ−ンのどちらかによってトランスフェクトされた場合には、ＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルスの複製を助ける。それゆえ、ＢＨＫ−２１細胞における抵抗因子（ａｒｅｓｉｓｔａｎｔｆａｃｔｏｒ）は、そのエントリー分子（ｔｈｅｅｎｔｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ）と結びついているかも知れない。ＢＨＫ−２１がＣＤ１５１を欠いていると言う事実は、ＣＤ１５１に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（図５、レーン６）によって明確に示された。ＣＤ１５１を発現するＢＨＫ−２１細胞は、上記＜材料と方法＞中に記載されたように、安定なトランスフェクションによって得られた。これらのトランスフェクトされた細胞を、ＰＲＲＳウイルスに感染させ、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）的方法によってウイルス産生についてテストした。特に、ＣＤ１５１でトランスフェクトされた細胞は、ＰＲＲＳウイルスに感染するようになったが、しかし、ＣＤ１５１（図６で証明されている）を欠く親ＢＨＫ−２１細胞はウイルス感染するようにならなかった。
【０１４３】
本願発明の他の有利な形態は、これらの実験で用いられるｔｈｅｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞系列は、サル起源ではないということだ。それゆえ、ＢＨＫは、サル起源のＰＲＲＳウイルスを増幅するために用いられる全ての他の細胞系列とは異なる。非サル細胞系列を使用しても、霊長類ウイルスもしくはサルウイルスを豚、とりわけ、異種生物間移植された豚へ伝達することに何のリスクも引き起こさないため、このことは大きな強みを与える。ＰＲＲＳウイルスを増殖させるために非サル細胞系列を使うことにより、霊長類ウイルスおよび／またサルウイルスは豚個体群（ｓｗｉｎｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に導入されず、それゆえ、ヒト個体群へのリスクを引き起こさない。また、ＣＤ１５１を発現するこれらの細胞は、ＰＲＲＳウイルスのより高い力価を有するがゆえに、ワクチン生産目的でＰＲＲＳウイルスを増殖させるには、より便利でかつ経済的有用性もある。好都合にも、これらの細胞は、ＰＲＲＳウイルスの不活化ワクチンおよび生ワクチンを作るために使用することができ、かつ血清診断アッセイ（ｓｅｒｏｄｉａｇｎｓｔｉｃａｓｓａｙｓ）に使用され得る。
【０１４４】
７Ｇ１０という名称のモノクロ−ナル抗体が開発された。この抗体は、細胞培養中のＰＲＲＳウイルス感染を完全にブロックする。この抗体は、ＭＡＲＫ細胞系列の宿主細胞蛋白質に対して作られ、そしてＰＲＲＳウイルスに対する高い中和活性を発現するＩｇＡアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）である。ｖｉｒｕｓｏｖｅｒｌａｙｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｔａｓｓａｙ（ＶＯＰＡ）に基づけば、７Ｇ１０はＰＲＲＳウイルスの受容体を認識しており、それゆえＰＲＲＳウイルスを中和し得る。これらの特異的特徴があるので、７Ｇ１０はＰＲＲＳウイルスの伝達を防ぐために豚産業に応用され得るのである。
【０１４５】
最後に、本願発明は、豚ＣＤ１５１のＤＮＡ塩基配列とゲノム構成を決めた。そうした知識は、耳ノッチバイオプシー（ｅａｒ−ｎｏｔｃｈｂｉｏｐｓｙ）について実施され得るＤＮＡ−ｂａｓｅｄＰＣＲを開発するのを助ける。一匹の生存動物が入手できなければ、生殖細胞質、精子および成熟した卵子（ｆｌｕｓｈｅｄｏｖａ）を用いても実験（ｔｅｓｔｉｎｇ）は実施できる。そうしたデザインにより、動物の死後数年或いは数世代経過したのちに、死亡動物由来の生殖細胞質を、群れ全体の改良を目的として使用することができる。更に、豚ＣＤ１５１は豚組織中にＰＲＲＳウイルスＲＮＡ結合活性を有し、かつ豚ＣＤ１５１はヒト、サルおよびマウスに対応する既知のＣＤ１５１配列とたった８４％の塩基配列相同性を有しているに過ぎないと言うことが分かった。加えて、本願発明は、豚ＣＤ１５１ｍＲＮＡの塩基配列決定を可能にした。そのような配列は、Ｔａｂｌｅ２のエクソンを配列順に連結し、かつこれら連結されたエクソンのＤＮＡ塩基配列からＲＮＡへの転写を考えることで決定され得る。ｍＲＮＡの塩基配列へつながり得る１つの塩基配列が本願で、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８として与えられている。
【図面の簡単な説明】
本特許の出願は、カラーで作成された少なくとも一枚の図面を含む。カラー図面を付した本願特許のコピーは、請求により必要な費用の支払いを条件として米国特許商標庁から入手できる。
【図１】サルＣＤ１５１のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド塩基配列であり、推定上の膜透過領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ）に下線を付した、予想されるアミノ酸配列およびフレーム内終止コドンをアステリスク（ａｓｔｅｒｉｓｋ）によって表示した。
【図２】ノースウェスタンブロッティングアッセイ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｓｓａｙ）においてＣＤ１５１モノクローナル抗体との免疫沈降で検出されたＣＤ１５１蛋白質のＲＮＡ結合活性を示す写真である。
【図３】ノースウェスタンブロッティングアッセイ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｓｓａｙ）においてベータガラクトシダーゼ（ β−ｇａｌａｃｔｏｃｉｄａｓｅ）モノクローナル抗体との免疫沈降で検出されたＣＤ１５１蛋白質のＲＮＡ結合活性を示す写真である。
【図４】ＰＲＲＳウイルスが感染したＭＡＲＫ細胞溶解物（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓ）を免疫沈降させたのち、ＲＴ−ＰＣＲによって明示されるようにＣＤ１５１蛋白質のｉｎｖｉｖｏＲＮＡ結合活性を示す写真である。
【図５】ＣＤ１５１の１０５塩基対（ｂｐ）の増幅単位の増幅を明示するＲＴ−ＰＣＲの写真である。
