JP2005507262A - 高コルチゾール血症及びそれに関連する病変の遺伝子マーカーとしてのcbg遺伝子の用法 - Google Patents
高コルチゾール血症及びそれに関連する病変の遺伝子マーカーとしてのcbg遺伝子の用法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、高コルチゾール血症表現型と関連する多型マーカーを識別するための方法に関するものであり、その特徴は、Cbg遺伝子の全部または一部を含む幾つかの個体の核酸配列を比較すること、および、Cbg遺伝子またはそれに隣接する配列における突然変異を識別することを含むことである。本発明はまた、高コルチゾール血症表現型と関連する多型マーカーをも対象とするものであり、その高コルチゾール血症表現型を構成するのは、Cbg遺伝子の全部もしくは一部を含む核酸配列、または、好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列である。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、トランスコルチン(即ちCBG=コルチコステロイド結合グロブリン)をコードする遺伝子を、構成的高コルチゾール血症の遺伝子マーカーとして、および、その高コルチゾール血症に関連する病変の新しい治療標的として用いることに関するものである。本発明は、1)高コルチゾール血症を進行させる可能性がより低い牧畜動物の選定、2)高コルチゾール血症を進行させるおそれのある患者の遺伝子診断、3)構成的高コルチゾール血症に関連する病変の治療に応用されるものである。高コルチゾール血症を進行させるおそれのある個体を決定するための、トランスコルチンの遺伝子マーカーの識別方法と、遺伝子スクリーニング方法とを説明する。
【0002】
グルココルチコイドホルモン、すなわち、ヒトや豚のコルチゾール、齧歯類のコルチコステロンは、糖新生、脂質及びタンパク質の代謝、抗炎症反応、ならびに成長のような、数ある生物学的過程と関係するものである。グルココルチコイドはまた、ストレス反応の主要な構成要素でもある。ストレスに晒されると、コルチゾールが副腎から急速に放出され、それにより、行動反応に必要なエネルギーが供給される。この刺激をその個体が制御している場合には、コルチゾールのレベルは、負のフィードバックにより基底値に戻る。慢性ストレス状況のように、そうでない場合には、コルチゾールが高レベルで一定し、その生命体にとって、危険性が大きい。そういうわけで、コルチゾール、そして一般的にはHPA軸は、肥満(Rosmond et al., 1998)、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性(Sternberg and Gold, 1997)、老化(Lupien et al., 1998)、あるいは濫用薬剤による増感現象(Piazza and Le Moal, 1998)などの様々な病変に関係するものである。
【背景技術】
【0003】
HPA軸の働きが個体間で非常にばらつきがあることが観察されており、そのばらつきが、上記のような、病変に対する個体の脆弱性に影響している。このようなばらつきは、一つには遺伝的な原因から来るものであり、それは、ストレスに対するHPA軸の反応性と、その概日性の活性とに関する、双子を対象としたいくつもの研究で証明されている通りである(Meikle et al., 1988; Kirschbaum et al., 1992; Linkowski et al., 1993)。同様に、HPA軸の働きがマウスやラットの様々な系統間で(Armario et al., 1995; Marissal−Arvy et al., 1999)あるいは豚の品種間で(Desautes et al., 1999)様々に異なるということが明らかになっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
したがって、HPA軸の働きにこのようにばらつきがあることの基になっている遺伝子を識別することは、ヒトや動物の健康にとって非常に重要である。ヒトの場合には、そのHPA軸を調節する遺伝子とその軸の機能不全に関連する病変との間の関連性の研究が行われてきた。例えば、グルココルチコイドに対する受容器の多型は腹部の肥満に関連するものであることが認められた(Buemann et al., 1997)。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、まさしくこのような遺伝子を識別することに専心し、そのための手段として、(i)最初に仮説を立てることをせずに、動物モデルについて量的形質遺伝子座すなわちQTL(Quantitative Trait Loci)の遺伝子マッピングを用いるアプローチ(Moisan et al., 1996)と、(ii)HPA軸の働きにおける候補遺伝子の役割についての知識に基づいて行う「候補遺伝子」アプローチとを用いた(Marissal−Arvy et al., 2000)。
【0006】
このような二つの取り組み方を、トランスコルチンをコードする遺伝子について活用したのであり、本発明を導き出した作業は、同時に、その遺伝子のQTLとすでに知られた機能との分析に関するものでもあった。トランスコルチン即ちCBG(コルチコステロイド結合グロブリン)は、グルココルチコイドホルモンの血漿中結合タンパク質であり、そのタンパク質については、それがコルチゾールを運搬する上でどのような役割を果たすのか、そして、それがコルチゾールの生物学的利用能にどのような影響を与えるのかに関する研究を行った。
【0007】
本発明者はここで、コルチゾールの生成についてトランスコルチンがどのような役割を果たすのか、そして、豚のコルチゾール血症のばらつきにおいて、それがどのような関わり合いをもっているのかを明らかにした。
【0008】
そのような結果を得ることになったのは、豚のHPA軸の働きに影響を及ぼす遺伝子の研究について本発明者が行った作業によるものであり、欧州産のラージホワイトと中国産のメイシャンという二つの豚の品種の交配種について、QTL遺伝子マッピングを用いた。
【0009】
豚の血漿中コルチゾール濃度と豚の7番染色体の遺伝子座との間に強度の遺伝的関連が見いだされた(Bidanel et al., 2000)。ヒトゲノムとの比較マッピングにより明らかになったのは、トランスコルチンの遺伝子が、以下のような遺伝子分析によって規定された区間内にあるということである。
・豚のCbg遺伝子は(FISHによって、そして放射線ハイブリッドマッピングによって明らかになった)QTL領域の中に確かにある。
・同じF2個体群に関して(コルチゾールの代わりに)トランスコルチンの血漿中濃度について行った遺伝的関連の分析でも、7番染色体の遺伝子座との強度の関連性が明らかになっている。
・ラージホワイトとメイシャンという、親に当たる二つの豚の品種間で、CBG濃度が異なっている。
・興味深い突然変異がメイシャン豚のCbg遺伝子のコード領域内に見いだされた。
【0010】
それゆえ、Cbg遺伝子は、豚におけるこのようなQTLの「位置的候補」となる。
【0011】
このような遺伝的関連の分析結果によって、初めて明らかになるのが、トランスコルチンの分子変異体とコルチゾール生成との間の因果関係である。
【0012】
また、高コルチゾール血症のメイシャン豚もまた肥満しており、ラージホワイトに比べて成長の遅れが見られるのだが、それはコルチゾールレベルが高いということの結果である可能性が考えられる。このような仮説を考慮して、F2個体群につき、コルチゾールレベルと背中の脂肪の厚みとの間に正の相関関係が見いだされた。この関係は、デュロック×ラージホワイトのF2個体群において、尿中のコルチゾール、背中の脂肪、そして枝肉の中の脂肪のない肉の割合との間にも見いだされた(Mormede P. 公表されていない)。このような結果を踏まえて、改めて統計分析を行ったところ、豚のF2個体群(メイシャン×ラージホワイト)において、背中の脂肪の厚みと7番染色体の遺伝子座との間に遺伝的関連があることを明らかにすることができた。図5は、背中の脂肪の厚みと高コルチゾール血症のQTLとの間の遺伝的関連を示すものである。Cbg遺伝子は、7番染色体の1.35モルガンの位置にあり、その図で示された二番目のQTLの頂点のところにある。それゆえ、コルチゾール血症と脂肪の蓄積とは、トランスコルチンの遺伝子を含むその遺伝子座に向かって集まっている。それゆえ、メイシャン豚は、HPA軸に遺伝的ばらつきがあることの研究、ならびにその病理生理学的結果、特に肥満についての優れたモデルとなるものである。
【0013】
更に、改めて指摘する必要があるのは、マウスの場合、肥満に関連するゲノムの遺伝子座が、1995年にWardenによって明らかにされたということである(Warden et al., 1995)。マウスのゲノムについての実際のデータでは、CBGがこのQTLの信頼区間の頂点にあり、このモデルにおいて改めて良好な位置的候補となることを確認することができる。
【0014】
最後に、ヒトの場合には、CBG濃度と高インシュリン血症との間に逆の関係があることが、肥満の過程で報告されており、その一方で、糖尿病患者のCBGの濃度は高い(Fernandez−Real et al.,1999)(Fernandez−Real et al., 2000)。このような関係は、CBGの肝臓での生成に対するインシュリンの抑制効果によって説明が可能である(Crave et al., 1995)。
【0015】
ヒトのトランスコルチンの分子変異体についての説明は文献にあり(Van Baelen et al., 1982)(Smith et al., 1992)、そして二つの研究において、トランスコルチン遺伝子に突然変異のある患者は肥満している(Emptoz−Bonneton et al., 2000; Torpy et al, 2001)。
