FR2831556A1 - Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees - Google Patents
Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees Download PDFInfo
- Publication number
- FR2831556A1 FR2831556A1 FR0114156A FR0114156A FR2831556A1 FR 2831556 A1 FR2831556 A1 FR 2831556A1 FR 0114156 A FR0114156 A FR 0114156A FR 0114156 A FR0114156 A FR 0114156A FR 2831556 A1 FR2831556 A1 FR 2831556A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- cbg
- hypercortisolemia
- gene
- sequences
- cortisol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 201000005255 adrenal gland hyperfunction Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000003131 corticotrophic effect Effects 0.000 title claims description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 5
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 title claims description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 title description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 title 1
- 101150055150 SERPINA6 gene Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 10
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 7
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 6
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 4
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims 1
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 abstract description 88
- 108010011095 Transcortin Proteins 0.000 abstract description 54
- 102000014034 Transcortin Human genes 0.000 abstract description 50
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 15
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 13
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 10
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 101000868967 Homo sapiens Corticosteroid-binding globulin Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 238000012254 genetic linkage analysis Methods 0.000 description 3
- 102000049531 human SERPINA6 Human genes 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 208000004611 Abdominal Obesity Diseases 0.000 description 2
- 206010065941 Central obesity Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N Corticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010013654 Drug abuse Diseases 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101001039035 Homo sapiens Lutropin-choriogonadotropic hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N corticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010060378 Hyperinsulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102100040788 Lutropin-choriogonadotropic hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000375 Mineralocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100021316 Mineralocorticoid receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100024078 Plasma serine protease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010001953 Protein C Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122929 Protein C inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101100059235 Sus scrofa Serpina6 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 108010091628 alpha 1-Antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002942 anti-growth Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000011685 brown norway rat Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000037326 chronic stress Effects 0.000 description 1
- 230000002060 circadian Effects 0.000 description 1
- 230000008632 circadian clock Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 108091008723 corticosteroid receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008451 emotion Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000003826 endocrine responses Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000003451 hyperinsulinaemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008980 hyperinsulinism Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001596 intra-abdominal fat Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020997 lean meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003608 radiolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 201000009032 substance abuse Diseases 0.000 description 1
- 231100000736 substance abuse Toxicity 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne une méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phénotype d'hypercortisolémie caractérisée en ce qu'elle comprend la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus, comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes. L'invention a également pour objet un marqueur polymorphe associé au phénotype d'hypercortisolémie constitué d'une séquence d'acide nucléique comprenant tout ou partie du gène Cbg ou des séquences 3' ou 5' adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
UTILISATION DU GENE DE LA CBG COMME MARQUEUR GENETIQUE DE L'HYPERCORTISOLEMIE ET DES PATHOLOGIES ASSOCIEES.
La présente invention concerne l'utilisation du gène codant pour la transcortine (ou CBG=corticosteroid binding globulin) comme marqueur génétique de l'hypercortisolémie constitutive et comme nouvelle cible thérapeutique de pathologies associées à l'hypercortisolémie. L'invention a pour application 1) la sélection des animaux d'élevage ayant une plus faible probabilité de développer une hypercortisolémie 2) le diagnostic génétique de patients susceptible de développer une hypercortisolémie. 3) le traitement de pathologies liées à l'hypercortisolémie constitutive. Sont décrits les méthodes d'identification des marqueurs génétiques de la transcortine et les méthodes de criblage génétique pour déterminer les individus susceptibles de développer une hypercortisolémie.
Les hormones glucocorticoïdes, cortisol chez l'homme et le porc, corticostérone chez les rongeurs, sont impliquées dans de nombreux processus biologiques comme la néoglucogénèse, le métabolisme lipidique et protéique, l'action anti-inflammatoire et la croissance. Les glucocorticoïdes sont aussi un composant majeur des réponses de stress. Après exposition à un stress, le cortisol est rapidement libéré des glandes surrénales pour fournir l'énergie nécessaire à la réponse comportementale. Par rétrocontrôle négatif, le niveau de cortisol retourne à des valeurs de base lorsque ce stimulus est contrôlé par l'individu. Dans le cas contraire, comme dans les situations de stress chronique, les niveaux élevés et constants de cortisol sont fortement délétères pour l'organisme. Ainsi, le cortisol et l'axe corticotrope en général sont impliqués dans diverses pathologies dont
<Desc/Clms Page number 2>
l'obésité (Rosmond et al., 1998), la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes (Sternberg and Gold, 1997), le vieillissement (Lupien et al., 1998) ou la sensibilisation aux drogues d'abus (Piazza and Le Moal, 1998).
Une importante variabilité du fonctionnement de l'axe corticotrope est observée entre individus, ce qui influence la vulnérabilité individuelle aux pathologies citées ci-dessus. Cette variabilité est en partie d'origine génétique comme en témoignent plusieurs études de jumeaux portant sur la réactivité de l'axe corticotrope au stress et son activité circadienne (Meikle et al., 1988 ; Kirschbaum et al., 1992 ; Linkowski et al., 1993). De même, des différences fonctionnelles de l'axe corticotrope ont été mises en évidence entre diverses lignées consanguines de souris ou de rats (Armario et al., 1995 ; (Marissal-Arvy et al., 1999) ou entre races de porcs (Désautés et al., 1999).
L'identification des gènes supportant cette variabilité du fonctionnement de l'axe corticotrope est donc d'une grande importance pour la santé humaine et animale. Chez l'homme, des études d'association ont été menées entre des gènes régulateurs de l'axe corticotrope et des pathologies liées au dysfonctionnement de cet axe. Par exemple, des polymorphismes du récepteur aux glucocorticoïdes ont été trouvés associés à l'obésité abdominale (Buemann et al., 1997).
Les Inventeurs se sont précisément intéressés à identifier ces gènes selon (i) des approches ne posant pas d'hypothèse de départ et utilisant la cartographie génétique de locus de traits quantitatifs ou QTL (Quantitative Trait Loci) sur modèles animaux (Moisan et al., 1996), et (ii) des approches gènes candidats basés sur la connaissance du rôle de ces gènes dans le
<Desc/Clms Page number 3>
fonctionnement de l'axe corticotrope (Marissal-Arvy et al., 2000).
Ces deux stratégies ont été mises en oeuvre sur le gène codant pour la transcortine, et les travaux ayant conduit à la présente Invention ont concerné à la fois une analyse de QTL et de la fonction connue de ce gène. La transcortine ou CBG (corticosteroid-binding globulin) est une protéine de liaison plasmatique des hormones glucocorticoïdes qui a été étudiée pour son rôle de transporteur du cortisol et son influence sur la biodisponibilité de celui-ci.
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence le rôle de la transcortine sur la production du cortisol et son implication dans la variabilité de la cortisolémie chez le porc.