【図６】ＣＤ１５１の存在を検出するウェスタンブロット実験（ａｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）の結果を示す写真である。
【図７ａ】ＰＲＲＳウイルスの抗原が検出されないことを示す、野生型ＢＨＫ−２１におけるＰＲＲＳウイルスの存在を検出するための免疫組織化学染色の写真である。
【図７ｂ】ＣＤ１５１によってトランスフェクトされたＢＨＫ−２１中にＰＲＲＳウイルスの存在を検出するための免疫組織化学染色の写真である。
【図８】ＣＤ１５１によって安定なトランスフェクションを行ったのちのＭＡＲＫ細胞による、増幅されたＰＲＲＳウイルス生産を明示するグラフである。
【図９】ＰＲＲＳウイルスＲＮＡが標的細胞に侵入するメカニズムおよびＣＤ１５１のようなＲＮＡ結合蛋白質の役割を模式的に表したものである。
【図１０】豚ＣＤ１５１ＤＮＡの塩基配列を模式的に表したものである。
【図１１】豚ＣＤ１５１のＲＮＡ結合活性を明示するノースウェスタンブロット（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）の写真である。

Claims

一匹の動物におけるＰＲＲＳウイルス感染への感受性を確かめる（ａｓｃｅｒｔａｉｎｉｎｇ）方法であって、
該動物から既知の起源を有する細胞物質（ｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｅｒｉａｌ）サンプルを得るステップ、
該サンプル上でＣＤ１５１アッセイを実施するステップ、および
該アッセイの結果を使って、該動物の感受性を測定するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
細胞物質が、精液、血液、生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）、卵子および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
アッセイステップが該サンプルからＲＮＡを抽出するステップを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
抽出されたＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施するステップを更に含む事を特徴とする請求項３記載の方法。
アッセイステップが、検出されたＣＤ１５１の量を定量するステップを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
ＣＤ１５１の定量された量を、該細胞物質サンプルに対する既知の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）と比較するステップを更に含む事を特徴とする請求項５記載の方法。
既知の標準が，動物の平均感受性（ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を表すことを特徴とする請求項６記載の方法。
既知の標準が、サンプルとしての同一起源を有する細胞物質サンプル由来のＣＤ１５１につき数多くの定量されたＣＤ１５１量の平均をとることにより決定されるものであることを特徴とする請求項６記載の方法。
一匹の動物のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性をＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性の既知の標準と比較する方法であって、
該既知の標準は、既知の起源を有する細胞物質のＣＤ１５１量と相互に関連をもち、かつ、
該動物由来の既知の起源を有する細胞物質のサンプルを得るステップ、
該動物におけるＣＤ１５１量を決定するための該サンプルを解析する（ａｎａｌｙｚｉｎｇｓａｉｄｓａｍｐｌｅ）ステップ、および
該サンプル由来の該決定されたＣＤ１５１量を該既知の標準と同じＣＤ１５１量と比較するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
既知の標準がサンプルとして同一の起源由来であることを特徴とする請求項９記載の方法。
解析ステップが、サンプル由来のＲＮＡを抽出するステップを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
抽出ＲＮＡにつきＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）を実施するステップを更に含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
解析ステップが、既知の標準が決定されたＣＤ１５１の量を定量するステップを含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。
サンプルが、精液、卵子、血液、生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）、および精子細胞から成るグループから選択される細胞物質サンプルを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
一匹の動物がＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性があるかどうかを決定する方法であって、
該動物由来の細胞物質のサンプルを得るステップ、
該サンプルにおけるＣＤ１５１の存在を確認するためのアッセイを実施するためのステップ、および、
該動物が、該サンプルにおいてＣＤ１５１が存在する場合もしくは存在しない場合に、ＰＲＲＳウイルス感染にたいして抵抗性があるかどうかを決定するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
サンプルが、既知の起源を有することを特徴とする請求項１５記載の方法。
サンプルが、精液、卵子、血液、生殖細胞質、および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
一匹の動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を分類する（ｃｌａｓｓｉｆｙ）方法であって、
該動物由来の既知の起源を有する細胞物質のサンプルを得るステップ、
該サンプルにおけるＣＤ１５１の量を知るために該サンプルにつきアッセイを実施するステップ、
該サンプルの該ＣＤ１５１量をＣＤ１５１の既知のスケール（ｓｃａｌｅ）と比較するステップであって、