【0016】
様々なアプローチに基づいて種々の動物で採取したデータを総合すると、肥満の過程でのCBGの変化を、その病気の病理生理学と関係するコルチゾールの生物学的利用能の重要な因子として考えることが可能である。
【0017】
そのような結果が注目に値するのは、今日に至るまで、利用できる構成的コルチゾール血症のマーカーが一切なかったからである。そのようなマーカーがあれば、血液サンプルに基づき、しかも誕生時点から、ある個体のコルチゾール血症をつきとめることが可能になる。このコルチゾール血症はやがて、肥満に対する脆弱性、自己免疫反応及び炎症反応に対する脆弱性、成長の速度、老化、薬物嗜癖に影響していく。それゆえ、本発明は、トランスコルチン遺伝子の有利な対立遺伝子をもつ、豚のような牧畜動物の選定の分野において、ならびに、ヒトにおける、構成的高コルチゾール血症の素因、およびその結果として引き起こされる前述の病変の遺伝子診断のために、応用されるものである。最後に、本発明により、HPA軸の機能不全に関連するそのような病変を治療するのに役立つ物質をスクリーニングする新しい手段を活用することが可能になる。
【0018】
それゆえ、本発明はまず、高コルチゾール血症の表現型に関連する多型マーカーを識別する方法を対象とするものであり、その一環として、Cbg遺伝子の全部または一部を含む幾つかの個体の核酸配列を比較し、Cbg遺伝子またはそれに隣接する配列における突然変異を識別することを含む。
【0019】
ここで個体というのは、ヒトの被験者と同様に動物の被験体も指す。有利には、前記核酸配列はゲノムDNA配列であって、Cbg遺伝子の一部、または、好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列を含むものである。
【0020】
例えば、豚のCbg遺伝子のcDNA配列とその遺伝子に隣接する5’配列とは、添付の配列表において、SEQ ID NO.1、およびSEQ ID NO.3という番号でそれぞれ示されており、それらを高コルチゾール血症のマーカーを探るために利用することが可能である。
【0021】
そのようなマーカーは、Cbg遺伝子の一部またはその脇にある配列を含むゲノムクローンに基づいて入手可能であり、それらクローンも、「材料と方法」と題した節の4)のところで説明するようなCbg遺伝子に特異的なプローブでDNAバンクをスクリーニングすることにより入手されるものである。そのような多型マーカーは例えば、マイクロサテライト、挿入/欠失多型、制限断片長多型(RFLP)あるいは単一ヌクレオチド多型(SNP)が考えられる。
【0022】
多型遺伝子座をカバーするDNA断片の配列決定を行うことにより、一つの個体のゲノムDNA全体から前記断片の特異的増幅が可能なヌクレオチドプライマーを規定することができる。
【0023】
それゆえ、本発明はまた、高コルチゾール血症表現型に関連する多型マーカーをも対象とするものであり、その多型マーカーを構成するのは、Cbg遺伝子または好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列を含む核酸配列の全部もしくは一部である。
【0024】
本発明はまた、上記のマーカーの脇にあるヌクレオチドプライマーに関するものでもある。そのようなプライマーには、上記で規定されたマーカーの脇にある、Cbg遺伝子配列の5個から50個、好適には10個から30個の連続するヌクレオチド、または好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列が含まれている。
【0025】
本発明はまた、多型マーカーを用いて、高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための、遺伝子スクリーニング方法に関するものでもある。そのような方法には下記のものが含まれる:
i)血液、組織あるいは精液から、ある個体のゲノムDNAを精製するのだが、一般的には、従来の方法による採血で得られた白血球からDNAを精製する、
ii)つぎに、前記DNAに基づき、上記で規定されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(すなわちPCR)によって、多型マーカーを含む遺伝子座を増幅する、
iii)そして、増幅した前記DNAのなかで、前記多型マーカーの一つまたは複数の対立遺伝子を検出する。
【0026】
マーカーの多型のタイプによって、つぎのような様々な技法の使用が考えられる。
・長多型(マイクロサテライト、挿入/欠失、RFLP)については、様々な個体の増幅されたDNAのなかにある対立遺伝子を従来の電気泳動法により検出するのであるが、その際、RFLPのためには、先に酵素による消化を行うのが有利である。
・点突然変異、SNP型の多型については、使用する方法には例えば、SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)(Orita et al, 1989 PNAS 86: 2766−2770)、対立遺伝子特異的PCR(Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17, 2427−2448)、あるいは、増幅したDNAを直接に配列決定することが含まれる。
【0027】
個体でマーカーの対立遺伝子を検出すると、その個体が高コルチゾール血症を進行させるおそれがより大きいかどうかを予測することができる。Cbg遺伝子の中のそのような点突然変異の一例を添付図4に示した。
【0028】
本発明はまた、高コルチゾール血症を進行させる確率が高く、肥満率の高い牧畜動物、特に豚を選択するため、あるいは選択を重ねていくために、多型マーカーを用いて、高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための遺伝子スクリーニング方法を使用することにも関するものである。
【0029】
本出願人の努力により、F1及びF0豚のCbg遺伝子のエクソン配列に基づき、以下のような多型を検出することができた。
・SEQ ID NO.1の部位133に対応する、G→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位134に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位539に対応する、T→Cの転位
・SEQ ID NO.1の部位620に対応する、A→Gの転位
・SEQ ID NO.1の部位626に対応する、G→Aの転位
・SEQ ID NO.1の部位859に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位866に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位882に対応する、A→Gの転位
・SEQ ID NO.1の部位890に対応する、G→Cの転位
・SEQ ID NO.1の部位960に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位1008に対応する、G→Aの転位
・SEQ ID NO.6の部位42に対応する、T→Cの転位
・SEQ ID NO.6の部位49に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.7の部位75に対応する、C→Tの転位
【0030】
添付配列表の中の配列SEQ ID NO.6及び7はそれぞれ、豚のCbg遺伝子のイントロンCの5’部分及び3’部分に対応する。したがって、本発明は、多型マーカーを用いて高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための遺伝子スクリーニング方法を使用することに関するものであり、ここで、上記に規定した多型マーカーの対立遺伝子は、上記に説明した突然変異のうちの一つを有するものである。
【0031】
本発明はまた、DNAサンプルに基づいて高コルチゾール血症の遺伝子マーカーのテストを行うことができるようにする、上記の方法を活用するためのキットを提供することをも目指している。そのようなキットに含まれるのは、前記にて規定したような一対のヌクレオチドプライマーであり、それは、市販されているものから入手可能なPCRの増幅試薬とともに用いられることになるものである。そのキットにはまた、反応のネガティブコントロール及びポジティブコントロール、およびマーカーも含まれることがありうる。
【0032】
本発明はまた、高コルチゾール血症を軽減する治療を目的として、Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成を変化させることのできる物質を識別するための方法にも関するものである。事実、CBGのコルチゾールとの結合及び/またはコルチコステロンとの結合を変化させることのできる化合物をin vitroでスクリーニングするために、野生型の、または突然変異型の、CBGタンパク質を用いることが可能である。したがって本発明は、CBGの機能を変化させることのできる物質の識別方法を対象としており、それは、適切なあらゆる技法を用いて、その化合物と(野生型または突然変異型の)CBGとの結合を評価するということである。それは、例えば「High throughput screening: The discovery of Bioactive Substances」, JP Delvin (Ed), Marcel Dekker Inc. New York (1997)という著書におけるように、文献に記載された、大規模なスクリーニング方法を用いる技法に関するものとなることも考えられる。