Ces résultats ont été obtenus suite aux travaux des Inventeurs sur la recherche des gènes influençant le fonctionnement de l'axe corticotrope chez le porc, et mettant en oeuvre la méthode de cartographie génétique de QTL sur un croisement de deux races porcines : Large White européen et Meishan chinois.
Une forte liaison génétique a été trouvée entre les concentrations plasmatiques de cortisol des porcs et un locus du chromosome 7 porcin (Bidanel et al., 2000). Par cartographie comparée avec le génome humain, il s'est avéré maintenant que le gène de la transcortine se trouvait dans l'intervalle défini par l'analyse génétique : - le gène Cbg porcin se trouve effectivement dans la région du QTL (démontré par FISH et par cartographie sur hybrides irradiés), - l'analyse de liaison génétique faite avec la concentration plasmatique de transcortine (au lieu du cortisol) sur la même population F2 montre également une forte liaison avec le locus du chromosome 7,
<Desc/Clms Page number 4>
- la concentration de CBG est différente chez les deux races de porcs parentaux Large White et Meishan, - une mutation intéressante a été trouvée dans la région codante du gène Cbg chez le porc Meishan.
Le gène Cbg constitue donc un candidat de position s pour ce QTL chez le porc.
Ces résultats de l'analyse de liaisons génétiques mettent en évidence, pour la première fois, une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la transcortine et la production de cortisol.
Par ailleurs, le porc Meishan qui est hypercortisolémique est également obèse et montre un retard de croissance par rapport au Large White ce qui pourrait être une conséquence de ses taux élevés de cortisol. En faveur de cette hypothèse, une corrélation positive a été trouvée chez les individus F2 entre les taux de cortisol et l'épaisseur de lard dorsal. Cette relation a été retrouvée dans une population F2 Duroc x Large White entre cortisol urinaire, lard dorsal et proportion de viande maigre dans la carcasse (Mormède P. non publié). Suite à ces résultats une nouvelle analyse statistique a permis de mettre en évidence une liaison génétique entre l'épaisseur de lard dorsal et le locus du chromosome 7 dans la population de porcs F2 (Meishan x large White). Cortisolémie et dépôt de gras convergent donc vers ce locus contenant le gène de la transcortine. Le porc Meishan représente donc un excellent modèle pour l'étude de la variabilité génétique de l'axe corticotrope et ses conséquences physiopathologiques, pour l'obésité en particulier.
Il convient en outre de rappeler que chez la souris, un locus génomique associé à l'obésité a été mis en évidence en 1995 par Warden (Warden et al., 1995). Avec les données actuelles sur le génome de la souris, il est possible de voir que la CBG est au pic de l'intervalle de
<Desc/Clms Page number 5>
confiance de ce QTL et constitue de nouveau dans ce modèle un bon candidat de position.
Enfin, chez l'homme une relation inverse entre la concentration de CBG et l'hyperinsulinémie a été rapportée au cours de l'obésité, tandis que les diabétiques ont une CBG plus élevée (Fernandez-Real et al., 1999) (Fernandez-Real et al., 2000). Ces relations pourraient s'expliquer par l'effet inhibiteur de l'insuline sur la production hépatique de CBG (Crave et al., 1995).
Des variants moléculaires de la transcortine chez l'homme ont été décrits dans la littérature (Van Baelen et al., 1982) (Smith et al., 1992) et dans deux études les patients ayant une mutation dans le gène de la transcortine sont obèses (Emptoz-Bonneton et al., 2000 ; Torpy et al, 2001)
L'ensemble des données recueillies dans diverses espèces animales à partir de différentes approches, permet de considérer les variations de la CBG au cours de l'obésité comme un facteur important de la biodisponibilité du cortisol impliqué dans la physiopathologie de la maladie.
L'ensemble des données recueillies dans diverses espèces animales à partir de différentes approches, permet de considérer les variations de la CBG au cours de l'obésité comme un facteur important de la biodisponibilité du cortisol impliqué dans la physiopathologie de la maladie.
Ces résultats sont remarquables car aucun marqueur de cortisolémie constitutive n'est disponible à ce jour. Un tel marqueur permet de déterminer à partir d'un échantillon de sang, et dès la naissance, la cortisolémie d'un individu. Cette cortisolémie va influencer la vulnérabilité à l'obésité, aux réactions auto-immunes et inflammatoires, la vitesse de croissance, le vieillissement, la toxicomanie. L'invention trouve donc des applications dans le domaine de la sélection d'animaux d'élevage, comme le porc, portant des allèles favorables du gène de la transcortine, ainsi que pour le diagnostic génétique chez l'homme de prédisposition à l'hypercortisolémie constitutive et ses conséquences pathologiques ci-dessus. Enfin, l'invention permet de
<Desc/Clms Page number 6>
disposer d'un nouvel outil de criblage de substances utiles pour traiter ces pathologies liées à un dysfonctionnement de l'axe corticotrope.
L'invention a donc tout d'abord pour objet une méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phénotype d'hypercortisolémie comprenant la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus,
comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes.
comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes.
On entend par individus tant des sujets humains que des animaux. Avantageusement, lesdites séquences d'acide nucléique sont des séquences d'ADN génomiques
comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3'ou 5' adjacente éloignée préférentiellement au plus de 100kb.
comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3'ou 5' adjacente éloignée préférentiellement au plus de 100kb.
A titre d'exemple, la séquence de l'ADNc du gène Cbg de porc et une séquence 5'adjacente de ce gène, qui sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3 respectivement, peuvent être utilisées pour rechercher des marqueurs de l'hypercortisolémie.
Ces marqueurs peuvent être obtenus à partir de clones génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou des séquences flanquantes, eux-mêmes obtenus à partir d'un criblage de banque d'ADN avec une sonde spécifique du gène Cbg comme décrit dans la partie 4) de la section Matériel et Méthodes. Ces marqueurs polymorphes peuvent être par exemple des microsatellites, des polymorphismes d'insertion/délétion, des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) ou des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP).
Le séquençage d'un segment d'ADN couvrant le locus polymorphe permet de définir des amorces
<Desc/Clms Page number 7>
nucléotidiques permettant l'amplification spécifique dudit segment à partir d'ADN génomique total d'un individu.
L'invention a donc également pour objet un marqueur polymorphe associé au phénotype d'hypercortisolémie constitué de tout ou partie d'une
séquence d'acide nucléique comprenant le gène Cbg ou les séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb.
séquence d'acide nucléique comprenant le gène Cbg ou les séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb.
L'invention concerne également des amorces nucléotidiques flanquant le marqueur ci-dessus. De telles amorces comprennent de 5 à 50 de préférence de 10 à 30
nucléotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb, flanquant un marqueur défini ci-dessus.
nucléotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb, flanquant un marqueur défini ci-dessus.
L'invention se rapporte aussi à une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolémie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes.