該既知のスケールがＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性の一定の程度（ｄｅｇｒｅｅ）に対応することを特徴とするステップ、および、
該スケールとの該比較に基づいて該動物のＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を分類するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
分類の結果として、動物のＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を、百分率でランク付けすることを特徴とする請求項１８記載の方法。
サンプルが、血液、精液、卵子、生殖細胞質、および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
既知のスケールが、サンプルとしての同一起源を有する細胞物質に対する１つのスケールであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
既知のスケールが、サンプルの起源に依存して異なることを特徴とする請求項１８記載の方法。
アッセイステップがサンプルからＲＮＡを抽出するステップを含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
抽出されたＲＮＡにつき、ＲＴ−ＰＣＲを実施するステップを更に含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
細胞物質のサンプル中にＣＤ１５１を検出する方法であって、
該動物からＲＮＡを抽出するステップ、
該抽出されたＲＮＡにつき逆転写酵素ＰＣＲを実施するステップ、および、
ＣＤ１５１が存在するかどうかについての該逆転写酵素ＰＣＲの結果を解析するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
ＣＤ１５１の量を定量するステップを更に含むことを特徴とする請求項２５記載の方法。
サンプルが既知の起源を有することを特徴とする請求項２５記載の方法。
サンプルが、精液、卵子、血液、生殖細胞質および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２５記載の方法。
ＰＲＲＳウイルスのワクチン材料（ｓｔｏｃｋ）を製造する方法であって、
該細胞系列をＣＤ１５１によって形質転換するステップ、
該細胞系列にＰＲＲＳウイルスを感染させるステップ、および、
該細胞系列に、該ワクチンストック中で使用されるＰＲＲＳウイルスの子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を生成させるステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
細胞系列が、非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
細胞系列が、ＣＤ１５１による形質転換に先立ってＰＲＲＳウイルス感染に対して非感受性であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
形質転換ステップが、ＣＤ１５１のＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドによる安定なトランスフェクションを含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１（塩基配列リストの配列番号１の配列）と少なくとも約９１％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３２記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３３記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３４記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列が非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列が豚起源を有することを特徴とする請求項３６記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３２記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３８記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３９記載の方法。
ＣＤ１５１塩基配列がＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３４記載の方法。
形質転換された細胞系列のワクチン材料（ｖａｃｃｉｎｅｓｔｏｃｋ）が、形質転換する前に前もって得ることができる力価（ｔｉｔｅｒ）よりも、高い力価を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
形質転換された細胞系列（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）の力価が、形質転換する前に可能であった力価の少なくとも約１００倍高率であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
細胞系列が、形質転換前にＣＤ１５１をコードしたＤＮＡを含まないことを特徴とするＣＤ１５１をコードするＤＮＡを含む、形質転換された細胞系列。
細胞系列が、非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項４４記載の形質転換された細胞系列。
ＣＤ１５１をコードするＤＮＡが、非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項４４記載の形質転換された細胞系列。
ＣＤ１５１をコードするＤＮＡが、豚起源を有することを特徴とする請求項４６記載の形質転換された細胞系列。
ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有する単離された（ｉｓｌａｔｅｄ）ＤＮＡ塩基配列。
塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有することを特徴とする請求項４８記載のＤＮＡ塩基配列。
塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有することを特徴とする請求項４９記載のＤＮＡ塩基配列。
ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むプラスミド。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項５１記載のプラスミド。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項５２記載のプラスミド。
Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ）ＡＦ２７５６６６を有するプラスミド。
ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むプラスミド。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項５５記載のプラスミド。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項５６記載のプラスミド。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項５７記載のプラスミド。
ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むベクター。
ベクターが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項５９記載のベクター。
ベクターが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６０記載のベクター。
ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むベクター。
ベクターが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６２記載のベクター。
ベクターが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６３記載のベクター。
ベクターが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６４記載のベクター。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列を含むプラスミドを用いて、細胞系列を形質転換するステップを含む、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を細胞系列に与える方法。
細胞系列が、形質転換ステップの前にＰＲＲＳウイルス感染に対して非感受性である（感染しづらい）ことを特徴とする請求項６６記載の方法。
細胞系列が非サルウイルス起源であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
細胞系列が豚起源であることを特徴とする請求項６８記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６６記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項７０記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項７１記載の方法。
プラスミドが、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２７５６６６を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６６記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項６６記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項７４記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項７５記載の方法。
プラスミドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の配列相同性を有するＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項７６記載の方法。
育種用動物を選択する方法であって、
ＣＤ１５１の量（ｌｅｖｅｌ）を得るために、ＣＤ１５１が存在するかしないかに関して、該動物の細胞物質サンプルをスクリーニングするステップ、
該ＣＤ１５１の量を、ＣＤ１５１量に関する既知の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）と比較するステップ、および
該既知の標準より少ないＣＤ１５１量を有する、育種用動物を選択するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
サンプルが、既知の起源を有することを特徴とする請求項７８記載の方法。
サンプルが、既知の標準と同一の起源を有することを特徴とする請求項７８記載の方法。
ＣＤ１５１の量が、既知の標準より少なくとも約２０％少ないことを特徴とする請求項７８記載の方法。
ＣＤ１５１の量が、既知の標準より少なくとも約３５％少ないことを特徴とする請求項８１記載の方法。
ＣＤ１５１の量が、既知の標準より少なくとも約５０％少ないことを特徴とする請求項８２記載の方法。
サンプルが、血液、精液、卵子、生殖細胞質、および精子細胞を含むグループから選択されることを特徴とする請求項７８記載の方法。
ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性である（ウイルス感染を受けやすい）細胞中におけるＰＲＲＳウイルス生産を改変する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）方法であって、
細胞をＣＤ１５１により形質転換するステップを含むことを特徴とする方法。
改変が、細胞においてＰＲＲＳウイルスの生産増加をもたらすことを特徴とする請求項８５記載の方法。
改変が、１ｍｌのワクチンウイルスストックあたりのＰＲＲＳウイルスの生産増加をもたらすことを特徴とする請求項８５記載の方法。
ＣＤ１５１が、豚以外に起源を有することを特徴とする請求項８５記載の方法。
