JP2005507238A - Transporters and ion channels - Google Patents

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Abstract

本発明はヒト輸送体およびイオンチャネル(TRICH)、並びにTRICHを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、TRICHの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。The present invention provides human transporters and ion channels (TRICH), and polynucleotides that identify and encode TRICH. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disease associated with abnormal expression of TRICH.

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸送体及びイオンチャネルの核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、輸送障害、神経疾患、筋疾患、免疫疾患、および細胞増殖異常の、診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、輸送体及びイオンチャネルの核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞は、殆どの極性分子にとって高度に非浸透性であるような疎水性脂質二重層膜に囲まれ、この膜によって機能的に異なるオルガネラに細区画される。細胞及びオルガネラは、必須栄養素及び、K+、NH4 +、Pi、SO4 2-を含む金属イオン、糖、ビタミン及び種々の代謝廃棄物を移出入するための輸送タンパク質を必要とする。輸送タンパク質は、抗生物質抵抗性、毒素分泌、イオンバランス、シナプス神経伝達、腎機能、腸管吸収、腫瘍成長及びその他の多様な細胞機能においても役割を果たす（Griffith, J. および C. Sansom (1998) The Transporter Facts Book. Academic Press, San Diego CA, 3-29ページ）。輸送は、受動的な濃度依存メカニズムによって起こるか、或いはATP加水分解またはイオン勾配などのエネルギー源に関連し得る。輸送で機能するタンパク質には、キャリアータンパク質及びチャネルタンパク質がある。キャリアータンパク質は、特定の溶質に結合して、あるコンフォメーションの変化を起こし、その変化によって結合した溶質が膜を通過できるようにする。チャネルタンパク質は、特定の溶質が電気化学的溶質勾配に従って膜を通過して拡散することができるような疎水性ポアを形成する。
【０００３】
膜の一方の側から他方の側へ単一溶質を輸送するキャリアタンパク質をユニポーターと呼ぶ。対照的に、共役輸送体は、１つの溶質の移動を第２溶質の移動に連結させ、その移動は同時または順次に起こるかのいずれかであり、移動の方向は同一方向（シンポート）または逆方向（アンチポート）のいずれかである。例えば、腸管及び腎臓の上皮は、原形質膜内外のナトリウム勾配によって駆動される種々のシンポーター系を含む。ナトリウムは、電気化学勾配に従って細胞内に移動し、その移動と共に溶質を細胞内に運ぶ。溶質を取り込むための駆動力を供給するナトリウム勾配は、遍在性のNa+/K+ ATP分解酵素系によって維持される。ナトリウム共役輸送体には、哺乳動物グルコース輸送体（SGLT1）、ヨウ化物輸送体（NIS）及びマルチビタミン輸送体（SMVT）がある。３つの輸送体はすべて、１２個の推定上の膜貫通セグメント、細胞外グリコシル化部位、並びに細胞質内側にあるN末端及びC末端を有する。NISは、放射性ヨウ素甲状腺イメージング技術及び甲状腺への放射性同位元素の特異的標的化の分子的基礎であるため、種々の甲状腺病理の評価、診断及び治療において重大な役割を果たす（Levy, O. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5568-5573）。SMVTは、腸管粘膜、腎臓及び胎盤において発現され、ビオチンやパントテン酸などの水溶性ビタミンの輸送に関与していると考えられる（Prasad, P. D. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:7501-7506）。
【０００４】
MFS（major facilitator superfamily）は、輸送体の最大ファミリーの１つであり、ユニポーター−シンポーター−アンチポーターファミリーとも呼ばれる。MFS輸送体は、イオン勾配に応じて小溶質を輸送する、単一ポリペプチドキャリアである。MFSのメンバーは、すべてのクラスの生物に見られ、糖、オリゴ糖、リン酸、硝酸、ヌクレオシド、モノカルボン酸及び薬剤のための輸送体を含む。真核生物に見られるMFS輸送体はすべて１２個の膜貫通セグメントを含む構成となっている（Pao, S. S. 他 (1998) Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:1-34）。MFS輸送体の最大のファミリーは糖輸送体ファミリーであり、ヒトに見られるような、グルコース及びその他の六炭糖の輸送に必要な７つのグルコース輸送体（GLUT1〜GLUT7）を含む。これらのグルコース輸送タンパク質は、独自の組織分布及び生理学的機能を有する。GLUT1は、基底板でのグルコース要求を有する多くの細胞型に提供して、上皮及び内皮の障壁組織を通ってグルコースを輸送し、GLUT2はグルコースの取り込みまたは肝臓からの流出を促進し、GLUT3はニューロンへのグルコースの供給を調整し、GLUT4はインシュリンによって調整されるグルコース分解に関与し、GLUT5は骨格筋へのフルクトースの取り込みを調節する。グルコース輸送体の欠陥は、最近同定された神経症候群であって、グリコーゲン貯蔵病、ファンコーニ−ビッケル症候群、及び非インスリン依存糖尿病のみならず、乳幼児けいれん及び発達遅滞の原因となるような神経症候群に関与している（Mueckler, M. (1994) Eur. J. Biochem. 219:713-725、Longo, N. および L. J. Elsas (1998) Adv. Pediatr. 45:293-313）。
【０００５】
モノカルボン酸アニオン輸送体は、L-乳酸、ピルビン酸及びケトン体アセテート、アセトアセテート及びβヒドロキシ酪酸を含む広範な基質特異性を有するプロトン共役シンポーターである。これまでに少なくとも７つのアイソフォームが同定されている。アイソフォームは、TM6とTM7との間に大きな細胞内ループを有する１２個の膜貫通（TM）らせん状ドメインを有し、解糖中に乳酸と共に化学量論的に生成されるプロトンを除去することにより、細胞内pHを維持する際に重要な役割を果たすと推定されている。最も良く特徴付けられたH+ モノカルボン酸輸送体は、L-乳酸及び広範囲の他の脂肪族モノカルボン酸を輸送する赤血球膜の輸送体である。その他の細胞は、異なる基質及び抑制因子選択性を有するH+ 共役モノカルボン酸輸送体を含む。特に心筋及び腫瘍細胞は、或る基質に対するKm値（D-乳酸よりL-乳酸を選択する立体化学的選択性を含む）及び抑制因子に対する感受性が異なる輸送体を有する。腸管及び肝臓上皮の管腔表面にNa+ モノカルボン酸共輸送体があり、それによってこれらの組織における乳酸、ピルビン酸及びケトン体の取り込みが可能になる。更に、肝臓、腸及び肺を含む器官に、有機カチオン及び有機アニオンのための特異的且つ選択的な輸送体がある。有機アニオン輸送体は、電子求引性側鎖を有する疎水性、荷電分子に選択的である。アンモニウム輸送体などの有機カチオン輸送体は、種々の薬剤及び内因性代謝の分泌を媒介し、細胞内pHの維持に寄与する（Poole, R. C. および A. P. Halestrap (1993) Am. J. Physiol. 264 : C761-C782、Price, N. T. 他 (1998) Biochem. J. 329 : 321-328、Martinelle, K. および I. Haggstrom (1993) J. Biotechnol. 30 : 339-350）。
【０００６】
ATP結合カセット（ABC）輸送体は、イオン、糖、アミノ酸、ペプチド、リン脂質のような小分子からリポペプチド、大タンパク質、及び複合体疎水性薬剤までに及ぶ基質を輸送するような、膜タンパク質のスーパーファミリーのメンバーである。ABC輸送体は、４つのモジュール即ち２つのヌクレオチド結合ドメイン（NBD）及び２つの膜貫通ドメイン（MSD）を含む。NBDは、ATPを加水分解して輸送に必要なエネルギーを供給し、各MSDは、推定上の６つの膜貫通セグメントを含む。これら４つのモジュールは、単一の遺伝子または別々の遺伝子によりコードし得る。 単一の遺伝子によりコードし得るのは、嚢胞性繊維症膜通過伝導制御因子（CFTR）に対する場合などである。別々の遺伝子にコードされる場合には、各遺伝子産物には１つのNBD及び１つのMSDが含まれる。これらの「半分子」は、小胞体での主要組織適合複合体（MHC）ペプチド輸送系であるTap1及びTap2などのホモ及びヘテロ二量体を形成する。幾つかの遺伝病は、ABC輸送体の欠陥に起因する。疾患及びそれに対応するタンパク質の例としては、嚢胞性繊維症（CFTR、イオンチャネル）、副腎白質ジストロフィー（副腎白質ジストロフィータンパク質、ALDP）、ツェルヴェーガー症候群（ペルオキシソームの膜タンパク質-70、PMP70）及び高インシュリン性低血糖症（スルホニル尿素受容体、SUR）がある。別のABC輸送体である多剤耐性（MDR）タンパク質がヒトの癌細胞において過剰発現すると、化学療法に用いられる種々の細胞毒性薬剤に対して細胞が耐性を有する（Taglicht, D. および S. Michaelis (1998) Meth. Enzymol. 292 : 130-162）。
【０００７】
鉄、亜鉛、銅、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン、ニッケル、クロムなどの多数の金属イオンは、多数の酵素に対する補助因子として重要である。例えば、銅は、スーパーオキシドジスムターゼ、フェロキシダーゼ（セルロプラスミン）及びリシルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼにおいて補助因子として作用することにより、ヘモグロビン合成、結合組織代謝及び骨格の発達に関与する。銅及びその他の金属イオンは、食餌中に与えなければならないものであり、消化管で輸送体に吸収される。血漿タンパク質は、金属イオンを肝臓及びその他の標的器官へ輸送し、ここで特異輸送体が必要に応じてイオンを細胞及び細胞のオルガネラに移動させる。金属イオンでの代謝の不均衡は、多数の疾患状態に関連してきた（Danks, D. M. (1986) J. Med. Genet. 23 : 99-106）。
【０００８】
原形質膜を通過する脂肪酸の輸送は、高容量で低親和性プロセスである拡散により起こる。しかしながら、通常の生理学的条件下では、脂肪酸輸送の内の有意の割合が高親和性、低容量のタンパク質媒介輸送プロセスによって起こっているように見える。脂肪酸輸送タンパク質（FATP）は、４つの膜貫通セグメントを有する膜内在性タンパク質であり、筋肉、心臓及び脂肪などの、高レベルの原形質膜脂肪酸流入を示す組織において発現される。FATPの発現は、脂肪変換中に3T3-L1細胞において上方制御され、COS7線維芽細胞における発現は、長鎖脂肪酸の取り込みを増加させる（Hui, T. Y. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273 : 27420-27429）。
【０００９】
ミトコンドリアキャリアタンパク質は、サイトゾル及びミトコンドリア基質の間でイオン及び荷電代謝産物を輸送する膜貫通タンパク質である。例として、ADP、ATPキャリアタンパク質、2-オキソグルタル酸／リンゴ酸キャリア、リン酸キャリアタンパク質、ピルビン酸キャリア、ジカルボン酸キャリア（リンゴ酸、コハク酸、フマル酸及びリン酸を輸送する）、トリカルボン酸キャリア（クエン酸及びリンゴ酸を輸送する）、及びグレーブス病キャリアタンパク質、即ち甲状腺機能亢進症の原因となる自己免疫異常である活性グレーブス病を患った患者のIgGにより認識されたタンパク質がある。このファミリーのタンパク質は、約１００アミノ酸ドメインの３つのタンデムリピートからなり、各タンデムリピートは２つの膜貫通領域を有する（Stryer, L. (1995) Biochemistrv, W. H. Freeman and Company, New York NY, p. 551、PROSITE PDOC00189 Mitochondrial energy transfer proteins signature、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) *275000 Graves Disease）。
【００１０】
このクラスの輸送体には、またミトコンドリア脱共役タンパク質も含まれる。この脱共役タンパク質はミトコンドリア内膜でプロトンリークを起こさせ、酸化的リン酸化をATP合成から脱共役させる。結果として、熱の形態でのエネルギー散逸が起こる。ミトコンドリア脱共役タンパク質は、温度調節及び代謝率のモジュレーターとみなされ、肥満症などの代謝病に対する薬剤の潜在的標的として提案されてきた（Ricquier, D. 他 (1999) J. Int. Med. 245 : 637-642）。
【００１１】
尿素輸送体（UT、UrT）は、尿素排出と水のバランスで中心的な役割を果たすが、後者は腎臓髄質での尿素の蓄積と濃縮をさせて行う（Hediger, M.A. 他 (1996) Kidney Int. 49:16151623）。尿素は尿中に見つかる主要な溶質であり、哺乳類が窒素老廃物を廃棄する主な手段である。尿素輸送体タンパク質は、赤血球（UT-B）と腎臓髄質（UT-A）で同定されている。腎尿素輸送体（UT-A）のいくつかのアイソフォームがクローンされている（例えば、UT-A1、UT-A2、UT-A3、UT-A4）。UT-A2は尿毒症に応じて上方制御される可能性がある。UT-A3は精巣で発現されている可能性がある。尿素輸送体はは脳でも発現されている可能性がある（Karakashian, A. 他 (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 1999 10:230237; Couriaud, C. 他 (1996) Biochim Biophys Acta. 1996 1309:19719）。少なくとも２つの異なるクラスの尿素輸送体（恒常的に発現される輸送体とバソプレシン調節性輸送体）がヒトにある（Olives, B. 他 (1996) FEBS Lett. 386:156160）。
【００１２】
鉄、亜鉛、銅、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン、ニッケル、クロムなどの多数の金属イオンは、多数の酵素に対する補助因子として重要である。例えば、銅は、スーパーオキシドジスムターゼ、フェロキシダーゼ（セルロプラスミン）及びリシルオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼにおいて補助因子として作用することにより、ヘモグロビン合成、結合組織代謝及び骨格の発達に関与する。銅及びその他の金属イオンは、食餌から取らなければならないものであり、消化管で輸送体に吸収される。血漿タンパク質は、金属イオンを肝臓及びその他の標的器官へ輸送し、ここで特異輸送体が必要に応じてイオンを細胞及び細胞のオルガネラに移動させる。金属イオンでの代謝の不均衡は、多数の疾患状態に関連付けされている（Danks, D. M. (1986) J. Med. Genet. 23 : 99-106）。
【００１３】
鉄は、酸素の輸送と酸化還元反応、特に細胞呼吸で或る重要な役割を果たすが、鉄は過剰にある時に毒性にもなる。ヒトでは、無調節の鉄吸収は、硬変症、内分泌不全、関節炎、および心筋症、さらに肝細胞癌を起こす（Griffiths, W.J.H. 他 (1999) Mol. Med. Today 5:431-438）。フェリチンは偏在する鉄結合タンパク質であり、微生物、植物、および動物での鉄の貯蔵と解毒に関与する。哺乳類のフェリチンは、Hサブユニット（HeartまたはHeavyの略）とLサブユニット（LightまたはLiverの略）の２つのタイプから成る２４サブユニット群から構成される。これらのサブユニット群は、フェリハイドライト（FeOOH）としての鉄原子を4,000まで収容できる球状の構造にアセンブリする（Aisen, P. 他 (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3:200-206）。
【００１４】
核膜穴（NPC）は核膜を貫通する大きなタンパク質複合体である。核膜は核と細胞質の間のタンパク質とRNA分子の輸送を仲介し、それにより遺伝子の発現の制御に寄与する。NPCは、イオン、小分子、および約60kD以下の高分子の受動的な拡散を可能にさせる。一方、大きな高分子は、促進された、エネルギー依存性の経路によって輸送される。塩基性残基の豊富なアミノ酸の短いストレッチから成る核局在化シグナル（NLS）は、グルココルチコイド受容体のような、核を標的とするタンパク質類に見られる。NLSは、単量体GTP結合タンパク質であるRanと相互作用する、NLS受容体（インポーチン）によって認識される。このNLSタンパク質／受容体／Ranの複合体は、ホモ二量体のタンパク質核輸送因子２（NTF2）の援助によって核孔を通過する（Nakielny, S. および Dreyfuss, G. (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9:420-429、 Gorlich, D. (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9:412-419）。４つのO結合型糖タンパク（p62、p58、p54、p45）は、安定な「p62複合体」として存在する。「p62複合体」は、NPCの核内側と細胞質側の両方の面に局在する１つのリングを形成する。p62、p58、およびp54のタンパク質はすべて、サイトゾル輸送因子のp97とNTF2と直接相互作用し、これはp62複合体がNPCの中央のゲート型チャネル（the central gated channel）の近くの重要なリガンド結合部位であることを示唆する（Hu, T. 他 (1996) J. Cell Biol. 134:589-601）。
【００１５】
イオンチャネル
細胞の電位は、原形質膜を通過するイオンの動きを制御することにより起こり、かつ維持される。イオンが動くためには、膜内にイオン選択性ポアを形成するようなイオンチャネルを必要とする。イオンチャネルには２つの基本型があり、それはイオン輸送体とゲート型イオンチャネルである。イオン輸送体は、ATP加水分解から得られるエネルギーを利用して、イオンの濃度勾配に逆らってイオンを能動的に輸送する。ゲート型イオンチャネルは、制限された条件下でイオンの電気化学勾配に従ってイオンの受動的流動を起こさせる。これらのタイプのイオンチャネルは共に、１）神経細胞の軸索に沿った電気インパルス伝導、２）濃度勾配に逆らった細胞内への分子の輸送、３）筋収縮の開始、及び４）内分泌細胞の分泌に用いられるような電気化学勾配を、発生させ、維持し、利用する。
【００１６】
イオン輸送体
イオン輸送体は、細胞の静止電位を発生させ及び維持する。ATP加水分解に由来するエネルギーを利用して、イオン輸送体は、イオンの濃度勾配に逆らってイオンを輸送する。これらの膜貫通ATPアーゼは、３つのファミリーに区分される。リン酸化（P）クラスイオン輸送体には、Na+/K+ATPアーゼ、Ca2+ATPアーゼ及びH+ATPアーゼがあり、リン酸化イベントによって活性化される。Pクラスイオン輸送体は、Na+及びCa2+のサイトゾル内濃度が低く、K+のサイトゾル内濃度が高くなるように静止電位での分布を維持するのに関与している。液胞（V）クラスのイオン輸送体には、リソソーム及びゴルジなどの細胞内オルガネラ上のH+ポンプがある。オルガネラの内腔内では低いｐHが、その機能に必要であり、Vクラスイオン輸送体は、その低ｐHを発生させるのに関与している。共役因子（F）クラスは、ミトコンドリアのH+ポンプから構成される。Fクラスイオン輸送体は、プロトン勾配を利用してADP及び無機リン酸（Pi）からATPを生成する。
【００１７】
P-ATPアーゼは、イオン結合に関与し得るような、１０個の膜貫通ドメイン及び幾つかの大きな細胞質領域を有する100 kD サブユニットの六量体である（Scarborough, G. A. (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:517-522）。V-ATPアーゼは、２つの機能的ドメインから構成される。V1ドメインは、ATPアーゼに関与する周辺複合体であり、V0ドメインは、プロトンの膜通過移動に関与する、膜内在性の複合体である。F-ATPアーゼは、構造的及び進化的にV-ATPアーゼに関連する。F-ATPアーゼのF0ドメインは、１２個のコピーのcサブユニットを含んでおり、各サブユニットは高度に疎水性のタンパク質で、２つの膜貫通ドメインから成り、プロトン輸送に不可欠なTM2に1つの埋没されたカルボキシル基を含む。V-ATPアーゼのV0ドメインは、TM4またはTM3に４つまたは５つの膜貫通ドメイン及び必須カルボキシル基を有する３つの型の相同cサブユニットを含む。複合体の両型は、活性のpH依存性の制御に関与している可能性のある単一サブユニットも含む（Forgac, M. (1999) J. Biol. Chem. 274:12951-12954）。
【００１８】
細胞の静止電位は、キャリアタンパク質及びゲート型イオンチャネルに関連する多くのプロセスに利用される。キャリアタンパク質は、静止電位を利用して分子を細胞内外に輸送する。多くの細胞へのアミノ酸及びグルコースの輸送は、ナトリウムイオン共輸送（シンポート）にカップルされ、Na+の電気化学勾配に従った動きが他の分子を濃度勾配に逆らって輸送させる。同様にして、心筋は、細胞からのCa2+の移動を細胞内へのNa+の輸送にカップルさせる（アンチポート）。
【００１９】
イオンチャネル
イオンチャネルは、ポアの開閉を調節することによってイオンの流れを制御する。種々のゲーティング機構によってイオン流速を制御する能力は、ニューロン及び内分泌シグナル伝達、筋収縮、受精並びに、イオン及びpHバランスの調整などの多様なシグナル伝達及び恒常性機能をイオンチャネルに媒介させ得る。イオンチャネルは、開口機能の制御方法に応じて区分される。機械依存性チャネルは、機械的応力に応じてポアを開け、電位依存性チャネル（例えばNa+、K+、Ca2+ 及びCl- チャネル）は膜電位に応じてポアを開け、リガンド依存性チャネル（例えばアセチルコリン依存性、セロトニン依存性、及びグルタミン依存性カチオンチャネル、並びにGABA依存性及びグリシン依存性クロライドチャネル）は、特定のイオン、ヌクレオチドまたは神経伝達物質の存在下でポアを開ける。特定のイオンチャネルの開口特性（即ち開閉に対するその閾値及び持続時間）は、補助チャネルタンパク質及び／またはリン酸化などの翻訳後修飾と関連して時折調節される。
【００２０】
機械依存性または機械刺激イオンチャネルは、触覚、聴覚及び平衡感覚のトランスデューサとして作用し、細胞容積調整、平滑筋収縮及び心リズム生成においても重要な役割を果たす。機械受容不活性化チャネル（SIC）は、最近ラットの腎臓からクローニングされた。 SICチャネルは、細胞膜への圧力またはストレスによって活性化され、Ca2+及びNa+ を共に伝導するようなあるグループのチャネルに属している（Suzuki, M. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274 : 6330-6335）。
【００２１】
電位依存性カチオンチャネルのポア形成サブユニットは、イオンチャネルタンパク質のスーパーファミリーを形成する。チャネルタンパク質の特徴的なドメインには、６つの膜貫通ドメイン（S1〜S6）、S5とS6との間に配置されたポア形成領域（P）及び、細胞内にあるアミノ末端及びカルボキシ末端がある。Na+ 及びCa2+ サブファミリーでは、このドメインは４回繰り返され、Ｋ＋チャネルサブファミリーでは、各チャネルは、同一または非類似のいずれかであるサブユニットの四量体から形成される。P領域は、チャネルに対するイオン選択性を特定する情報を含む。K+ チャネルの場合、GYGトリペプチドがこの選択性に関与する（Ishii, T.M. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 11651-11656）。
【００２２】
電位依存性Na+ 及びK+ チャネルは、神経及び筋肉細胞などの電気的興奮性細胞の機能に必要である。活動電位は、神経伝達物質放出及び筋収縮の原因となるものであるが、Na+及びK+ イオンへの膜の浸透性における大きな一過的変化から生じる。閾値レベルを超えた膜の脱分極によって、電位依存性Na+ チャネルが開く。ナトリウムイオンは、細胞内に流れ、更に膜を脱分極してより多く電位依存性Na+チャネルを開き、このようにして脱分極が細胞に沿って伝わっていく。脱分極はまた、電位依存性カリウムチャネルを開く。結果として、カリウムイオンは外向きに流れ、それによって膜の再分極が生じる。電位依存性チャネルは、第４膜貫通セグメント（S4）において荷電した残基を利用して電圧変化を検出する。開状態は、約１ミリ秒しか持続せず、その約１ミリ秒後に、チャンネルは膜電位と無関係に開き得ない不活性化状態に自発的に変換する。不活性化は、ポアを閉じるプラグとして作用するようなチャネルのN末端によって媒介される。不活性化状態から閉状態へ遷移するには、静止電位に戻すことが必要である。
【００２３】
電位依存性Na+ チャネルは、２つの更に小さな補助サブユニットβ１及びβ２に関連する260 kDaのポア形成αサブユニットから構成されるようなヘテロ三量体の複合体である。β２サブユニットは、細胞外Igドメインを含む膜内在性糖タンパク質であり、そのα及びβ１サブユニットとの会合は、チャネルの機能的発現の増加、そのゲーティング特性の変化、及び膜表面面積の増加に起因する全細胞キャパシタンスの増加と関連がある（Isom, L. L. 他 (1995) Cell 83: 433-442）。
【００２４】
非電位依存性Na+ チャネルには、アミロライド感受性Na+ チャネル／degenerin（NaC/DEG）ファミリーのメンバーが含まれる。このファミリーのチャネルサブユニットは、アミノ末端及びカルボキシル末端が細胞内にあり、長い細胞外ループに隣接する２つの膜貫通ドメインを含むと考えられる。NaC/DEGファミリーには、気道、遠位結腸、腎臓の皮質集合管及び外分泌有導管腺(exocrine duct glands)を含む上皮におけるNa+ 再吸収に関与する上皮性Na+ チャネル（EnaC）がある。EnaCにおける突然変異は、１型偽性低アルドステロン症及びリドル症候群（偽性高アルドステロン症）を引き起こす。NaC/DEGファミリーには、最近特徴付けられたH+ 依存性カチオンチャネルまたは酸感受性イオンチャネル（ASIC）もある。ASICサブユニットは、脳で発現し、ヘテロ多量体のNa+ 透過性チャネルを形成する。これらのチャネルは、活性化のために酸性pH変動を必要とする。ASICサブユニットは、元々は線虫から単離された機械刺激依存性チャネルのファミリーであるdegenerinとの相同性を示す。degenerinでの突然変異は、神経変性を引き起こす。組織アシドーシスが痛みの原因となるため、ASICサブユニットは、神経機能または痛みの知覚にも関与し得る（Waldmann, R. および M. Lazdunski (1998) Curr. Opin. Neurobiol. 8:418-424; Eglen, R. M. 他 (1999) Trends Pharmacol. Sci. 20:337-342）。
【００２５】
K+ チャネルはすべての細胞種に存在し、電圧、ATP濃度、またはCa2+ 及びcAMPなどのセカンドメッセンジャーによって制御され得る。非興奮性組織では、K+ チャネルが、タンパク質合成、内分泌性分泌の制御、及び、膜内外の浸透平衡の維持に関与している。ニューロン及びその他の興奮性細胞では、活動電位の調整及び膜の再分極に加えて、K+ チャネルが静止膜電位の設定に関与する。サイトゾルは、非拡散性アニオンを含み、この負の電荷総ての平衡を保持するために、細胞にはNa+、K+ 及びCl- の再分布を提供するNa+/K+ ポンプ及びイオンチャネルが含まれる。ポンプは、能動的にNa+ を細胞外へ輸送し、K+ を細胞内に輸送され、そのNa+：K+ の割合は３：２である。原形質膜のイオンチャネルは、K+ 及びCl- が受動的な拡散により流出入することを許容する。サイトゾル内の電荷が高度に負であるので、Cl- は細胞外に流出する。K+ の流れは、K+ を細胞内に引き込む起電力及びK+ を細胞外に押し出すK+濃度勾配によって均衡が保たれる。従って、静止膜電位は、主としてK+ の流れによって調整される（Salkoff, L. および T. Jegla (1995) Neuron 15:489-492）。
【００２６】
Shaker様スーパーファミリーのカリウムチャネルサブユニットはすべて６つの膜貫通ドメイン／１つのポアドメイン構造の特徴を有する。４つのサブユニットは、ホモ四量体またはヘテロ四量体として結合し、機能的Kチャネルを形成する。これらのポア形成サブユニットは、チャネル不活性化動力学を変容させるような種々の細胞質βサブユニットとも会合している。Shaker様チャネルファミリーには、QT延長症（1種の心律動異常症候群／不整脈）に関連するようなヒトether-a-go-go関連遺伝子（HERG）などの遅延整流型チャネルや、電位依存性K+チャネルがある（Curran, M. E. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:565-572、Kaczarowski, G. J. および M. L. Garcia (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3:448-458）。
【００２７】
K+ チャネルの第２のスーパーファミリーは、内向き整流型チャネル（Kir）で構成される。Kirチャネルは、優先的にK+ の流れを内向きに導く特性を有する。これらのタンパク質は、１つのカリウム選択性ポアドメイン及び２つの膜貫通ドメインから構成され、これらは電位依存性K+チャネルの第５及び第６膜貫通ドメインに対応する。Kirサブユニット群は、四量体としても会合している。Kirファミリーには、腎尿細管疾患のバーター症候群の原因となる突然変異であるROMK1がある。Kirチャネルは、心臓ペースメーカー活動の調整、発作及びてんかん、並びにインスリン調整にも関与している（Doupnik, C. A. 他 (1995) Curr. Opin. Neurobiol. 5:268-277、前出のCurran）。
【００２８】
最近認識されたTWIK K+ チャネルファミリーには、哺乳類のTWIK-1、TREK-1及びTASKタンパク質がある。このファミリーのメンバーは、４つの膜貫通ドメイン及び２つのPドメインを含む全体構造を有する。これらのタンパク質は、おそらく多くの細胞種における静止電位の制御に関与している（Duprat, F. 他 (1997) EMBO J 16:5464-5471）。
【００２９】
電位依存性Ca2+ チャネルは、電気生理学的特性及び薬理学的特性に基づき、幾つかのサブタイプに区分分けされてきた。L型Ca2+ チャネルは、心筋及び骨格筋に主に発現し、興奮収縮連関において不可欠な役割を果たす。T型チャネルは、心臓ペースメーカー活動に重要であり、N型及びP/Q型チャネルは、中枢神経系及び抹消神経系における神経伝達物質放出の制御に関与している。L型及びN型電位依存性Ca2+ チャネルは精製されており、両チャネルは機能が非常に異なるが、類似のサブユニット組成を有する。両チャネルは、３つのサブユニットを含む。α１サブユニット群は膜細孔と電圧センサーを形成し、α２δとβサブユニットは電圧依存性、開口特性、およびチャネルの電流を調節する。これらのサブユニットは、少なくとも6つのα1、1つのα2δ、4つのβ遺伝子によってコードされる。第４サブユニットγは、骨格筋において同定されている（Walker, D. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273 : 2361-2367、McCleskey, E. W. (1994) Curr. Opin. Neurobiol. 4 : 304-312）。
【００３０】
生化学的に特徴づけられている高電位活性化Ca 2+ チャネルには、約１９０〜２５０ kDaの細孔形成アルファ1サブユニットの複合体、アルファ２およびデルタサブユニットの膜貫通複合体、細胞内ベータサブユニット、および場合によっては膜貫通ガンマサブユニットを含む。さまざまなアルファ１サブユニット、アルファ２デルタ複合体、ベータサブユニットおよびガンマサブユニットが知られている。アルファ１サブユニットのCav1ファミリはLタイプCa 2+ 電流を流し、それによって筋肉の収縮、内分泌および遺伝子の転写が始まる。LタイプCa 2+ 電流の調節は主にセカンドメッセンジャー活性化タンパク質リン酸化経路によって行われる。アルファ１サブユニットのCav2ファミリはNタイプ、P/QタイプおよびRタイプのCa 2+ 電流を流し、それによって急速なシナプス伝達が始まる。調節は主にGタンパク質およびSNAREタンパク質との直接の相互作用によって、そして補助的にタンパク質リン酸化によって行われる。アルファ１サブユニットのCav3ファミリはTタイプのCa 2+ 電流を流すが、この活性化と不活性化は他のCa 2+ 電流タイプと比べてより速く起こり、またより負の膜電位で起こる。これら３つのファミリのCa 2+ チャネルの異なる構造と調節パターンにより、膜電位の変化に応答してさまざまなCa 2+ 流入経路が提供され、またセカンドメッセンジャー経路および相互作用するタンパク質によってCa 2+ の流入を調節するさまざまな可能性が提供される(Catterall, W.A. (2000) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:521-555)。
【００３１】
電位依存性Ca 2+チャネルのアルファ2サブユニットは1つ以上のCacheドメインを含んでいる可能性がある。細胞外Cacheドメインは、細胞内触媒ドメイン（ヒスチジンキナーゼ、PP2Cホスファターゼ、GGDEF（推定ジグアニレートシクラーゼ）、HD-GYP(推定ホスホジエステラーゼ)、またはアデニリルシクラーゼドメイン等）あるいは非触媒ドメイン（メチル基受容、DNA結合ウィング付きヘリックス・ターン・ヘリックス（DNAbinding winged helixturnhelix）、GAF、PASまたはHAMP（istidine キナーゼ、デニリルシクラーゼ、エチル結合タンパク質、およびホスファターゼに見られるドメイン）等）に融合している可能性がある。小さな分子はCacheドメインを通じて結合し、このシグナルが細胞内ドメインに依存して多様な出力に変換される（Anantharaman, V. および Aravind, L.(2000) Trends Biochem. Sci. 25:535-537）。
【００３２】
カルシウムイオンチャネルの過渡的な受容体ファミリ(Trp)は容量性カルシウム流入(CCE)を媒介すると考えられている。CCEは、イノシトール三リン酸(IP3)や多くのホルモンや成長因子に応答する他の物質の作用によって消耗されるCa2+ 貯蔵を再供給するためのCa2+ の細胞内への流入である。Trpおよび Trp様物質は、最初にショウジョウバエからクローンされ、S3 から S6領域にある電位依存性Ca2+ チャネルに類似性を持つ。これはTrpまたはその関連タンパク質が、哺乳動物のCCC流入チャネルを形成し得ることを示唆する（Zhu, X. 他 (1996) Cell 85:661-671; Boulay, G. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:29672-29680）。メラスタチン(melastatin)はマウスおよびヒトの両方において単離された遺伝子であり、黒色腫細胞におけるその発現は、生体内における黒色腫の侵襲性と逆比例している。このヒトcDNA転写物は、Trpファミリのメンバーに相同体を有する1533基のアミノ酸をもつタンパク質に相当する。メラスタチンmRNA発現状態と腫瘍の厚さを組み合わせて利用すると、転移性疾患の発症に対するリスクの低いグループと高いグループに患者のグループ分けを決定できる可能性が提示されている（Duncan, L.M. 他(2001) J. Clin. Oncol. 19:568-576）。
【００３３】
クロライドチャネルは、内分泌性分泌及びサイトゾルオルガネラのpH 調整に必要である。分泌性上皮細胞では、Cl- はNa+/K+/Cl- 共輸送体によって側底膜を通過して細胞に入り、電気化学的平衡濃度以上で細胞内に蓄積する。ホルモンの刺激に応じて、頂側膜表面からのCl- を分泌することにより、Na+ 及び水が分泌性ルーメンに流入する。嚢胞性線維症膜通過伝導制御因子（CFTR）は、ヒトによく見られる致命的な遺伝病である嚢胞性繊維症のための遺伝子によってコードされるクロライドチャネルである。 CFTRはABC輸送体ファミリーのメンバーであり、６つの膜貫通ドメインを各々有するような２つのドメインとその後に続くヌクレオチド結合部位から構成される。CFTR機能の損失は、経上皮水分泌を減少させ、結果的に、呼吸樹、膵管及び腸を被膜する粘液の層は、脱水されて、取り除くのが困難になる。結果的にこれらの部位が閉塞することにより、膵不全、「胎便性イレウス」及び悲惨な「慢性閉塞性肺疾患」を生じさせる（Al-Awqati, Q. 他 (1992) J. Exp. Biol. 172 : 245-266）。
【００３４】
電位依存性クロライドチャネル（CLC）は、CBSドメインとして知られる２つの小球形ドメインの他に１０〜１２個の膜貫通ドメインによって特徴付けられる。CLCサブユニットは、おそらくホモ四量体として機能する。CLCタンパク質は、細胞容積、膜電位安定化、シグナル伝達及び経上皮輸送の調整に関与している。骨格筋で主に発現されるようなCLC-1の突然変異は、常染色体劣性全身性ミオトニー及び常染色体優性先天性ミオトニーの原因であり、腎臓チャネルCLC-5における突然変異は、腎臓結石を引き起こす（Jentsch, T. J. (1996) Curr. Opin. Neurobiol. 6 : 303-310）。
【００３５】
リガンド依存性チャネルがポアを開くのは、細胞外または細胞内のメディエータがチャネルに結合する時である。神経伝達物質依存性チャネルは、神経伝達物質が細胞外ドメインに結合すると開くチャネルである。これらのチャネルは、神経または筋肉細胞のシナプス後膜に存在する。神経伝達物質依存性チャネルには、２つの型がある。ナトリウムチャネルは、アセチルコリン、グルタミン酸及びセロトニンなどの興奮性神経伝達物質に応じて開く。こうして開くことによって、Na+ の流入を引き起こし、電位依存性チャネルを活性化して活動電位を開始する最初の局在脱分極を提供する。クロライドチャネルは、γアミノ酪酸（GABA）及びグリシンなどの抑制神経伝達物質に応じて開き、膜の過分極及びそれに続く活動電位の発生を引き起こす。神経伝達物質依存性イオンチャネルは、４つの膜貫通ドメインを有し、おそらく五量体として機能する（前出のJentsch）。第２膜貫通ドメインのアミノ酸は、チャネル浸透及び選択性の決定において重要であるように見える（Sather, W. A. 他 (1994) Curr. Opin. Neurobiol. 4 : 313-323）。
【００３６】
リガンド依存性チャネルは、細胞内のセカンドメッセンジャーによって制御され得る。例えば、カルシウム活性化K+ チャネルは、内部カルシウムイオンによってゲーティングされる。神経細胞では、脱分極中のカルシウムの流入によってK+ チャネルが開き、活動電位の大きさが調節される（前出のIshii 他）。大コンダクタンス（BK）チャネルは、脳から精製され、そのサブユニット組成が決定された。BKチャネルのαサブユニットは、電位依存性K+ チャネルとは対照的に、６つでなく７つの膜貫通ドメインを有する。付加的な膜貫通ドメインは、サブユニットN末端に位置する。サブユニットのC末端領域（「カルシウムボウル(calcium bowl)」領域）の28個のアミノ酸ストレッチは、負に荷電した残基を多数含み、カルシウム結合に関与する領域であると考えられる。βサブユニットは、グリコシル化された細胞外ループによって結合された２つの膜貫通ドメインを含み、細胞内にN末端及びC末端を有する（前出のKaczorowski、Vergara, C. 他 (1998) Curr. Opin. Neurobiol. 8:321-329）。
【００３７】
サイクリックヌクレオチド依存性（CNG）チャネルは、サイトゾルのサイクリックヌクレオチドによってゲーティングされる。最も良い例は、嗅覚に関与するcAMP依存性Na+ チャネルと、視覚に関与するcGMP依存性カチオンチャネルである。両システムは、Gタンパク質共役受容体のリガンド媒介活性化に関与し、Gタンパク質共役受容体は次に細胞内でのサイクリックヌクレオチドのレベルを変化させる。CNGチャネルはまた、Ca2+がニューロンに入る主要経路を示し、ニューロンの発達及び可塑性において役割を果たす。CNGチャネルは、少なくとも２つのタイプのサブユニット（機能的ホモマーチャネルを形成し得るαサブユニットとチャネル特性を調節するβサブユニット）を含む四量体である。すべてのCNGサブユニットは、電位依存性K+ チャネルに類似して、６つの膜貫通ドメインと第５及び第６膜貫通ドメインの間にポア形成領域を有する。大きなC末端ドメインにはサイクリックヌクレオチド結合ドメインが含まれ、N末端ドメインはチャネルサブタイプ間に変異をもたらす（Zufall, F. 他 (1997) Curr. Opin. Neurobiol. 7:404-412）。
【００３８】
別のタイプのイオンチャネルタンパク質の活性は、種々の細胞内シグナル伝達タンパク質によっても調節され得る。多くのチャネルは、１個以上のプロテインキナーゼによるリン酸化部位を有する。そのようなプロテインキナーゼには、プロテインキナーゼA、プロテインキナーゼC、チロシンキナーゼ及びカゼインキナーゼIIがあり、これらはすべて細胞のイオンチャネル活性を調節する。Kirチャネルは、ヘテロ三量体Gタンパク質のGβγサブユニットの結合により活性化される（Reimann, F. および F. M. Ashcroft (1999) Curr. Opin. Cell. Biol. 11:503-508）。別のタンパク質は、細胞膜の特定部位へのイオンチャネルの局在化に関与している。このようなタンパク質にはPDZドメインタンパク質があり、これはニューロンのシナプスでイオンチャネルのクラスター形成を調整するMAGUK（膜関連グアニル酸キナーゼ）として知られている（Craven, S. E. および D. S. Bredt (1998) Cell 93:495-498）。
【００３９】
疾患との相関関係
多くのヒトの疾患及び障害の原因は、膜を通過する分子輸送における欠陥に帰しし得る。膜結合輸送体及びイオンチャネルの輸送における欠陥は、嚢胞性繊維症、グルコース−ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、フォンギールケ病及び或る種の真性糖尿病など幾つかの疾患に関連している。膜を通過して小分子を輸送できなくなる単一遺伝子の欠陥による疾患には、例えばシスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病、及びファンコーニ病がある（van't Hoff, W. G. (1996) Exp. Nephrol. 4:253-262、Talente, G. M. 他 (1994) Ann. Intern. Med. 120:218-226、及びChillon, M. 他 (1995) New Engl. J. Med. 332:1475-1480）。
【００４０】
イオンチャネル遺伝子における突然変異に起因するヒト疾患には、骨格筋、心筋及び中枢神経系の疾患がある。ナトリウムチャネル及びクロライドチャネルのポア形成サブユニットにおける突然変異は、ミオトニーを引き起こす。ミオトニーは、随意収縮後の弛緩が遅れる筋肉障害である。ナトリウムチャネルミオトニーは、チャネル遮断薬で治療されてきた。筋肉のナトリウム及びカルシウムチャネルにおける突然変異は、数種の周期性麻痺を引き起こし、筋形質カルシウム放出チャネル、T管カルシウムチャネル及び筋肉ナトリウムチャネルにおける突然変異は、悪性高熱症を引き起こす。QT延長症候群及び特発性心室細動などの心不整脈疾患は、カリウム及びナトリウムチャネルにおける突然変異に起因する（Cooper, E. C. および L. Y. Jan (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4759-4766）。既知のヒト特発性てんかん遺伝子は、４つがすべてイオンチャネルタンパク質をコードする（Berkovic, S. F. および I. E. Scheffer (1999) Curr. Opin. Neurology 12:177182）。その他の神経疾患、例えば運動失調、片麻痺性片頭痛及び遺伝性難聴などもまた、イオンチャネル遺伝子における突然変異に起因し得る（Jen, J. (1999) Curr. Opin. Neurobiol. 9:274-280、前出のCooper）。
【００４１】
イオンチャネルは、多くの薬物治療法に対する標的となっている。神経伝達物質依存性チャネルは、不眠症、不安、抑うつ症及び精神分裂病(統合失調症)の治療において標的とされて来た。電位依存性チャネルは、不整脈、虚血性発作、頭部外傷及び神経変性疾患の治療法において標的にされてきた（Taylor, C. P. および L. S. Narasimhan (1997) Adv. Pharmacol. 39:47-98）。種々のクラスのイオンチャネルは、痛みの知覚においても重要な役割を果たすので、新たな鎮痛薬の標的となり得る。このようなイオンチャネルにはバニロイド（vanilloid）依存性イオンチャネルがあり、これは侵害熱によってのみならずバニロイドであるカプサイシンによっても活性化される。電位依存性Na+ チャネルを遮断するリドカインやメキシレチンなどの局部麻酔薬は、神経障害性の痛みの治療において有用である（前出のEglen）。
【００４２】
免疫調節のための標的として、最近では免疫系におけるイオンチャネルが示唆されている。T細胞活性化は、カルシウムシグナル伝達に依存し、多様なT細胞特異的イオンチャネルは、このシグナル伝達過程に影響することが特徴付けられている。チャネル遮断薬は、リンホカインの分泌、細胞増殖、及び標的細胞の死滅を阻害することができる。T細胞カリウムチャネルKv1.3のペプチドアンタゴニストは、ブタにおける遅延型過敏症及び異質遺伝子型反応を抑制し、安全で効果的な免疫抑制薬としてのチャネル遮断薬の使用のアイデアを実証している（Calahan, M. D.及びK. G. Chandy (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8 : 749-756）。
【００４３】
さらに、いくつかのSLC26遺伝子ファミリ（溶質キャリアファミリ26）イオン輸送体群がヒトの疾患に関連付けられている。DTDST遺伝子によってコードされる硫酸輸送体の欠陥は、捻曲性骨異形成症、骨発生不全症（atelosteogenesis ）II 型、または軟骨無形成症IB型の原因である。CLD遺伝子（以前にDRAとして知られていた）によってコードされるクロライド輸送体の欠陥は、先天性クロール下痢症の原因である。PDS遺伝子によってヨード輸送体の欠陥は、ペンドレッド症候群（PS）と非症候群的難聴DFNB4型（nonsyndromic deafness type DFNB4）に関連する。そのファミリーの４番目のメンバーは、硫酸、シュウ酸、および重炭酸のようなアニオンを輸送する。５番目のメンバーは、蝸牛殻の外有毛細胞のモータータンパク質として機能する。６番目のメンバーであるSLC26A6は、最近、硫酸輸送体として同定された（Waldegger, S. 他 (2001) Genomics 72:4350とその中の引用文献）。
【００４４】
発現プロファイル作成
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００４５】
遺伝子発現プロファイル作製の潜在的応用は特に、免疫応答に影響する疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。ジャーカットは、外的刺激なしに活性的に成長する急性T細胞白血病細胞株である。ジャーカットは、ヒトのT細胞でのシグナル伝達を研究するために広く使用されている。
【００４６】
PMAは、プロテインキナーゼC依存性の経路の広範な活性化因子である。イオノマイシンは、細胞へカルシウムの流入を許容し、サイトゾル内のカルシウム濃度を増加させるカルシウムイオノフォアである。PMAとイオノマイシンの併用によって、環境と相互作用する哺乳類細胞によって使用される主要シグナル伝達経路のうちの２つが活性化される。T細胞では、PMAとイオノマイシンの併用が、最適なB細胞活性化中に誘発される二次的シグナル伝達イベントを模倣する。
【００４７】
新たな輸送体及びイオンチャネル並びにこれらをコードするポリヌクレオチドの発見は、輸送障害、神経疾患、筋肉疾患、免疫疾患、および細胞増殖異常、さらに鉄代謝疾患の、診断、治療並びに予防において、また、輸送体及びイオンチャネルの核酸配列及びアミノ酸配列の発現に対する外因性化合物の効果の評価において有用であるような新たな組成物を提供することにより、当分野における必要性を満たす。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００４８】
本発明は、総称して「TRICH」、個別にはそれぞれ「TRICH-1」、「TRICH-2」、「TRICH-3」、「TRICH-4」、「TRICH-5」、「TRICH-6」、「TRICH-7」、「TRICH-8」、「TRICH-9」と呼ぶ輸送体およびイオンチャネルである精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、(a)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から成る群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。一実施態様では、本発明はSEQ ID NO:1-9のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００４９】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群より選択されたポリペプチドをコードするような単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-9からなる群から選択したポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:10-18からなる群から選択される。
【００５０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換生物体を提供する。
【００５１】
更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを含む。
【００５２】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００５３】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００５４】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００５５】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：10-18からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO：10-18からなる群から選択したポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００５６】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択される。一実施例では、SEQ ID NO:1-9からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、機能的TRICHの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療を要する患者にこの組成物を投与することを含む治療方法を提供する。
【００５７】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の、機能的TRICHの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療を要する患者への投与を含む治療方法を提供する。
【００５８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の、機能的TRICHの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療を要する患者への投与を含む治療方法を提供する。
【００５９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００６０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００６１】
更に本発明は、SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００６２】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群を或るプローブとハイブリダイズする過程があり、そのようなプローブには、（i）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群が含まれる。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００６４】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００６５】
本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６６】
（定義）
用語「TRICH」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などからの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたTRICHのアミノ酸配列を指す。
【００６７】
用語「アゴニスト」は、TRICHの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、TRICHに直接相互作用するか、或いはTRICHが関与する生物学的経路の成分と作用して、TRICHの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００６８】
用語「対立遺伝子変異体／変異配列」は、TRICHをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変容したRNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００６９】
TRICHをコードする「変容した／改変された」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換を有し、その結果、TRICHと同じポリペプチド或いはTRICHの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにTRICHをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、サイレント変化を生じ機能的に等価なTRICHとなる、アミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にTRICHの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００７０】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００７１】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる。
【００７２】
用語「アンタゴニスト」は、TRICHの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、TRICHに直接相互作用するか、或いはTRICHが関与する生物学的経路の成分と作用して、TRICHの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００７３】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。TRICHポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷のポリペプチド、または関心のある小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００７４】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００７５】
用語「アプタマー（aptamer）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）に抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって、各々の同種リガンドと特異的に架橋させることができる（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【００７６】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する。たとえば、ワクシニアウィルスに基づくＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Blind, M. 他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【００７７】
「spiegelmer」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【００７８】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味しうる。
【００７９】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のTRICH、合成のTRICHまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００８０】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【００８１】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む(有する)組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（有する）組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。TRICH 若しくはTRICH の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００８２】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブリシステム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００８３】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。