Une telle méthode comprend : i) la purification d'ADN génomique d'un individu à partir de sang, de tissu ou de sperme, en général, l'ADN est purifié à partir des leucocytes obtenus d'un prélèvement sanguin selon les techniques classiques, puis ii) l'amplification du locus contenant le marqueur polymorphe par la réaction de polymérase en chaîne (ou PCR) à partir dudit ADN, à l'aide des amorces définies ci-dessus, et iii) la détection du ou des les allèles dudit marqueur polymorphe dans ledit ADN amplifié.
Selon le type de polymorphisme du marqueur, différentes techniques peuvent être utilisées : - Pour les polymorphismes de longueur (microsatellites, insertion/délétion, RFLP) les allèles
<Desc/Clms Page number 8>
présents dans les ADN amplifiés des différents individus sont détectés par les techniques classiques d'électrophorèse, avantageusement précédées d'une digestion enzymatique pour les RFLP.
Pour les mutations ponctuelles, polymorphismes de type SNP, les techniques utilisées incluent par exemple la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al, 1989 PNAS 86 : 2766-2770), la PCR allèle-spécifique (Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17,2427- 2448) ou le séquençage direct de l'ADN amplifié.
La détection des allèles du marqueur chez un individu permet de prédire si celui-ci est plus susceptible de développer une hypercortisolémie. Un exemple d'une telle mutation ponctuelle dans le gène Cbg est décrit dans la figure 4 en annexe.
L'invention vise également à offrir un kit pour la mise en oeuvre de la méthode ci-dessus permettant de tester les marqueurs génétiques de l'hypercortisolémie à partir d'un échantillon d'ADN. Un tel kit comprend une paire d'amorces nucléotidiques comme définie précédemment qui seront utilisées avec des réactifs d'amplification par PCR disponibles commercialement. Le kit peut aussi inclure des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs.
L'invention se rapporte aussi à une méthode pour identifier des substances capables de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse dans le but thérapeutique de réduire une hypercortisolémie. En effet, la protéine CBG, de type sauvage ou mutante, peut être utilisée pour un criblage in vitro de composés capables de modifier la liaison de la CBG au cortisol et/ou à la corticostérone. En conséquence, l'invention a pour objet une méthode d'identification de substances capables de
<Desc/Clms Page number 9>
moduler la fonction de la CBG consistant à mesurer par toute technique appropriée la liaison du composé à la CBG (sauvage ou mutante). Il peut s'agir d'une technique utilisant les méthodes de criblage à grande échelle décrites dans la littérature comme par exemple dans l'ouvrage High throughput screening : The discovery of Bioactive Substances , JP Delvin (Ed), Marcel Dekker Inc.
New York (1997).
L'activité de liaison entre la CBG et un composé actif peut par exemple être déterminée par un test de radio-liaison dans lequel la capacité de liaison et l'affinité des composés à tester sont estimés par leur capacité de déplacement de cortisol radioactif. La source de CBG est obtenue par exemple par transfection d'un vecteur contenant l'ADNc du gène Cbg dans des cellules en culture. La protéine étant sécrétée, le test de radioliaison peut-être réalisé sur le milieu de culture. Les composés entrant efficacement en compétition avec le cortisol seront sélectionnés.
L'invention concerne également l'utilisation d'animaux surexprimant le gène Cbg ou exprimant un mutant de ce gène comme modèle d'étude pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et/ou pour cribler des composés capables de moduler l'expression de la CBG.
A titre d'exemple, ces animaux transgéniques sont obtenus par micro-injection dans des embryons de l'animal (par exemple souris, rat, porc) d'un acide
nucléique contenant la séquence codante du gène Cbg (par exemple SEQ ID n l) ainsi que des séquences régulatrices permettant sa sur-expression dans le tissu cible (dans ce cas le foie) comme il est classiquement d'usage pour cette technologie.
nucléique contenant la séquence codante du gène Cbg (par exemple SEQ ID n l) ainsi que des séquences régulatrices permettant sa sur-expression dans le tissu cible (dans ce cas le foie) comme il est classiquement d'usage pour cette technologie.
<Desc/Clms Page number 10>
Ces animaux peuvent être utilisés comme modèles de pathologies associées à l'hypercortisolémie dont l'obésité, les réponses inflammatoires et auto-immunes, le vieillissement en particulier cognitif, les toxicomanies.
Le criblage de composés peut être réalisés par l'administration à l'animal du composé à tester suivie de la mesure des altérations dans ledit animal de la fonction corticotrope par les méthodes classiques.
L'identification des marqueurs génétiques selon l'invention permet de disposer de nouveaux outils pour la réalisation de tests génétiques pour la CBG afin d'évaluer l'hypercortisolémie constitutive et par voie de conséquence la vulnérabilité aux pathologies indiquées précédemment et notamment l'obésité. Un tel test est également utile pour la contre-sélection d'animaux d'élevage montrant une hypercortisolémie constitutive.
A titre d'exemple, une telle méthode comprend l'amplification par PCR d'une région de l'ADN de l'échantillon comprenant tout ou partie du gène Cbg puis l'analyse de cette région pour identifier la présence d'au moins une mutation responsable d'une hypercortisolémie et susceptible d'avoir été identifiée par la méthode décrite précédemment.
L'invention se rapporte donc aussi à l'utilisation de la méthode ci-dessus pour le diagnostic d'une hypercortisolémie ou d'une prédisposition à une hypercortisolémie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus.
<Desc/Clms Page number 11>
L'invention se rapporte enfin à l'identification de composé agoniste ou antagoniste de la CBG et donc capable d'agir directement sur le taux de CBG ou sur son affinité pour le cortisol ce qui indirectement réduira le taux de corticostéroïdes.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant l'identification de mutations dans le gène Cbg chez le porc et l'analyse de liaisons génétiques mettant en une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la CBG et la production de cortisol. 11 sera fait référence aux figures en annexe dans lesquels :
- la figure 1 représente la localisation du gène Cbg de porc par cartographie sur hybrides irradiés. En A : Evolution du taux maximal de vraisemblance le long de Sscr 7 (en cM) pour les concentrations de cortisol plasmatique. En B : profil de cartographie par hybrides irradiés du chromosome 7 de porc. Les distances sont en cor7000.
- la figure 1 représente la localisation du gène Cbg de porc par cartographie sur hybrides irradiés. En A : Evolution du taux maximal de vraisemblance le long de Sscr 7 (en cM) pour les concentrations de cortisol plasmatique. En B : profil de cartographie par hybrides irradiés du chromosome 7 de porc. Les distances sont en cor7000.
- la figure 2 représente la localisation du gène Cbg de porc à 7q26 par FISH.
- La figure 3 représente l'analyse de liaison génétique des concentrations de CBG plasmatique sur 81 porcs F2.