【0033】
CBGと活性化合物との間の結合活性を、例えば、試験対象化合物の結合力と親和力とを、それらが放射性コルチゾールを移動させる能力によって評価する、放射標識結合テストで決定することも可能である。CBGの供給源は、例えばCbg遺伝子のcDNAを含むベクターを培養細胞の中にトランスフェクトすることにより得られる。タンパク質が分泌されて、その培地で、放射標識結合テストを実施することが可能である。コルチゾールと効果的に競合する化合物が選定される。
【0034】
本発明はまた、Cbg遺伝子を過剰発現する動物またはその遺伝子の突然変異体を発現する動物を、CBGがHPA軸に及ぼす作用の仕組みを理解するため、そして/または、CBGの発現を変化させることのできる化合物をスクリーニングするために、研究モデルとして用いることにも関するものである。更に、本発明は遺伝子導入動物に関するものであり、その導入遺伝子に含まれる核酸配列は、Cbg遺伝子または好適には100kb以下の距離で隣接する3’および5’配列に含まれている。好適には、選択された配列は、CBGタンパク質と同一または相同のポリペプチドをコードするものである。
【0035】
例えば、そのような遺伝子導入動物は、この技術について従来から用いられているように、Cbg遺伝子をコードする配列(例えばSEQ ID No.1)と標的組織(この場合は肝臓)でそれを過剰発現できるような調節配列とを含む核酸を、その動物(例えばマウス、ラット、豚)の胚の中にマイクロインジェクトすることで得られる。
【0036】
HPA軸、ならびに、肥満、炎症反応及び自己免疫反応、特に認知機能における老化、薬物嗜癖に関連する病変に対してCBGが作用する仕組みを理解するための技術的モデルとして、これらの動物を使用することができる。
【0037】
CBGの機能を変化させることのできる化合物をスクリーニングするために、これらの動物を使用することができる。
【0038】
化合物のスクリーニングは、その動物にテスト対象の化合物を投与し、その後で、従来の方法により、その動物の中でのHPA機能の変化を測定することによって行うことができる。
【0039】
本発明はまた、高コルチゾール血症を軽減する治療を目的として、したがって、肥満、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性、あるいは更に、老化の病変あるいは薬物濫用による増感現象などの、高コルチゾール血症に関連する病変の治療をするために、Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成及び/またはコルチゾールとの結合を変化させることのできる化合物をスクリーニングする方法にも関するものである。その方法には、例えばHepG2細胞のような培養細胞に基づいてCBGタンパク質を生成すること、そして、そのタンパク質の生成について前記化合物をテストすることが含まれている。有利には、そのスクリーニングは大規模なスクリーニングである。
【0040】
本発明はまた、Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成及び/またはコルチゾールとの結合を変化させることのできる化合物をスクリーニングする方法にも関するものであり、本発明の特徴は、既に説明したような遺伝子導入動物について、上記のスクリーニング方法によってin vitroで識別した化合物をin vivoでスクリーニングする過程が含まれることである。
【0041】
本発明によって遺伝子マーカーを識別することにより、構成的高コルチゾール血症を評価し、したがって、上記に示した病変、特に肥満に対する脆弱性を評価することを目的とした、CBGのための遺伝子検査を実施するための新しい手段を活用することが可能になる。そのような検査はまた、構成的高コルチゾール血症を呈する牧畜動物の選択を重ねていくことにも役立つ。
【0042】
例えば、そのような方法には、Cbg遺伝子の全部または一部を含むサンプルのDNA領域をPCRによって増幅し、つぎにその領域を分析して、高コルチゾール血症の原因となり、かつ既に説明した方法によって識別済みの可能性のある、少なくとも一つの突然変異の存在を識別することが含まれる。
【0043】
それゆえ、本発明はまた、被験体、特にヒトの高コルチゾール血症あるいは高コルチゾール血症の素因を診断するために上記の方法を用いることにも関係しているものであって、この方法を用いることによって、HPA軸の機能不全、ならびに、肥満、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性、あるいは更に(特に認知機能に関わる)老化の病変、あるいは濫用薬剤による増感現象などの、この軸に関連する病気または病気の素因を識別することができるようになるものである。
【0044】
最後に本発明は、CBGのアゴニストまたはアンタゴニストとなり、したがってCBGのレベルまたはコルチゾールに対するその親和性に直接作用することができる化合物を識別し、それにより、間接的にコルチコステロイドのレベルを下げることに関するものである。
【0045】
本発明のほかの利点と特徴とは、豚のCbg遺伝子における突然変異の識別と、CBGの分子変異体とコルチゾール生成との間を因果関係で結びつける遺伝的関連の分析とに関する以下の例で明らかになっていく。その際に、次の添付図面を参照していくことになる。
・図1では、放射線ハイブリッドマッピングにより豚のCbg遺伝子の位置を特定している。Aでは、血漿コルチゾールの濃度についてSscr7に沿った最大尤度比の推移をセンチメートル単位で示している。Bでは、豚の7番染色体のマッピングを放射線ハイブリッドにより行い、その概況を示している。距離の単位はcR7000である。
・図2では、豚のCbg遺伝子の位置をFISH法により7q26に特定している。
・図3では、81頭のF2豚について血漿中のCBG濃度の遺伝的な関連の分析を行っている。
・図4では、Cbgのゲノム配列における突然変異の検出を行っている。矢印が示すヌクレオチドについては、F1豚#9110045とその母に当たるメイシャンとが異型接合体(T/G)である一方で、その父に当たるLWは同型接合体(G/G)である。
【実施例】
【0046】
I−材料と方法
1)放射線ハイブリッドパネルマッピング
IMpRHパネルについて別々の二度の反応を起こさせる(Yerle et al., 1998)。PCR産物の分析をエチジウムブロマイドで染色した後、緩衝剤1×TBE中のアガロースゲル2%で行った。調和を欠く結果が得られたクローンについて三度目の増幅を行った。増幅結果のベクターをIMpRHバンクに登録した(Milan et al. 2000)。
【0047】
2)FISH法によるマッピング
末梢血リンパ球の培養から分裂中期の染色体を入手した。染色体識別のため、ハイブリダイゼーション前に、G−T−G技法を用いて分裂中期のGバンドに標識を行い、そして分裂中期の最盛期の画像を前述したビデオ・プリンターで撮影した(Yerle et al., 1992)。
【0048】
in situハイブリダイゼーション法の実験をYerleらの方法に従って行った(Yerle et al., 1992)。その際に、幾つかの修正を加えた(Sun et al., 1999)。
【0049】
3)遺伝的関連の分析
正規分布に従ってデータが分布しているということをまず検証した。四つの形質は対数正規分布を呈し、そのデータを分析に先立って対数スコアに変換した。QTLマッピングを、複数の部位で最大尤度を求める技法によって、実施した。考慮の対象となるマーカーのセットと関連するQTLが有るか(H1)無いか(H0)の仮説の下での尤度比として規定された統計的テストを、染色体に沿った各位置(各センチメートル)で計算した。そこで用いた7番染色体のマーカーの地図を、1100を越える豚の遺伝子型に基づいてBidanelらの方法(2000)により計算した。仮説H1に従って、各父母について遺伝子を置換する効果を伴ったQTLをデータに適合させた。確率計算の方法についての他の詳細は、Bidanelらの文献(2000)に見いだすことが可能である。置換による平均的効果の推定値の計算を、各位置において、最も高い確率で行った。
【0050】
染色体に沿った有意水準を、微分モデルと記録の正規分布とを前提にして、データをシミュレーションして経験的に決定した。各形質について合計50000回のシミュレーションを行った。ゲノム全体の確率Pgの検定に対応する染色体試験の有意水準Pcを、Bonferroniの修正を用いて求めた、つまり、Pg=1−(1−Pc)19の解として求めたところ、有意なレベル(Pg=0.05)と非常に有意なレベルとについて、それぞれPc=0.0027と0.000054となった(Knott et al., 1998)。
【0051】
4)BACのDNAバンクのスクリーニング
BACクローンを、前述したようにBACクローンの豚バンクの三次元PCRスクリーニングによって単離した(Rogel−Gaillard et al., 1999)。豚のCBG配列を含むBACクローン383F4を、以下のようなヒトCBGのエクソン2の配列に基づいて確立した一対のプライマーを用いてクローニングした。
FW:ACACCTGTCTTCTCTGGCTG(SEQ ID NO.4)
REV:ACAGGCTGAAGGCAAAGTC(SEQ ID NO.5)
【0052】
各dNTPを0.2mM、MgCl2を1.5mM;各プライマーを8pM、TaqDNAポリメラーゼを2U、そして反応緩衝液を含む、20μlの反応総量の中で、94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で30秒を35回繰り返して、PCRを実施した(Perkin−Elmer, Roche)。
【0053】