Figure 2005507238
【００８４】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の占有体積、を保持する。
【００８５】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【００８６】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【００８７】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００８８】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００８９】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。1つのエキソンはコードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって、新しいタンパク質がアセンブリされることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９０】
用語「断片」は、TRICHまたはTRICHをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250、若しくは少なくとも５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００９１】
SEQ ID NO:10-18の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:10-18を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持つ。SEQ ID NO:10-18の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術に、またはSEQ ID NO:10-18を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:10-18の断片の正確な長さ及び、断片が対応するSEQ ID NO:10-18の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９２】
SEQ ID NO:1-9の或る断片は、SEQ ID NO:10-18の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-9の或る断片は、SEQ ID NO:1-9を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持つ。例えば、SEQ ID NO:1-9の或る断片は、SEQ ID NO:1-9を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-9の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するSEQ ID NO:1-9の領域は、その断片に意図する目的に基づき、当業者が慣例的に判定し得る。
【００９３】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９４】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【００９５】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」および「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。そのような標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００９６】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００９７】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）。このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と、様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００９８】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【００９９】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１００】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１０１】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１０２】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスが選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【０１０３】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年４月２１日)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１０４】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１０５】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）の全長について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続した残基の断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０６】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１０７】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１０８】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。許容条件は、どのハイブリダイゼーション実験でも一定でありうるが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験によって変更することができる。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１０９】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびpHにおける特定配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１１０】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約0.１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlのせん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１１１】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１２】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【０１１３】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１１４】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすTRICHのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。「免疫抗原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用なTRICHの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【０１１５】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１６】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１７】
用語「モジュレート」または「活性の調節」は、TRICHの活性の変化を指す。例えば、モジュレートによって、TRICHのタンパク質活性の増減、或いは結合特性またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１１８】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１１９】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は、同一のリーディングフレーム内に在り得る。
【０１２０】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成物に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１２１】
TRICHの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及び当分野で既知の、その他の修飾が含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、TRICHの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１２２】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、TRICHやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的ポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１２３】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１２４】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１２５】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２６】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメント群の人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１２７】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２８】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１２９】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１３０】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１３１】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。TRICH、TRICHをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞や細胞から単離された染色体や細胞内小器官（オルガネラ）または膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１３２】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合分子が認識する、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）が存在するか否かに依存している。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１３３】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも６０％除去されたものであり、好ましくは７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１３４】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３５】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３６】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１３７】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１３８】
ここで用いる「遺伝形質転換生物体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することにより、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。或いは核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る（Lois, C. 他 (2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられている。
【０１３９】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異体は、所与の種の個体間での特定遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異体にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１４０】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、一方のポリペプチドの或る所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１４１】
（発明）
本発明は、新規のヒト輸送体及びイオンチャネル（TRICH）、並びにTRICHをコードするポリヌクレオチドの発見に基づく。また、これらの組成物を利用した、輸送障害、神経の疾患、筋疾患、免疫疾患、および細胞増殖異常の、診断、予防法、および治療の発見に基づく。
【０１４２】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１４３】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号（Genbank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにGenBank相同体１つ以上の注釈（annotation）を示し、これら全ては特に引用を以って本明細書の一部とする。
【０１４４】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４５】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが輸送体及びイオンチャネルであることを確立している。例えば、SEQ ID NO:3は、カウロバクター（Caulobacter crescentus）のMotA/TolQ/ExbBプロトンチャネルファミリタンパク質（GenBank ID g13424917）と残基Ａ１４から残基Ｒ２３６まで、50％の同一性を有することが、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表２参照）。BLAST確率スコアは6.2e-53であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3はまた、１つのMotA/TolQ/ExbBプロトンチャネルファミリードメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。更なるBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:3がプロトンチャネルであることを示す更に確証的な証拠を提供する。別の例でSEQ ID NO:4 は、ヒトのカルシウムチャネルアルファ-2-デルタ3サブユニット（GenBank ID g7105926）と、残基G88から残基R947まで、９９％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)で確認された（表２参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:4はまた、cacheドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS解析およびMOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:4がカルシウムチャネルα‐2-δ3サブユニットであることを更に確証する証拠を提供する。別の例でSEQ ID NO:5 は、マウスの尿素輸送体UTA-3（GenBank ID g11177180）と、残基E8から残基E461まで、81％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)で確認された（表２参照）。BLAST確率スコアは4.0e-207であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:6はまた、E43残基からL443残基までヒトの溶質キャリアファミリ26メンバー6タンパク質（SLC26A6）であるアニオン輸送体(GenBank ID g13344999)に40%の同一性があり、BLAST確率スコア4.0e-93である。SEQ ID NO:6はまた、硫酸輸送体ドメインを持ち、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS解析よりのデータは、SEQ ID NO:6 が硫酸輸送体である、さらに実証的な証拠を提供する。 別の例においてSEQ ID NO:7は、残基M1から残基E323までが、ヒトのGTミトコンドリア溶質キャリアタンパク質（GenBank ID g386960）に対して96％が同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは6.2e-167であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:7はまた、ミトコンドリアキャリアタンパク質ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:7がミトコンドリアキャリアタンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:1-2、およびSEQ ID NO:8-9は同じような方法で解析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-9の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１４６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに使われたｃDNA配列および／またはゲノム配列のヌクレオチド開始位置（5'）と停止位置（3'）、およびSEQ ID NO:10-18 を同定するか、またはSEQ ID NO:10-18 と、関連するポリヌクレオチド配列とを区別する技術(例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術)に有用なポリヌクレオチド配列の断片のヌクレオチド開始位置(5')と終了位置(3')を示す。
【０１４７】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ENST」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースに由来する場合もあり（すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある（すなわち「NP」の命名を含む配列）。または列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方からなるアセンブリ体を指す場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定されるポリヌクレオチド配列はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である( 実施例５参照 )。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N として同定されるポリヌクレオチド配列は「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号である。（実施例５を参照。）あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別番号（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１４８】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
Figure 2005507238
【０１４９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１５０】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列をアセンブリ及び確認するために用いられたIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５１】
本発明はまた、TRICHの変異体も含む。好適なTRICH変異体は、TRICHの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつ該TRICHアミノ酸配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５２】
本発明はまた、TRICHをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、TRICHをコードするSEQ ID NO:10-18からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:10-18のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくてリボースから構成されている。
【０１５３】
本発明はまた、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:10-18からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:10-18からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、TRICHの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１５４】
さらに、あるいは別法において、本発明のポリヌクレオチド変異体はTRICHをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体はTRICHをコードするポリヌクレオチド配列との有意の配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによる、配列ブロック群の付加または欠失により、通常、より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。スプライス変異体はその全長について、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列とのポリヌクレオチド配列同一性が約７０％未満、あるいは約６０％、あるいは約５０％未満でありえるが、そのスプライス変異体のいくつかの部分は、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列の各部分とのポリヌクレオチド配列同一性が少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは１００％になる。上記したスプライス変異配列は何れも、TRICHの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５５】
遺伝暗号の縮重により、TRICHをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出される可能性があり、中には、いかなる既知の自然発生する遺伝子のポリヌクレオチド配列とも最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明は、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然TRICHのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られる。また、こうした全ての変異が明確に開示されていると考慮されたい。
【０１５６】
TRICHとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然TRICHのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドンを含めるなどの実質的に異なったコドン使用頻度を有する、TRICH或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、TRICH及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０１５７】
本発明はまた、TRICH及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。 更に、合成化学を用いて、TRICHまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０１５８】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:10-18及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる（例えば、Wahl, G.M.及び S.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照）。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１５９】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で既知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０１６０】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、TRICHをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出しうる。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318322 等を参照）。別の方法にインバースPCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えばTriglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法では、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１６１】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５'領域を有する配列を含み、オリゴd（T）ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１６２】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシング産物またはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザーで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATORなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６３】
本発明の別の実施例では、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にTRICH、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を作って、TRICHの発現に利用することが可能である。
【０１６４】
種々の目的で、TRICHをコードする配列を改変するために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節(modification)が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１６５】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、TRICHの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのTRICHの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、管理された、制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６６】
別の実施例によれば、TRICHをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてTRICH自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ; および Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にTRICHのアミノ酸配列または任意のその一部を用い、直接合成の際の改変により、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質からの配列または任意のその一部との組み合わせにより、天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１６７】
このペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（Creighton、前出、28−53ページ等を参照）。
【０１６８】
生物学的に活性なTRICHを発現させるために、TRICHをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びTRICHをコードするポリヌクレオチド配列における、エンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、強度及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、TRICHをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。TRICHをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばScharf, D. 他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162を参照)。
【０１６９】
当業者に周知の方法を用いて、TRICHをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章、8章及び１6-17章、Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,9章、13章及び16章等を参照)。
【０１７０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、TRICHをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス：CaMVまたはタバコモザイクウイルス：TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（例えば前出Sambrook; 前出Ausubel; Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ; Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659; および Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（例えばDi Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356; Yu, M.他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226; 並びに Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242を参照)。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７１】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列の、日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Invitrogen）など、多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターのマルチクローニング部位にTRICHをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のTRICHが必要な場合は、TRICHの高レベル発現を誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０１７２】
TRICHの産生に酵母発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを指示する。また、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことを可能にする（例えば前出のAusubel, 1995; Bitter, G.A. 他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; および Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照）。
【０１７３】
植物系もTRICHの発現に使用可能である。TRICHをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えばCoruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838843; および Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85105等を参照）。これらの作製物は、直接DNA形質転換にまたは病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（例えば『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページを参照）。
【０１７４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、TRICHをコードする配列を結合し得る。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域へ挿入することにより、宿主細胞でＴＲＩＣＨを発現する感染ウイルスを得ることが可能である（例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７５】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を送達することもできる。治療のために約６kb〜１０MbのHACが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばHarrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。
【０１７６】
哺乳動物系での組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるTRICHの安定した発現が望ましい。例えば、TRICHをコードする配列を株化細胞に形質転換するために、発現ベクターと、同じ或いは別のベクターの上の選択可能マーカー遺伝子を用いることが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素及び／または内因性の発現要素を持ちうる。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１７７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. 他 (1980) Cell 22:817-823を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシド系ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（例えばWigler, M.他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている（例えばHartman, S.C. および R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照）。
【０１７８】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、TRICHをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、TRICHをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下で、マーカー遺伝子を、TRICHをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子も発現していることを意味する。
【０１７９】
一般に、TRICHをコードする核酸配列を含み、TRICHを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定することが可能である。 これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR増幅が含まれ、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８０】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるTRICHの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で既知である。 このような技法には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取（FACS）などがある。TRICH上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である（例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; および Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJを参照）。
【０１８１】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。TRICHをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、TRICHをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子の他、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１８２】
TRICHをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。TRICHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するTRICH分泌を指示するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の方法で処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０１８４】
本発明の別の実施例では、TRICHをコードする天然の核酸配列、修飾された核酸配列、または組換え核酸配列を異種配列に連結させることにより、上記した任意の宿主系で融合タンパク質の翻訳を生じうる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラTRICHタンパク質が、TRICH活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、TRICHをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、TRICHが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１８５】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射能標識したTRICHの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の、転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８６】
本発明のTRICHまたはその断片を用いて、TRICHに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、TRICHへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンド、または受容体）または小分子が挙げられる。一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのTRICHの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）（例えばColigan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章を参照）。別の実施例では、このように同定された化合物が、受容体であるTRICHの天然のリガンドである（例えばHoward, A.D. 他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246を参照）。
【０１８７】
別の実施例では、その化合物が、TRICHが結合する天然受容体、或いは少なくとも該受容体の１断片、リガンド結合部位や結合ポケットのすべてまたは一部を含む該受容体の１断片に密接に関連する可能性がある。例えば、その化合物は、シグナルを伝達し得る、TRICHに対する或る受容体であったり、シグナルを伝達できない、TRICHに対するおとり（decoy）受容体である可能性がある（Ashkenazi, A. および V.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260; Mantovani, A. 他 (2001) Trends Immunol. 22:328-336）。既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。そのようなテクニックの例としては、ヒトで慢性関節リューマチに効能のある化合物エタネルセプト（etanercept）（(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA）を作製するのに使用されるテクニックが含まれる。エタネルセプトは、遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子（TNF）受容体二量体であり、ヒトのIgG1のFc部分に連結されている（Taylor, P.C. 他 (2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616）。
【０１８８】
或る実施例では、TRICHに特異的に結合する、刺激する、または阻害する化合物のためのスクリーニングには、分泌タンパク質として、または細胞膜上にTRICHを発現する好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。TRICHを発現する細胞またはTRICHを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、TRICHまたは化合物の何れかの結合、刺激または活性の阻害を分析する。
【０１８９】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたTRICHと混合するステップと、TRICHとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然産物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０１９０】
あるアッセイは、或る化合物が天然のリガンドに結合する能力、および／または天然リガンドがその天然受容体に結合するのを或る化合物が阻害する能力を査定するのに使用され得る。そのようなアッセイの例には、米国特許第5,914,236と米国特許第6,372,724に記載されたような放射標識アッセイが含まれる。関連した実施例では、１つ以上のアミノ酸置換がポリペプチド化合物（例えば、受容体）に導入して、その天然リガンドに結合する能力を向上したり、改変し得る（Matthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30等を参照）。さらに関連した実施例では、１つ以上のアミノ酸置換がポリペプチド化合物（例えば、リガンド）に導入して、その天然受容体に結合する能力を向上したり、改変し得る（Cunningham, B.C. および J.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他 (1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988等を参照）。
【０１９１】
本発明のTRICHまたはその断片を用いて、TRICHの活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施例では、TRICHの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をTRICHと混合し、試験化合物の存在下でのTRICHの活性を試験化合物不在下でのTRICHの活性と比較する。試験化合物の存在下でのTRICHの活性の変化は、TRICHの活性を調節する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をTRICHの活性に適した条件下でTRICHを含むin vitroすなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、TRICHの活性を調節する試験化合物は間接的に結合する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１９２】
別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、TRICHまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマーカー遺伝子で破壊された目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１９３】
TRICHをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1147）。
【０１９４】
TRICHをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、TRICHをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばTRICHを乳汁内に分泌するなどTRICHを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０１９５】
（治療）
TRICHのある領域と輸送体及びイオンチャネルのある領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、TRICHを発現する組織の例としては表６に示されており、また実施例１１にも示されている。従って、TRICHは、輸送障害、神経疾患、筋疾患、免疫疾患、および細胞増殖異常、および鉄代謝疾患においてある役割を果たすと考えられる。TRICHの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、TRICHの発現または活性を低下させることが望ましい。また、TRICHの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、TRICHの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９６】
従って、一実施例において、TRICHの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にTRICHまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、こうした疾患としては、輸送障害として、運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、嚢胞性線維症、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面神経麻痺、シャルコー・マリー・ツース病、糖尿病、尿崩症、糖尿病性ニューロパシー、 デュシェンヌ型筋ジストロフィー、高カリウム血性周期性四肢麻痺、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パーキンソン病、悪性高体温症、多剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性異栄養症(筋強直性ジストロフィー)、緊張病、遅発性ジスキネジー、ジストニー、末梢神経障害、脳腫瘍、前立腺癌、輸送に関連する心臓疾患（例えばアンギナ、徐脈性不整脈、頻脈性不整脈、高血圧、QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリンミオパシー、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚筋炎、封入体筋炎、感染性筋炎、多発性筋炎）、輸送に関連する神経疾患（例えばアルツハイマー病、記憶喪失、双極性障害、痴呆、鬱病、癲癇、トゥーレット病、パラノイド精神病、および精神分裂病(統合失調症)）、輸送に関する他の疾患（例えば神経線維腫症、帯状疱疹後神経痛、三叉神経障害、サルコイドーシス、鎌状赤血球貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄、感音常染色体難聴、高血糖症、低血糖症、グレーヴズ病、甲状腺腫、クッシング病、アジソン病、グルコース・ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、副腎脳白質ジストロフィー、ツェルヴェーガー症候群、Menkes病、後頭角症候群（occipital horn syndrome）、von Gierke病、シスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病、およびファンコーニ病）が含まれ、神経疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎(網膜色素変性症)、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管腫症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神遅滞及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性のミオパシー、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジー、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、及び家族性前頭側頭型痴呆が含まれ、筋疾患には、心筋症、心筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張（強直）性ジストロフィー、セントラルコア病、ネマリンミオパシー、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、感染性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒性ミオパシーおよびエタノールミオパシー、狭心症、アナフィラキシーショック、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング病、高血圧症、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、クロム親和細胞腫、脳症、てんかん、カーンズ‐セイヤ症候群、乳酸アシドーシス、ミオクローヌス疾患、眼筋麻痺、および酸性マルターゼ欠損症（AMD、ポンペ病としても知られる）が含まれ、免疫疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症(新生児溶血性疾患)、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症(強皮症)、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、また、細胞増殖異常では日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、鉄代謝疾患には、低トランスフェリン血症（hypotransferrinaemia）、acaeruloplasminaemia、成人、小児、および乳児のヘマクロマトーシス（haemochromatosis）が含まれる。
【０１９７】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTRICHの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、TRICHまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与することも可能である。
【０１９８】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTRICHの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたTRICHを含む組成物を好適な医薬用担体と共に被験者に投与することも可能である。
【０１９９】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTRICHの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、TRICHの活性を調節するアゴニストを被験者に投与することも可能である。
【０２００】
更なる実施例では、TRICHの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にTRICHのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した輸送障害、神経疾患、筋疾患、免疫疾患および細胞増殖異常、さらに鉄代謝疾患が含まれる。一実施態様では、TRICHと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはTRICHを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２０１】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTRICHの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、TRICHをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与することも可能である。
【０２０２】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０３】
TRICHのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 詳しくは、精製されたTRICHを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてTRICHと特異的に結合するものの同定が可能である。TRICHの抗体も、当分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。 但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体(例えば、ラクダまたはラマからの一本鎖抗体)は有力な酵素阻害剤であり、またペプチド擬態物質の設計および免疫吸着剤やバイオセンサーの開発に利点があるであろう(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２０４】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、TRICH または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２０５】
TRICHに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約5個のアミノ酸からなるものが好ましく、一般的には約10個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。TRICHアミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、このキメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２０６】
TRICHに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（例えばKohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; および Cole, S.P.他(1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120を参照）。
【０２０７】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えばMorrison, S.L.他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; および Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、TRICH特異性一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２０８】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（例えばOrlandi, R.他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299を参照）。