La figure 4 représente la détection de mutation dans la séquence génomique de Cbg. Les flèches indiquent le nucléotide pour lequel le porc Fl#9110045 et sa mère Meishan sont hétérozygote (T/G) alors que le père LW est homozygote (G/G).
1-Matériel et Méthodes.
1) Cartographie sur hybrides irradiés.
Les réactions ont été réalisées indépendamment en double sur un panel ImpRH (Yerle et al., 1998). Les
<Desc/Clms Page number 12>
produits de PCR ont été analysés sur des gels d'agarose 2% en tampon IX TBE après coloration au bromure d'éthidium.
Une troisième amplification a été effectuée sur les clones pour lesquels des résultats discordants avaient été obtenus. Les vecteurs des résultats d'amplification ont été soumis à la banque ImpRH (Milan et al. 2000).
2) Cartographie FISH.
Les chromosomes en métaphase ont été obtenus à partir de cultures de lymphocytes de sang périphérique.
Pour identifier les chromosomes, les métaphases ont été marquées en bandes G en utilisant une technique G-T-G avant hybridation, et les images des meilleures métaphases ont été prises avec une imprimante vidéo comme décrit antérieurement (Yerle et al., 1992).
Les expériences d'hybridation in situ ont été réalisées conformément à Yerle et al. (Yerle et al., 1992). Avec quelques modifications (Sun et al., 1999).
3) Analyse de liaisons génétiques.
La distribution des données selon une loi normale a d'abord été vérifiée. Les quatre caractères présentaient des distributions logarithmiques normales et les données ont été transformées en scores logarithmiques avant analyse. La cartographie QTL a été effectuée en utilisant des techniques de vraissemblance maximum multipoints. Un test statistique défini comme le rapport des vraissemblances sous les hypothèses de un (Hl) contre pas (HO) de QTL lié au jeu de marqueurs considéré a été calculé en chaque position (chaque cM) le long du chromosome. La carte de marqueur du chromosome 7 utilisée a été calculée à partir des génotypes de plus de 1100 porcspar Bidanel et al. (2000). Selon l'hypothèse Hl, un QTL avec un effet de substitution de gène pour chaque père et mère a été adapté aux données. D'autres détails sur les procédures de calcul de probabilités peuvent être trouvés dans Bidanel et al. (2000). Les estimations des effets
<Desc/Clms Page number 13>
moyens de substitution ont été calculées à chaque position avec le plus fort rapport de probabilité.
Les seuils de signification le long des chromosomes ont été déterminés empiriquement en simulant les données en supposant un modèle infinitésimal et une distribution normale des performances. Un total de 50 000 simulations ont été réalisés pour chaque caractère. Le niveau de signification du test chromosomique Pc correspondant à un test de probabilité du génome entier Pg a été obtenu en utilisant la correction de Bonferroni, i. e. en tant que solution de : Pg = 1- (1-P,) 19, qui donne Pc = 0,0027 et 0,000054, respectivement, pour des niveaux significatif (Pg = 0,05) et très significatif (Knott et al., 1998).
4) Criblage de la banque d'ADN de BAC.
Les clones BAC ont été isolés par criblage PCR trois dimensions d'une banque porcine de clones BAC comme décrit précédemment (Rogel-Gaillard et al., 1999). Le clone BAC 383F4 contenant la séquence CBG de porc a été cloné en utilisant une paire d'amorces établie à partir de la séquence de l'exon 2 de CBG humaine :
FW : ACACCTGTCTTCTCTGGCTG (SEQ ID NO : 4)
REV : ACAGGCTGAAGGCAAAGTC (SEQ ID NO : 5)
Les PCR ont été réalisés sur 35 cycles de 30
secondes à 94 C, 30 secondes à 56 C, 30 secondes à 72 C, dans un volume de réaction de 20 gl contenant 0, 2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM de MgCl2 ; 8pM de chaque amorce, 2U de Taq DNA polymérase et de tampon de réaction (Perkin-Elmer, Roche).
FW : ACACCTGTCTTCTCTGGCTG (SEQ ID NO : 4)
REV : ACAGGCTGAAGGCAAAGTC (SEQ ID NO : 5)
Les PCR ont été réalisés sur 35 cycles de 30
secondes à 94 C, 30 secondes à 56 C, 30 secondes à 72 C, dans un volume de réaction de 20 gl contenant 0, 2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM de MgCl2 ; 8pM de chaque amorce, 2U de Taq DNA polymérase et de tampon de réaction (Perkin-Elmer, Roche).
5) Séquençage.
Les réactions de séquences ont été réalisées avec le kit Prism AmpliTaq FS diChloroRhodamine Dye Terminators (Perkin Elmer) sur un séquenceur automatique PE 970.
<Desc/Clms Page number 14>
La capacité de liaison de CBG et son affinité pour le cortisol ont été mesurées à 40C par un test de fixation en phase solide utilisant une colonne Concavalin A-Sepharose (Pugeat et al., 1984). La constante d'équilibre d'association (Ka) et la capacité de CBG pour le cortisol ont été calculées par une analyse de Scatchard utilisant bound comme la quantité de cortisol spécifiquement fixée aux glycoprotéines adsorbées sur le gel et free comme la concentration de cortisol dans la phase aqueuse.
7) Statistiques.
Les matrices de corrélation et le test Student t ont été effectués en utilisant la version 5 du logiciel Statistic.
II-Résultat.
1) La cartographie comparative permet de proposer le gène Cbg comme candidat au QTL d'hypercortisolémie.
Goureau et al. (2000) ont décrit lescorrespondances des segments de chromosomes humains et porcins en utilisant une analyse de peinture chromosomique bi-directionnelle. Le QTL cortisol flanqué par les marqueurs S0101 et Sw764 a été localisé sur la région porcine 7q2.4-7q2. 6. Parmi les gènes localisés sur la région hortologue humaine (Hsapl4q), le gène codant pour la CBG localisé en Hsapl4q32. 1 (Billingsley et al., 1993) a retenu l'attention. En effet 90% du cortisol plasmatique est fixé à la CBG qui est une glycoprotéine synthétisée par le foie. Puisque seulement le cortisol libre est actif, la CBG a un rôle majeur dans le bio-disponibilité du cortisol.
Ainsi, le gène Cbg constitue un bon candidat fonctionnel pour ce QTL associé à des niveaux de cortisol.