5)配列決定
配列決定の反応を、自動シーケンサーPE970で「Prism AmpliTaq FS diChloroRhodamine Dye Terminators」(Perkin Elmer)というキットで行った。
【0054】
CBGの結合力とそのコルチゾールへの親和性とを、Concavalin A−セファロースカラムを用いて、固体相への固定試験により4℃で測定した(Pugeat et al., 1984)。結合平衡定数(Ka)とコルチゾールに対するCBGの容量とをScatchard解析により計算したが、その際に、「bound」をゲルの上に吸収された糖タンパク質に特異的に固定されたコルチゾールの量として、そして「free」を水性相の中でのコルチゾールの濃度として用いた。
【0055】
7)統計
Statisticaというソフトウエアの第5版を用いて、相関行列を求め、スチューデントのt検定を行った。
【0056】
II−結果
1)比較マッピングにより、Cbg遺伝子を高コルチゾール血症のQTLの候補として提案することができる。
Goureauら(2000)は、ヒトと豚の染色体断片の対応を、双方向性の染色体着色の分析を用いて説明した。脇にマーカーS0101とSw764とがあるコルチゾールのQTLの位置を豚の7q2.4−7q2.6の領域に特定した。ヒトのオーソロガス領域(Hsap14q)に位置を特定した遺伝子の中で、Hsap14q32.1に位置が特定されたCBGをコードする遺伝子(Billingsley et al., 1993)が注意を引いた。事実、血漿のコルチゾールの90%は、肝臓が合成する糖タンパク質であるCBGに固定される。遊離しているコルチゾールだけが活性なので、CBGの主要な役割はコルチゾールの生物学的利用能にある。そういうわけで、Cbg遺伝子は、コルチゾールのレベルに関連するそのQTLのための機能的候補として有力である。
【0057】
Cbg遺伝子は、ヒト、サル、羊およびマウスにおいてクローニングされていたものだったので(Hammond et al., 1987; Hammond et al., 1994; Berdusco et al., 1993; Orava et al., 1994)、入手可能な様々な配列をMultalinというプログラムを使ってアラインメントし(Corpet,1988)、豚のCbgのPCR断片を入手するために、エクソン2に基づいて、オリゴヌクレオチドコンセンサスプライマーを用意することが可能であった。PCR断片の配列が他の種のCbg遺伝子と高い相同性があることを検証した後、放射線ハイブリッドパネルを使って豚のCbg遺伝子マッピングをするため、それらプライマーを用いた(Yerle et al., 1988)。このとき、図1に示されるように、豚のCbg遺伝子は、コルチゾールのQTLのように、マーカーS0101とSW764との間にあることがわかった。
【0058】
この染色体での位置決定は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法により確認した。まず、豚ゲノムのBACバンクを、豚のCbg遺伝子のエクソン2を増幅するプライマーを使ってPCRスクリーニングした。BAC383F4と名付けられ、豚のCbg遺伝子のゲノム配列全体を含む、150kbのクローンが得られた。このBACクローンを、分裂中期の広がった染色体に対するFISH法によって豚のCbg遺伝子のマッピングを行うためのプローブとして用い、そして、図2に示されるように、豚のCbg遺伝子が染色体7q26にあることが確認された。
【0059】
2)CBGの結合力は、高コルチゾール血症のQTLの脇にあるマーカーに遺伝的に関連している。
CBGのコルチゾールへの結合力を、初代の交配に基づく、全てがF1豚#911045の子孫である81頭のF2豚の血漿中で測定した。予想した通り、その測定値とコルチゾールのレベルとの間に強い相関関係が認められた(r=0.57)。その新しい表現型の測定値とマーカーSsc7との間の遺伝的関連を算定した。図3が示すように、確かにコルチゾールのQTLと同じ領域の中に強い遺伝的関連が検出された。確率の最大値は、CBGの値と共に、上回ってさえいて(p<5×10-4)、そのことがそのQTLへのCbg遺伝子のかかわり合いを更に強固なものにしている。
【0060】
3)CBGの結合力はLW豚とMS豚との間で異なる。
タンパク質に関して、コルチゾールへの結合力とCBGの親和定数とを、放射標識結合テストにより、LWとメイシャンとの間で比較した。2種の豚の間で親和性には何の違いも見いだせなかった。しかしながら、以下の表1が示すように、最大結合力は、LW豚に対して、メイシャン豚が平均して1.6倍も上回っていた(p<0.001)。
【0061】
【表1】
【0062】
4)Cbg遺伝子における突然変異の識別
BACクローン383F4により、以前にはクローニングされたことのないCbg遺伝子のゲノム構成と配列の識別が可能になった。他の種におけるのと同様に、豚のCbg遺伝子の中に5個のエクソンがあり、エクソン2の中にAUGコドンがある。アミノ酸に関しては、本発明者は、豚のCBGタンパク質と、ヒトおよびヒツジのCBGタンパク質との間に、それぞれ66%と80%の相同性を見いだした。
【0063】
突然変異を探るために、父がLWで母がメイシャンであるF1個体の、エクソンとプロモーター領域の900bpとの配列を決定した。このF1豚(#911045)はQTLに対して異型接合体になるはずであったと考えられたが、それは、QTLの脇にあるマーカーS0101のどちらかの対立遺伝子を受け取った子の間で、コルチゾールの平均レベルに有意な差があったからである。したがって、その母メイシャン豚は問題の突然変異のところで父LWとは違う対立遺伝子を少なくとも一つもつことになるはずである。このタイプの突然変異は、F1豚#911045のエクソン2の中で識別された。開始コドンATGから+15の位置で、この個体は一方の対立遺伝子について点突然変異G→Tをもつ異型接合体となっている(図4)。このG→T置換は、コドン15に対応しており、CBGタンパク質のシグナルペプチドの中で一つのセリンを一つのイソロイシンに変える。PCRによる増幅テストを以下のパラメーターで最適化した。
センスプライマー:5’−CCCTGTATGCCTGTCTCCTC−3’
アンチセンスプライマー:5’−CCTGCTCCAAGAACAAGTCC−3’
PCRの条件:1×PCR緩衝液(Promega)、MgCl2 1.5mM、dNTP 100μM、各プライマーを10pmol、Taqポリメラーゼ 0.4U(Promega)。
サーマルサイクラーのプログラム:
1) 96℃:5分
2) 92℃:30秒
3) 60℃:1分
4) 72℃:30秒
5) 2)3)及び4)の手順を34回
6) 72℃ 2分
【0064】
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【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】放射線ハイブリッドマッピングの結果を示した図。
【図2】豚のCbg遺伝子の位置を示した写真。
【図3】豚の血漿中CBG濃度の遺伝的な関連を示したグラフ。
【図4】Cbg遺伝子における点突然変異を示した図。
【図5】背中の脂肪の厚みと高コルチゾール血症のQTLとの間の遺伝的関連を示したグラフ。
【0001】
本発明は、トランスコルチン(即ちCBG=コルチコステロイド結合グロブリン)をコードする遺伝子を、構成的高コルチゾール血症の遺伝子マーカーとして、および、その高コルチゾール血症に関連する病変の新しい治療標的として用いることに関するものである。本発明は、1)高コルチゾール血症を進行させる可能性がより低い牧畜動物の選定、2)高コルチゾール血症を進行させるおそれのある患者の遺伝子診断、3)構成的高コルチゾール血症に関連する病変の治療に応用されるものである。高コルチゾール血症を進行させるおそれのある個体を決定するための、トランスコルチンの遺伝子マーカーの識別方法と、遺伝子スクリーニング方法とを説明する。
【0002】
グルココルチコイドホルモン、すなわち、ヒトや豚のコルチゾール、齧歯類のコルチコステロンは、糖新生、脂質及びタンパク質の代謝、抗炎症反応、ならびに成長のような、数ある生物学的過程と関係するものである。グルココルチコイドはまた、ストレス反応の主要な構成要素でもある。ストレスに晒されると、コルチゾールが副腎から急速に放出され、それにより、行動反応に必要なエネルギーが供給される。この刺激をその個体が制御している場合には、コルチゾールのレベルは、負のフィードバックにより基底値に戻る。慢性ストレス状況のように、そうでない場合には、コルチゾールが高レベルで一定し、その生命体にとって、危険性が大きい。そういうわけで、コルチゾール、そして一般的にはHPA軸は、肥満(Rosmond et al., 1998)、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性(Sternberg and Gold, 1997)、老化(Lupien et al., 1998)、あるいは濫用薬剤による増感現象(Piazza and Le Moal, 1998)などの様々な病変に関係するものである。
【背景技術】
【0003】
HPA軸の働きが個体間で非常にばらつきがあることが観察されており、そのばらつきが、上記のような、病変に対する個体の脆弱性に影響している。このようなばらつきは、一つには遺伝的な原因から来るものであり、それは、ストレスに対するHPA軸の反応性と、その概日性の活性とに関する、双子を対象としたいくつもの研究で証明されている通りである(Meikle et al., 1988; Kirschbaum et al., 1992; Linkowski et al., 1993)。同様に、HPA軸の働きがマウスやラットの様々な系統間で(Armario et al., 1995; Marissal−Arvy et al., 1999)あるいは豚の品種間で(Desautes et al., 1999)様々に異なるということが明らかになっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