【０２０９】
TRICHに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばHuse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281を参照）。
【０２１０】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合アッセイ、または免疫放射線アッセイのための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、TRICHとその特異抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性TRICHエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２１１】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、TRICHに対する抗体の親和性を評価しうる。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でTRICH抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なTRICHエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したＫａは、TRICHに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は或る特定のTRICHエピトープに単一特異的であり、或るモノクローナル抗体製剤について判定したＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が109〜1012liter／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、TRICH抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体製剤は、TRICHが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２１２】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、TRICH抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（例えば前出のCatty、同Coligan 他を参照）。
【０２１３】
本発明の別の実施例では、TRICHをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、TRICHをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片を、TRICHをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（例えばAgrawal, S.,編集（1996）Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照）。
【０２１４】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（例えばSlater, J.E. 他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475;およびScanlon, K.J.他(1995) 9(13):1288-1296を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（例えばRossi, J.J.（1995）Br. Med. Bull. 51（1）:217-225; Boado、R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736を参照）。
【０２１５】
本発明の別の実施例では、TRICHをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、カンジダ（Candida albicans ）及びパラコクシジオイデス ブラジリエンジス （Paracoccidioides brasiliensis ）等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum ）及びトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi ）等の原生動物寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。TRICHの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からTRICHを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１６】
本発明の更なる実施例では、TRICHの欠損による疾患や異常症は、TRICHをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってTRICH欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２１７】
限定するものではないがTRICHの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）及びPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）がある。TRICHを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M及びH. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551、Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769、Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するTRICHをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１８】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L.及びA.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２１９】
本発明の別の実施例では、TRICHの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症を、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でTRICHをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２２０】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、TRICHの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞にTRICHをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製に欠陥のあるアデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するのに融通がきくことが証明された（Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263-268）。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はArmentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544、Verma, I.M.及びN. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２２１】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、TRICHの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にTRICHをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にTRICHを導入する際に特に有用たりうる。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res. 169:385395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999) J. Virol. 73:519-532 および Xu, H.他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なったセグメント群を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２２】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてTRICHをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのカプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、TRICHをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のTRICHをコードするRNAが産生され、高いレベルでTRICHが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にTRICHを導入できることとなる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２３】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん体塩基対形成は、二重らせん体が開いてポリメラーゼ、転写因子または調節分子と結合するのを阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（例えばGee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページを参照）。また、相補配列またはアンチセンス分子を設計し、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳をブロックし得る。
【０２２４】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、TRICHをコードする配列の内ヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２５】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位を先ず同定するため、GUA、GUU、GUC配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンする。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２２６】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等の、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、TRICHをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２７】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を含める。
【０２２８】
本発明の更なる実施例は、TRICHをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、TRICHの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、TRICHをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、TRICHの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、TRICHをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２２９】
特異ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変容させる場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。TRICHをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。TRICHをコードするポリヌクレオチドの発現における変容は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常、TRICHをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの発現改変に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他 (1997) U.S. Patent No. 5,686,242、Bruice, T.W. 他. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691)。
【０２３０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466.等を参照）。
【０２３１】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３２】
本発明のさらなる実施例は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、TRICH、TRICHの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはTRICHのインヒビターなどからなる。
【０２３３】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２３４】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３５】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３６】
TRICHまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な種々の形状の組成物が調製されうる。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、TRICHまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質から得た短い陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２３７】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２３８】
治療有効投与量とは、症状や容態を回復させる、たとえばTRICHまたはその断片、TRICHの抗体、TRICHのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性成分の量を指す。治療有効性および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の治療効果に対する投与量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を策定するのに用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２３９】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の全身の健康状態、患者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２４０】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100.000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２４１】
（診断）
別の実施例では、TRICHに特異的に結合する抗体が、TRICHの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはTRICHやTRICHのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。TRICHの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織の抽出物からTRICHを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４２】
TRICHを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのTRICHの発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なTRICHの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物とTRICHに対する抗体とを混合させることによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照、および、生検組織からの罹患サンプルでの、TRICHの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２４３】
本発明の別の実施例によれば、TRICHをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNAおよびDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、TRICHの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、TRICHの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のTRICH値の調節を監視する。
【０２４４】
一実施形態では、TRICHまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションによって、TRICHをコードする核酸配列を同定することが可能である。例プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、そのプローブがTRICHをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２４５】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用されうる。また、TRICHをコードする任意の配列と少なくとも50％の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:10-18の配列、或いはTRICH遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４６】
TRICHをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、TRICHまたはTRICH誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。mRNAプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35Sなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０２４７】
TRICHをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、TRICHの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、こうした疾患としては、輸送障害として、運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、嚢胞性線維症、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面神経麻痺、シャルコー・マリー・ツース病、糖尿病、尿崩症、糖尿病性ニューロパシー、 デュシェンヌ型筋ジストロフィー、高カリウム血性周期性四肢麻痺、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パーキンソン病、悪性高体温症、多剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性異栄養症(筋強直性ジストロフィー)、緊張病、遅発性ジスキネジー、ジストニー、末梢神経障害、脳腫瘍、前立腺癌、輸送に関連する心臓疾患（例えばアンギナ、徐脈性不整脈、頻脈性不整脈、高血圧、QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマリンミオパシー、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚筋炎、封入体筋炎、感染性筋炎、多発性筋炎）、輸送に関連する神経疾患（例えばアルツハイマー病、記憶喪失、双極性障害、痴呆、鬱病、癲癇、トゥーレット病、パラノイド精神病、および精神分裂病(統合失調症)）、輸送に関する他の疾患（例えば神経線維腫症、帯状疱疹後神経痛、三叉神経障害、サルコイドーシス、鎌状赤血球貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄、感音常染色体難聴、高血糖症、低血糖症、グレーヴズ病、甲状腺腫、クッシング病、アジソン病、グルコース・ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、副腎脳白質ジストロフィー、ツェルヴェーガー症候群、Menkes病、後頭角症候群（occipital horn syndrome）、von Gierke病、シスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病、およびファンコーニ病）が含まれ、神経疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎(網膜色素変性症)、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管腫症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神遅滞及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性のミオパシー、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジー、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、及び家族性前頭側頭型痴呆が含まれ、筋疾患には、心筋症、心筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張（強直）性ジストロフィー、セントラルコア病、ネマリンミオパシー、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、感染性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒性ミオパシーおよびエタノールミオパシー、狭心症、アナフィラキシーショック、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング病、高血圧症、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、クロム親和細胞腫、脳症、てんかん、カーンズ‐セイヤ症候群、乳酸アシドーシス、ミオクローヌス疾患、眼筋麻痺、および酸性マルターゼ欠損症（AMD、ポンペ病としても知られる）が含まれ、免疫疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症(新生児溶血性疾患)、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症(強皮症)、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、また、細胞増殖異常では日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、鉄代謝疾患には、低トランスフェリン血症（hypotransferrinaemia）、acaeruloplasminaemia、成人、小児、および乳児のヘマクロマトーシス（haemochromatosis）が含まれる。TRICHをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したTRICH発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術や、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４８】
ある実施態様では、TRICHをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。TRICHをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内の、TRICHをコードするヌクレオチド配列の変容したレベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２４９】
TRICHの発現に関連する疾患の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、TRICHをコードする配列或いはその断片とを混合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２５０】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２５１】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５２】
TRICHをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはTRICHをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはTRICHをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適化した条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２５３】
或る実施態様において、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP（single-stranded conformation polymorphism）および蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形のPCR生成物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２５４】
ヒト疾患の遺伝的根拠を研究するためにSNPを用いることができる。例えば、少なくとも16の一般的ＳＮＰが非インスリン依存型真性糖尿病と関連がある。ＳＮＰは、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血あるいは慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の疾患転帰の差異を研究する面でも有用である。例えば、マンノース結合レクチンの変異体であるMBL2は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰と相関することが示されてきた。SNPはまた、薬理ゲノミックス（命にかかわる毒性など、患者の薬への反応に影響する遺伝的変異体の同定）にも役立つ。例えば、N-アセチルトランスフェラーゼにおける変異は抗結核剤、イソニアジドに応答した末梢神経障害の高発生率と関連しているが、ALOX5 遺伝子のコアプロモータの変異は５-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬での治療に対する臨床的反応を減少する。異なった集団でのSNPの分布についての分析は遺伝的浮動、突然変異、組み換えや選択の調査、および集団の起源の追跡および集団の移動の追跡に有用である(Taylor, J.G. 他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. および Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641）。
【０２５５】
TRICHの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）及び標準曲線から得た結果の補間もある（例えばMelby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C.他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０２５６】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２５７】
別の実施例では、TRICH、TRICHの断片、TRICHに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５８】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２５９】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２６０】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他（1999）Mol. Carcinog. 24:153-159、Steiner, S. および N.L. Anderson（2000）Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現をゲノム全域にわたって測定することによって最高品質のシグネチャが得られる。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的マッチングに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２６１】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写物レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２６２】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理された、または未処理の生物学的サンプルから得られる、同等に位置するタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２６３】
プロテオームのプロファイルは、TRICHに特異的な抗体を用いてTRICH発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。数種の組織の数種のタンパク質に対しては、転写物とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージには有意に影響しないがプロテオームのプロファイルを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２６５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２６６】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０２６７】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（例えばBrennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他（1997）米国特許第5,605,662号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２６８】
本発明の別の実施例ではまた、TRICHをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされる（例えばHarrington, J.J.他（1997）Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関するような遺伝子連鎖地図を作製できる（例えば、 Lander, E.S. および D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。
【０２６９】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のMeyers 中のHeinz-Ulrich, 他 (1995) 965-968ページ.等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見られる。物理的な染色体地図上の、TRICHをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間の相関性が、このような疾患と関連するDNA領域の決定に役立つため、更なるポジショナルクローニングが行われうる。
【０２７０】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域のように、特定のゲノム領域への遺伝的連関によって大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされた任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他(1988) Nature 336:577-580を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２７１】
本発明の別の実施例では、TRICH、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。TRICHと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２７２】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（例えばGeysen, 他（1984）PCT出願第WO84/03564号を参照）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、TRICH、或いはその断片と反応させてから洗浄される。次ぎに、結合したTRICHが、当分野で周知の方法で検出される。 精製されたTRICHはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上に直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７３】
別の実施例では、TRICHと特異結合可能な中和抗体が、TRICHとの結合を試験化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。このようにして、TRICHと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在をも、抗体を使って検出できる。
【０２７４】
別の実施例では、TRICHをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０２７５】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２７６】
前述した、および以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、米国特許出願第60/296,881号、同第60/305,105号、同第60/293,722号、および同第60/304,593号も含めて、言及することをもって本明細書の一部とする。
【実施例】
【０２７７】
１ cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０２７８】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２７９】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Biosciences）、或いは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位に結合させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1 プラスミド(Invitrogen)、PCDNA2.1 プラスミド (Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド (Stratagene)、PCR2-TOPOTAプラスミド (Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)、plNCY（Incyte Genomics）またはその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０２８０】
２ cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２８１】
別法では、高処理フォーマットで直接結合PCR法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B.（1994）Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２８２】
３ シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences 社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０２８３】
IncyteのｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864、Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた。（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAのアセンブリ体を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAのアセンブリ体をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を引き出した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。次に、完全長ポリペプチド配列群の分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析される。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０２８４】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は全体を引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０２８５】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群とのアセンブリと分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:10-18のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも利用した。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０２８６】
４ ゲノム DNA からのコード配列の同定および編集
推定上の輸送体及びイオンチャネルは、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. 及び S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354を参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンまでのアセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が輸送体及びイオンチャネルをコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて輸送体及びイオンチャネルについて問合せて分析した。潜在的な輸送体及びイオンチャネルもまた、輸送体及びイオンチャネルとして注釈を付けたインサイトcDNA配列に対する相同性を基に同定した。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなど、Genscanにより予測された配列のエラーを修正した。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられ、したがって転写の証拠を提供した。。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブリプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０２８７】
５ ゲノム配列データの cDNA 配列データとのアセンブリ
ステッチ配列（ Stitched Sequence ）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に或る区間が存在する場合、３つの区間は全て等しいと考えられた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した区間と区間との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０２８８】
ストレッチ配列（ Stretched Sequence ）
部分ＤＮＡ配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２８９】
６ TRICH をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:10-18をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及び他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装を用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:10-18 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が既にマッピングされていたかを確認した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２９０】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/）などの公的に入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを決定できる。
【０２９１】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０２９２】
BLASTを適用した類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のｃDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２９３】
【数１】
Figure 2005507238
【０２９４】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２９５】
或いは、TRICHをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするようにアセンブリされる。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝臓、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿路などの１つの器官／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、TRICHをコードするcDNAの、組織特異的発現および疾患特異的発現を反映する。
【０２９６】
８ TRICH をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー複数を用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０２９７】
配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２９８】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて96ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２ +と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃、5 分、ステップ7: 4℃で保存する。
【０２９９】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット5〜10μlを1％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３００】
伸長したヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４ウエルプレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３０１】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステップ6: 72℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３０２】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５'調節配列を得る。
【０３０３】
９ TRICH をコードするポリヌクレオチドの SNP( 一塩基多型 ) の同定
一塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体がLIFESEQ データベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:10-18 において同定された。実施例３に記述されているように、同じ遺伝子からの配列を共にクラスターにしてアセンブリし、これによって遺伝子のすべての配列変異体の同定ができた。一連のフィルタから成るアルゴリズムは、ＳＮＰを他の配列変異体から区別するために用いられる。予備フィルターは、最小限のPhredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。先進の染色体分析の自動化手順により、推定上のSNPの近傍のオリジナルのクロマトグラムファイルを分析した。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて近接の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。フィルタの最終セットは、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に見出される重複とSNPを除去した。
【０３０４】
高速処理MASSARRAY システム(Sequenom, Inc.) を用いて質量分析によってさらに特徴付けるために数種のSNPを選択して、四つの異なったヒト母集団中のSNP部位における対立遺伝子発生頻度を分析した。白人母集団は、ユタ州の83人、フランス人4人、ベネズエラ３人およびアーミッシュ派２人を含む92人(男性46人、女性46人)で構成された。アフリカ人集団は194人（男性97人、女性97人）から成り、全てアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック母集団はすべてメキシコ系ヒスパニックの324人( 男性162人、 女性162人)からなる。アジア系の集団は126人（男性64人、女性62人）からなり、中国人43％、日本人31％、コリアン13％、ベトナム人5％、他のアジア系8％の親の構成が報告されている。対立形質の発生頻度は最初に白人母集団において分析し、いくつかの例において、この母集団で対立形質分散を示さなかったSNPは他の三つの母集団においてさらに検査しなかった。
【０３０５】
１０ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化および使用
SEQ ID NO:10-18由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸（Amersham Biosciences）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）とを混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３０６】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水および０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３０７】
１１ マイクロアレイ
マイクロアレイ上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ無孔の固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウエハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばSchena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31を参照）。
【０３０８】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３０９】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、２００ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する２５ｍｌの容量で行う。特異的対照ポリ（A）+RNA群は、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ3、もう１つはＣｙ5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３１０】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートを持つベクター含有細菌細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３１１】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理の間及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で充分に洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で充分に洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３１２】
米国特許第5,807,522号に記載されている手順を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３１３】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０.２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０３１４】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して１.８cm2のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100％に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC、０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において各々４５℃で１０分間３度洗浄して乾燥させる。
【０３１５】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ3の励起のためには４８８nm、Ｃｙ5の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、20×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる1.8cm×1.8cmのアレイは、解像度20μmでスキャンする。
【０３１６】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３１７】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つのフルオロフォアで較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３１８】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起及び測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３１９】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。少なくとも約２倍の発現変化、2.5以上のSB比、および少なくとも40％のエレメントスポットサイズを示したアレイエレメントが、差次的発現を示したとしてGEMTOOLSプログラム(Incyte Genomics)で同定された。
【０３２０】
発現
SEQ ID NO:10は、無処理ジャーカット細胞株に比較して、PMAとイオノマイシンで処理されたジャーカット細胞株に関連して差次的発現を示したが、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:10の発現が、少なくとも100ｍMのPMAと少なくとも１μｇ/ｍｌのイオノマイシンで１時間処理されたジャーカット細胞では、対照と比較して、少なくとも2倍減少した。したがって、SEQ ID NO:10は免疫応答疾患の治療をモニターする診断アッセイに有用であり得る。
【０３２１】
１２ 相補的ポリヌクレオチド
TRICHをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のTRICHの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びTRICHのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがTRICHをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３２２】
１３ TRICH の発現
TRICHの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でTRICHを発現させるためには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとTRICHを発現する。真核細胞でのTRICHの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え、或いはトランスファープラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、TRICHをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられる。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945を参照）。
【０３２３】
殆どの発現系では、TRICHが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でTRICHからタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したTRICHを直接用いて、以下の実施例１７、１８及び１９の、適用可能なアッセイを行い得る。
【０３２４】
１４ 機能的アッセイ
TRICHの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの、TRICHをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３２５】
遺伝子発現に与えるTRICHの影響は、TRICHをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。 TRICH及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３２６】
１５ TRICH 特異的抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたTRICH を用いて、標準的なプロトコルで動物(例えば、ウサギ、マウス等)を免疫化して抗体を作り出す。
【０３２７】
別法では、TRICHアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。 Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照）。
【０３２８】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗TRICH活性を検査するには、ペプチドまたはTRICHを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３２９】
１６ 特異的抗体を用いる天然 TRICH の精製
天然TRICH或いは組換えTRICHは、TRICHに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィによって実質的に精製される。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗TRICH抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３３０】
TRICHを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、TRICHを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とTRICHとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、TRICHを回収する。
【０３３１】
１７ TRICH と相互作用する分子の同定