Puisque le gène Cbg avait été cloné chez l'homme, le singe, le mouton et la souris (Hammond et a 1.,
<Desc/Clms Page number 15>
1987 ; Hammond et al., 1994 ; Berdusco et al., 1993 ; Orava et al., 1994), il a été possible d'aligner les différentes séquences disponibles en utilisant le programme Multalin (Corpet, 1988) et de préparer des amorces oligonucléotidiques consensus à partir de l'exon 2 pour obtenir un fragment PCR de Cbg de porc. Après vérification de la forte homologie de la séquence du fragment PCR avec
le gène Cbg d'autres espèces, les amorces ont été utilisées pour cartographier le gène Cbg de porc en utilisant un panel d'hybrides irradiés (Yerle et al., 1988). Comme montré sur la figure 1, il a alors été trouvé que le gène Cbg de porc se trouve entre les marqueurs S0101 et SW764 comme le QTL cortisol.
le gène Cbg d'autres espèces, les amorces ont été utilisées pour cartographier le gène Cbg de porc en utilisant un panel d'hybrides irradiés (Yerle et al., 1988). Comme montré sur la figure 1, il a alors été trouvé que le gène Cbg de porc se trouve entre les marqueurs S0101 et SW764 comme le QTL cortisol.
Cette localisation chromosomique a été confirmée par hybridation in situ fluorescente (FISH). Tout d'abord une banque BAC génomique de porc a été criblée par PCR avec des amorces amplifiant l'exon 2 du gène Cbg de porc. Un clone de 150 kb, dénommé BAC 383F4, contenant la totalité de la séquence génomique du gène Cbg de porc a été obtenu. Ce clone BAC a été utilisé comme sonde pour cartographier le gène Cbg de porc par FISH sur un étalement de chromosomes en métaphase et, comme montré à la figure 2, il a été confirmé que le gène Cbg de porc se trouve en 7q26 du chromosome.
2) La capacité de liaison de la CBG est génétiquement liée aux marqueurs flanquant le QTL d'hypercortisolémie.
La capacité de liaison de la CBG au cortisol a été mesurée dans le plasma de 81 porcs F2 à partir du croisement d'origine, tous descendants du porc Fl #911045.
Comme attendu, une forte corrélation a été trouvée entre cette mesure et le niveau de cortisol (r = 0,57). La liaison génétique entre cette nouvelle mesure phénotypique et les marqueurs Ssc7 a été évaluée. La figure 3 montre qu'une forte liaison génétique est détectée exactement dans
<Desc/Clms Page number 16>
la même région que pour le QTL cortisol. La probabilité maximale est même supérieure avec les valeurs CBG (p < 5. 10-4) ce qui renforce l'implication du gène Cbg dans ce QTL.
3) La capacité de liaison de la CBG est différente entre les porcs LW et MS.
Au niveau des protéines, la capacité de liaison a u cortisol et la constante d'affinité de CBG ont été comparées entre les porcs LW et Meishan par des études de radio-liaison. Aucune différence d'affinité a été trouvée entre les 2 races de porc. Toutefois, comme le montre le tableau 1 ci-dessous, la capacité maximale de liaison était en moyenne 1.6 fois supérieure chez les porcs Meishan par rapport aux porcs LW (p < 0, 001).
Tableau 1
<tb>
<tb> Large <SEP> Meishan <SEP> t <SEP> p
<tb> White <SEP> n=12 <SEP> (Student
<tb> n=12 <SEP> test)
<tb> Bmax <SEP> 46, <SEP> 89 <SEP> 74, <SEP> 38 <SEP> 3, <SEP> 996 < 0, <SEP> 001
<tb> (nM/l <SEP> de <SEP> 4,83 <SEP> 5, <SEP> 95
<tb> sang)
<tb> Kd <SEP> (nM) <SEP> 0,38 <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> 1, <SEP> 038 < 0, <SEP> 3
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> 0,05
<tb>
<tb> Large <SEP> Meishan <SEP> t <SEP> p
<tb> White <SEP> n=12 <SEP> (Student
<tb> n=12 <SEP> test)
<tb> Bmax <SEP> 46, <SEP> 89 <SEP> 74, <SEP> 38 <SEP> 3, <SEP> 996 < 0, <SEP> 001
<tb> (nM/l <SEP> de <SEP> 4,83 <SEP> 5, <SEP> 95
<tb> sang)
<tb> Kd <SEP> (nM) <SEP> 0,38 <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> 1, <SEP> 038 < 0, <SEP> 3
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> 0,05
<tb>
4) Identification d'une mutation dans le gène Cbg.
Le clone BAC 383F4 a permis d'identifier l'organisation génomique et la séquence du gène Cbg qui n'avait jamais été clonée auparavant. Comme dans les autres espèces, le gène Cbg de porc contient 5 exons avec un codon AUG dans l'exon 2. Au niveau des acides aminés, les Inventeurs ont trouvé 66% et 80% d'homologie entre la protéine CBG de porc et respectivement celles de l'humain et de mouton.
<Desc/Clms Page number 17>
Afin de rechercher des mutations, les exons et 900pb de la région du promoteur d'un animal FI, de son père LW et de sa mère Meishan ont été séquencés. Il a été considéré que ce porc Fl (#911045) devait être hétérozygote au QTL puisqu'il y avait une différence significative dans les niveaux moyens de cortisol entre la progéniture qui avait reçu l'un ou l'autre allèle du marqueur S0101 flnquant le QTL. En conséquence, la mère Meishan devrait avoir au moins un allèle différent du père LW au niveau de la mutation en cause. Une mutation de ce type a été identifiée dans l'exon 2 du porc Fl #9110045. En position +15 à partir du codon de départ ATG, cet animal est
hétérozygote avec une mutation ponctuelle G --7 T sur un allèle (figure 4). Cette substitution G --7 T correspondant au codon 15, change une sérine en une isoleucine dans le peptide signal de la protéine CBG. Le test d'amplification par PCR a été optimisé avec les paramètres suivants :
Amorce sens : 5'-CCCTGTATGCCTGTCTCCTC-3'Amorce antisens : 5'-CCTGCTCCAAGAACAAGTCC-3'
Conditions PCR : lx tampon PCR (Promega), 1. 5mM MgCl2, 100 uM dNTP, 10 pmol de chaque amorce, 0.4 U Taq polymerase (Promega).
hétérozygote avec une mutation ponctuelle G --7 T sur un allèle (figure 4). Cette substitution G --7 T correspondant au codon 15, change une sérine en une isoleucine dans le peptide signal de la protéine CBG. Le test d'amplification par PCR a été optimisé avec les paramètres suivants :
Amorce sens : 5'-CCCTGTATGCCTGTCTCCTC-3'Amorce antisens : 5'-CCTGCTCCAAGAACAAGTCC-3'
Conditions PCR : lx tampon PCR (Promega), 1. 5mM MgCl2, 100 uM dNTP, 10 pmol de chaque amorce, 0.4 U Taq polymerase (Promega).
Programme du thermocycleur :
1) 96 C : 5 min
2) 92 C : 30 s
3) 60 C : 1 min
4) 72 C : 30s
5) etape 2) 3) et 4) 34 fois
6) 72 C 2 min
1) 96 C : 5 min
2) 92 C : 30 s
3) 60 C : 1 min
4) 72 C : 30s
5) etape 2) 3) et 4) 34 fois
6) 72 C 2 min
<Desc/Clms Page number 18>
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Armario, A., Gavalda, A., and Marti, J.