ＣＤ１５１が、豚に起源を有することを特徴とする請求項８８記載の方法。
ＰＲＲＳウイルスの細胞内への侵入（ｅｎｔｒｙ）をブロックする方法であって、
ＰＲＲＳウイルスのＲＮＡがＣＤ１５１と相互作用することをブロックするステップを含むことを特徴とする方法。
ブロックするステップが、細胞を抗ウイルス化合物（ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌｃｏｍｐｏｕｎｄ）に接触させることを含むことを特徴とする請求項９０記載の方法。
抗ウイルス化合物が、抗ＲＮＡエントリー化合物（ａｎｔｉ−ＲＮＡＥｎｔｒｙＣｏｍｐｏｕｎｄ）を含むグループから選択されることを特徴とする請求項９１記載の方法。
抗ウイルス化合物が、ＣＤ１５１上の結合サイトを占有することを特徴とする請求項９２記載の方法。
抗ウイルス化合物が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ以上に、結合サイトに対するより大きな親和性（アフィニティー）を有することを特徴とする請求項９３記載の方法。
抗ウイルス化合物が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ以上に、結合サイトに対するより大きな結合力（アビディティー）を有することを特徴とする請求項９３記載の方法。
抗ウイルス化合物がハイスループット処理（ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｍａｎｎｅｒ）によりスクリーニングされることを特徴とする請求項９３記載の方法。
豚の群（ａｓｗｉｎｅｈｅｒｄ）におけるＰＲＲＳウイルス感染を診断する方法であって、
該群の個別の豚から、細胞物質サンプルを得るステップ、
ＣＤ１５１によって形質転換された細胞系列を供給する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）ステップ、
該サンプルおよび形質転換された該細胞系列を用いてｉｎｖｉｔｒｏ診断テストを実施するステップ、および、
ＰＲＲＳウイルス感染を診断するため該診断テストの結果を用いるステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
細胞物質が、血液、精液、卵子、生殖細胞質、および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項９７記載の方法。
診断テストがウイルス単離アッセイ（ｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ）および免疫診断アッセイ（ｉｍｍｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｓｓａｙｓ）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項９７記載の方法。
免疫診断アッセイが、エライザ（ＥＬＩＳＡ）、間接蛍光抗体テスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔｓ）、および間接免疫ペルオキシダーゼテスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｔｅｓｔｓ）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項９９記載の方法。
形質転換された細胞系列が、形質転換前の該細胞系列以上に活発なウイルスの複製を可能にすることを特徴とする請求項９７記載の方法。
細胞系列が、非サル起源（ｎｏｎ−ｓｉｍｉａｎｏｒｉｇｉｎ）を有することを特徴とする請求項９７記載の方法。
形質転換された細胞系列が、非サル起源を有するＣＤ１５１塩基配列を含むことを特徴とする請求項９７記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列（ＣＤ１５１ｃｏｒｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）を染色体へ直接組み込む方法であって、
ＣＤ１５１をコードする塩基配列を内部に有するベクターを供給するステップ、
染色体を該ベクターと接触させるステップ、および
該ＣＤ１５１をコードする塩基配列を染色体中に組み込んで１つにするステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
該ベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１０４記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列の発現を引き起こすステップを更に含むことを特徴とする請求項１０４記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、サルＣＤ１５１および豚ＣＤ１５１から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１０４記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９１％の相同性を有することを特徴とする請求項１０４記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１と少なくとも約９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１０８記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１０４記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項１１０記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１１１記載の方法。
ＣＤ１５１をコードする塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とする請求項１１２記載の方法。
改変前のゲノムと比較して、変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）量のＣＤ１５１を発現する改変されたゲノムであって、該改変が該ゲノム中にあるＣＤ１５１をコードする塩基配列（ＣＤ１５１ｃｏｒｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）の個数（ｔｈｅｎｕｍｂｅｒ、コピー数）を変化させることを特徴とする改変されたゲノム。