TRICHと相互作用する分子としては、輸送体基質、アゴニスト若しくはアンタゴニスト、Gβγタンパク質（Reimann前出）のような調節性タンパク質(modulatory proteins)、又はMAGUKs（Craven前出）の様なTRICHの局在化若しくはクラスター形成に関与するタンパク質が含まれうる。TRICHまたは生物学的に活性であるTRICH断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する(例えば Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照）。マルチウェルプレートのウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したTRICHと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたTRICH複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なTRICH濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したTRICHの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３３２】
別法では、TRICHと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。TRICHもしくはその断片はGal4若しくはlexAのDNA結合ドメインを有する融合タンパク質として発現し、また潜在的な相互作用タンパク質は、活性化ドメインを有する融合タンパク質として発現する。TRICH融合タンパク質とTRICH相互作用タンパク質（活性化ドメインを有する融合タンパク質）間の相互作用は、レポーター遺伝子の発現によって観察されるトランス活性化機能を元に戻す。酵母２−ハイブリッドシステムは商業的に利用可能であり、イオンチャネルタンパク質を有する酵母２−ハイブリッドシステムの使用方法は、 Niethammer, M. およびM. Sheng(1998, Methods Enzymol. 293:104-122)に記載されている。
【０３３３】
TRICHはまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３３４】
潜在的なTRICHアゴニスト若しくはアンタゴニストは、実施例１８に記載のアッセイを用いてTRICHイオンチャネル活性の活性化若しくは阻害について試験されうる。
【０３３５】
18 TRICH 活性の実証
TRICHのイオンチャネル活性は、イオンコンダクタンスの電気生理学的アッセイを用いて実証される。TRICHは、TRICHをコードする真核生物発現ベクターで、COS7、HeLa、若しくはCHOのようなほ乳類株化細胞を形質転換することによって発現され得る。真核生物発現ベクターは市販されており、それらを細胞内に導入する技術は当業者には周知である。 β−ガラクトシダーゼのような多数の標識遺伝子いずれか一つを発現させる第二のプラスミドが細胞へと同時形質転換され、外来DNAを取り込み発現させるそれら細胞の迅速な同定を可能とする。細胞は、形質転換の後、株化細胞がTRICH及びβ−ガラクトシダーゼを発現し蓄積するのに適した条件下で、48〜72時間に渡ってインキュベートされる。
【０３３６】
β−ガラクトシダーゼを発現させる形質転換細胞は、好適な比色用基質が本技術分野で公知の条件下で培地へ添加されると、青く染色される。染色された細胞は、本技術分野で既知の電気生理学技術を用いて膜電気伝導度の違いを試験される。形質転換されていない細胞、及び/又はベクター配列だけ、若しくはβ−ガラクトシダーゼ配列だけのいずれかで形質転換された細胞は、対照として用いられ、並行に試験される。TRICHを発現する細胞は、対照細胞よりも高いカチオンコンダクタンスを有することとなる。TRICHの伝導度への寄与は、TRICHに特異的な抗体を用いて細胞をインキュベーションすることによって確認できる。抗体は、TRICHの細胞外側面に結合し、それによってイオンチャネル内の孔とそれに伴うコンダクタンスをブロッキングする。
【０３３７】
別法では、TRICHのイオンチャネル活性は、二電極電位クランプ技術(Ishi 他 前出、Jegla, T.及びL. Salkoff (1997) J. Neurosci. 17 : 32-44)を用いて、TRICH含有アフリカツメガエル卵母細胞膜を通る電流として測定される。TRICHは、pBFのような適切なアフリカツメガエル卵母細胞発現ベクターへとサブクローニングされ、また0.5〜5ngのmRNAが成熟段階４の卵母細胞へ注入される。注入された卵母細胞は18℃で1〜5日間インキュベートされる。インサイド‐アウトマクロパッチが切り取られて、116mMのK-グルコン酸、4mMのKC1、および10 mMのHepes (pH 7.2)を含む細胞内溶液へと移される。細胞内溶液には、cAMP、cGMP、またはCa+2 (CaCl2の形態)のような様々な濃度のTRICH媒介物質が適切に補充される。電極の抵抗は２〜５MΩにセットされ、電極は媒介物質のない細胞内溶液で満たされる。実験は、室温で0mVの保持電位から実行される。-100mVから100mVまでの電圧ランプ(voltage ramps) (2.5 秒)が、サンプリング周波数500Hzで得られる。測定される電流はアッセイに於けるTRICHの活性に比例する。
【０３３８】
例えば、TRICH-３の活性ははプロトンコンダクタンスとして測定され、TRICH-４の活性はカルシウムコンダクタンスとして測定される。
【０３３９】
TRICHの輸送活性は、アフリカツメガエル卵母細胞への標識された基質の取り込みを測定してアッセイされる。ステージ５及び６における卵母細胞は、TRICH mRNA (卵母細胞あたり10 ng)で注入され、OR2培地(82.5mMのNaCl、2.5mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、1mM Na2HPO4、5mMのHepes、3.8mMのNaOH、50μg/ml ゲンタマイシン、pH7.8)内で１８℃で３日間インキュベートされ、TRICHの発現を可能とする。卵母細胞は、次に標準取り込み培地(100mMのNaCl、2mMのKC1、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10mMのHepes/Tris、pH7.5)へと移される。様々な基質（例えばアミノ酸、糖、薬剤、イオン、及び神経伝達物質）の取り込みは、標識された基質(例えば3Hで放射標識されていたり、ローダミンで蛍光標識されている)を添加することで開始される。30分間のインキュベートの後、取り込みは、卵母細胞を３回、Na+のない培養液で洗浄することで終了し、取り込まれた標識を測定して、対照と比較する。TRICH活性は、内部移行された標識基質のレベルに比例する。検査基質には、限定はされるものではないが、TRICH-１に対してメリビオスや他の糖を含み、TRICH-６に対して硫酸を含む。
【０３４０】
TRICHに関連するATPase活性は、放射性ラベルされたATP-[γ-32P]の加水分解、クロマトグラフィー法による加水分解生成物の分離、及び、シンチレーションカウンターを用いる回収した32Pの定量化によって測定できる。反応混合物は、好適なバッファ中にATP-[g-32P]と、様々な量のTRICHとを含み、好適な時間、３７℃でインキュベートされる。反応は、トリクロロ酢酸での沈殿によって終了し、次に塩基で中和され、反応混合物のアリコットは、反応産物を分離するべく、膜若しくはろ紙ベースのクロマトグラフィーにかけられる。遊離された32Pの量は、シンチレーション計数器でカウントされる。このアッセイでは、回収した放射活性の量がTRICHのATP分解酵素活性に比例する。
【０３４１】
別法では、TRICHの鉄取り込み活性は、Fe2+とTRICHを1000：１のモル比で含む100ｍM HEPES/NaOHバッファ（pH 7.0）内で室温でアッセイされる。鉄取り込みは或るUV分光光度計を用いて310nmでの吸収を測定してモニターされる（Masuda, T. 他 (2001) J. Biol. Chem. 276:19575-19579）。
【０３４２】
１９ TRICH アゴニストおよびアンタゴニストの同定
TRICHは、CHO(チャイニーズハムスターの卵巣)またはHEK (ヒト胎児腎臓) 293のような真核細胞株内で発現する。形質転換細胞のイオンチャネル活性は、候補アゴニスト又は候補アンタゴニストの存在若しくは不在条件下で測定される。イオンチャネル活性は本技術分野で公知のパッチクランプ法を用いて、または実施例１７に記載のように検定される。別法では、細胞膜を通るイオンの流れを測定する蛍光技術を用い、イオンチャネル活性をアッセイする（Velicelebi, G.他 (1999) Meth. Enzymol. 294:20-47 ； West, M. R.及びC. R. Molloy (1996) Anal. Biochem. 241:51-58）。これらアッセイは、マイクロプレートを用いる高処理のスクリーニングに適合されうる。内部イオン濃度の変化は、Ca2+ 指示薬Fluo-4 AM(Molecular Probes社より入手可能) のような蛍光色素を用い、FLIPR蛍光定量プレートリーディングシステム(Molecular Device社)と併せて測定される。アッセイのさらに一般的な別法では、原形質膜を通るイオンの流れによって生じる膜電位の変化は、DiBAC4(Molecular Probes)のようなoxonyl色素を用いて測定される。DiBAC4は、細胞膜電位に従って細胞外溶液と細胞部位との間で平衡となる。色素の蛍光強度は、疎水性の細胞内部位に結合すると20倍に大きくなり、細胞内へのDiBAC4の流入が検出可能となる（Gonzalez, J. E.及び P. A. Negulescu (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:624-631）。候補アゴニスト若しくはアンタゴニストは、既知のイオンチャネルアゴニスト若しくはアンタゴニスト、ペプチドライブラリ、若しくは組み合わせの化学ライブラリより選択されてもよい。
【０３４３】
当業者には、本発明の範囲及び精神から逸脱しない、本発明の記載した方法及びシステムの種々の修正および変更は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な修正は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３４４】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３４５】
表２は、GenBank識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈とを示す。各ポリペプチドとその相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３４６】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３４７】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３４８】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３４９】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３５０】
表7は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３５１】
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表７
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表７（続）
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表７（続）
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表７（続）
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【Technical field】
[0001]
The present invention relates to nucleic acid and amino acid sequences of transporters and ion channels. The present invention also relates to diagnosis / treatment / prevention of transport disorders, neurological diseases, muscle diseases, immune diseases, and abnormal cell proliferation using these sequences. The invention further relates to the evaluation of the effects of foreign compounds on the expression of transporter and ion channel nucleic acid and amino acid sequences.
[Background]
[0002]
Eukaryotic cells are surrounded by a hydrophobic lipid bilayer membrane that is highly impermeable to most polar molecules and is subdivided into functionally distinct organelles by this membrane. Cells and organelles are essential nutrients and K+, NHFour +, Pi, SOFour 2-Require transport proteins to import and export metal ions, sugars, vitamins and various metabolic wastes. Transport proteins also play a role in antibiotic resistance, toxin secretion, ion balance, synaptic neurotransmission, renal function, intestinal absorption, tumor growth and various other cellular functions (Griffith, J. and C. Sansom (1998 )The Transporter Facts BookAcademic Press, San Diego CA, pages 3-29). Transport can occur by passive concentration dependent mechanisms or can be related to energy sources such as ATP hydrolysis or ion gradients. Proteins that function in transport include carrier proteins and channel proteins. A carrier protein binds to a specific solute and causes a conformational change that allows the bound solute to pass through the membrane. Channel proteins form hydrophobic pores that allow certain solutes to diffuse across the membrane according to an electrochemical solute gradient.
[0003]
A carrier protein that transports a single solute from one side of the membrane to the other is called a uniporter. In contrast, a conjugated transporter links the movement of one solute to the movement of a second solute, which movement occurs either simultaneously or sequentially and the direction of movement is the same direction (symport) or reverse. One of the directions (anti-port). For example, the intestinal and renal epithelia contain various symporter systems driven by sodium gradients inside and outside the plasma membrane. Sodium moves into the cell according to an electrochemical gradient and carries the solute into the cell with the movement. The sodium gradient that provides the driving force for solute uptake is the ubiquitous Na+/ K+ Maintained by the ATP-degrading enzyme system. Sodium-coupled transporters include mammalian glucose transporter (SGLT1), iodide transporter (NIS) and multivitamin transporter (SMVT). All three transporters have 12 putative transmembrane segments, extracellular glycosylation sites, and N- and C-termini inside the cytoplasm. Because NIS is the molecular basis for radioiodine thyroid imaging technology and the specific targeting of radioisotopes to the thyroid, it plays a critical role in the evaluation, diagnosis and treatment of various thyroid pathologies (Levy, O. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5568-5573). SMVT is expressed in the intestinal mucosa, kidney and placenta and is thought to be involved in the transport of water-soluble vitamins such as biotin and pantothenic acid (Prasad, PD et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 7501- 7506).
[0004]
MFS (major facilitator superfamily) is one of the largest families of transporters and is also called the uniporter-symporter-antiporter family. The MFS transporter is a single polypeptide carrier that transports small solutes in response to an ionic gradient. Members of MFS are found in all classes of organisms and include sugars, oligosaccharides, phosphates, nitrates, nucleosides, monocarboxylic acids and transporters for drugs. All MFS transporters found in eukaryotes are composed of 12 transmembrane segments (Pao, S. S. et al. (1998) Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62: 1-34). The largest family of MFS transporters is the sugar transporter family, which contains seven glucose transporters (GLUT1 to GLUT7) required for transport of glucose and other hexoses, as found in humans. These glucose transport proteins have unique tissue distribution and physiological functions. GLUT1 provides many cell types with glucose requirements at the basement plate, transports glucose through epithelial and endothelial barrier tissues, GLUT2 promotes glucose uptake or efflux from the liver, and GLUT3 It regulates the supply of glucose to neurons, GLUT4 is involved in glucose degradation regulated by insulin, and GLUT5 regulates fructose uptake into skeletal muscle. Glucose transporter deficiency is a recently identified neurological syndrome that includes not only glycogen storage disease, Fanconi-Bickel syndrome, and non-insulin dependent diabetes, but also neurological syndromes that cause infantile spasms and developmental delays. (Mueckler, M. (1994) Eur. J. Biochem. 219: 713-725, Longo, N. and LJ Elsas (1998) Adv. Pediatr. 45: 293-313).
[0005]
Monocarboxylate anion transporters are proton conjugated symporters with a wide range of substrate specificities including L-lactic acid, pyruvate and ketone acetate, acetoacetate and β-hydroxybutyric acid. To date, at least seven isoforms have been identified. The isoform has 12 transmembrane (TM) helical domains with a large intracellular loop between TM6 and TM7 and removes the stoichiometrically generated protons with lactic acid during glycolysis Thus, it is presumed to play an important role in maintaining intracellular pH. The best characterized H+ The monocarboxylic acid transporter is an erythrocyte membrane transporter that transports L-lactic acid and a wide range of other aliphatic monocarboxylic acids. Other cells have different substrate and inhibitor selectivity+ Conjugated monocarboxylic acid transporter. In particular, myocardium and tumor cells have transporters with different Km values for certain substrates (including stereochemical selectivity for selecting L-lactic acid over D-lactic acid) and sensitivity to inhibitors. Na on the luminal surface of the intestinal tract and liver epithelium+ There are monocarboxylic acid cotransporters, which allow the uptake of lactic acid, pyruvic acid and ketone bodies in these tissues. Furthermore, there are specific and selective transporters for organic cations and organic anions in organs including liver, intestine and lung. Organic anion transporters are selective for hydrophobic, charged molecules with electron withdrawing side chains. Organic cation transporters such as ammonium transporters mediate the secretion of various drugs and endogenous metabolism and contribute to the maintenance of intracellular pH (Poole, RC and AP Halestrap (1993) Am. J. Physiol. 264: C761-C782, Price, NT et al. (1998) Biochem. J. 329: 321-328, Martinelle, K. and I. Haggstrom (1993) J. Biotechnol. 30: 339-350).
[0006]
ATP-binding cassette (ABC) transporters are membrane proteins that transport substrates ranging from small molecules such as ions, sugars, amino acids, peptides, phospholipids to lipopeptides, large proteins, and complex hydrophobic drugs A member of the superfamily. The ABC transporter contains four modules: two nucleotide binding domains (NBD) and two transmembrane domains (MSD). NBD hydrolyzes ATP to provide the energy required for transport, and each MSD contains a putative six transmembrane segment. These four modules can be encoded by a single gene or separate genes. It can be encoded by a single gene, such as for the cystic fibrosis transmembrane conduction factor (CFTR). When encoded by separate genes, each gene product contains one NBD and one MSD. These “half molecules” form homo- and heterodimers such as Tap1 and Tap2, which are major histocompatibility complex (MHC) peptide transport systems in the endoplasmic reticulum. Some genetic diseases are due to ABC transporter defects. Examples of diseases and their corresponding proteins include cystic fibrosis (CFTR, ion channel), adrenoleukodystrophy (adrenoleukodystrophy protein, ALDP), Zellweger syndrome (peroxisomal membrane protein-70, PMP70) and high There is insulin hypoglycemia (sulfonylurea receptor, SUR). When overexpressed in human cancer cells, another ABC transporter, multidrug resistance (MDR) protein, cells are resistant to various cytotoxic drugs used in chemotherapy (Taglicht, D. and S. Michaelis (1998) Meth. Enzymol. 292: 130-162).
[0007]
Many metal ions such as iron, zinc, copper, cobalt, manganese, molybdenum, selenium, nickel, chromium are important as cofactors for many enzymes. For example, copper is involved in hemoglobin synthesis, connective tissue metabolism, and skeletal development by acting as a cofactor in oxidoreductases such as superoxide dismutase, ferroxidase (ceruloplasmin) and lysyl oxidase. Copper and other metal ions must be given in the diet and are absorbed by the transporter in the digestive tract. Plasma proteins transport metal ions to the liver and other target organs, where specific transporters move ions to cells and cell organelles as needed. Metabolic imbalances with metal ions have been associated with a number of disease states (Danks, D. M. (1986) J. Med. Genet. 23: 99-106).
[0008]
Transport of fatty acids across the plasma membrane occurs by diffusion, a high capacity, low affinity process. However, under normal physiological conditions, a significant proportion of fatty acid transport appears to be caused by a high affinity, low volume protein-mediated transport process. Fatty acid transport protein (FATP) is an integral membrane protein with four transmembrane segments and is expressed in tissues that exhibit high levels of plasma membrane fatty acid influx, such as muscle, heart and fat. FATP expression is upregulated in 3T3-L1 cells during fat conversion, and expression in COS7 fibroblasts increases uptake of long chain fatty acids (Hui, TY et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 27420-27429).
[0009]
Mitochondrial carrier proteins are transmembrane proteins that transport ions and charged metabolites between the cytosol and the mitochondrial matrix. Examples include ADP, ATP carrier protein, 2-oxoglutarate / malate carrier, phosphate carrier protein, pyruvate carrier, dicarboxylic acid carrier (transporting malic acid, succinic acid, fumaric acid and phosphoric acid), tricarboxylic acid carrier (Transporting citric acid and malic acid), and Graves disease carrier protein, a protein recognized by IgG from patients with active Graves disease, an autoimmune disorder that causes hyperthyroidism. This family of proteins consists of three tandem repeats of approximately 100 amino acid domains, each tandem repeat having two transmembrane regions (Stryer, L. (1995) Biochemistrv, WH Freeman and Company, New York NY, p. 551, PROSITE PDOC00189 Mitochondrial energy transfer proteins signature, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) * 275000 Graves Disease).
[0010]
This class of transporters also includes mitochondrial uncoupling proteins. This uncoupling protein causes proton leakage in the inner mitochondrial membrane, uncoupling oxidative phosphorylation from ATP synthesis. As a result, energy dissipation in the form of heat occurs. Mitochondrial uncoupling proteins are considered as modulators of temperature regulation and metabolic rate and have been proposed as potential targets for drugs against metabolic diseases such as obesity (Ricquier, D. et al. (1999) J. Int. Med. 245 : 637-642).
[0011]
Urea transporters (UT, UrT) play a central role in the balance of urea excretion and water, the latter by accumulating and concentrating urea in the kidney medulla (Hediger, MA et al. (1996) Kidney Int 49: 16151623). Urea is the main solute found in urine and the main means by which mammals dispose of nitrogen waste. Urea transporter proteins have been identified in red blood cells (UT-B) and kidney medulla (UT-A). Several isoforms of the renal urea transporter (UT-A) have been cloned (eg UT-A1, UT-A2, UT-A3, UT-A4). UT-A2 may be up-regulated in response to uremia. UT-A3 may be expressed in the testis. The urea transporter may also be expressed in the brain (Karakashian, A. et al. (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 1999 10: 230237; Couriaud, C. et al. (1996) Biochim Biophys Acta. 1996 1309: 19719). There are at least two different classes of urea transporters in humans (constitutively expressed transporters and vasopressin-regulated transporters) (Olives, B. et al. (1996) FEBS Lett. 386: 156160).
[0012]
Many metal ions such as iron, zinc, copper, cobalt, manganese, molybdenum, selenium, nickel, chromium are important as cofactors for many enzymes. For example, copper is involved in hemoglobin synthesis, connective tissue metabolism and skeletal development by acting as a cofactor in oxidoreductases such as superoxide dismutase, ferroxidase (ceruloplasmin) and lysyl oxidase. Copper and other metal ions must be taken from the diet and are absorbed by the transporter in the digestive tract. Plasma proteins transport metal ions to the liver and other target organs, where specific transporters move ions to cells and cell organelles as needed. Metabolic imbalances with metal ions have been associated with a number of disease states (Danks, D. M. (1986) J. Med. Genet. 23: 99-106).
[0013]
Iron plays an important role in oxygen transport and redox reactions, especially cellular respiration, but iron is also toxic when in excess. In humans, unregulated iron absorption causes cirrhosis, endocrine insufficiency, arthritis, and cardiomyopathy, as well as hepatocellular carcinoma (Griffiths, W.J.H. et al. (1999) Mol. Med. Today 5: 431-438). Ferritin is an ubiquitous iron-binding protein that is involved in iron storage and detoxification in microorganisms, plants, and animals. Mammalian ferritin is composed of a group of 24 subunits consisting of two types: H subunit (abbreviation of Heart or Heavy) and L subunit (abbreviation of Light or Liver). These subunits assemble into a spherical structure that can accommodate up to 4,000 iron atoms as ferrihydrite (FeOOH) (Aisen, P. et al. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 200-206. ).
[0014]
The nuclear membrane hole (NPC) is a large protein complex that penetrates the nuclear membrane. The nuclear membrane mediates the transport of protein and RNA molecules between the nucleus and the cytoplasm, thereby contributing to the control of gene expression. NPC allows passive diffusion of ions, small molecules, and macromolecules up to about 60 kD. On the other hand, large macromolecules are transported by an accelerated, energy dependent pathway. Nuclear localization signals (NLS) consisting of short stretches of amino acids rich in basic residues are found in proteins that target the nucleus, such as the glucocorticoid receptor. NLS is recognized by the NLS receptor (importin), which interacts with Ran, a monomeric GTP-binding protein. This NLS protein / receptor / Ran complex crosses the nuclear pore with the aid of homodimeric protein nuclear transport factor 2 (NTF2) (Nakielny, S. and Dreyfuss, G. (1997) Curr. Opin Cell Biol. 9: 420-429, Gorlich, D. (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9: 412-419). Four O-linked glycoproteins (p62, p58, p54, p45) exist as stable “p62 complexes”. The “p62 complex” forms a single ring that is localized on both the nucleus inner side and the cytoplasmic side of NPC. The p62, p58, and p54 proteins all interact directly with the cytosolic transport factors p97 and NTF2, which is a key ligand near the central gated channel of the NPC. This suggests a binding site (Hu, T. et al. (1996) J. Cell Biol. 134: 589-601).
[0015]
Ion channel
Cell potentials occur and are maintained by controlling the movement of ions through the plasma membrane. In order for ions to move, ion channels that form ion selective pores in the membrane are required. There are two basic types of ion channels: ion transporters and gated ion channels. The ion transporter uses the energy obtained from ATP hydrolysis to actively transport ions against the ion concentration gradient. A gated ion channel causes passive flow of ions according to the electrochemical gradient of ions under limited conditions. Both of these types of ion channels are: 1) electrical impulse conduction along nerve cell axons, 2) transport of molecules into cells against concentration gradients, 3) onset of muscle contraction, and 4) endocrine cells. An electrochemical gradient, such as that used for secretion, is generated, maintained and utilized.
[0016]
Ion transporter
The ion transporter generates and maintains the resting potential of the cell. Utilizing the energy derived from ATP hydrolysis, the ion transporter transports ions against the ion concentration gradient. These transmembrane ATPases are divided into three families. Phosphorylated (P) class ion transporters include Na+/ K+ATPase, Ca2+ATPase and H+There is an ATPase that is activated by phosphorylation events. P class ion transporter is Na+And Ca2+The concentration in the cytosol is low, K+It is involved in maintaining the distribution at rest potential so that the concentration in the cytosol is high. Vacuolar (V) class ion transporters include H on intracellular organelles such as lysosomes and Golgi+There is a pump. In organelle lumens, low pH is required for its function, and V-class ion transporters are involved in generating that low pH. The coupling factor (F) class is mitochondrial H+Consists of a pump. The F class ion transporter uses a proton gradient to generate ATP from ADP and inorganic phosphate (Pi).
[0017]
P-ATPase is a hexamer of 100 kD subunits with 10 transmembrane domains and several large cytoplasmic regions that may be involved in ionic binding (Scarborough, GA (1999) Curr. Opin Cell Biol. 11: 517-522). V-ATPase is composed of two functional domains. V1Domain is a peripheral complex involved in ATPase and V0Domains are integral membrane complexes that are involved in the movement of protons across the membrane. F-ATPases are structurally and evolutionarily related to V-ATPases. F-ATPase F0The domain contains 12 copies of the c subunit, each subunit being a highly hydrophobic protein, consisting of two transmembrane domains, one embedded carboxyl group in TM2 essential for proton transport including. V-ATPase V0The domain contains three types of homologous c subunits with 4 or 5 transmembrane domains and an essential carboxyl group in TM4 or TM3. Both forms of the complex also contain a single subunit that may be involved in the pH-dependent control of activity (Forgac, M. (1999) J. Biol. Chem. 274: 12951-12954).
[0018]
Cell resting potential is utilized in many processes associated with carrier proteins and gated ion channels. The carrier protein uses a resting potential to transport molecules into and out of the cell. The transport of amino acids and glucose to many cells is coupled to sodium ion cotransport (Symport) and Na+The movement according to the electrochemical gradient causes other molecules to be transported against the concentration gradient. In the same way, the myocardium2+Na into the cell+To transport (antiport).
[0019]
Ion channel
The ion channel controls the flow of ions by adjusting the opening and closing of the pores. The ability to control ion flux through various gating mechanisms can mediate a variety of signaling and homeostatic functions, such as neuronal and endocrine signaling, muscle contraction, fertilization, and regulation of ion and pH balance, to ion channels. The ion channel is classified according to the control method of the opening function. Machine-dependent channels open pores in response to mechanical stress, and voltage-dependent channels (eg Na+, K+, Ca2+ And Cl- Channels) open pores in response to membrane potential, and ligand-dependent channels (eg acetylcholine-dependent, serotonin-dependent, and glutamine-dependent cation channels, and GABA-dependent and glycine-dependent chloride channels) are specific ions, The pore is opened in the presence of nucleotides or neurotransmitters. The opening characteristics of a particular ion channel (ie its threshold and duration for opening and closing) are sometimes adjusted in conjunction with post-translational modifications such as auxiliary channel proteins and / or phosphorylation.
[0020]
Machine-dependent or mechanically-stimulated ion channels act as tactile, auditory and balance sensory transducers and also play an important role in cell volume regulation, smooth muscle contraction and cardiac rhythm generation. The mechanosensitive inactivation channel (SIC) was recently cloned from rat kidney. SIC channels are activated by pressure or stress on the cell membrane, and Ca2+And Na+ Belong to a group of channels that conduct together (Suzuki, M. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 6330-6335).
[0021]
The pore-forming subunits of voltage-gated cation channels form a superfamily of ion channel proteins. The characteristic domains of the channel protein are the six transmembrane domains (S1-S6), the pore-forming region (P) located between S5 and S6, and the amino and carboxy termini that are intracellular. . Na+ And Ca2+ In the subfamily, this domain is repeated 4 times and K+In the channel subfamily, each channel is formed from a tetramer of subunits that are either identical or dissimilar. The P region contains information that identifies ion selectivity for the channel. K+ In the case of channels, GYG tripeptides are involved in this selectivity (Ishii, T.M. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11651-11656).