(1995). Comparison of the behavioural and endocrine response to forced swimming stress in five inbred strains of rats. Psychoneuroendocrinology 20 : 879-890.
- Berdusco, E. T., Hammond, G. L., Jacobs, R.
A., Grolla, A., Akagi, K., Langlois, D., and Challis, J. R. (1993). Glucocorticoid-induced increase in plasma corticosteroid-binding globulin levels in fetal sheep is associated with increased biosynthesis and alterations in glycosylation. Endocrinology 132 : 2001-2008.
- Bidanel, J. P., Milan, D., Chevalet, C., Woloszyn, N., Bourgeois, F., Caritez, J. C., Gruand, J., Le Roy, P., Bonneau, M., Lefaucheur, L., Mourot, J., Prunier, M., Désautés, C., Mormède, P., Renard, C., Vaiman, M., Robic, A., Gellin, J., and Olivier, L. (1998). Détection de locus à effets quantitatifs dans le croisement entre les races porcines Large White et meishan. Dispositif expérimental et premiers résultats. Journées Rech Porcine en France 30 : 117-125.
- Bidanel, J. P., Milan, D., Iannuccelli, N., Amigues, Y., Bosher, M.-Y., Bourgeois, F., Caritez, J.-C., Gruand, J., Le Roy, P., Lagand, H. B. M., Lefaucheur, L., Mourot, J., Prunier, A., Désautés, C., Mormède, P., Renard, C., Vaiman, M., Robic, A., Gellin, J., Olivier, L., and Chevalet, C. (2000). Détection de locus à effets quantitatifs dans le croisement entre les races porcines Large White et Meishan : Résultats et Perspectives. Journées Rech Porcine en France 32 : 369-383.
- Billingsley, G. D., Walter, M. A., Hammond, G. L., and Cox, D. W. (1993). Physical mapping of four serpin genes : alpha l-antitrypsin, alpha 1antichymotrypsin, corticosteroid-binding globulin, and
<Desc/Clms Page number 19>
protein C inhibitor, within a 280-kb region on chromosome I4q32. 1. Am J Hum Genet 52 : 343-353.
- Buemann, B., Vohl, M. C., Chagnon, M., Chagnon, Y. C., Gagnon, J., Perusse, L., Dionne, F., Despres, J. P., Tremblay, A., Nadeau, A., and Bouchard, C.
(1997). Abdominal visceral fat is associated with a BclI restriction fragment length polymorphism at the glucocorticoid receptor gene locus. Obes Res 5 : 186-192.
- Corpet, F. (1988). Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 16 : 10881-10890.
- Crave, J. C., Lejeune, H., Brebant, C., Baret, C., and Pugeat, M. (1995). Differential effects of insulin and insulin-like growth factor I on the production of plasma steroid-binding globulins by human hepatoblastoma-derived (Hep G2) cells. J Clin Endocrinol Metab 80 : 1283-1289.
- Désautés, C., Bidanel, J. P., and Mormède, P.
(1997). Genetic study of behavioral and pituitaryadrenocortical reactivity in response to an environmental challenge in pigs. Physiol Behav 62 : 337-345.
- Désautés, C., Sarrieau, A., Caritez, J. C., and Mormède, P. (1999). Behavior and pituitary-adrenal function in Large White and Meishan pigs. Domestic animal endocrinology 16 : 193-205.
- Emptoz-Bonneton, A., Cousin, P., Seguchi, K., Avvakumov, G. V., Bully, C., Hammond, G. L., and Pugeat, M. (2000). Novel human corticosteroid-binding globulin variant with low cortisol- binding aff ini ty. J Clin Endocrinol Metab 85 : 361-367.
Fernandez-Real, J. M., Grasa, M., Casamitjana, R., Pugeat, M., Barret, C., and Ricart, W.
(1999). Plasma total and glycosylated corticosteroidbinding globulin levels are associated with insulin secretion. J Clin Endocrinol Metab 84 : 3192-3196.
<Desc/Clms Page number 20>
Fernandez-Real, J. M., Grasa, M., Casamitjana, R., and Ricart, W. (2000). The insulin resistance syndrome and the binding capacity of cortisol binding globulin (CBG) in men and women. Clin Endocrinol (Oxf) 52 : 93-99.
- Goureau, A., Vignoles, M., Pinton, P., Gellin, J., and Yerle, M. (2000). Improvement of comparative map between porcine chromosomes 1 and 7 and human chromosomes 6,14, and 15 by using human YACs. Mamm Genome 11 : 796-799.
- Hammond, G. L. (1995). Potential functions of plasma steroid-binding proteins. Trends in Endocrinology and Metabolism 6 : 298-304.
- Hammond, G. L., Smith, C. L., Goping, I. S., Underhill, D. A., Harley, M. J., Reventos, J., Musto, N.
A., Gunsalus, G. L., and Bardin, C. W. (1987). Primary structure of human corticosteroid binding globulin, deduced from hepatic and pulmonary cDNAs, exhibits homology with serine protease inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 84 : 5153-5157.
- Hammond, G. L., Smith, C. L., Lahteenmaki, P., Grolla, A., Warmels-Rodenhiser, S., Hodgert, H., Murai, J. T., and Siiteri, P. K. (1994). Squirrel monkey corticosteroid-binding globulin : primary structure and comparison with the human protein. Endocrinology 134 : 891- 898.
- Hammond, G. L., Smith, C. L., Paterson, N.
A., and Sibbald, W. J. (1990). A role for corticosteroid-
binding globulin in delivery of cortisol to activated neutrophils. J Clin Endocrinol Metab 71 : 34-39.
binding globulin in delivery of cortisol to activated neutrophils. J Clin Endocrinol Metab 71 : 34-39.
- Kirschbaum, C., Wust, S., Faig, H. G., and Hellhammer, D. H. (1992). Heritability of cortisol responses to human corticotropin-releasing hormone, ergometry, and psychological stress in humans. J Clin Endocrinol Metab 75 : 1526-1530.
<Desc/Clms Page number 21>
- Knott, S. A., Marklund, L., Haley, C. S., Andersson, K., Davies, W., Ellegren, H., Fredholm, M., Hansson, I., Hoyheim, B., Lundstrom, K., Moller, M., and Andersson, L. (1998). Multiple marker mapping of quantitative trait loci in a cross between outbred wild boar and large white pigs. Genetics 149 : 1069-1080.
- Linkowski, P., Van Onderbergen, A., Kerkhofs, M., Bosson, D., Mendlewicz, J., and Van Cauter, E. (1993). Twin study of the 24-h cortisol profile : evidence for genetic control of the human circadian clock. Am J Physiol 264 : E173-E181.