したがって、HPA軸の働きにこのようにばらつきがあることの基になっている遺伝子を識別することは、ヒトや動物の健康にとって非常に重要である。ヒトの場合には、そのHPA軸を調節する遺伝子とその軸の機能不全に関連する病変との間の関連性の研究が行われてきた。例えば、グルココルチコイドに対する受容器の多型は腹部の肥満に関連するものであることが認められた(Buemann et al., 1997)。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、まさしくこのような遺伝子を識別することに専心し、そのための手段として、(i)最初に仮説を立てることをせずに、動物モデルについて量的形質遺伝子座すなわちQTL(Quantitative Trait Loci)の遺伝子マッピングを用いるアプローチ(Moisan et al., 1996)と、(ii)HPA軸の働きにおける候補遺伝子の役割についての知識に基づいて行う「候補遺伝子」アプローチとを用いた(Marissal−Arvy et al., 2000)。
【0006】
このような二つの取り組み方を、トランスコルチンをコードする遺伝子について活用したのであり、本発明を導き出した作業は、同時に、その遺伝子のQTLとすでに知られた機能との分析に関するものでもあった。トランスコルチン即ちCBG(コルチコステロイド結合グロブリン)は、グルココルチコイドホルモンの血漿中結合タンパク質であり、そのタンパク質については、それがコルチゾールを運搬する上でどのような役割を果たすのか、そして、それがコルチゾールの生物学的利用能にどのような影響を与えるのかに関する研究を行った。
【0007】
本発明者はここで、コルチゾールの生成についてトランスコルチンがどのような役割を果たすのか、そして、豚のコルチゾール血症のばらつきにおいて、それがどのような関わり合いをもっているのかを明らかにした。
【0008】
そのような結果を得ることになったのは、豚のHPA軸の働きに影響を及ぼす遺伝子の研究について本発明者が行った作業によるものであり、欧州産のラージホワイトと中国産のメイシャンという二つの豚の品種の交配種について、QTL遺伝子マッピングを用いた。
【0009】
豚の血漿中コルチゾール濃度と豚の7番染色体の遺伝子座との間に強度の遺伝的関連が見いだされた(Bidanel et al., 2000)。ヒトゲノムとの比較マッピングにより明らかになったのは、トランスコルチンの遺伝子が、以下のような遺伝子分析によって規定された区間内にあるということである。
・豚のCbg遺伝子は(FISHによって、そして放射線ハイブリッドマッピングによって明らかになった)QTL領域の中に確かにある。
・同じF2個体群に関して(コルチゾールの代わりに)トランスコルチンの血漿中濃度について行った遺伝的関連の分析でも、7番染色体の遺伝子座との強度の関連性が明らかになっている。
・ラージホワイトとメイシャンという、親に当たる二つの豚の品種間で、CBG濃度が異なっている。
・興味深い突然変異がメイシャン豚のCbg遺伝子のコード領域内に見いだされた。
【0010】
それゆえ、Cbg遺伝子は、豚におけるこのようなQTLの「位置的候補」となる。
【0011】
このような遺伝的関連の分析結果によって、初めて明らかになるのが、トランスコルチンの分子変異体とコルチゾール生成との間の因果関係である。
【0012】
また、高コルチゾール血症のメイシャン豚もまた肥満しており、ラージホワイトに比べて成長の遅れが見られるのだが、それはコルチゾールレベルが高いということの結果である可能性が考えられる。このような仮説を考慮して、F2個体群につき、コルチゾールレベルと背中の脂肪の厚みとの間に正の相関関係が見いだされた。この関係は、デュロック×ラージホワイトのF2個体群において、尿中のコルチゾール、背中の脂肪、そして枝肉の中の脂肪のない肉の割合との間にも見いだされた(Mormede P. 公表されていない)。このような結果を踏まえて、改めて統計分析を行ったところ、豚のF2個体群(メイシャン×ラージホワイト)において、背中の脂肪の厚みと7番染色体の遺伝子座との間に遺伝的関連があることを明らかにすることができた。図5は、背中の脂肪の厚みと高コルチゾール血症のQTLとの間の遺伝的関連を示すものである。Cbg遺伝子は、7番染色体の1.35モルガンの位置にあり、その図で示された二番目のQTLの頂点のところにある。それゆえ、コルチゾール血症と脂肪の蓄積とは、トランスコルチンの遺伝子を含むその遺伝子座に向かって集まっている。それゆえ、メイシャン豚は、HPA軸に遺伝的ばらつきがあることの研究、ならびにその病理生理学的結果、特に肥満についての優れたモデルとなるものである。
【0013】
更に、改めて指摘する必要があるのは、マウスの場合、肥満に関連するゲノムの遺伝子座が、1995年にWardenによって明らかにされたということである(Warden et al., 1995)。マウスのゲノムについての実際のデータでは、CBGがこのQTLの信頼区間の頂点にあり、このモデルにおいて改めて良好な位置的候補となることを確認することができる。
【0014】
最後に、ヒトの場合には、CBG濃度と高インシュリン血症との間に逆の関係があることが、肥満の過程で報告されており、その一方で、糖尿病患者のCBGの濃度は高い(Fernandez−Real et al.,1999)(Fernandez−Real et al., 2000)。このような関係は、CBGの肝臓での生成に対するインシュリンの抑制効果によって説明が可能である(Crave et al., 1995)。
【0015】
ヒトのトランスコルチンの分子変異体についての説明は文献にあり(Van Baelen et al., 1982)(Smith et al., 1992)、そして二つの研究において、トランスコルチン遺伝子に突然変異のある患者は肥満している(Emptoz−Bonneton et al., 2000; Torpy et al, 2001)。
【0016】
様々なアプローチに基づいて種々の動物で採取したデータを総合すると、肥満の過程でのCBGの変化を、その病気の病理生理学と関係するコルチゾールの生物学的利用能の重要な因子として考えることが可能である。
【0017】
そのような結果が注目に値するのは、今日に至るまで、利用できる構成的コルチゾール血症のマーカーが一切なかったからである。そのようなマーカーがあれば、血液サンプルに基づき、しかも誕生時点から、ある個体のコルチゾール血症をつきとめることが可能になる。このコルチゾール血症はやがて、肥満に対する脆弱性、自己免疫反応及び炎症反応に対する脆弱性、成長の速度、老化、薬物嗜癖に影響していく。それゆえ、本発明は、トランスコルチン遺伝子の有利な対立遺伝子をもつ、豚のような牧畜動物の選定の分野において、ならびに、ヒトにおける、構成的高コルチゾール血症の素因、およびその結果として引き起こされる前述の病変の遺伝子診断のために、応用されるものである。最後に、本発明により、HPA軸の機能不全に関連するそのような病変を治療するのに役立つ物質をスクリーニングする新しい手段を活用することが可能になる。
【0018】
それゆえ、本発明はまず、高コルチゾール血症の表現型に関連する多型マーカーを識別する方法を対象とするものであり、その一環として、Cbg遺伝子の全部または一部を含む幾つかの個体の核酸配列を比較し、Cbg遺伝子またはそれに隣接する配列における突然変異を識別することを含む。
【0019】
ここで個体というのは、ヒトの被験者と同様に動物の被験体も指す。有利には、前記核酸配列はゲノムDNA配列であって、Cbg遺伝子の一部、または、好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列を含むものである。
【0020】
例えば、豚のCbg遺伝子のcDNA配列とその遺伝子に隣接する5’配列とは、添付の配列表において、SEQ ID NO.1、およびSEQ ID NO.3という番号でそれぞれ示されており、それらを高コルチゾール血症のマーカーを探るために利用することが可能である。
【0021】
そのようなマーカーは、Cbg遺伝子の一部またはその脇にある配列を含むゲノムクローンに基づいて入手可能であり、それらクローンも、「材料と方法」と題した節の4)のところで説明するようなCbg遺伝子に特異的なプローブでDNAバンクをスクリーニングすることにより入手されるものである。そのような多型マーカーは例えば、マイクロサテライト、挿入/欠失多型、制限断片長多型(RFLP)あるいは単一ヌクレオチド多型(SNP)が考えられる。
【0022】
多型遺伝子座をカバーするDNA断片の配列決定を行うことにより、一つの個体のゲノムDNA全体から前記断片の特異的増幅が可能なヌクレオチドプライマーを規定することができる。
【0023】
それゆえ、本発明はまた、高コルチゾール血症表現型に関連する多型マーカーをも対象とするものであり、その多型マーカーを構成するのは、Cbg遺伝子または好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列を含む核酸配列の全部もしくは一部である。
【0024】
本発明はまた、上記のマーカーの脇にあるヌクレオチドプライマーに関するものでもある。そのようなプライマーには、上記で規定されたマーカーの脇にある、Cbg遺伝子配列の5個から50個、好適には10個から30個の連続するヌクレオチド、または好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列が含まれている。