[0022]
Voltage-dependent Na+ And K+ Channels are necessary for the function of electrically excitable cells such as nerve and muscle cells. Action potentials cause neurotransmitter release and muscle contraction, but Na+And K+ Resulting from a large transient change in membrane permeability to ions. Depolarization of the membrane above the threshold level causes voltage-dependent Na+ The channel opens. Sodium ions flow into the cell and further depolarize the membrane, resulting in more voltage-dependent Na+Open the channel and thus depolarize along the cell. Depolarization also opens voltage-gated potassium channels. As a result, potassium ions flow outward, thereby causing membrane repolarization. Voltage-gated channels detect voltage changes using charged residues in the fourth transmembrane segment (S4). The open state lasts only about 1 millisecond, after which time the channel spontaneously converts to an inactivated state that cannot open regardless of membrane potential. Inactivation is mediated by the N-terminus of the channel, which acts as a plug that closes the pore. In order to transition from the inactivated state to the closed state, it is necessary to return to a static potential.
[0023]
Voltage-dependent Na+ The channel is a heterotrimeric complex composed of a 260 kDa pore-forming α subunit associated with two smaller auxiliary subunits β1 and β2. The β2 subunit is an integral membrane glycoprotein containing an extracellular Ig domain, and its association with the α and β1 subunits increases the functional expression of the channel, changes in its gating properties, and the membrane surface area. It is associated with an increase in total cell capacitance due to the increase (Isom, LL et al. (1995) Cell 83: 433-442).
[0024]
Non-potential dependent Na+ The channel contains amiloride sensitive Na+ Includes members of the channel / degenerin (NaC / DEG) family. This family of channel subunits is thought to contain two transmembrane domains with an amino and carboxyl terminus intracellularly and adjacent to a long extracellular loop. The NaC / DEG family includes Na in the epithelium, including the airways, distal colon, renal cortical collecting ducts, and exocrine duct glands.+ Epithelial Na involved in reabsorption+ There is a channel (EnaC). Mutations in EnaC cause type 1 pseudohypoaldosteronism and Riddle syndrome (pseudohyperaldosteronism). The NaC / DEG family has a recently characterized H+ There are also dependent cation channels or acid-sensitive ion channels (ASICs). ASIC subunits are expressed in the brain and are heteromultimeric Na+ A permeable channel is formed. These channels require acidic pH fluctuations for activation. The ASIC subunit exhibits homology with degenerin, a family of mechano-dependent channels originally isolated from nematodes. Mutations at degenerin cause neurodegeneration. Since tissue acidosis causes pain, ASIC subunits may also be involved in nerve function or pain perception (Waldmann, R. and M. Lazdunski (1998) Curr. Opin. Neurobiol. 8: 418-424; Eglen, RM et al. (1999) Trends Pharmacol. Sci. 20: 337-342).
[0025]
K+ Channels are present in all cell types, and voltage, ATP concentration, or Ca2+ And can be controlled by a second messenger such as cAMP. K for non-excitable tissue+ Channels are involved in protein synthesis, regulation of endocrine secretion, and maintaining osmotic equilibrium across the membrane. In neurons and other excitable cells, in addition to action potential regulation and membrane repolarization, K+ Channels are involved in setting the resting membrane potential. The cytosol contains non-diffusible anions, and in order to maintain the balance of all this negative charge, cells have Na+, K+ And Cl- Provides redistribution of Na+/ K+ A pump and ion channel are included. Pump actively Na+ To the outside of the cell, K+ Is transported into the cell and its Na+: K+ The ratio is 3: 2. The ion channel of the plasma membrane is K+ And Cl- Are allowed to enter and exit by passive diffusion. Since the charge in the cytosol is highly negative, Cl- Flows out of the cell. K+ The flow of K+ Of electromotive force and K+ To push out the cell+Equilibrium is maintained by the concentration gradient. Therefore, the resting membrane potential is mainly K+ (Salkoff, L. and T. Jegla (1995) Neuron 15: 489-492).
[0026]
The Shaker-like superfamily of potassium channel subunits all have the characteristics of six transmembrane domains / one pore domain structure. The four subunits bind as homotetramers or heterotetramers to form functional K channels. These pore-forming subunits are also associated with various cytoplasmic β subunits that alter channel inactivation kinetics. The Shaker-like channel family includes delayed rectifier channels such as the human ether-a-go-go related gene (HERG) associated with QT prolongation (a type of cardiac rhythm disorder / arrhythmia) and voltage-dependent K+There are channels (Curran, M. E. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 565-572, Kaczarowski, G. J. and M. L. Garcia (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 448-458).
[0027]
K+ The second superfamily of channels consists of inward rectifying channels (Kir). Kir channel preferentially K+ It has the characteristic of guiding the flow of air inward. These proteins are composed of one potassium selective pore domain and two transmembrane domains, which are voltage-dependent K+Corresponds to the fifth and sixth transmembrane domains of the channel. Kir subunits are also associated as tetramers. The Kir family has ROMK1, a mutation that causes Barter syndrome, a renal tubular disease. Kir channels are also involved in coordination of cardiac pacemaker activity, seizures and epilepsy, and insulin regulation (Doupnik, C. A. et al. (1995) Curr. Opin. Neurobiol. 5: 268-277, supra Curran).
[0028]
Recently recognized TWIK K+ Channel families include mammalian TWIK-1, TREK-1 and TASK proteins. Members of this family have an overall structure that includes four transmembrane domains and two P domains. These proteins are probably involved in the regulation of resting potentials in many cell types (Duprat, F. et al. (1997) EMBO J 16: 5464-5471).
[0029]
Voltage-dependent Ca2+ Channels have been divided into several subtypes based on electrophysiological and pharmacological properties. L-type Ca2+ Channels are mainly expressed in myocardium and skeletal muscle and play an essential role in excitation-contraction coupling. T-type channels are important for cardiac pacemaker activity, and N-type and P / Q-type channels are involved in controlling neurotransmitter release in the central and peripheral nervous systems. L-type and N-type voltage-dependent Ca2+ The channels have been purified and both channels have very similar functions, although the functions are very different. Both channels contain three subunits. α1The subunit group forms a membrane pore and a voltage sensor, and α2The δ and β subunits regulate voltage dependence, aperture characteristics, and channel current. These subunits contain at least 6 α1, 1 α2δ, encoded by four β genes. The fourth subunit γ has been identified in skeletal muscle (Walker, D. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 2361-2367, McCleskey, EW (1994) Curr. Opin. Neurobiol. 4: 304). -312).
[0030]
Biochemically characterized high-potential activated Ca2+ The channel contains a complex of pore-forming alpha 1 subunit of about 190-250 kDa, a transmembrane complex of alpha 2 and delta subunit, an intracellular beta subunit, and possibly a transmembrane gamma subunit . Various alpha 1 subunits, alpha 2 delta complexes, beta subunits and gamma subunits are known. The Cav1 family of alpha 1 subunits is L-type Ca2+ An electric current is applied, which initiates muscle contraction, endocrine and gene transcription. L type Ca2+ The regulation of current is mainly performed by the second messenger activated protein phosphorylation pathway. The Cav2 family of alpha 1 subunits is N type, P / Q type and R type Ca2+ A current is passed, which initiates rapid synaptic transmission. Regulation is mainly carried out by direct interaction with G and SNARE proteins, and supplementarily by protein phosphorylation. The Cav3 family of alpha 1 subunits is a T-type Ca2+ Current is passed, but this activation and deactivation is caused by other Ca2+ It occurs faster compared to the current type and occurs at a more negative membrane potential. These three families of Ca2+ Due to the different structures and regulatory patterns of the channel, various Ca in response to changes in membrane potential2+ An influx pathway is provided, and the second messenger pathway and interacting proteins2+ Various possibilities are provided to regulate the influx of blood (Catterall, W.A. (2000) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 521-555).
[0031]
Voltage-dependent Ca2+The alpha 2 subunit of the channel may contain one or more Cache domains. The extracellular cache domain can be an intracellular catalytic domain (such as histidine kinase, PP2C phosphatase, GGDEF (putative diguanylate cyclase), HD-GYP (putative phosphodiesterase), or adenylyl cyclase domain) or non-catalytic domain (methyl group accepting) , DNA binding winged helixturnhelix, GAF, PAS or HAMP (domains found in istidine kinase, denylyl cyclase, ethyl-binding protein, and phosphatase)) is there. Small molecules bind through the Cache domain and this signal is converted into diverse outputs depending on the intracellular domain (Anantharaman, V. and Aravind, L. (2000) Trends Biochem. Sci. 25: 535-537) .
[0032]
The transient receptor family of calcium ion channels (Trp) is thought to mediate capacitive calcium influx (CCE). CCE is consumed by the action of inositol triphosphate (IP3) and other substances that respond to many hormones and growth factors.2+ Ca for resupplying storage2+ Inflow into the cell. Trp and Trp-like substances were first cloned from Drosophila and voltage-dependent Ca in the S3 to S6 region2+ Similar to channels. This suggests that Trp or its related proteins can form mammalian CCC entry channels (Zhu, X. et al. (1996) Cell 85: 661-671; Boulay, G. et al. (1997) J. Biol Chem. 272: 29672-29680). Melastatin is an isolated gene in both mice and humans, and its expression in melanoma cells is inversely proportional to invasiveness of melanoma in vivo. This human cDNA transcript corresponds to a protein with 1533 amino acids having homologues in members of the Trp family. The combined use of melastatin mRNA expression status and tumor thickness suggests the possibility of determining patient groupings in low and high risk groups for the development of metastatic disease (Duncan, LM et al. (2001) ) J. Clin. Oncol. 19: 568-576).
[0033]
The chloride channel is required for endocrine secretion and cytosolic organelle pH adjustment. In secretory epithelial cells, Cl- Is Na+/ K+/ Cl- It enters the cell through the basolateral membrane by the cotransporter and accumulates in the cell at an electrochemical equilibrium concentration or higher. Cl from the top membrane surface in response to hormone stimulation- By secreting Na+ And water flows into the secretory lumen. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel encoded by the gene for cystic fibrosis, a fatal genetic disease common in humans. CFTR is a member of the ABC transporter family and consists of two domains, each with six transmembrane domains, followed by a nucleotide binding site. Loss of CFTR function reduces transepithelial water secretion, and as a result, the mucus layer that covers the respiratory tree, pancreatic duct and intestine becomes dehydrated and difficult to remove. Occlusion of these sites results in pancreatic insufficiency, “meconium ileus” and disastrous “chronic obstructive pulmonary disease” (Al-Awqati, Q. et al. (1992) J. Exp. Biol. 172: 245-266).
[0034]
Voltage-gated chloride channels (CLC) are characterized by 10-12 transmembrane domains in addition to two small spherical domains known as CBS domains. The CLC subunit probably functions as a homotetramer. CLC proteins are involved in the regulation of cell volume, membrane potential stabilization, signal transduction and transepithelial transport. Mutations in CLC-1 as expressed predominantly in skeletal muscle are responsible for autosomal recessive systemic and autosomal dominant congenital myotonia, and mutations in kidney channel CLC-5 cause kidney stones (Jentsch, TJ (1996) Curr. Opin. Neurobiol. 6: 303-310).
[0035]
A ligand-gated channel opens a pore when an extracellular or intracellular mediator binds to the channel. Neurotransmitter-gated channels are channels that open when neurotransmitters bind to the extracellular domain. These channels are present in the postsynaptic membrane of nerve or muscle cells. There are two types of neurotransmitter-gated channels. Sodium channels open in response to excitatory neurotransmitters such as acetylcholine, glutamate and serotonin. By opening in this way, Na+ , Providing an initial localized depolarization that activates voltage-gated channels and initiates action potentials. Chloride channels open in response to inhibitory neurotransmitters such as γ-aminobutyric acid (GABA) and glycine, causing membrane hyperpolarization and subsequent action potential generation. Neurotransmitter-gated ion channels have four transmembrane domains and probably function as pentamers (Jentsch, supra). The amino acids of the second transmembrane domain appear to be important in determining channel penetration and selectivity (Sather, W. A. et al. (1994) Curr. Opin. Neurobiol. 4: 313-323).
[0036]
Ligand-gated channels can be controlled by intracellular second messengers. For example, calcium activated K+ The channel is gated by internal calcium ions. In neurons, the influx of calcium during depolarization causes K+ The channel opens and the action potential is adjusted (Ishii et al.). The large conductance (BK) channel was purified from the brain and its subunit composition was determined. The α subunit of the BK channel is voltage-dependent K+ In contrast to channels, it has seven transmembrane domains instead of six. An additional transmembrane domain is located at the subunit N-terminus. The 28 amino acid stretch in the C-terminal region of the subunit (the “calcium bowl” region) contains many negatively charged residues and is thought to be the region involved in calcium binding. The β subunit contains two transmembrane domains joined by a glycosylated extracellular loop and has an N-terminus and a C-terminus in the cell (see Kaczorowski, Vergara, C. et al. (1998) Curr. Opin. Neurobiol. 8: 321-329).
[0037]
Cyclic nucleotide dependent (CNG) channels are gated by cytosolic cyclic nucleotides. The best example is cAMP-dependent Na, which is involved in olfaction+ Channels and cGMP-dependent cation channels involved in vision. Both systems are involved in ligand-mediated activation of G protein-coupled receptors, which in turn change the level of cyclic nucleotides in the cell. CNG channel is also Ca2+Shows the main pathways into the neuron and plays a role in neuronal development and plasticity. CNG channels are tetramers that contain at least two types of subunits, an α subunit that can form a functional homomeric channel and a β subunit that regulates channel properties. All CNG subunits are voltage-dependent K+ Similar to a channel, it has a pore-forming region between six transmembrane domains and the fifth and sixth transmembrane domains. The large C-terminal domain contains a cyclic nucleotide binding domain and the N-terminal domain mutates between channel subtypes (Zufall, F. et al. (1997) Curr. Opin. Neurobiol. 7: 404-412).
[0038]
The activity of other types of ion channel proteins can also be regulated by various intracellular signaling proteins. Many channels have phosphorylation sites by one or more protein kinases. Such protein kinases include protein kinase A, protein kinase C, tyrosine kinase, and casein kinase II, all of which regulate cellular ion channel activity. Kir channels are activated by the binding of Gβγ subunits of heterotrimeric G proteins (Reimann, F. and F. M. Ashcroft (1999) Curr. Opin. Cell. Biol. 11: 503-508). Another protein is involved in the localization of ion channels to specific sites in the cell membrane. Such proteins include PDZ domain proteins, known as MAGUK (membrane associated guanylate kinase) that regulates ion channel clustering at neuronal synapses (Craven, SE and DS Bredt (1998) Cell). 93: 495-498).
[0039]
Correlation with disease
The causes of many human diseases and disorders can be attributed to defects in molecular transport across the membrane. Defects in transport of membrane-bound transporters and ion channels are associated with several diseases such as cystic fibrosis, glucose-galactose malabsorption syndrome, hypercholesterolemia, von Gierke's disease and certain types of diabetes mellitus . Diseases due to single gene defects that prevent transport of small molecules across the membrane include, for example, cystinuria, iminoglycinuria, Harup disease, and Fanconi disease (van't Hoff, WG (1996) Exp. Nephrol. 4: 253-262, Talente, GM et al. (1994) Ann. Intern. Med. 120: 218-226, and Chillon, M. et al. (1995) New Engl. J. Med. 332: 1475-1480 ).
[0040]
Human diseases resulting from mutations in ion channel genes include skeletal muscle, cardiac muscle and central nervous system diseases. Mutations in the pore-forming subunits of sodium and chloride channels cause myotony. Myotony is a muscular disorder that delays relaxation after voluntary contraction. Sodium channel myotony has been treated with channel blockers. Mutations in muscle sodium and calcium channels cause several types of periodic paralysis, and mutations in muscle plasma calcium release channels, T-tubule calcium channels and muscle sodium channels cause malignant hyperthermia. Cardiac arrhythmia diseases such as long QT syndrome and idiopathic ventricular fibrillation result from mutations in potassium and sodium channels (Cooper, EC and LY Jan (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4759-4766 ). All four known human idiopathic epilepsy genes encode ion channel proteins (Berkovic, S. F. and I. E. Scheffer (1999) Curr. Opin. Neurology 12: 177182). Other neurological diseases such as ataxia, hemiplegic migraine and hereditary hearing loss can also result from mutations in ion channel genes (Jen, J. (1999) Curr. Opin. Neurobiol. 9: 274- 280, the previous Cooper).
[0041]
Ion channels are a target for many drug therapies. Neurotransmitter-gated channels have been targeted in the treatment of insomnia, anxiety, depression and schizophrenia (schizophrenia). Voltage-gated channels have been targeted in the treatment of arrhythmias, ischemic attacks, head trauma and neurodegenerative diseases (Taylor, C. P. and L. S. Narasimhan (1997) Adv. Pharmacol. 39: 47-98). Different classes of ion channels also play important roles in pain perception and can therefore be targets for new analgesics. Such ion channels include vanilloid-dependent ion channels that are activated not only by noxious heat but also by capsaicin, a vanilloid. Voltage-dependent Na+ Local anesthetics such as lidocaine and mexiletine that block channels are useful in the treatment of neuropathic pain (Eglen, supra).
[0042]
Recently, ion channels in the immune system have been suggested as targets for immune regulation. T cell activation is dependent on calcium signaling, and a variety of T cell specific ion channels have been characterized to affect this signaling process. Channel blockers can inhibit lymphokine secretion, cell proliferation, and target cell death. Peptide antagonists of T cell potassium channel Kv1.3 suppress delayed type hypersensitivity and allogeneic response in pigs, demonstrating the idea of using channel blockers as safe and effective immunosuppressive drugs ( Calahan, MD and KG Chandy (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 749-756).
[0043]
In addition, several SLC26 gene families (solute carrier family 26) ion transporters have been associated with human diseases. A defect in the sulfate transporter encoded by the DTDST gene is responsible for torsional dysplasia, atelosteogenesis type II, or achondroplasia type IB. A defect in the chloride transporter encoded by the CLD gene (previously known as DRA) is responsible for congenital crawl diarrhea. Defective iodine transporters by the PDS gene are associated with Pendred syndrome (PS) and nonsyndromic deafness type DFNB4. The fourth member of the family transports anions such as sulfuric acid, oxalic acid, and bicarbonate. The fifth member functions as a motor protein for the outer hair cells of the cochlea. The sixth member, SLC26A6, was recently identified as a sulfate transporter (Waldegger, S. et al. (2001) Genomics 72: 4350 and references therein).
[0044]
Expression profile creation
Array technology can provide a simple way to explore the expression of a single polymorphic gene or the expression profile of many related or unrelated genes. When testing the expression of a single gene, the array is used to detect the expression of a particular gene or variant thereof. When testing expression profiles, the array provides a platform to identify genes such as: That is, which genes are tissue specific, affected by the substance being tested in the toxicity assay, are part of a signaling cascade, perform housekeeping functions, or have a specific genetic predisposition or condition Identification of genes that are specifically associated with a disease or disorder.
[0045]
Potential applications of gene expression profiling particularly relate to improved diagnosis, prognosis, and treatment of diseases that affect the immune response. Jurkat is an acute T cell leukemia cell line that grows actively without external stimulation. Jurkat is widely used to study signal transduction in human T cells.
[0046]
PMA is a broad activator of protein kinase C-dependent pathways. Ionomycin is a calcium ionophore that allows calcium to enter the cell and increases the concentration of calcium in the cytosol. The combination of PMA and ionomycin activates two of the major signaling pathways used by mammalian cells that interact with the environment. In T cells, the combination of PMA and ionomycin mimics secondary signaling events triggered during optimal B cell activation.
[0047]
The discovery of new transporters and ion channels and the polynucleotides encoding them has been used in the diagnosis, treatment and prevention of transport disorders, neurological diseases, muscle diseases, immune diseases, and cell proliferation disorders, as well as iron metabolic diseases, and The need in the art is met by providing such new compositions that are useful in assessing the effects of exogenous compounds on the expression of transporter and ion channel nucleic acid and amino acid sequences.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
【The invention's effect】
[0048]
The present invention is generically referred to as “TRICH” and individually “TRICH-1”, “TRICH-2”, “TRICH-3”, “TRICH-4”, “TRICH-5”, “TRICH-6”. Purified polypeptides that are transporters and ion channels referred to as “TRICH-7”, “TRICH-8”, “TRICH-9”. In certain embodiments, the invention provides: (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9; (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, or (d) An isolated polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 is provided. In one embodiment, the invention provides an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-9.
[0049]
The present invention also relates to (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, (b) at least 90% of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (d) SEQ ID NO An isolated polynucleotide is provided that encodes a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: 1-9. In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. In another embodiment, the polynucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18.
[0050]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 And (d) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of: A recombinant polynucleotide having a promoter sequence linked to is provided. In one embodiment, the present invention provides a cell transformed with this recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a transgenic organism comprising a recombinant polynucleotide.
[0051]
Furthermore, the present invention relates to (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9; A polypeptide comprising a natural amino acid sequence having 90% or more identity, and (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 , (D) a method for producing a polypeptide selected from the group consisting of an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. The production method comprises: (a) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expression of the polypeptide; (B) recovering the polypeptide so expressed.
[0052]
The invention further comprises (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 A polypeptide comprising a natural amino acid sequence that is identical, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (d) SEQ ID NO: 1 An isolated antibody is provided that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of -9.
[0053]
The invention further comprises (a) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18, (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence with at least 90% identity to (c) a polynucleotide complementary to (a), a polynucleotide complementary to (d) (b), and (e ) An isolated polynucleotide selected from the group consisting of the RNA equivalents of (a)-(d). In one embodiment, the polynucleotide has at least 60 contiguous nucleotides.
[0054]
The present invention further provides a method of detecting a target polynucleotide in a sample. Wherein the target polynucleotide is selected from (a) a polynucleotide having a certain polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18, and (b) a group consisting of SEQ ID NO: 10-18 A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to a polynucleotide sequence, (c) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a), (d) a polynucleotide of (b) A polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of a complementary polynucleotide and an RNA equivalent of (e) (a)-(d). The detection method comprises: (a) hybridizing the sample with a probe consisting of at least 20 consecutive nucleotide groups consisting of a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; and (b) The process comprises detecting the presence or absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex if present. The probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide or fragment thereof. In one embodiment, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0055]
The present invention also provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Wherein the target polynucleotide is (a) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18, (b) a polynucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to the sequence, (c) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a), (d) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (b) It has the sequence of a polynucleotide selected from the group consisting of nucleotides and RNA equivalents of (e) (a)-(d). The detection method comprises: (a) a process of amplifying a target polynucleotide or fragment thereof using polymerase chain reaction amplification; and (b) detecting the presence / absence of the amplified target polynucleotide or fragment thereof, Or, optionally, if the fragment is present, detecting the amount.
[0056]
The present invention further provides a composition comprising an effective amount of a polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient. An effective amount of the polypeptide comprises (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 and at least A polypeptide comprising a natural amino acid sequence that is 90% identical, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (d) SEQ ID Selected from the group consisting of immunogenic fragments of polypeptides having an amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 1-9. In one example, a composition comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 is provided. Furthermore, the present invention provides a method of treatment comprising administering the composition to a patient in need of treatment for a disease or symptom associated with a reduced expression of functional TRICH.
[0057]
The invention also provides (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (d) SEQ ID NO A method is provided for screening a compound to confirm the effectiveness as an agonist of a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of 1-9. The screening method includes (a) exposing a sample containing the polypeptide to a compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. Alternatively, the present invention provides a composition having an agonist compound identified by this method and an acceptable pharmaceutical excipient. In a further alternative, the present invention provides a method of treatment comprising administration of this composition to a patient in need of treatment of a disease or symptom associated with reduced expression of functional TRICH.
[0058]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (d) A method for screening certain compounds for the effectiveness as an antagonist of a polypeptide selected from the group consisting of: an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 provide. The screening method consists of (a) exposing a sample containing the polypeptide to a certain compound, and (b) detecting antagonistic activity in the sample. In one embodiment, the present invention provides a composition comprising an antagonist compound identified by this method and a pharmaceutically acceptable excipient. In yet another alternative, the present invention provides a method of treatment comprising administration of the composition to a patient in need of treatment of a disease or symptom associated with overexpression of functional TRICH.
[0059]
The invention further comprises (a) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, or (d) SEQ ID NO A method of screening for a compound that specifically binds to a polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: 1-9. The screening method comprises: (a) a process of mixing a polypeptide with at least one test compound under appropriate conditions; and (b) a compound that detects binding of the polypeptide to the test compound and thereby specifically binds to the polypeptide. Identifying the process.
[0060]
The invention further comprises (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. A polypeptide having a certain natural amino acid sequence having at least 90% identity, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, and (D) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9, a compound that modulates the activity of a polypeptide selected from the group consisting of Provide a method of screening. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under conditions acceptable for the activity of the polypeptide; and (b) converting the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide in the absence of the test compound. A change in the activity of the polypeptide at is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide.
[0061]
The present invention further provides a method of screening a compound for the effect of altering the expression of a target polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18. The method comprises (a) exposing a sample having the target polynucleotide to a compound, (b) detecting alterations in expression of the target polynucleotide, and (c) a variable amount of the compound. The process consists of comparing the expression of the target polynucleotide in the presence to the expression in the absence of the compound.
[0062]
The present invention further provides a method for calculating the toxicity of a test compound. This method includes (a) a process in which a biological sample having a nucleic acid group is treated with a test compound, and (b) a process in which the nucleic acid group in the treated biological sample is hybridized with a probe. (I) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18; (ii) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18; A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity of (iii) a polynucleotide having a sequence complementary to (i), (iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), (V) a group of at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide selected from the group consisting of the RNA equivalents of (i) to (iv). Hybridization occurs under conditions such that a specific hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide in the biological sample. The target polynucleotide is (i) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18, and (ii) a certain selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 A polynucleotide having a natural polynucleotide sequence having at least 90% identity to the polynucleotide sequence, (iii) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (i), (iv) complementary to the polynucleotide of (ii) Selected from the group consisting of (v) (i) to (iv) RNA equivalents. Alternatively, the target polynucleotide has a fragment of a polynucleotide sequence selected from the group consisting of (i) to (v) above. The toxicity calculation method further includes (c) the process of quantifying the amount of hybridization complex, and (d) the amount of hybridization complex of the treated biological sample, compared to the amount of untreated biological sample. A difference in the amount of hybridization complex in the treated biological sample, including the process of comparing to the amount of hybridization complex, indicates the toxicity of the test compound.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0063]
(Description of the present invention)
Although the proteins, nucleotide sequences and methods of the present invention will be described, it should be understood before that that the present invention is not limited to the particular devices, materials and methods described and may be modified. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the present invention which is limited only by the claims. Please also understand.
[0064]
As used in the claims and in the specification, the singular forms “a” and “its” may refer to the plural unless the context clearly dictates otherwise. Please note that. Thus, for example, when “a certain host cell” is described, there may be a plurality of such host cells, when “a certain antibody” is described, one or more antibodies, and It also refers to antibody equivalents known to those skilled in the art.
[0065]
All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art unless otherwise defined. Although any devices, materials, and methods similar or equivalent to those described herein can be used to practice or test the present invention, suitable devices, materials, and methods are now described. All publications referred to in this invention are cited for purposes of describing and disclosing cell lines, protocols, reagents and vectors that have been reported in the publications and may be used in connection with the present invention. is there. No disclosure in this specification is an admission that the invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
[0066]
(Definition)
The term “TRICH” is substantially purified from all species (especially mammals including cattle, sheep, pigs, mice, horses and humans), such as natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant. Refers to the amino acid sequence of TRICH.
[0067]
The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of TRICH. This agonist interacts directly with TRICH or interacts with components of biological pathways involving TRICH to regulate proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compound, A composition may be included.
[0068]
The term “allelic variant / mutant sequence” refers to another form of the gene encoding TRICH. Allelic variants can be made from at least one mutation in a nucleic acid sequence. It can also be made from a modified RNA or polypeptide. The structure or function of the polypeptide may or may not be mutated. A gene may not have any of its native allelic variant sequences, or may have more than one. The usual mutational changes that give rise to allelic variants are generally attributed to natural deletions, additions or substitutions of nucleotides. These various changes can occur one or more times within a sequence, either alone or together with other changes.
[0069]
A “transformed / modified” nucleic acid sequence encoding TRICH has various nucleotide deletions, insertions, or substitutions, resulting in at least one of the same polypeptides or functional characteristics of TRICH Refers to a polypeptide. This definition includes improper or unexpected hybridization of a polynucleotide sequence encoding TRICH with an allelic variant at a position that is not a normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotides of the polynucleotide encoding TRICH. It includes polymorphisms that are easily detectable or difficult to detect using a probe. The encoded protein can also be “transformed / modified” and can include deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that result in a silent change resulting in a functionally equivalent TRICH. Intentional amino acid substitutions are similar in terms of residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphiphilicity, as long as biological or immunological activity of TRICH is retained. Can be made based on. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids with uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, serine and threonine. Amino acids having uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine and valine, glycine and alanine, and phenylalanine and tyrosine.