- Lupien, S. J., de Leon, M., de Santi, S., Convit, A., Tarshish, C., Nair, N. P., Thakur, M., McEwen, B. S., Hauger, R. L., and Meaney, M. J. (1998). Cortisol levels during human aging predict hippocampal atrophy and
memory deficits [see comments published erratum appears in Nat Neurosci 1998 Aug ; l (4) : 329]. Nat Neurosci 1 : 69-73.
memory deficits [see comments published erratum appears in Nat Neurosci 1998 Aug ; l (4) : 329]. Nat Neurosci 1 : 69-73.
- Marissal-Arvy, N., Mormede, P., and Sarrieau, A. (1999). Strain differences in corticosteroid receptor efficiencies and regulation in Brown Norway and Fischer 344 rats. J Neuroendocrinol 11 : 267-273.
- Marissal-Arvy, N., Ribot, E., Sarrieau, A., and Mormede, P. (2000). Is the mineralocorticoid receptor in Brown Norway rats constitutively active ? J Neuroendocrinol 12 : 576-588.
- Meikle, A. W., Stringham, J. D., Woodward, M.
G., and Bishop, D. T. (1988). Heritability of variation of plasma cortisol levels. Metabolism 37 : 514-517.
- Milan, D., Hawken, R., Cabau, C., Leroux, S., Genet, C., Lahbib, Y., Tosser, G., Robic, A., Hatey, F., Alexander, L., Beattie, C., Schook, L., Yerle, M., and Gellin, J. (2000). IMpRH server : an RH mapping server available on the Web [In Process Citation]. Bioinformatics 16 : 558-559.
<Desc/Clms Page number 22>
- Moisan, M. P., Courvoisier, H., Bihoreau, M.
T., Gauguier, D., Hendley, E. D., Lathrop, M., James, M. R., and Mormède, P. (1996). A major quantitative trait locus influences hyperactivity in the WKHA rat. Nat Genet 14 : 471-473.
- Mormède, P., Dantzer, R., Bluthe, R.-M., and Caritez, J.-C. (1984). Differences in adaptive abilities of three breeds of chinese pigs. Genet Sel Evol 16 : 85-102.
- Orava, M., Zhao, X. F., Leiter, E., and Hammond, G. L. (1994). Structure and chromosomal location of the gene encoding mouse corticosteroid-binding globulin : strain differences in coding sequence and steroid-binding activity. Gene 144 : 259-264.
- Piazza, P. V. and Le Moal, M. (1998). The role of stress in drug self-administration. Trends Pharmacol Sci 19 : 67-74.
- Pugeat, M. M., Chrousos, G. P., Nisula, B.
C., Loriaux, D. L., Brandon, D., and Lipsett, M. B. (1984).
Plasma cortisol transport and primate evolution.
Endocrinology 115 : 357-361.
- Rogel-Gaillard, C., Bourgeaux, N., Billault, A., Vaiman, M., and Chardon, P. (1999). Construction of a swine BAC library : application to the characterization and mapping of porcine type C endoviral elements. Cytogenet Cell Genet 85 : 205-211.
- Rosmond, R., Dallman, M. F., and Bjorntorp, P. (1998). Stress-related cortisol secretion in men : relationships with abdominal obesity and endocrine, metabolic and hemodynamic abnormalities [see comments]. J Clin Endocrinol Metab 83 : 1853-1859.
- Sambrook, J. Fritsch, E. F., and Maniatis, T.
1989 Molecular cloning : A laboratory manual, 2"sedition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
<Desc/Clms Page number 23>
- Smith, C. L. and Hammond, G. L. (1991). An amino acid substitution in biobreeding rat corticosteroid binding globulin results in reduced steroid binding affinity. J Biol Chem 266 : 18555-18559.
- Smith, C. L., Power, S. G., and Hammond, G.
L. (1992). A Leu----His substitution at residue 93 in human corticosteroid binding globulin results in reduced affinity for cortisol. J Steroid Biochem Mol Biol 42 : 671-676.
- Sternberg, E. and Gold, P. (1997). Emotions and disease. From balance of humors to balance of molecule.
Nature Medicine 3 : 264-267.
- Sun, H. F., Ernst, C. W., Yerle, M., Pinton, P., Rothschild, M. F., Chardon, P., Rogel-Gaillard, C., and Tuggle, C. K. (1999). Human chromosome 3 and pig chromosome 13 show complete synteny conservation but extensive geneorder differences. Cytogenet Cell Genet 85 : 273-278.
- Torpy, D. J., Bachmann, A. W., Grice, J. E., Fitzgerald, S. P., Phillips, P. J., Whitworth, J. A., Jackson, R. V. (2001) in press J Clin Endocrinol Metab 86 (6) - Van Baelen, H., Brepoels, R., and De Moor, P.
(1982). Transcortin Leuven : a variant of human corticosteroid-binding globulin with decreased cortisolbinding affinity. J Biol Chem 257 : 3397-3400.
- Warden, C. H., Fisler, J. S., Shoemaker, S.
M., Wen, P. Z., Svenson, K. L., Pace, M. J., and Lusis, A.
J. (1995). Identification of four chromosomal loci determining obesity in a multifactorial mouse model. J Clin Invest 95 : 1545-1552.
- Yerle, M., Galman, O., Lahbib-Mansais, Y., and Gellin, J. (1992). Localization of the pig luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor gene (LHCGR) by radioactive and nonradioactive in situ hybridization.
Cytogenet Cell Genet 59 : 48-51.
- Yerle, M., Pinton, P., Robic, A., Alfonso, A., Palvadeau, Y., Delcros, C., Hawken, R., Alexander, L.,
<Desc/Clms Page number 24>
Beattie, C., Schook, L., Milan, D., and Gellin, J. (1998). Construction of a whole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs. Cytogenet Cell Genet 82 : 182-188.
Claims (9)
1) Méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phénotype d'hypercortisolémie caractérisée en ce qu'elle comprend la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus,
comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes.
2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique sont des séquences d'ADN génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3'ou 5'adjacente éloignée préférentiellement au plus de lOOkb.
3) Un marqueur polymorphe responsable du phénotype d'hypercortisolémie constitué de tout ou partie
d'une séquence d'acide nucléique contenu dans le gène Cbg ou les séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb.
4) Un marqueur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant des microsatellites, des polymorphismes d'insertion/délétion, des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) ou des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP).
5) Une amorce nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend de 5 à 50 de préférence de 10 à 30
nucléotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3'ou 5'adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb, flanquant un marqueur selon l'une des revendications 3 ou 4.
<Desc/Clms Page number 26>
6) Méthode de criblage génétique pour identifier les individus susceptibles de développer une hypercortisolémie et les pathologies associées, à l'aide de marqueurs polymorphes, caractérisée en ce qu'elle comprend : i) la purification d'ADN génomique d'un individu, puis ii) l'amplification du locus contenant un marqueur polymorphe selon l'une des revendications 3 ou 4 par PCR à partir dudit ADN, et iii) la détection du ou des les allèles dudit marqueur polymorphe dans ledit ADN amplifié.