【0025】
本発明はまた、多型マーカーを用いて、高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための、遺伝子スクリーニング方法に関するものでもある。そのような方法には下記のものが含まれる:
i)血液、組織あるいは精液から、ある個体のゲノムDNAを精製するのだが、一般的には、従来の方法による採血で得られた白血球からDNAを精製する、
ii)つぎに、前記DNAに基づき、上記で規定されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(すなわちPCR)によって、多型マーカーを含む遺伝子座を増幅する、
iii)そして、増幅した前記DNAのなかで、前記多型マーカーの一つまたは複数の対立遺伝子を検出する。
【0026】
マーカーの多型のタイプによって、つぎのような様々な技法の使用が考えられる。
・長多型(マイクロサテライト、挿入/欠失、RFLP)については、様々な個体の増幅されたDNAのなかにある対立遺伝子を従来の電気泳動法により検出するのであるが、その際、RFLPのためには、先に酵素による消化を行うのが有利である。
・点突然変異、SNP型の多型については、使用する方法には例えば、SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)(Orita et al, 1989 PNAS 86: 2766−2770)、対立遺伝子特異的PCR(Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17, 2427−2448)、あるいは、増幅したDNAを直接に配列決定することが含まれる。
【0027】
個体でマーカーの対立遺伝子を検出すると、その個体が高コルチゾール血症を進行させるおそれがより大きいかどうかを予測することができる。Cbg遺伝子の中のそのような点突然変異の一例を添付図4に示した。
【0028】
本発明はまた、高コルチゾール血症を進行させる確率が高く、肥満率の高い牧畜動物、特に豚を選択するため、あるいは選択を重ねていくために、多型マーカーを用いて、高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための遺伝子スクリーニング方法を使用することにも関するものである。
【0029】
本出願人の努力により、F1及びF0豚のCbg遺伝子のエクソン配列に基づき、以下のような多型を検出することができた。
・SEQ ID NO.1の部位133に対応する、G→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位134に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位539に対応する、T→Cの転位
・SEQ ID NO.1の部位620に対応する、A→Gの転位
・SEQ ID NO.1の部位626に対応する、G→Aの転位
・SEQ ID NO.1の部位859に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位866に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位882に対応する、A→Gの転位
・SEQ ID NO.1の部位890に対応する、G→Cの転位
・SEQ ID NO.1の部位960に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位1008に対応する、G→Aの転位
・SEQ ID NO.6の部位42に対応する、T→Cの転位
・SEQ ID NO.6の部位49に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.7の部位75に対応する、C→Tの転位
【0030】
添付配列表の中の配列SEQ ID NO.6及び7はそれぞれ、豚のCbg遺伝子のイントロンCの5’部分及び3’部分に対応する。したがって、本発明は、多型マーカーを用いて高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための遺伝子スクリーニング方法を使用することに関するものであり、ここで、上記に規定した多型マーカーの対立遺伝子は、上記に説明した突然変異のうちの一つを有するものである。
【0031】
本発明はまた、DNAサンプルに基づいて高コルチゾール血症の遺伝子マーカーのテストを行うことができるようにする、上記の方法を活用するためのキットを提供することをも目指している。そのようなキットに含まれるのは、前記にて規定したような一対のヌクレオチドプライマーであり、それは、市販されているものから入手可能なPCRの増幅試薬とともに用いられることになるものである。そのキットにはまた、反応のネガティブコントロール及びポジティブコントロール、およびマーカーも含まれることがありうる。
【0032】
本発明はまた、高コルチゾール血症を軽減する治療を目的として、Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成を変化させることのできる物質を識別するための方法にも関するものである。事実、CBGのコルチゾールとの結合及び/またはコルチコステロンとの結合を変化させることのできる化合物をin vitroでスクリーニングするために、野生型の、または突然変異型の、CBGタンパク質を用いることが可能である。したがって本発明は、CBGの機能を変化させることのできる物質の識別方法を対象としており、それは、適切なあらゆる技法を用いて、その化合物と(野生型または突然変異型の)CBGとの結合を評価するということである。それは、例えば「High throughput screening: The discovery of Bioactive Substances」, JP Delvin (Ed), Marcel Dekker Inc. New York (1997)という著書におけるように、文献に記載された、大規模なスクリーニング方法を用いる技法に関するものとなることも考えられる。
【0033】
CBGと活性化合物との間の結合活性を、例えば、試験対象化合物の結合力と親和力とを、それらが放射性コルチゾールを移動させる能力によって評価する、放射標識結合テストで決定することも可能である。CBGの供給源は、例えばCbg遺伝子のcDNAを含むベクターを培養細胞の中にトランスフェクトすることにより得られる。タンパク質が分泌されて、その培地で、放射標識結合テストを実施することが可能である。コルチゾールと効果的に競合する化合物が選定される。
【0034】
本発明はまた、Cbg遺伝子を過剰発現する動物またはその遺伝子の突然変異体を発現する動物を、CBGがHPA軸に及ぼす作用の仕組みを理解するため、そして/または、CBGの発現を変化させることのできる化合物をスクリーニングするために、研究モデルとして用いることにも関するものである。更に、本発明は遺伝子導入動物に関するものであり、その導入遺伝子に含まれる核酸配列は、Cbg遺伝子または好適には100kb以下の距離で隣接する3’および5’配列に含まれている。好適には、選択された配列は、CBGタンパク質と同一または相同のポリペプチドをコードするものである。
【0035】
例えば、そのような遺伝子導入動物は、この技術について従来から用いられているように、Cbg遺伝子をコードする配列(例えばSEQ ID No.1)と標的組織(この場合は肝臓)でそれを過剰発現できるような調節配列とを含む核酸を、その動物(例えばマウス、ラット、豚)の胚の中にマイクロインジェクトすることで得られる。
【0036】
HPA軸、ならびに、肥満、炎症反応及び自己免疫反応、特に認知機能における老化、薬物嗜癖に関連する病変に対してCBGが作用する仕組みを理解するための技術的モデルとして、これらの動物を使用することができる。
【0037】
CBGの機能を変化させることのできる化合物をスクリーニングするために、これらの動物を使用することができる。
【0038】
化合物のスクリーニングは、その動物にテスト対象の化合物を投与し、その後で、従来の方法により、その動物の中でのHPA機能の変化を測定することによって行うことができる。
【0039】
本発明はまた、高コルチゾール血症を軽減する治療を目的として、したがって、肥満、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性、あるいは更に、老化の病変あるいは薬物濫用による増感現象などの、高コルチゾール血症に関連する病変の治療をするために、Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成及び/またはコルチゾールとの結合を変化させることのできる化合物をスクリーニングする方法にも関するものである。その方法には、例えばHepG2細胞のような培養細胞に基づいてCBGタンパク質を生成すること、そして、そのタンパク質の生成について前記化合物をテストすることが含まれている。有利には、そのスクリーニングは大規模なスクリーニングである。
【0040】
本発明はまた、Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成及び/またはコルチゾールとの結合を変化させることのできる化合物をスクリーニングする方法にも関するものであり、本発明の特徴は、既に説明したような遺伝子導入動物について、上記のスクリーニング方法によってin vitroで識別した化合物をin vivoでスクリーニングする過程が含まれることである。
【0041】