[0070]
The terms “amino acid” and “amino acid sequence” refer to oligopeptides, peptides, polypeptides, protein sequences, or fragments of any thereof, and refer to natural or synthetic molecules. When an “amino acid sequence” refers to the sequence of a natural protein molecule, the “amino acid sequence” and similar terms are not limited to the complete and intact amino acid sequence associated with that protein molecule described.
[0071]
“Amplification” refers to the act of creating additional copies of a nucleic acid sequence. Amplification usually uses polymerase chain reaction (PCR) techniques known to those skilled in the art.
[0072]
The term “antagonist” is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of TRICH. Antagonists interact with TRICH directly or interact with components of biological pathways involving TRICH to modulate the activity of TRICH antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compound or composition Proteins such as objects can be included.
[0073]
The term “antibody” refers to intact immunoglobulin molecules and fragments thereof, such as Fab, F (ab ′) 2 and Fv fragments, which are capable of binding antigenic determinants. Antibodies that bind to TRICH polypeptides can be made using intact polypeptides, or fragments containing small peptides of interest, as immunizing antigens. The origin of the polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (mouse, rat, rabbit, etc.) can be RNA translation or chemical synthesis. They can also be conjugated to a carrier protein if desired. Commonly used carriers that chemically bond with peptides include bovine serum albumin, thyroglobulin, and mussel hemocyanin (KLH). This bound peptide is used to immunize the animal.
[0074]
The term “antigenic determinant” refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that makes contact with a particular antibody. When immunizing a host animal with a protein or protein fragment, multiple regions of the protein can induce the production of antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a specific region or three-dimensional structure of the protein). Certain antigenic determinants can compete with an intact antigen (ie, an immunogen used to elicit an immune response) for binding to certain antibodies.
[0075]
The term “aptamer” refers to a nucleic acid or oligonucleotide molecule that binds to a specific molecular target. Aptamersin vitro(E.g. SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment), described in US Pat. No. 5,270,163). This is a process of selecting target-specific aptamer sequences from a large group of combinatorial libraries. Aptamer composition is double-stranded or single-stranded and may include deoxyribonucleotides, ribonucleotides, nucleotide derivatives, or other nucleotide-like molecules. Each nucleotide component of an aptamer may have a modified sugar group (for example, the 2'-OH group of ribonucleotides is 2'-F or 2'-NH2This may improve desired properties such as resistance to nucleases or longer life in blood. By conjugating the aptamer to other molecules (eg, high molecular weight carriers), clearance of the aptamer from the circulatory system can be delayed. Aptamers can be specifically cross-linked with their respective homologous ligands, for example by photoactivation of a cross-linking agent (see, for example, Brody, E.N. and L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74: 5-13).
[0076]
The term “intramer”in vivoMeans an aptamer expressed in For example, RNA expression systems based on vaccinia virus have been used to express high levels of specific RNA aptamers in the cytoplasm of leukocytes (Blind, M. et al. (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 3606-3610).
[0077]
The term “spiegelmer” refers to aptamers comprising L-DNA, L-RNA or other levorotary nucleotide derivatives or nucleotide-like molecules. Aptamers containing levorotatory nucleotides are resistant to degradation by natural enzymes that normally act on substrates containing dextrorotatory nucleotides.
[0078]
The term “antisense” refers to any composition capable of forming base pairs with the “sense” (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense compositions include DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA), modified backbone linkages such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, modified sugar groups such as 2 ' There are oligonucleotides with 2-methoxyethyl sugar or 2'-methoxyethoxy sugar, or oligonucleotides with modified bases such as 5-methylcytosine, 2-deoxyuracil or 7-deaza-2'-deoxyguanosine obtain. Antisense molecules can be produced by any method, such as chemical synthesis or transcription. When introduced into a cell, a complementary antisense molecule forms base pairs with the natural nucleic acid sequence produced by the cell and forms a duplex that prevents transcription or translation. The expression “negative” or “minus” can mean the antisense strand of a reference DNA molecule, and the expression “positive” or “plus” can mean the sense strand of a reference DNA molecule.
[0079]
The term “biologically active” refers to a protein having the structural, regulatory, or biochemical functions of a natural molecule. Similarly, the term “immunologically active” or “immunogenic” means that natural or recombinant TRICH, synthetic TRICH, or any oligopeptide thereof, is capable of producing a specific immune response in an appropriate animal or cell. Refers to the ability to induce and bind to a specific antibody.
[0080]
“Complementary” refers to the relationship between two single-stranded nucleic acid sequences that anneal by base pairing. For example, “5′-AGT-3 ′” forms a pair with its complementary sequence “3′-TCA-5 ′”.
[0081]
“A composition comprising (having) a polynucleotide sequence of” or “a composition comprising (having) an amino acid sequence of” in a broad sense refers to any composition comprising a predetermined polynucleotide sequence or amino acid sequence. The composition can include a dry formulation or an aqueous solution. A composition comprising a polynucleotide sequence encoding TRICH or a fragment of TRICH can be used as a hybridization probe. These probes can be stored in lyophilized form and can be conjugated with stabilizers such as carbohydrates. In hybridization, the probe is dispersed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, sodium dodecyl sulfate; SDS) and other components (eg, Denhart's solution, milk powder, salmon sperm DNA, etc.) be able to.
[0082]
The “consensus sequence” is obtained by repeatedly analyzing the DNA sequence in order to separate unnecessary bases, extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), Resequenced nucleic acid sequences or one or more overlapping cDNAs using computer programs for fragment assembly such as GELVIEW fragment assembly system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA) EST, or nucleic acid sequence assembled from genomic DNA fragments. Some sequences perform both extension and assembly to create a consensus sequence.
[0083]
The term “conservative amino acid substitution” refers to a substitution that is predicted to change little in the properties of the original protein. That is, the structure of the protein, particularly its function, is preserved and does not change significantly by substitution. The table below shows the amino acids that can be substituted for the original amino acids in the protein and are recognized as conservative amino acid substitutions.
Figure 2005507238
[0084]
Conservative amino acid substitutions usually include (a) the backbone structure of the polypeptide in the substitution region, eg, a β-sheet or α-helical structure, (b) the molecular charge or hydrophobicity at the substitution site, and / or (c) the side chain. Holds the occupied volume.
[0085]
The term “deletion” refers to a change in an amino acid sequence that lacks one or more amino acid residues, or a change in a nucleotide sequence that lacks one or more nucleotides.
[0086]
The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. For example, replacement of hydrogen with an alkyl group, acyl group, hydroxyl group or amino group can be included in chemical modification of the polynucleotide. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains at least one biological or immunological function of the natural molecule. A polypeptide derivative is a polypeptide that has been modified by the following process. That is, glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function of the originating polypeptide.
[0087]
“Detectable label” refers to a reporter molecule or enzyme that is covalently or non-covalently bound to a polynucleotide or polypeptide capable of generating a measurable signal.
[0088]
“Differential expression” refers to an increase (upregulation) or decrease (downregulation), or a loss of gene expression or protein expression, as determined by comparing at least two different samples. Such a comparison can be made, for example, between a treated sample and an untreated sample, or a diseased sample and a normal sample.
[0089]
“Exon shuffling” refers to the recombination of different coding region (exon) groups. Because an exon can represent one structural or functional domain of the encoded protein, new combinations of stable substructures can be assembled into new proteins and Can promote evolution.
[0090]
The term “fragment” refers to a unique portion of TRICH or a polynucleotide encoding TRICH that is identical to its parent sequence but shorter in length. A fragment may have a length that is less than the total length of the defined sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have 5 to 1000 consecutive nucleotide or amino acid residues. Fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes are at least 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, It may be 250, or at least 500 contiguous nucleotides or amino acid residue lengths. Fragments can be preferentially selected from specific regions of a molecule. For example, a polypeptide fragment is a length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids (or the first 25% or 50%) of a polypeptide as found within a defined sequence. Can have. These lengths are clearly given by way of example, and in embodiments of the invention can be any length supported by this specification including the sequence listing, tables and drawings.
[0091]
A fragment of SEQ ID NO: 10-18 has a region of unique polynucleotide sequence that specifically identifies SEQ ID NO: 10-18, for example, which differs from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. . Certain fragments of SEQ ID NO: 10-18 are useful, for example, for hybridization and amplification techniques, or for similar methods of distinguishing SEQ ID NO: 10-18 from related polynucleotide sequences. The exact length of the fragment of SEQ ID NO: 10-18 and the region of SEQ ID NO: 10-18 that the fragment corresponds to can be routinely determined by one skilled in the art based on the intended purpose for the fragment. is there.
[0092]
Certain fragments of SEQ ID NO: 1-9 are encoded by certain fragments of SEQ ID NO: 10-18. Certain fragments of SEQ ID NO: 1-9 have unique amino acid sequence regions that specifically identify SEQ ID NO: 1-9. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1-9 are useful as immunogenic peptides in the development of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1-9. The exact length of a fragment of SEQ ID NO: 1-9 and the region of SEQ ID NO: 1-9 corresponding to this fragment is based on the intended purpose of the fragment, Can be determined.
[0093]
A “full length” polynucleotide sequence is a sequence having at least one translation start codon (eg, methionine) followed by an open reading frame and a translation stop codon. A “full length” polynucleotide sequence encodes a “full length” polypeptide sequence.
[0094]
The term “homology” means sequence similarity, interchangeability, or sequence identity between two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences.
[0095]
The terms “percent match” and “˜% identical” as applied to a polynucleotide sequence refer to the percentage of residues that match between two or more polynucleotide sequences aligned using a standardized algorithm. . Such a standardization algorithm compares the two sequences more significantly because it can insert gaps into the two sequences to be compared in a standardized and reproducible way to optimize the alignment between the two sequences. it can.
[0096]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using CLUSTAL V algorithm default parameters such as those incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package (a set of molecular biological analysis programs) (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is described in Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153, Higgins, D.G. et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. The default parameters when aligning polynucleotide sequences in pairs are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. Select a weighted table of “weighted” residues as default. Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, “diagonals saved” = 4. A “weighted” residue weight table is selected by default. The percent identity is reported by CLUSTAL V as the “percent similarity” between the aligned polynucleotide sequences.
[0097]
Alternatively, the National Local Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is commonly used and provides a set of free sequence comparison algorithms (Altschul, SF et al. (1990) ) J. Mol. Biol. 215: 403-410). This algorithm is available from several sources, and is also available from NCBI in Bethesda, Maryland and the Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The BLAST software suite includes a variety of sequence analysis programs, including “blastn” used to align a known polynucleotide sequence with another polynucleotide sequence from various databases. A tool called “BLAST 2 Sequences” is also available, which is used to directly compare two nucleotide sequences. “BLAST 2 Sequences” can be used interactively by accessing http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html. The “BLAST 2 Sequences” tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are generally used with parameters such as gaps set to default settings. For example, to compare two nucleotide sequences, blastn can be performed using the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) set to default parameters. An example of setting default parameters is shown below.
[0098]
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
[0099]
The percent identity can be measured over the full length of a defined sequence (eg, a sequence defined with a particular SEQ ID number). Alternatively, the percentage match for shorter lengths, eg, lengths of defined fragments obtained from larger sequences (eg, fragments of at least 20, 30, 40, 50, 70, 100 or 200 consecutive nucleotides) May be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and the percent identity can be measured using any fragment length supported by the sequences described herein, including tables, figures, and sequence listings. It should be understood that a certain length can be described.
[0100]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of identity may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It should be understood that this degeneracy can be used to cause changes in a nucleic acid sequence to produce a large number of nucleic acid sequences in which all nucleic acid sequences encode substantially the same protein.
[0101]
The term “percent match” or “˜% identity” as used for a polypeptide sequence refers to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Methods for polypeptide sequence alignment are known. Some alignment methods take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions as detailed above usually preserve the charge and hydrophobicity of the substitution site, thus preserving the structure of the polypeptide (and thus also the function).
[0102]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm, such as those incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (see above for explanation). Default parameters for pairwise alignment of polypeptide sequences using CLUSTAL V are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, “diagonals saved” = 5. The PAM250 matrix is selected as the default residue weight table. As with polynucleotide alignment, the percent identity of aligned polypeptide sequence pairs is reported by CLUSTAL V as “percent similarity”.
[0103]
Alternatively, the NCBI BLAST software suite may be used. For example, when comparing two polypeptide sequences pairwise, one would use blastp with the “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) set with default parameters. . An example of setting default parameters is shown below.
[0104]
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
[0105]
The percent identity can be measured for the entire length of a defined polypeptide sequence (eg, a sequence defined by a particular SEQ ID number). Alternatively, a shorter length, eg, the length of a fragment derived from a defined larger polypeptide sequence (eg, a fragment of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70, or 150 consecutive residues). Can also be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and the percent identity can be measured using any fragment length supported by the sequences described herein, including tables, figures, and sequence listings. It should be understood that a certain length can be described.
[0106]
“Human Artificial Chromosome (HAC)” is a linear microchromosome containing all the elements necessary for chromosomal replication, segregation and maintenance, which may contain a DNA sequence of about 6 kb (kilobase) to 10 Mb in size. .
[0107]
The term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been modified to resemble a more human antibody while retaining its original binding ability.
[0108]
“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms base pairs with a complementary single strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization is an indication that two nucleic acid sequences share high complementarity. Specific hybridization complexes are formed under acceptable annealing conditions and remain hybridized after one or more “washing” steps. The washing step is particularly important in determining the stringency of the hybridization process, and under more stringent conditions, nonspecific binding (ie, binding between nucleic acid strand pairs that are not perfectly matched) is reduced. The permissive conditions for nucleic acid sequence annealing can be routinely determined by those skilled in the art. The permissive conditions can be constant for any hybridization experiment, but the wash conditions can be varied from experiment to experiment to obtain the desired stringency and thus also hybridization specificity. Permissive annealing conditions are, for example, at a temperature of 68 ° C., in the presence of about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS, and about 100 μg / ml shear-denatured salmon sperm DNA. .
[0109]
In general, the stringency of hybridization can be expressed to some extent relative to the temperature at which the wash step is performed. Such washing temperature is usually selected to be about 5-20 ° C. below the melting point (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under conditions of a predetermined ionic strength and pH. The formula for calculating Tm and hybridization conditions for nucleic acids are well known, Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, see especially chapter 9 in volume 2.
[0110]
High stringency hybridization between polynucleotides of the invention involves a 1 hour wash step at about 68 ° C. in the presence of about 0.2 × SSC and about 0.1% SDS. Alternatively, it is performed at a temperature of about 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, or 42 ° C. The SSC concentration can be varied in the range of about 0.1-2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, a blocking agent is used to prevent nonspecific hybridization. Such blocking agents include, for example, about 100-200 μg / ml sheared denatured salmon sperm DNA. For example, in the hybridization of RNA and DNA under specific conditions, an organic solvent such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can also be used. Useful variations of the wash conditions will be apparent to those skilled in the art. Hybridization can indicate evolutionary similarity between nucleotides, particularly under high stringency conditions. Evolutionary similarity strongly suggests a similar role for nucleotide groups and nucleotide-encoded polypeptides.
[0111]
The term “hybridization complex” refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by the formation of hydrogen bonds between complementary bases. Hybridization complexes can be formed in solution (C0t or R0t analysis etc.). Alternatively, one nucleic acid sequence is present in a dissolved state and the other nucleic acid sequence is a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin or glass slide, or other suitable substrate that is a cell or nucleic acid thereof. Can be formed between two nucleic acid sequences that are immobilized on a substrate to which is immobilized.
[0112]
The term “insertion” or “addition” refers to a change in an amino acid sequence or nucleic acid sequence to which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0113]
"Immune response" can refer to symptoms associated with inflammation, trauma, immune disorders, infectious diseases or genetic diseases and the like. These symptoms can be characterized by the expression of various factors that can affect cellular and systemic defense systems, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules.
[0114]
The term “immunogenic fragment” refers to a polypeptide or oligopeptide fragment of TRICH that, when introduced into a living animal such as a mammal, causes an immune response. The term “immunogenic antigenic fragment” also includes any polypeptide or oligopeptide fragment of TRICH useful in any antibody production method as disclosed herein or as known in the art. .
[0115]
The term “microarray” refers to the organization of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0116]
The term “element” or “array element” refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound having a specific designated position on a microarray.
[0117]
The term “modulate” or “modulation of activity” refers to a change in the activity of TRICH. For example, modulation results in an increase or decrease in protein activity of TRICH, or a change in binding properties or other biological, functional or immunological properties.
[0118]
The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” also refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin that can be single-stranded or double-stranded, or can represent the sense or antisense strand It may also refer to peptide nucleic acid (PNA) or any DNA-like or RNA-like substance.
[0119]
“Functionally linked” refers to a state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. Functionally linked DNA sequences can be very close or contiguous. Alternatively, if necessary to join two protein coding regions, they can be in the same reading frame.
[0120]
“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or anti-gene agent comprising an oligonucleotide of at least about 5 nucleotides in length, attached to the peptide backbone of amino acid residues ending in lysine. The terminal lysine imparts solubility to the composition. PNA binds preferentially to complementary single-stranded DNA or RNA and stops transcriptional elongation. Polyethylene glycolation can extend the lifetime of PNA in cells.
[0121]
“Post-translational modifications” of TRICH can include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzyme environment of TRICH and will vary depending on the cell type.
[0122]
A “probe” is a nucleic acid sequence that encodes the same sequence or allelic nucleic acid sequence, a related sequence of TRICH, a complementary sequence thereof, or a fragment thereof. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide that is a sequence attached to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioactive isotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, that can form complementary base pairs and anneal to a target polynucleotide. The primer can then be extended along the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme. Primer pairs can be used for amplification (and identification) of nucleic acid sequences, for example, by polymerase chain reaction (PCR).
[0123]
Probes and primers as used in the present invention typically contain at least 15 contiguous nucleotides of known sequence. To increase specificity, longer probes and primers, such as probes consisting of at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or at least 150 consecutive nucleotides of the disclosed nucleic acid sequence And primers may also be used. Some probes and primers are much longer than this. It should be understood that nucleotides of any length supported by this specification, including tables, drawings and sequence listings may be used.
[0124]
See Sambrook, J. et al. (1989) for the preparation and use of probes and primers.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Ausubel, F.M., et al. (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY, Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications See Academic Press, San Diego CA, etc. PCR primer pairs can be obtained from known sequences using a computer program for that purpose, such as using Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA).
[0125]
The selection of oligonucleotides to be used as primers is performed using software well known in the art for such purposes. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs up to 100 nucleotides each, derived from oligonucleotides and up to 5,000 larger polynucleotides, up to 32 kilobases of input polynucleotide sequences. It is also useful for analyzing. Similar primer selection programs incorporate additional functionality for extended capabilities. For example, the PrimOU primer selection program (available to the general public from the Genome Center of the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) can select specific primers from the megabase sequence, and thus the entire genome range. This is useful for designing primers. Using the Primer3 primer selection program (available from the Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Cambridge, Mass.), You can enter a “mispriming library” that allows you to specify the sequences you want to avoid as primer binding sites. Primer3 is particularly useful for the selection of oligonucleotides for microarrays (the source code for the latter two primer selection programs can be obtained from their respective sources and modified to meet user-specific needs). The PrimerGen program (available from the UK Human Genome Mapping Project in Cambridge, UK-publicly available from the Resource Center) designs primers based on multiple sequence alignments, thereby maximal or minimal conservation of aligned nucleic acid sequences Allows selection of primers that hybridize to any of the regions. Therefore, this program is useful for identifying oligonucleotides and polynucleotide fragments, whether original or conserved. Oligonucleotides and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods identify complete or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, eg, as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples Useful as a specific probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
[0126]
A “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence, but a sequence that artificially combines two or more separated segments of a sequence. This artificial combination is often achieved by chemical synthesis, but more commonly by artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, for example by genetic engineering as described in Sambrook et al. (Supra). Achieve by technique. The term recombinant nucleic acid also includes nucleic acids in which a portion of the nucleic acid has been modified by addition, substitution or deletion. Often recombinant nucleic acids include a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such recombinant nucleic acids can be part of a vector that is used, for example, to transform a cell.
[0127]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid can be part of a viral vector, which can be based, for example, on vaccinia virus. Such vectors can be used to inoculate a mammal and the recombinant nucleic acid is expressed to induce a protective immune response in the mammal.
[0128]
“Regulators” are nucleic acid sequences that are usually derived from untranslated regions of a gene, and include enhancers, promoters, introns, and 5 ′ and 3 ′ untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that control transcription, translation or RNA stability.
[0129]
A “reporter molecule” is a chemical or biochemical component used to label a nucleic acid, amino acid or antibody. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, color formers, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles and other components known in the art.
[0130]
In the present specification, the “RNA equivalent” for a DNA sequence is composed of the same linear nucleic acid sequence as the reference DNA sequence, but the thymine of the nitrogenous base is replaced with uracil, and the backbone of the sugar chain is It consists of ribose instead of deoxyribose.
[0131]
The term “sample” is used in its broadest sense. Samples presumed to contain TRICH, a nucleic acid encoding TRICH, or a fragment thereof include body fluids, extracts from cells and chromosomes, organelles or membranes, cells, May include genomic DNA, RNA, cDNA, tissue, tissue prints, etc. present in solution or immobilized on a substrate.
[0132]
The terms “specific binding” and “specifically bind” refer to the interaction of a protein or peptide with an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction depends on whether there is a specific structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if an antibody is specific for epitope “A”, a polypeptide with epitope A may bind or bind in a reaction involving unbound labeled “A” and the antibody. If unlabeled “A” is present, the amount of labeled A bound to the antibody is reduced.
[0133]
The term “substantially purified” refers to an isolated or separated nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from the natural environment and has at least 60% removed from the naturally bound composition. Preferably, 75% or more removed, most preferably 90% or more removed.
[0134]
“Substitution” is the replacement of one or more amino acid residues or nucleotides with another amino acid residue or nucleotide, respectively.
[0135]
The term “substrate” refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate can have various surface forms such as wells, grooves, pins, channels, holes, and the like, and polynucleotides and polypeptides bind to the substrate surface.
[0136]
A “transcript image” or “expression profile” refers to the pattern of collective gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under given conditions.
[0137]
“Transformation” is the process by which foreign DNA is introduced into a recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to various methods known in the art, and is any known method that inserts an exogenous nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. Based on this method. The method of transformation is selected according to the type of host cell to be transformed. Non-limiting transformation methods include bacteriophage or viral infection, electroporation, heat shock, lipofection, and particle bombardment. A “transformed cell” includes a stably transformed cell in which the introduced DNA is replicable as an autonomously replicating plasmid or as part of a host chromosome. Furthermore, cells that transiently express introduced DNA or RNA for a limited period are also included.
[0138]
As used herein, a “transgenic organism” is any organism, including but not limited to animals and plants, in which one or more cells of the organism are, for example, Has heterologous nucleic acid introduced by transgenic techniques well known in the art. Nucleic acids are introduced into cells either directly or indirectly by introduction into cell precursors, by planned genetic manipulation, for example, by microinjection or by infection with recombinant viruses. Alternatively, the nucleic acid can be introduced by infecting a recombinant viral vector, such as a lentiviral vector (Lois, C. et al. (2002) Science 295: 868-872). The term genetic manipulation means classical crossbreeding orin vitroIt does not refer to fertilization but refers to the introduction of recombinant DNA molecules. Among the genetic transformants expected in accordance with the present invention are bacteria, cyanobacteria, fungi and animals and plants. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods known in the art, such as infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the present invention into such organisms are well known and are given in references such as Sambrook et al. (1989) supra.
[0139]
A “variant” of a particular nucleic acid sequence is defined as a nucleic acid sequence that has at least 40% homology with the particular nucleic acid sequence over the length of one nucleic acid sequence. At that time, “blastn” is executed by using “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as default parameters. Such nucleic acid pairs are, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% for a given length, It can show 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence identity. Certain variants may be described, for example, as “allelic” variants (described above), “splice” variants, “species” variants, or “polymorphic” variants. Splice variants may have significant identity to the reference molecule, but will usually have more or fewer nucleotides due to alternative splicing of exons during mRNA processing. Corresponding polypeptides may have additional functional domain groups or may lack domain groups present in the reference molecule. Species variants are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides usually have significant amino acid identity with each other. A polymorphic variant is a variation in the polynucleotide sequence of a particular gene between individuals of a given species. Polymorphic variants can also include “single nucleotide polymorphisms” (SNPs) that differ in one nucleotide base of the polynucleotide sequence. The presence of SNPs can indicate, for example, a particular population, condition or disease propensity.
[0140]
A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a polypeptide sequence that has at least 40% homology to the particular polypeptide sequence over the entire length of one polypeptide sequence. For definition, blastp is executed by using “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) set as default parameters. Such polypeptide pairs are, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 for a given length of one polypeptide. %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence identity may be exhibited.
[0141]
(invention)
The present invention is based on the discovery of novel human transporters and ion channels (TRICH), and polynucleotides encoding TRICH. It is also based on the discovery of diagnosis, prophylaxis, and treatment of transport disorders, neurological diseases, muscle diseases, immune diseases, and abnormal cell proliferation using these compositions.
[0142]
Table 1 summarizes the nomenclature for the full-length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide correlates to one Incyte project identification number (Incyte project ID). Each polypeptide sequence was represented by a polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO :) and an Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Each polynucleotide sequence was represented by a polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO :) and an Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID).
[0143]
Table 2 shows sequences homologous to the polypeptides of the present invention identified by BLAST analysis against the GenBank protein (genpept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the present invention. Column 3 shows the GenBank identification number (Genbank ID NO :) of the closest homolog of GenBank. Column 4 shows the probability score for a match between each polypeptide and one or more of its homologues. Column 5 shows appropriate citations where applicable and one or more annotations of GenBank homologues, all of which are specifically incorporated herein by reference.
[0144]
Table 3 shows various structural features of the polypeptides of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID) for each polypeptide of the invention. Column 3 shows the number of amino acid residues of each polypeptide. Columns 4 and 5 show potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the GCG sequence analysis software package MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI). Column 6 shows the amino acid residues that include the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for the analysis of the structure / function of the protein, and the applicable part further shows a searchable database used for the analysis method.
[0145]
Tables 2 and 3 together summarize the properties of each polypeptide of the present invention, which establishes that the claimed polypeptides are transporters and ion channels. For example, SEQ ID NO: 3 is Caulobacter (Caulobacter crescentus) MotA / TolQ / ExbB proton channel family protein (GenBank ID g13424917) has been shown by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 50% identity from residue A14 to residue R236 (Table) 2). The BLAST probability score is 6.2e-53, indicating the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 3 also has one MotA / TolQ / ExbB proton channel family domain, which is a statistically significant PFAM database of conserved protein family domains based on the hidden Markov model (HMM). Was determined by searching for significant matches (see Table 3). Data from further BLAST analysis provides more confirmatory evidence that SEQ ID NO: 3 is a proton channel. In another example, SEQ ID NO: 4 is 99% identical to the human calcium channel alpha-2-delta3 subunit (GenBank ID g7105926) from residue G88 to residue R947. Confirmed with Tool (BLAST) (see Table 2). The BLAST probability score is 0.0, indicating the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 4 also has a cache domain, which is determined by searching for statistically significant matches in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM). (See Table 3). Data from BLIMPS and MOTIFS analyzes provide evidence to further confirm that SEQ ID NO: 4 is a calcium channel α-2-δ3 subunit. In another example, SEQ ID NO: 5 is 81% identical to the mouse urea transporter UTA-3 (GenBank ID g11177180) from residue E8 to residue E461. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (See Table 2). The BLAST probability score is 4.0e-207, indicating the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 6 also has 40% identity to the anion transporter (GenBank ID g13344999), a human solute carrier family 26 member 6 protein (SLC26A6) from residue E43 to L443, with a BLAST probability score 4.0e-93. SEQ ID NO: 6 also has a sulfate transporter domain, which is determined by searching for statistically significant matches in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM) (See Table 3). Data from BLIMPS analysis provides further empirical evidence that SEQ ID NO: 6 is a sulfate transporter. In another example, SEQ ID NO: 7 indicates that residues M1 to E323 are 96% identical to the human GT mitochondrial solute carrier protein (GenBank ID g386960) and the Basic Local Alignment Search Tool ( BLAST) (see Table 2). The BLAST probability score is 6.2e-167, indicating the probability that an observed polypeptide sequence alignment will be obtained by chance. SEQ ID NO: 7 also has a mitochondrial carrier protein domain, which searches for a statistically significant match in the conserved protein family domain PFAM database based on the Hidden Markov Model (HMM). Determined (see Table 3). Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analyzes provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 7 is a mitochondrial carrier protein. SEQ ID NO: 1-2 and SEQ ID NO: 8-9 were analyzed and annotated in a similar manner. The algorithm and parameters for analysis of SEQ ID NO: 1-9 are listed in Table 7.