7) Un kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon la revendication 6 permettant de tester les marqueurs génétiques de l'hypercortisolémie à partir d'un échantillon d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces nucléotidiques selon la revendication 5, des réactifs de PCR, et éventuellement des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs.
8) Utilisation de la méthode selon la revendication 6 pour le diagnostic d'une hypercortisolémie ou d'une prédisposition à une hypercortisolémie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus.
<Desc/Clms Page number 27>
9) Utilisation de la méthode selon la revendication 6 pour la sélection d'animaux, plus particulièrement d'animaux d'élevage.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0114156A FR2831556B1 (fr) | 2001-10-31 | 2001-10-31 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
| FR0209551A FR2831890B1 (fr) | 2001-10-31 | 2002-07-26 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
| PCT/FR2002/003762 WO2003038124A1 (fr) | 2001-10-31 | 2002-10-31 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
| JP2003540389A JP2005507262A (ja) | 2001-10-31 | 2002-10-31 | 高コルチゾール血症及びそれに関連する病変の遺伝子マーカーとしてのｃｂｇ遺伝子の用法 |
| CA002465320A CA2465320A1 (fr) | 2001-10-31 | 2002-10-31 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
| EP02785578A EP1440164A1 (fr) | 2001-10-31 | 2002-10-31 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
| US10/833,970 US20040248179A1 (en) | 2001-10-31 | 2004-04-28 | Cbg gene as a genetic marker of hypercortisolism and associated pathologies |
| US11/890,368 US20080115236A1 (en) | 2001-10-31 | 2007-08-06 | CBG gene as a genetic marker of hypercortisolism and associated pathologies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0114156A FR2831556B1 (fr) | 2001-10-31 | 2001-10-31 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2831556A1 true FR2831556A1 (fr) | 2003-05-02 |
| FR2831556B1 FR2831556B1 (fr) | 2004-02-13 |
Family
ID=8868978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0114156A Expired - Fee Related FR2831556B1 (fr) | 2001-10-31 | 2001-10-31 | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2831556B1 (fr) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035602A1 (fr) * | 1996-03-22 | 1997-10-02 | Smithkline Beecham Plc | Utilisation de l'antagoniste du recepteur de la vasopressine pour reguler la liberation de l'acth |
-
2001
- 2001-10-31 FR FR0114156A patent/FR2831556B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035602A1 (fr) * | 1996-03-22 | 1997-10-02 | Smithkline Beecham Plc | Utilisation de l'antagoniste du recepteur de la vasopressine pour reguler la liberation de l'acth |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MARISSAL-ARVY N ET AL: "Strain differences in corticosteroid receptor efficiencies and regulation in Brown Norway and Fischer rats", JOURNAL OF NEUROENDOCRINOLOGY, vol. 11, 1999, pages 267 - 73, XP002204421 * |
| ROLLINI P ET AL: "Long-range chromatin reorganization of the human serpin gene cluster at 14q32.1 accompanies gene activation and extinction in microcell hybrids", GENOMICS, vol. 56, no. 1, February 1999 (1999-02-01), pages 22 - 30, XP002204420 * |
| UNDERHILL D A ET AL: "cis-Regulatory elements within the proximal promoter of the rat gene encoding corticosteroid-binding globulin", GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, vol. 162, no. 2, 11 September 1995 (1995-09-11), pages 205 - 211, XP004042017, ISSN: 0378-1119 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2831556B1 (fr) | 2004-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| King et al. | Variation in the oxytocin receptor gene predicts brain region–specific expression and social attachment | |
| Ousova et al. | Corticosteroid binding globulin: a new target for cortisol-driven obesity | |
| Tryon et al. | Homozygosity mapping approach identifies a missense mutation in equine cyclophilin B (PPIB) associated with HERDA in the American Quarter Horse | |
| US8017324B1 (en) | ENPP1 (PC-1) gene haplotype associated with the risk of obesity and type 2 diabetes and their applications | |
| Saadi et al. | Molecular genetics of cystinuria: Mutation analysis of SLC3A1 and evidence for another gene in the type I (silent) phenotype | |
| Cirera et al. | New insights into the melanophilin (MLPH) gene controlling coat color phenotypes in American mink | |
| Chung et al. | Genetic Modifiers ofLeprfaAssociated with Variability in Insulin Production and Susceptibility to NIDDM | |
| Isaacs et al. | Identification of two new Pmp22 mouse mutants using large-scale mutagenesis and a novel rapid mapping strategy | |
| Fife et al. | Multipoint linkage analysis of a candidate gene locus in rheumatoid arthritis demonstrates significant evidence of linkage and association with the corticotropin‐releasing hormone genomic region | |
| Jenkinson et al. | Novel polymorphisms in the neuropeptide-Y Y5 receptor associated with obesity in Pima Indians | |
| Christensen et al. | TEAD3, implicated by association to grilsing in Atlantic salmon | |
| Nielsen et al. | Association of DNA polymorphism in the growth‐hormone gene with basal‐plasma growth‐hormone concentration and production traits in pigs | |
| JP5686335B2 (ja) | 筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー、及び、方法、並びに、筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル動物、及び、モデル細胞 | |
| Peters et al. | Alopecia in a novel mouse model RCO3 is caused by mK6irs1 deficiency | |
| Runkel et al. | Grey, a novel mutation in the murine Lyst gene, causes the beige phenotype by skipping of exon 25 | |
| Cieslak et al. | Polymorphisms in the promoter region of the adiponectin (ADIPOQ) gene are presumably associated with transcription level and carcass traits in pigs | |
| Kooistra et al. | Strain-specific modifier genes of Cecr2-associated exencephaly in mice: genetic analysis and identification of differentially expressed candidate genes | |
| JP2009533047A (ja) | 機能的膵β細胞を調製するためのＧＬＩＳ３の使用 | |
| Vaingankar et al. | Long human CHGA flanking chromosome 14 sequence required for optimal BAC transgenic “rescue” of disease phenotypes in the mouse Chga knockout | |
| Collin et al. | Genetic modifiers interact with Cpe fat to affect body weight, adiposity, and hyperglycemia | |
| AU752138B2 (en) | A DNA molecule encoding a mutant prepro-neuropeptide Y, a mutant signal peptide, and uses thereof | |
| FR2831890A1 (fr) | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees | |
| FR2831556A1 (fr) | Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees | |
| Jiang et al. | A missense mutation in the follicle stimulating hormone receptor (FSHR) gene shows different allele effects on litter size in Chinese Erhualian and German Landrace pigs | |
| WO2001081633A1 (fr) | Association de polymorphismes de la proteine kinase c zeta aux diabetes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20100630 |