請求項１１４記載の、改変されたゲノムを有する動物。
ｍＲＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８と少なくとも８４％の相同性を有するＤＮＡ塩基配列に対応していることを特徴とする単離されたｍＲＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項１１６記載のｍＲＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１１７記載のｍＲＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．３８と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とする請求項１１８記載のｍＲＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とするＣＤ１５１をコードする単離されたＤＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項１２０記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１２１記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
ＤＮＡ塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とする請求項１２２記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
塩基配列が、豚ＣＤ１５１に由来することを特徴とするＣＤ１５１をコードする単離されたＤＮＡ塩基配列。
塩基配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５−２９から成るグループから選択された塩基配列を含むことを特徴とする請求項１２４記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
塩基配列が、ＣＤ１５１をコードするイントロンおよびエキソンの両者を含むことを特徴とする請求項１２５記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
少なくともイントロンの１つが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１６，１８，２１，２３，２５，２７および２９から成るグループから選択された塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１２６記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
少なくともエキソンの１つが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６，および２８から成るグループから選択された塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１２６記載の単離されたＤＮＡ塩基配列。
ワクチンが、非サルＣＤ１５１により形質転換された非サル細胞系列において生成されるウイルスの子孫を含むことを特徴とする、ＰＲＲＳウイルスに対して有効な免疫を誘発するためのワクチン。
ＣＤ１５１が豚に起源を持つことを特徴とする請求項１２９記載のワクチン。
ＣＤ１５１が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１２９記載のワクチン。
ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に一塩基変異多形が与える影響を決定する方法であって、
少なくとも２つのＣＤ１５１ゲノム塩基配列を得るステップ、
塩基配列間の一塩基多形（ＳＮＰｓ，ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を比較するステップ、および
一塩基多形をＰＲＲＳウイルス感受性と相互に関係づけるステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
細胞のＣＤ１５１総量（ａｍｏｕｎｔ）を変化させるステップを含むことを特徴とする細胞中へのウイルスＲＮＡの侵入を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）方法。
ＲＮＡの侵入が、エンドサイトーシスに由来することを特徴とする請求項１３３記載の方法。
ウイルスＲＮＡが、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡであることを特徴とする請求項１３３記載の方法。
ＰＲＲＳウイルス感受性ファクター（ＰＲＲＳＶｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒｓ）を、個々の豚の間で比較する方法であって、該方法は、
少なくとも２匹の豚の遺伝子配列を得るステップ、
ＣＤ１５１遺伝子をコードする塩基配列（ＣＤ１５１ｅｎｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の量（ａｍｏｕｎｔ）を解析するステップ、および
ＣＤ１５１遺伝子をコードする塩基配列の量を比較するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
豚のＣＤ１５１の塩基配列を決定する方法であって、
一匹の豚からバイオプシー（生物学材料）を採取するステップであって、
該バイオプシーを耳ノッチ（ｅａｒｎｏｔｃｈ、耳の刻み目）もしくは尻尾スニップ（ｔａｉｌｓｎｉｐ、尻尾の切れはし）から採取するステップ、および、
ＣＤ１５１塩基配列を決定するために該バイオプシーについてＰＣＲを実施するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
塩基配列決定されたＣＤ１５１の配列を用いるステップ、および
発現量（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓ）をＰＲＲＳウイルスに対する感受性と相互に関連づけするステップ、
の両ステップを含むことを特徴とする請求項１３７記載の方法。