[0146]
As shown in Table 4, the full-length polynucleotide sequences of the present invention were assembled using cDNA sequences or coding (exon) sequences derived from genomic DNA, or any combination of these two sequences. Column 1 shows the polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO) and the corresponding Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte ID) for each polynucleotide of the invention, and the length of each polynucleotide sequence in base pairs. Yes. Column 2 shows the nucleotide start position (5 ') and stop position (3') of the cDNA sequence and / or genomic sequence used in the assembly of the full length polynucleotide sequence of the present invention, and SEQ ID NO: 10-18. Nucleotide start position (5 ′) of a fragment of a polynucleotide sequence useful for identifying or distinguishing SEQ ID NO: 10-18 from the associated polynucleotide sequence (e.g., hybridization or amplification techniques) And the end position (3 ').
[0147]
The polynucleotide fragment described in column 2 of Table 4 may specifically refer to Incyte cDNA derived from, for example, a tissue-specific cDNA library or a pooled cDNA library. Alternatively, the polynucleotide fragment listed in column 2 may refer to a GenBank cDNA or EST that contributed to the assembly of the full length polynucleotide sequence. In addition, the polynucleotide fragments listed in column 2 may identify sequences from the ENSEMBL (The Sanger Centre, Cambridge, UK) database (ie, sequences that include the designation “ENST”). Alternatively, the polynucleotide fragments listed in column 2 may be derived from the NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records database (ie, sequences containing the designation “NM” or “NT”) and from the NCBI RefSeq Protein Sequence Records. (Ie, sequences that include the designation “NP”). Alternatively, the polynucleotide fragment described in column 2 may refer to an assembly consisting of both cDNA and Genscan predicted exons combined by an “exon-stitching” algorithm. For example, FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_NThree_NFour  The polynucleotide sequence identified as has the cluster identification number XXXXXX to which the algorithm is applied, the prediction number generated by the algorithm is YYYYY, and N (if present)1,2,3 ..Is a `` stitched '' sequence that is a specific exon that may have been manually edited during analysis (Example 5See). Alternatively, the polynucleotide fragments in row 2 may refer to an assembly of exons joined together by an “exon-stretching” algorithm. For example, the polynucleotide sequence identified as FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N is a “stretch” sequence. Where XXXXXX is the Incyte project identification number, gAAAAA is the GenBank identification number of the human genome sequence to which the “exon stretching” algorithm is applied, and gBBBBB is the GenBank identification number or NCBI RefSeq identification number of the closest GenBank protein homologue. (Example 5See ) When a RefSeq sequence is used as a protein homolog for the “exon stretching” algorithm, the RefSeq identification number (represented by “NM”, “NP”, or “NT”) is the GenBank identifier ( That is, it may be used instead of gBBBBB).
[0148]
Alternatively, the prefix code identifies a component sequence derived from a manually edited component sequence, a component sequence predicted from a genomic DNA sequence, or a combined sequence analysis method. The following table lists the constituent sequence prefix codes and examples of sequence analysis methods corresponding to the prefix codes (Examples 4 and 5See).
Figure 2005507238
[0149]
In some cases, an Incyte cDNA coverage that overlapped the sequence coverage as shown in Table 4 was obtained to confirm the final consensus polynucleotide sequence, but the associated Incyte cDNA identification number was not shown.
[0150]
Table 5 shows a representative cDNA library for full-length polynucleotide sequences assembled using Incyte cDNA sequences. A representative cDNA library is the Incyte cDNA library most frequently represented by the Incyte cDNA sequences used to assemble and confirm the polynucleotide sequences described above. The tissues and vectors used to construct the cDNA library are shown in Table 5 and described in Table 6.
[0151]
The invention also includes variants of TRICH. Preferred TRICH variants have at least one functional or structural characteristic of TRICH and have at least about 80% amino acid sequence identity to the TRICH amino acid sequence, or at least about 90% amino acid sequence Have identity, and at least about 95% amino acid sequence identity.
[0152]
The present invention also provides a polynucleotide encoding TRICH. In certain embodiments, the present invention provides a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 encoding TRICH. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10-18 also includes an equivalent RNA sequence as shown in the sequence listing, where the occurrence of the nitrogen base thymine is replaced by uracil and the sugar backbone is deoxyribose. There is no ribose.
[0153]
The present invention also includes variant sequences of polynucleotide sequences encoding TRICH. In particular, such a variant sequence of the polynucleotide sequence is at least about 70% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide sequence encoding TRICH, or at least about 85% polynucleotide sequence identity, and at least about at least about Has as much as 95% polynucleotide sequence identity. Certain embodiments of the present invention have at least about 70% polynucleotide sequence identity with a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18, or at least about 85% polynucleotide sequence identity, Provides a variant sequence of a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 having at least about 95% polynucleotide sequence identity. Any of the polynucleotide variants described above encodes an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of TRICH.
[0154]
Additionally or alternatively, the polynucleotide variants of the invention are splice variants of the polynucleotide sequence encoding TRICH. Splice variants may have multiple portions with significant sequence identity to the polynucleotide sequence encoding TRICH, but by addition or deletion of sequence blocks by alternative splicing of exons during mRNA processing. Usually it will have more or fewer polynucleotides. A splice variant may have less than about 70%, alternatively about 60%, alternatively less than about 50% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide sequence encoding TRICH for its entire length, but some of the splice variants The portions will have at least about 70%, alternatively at least about 85%, alternatively at least about 95%, alternatively 100%, with each portion of the polynucleotide sequence encoding TRICH. Any of the splice variant sequences described above can encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of TRICH.
[0155]
The degeneracy of the genetic code can create various polynucleotide sequences that code for TRICH, including those that have minimal similarity to the polynucleotide sequence of any known naturally occurring gene. Those skilled in the art will understand that. Thus, the present invention can cover all possible variations of polynucleotide sequences that can be produced by selection of combinations based on possible codon selection. These combinations are made on the basis of the standard triplet genetic code applied to the native TRICH polynucleotide sequence. Also consider that all these mutations are clearly disclosed.
[0156]
Nucleotide sequences encoding TRICH and its mutant sequences are generally substantially different, such as including non-natural codons, although they can hybridize to the nucleotide sequence of native TRICH under suitably chosen stringent conditions. It may be beneficial to make a nucleotide sequence encoding TRICH or a derivative thereof having a high codon usage. Codons can be selected to increase the expression rate of peptides generated in a particular eukaryotic or prokaryotic host based on the frequency with which the host utilizes a particular codon. Another reason for substantially altering the nucleotide sequence encoding TRICH and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence has favorable properties such as longer half-life than transcripts made from the native sequence May make RNA transcripts.
[0157]
The invention also includes the complete creation of DNA sequences encoding TRICH and its derivatives or fragments thereof by synthetic chemistry. After production, this synthetic sequence can be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to introduce mutations into sequences encoding TRICH or any fragment thereof.
[0158]
The invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing under the various stringency conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NO: 10-18 and fragments thereof. (See, for example, Wahl, GM, and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, Kimmel, AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in “Definitions”.
[0159]
Methods for DNA sequencing are known in the art, and any embodiment of the present invention can be performed using DNA sequencing methods. Enzymes can be used for DNA sequencing methods. For example, Klenow fragment of DNA polymerase 1, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), thermostable T7 polymerase (Amersham Biosciences, Piscataway NJ) can be used. Alternatively, a polymerase and a proofreading exonuclease can be used in combination, as seen, for example, in the ELONGASE amplification system (Invitrogen, Carlsbad CA). Preferably, sequence preparation is automated using equipment such as the MICROLAB 2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), the PTC200 thermal cycler (MJ Research, Watertown MA), and the ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems). The sequencing is then performed using the ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Applied Biosystems), the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Amersham Biosciences) or other methods known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (Ausubel, F.M. (1997)Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7, Meyers, R.A. (1995)Molecular Biology and BiotechnologyWiley VCH, New York NY, pages 856-853).
[0160]
Various methods based on PCR, well known in the art, use partial nucleotide sequences to extend TRICH-encoding nucleic acid sequences and detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. sell. For example, restriction site PCR, one of the methods that can be used, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using a universal primer and a nested primer (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318322 etc.). Another method is inverse PCR, which amplifies an unknown sequence from a circularized template using primers extended in a wide range of directions. The template is obtained from a group of restriction enzymes consisting of a certain known genomic locus and its surrounding sequences (see, eg, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). A third method is capture PCR, which is involved in PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosome DNA (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods). Applic 1: 111-119 etc.). In this method, it is possible to insert a recombinant double-stranded sequence into an unknown sequence region using a plurality of restriction enzyme digestion and ligation reactions before PCR. Other methods that can be used to search for unknown sequences are known in the art (see Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060, etc.). In addition, genomic DNA can be walked using PCR, nested primers and PromoterFinder ™ library (Clontech, Palo Alto CA). This procedure is useful for finding intron / exon junctions without having to screen the library. All PCR-based methods use commercially available software such as OLIGO 4.06 primer analysis software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program and are about 22-30 nucleotides in length and have a GC content of Primers can be designed to anneal to the template at about 50% or more and at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
[0161]
When screening for full-length cDNA groups, it is preferable to use library groups that are size-selected to include larger cDNA groups. In addition, random primer libraries often contain sequences having the 5 ′ region of the gene cluster and are suitable for situations in which an oligo d (T) library cannot produce a full-length cDNA. Genomic libraries may be useful for extending sequences into the 5 ′ non-transcribed regulatory region.
[0162]
Commercially available capillary electrophoresis systems can be used to analyze the size of the sequencing product or PCR product or to confirm its nucleotide sequence. Specifically, capillary sequencing is a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye that is specific for four different nucleotides, and detection of the emitted wavelength. And a CCD camera to be used. The output / light intensity can be converted to an electrical signal using appropriate software (eg, Applied Biosystems GENOTYPER, SEQUENCE NAVIGATOR, etc.). The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display can be computer controlled. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that are present in small amounts in a particular sample.
[0163]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding TRICH or a fragment thereof can be cloned into a recombinant DNA molecule to express TRICH, a fragment thereof or a functional equivalent in a suitable host cell. It is. Due to the degeneracy inherent in the genetic code, it is possible to create another DNA sequence that encodes substantially the same or functionally equivalent amino acid sequence and use it for the expression of TRICH.
[0164]
For various purposes, the nucleotide sequences of the present invention can be recombined using methods generally known in the art to modify the sequence encoding TRICH. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or modification of expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, site-directed mutagenesis via oligonucleotides can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, change codon preference, generate splice variants, and the like.
[0165]
Nucleotides of the present invention can be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; U.S. Pat.No. 5,837,458; Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-797; Christians, FC et al. Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319). The biological properties of TRICH, such as the ability to bind to other activities or molecules, can be altered or improved. DNA shuffling is a process of creating a library of gene variants using gene fragment recombination via PCR. The library is then subjected to selection or screening to identify gene variant sequences with the desired properties. These suitable variants may then be pooled and further repeated for DNA shuffling and selection / screening. Thus, “artificial” breeding and rapid molecular evolution create diverse genes. For example, single gene fragments with random point mutations can be recombined and screened and then shuffled until the desired properties are optimized. Alternatively, recombining a given gene with homologous genes from the same gene family, either from the same species or from different species, thereby maximizing the genetic diversity of multiple naturally occurring genes in a controlled and controllable manner Can be made.
[0166]
According to another embodiment, the sequence encoding TRICH can be synthesized in whole or in part using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH et al. (1980) Nucl. Acids Res). Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). Alternatively, it is possible to synthesize TRICH itself or fragments thereof using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid phase or solid phase techniques (eg, Creighton, T. (1984)Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pages 55-60; and Roberge, J.Y. et al. (1995) Science 269: 202-204). Automated synthesis can be achieved using an ABI 431A peptide synthesizer (Applied Biosystems). In addition, using the amino acid sequence of TRICH or any part thereof, natural polymorphism by modification during direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins using chemical methods or any part thereof. It is possible to produce a polypeptide having a peptide sequence or a variant polypeptide.
[0167]
This peptide can be substantially purified using preparative high performance liquid chromatography (see Chiez, R.M. and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421, etc.). The composition of this synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see Creighton, supra, pages 28-53, etc.).
[0168]
In order to express biologically active TRICH, a nucleotide sequence encoding TRICH or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the elements necessary for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions in vectors and polynucleotide sequences encoding TRICH. Such elements vary in strength and specificity. Depending on the specific initiation signal, it is possible to achieve a more efficient translation of the sequence encoding TRICH. Such signals include the ATG initiation codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding TRICH, its initiation codon, and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational control signals may be required. However, if only the coding sequence or fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal including an in-frame ATG start codon should be included in the expression vector. Exogenous translation elements and initiation codons can originate from a variety of natural and synthetic products. Inclusion of an enhancer suitable for the particular host cell system used can increase the efficiency of expression (see, eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162).
[0169]
Methods which are well known to those skilled in the art can be used to create expression vectors containing sequences encoding TRICH, suitable transcriptional and translational control elements. These methods includein vitroRecombinant DNA technology, synthesis technology, andin vivoIncludes genetic engineering techniques (eg Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4, 8 and 16-17, Ausubel, F.M. et al. (1995)Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons, New York NY, see chapters 9, 13 and 16).
[0170]
A variety of expression vector / host systems may be utilized to maintain and express sequences encoding TRICH. Such expression vectors / host systems include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, and yeast transformed with yeast expression vectors. Or transformed with an insect cell line infected with a viral expression vector (eg baculovirus), a viral expression vector (eg cauliflower mosaic virus: CaMV or tobacco mosaic virus: TMV) or a bacterial expression vector (eg Ti plasmid or pBR322 plasmid) Plant cell lines and animal cell lines (eg, Sambrook; supra Ausubel; Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509; Engelhard, EK et al. (1994 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307-311 ; 『Maglowhi Le Science and Technology YearbookThe McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196; Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659; and Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355). Nucleotide sequences can be delivered to target organs, tissues or cell populations using expression vectors from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses, or expression vectors from various bacterial plasmids (eg Di Nicola). , M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. 5 (6): 350-356; Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344; Buller, RM (1985) Nature 317 (6040): 813-815; McGregor, DP et al. (1994) Mol.Immunol. 31 (3): 219-226; and Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389: 239- 242). The present invention is not limited by the host cell used.
[0171]
In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use intended for polynucleotide sequences encoding TRICH. For example, a multifunctional E. coli vector such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or PSPORT1 plasmid (Invitrogen) can be used for routine cloning, subcloning and propagation of the polynucleotide sequence encoding TRICH. Ligation of a TRICH-encoding sequence into the vector's multiple cloning site disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method for identification of transformed bacteria containing recombinant molecules. Furthermore, these vectors are in the cloned sequencein vitroIt may also be useful for transcription, dideoxy sequencing, single-stranded rescue with helper phage, generation of nested deletions (eg, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264). : 5503-5509). For example, when a large amount of TRICH is required for antibody production or the like, a vector that induces high-level expression of TRICH can be used. For example, vectors with a strong inducible SP6 bacteriophage promoter or an inducible T7 bacteriophage promoter can be used.
[0172]
Yeast expression systems can be used to produce TRICH. Many vectors with constitutive or inducible promoters, such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH promoter,Saccharomyces cerevisiae) Or Pichia yeast (Pichia pastoris) Can be used. In addition, such vectors direct either secretion of the expressed protein or retention within the cell. It also makes it possible to incorporate foreign sequences into the host genome for stable growth (see eg, Ausubel, 1995; Bitter, GA et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544; and Scorer, CA et al. (1994) Bio / Technology 12: 181-184).
[0173]
Plant systems can also be used for the expression of TRICH. Transcription of sequences encoding TRICH can be performed by viral promoters such as 35S and 19S from CaMV as used alone or in combination with omega leader sequences from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6: 307-311). Promoted by a promoter. Alternatively, a plant promoter such as a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter may be used (eg Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or by pathogen-mediated transfection (eg, “McGraw Hill Science and Technology Yearbook” (The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, see pages 191-196).
[0174]
In mammalian cells, a number of virus-based expression systems can be utilized. In cases where an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding TRICH can be ligated to an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. By inserting into a nonessential E1 or E3 region of the viral genome, it is possible to obtain infectious viruses that express TRICH in host cells (eg, Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. Proteins can also be expressed at high levels using vectors based on SV40 or EBV.
[0175]
Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to deliver fragments of DNA that are larger than those contained in and expressed from a plasmid. Approximately 6 kb to 10 Mb of HAC is made for therapy and is delivered by conventional delivery methods (liposomes, polycation amino polymers, or vesicles) (eg, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345). -355).
[0176]
For long-term production of recombinant proteins in mammalian systems, stable expression of TRICH in cell lines is desirable. For example, a selectable marker gene on the same or a different vector as the expression vector can be used to transform a sequence encoding TRICH into a cell line. Such expression vectors can have viral origins of replication elements and / or endogenous expression elements. After the introduction of the vector, the cells can be grown for about 1-2 days in enhanced medium before being transferred to the selective medium. The purpose of the selectable marker is to provide resistance to the selection medium, and the presence of the selectable marker allows the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate to the cell type.
[0177]
Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. Such a selection system is not limited to tk−Herpes simplex virus thymidine kinase gene used for cells and apr−There are herpes simplex virus adenine phosphoribosyltransferase genes used for cells (eg, Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232, Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823. reference). Moreover, tolerance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as a basis for selection. For example, dhfr provides resistance to methotrexate, neo provides resistance to aminoglycosides neomycin and G-418, als provides resistance to chlorsulfuron, and pat provides resistance to phosphinothricin acetyltransferase (see, for example, Wigler, M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 35673570; Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Other selectable genes, such as trpB and hisD that alter cellular requirements for metabolism, are described in the literature (see, eg, Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047-8051). Visible markers such as anthocyanins, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin may be used. These markers can be used not only to identify transformants, but also to quantify transient or stable protein expression resulting from specific vector systems (Rhodes, CA (1995) Methods Mol. Biol 55: 121-131 etc.).
[0178]
Even if the presence / absence of marker gene expression suggests the presence of the target gene, the presence and expression of the gene may need to be confirmed. For example, if a sequence encoding TRICH is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding TRICH can be identified by the lack of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be placed in tandem with the sequence encoding TRICH under the control of one promoter. Expression of a marker gene in response to induction or selection usually means that a tandem gene is also expressed.
[0179]
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence encoding TRICH and that express TRICH can be identified using various methods well known to those of skill in the art. These methods include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR amplification, and membrane systems, solution-based, or chip-based for detection and / or quantification of nucleic acid or protein sequences. This includes, but is not limited to, protein biological testing methods or immunological assays including techniques.
[0180]
Immunological methods for detection and measurement of TRICH expression using either specific polyclonal or monoclonal antibodies are known in the art. Such techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence activated cell sorting (FACS) and the like. A two-site, monoclonal-based immunoassay using a monoclonal antibody that reacts with two non-interfering epitopes on TRICH is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are well known in the art (eg, Hampton, R. et al. (1990)Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect. IV; Coligan, J.E. et al. (1997)Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; and Pound, J.D. (1998)Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ).
[0181]
A wide variety of labeling and conjugation methods are known to those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization probes or PCR probes to detect sequences related to polynucleotides encoding TRICH include oligo labeling, nick translation, end labeling, or labeling. PCR amplification using the synthesized nucleotides is included. Alternatively, the sequence encoding TRICH, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for generating mRNA probes. Such vectors are known in the art and are commercially available and should be used for in vitro RNA probe synthesis with the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides. Can do. Such methods can be performed using various kits commercially available from, for example, Amersham Biosciences, Promega (Madison WI), U.S. Biochemical, and the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, color formers, and the like.
[0182]
Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding TRICH are cultured under conditions suitable for expression and recovery of this protein in cell culture media. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains intracellular depends on the sequence used, the vector, or both. One skilled in the art will appreciate that an expression vector comprising a polynucleotide encoding TRICH can be designed to include a signal sequence that directs TRICH secretion across the prokaryotic and eukaryotic membranes.
[0183]
In addition, selection of a host cell line may be made by its ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such polypeptide modifications include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation and acylation. Post-translational processing that cleaves the “prepro” or “pro” form of the protein can be used to identify induction, folding, and / or activity of the protein to the target. Various host cells (eg CHO, HeLa, MDCK, HEK293, WI38, etc.) with specific cellular equipment and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). And can be selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0184]
In another embodiment of the invention, translation of the fusion protein in any of the host systems described above can be accomplished by linking a natural, modified, or recombinant nucleic acid sequence encoding TRICH to a heterologous sequence. Can occur. For example, a chimeric TRICH protein containing a heterologous moiety that can be recognized by a commercially available antibody can facilitate the screening of peptide libraries for inhibitors of TRICH activity. Also, heterologous protein portions and heterologous peptide portions can facilitate the purification of fusion proteins using commercially available affinity substrates. Such moieties include, but are not limited to, glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, There is hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-His on metal chelate resins allow for purification of cognate fusion proteins. FLAG, c-myc and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. In addition, when the fusion protein includes a proteolytic cleavage site between the sequence encoding TRICH and the heterologous protein sequence, TRICH can be cleaved from the heterologous portion after purification. Fusion protein expression and purification methods are described in Ausubel (1995) chapter 10 above. Various commercially available kits can also be used to facilitate the expression and purification of the fusion protein.
[0185]
In another embodiment of the present invention, radiolabeled TRICH can be synthesized in vitro using TNT rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract system (Promega). These systems couple transcription and translation of protein coding sequences operably linked to a T7, T3 or SP6 promoter. Translation is for example35Occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor such as S-methionine.
[0186]
A compound that specifically binds to TRICH can be screened using TRICH of the present invention or a fragment thereof. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to TRICH. Test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, ligands or receptors) or small molecules. In one example, the compound thus identified is closely related to a natural ligand of TRICH, such as a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)) (eg Coligan, J.E. et al. (1991)Current Protocols in Immunology 1 (2): see chapter 5). In another example, the compound thus identified is a natural ligand for the receptor TRICH (eg, Howard, AD et al. (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22: 132-140; Wise, A. Et al. (2002) Drug Discovery Today 7: 235-246).
[0187]
In another embodiment, the compound is closely related to the natural receptor to which TRICH binds, or at least one fragment of the receptor, one fragment of the receptor comprising all or part of a ligand binding site or binding pocket. there's a possibility that. For example, the compound may be a receptor for TRICH that can transmit signals, or a decoy receptor for TRICH that cannot transmit signals (Ashkenazi, A. and VM Divit ( 1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11: 255-260; Mantovani, A. et al. (2001) Trends Immunol. 22: 328-336). This compound can be rationally designed using known techniques. Examples of such techniques include the technique used to make the compound etanercept (ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA) effective in rheumatoid arthritis in humans. Genetically engineered p75 tumor necrosis factor (TNF) receptor dimer, human IgG1(Taylor, P.C. et al. (2001) Curr. Opin. Immunol. 13: 611-616).
[0188]
In certain embodiments, screening for compounds that specifically bind, stimulate, or inhibit TRICH includes the generation of suitable populations of cells that express TRICH as secreted proteins or on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, Drosophila, or E. coli. Cells expressing TRICH or cell membrane fractions containing TRICH are contacted with a test compound and analyzed for inhibition of binding, stimulation or activity of either TRICH or the compound.
[0189]
Some assays simply allow the test compound to be conjugated experimentally to the polypeptide and the binding detected by a fluorophore, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay can include mixing at least one test compound with TRICH in solution or immobilized on a solid support and detecting binding of TRICH to the compound. Alternatively, detection and measurement of test compound binding in the presence of labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed using cell-free reconstituted specimens, chemical libraries, or natural product mixtures, where the test compound (s) are released in solution or immobilized on a solid support.
[0190]
An assay can be used to assess the ability of a compound to bind to a natural ligand and / or the ability of a compound to inhibit the natural ligand from binding to its natural receptor. Examples of such assays include radiolabel assays such as those described in US Pat. No. 5,914,236 and US Pat. No. 6,372,724. In related examples, one or more amino acid substitutions can be introduced into a polypeptide compound (eg, a receptor) to improve or modify its ability to bind to a natural ligand (Matthews, DJ and JA Wells. (1994) Chem. Biol. 1: 25-30 etc.). In further related examples, one or more amino acid substitutions can be introduced into a polypeptide compound (eg, a ligand) to improve or modify its ability to bind to its natural receptor (Cunningham, BC and JA Wells). (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3407-3411; Lowman, HB et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 10982-10988).
[0191]
The TRICH of the present invention or a fragment thereof can be used to screen for compounds that modulate the activity of TRICH. Such compounds can include agonists, antagonists, partial agonists or inverse agonists and the like. In one example, the assay is conducted under conditions that permit TRICH activity, wherein the assay mixes at least one test compound with TRICH and the activity of TRICH in the presence of the test compound in the absence of the test compound. Compare with the activity of TRICH. A change in the activity of TRICH in the presence of the test compound suggests the presence of a compound that modulates the activity of TRICH. Alternatively, the assay is performed by mixing the test compound with an in vitro or cell-free system containing TRICH under conditions suitable for the activity of TRICH. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of TRICH may bind indirectly, and does not need to be in direct contact with the test compound. At least one or more test compounds can be screened.
[0192]
In another example, homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells) is used to “knock out” a polynucleotide encoding TRICH or a mammalian homologue thereof in an animal model system. Such techniques are well known in the art and are useful for creating animal models of human disease (see US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337, etc.). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from early mouse embryos and can be grown in culture. This ES cell is transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. Alternatively, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system, and the target gene is knocked out in a tissue specific or developmental stage specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002; Wagner, KU et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). Transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected from, for example, the C57BL / 6 mouse strain. These blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are identified, and they are crossed to create heterozygous or homozygous systems. The genetically modified animals thus prepared can be examined with potential therapeutic agents and toxic agents.
[0193]
Polynucleotides encoding TRICH can be engineered in vitro in human blastocyst-derived ES cells. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight separate cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neural cells, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, J.A. et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0194]
Polynucleotides encoding TRICH can be used to create “knock-in” humanized animals (pigs) or transgenic animals (mouse or rat) that model human disease. Using a knock-in technique, a region of the polynucleotide encoding TRICH is injected into animal ES cells and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. Transformed cells are injected into blastula and transplanted as described above. Test for genetically modified progeny or inbreds and treat with potential medicines to obtain information on the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress TRICH, for example, secreting TRICH into milk, can be a convenient protein source (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55 -74).
[0195]
(Treatment)
There are chemical and structural similarities, for example in sequence and motif content, between certain regions of TRICH and certain regions of transporters and ion channels. In addition, examples of tissues expressing TRICH are shown in Table 6,Example 11Also shown in Therefore, TRICH is thought to play a role in transport disorders, neurological diseases, muscle diseases, immune diseases, and cell proliferation disorders, and iron metabolism diseases. In the treatment of diseases associated with increased TRICH expression or activity, it is desirable to reduce TRICH expression or activity. It is also desirable to increase the expression or activity of TRICH in the treatment of diseases associated with decreased expression or activity of TRICH.