本発明によって遺伝子マーカーを識別することにより、構成的高コルチゾール血症を評価し、したがって、上記に示した病変、特に肥満に対する脆弱性を評価することを目的とした、CBGのための遺伝子検査を実施するための新しい手段を活用することが可能になる。そのような検査はまた、構成的高コルチゾール血症を呈する牧畜動物の選択を重ねていくことにも役立つ。
【0042】
例えば、そのような方法には、Cbg遺伝子の全部または一部を含むサンプルのDNA領域をPCRによって増幅し、つぎにその領域を分析して、高コルチゾール血症の原因となり、かつ既に説明した方法によって識別済みの可能性のある、少なくとも一つの突然変異の存在を識別することが含まれる。
【0043】
それゆえ、本発明はまた、被験体、特にヒトの高コルチゾール血症あるいは高コルチゾール血症の素因を診断するために上記の方法を用いることにも関係しているものであって、この方法を用いることによって、HPA軸の機能不全、ならびに、肥満、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性、あるいは更に(特に認知機能に関わる)老化の病変、あるいは濫用薬剤による増感現象などの、この軸に関連する病気または病気の素因を識別することができるようになるものである。
【0044】
最後に本発明は、CBGのアゴニストまたはアンタゴニストとなり、したがってCBGのレベルまたはコルチゾールに対するその親和性に直接作用することができる化合物を識別し、それにより、間接的にコルチコステロイドのレベルを下げることに関するものである。
【0045】
本発明のほかの利点と特徴とは、豚のCbg遺伝子における突然変異の識別と、CBGの分子変異体とコルチゾール生成との間を因果関係で結びつける遺伝的関連の分析とに関する以下の例で明らかになっていく。その際に、次の添付図面を参照していくことになる。
・図1では、放射線ハイブリッドマッピングにより豚のCbg遺伝子の位置を特定している。Aでは、血漿コルチゾールの濃度についてSscr7に沿った最大尤度比の推移をセンチメートル単位で示している。Bでは、豚の7番染色体のマッピングを放射線ハイブリッドにより行い、その概況を示している。距離の単位はcR7000である。
・図2では、豚のCbg遺伝子の位置をFISH法により7q26に特定している。
・図3では、81頭のF2豚について血漿中のCBG濃度の遺伝的な関連の分析を行っている。
・図4では、Cbgのゲノム配列における突然変異の検出を行っている。矢印が示すヌクレオチドについては、F1豚#9110045とその母に当たるメイシャンとが異型接合体(T/G)である一方で、その父に当たるLWは同型接合体(G/G)である。
【実施例】
【0046】
I−材料と方法
1)放射線ハイブリッドパネルマッピング
IMpRHパネルについて別々の二度の反応を起こさせる(Yerle et al., 1998)。PCR産物の分析をエチジウムブロマイドで染色した後、緩衝剤1×TBE中のアガロースゲル2%で行った。調和を欠く結果が得られたクローンについて三度目の増幅を行った。増幅結果のベクターをIMpRHバンクに登録した(Milan et al. 2000)。
【0047】
2)FISH法によるマッピング
末梢血リンパ球の培養から分裂中期の染色体を入手した。染色体識別のため、ハイブリダイゼーション前に、G−T−G技法を用いて分裂中期のGバンドに標識を行い、そして分裂中期の最盛期の画像を前述したビデオ・プリンターで撮影した(Yerle et al., 1992)。
【0048】
in situハイブリダイゼーション法の実験をYerleらの方法に従って行った(Yerle et al., 1992)。その際に、幾つかの修正を加えた(Sun et al., 1999)。
【0049】
3)遺伝的関連の分析
正規分布に従ってデータが分布しているということをまず検証した。四つの形質は対数正規分布を呈し、そのデータを分析に先立って対数スコアに変換した。QTLマッピングを、複数の部位で最大尤度を求める技法によって、実施した。考慮の対象となるマーカーのセットと関連するQTLが有るか(H1)無いか(H0)の仮説の下での尤度比として規定された統計的テストを、染色体に沿った各位置(各センチメートル)で計算した。そこで用いた7番染色体のマーカーの地図を、1100を越える豚の遺伝子型に基づいてBidanelらの方法(2000)により計算した。仮説H1に従って、各父母について遺伝子を置換する効果を伴ったQTLをデータに適合させた。確率計算の方法についての他の詳細は、Bidanelらの文献(2000)に見いだすことが可能である。置換による平均的効果の推定値の計算を、各位置において、最も高い確率で行った。
【0050】
染色体に沿った有意水準を、微分モデルと記録の正規分布とを前提にして、データをシミュレーションして経験的に決定した。各形質について合計50000回のシミュレーションを行った。ゲノム全体の確率Pgの検定に対応する染色体試験の有意水準Pcを、Bonferroniの修正を用いて求めた、つまり、Pg=1−(1−Pc)19の解として求めたところ、有意なレベル(Pg=0.05)と非常に有意なレベルとについて、それぞれPc=0.0027と0.000054となった(Knott et al., 1998)。
【0051】
4)BACのDNAバンクのスクリーニング
BACクローンを、前述したようにBACクローンの豚バンクの三次元PCRスクリーニングによって単離した(Rogel−Gaillard et al., 1999)。豚のCBG配列を含むBACクローン383F4を、以下のようなヒトCBGのエクソン2の配列に基づいて確立した一対のプライマーを用いてクローニングした。
FW:ACACCTGTCTTCTCTGGCTG(SEQ ID NO.4)
REV:ACAGGCTGAAGGCAAAGTC(SEQ ID NO.5)
【0052】
各dNTPを0.2mM、MgCl2を1.5mM;各プライマーを8pM、TaqDNAポリメラーゼを2U、そして反応緩衝液を含む、20μlの反応総量の中で、94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で30秒を35回繰り返して、PCRを実施した(Perkin−Elmer, Roche)。
【0053】
5)配列決定
配列決定の反応を、自動シーケンサーPE970で「Prism AmpliTaq FS diChloroRhodamine Dye Terminators」(Perkin Elmer)というキットで行った。
【0054】
CBGの結合力とそのコルチゾールへの親和性とを、Concavalin A−セファロースカラムを用いて、固体相への固定試験により4℃で測定した(Pugeat et al., 1984)。結合平衡定数(Ka)とコルチゾールに対するCBGの容量とをScatchard解析により計算したが、その際に、「bound」をゲルの上に吸収された糖タンパク質に特異的に固定されたコルチゾールの量として、そして「free」を水性相の中でのコルチゾールの濃度として用いた。
【0055】
7)統計
Statisticaというソフトウエアの第5版を用いて、相関行列を求め、スチューデントのt検定を行った。
【0056】
II−結果
1)比較マッピングにより、Cbg遺伝子を高コルチゾール血症のQTLの候補として提案することができる。
Goureauら(2000)は、ヒトと豚の染色体断片の対応を、双方向性の染色体着色の分析を用いて説明した。脇にマーカーS0101とSw764とがあるコルチゾールのQTLの位置を豚の7q2.4−7q2.6の領域に特定した。ヒトのオーソロガス領域(Hsap14q)に位置を特定した遺伝子の中で、Hsap14q32.1に位置が特定されたCBGをコードする遺伝子(Billingsley et al., 1993)が注意を引いた。事実、血漿のコルチゾールの90%は、肝臓が合成する糖タンパク質であるCBGに固定される。遊離しているコルチゾールだけが活性なので、CBGの主要な役割はコルチゾールの生物学的利用能にある。そういうわけで、Cbg遺伝子は、コルチゾールのレベルに関連するそのQTLのための機能的候補として有力である。
【0057】
Cbg遺伝子は、ヒト、サル、羊およびマウスにおいてクローニングされていたものだったので(Hammond et al., 1987; Hammond et al., 1994; Berdusco et al., 1993; Orava et al., 1994)、入手可能な様々な配列をMultalinというプログラムを使ってアラインメントし(Corpet,1988)、豚のCbgのPCR断片を入手するために、エクソン2に基づいて、オリゴヌクレオチドコンセンサスプライマーを用意することが可能であった。PCR断片の配列が他の種のCbg遺伝子と高い相同性があることを検証した後、放射線ハイブリッドパネルを使って豚のCbg遺伝子マッピングをするため、それらプライマーを用いた(Yerle et al., 1988)。このとき、図1に示されるように、豚のCbg遺伝子は、コルチゾールのQTLのように、マーカーS0101とSW764との間にあることがわかった。
【0058】
この染色体での位置決定は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法により確認した。まず、豚ゲノムのBACバンクを、豚のCbg遺伝子のエクソン2を増幅するプライマーを使ってPCRスクリーニングした。BAC383F4と名付けられ、豚のCbg遺伝子のゲノム配列全体を含む、150kbのクローンが得られた。このBACクローンを、分裂中期の広がった染色体に対するFISH法によって豚のCbg遺伝子のマッピングを行うためのプローブとして用い、そして、図2に示されるように、豚のCbg遺伝子が染色体7q26にあることが確認された。
【0059】
2)CBGの結合力は、高コルチゾール血症のQTLの脇にあるマーカーに遺伝的に関連している。
CBGのコルチゾールへの結合力を、初代の交配に基づく、全てがF1豚#911045の子孫である81頭のF2豚の血漿中で測定した。予想した通り、その測定値とコルチゾールのレベルとの間に強い相関関係が認められた(r=0.57)。その新しい表現型の測定値とマーカーSsc7との間の遺伝的関連を算定した。図3が示すように、確かにコルチゾールのQTLと同じ領域の中に強い遺伝的関連が検出された。確率の最大値は、CBGの値と共に、上回ってさえいて(p<5×10-4)、そのことがそのQTLへのCbg遺伝子のかかわり合いを更に強固なものにしている。
【0060】
3)CBGの結合力はLW豚とMS豚との間で異なる。
タンパク質に関して、コルチゾールへの結合力とCBGの親和定数とを、放射標識結合テストにより、LWとメイシャンとの間で比較した。2種の豚の間で親和性には何の違いも見いだせなかった。しかしながら、以下の表1が示すように、最大結合力は、LW豚に対して、メイシャン豚が平均して1.6倍も上回っていた(p<0.001)。
【0061】
【表1】
【0062】
4)Cbg遺伝子における突然変異の識別
BACクローン383F4により、以前にはクローニングされたことのないCbg遺伝子のゲノム構成と配列の識別が可能になった。他の種におけるのと同様に、豚のCbg遺伝子の中に5個のエクソンがあり、エクソン2の中にAUGコドンがある。アミノ酸に関しては、本発明者は、豚のCBGタンパク質と、ヒトおよびヒツジのCBGタンパク質との間に、それぞれ66%と80%の相同性を見いだした。
【0063】
突然変異を探るために、父がLWで母がメイシャンであるF1個体の、エクソンとプロモーター領域の900bpとの配列を決定した。このF1豚(#911045)はQTLに対して異型接合体になるはずであったと考えられたが、それは、QTLの脇にあるマーカーS0101のどちらかの対立遺伝子を受け取った子の間で、コルチゾールの平均レベルに有意な差があったからである。したがって、その母メイシャン豚は問題の突然変異のところで父LWとは違う対立遺伝子を少なくとも一つもつことになるはずである。このタイプの突然変異は、F1豚#911045のエクソン2の中で識別された。開始コドンATGから+15の位置で、この個体は一方の対立遺伝子について点突然変異G→Tをもつ異型接合体となっている(図4)。このG→T置換は、コドン15に対応しており、CBGタンパク質のシグナルペプチドの中で一つのセリンを一つのイソロイシンに変える。PCRによる増幅テストを以下のパラメーターで最適化した。
センスプライマー:5’−CCCTGTATGCCTGTCTCCTC−3’
アンチセンスプライマー:5’−CCTGCTCCAAGAACAAGTCC−3’
PCRの条件:1×PCR緩衝液(Promega)、MgCl2 1.5mM、dNTP 100μM、各プライマーを10pmol、Taqポリメラーゼ 0.4U(Promega)。
サーマルサイクラーのプログラム:
1) 96℃:5分
2) 92℃:30秒
3) 60℃:1分
4) 72℃:30秒
5) 2)3)及び4)の手順を34回
6) 72℃ 2分
【0064】
[参考文献]
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【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】放射線ハイブリッドマッピングの結果を示した図。
【図2】豚のCbg遺伝子の位置を示した写真。
【図3】豚の血漿中CBG濃度の遺伝的な関連を示したグラフ。
【図4】Cbg遺伝子における点突然変異を示した図。
【図5】背中の脂肪の厚みと高コルチゾール血症のQTLとの間の遺伝的関連を示したグラフ。
Claims (17)
- Cbg遺伝子の全部または一部を含む幾つかの個体の核酸配列を比較すること、および、Cbg遺伝子またはそれに隣接する配列における突然変異を識別することを含むことを特徴とする、高コルチゾール血症表現型に関連する多型マーカーの識別方法。
- 前記核酸配列が、Cbg遺伝子の一部または好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列を含むゲノムDNA配列であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- Cbg遺伝子または好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列の中に含まれる核酸配列の全部または一部からなる、高コルチゾール血症表現型に関与する多型マーカー。
- マイクロサテライト、挿入/欠失多型、制限断片長多型(RFLP)または単一ヌクレオチド多型(SNP)を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項3に記載の多型マーカー。
- 請求項3または4に記載のマーカーの脇に、Cbg遺伝子配列の5個から50個、好適には10個から30個の連続するヌクレオチド、または、好適には100kb以下の距離で隣接する3’もしくは5’配列を含むことを特徴とする、ヌクレオチドプライマー。
- 多型マーカーを用いて、高コルチゾール血症及びそれに関連する病変を進行させるおそれのある個体を識別するための遺伝子スクリーニング方法であって、
i)ある個体のゲノムDNAを精製し、つぎに、
ii)前記DNAに基づき、PCRによって、請求項3または4に記載の多型マーカーを含む遺伝子座を増幅し、そして、
iii)増幅した前記DNAのなかで前記多型マーカーの一つまたは複数の対立遺伝子を検出する
ことを含むことを特徴とする方法。 - DNAサンプルに基づいて高コルチゾール血症の遺伝子マーカーのテストを行えるようにする、請求項6に記載の方法を活用するためのキットであって、請求項5に記載の一対のヌクレオチドプライマー、PCR試薬、ならびに場合によっては、反応のネガティブコントロール及びポジティブコントロール、ならびにマーカーを含むことを特徴とするキット。
- HPA軸の機能不全、ならびに、肥満、炎症反応及び自己免疫反応への構成的な感受性、あるいは更に(特に認知機能に関わる)老化の病変、あるいは濫用薬剤による増感現象などの、この軸に関連する病気または病気の素因を識別することのできる、被験体、特にヒトの高コルチゾール血症あるいは高コルチゾール血症の素因を診断するための、請求項6に記載の方法の使用。
- 高コルチゾール血症を進行させる確率が高く、肥満率の高い牧畜動物、特に豚を選択するため、あるいは選択を重ねていくための、請求項6に記載の方法の使用。
- 請求項3または4に記載の多型マーカーの対立遺伝子が、
・SEQ ID NO.1の部位133に対応する、G→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位134に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位539に対応する、T→Cの転位
・SEQ ID NO.1の部位620に対応する、A→Gの転位
・SEQ ID NO.1の部位626に対応する、G→Aの転位
・SEQ ID NO.1の部位859に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位866に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位882に対応する、A→Gの転位
・SEQ ID NO.1の部位890に対応する、G→Cの転位
・SEQ ID NO.1の部位960に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.1の部位1008に対応する、G→Aの転位
・SEQ ID NO.6の部位42に対応する、T→Cの転位
・SEQ ID NO.6の部位49に対応する、C→Tの転位
・SEQ ID NO.7の部位75に対応する、C→Tの転位
からなる突然変異群の中から選択された一つの突然変異を呈する、請求項6に記載の方法の使用。 - 導入遺伝子の中に請求項3に記載の核酸配列のうちの一つが含まれる、遺伝子導入動物。
- CBGタンパク質と同一または相同のポリペプチドをコードする請求項3に記載の配列のうちの一つを過剰発現する、遺伝子導入動物。
- HPA軸、ならびに、肥満、炎症反応及び自己免疫反応、特に認知機能に関わる老化、薬物嗜癖に関連する病変にCBGが作用する仕組みを理解するための技術的モデルとしての、請求項11または12に記載の遺伝子導入動物の使用。
- CBGの機能を変化させることのできる化合物をスクリーニングするための、請求項11または12に記載の遺伝子導入動物の使用。
- Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成及び/またはそのコルチゾールとの結合を変化させることのできる化合物をスクリーニングする方法であって、例えばHepG2細胞のような培養細胞に基づくCBGタンパク質の生成を含むこと、および、前記タンパク質の生成に対する前記化合物のテストが行われることを特徴とする方法。
- 前記スクリーニングが大規模なスクリーニングであることを特徴とする、請求項15に記載のスクリーニング方法。
- Cbg遺伝子の発現及び/またはその合成及び/またはそのコルチゾールとの結合を変化させることのできる化合物をスクリーニングする方法であって、請求項15または16に記載のスクリーニング方法によりin vitroで識別した化合物を、請求項12に記載の遺伝子導入動物についてin vivoでスクリーニングすることを含むことを特徴とする方法。
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