[0196]
Thus, in one embodiment, it is possible to administer TRICH or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with decreased TRICH expression or activity. Without limitation, these diseases include transport disorders such as ataxia, amyotrophic lateral sclerosis, telangiectasia ataxia, cystic fibrosis, Becker muscular dystrophy, facial palsy, Charcot・ Marie-Tooth disease, diabetes, diabetes insipidus, diabetic neuropathy, Duchenne muscular dystrophy, hyperkalemic cyclic limb paralysis, normal potassium blood cyclic limb paralysis, Parkinson's disease, malignant hyperthermia, multidrug resistance, severe muscle Asthenia, myotonic dystrophy (myotonic dystrophy), catatonia, tardive dyskinesia, dystonia, peripheral neuropathy, brain tumor, prostate cancer, transport-related heart disease (eg, angina, bradyarrhythmia, Tachyarrhythmia, hypertension, prolonged QT syndrome, myocarditis, cardiomyopathy, nemarine myopathy, central myopathy, lipid myopathy Mitochondrial myopathy, thyroid toxic myopathy, ethanol myopathy, dermatomyositis, inclusion body myositis, infectious myositis, polymyositis), transport related neurological diseases (eg Alzheimer's disease, memory loss, bipolar disorder, dementia, depression, epilepsy , Tourette's disease, paranoid psychosis, and schizophrenia (schizophrenia)), other diseases related to transport (eg neurofibromatosis, postherpetic neuralgia, trigeminal neuropathy, sarcoidosis, sickle cell anemia, Wilson disease, Cataract, infertility, pulmonary artery stenosis, sensory autosomal deafness, hyperglycemia, hypoglycemia, Graves' disease, goiter, Cushing's disease, Addison's disease, glucose galactose malabsorption syndrome, hypercholesterolemia, adrenal white matter dystrophy , Zerweger syndrome, Menkes disease, occipital horn syndrome, vo n Gierke disease, cystinuria, iminoglycinuria, Hartup disease, and Fanconi disease), neurological diseases include epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, pick Disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa (retinitis pigmentosa), heredity Ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural abscess, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and nerve Rhinitis, viral central nervous system diseases, prion diseases (including Kuru, Creutzfeldt-Jakob disease, and Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), lethal familial insomnia, neurotrophic and metabolic diseases, nerve fibers Tumor, nodule Sclerosis, cerebelloretinal hemangioblastomatosis, trigeminal hemangioblastoma syndrome, central nervous system mental retardation including Down syndrome and other developmental disorders, cerebral palsy, neuroskeletal disorders, autonomic nervous system disorders , Cranial nerve disease, spinal cord disorder, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, peripheral neuropathy, dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine and addictive myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis , Mental disorders (moodness, anxiety disorder, schizophrenia), seasonal emotional disorder (SAD), restlessness, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, tardive dyskinesia, dystonia, paranoid psychosis, zonal Post-herpetic neuralgia and Tourette's disease, progressive supranuclear palsy, cortical basal ganglia degeneration, and familial frontotemporal dementia are included. Inflammation, Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, myotonic dystrophy, central core disease, nemarine myopathy, centronuclear myopathy, lipid myopathy, mitochondrial myopathy, infectious myositis, polymyositis, dermatomyositis, inclusion body myositis , Thyroid toxic myopathy and ethanol myopathy, angina, anaphylactic shock, arrhythmia, asthma, cardiovascular shock, Cushing disease, hypertension, hypoglycemia, myocardial infarction, migraine, pheochromocytoma, encephalopathy, epilepsy, Kearns -Seiya syndrome, lactic acidosis, myoclonic disease, ocular palsy, and acid maltase deficiency (AMD, also known as Pompe disease), including immune acquired syndrome (AIDS), Addison's disease, Adult respiratory distress syndrome, allergy, strong Ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyendocrine candidiasis ectoderm dystrophy (APECED), bronchitis , Cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes mellitus, pulmonary emphysema, lymphocytic factor-induced accidental lymphopenia, fetal erythroblastosis (neonatal hemolytic disease), erythema nodosum , Atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, Osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis (Scleroderma), thrombocytopenic purpura, ulcerative colitis, uveitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasitic infection , Protozoan infections, helminth infections, trauma, and cell proliferation abnormalities include actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), Myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and cancers such as adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically , Adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, gastrointestinal tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, Includes testicular, thymic, thyroid, and uterine cancers. Suferin hyperinsulinemia (hypotransferrinaemia), acaeruloplasminaemia, adults include children, and infants Hema chromatography over cis (haemochromatosis).
[0197]
In another embodiment, a vector capable of expressing TRICH or a fragment or derivative thereof for the treatment or prevention of a disease associated with decreased expression or activity of TRICH, including but not limited to the diseases listed above. It can also be administered to a subject.
[0198]
In yet another embodiment, a composition comprising substantially purified TRICH for the treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of TRICH, including but not limited to the diseases listed above Can be administered to a subject together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0199]
In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of TRICH is administered to a subject for the treatment or prevention of a disease associated with decreased expression or activity of TRICH, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to do.
[0200]
In a further example, an antagonist of TRICH can be administered to a subject for the treatment or prevention of a disease associated with increased expression or activity of TRICH. Examples of such diseases include, but are not limited to, transport disorders, neurological diseases, muscle diseases, immune diseases and abnormal cell proliferation as described above, and iron metabolic diseases. In one embodiment, an antibody that specifically binds to TRICH can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism that delivers the drug to cells or tissues that express TRICH.
[0201]
In another embodiment, a complementary sequence of a polynucleotide encoding TRICH is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with increased expression or activity of TRICH, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer the vector to a subject.
[0202]
In another embodiment, any protein, antagonist, antibody, agonist, complementary sequence, or vector of the invention can be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy can be selected by one skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles. When combined with a therapeutic agent, it can provide a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases described above. This method makes it possible to increase the pharmaceutical effect with a small amount of each drug, thereby reducing the possibility of side effects.
[0203]
An antagonist of TRICH can be produced using methods common in the art. Specifically, antibodies can be made using purified TRICH, or a library of therapeutic agents can be screened to identify those that specifically bind to TRICH. TRICH antibodies can also be produced using methods known in the art. Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. However, it is not limited to these. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are usually suitable for therapy. Single-chain antibodies (e.g. single-chain antibodies from camels or llamas) are potent enzyme inhibitors and may have advantages in the design of peptidomimetics and in the development of immunosorbents and biosensors (Muyldermans , S. (2001) J. Biotechnol. 74: 277-302).
[0204]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, camels, dromedaries, llamas, humans and others, can use either TRICH or any fragment, or oligos thereof with immunogenic properties. It can be immunized by injection of peptides. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyol, polyanion, peptide, oily emulsion, mussel hemocyanin (KLH), dinitrophenol, etc. There is a surfactant. Among adjuvants used in humans, BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum (Corynebacterium parvumIs particularly preferred.
[0205]
The oligopeptide, peptide or fragment used for inducing an antibody against TRICH is preferably composed of at least about 5 amino acids, and generally consists of about 10 or more amino acids. These oligopeptides, peptides or fragments are preferably identical to part of the amino acid sequence of the natural protein. A short stretch of TRICH amino acids can be fused with the sequence of another protein, such as KLH, to produce antibodies against this chimeric molecule.
[0206]
Monoclonal antibodies against TRICH can be made using any technique that produces antibody molecules by continuous cell lines in the culture medium. Such technologies include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote, RJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030; and Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62 : 109-120).
[0207]
Furthermore, techniques developed for the production of “chimeric antibodies”, such as splicing mouse antibody genes into human antibody genes, are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg Morrison). , SL et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604-608; and Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452-454 See). Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies are applied using methods well known in the art to produce TRICH specific single chain antibodies. Antibodies with related specificity but different idiotype composition can also be generated by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (Burton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 10134-10137 etc.).
[0208]
Antibody production in lymphocyte populationsin vivoIt can also be done by induction of production or by screening a library or panel of immunoglobulins of very specific binding reagents as disclosed in the literature (eg Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837; see Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0209]
Antibodies containing specific binding sites for TRICH can also be obtained. For example, without limitation, such fragments include F (ab ′) produced by pepsin digestion of antibody molecules.2 Fragment and F (ab ')2 And Fab fragments made by reducing the disulfide bridges of the fragments. Alternatively, a Fab expression library can be generated to quickly and easily identify monoclonal Fab fragments with the desired specificity (see, eg, Huse, WD et al. (1989) Science 246: 1275-1281) .
[0210]
A variety of immunoassays can be screened to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity, or immunoradioassay are well known in the art. Usually such immunoassays involve the measurement of complex formation between TRICH and its specific antibody. Two-site monoclonal-based immunoassays that use monoclonal antibodies reactive against two non-interfering TRICH epitopes are commonly used, but competitive binding assays can also be used (Pound, supra).
[0211]
Various methods such as Scatchard analysis in conjunction with radioimmunoassay techniques can be used to assess the affinity of an antibody for TRICH. Affinity is expressed by the binding constant Ka, which is a value obtained by dividing the molar concentration of the TRICH antibody complex by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. Polyclonal antibodies have heterogeneous affinities for various TRICH epitopes, and the Ka determined for a polyclonal antibody formulation represents the average affinity or binding activity of the antibody to TRICH. Monoclonal antibodies are monospecific for a particular TRICH epitope, and the Ka determined for a given monoclonal antibody formulation represents a true measure of affinity. Ka value is 109~Ten12The liter / mol high affinity antibody drug is preferably used in an immunoassay where the TRICH antibody complex must withstand harsh manipulations. Ka value is 106-107A liter / mol low affinity antibody formulation is preferably used for immunopurification and similar treatments where TRICH must eventually dissociate from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988)Antibodies, Volume I: A Practical ApproachIRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0212]
The antibody titer and binding activity of the polyclonal antibody formulation can be further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain applications used later. For example, polyclonal antibody formulations containing at least 1-2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody are generally used in processes where the TRICH antibody complex must be precipitated. Antibody specificity, antibody titer, binding activity, and guidelines for antibody quality and use in various applications are generally available (see, eg, Catty, Coligan et al., Supra).
[0213]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding TRICH, or any fragment or complementary sequence thereof, can be used for therapeutic purposes. In one embodiment, gene expression can be altered by designing sequences or antisense molecules (DNA, RNA, PNA, or modified oligonucleotides) that are complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding TRICH. . Such techniques are well known in the art, and antisense oligonucleotides or larger fragments can be designed from the control region of sequences encoding TRICH, or from various locations along the coding region (eg, Agrawal, S ., Editing (1996)Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ).
[0214]
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing an antisense sequence into a suitable target cell can be used. Antisense sequences can be delivered into cells in the form of expression plasmids that produce sequences complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein during transcription (eg, Slater, JE et al. (1998)). J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475; and Scanlon, KJ et al. (1995) 9 (13): 1288-1296). Antisense sequences can also be introduced into cells using viral vectors such as retrovirus and adeno-associated virus vectors (Miller, AD (1990) Blood 76: 271, supra, Ausubel, Uckert, W. et al. And W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323-347 etc.). Other gene delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes and other systems known in the art (eg, Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217-225). Boado, RJ et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315; Morris, MC et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736).
[0215]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding TRICH can be used for somatic or germ cell gene therapy. By performing gene therapy, (i) Severe combined immunodeficiency (SCID) − characterized by gene deficiency (eg, X chromosome linkage inheritance (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)) X1 disease), severe combined immunodeficiency syndrome associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480, Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 643-666, Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassamia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to factor VIII or factor IX deficiency (Crystal, 35 RG (1995) Science 270: 404- 410, Verma, IM and Somia. N. (1997) Nature 389: 239-242) and (ii) express a conditional lethal gene product (eg, cancer caused by uncontrolled cell growth) (Iii) Intracellular parasites such as human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396, Poescbla, E. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 93: 11395-11399) and other human retroviruses, hepatitis B or C virus (HBV, HCV), Candida (Candida albicans )And Paracoccidioides brazilianis (Paracoccidioides brasiliensis )Fungal parasites such as Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum )And trypanosoma (Trypanosoma cruzi )A protein having a protective function against protozoan parasites such as can be expressed. When a gene deficiency required for the expression or regulation of TRICH causes a disease, it is possible to reduce the expression of symptoms caused by the gene deficiency by expressing TRICH from a suitable population of introduced cells.
[0216]
In a further embodiment of the present invention, diseases and abnormalities caused by TRICH deficiency are treated by preparing mammalian expression vectors encoding TRICH and introducing these vectors into TRICH-deficient cells by mechanical means. . Mechanical introduction techniques for in vivo or ex vivo cells include (i) direct DNA microinjection into individual cells, (ii) gene guns, (iii) transfection via liposomes, ( iv) with receptor-mediated gene transfer, and (v) with the use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217, Ivics, Z. (1997) Cell 91: 501-510; Boulay, JL. And H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0217]
Expression vectors that can affect the expression of TRICH include, but are not limited to, PCDNA 3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX, PCR2-TOPOTA vectors (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA) and PTET-OFF, PTET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA). To express TRICH, (i) a constitutively active promoter (such as cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene), (ii) Inducible promoters (eg, tetracycline regulatable promoters (Gossen, M and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, contained in the commercially available T-REX plasmid (Invitrogen)) 89: 5547-5551, Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769, Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456)), ecdysone inducible promoter (commercially available) Included in plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), FK506 / rapamycin inducible promoter, or RU486 / mifepristone inducible promoter (Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) normal Individual It is possible to use natural promoter or a tissue specific promoter of an endogenous gene encoding a TRICH derived.
[0218]
By using a commercially available liposome transformation kit (for example, Invitrogen's PerFect Lipid Transfection Kit), those skilled in the art do not need much effort to optimize the parameters of the experiment, and the polynucleotide group can be used as the target cell group in culture. Can be delivered. Alternatively, transformation is performed using the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or electroporation (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841845). . In order to introduce DNA into primary culture cells, modifications to standardized mammalian transfection protocols are required.
[0219]
In another embodiment of the present invention, a disease or disorder caused by a gene deficiency associated with expression of TRICH is expressed as follows: Nucleotides; (ii) a suitable RNA packaging signal; and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences necessary for efficient vector propagation. The retroviral vector can be made and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are commercially available from Stratagene and are based on published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 6733-6737). The above data is incorporated herein by reference. The vector is propagated in a suitable vector producing cell line (VPCL), which expresses an envelope gene with affinity for a receptor on the target cell or a pan-affinity envelope protein such as VSVg (Armentano, D. et al. (1987) J. Virol. 61: 1647-1650, Bender, MA et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646, Adam, MA and AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806, Dull , T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880). In US Pat. No. 5,910,434 to Rigg (“Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant”), a method for obtaining a retroviral packaging cell line is disclosed, with reference to It is a part of this specification. Retroviral vector propagation, cell population (eg CD4+ Transduction of T cells) and the return of transduced cells to patients is a method well known to those skilled in the art of gene therapy and has been described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997). J. Virol. 71: 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U. et al. (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283-2290).
[0220]
Alternatively, an adenoviral gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding TRICH to cells having one or more genetic abnormalities associated with expression of TRICH. Production and packaging of adenoviral vectors are known to those skilled in the art. Replication-deficient adenoviral vectors have proven to be flexible in introducing genes encoding immune regulatory proteins into intact pancreatic islets (Csete, ME et al. (1995) Transplantation 27: 263 -268). Potentially useful adenoviral vectors are described in US Pat. No. 5,707,618 (“Adenovirus vectors for gene therapy”) to Armentano, which is incorporated herein by reference. See also Antinozzi, P.A. et al. (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 511-544, Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242 for adenoviral vectors. Both documents are hereby incorporated by reference.
[0221]
Alternatively, a herpes gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding TRICH to target cells having one or more genetic abnormalities associated with expression of TRICH. Herpes simplex virus (HSV) -based vectors may be particularly useful in introducing TRICH into central neurons where HSV is tropic. The production and packaging of herpes vectors is known to those skilled in the art. A replication competent herpes simplex virus (HSV) type I vector has been used to deliver a reporter gene to the primate eye (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385395). The production of HSV-1 viral vectors is also disclosed in US Pat. No. 5,804,413 (“Herpes simplex virus swains for gene transfer”) granted to DeLuca, which is incorporated herein by reference. . US Pat. No. 5,804,413 describes a recombinant HSV d92 comprising a genome having at least one exogenous gene that is introduced into cells under the control of a promoter suitable for purposes including human gene therapy. The patent also discloses the generation and use of recombinant HSV lines lacking ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see also Goins, W.F. et al. (1999) J. Virol. 73: 519-532 and Xu, H. et al. (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are hereby incorporated by reference. Manipulation of cloned herpesvirus sequences, production of recombinant virus after transfection with a large number of plasmids containing different segments of the giant herpesvirus genome, herpesvirus growth and proliferation, and infection of herpesvirus cells Is a technique known to those skilled in the art.
[0222]
Alternatively, an α virus (positive single stranded RNA virus) vector is used to deliver a TRICH encoding polynucleotide to target cells. Biological research on the prototype alphavirus Semliki Forest Virus (SFV) has been extensive and gene transfer vectors are based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During the replication of alpha viral RNA, a subgenomic RNA that normally encodes the viral capsid protein is created. This subgenomic RNA is replicated to a higher level than full-length genomic RNA, resulting in overproduction of capsid proteins compared to viral proteins with enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding TRICH into the region encoding the capsid of the α virus genome, a large number of RNAs encoding TRICH are produced in the vector-introduced cells, and TRICH is synthesized at a high level. Usually, infection with alpha virus is accompanied by cell lysis within a few days. On the other hand, the ability of a group of normal hamster kidney cells (BHK-21) with a variant of Sindbis virus (SIN) to establish a persistent infection can apply lytic replication of α viruses to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). Since the host range of α virus is wide, TRICH can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require cell sorting prior to transduction. Methods for treating alphavirus infectious cDNA clones, alphavirus cDNA and RNA transfection methods, and alphavirus infection methods are known to those skilled in the art.
[0223]
It is also possible to inhibit gene expression using an oligonucleotide derived from the transcription start site. This position is, for example, between about −10 and about +10 counting from the start site. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing methods. Triple helix base pairing is useful because it prevents the double helix from opening and binding to a polymerase, transcription factor, or regulatory molecule. Recent therapeutic advances using triple helix DNA are described in the literature (eg Gee, J.E. et al. (1994) in Huber, B.E. and B.I. Carr,Molecular and Immunologic ApproachesFutura Publishing, Mt. Kisco NY, pages 163-177). In addition, complementary sequences or antisense molecules can be designed to block the translation of mRNA by preventing transcripts from binding to ribosomes.
[0224]
Ribozymes are enzymatic RNA molecules, and ribozymes can also be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence specific hybridization of ribozyme molecules to complementary target RNA and subsequent internal nucleotide strand breaks. For example, it is possible that a hammerhead ribozyme molecule produced by genetic engineering can specifically and effectively catalyze the cleavage of a nucleotide chain in a sequence encoding TRICH.
[0225]
To identify specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target, the target molecule is scanned for ribozyme cleavage sites such as GUA, GUU, and GUC sequences. Once identified, assess whether a short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site has secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional. Is possible. Assessment of the suitability of candidate targets can also be performed by testing accessibility to hybridization with complementary oligonucleotide groups using a ribonuclease protection assay.
[0226]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the present invention can be made using any method well known in the art for nucleic acid molecule synthesis. Production methods include methods of chemically synthesizing oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, the DNA sequence encoding TRICHin vitroas well asin vivoTranscription can yield RNA molecules. Such DNA sequences can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells or tissues.
[0227]
RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, the addition of adjacent sequences at the 5 'end, 3' end, or both of the molecule, or phosphorothioate or 2 'O instead of phosphodiesterase linkages in the main chain of the molecule. -Use of methyl is included. This concept is unique to the production of PNAs but can be extended to all these molecules. This includes adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine with acetyl-, methyl-, thio- and similar modifications that are not readily recognized by endogenous endonucleases, as well as non-conventional bases such as inosine, Include queosine, wybutosine, etc.
[0228]
Further embodiments of the invention include methods of screening for compounds that are effective in altering the expression of a polynucleotide encoding TRICH. Non-limiting compounds that are effective in altering the expression of specific polynucleotides include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcriptional regulators, and specific polynucleotides There are non-polymeric chemical entities that can interact with sequences. Effective compounds can alter polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Therefore, in the treatment of diseases associated with increased expression or activity of TRICH, compounds that specifically inhibit the expression of polynucleotides encoding TRICH are therapeutically useful and are associated with decreased expression or activity of TRICH. In the treatment of disease, compounds that specifically promote the expression of a polynucleotide encoding TRICH may be therapeutically useful.
[0229]
At least one to a plurality of test compounds can be screened for efficacy in altering the expression of a specific polynucleotide. The test compound is obtained by any method commonly known in the art. Such methods include modifying the expression of the polynucleotide, selecting from an existing, commercially available or private, natural or non-natural compound library, and the chemical and / or structure of the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective when rationally designing compounds based on chemical properties and when selecting from a library of compounds generated in a combinatorial or random manner. A sample containing a polynucleotide encoding TRICH is exposed to at least one of the test compounds thus obtained. The sample can be, for example, an intact cell, a permeabilized cell, or an in vitro cell-free or reconstituted biochemical system. Alterations in the expression of a polynucleotide encoding TRICH are assayed by any method known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of a polynucleotide encoding TRICH. Quantifying the amount of hybridization can form the basis for comparison of expression of polynucleotides that are exposed to or not exposed to one or more test compounds. Detection of a change in the expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in altering the expression of the polynucleotide. For compounds effective for modifying the expression of specific polynucleotides, for example, fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) Gene expression systems (Atkins, D. et al. (1999) US Pat. No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell systems such as HeLa cells (Clarke, ML et al. (2000) Screening is performed using Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). Certain embodiments of the invention relate to the process of screening a combinatorial library of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against a particular polynucleotide sequence (Bruice , TW et al. (1997) US Patent No. 5,686,242, Bruice, TW et al. (2000) US Patent No. 6,022,691).
[0230]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available and are equally suitable for in vivo, in vitro and ex vivo use. For ex vivo treatment, the vector can be introduced into stem cells taken from the patient, cloned and expanded back to the patient by autologous transplantation. Delivery by transfection, liposome injection or polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 462-466. Etc. See).
[0231]
Any of the above treatment methods can be applied to all subjects in need of treatment including mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and the like.
[0232]
A further embodiment of the invention relates to the administration of compositions generally having certain active ingredients formulated with certain pharmaceutically acceptable excipients. Excipients include, for example, sugar, starch, cellulose, gum and protein. Various dosage forms are widely known.Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA). Such compositions consist of TRICH, TRICH antibodies, mimetics, agonists, antagonists, TRICH inhibitors, and the like.
[0233]
The compositions used in the present invention can be administered by any number of routes including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, There are intraventricular, lung, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal.
[0234]
Compositions administered from the lungs can be prepared in liquid or dry powder form. Such compositions are usually aerosolized just before the patient inhales. In the case of small molecules (eg, conventional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast acting formulations is well known in the art. In the case of macromolecules (eg, larger peptides and proteins), recent improvements in pulmonary delivery through the alveolar region of the lung in the art can substantially transport drugs such as insulin into the blood circulation. (See Patton, JS et al., US Pat. No. 5,997,848, etc.). Pulmonary delivery is superior in administration without needle injection and eliminates the need for penetration enhancers that may be toxic.
[0235]
Compositions suitable for use in the present invention include compositions that contain as much active ingredient as necessary to achieve a given purpose. The determination of an effective dose is within the ability of those skilled in the art.
[0236]
In order to deliver a macromolecule containing TRICH or a fragment thereof directly into the cell, various specially shaped compositions can be prepared. For example, a liposomal formulation comprising a cell-impermeable polymer can facilitate cell fusion and intracellular delivery of the polymer. Alternatively, TRICH or a fragment thereof can be attached to the short cation N-terminus obtained from HIV Tat-1 protein. The fusion proteins thus generated have been shown to transduce cell groups of all tissues, including the brain, of a mouse model system (Schwarze, SR et al. (1999) Science 285: 1569- 1572).
[0237]
For a given compound, first estimate a therapeutically effective amount in a cell culture assay, eg, a cell culture assay of neoplastic cells, or in an animal model such as a mouse, rat, rabbit, dog, monkey or pig. Can do. The animal model may also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine beneficial doses and routes for administration to humans.
[0238]
A therapeutically effective dose refers to the amount of an active ingredient, such as TRICH or a fragment thereof, an antibody of TRICH, an agonist or antagonist of TRICH, an inhibitor, etc., which recovers symptoms and conditions. Therapeutic efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal experiments, e.g. ED50(Therapeutically effective amount of 50% of the population) or LD50(50% lethal dose of population) Can be determined by calculating statistics. The dose ratio of toxic to therapeutic effects is the therapeutic index, and LD50/ ED50It can be expressed as a ratio. Compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. Data obtained from cell culture assays and animal studies is used to formulate a range of dosage for use in humans. The dosage contained in such compositions has little or no toxicity, and ED50It is preferable to be in the range of the blood concentration that contains Depending on the mode of administration used, patient sensitivity and route of administration, the dosage will vary within this range.
[0239]
The exact dosage will be determined by the practitioner in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage forms and dosages are adjusted to provide sufficient levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors relating to the subject may include the severity of the disease, the general health of the patient, the patient's age, weight and sex (gender), time and frequency of administration, concomitant medications, response sensitivity and response to treatment. Long-acting compositions may be administered once every 3-4 days, once a week, or once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0240]
The normal dose is about 0.1 to 100.000 μg depending on the route of administration, and is up to about 1 g in total. Guidance on specific doses and delivery methods is described in the literature and is usually available to practitioners. Those skilled in the art will utilize different formulations for nucleotides than for proteins or their inhibitors. Similarly, delivery of polynucleotides or polypeptides will be specific to particular cells, symptoms, sites, etc.
[0241]
(Diagnosis)
In another embodiment, an antibody that specifically binds to TRICH is an assay for diagnosing a disease characterized by expression of TRICH, or for monitoring a patient being treated with an agonist or antagonist or inhibitor of TRICH or TRICH Used for. Antibodies useful for diagnostic purposes are formulated in the same manner as described above for the treatment site. TRICH diagnostic assays include methods for detecting TRICH from human body fluids or cell or tissue extracts using antibodies and labels. The antibody can be modified or not, and can be labeled covalently or non-covalently with a reporter molecule. A wide variety of reporter molecules are known in the art and can be used, some of which have been described above.
[0242]
Various protocols, including ELISA, RIA, and FACS for measuring TRICH are well known in the art and provide a basis for diagnosing altered or abnormal levels of expression of TRICH. Normal or standard TRICH expression value is determined by mixing a body fluid or cell extract collected from a normal mammal such as a human subject with an antibody against TRICH under conditions suitable for complex formation. To confirm. The amount of standard complex formation can be quantified by various methods such as photometry. The amount of TRICH expression in affected samples from subjects, controls, and biopsy tissues is compared to a reference value. The deviation between the standard value and the subject establishes the parameter for diagnosing the disease.
[0243]
According to another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding TRICH can also be used for diagnosis. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. This polynucleotide is used to detect and quantify gene expression in biopsy tissues where TRICH expression can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to check for the presence of TRICH, as well as overexpression, and to monitor the modulation of TRICH levels during treatment.
[0244]
In one embodiment, a nucleic acid sequence encoding TRICH can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence, including genomic sequences, encoding TRICH or closely related molecules. Whether the probe is made from a highly specific region (eg, a 5 ′ regulatory region) or a slightly less specific region (eg, a conserved motif), the specificity of the probe And the stringency of hybridization or amplification will determine whether the probe identifies only the natural sequence encoding TRICH or only the natural sequence encoding the allele or related sequence. .
[0245]
Probes can also be used to detect related sequences. It may also have at least 50% sequence identity with any sequence encoding TRICH. The hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 10-18, or the genomic sequence including the TRICH gene promoter, enhancer, and intron.
[0246]
As a method for preparing a hybridization probe specific for DNA encoding TRICH, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding TRICH or a TRICH derivative into a vector for preparing an mRNA probe. Vectors for making mRNA probes are known to those skilled in the art and are commercially available, by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in vitroCan be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with various reporter populations. Examples of reporter groups include32P or35Examples include enzyme labels such as alkaline phosphatase in which a radionuclide such as S is bound to a probe via an avidin / biotin binding system.
[0247]
Polynucleotide sequences encoding TRICH can be used to diagnose diseases associated with TRICH expression. Without limitation, these diseases include transport disorders such as ataxia, amyotrophic lateral sclerosis, telangiectasia ataxia, cystic fibrosis, Becker muscular dystrophy, facial palsy, Charcot・ Marie-Tooth disease, diabetes, diabetes insipidus, diabetic neuropathy, Duchenne muscular dystrophy, hyperkalemic cyclic limb paralysis, normal potassium blood cyclic limb paralysis, Parkinson's disease, malignant hyperthermia, multidrug resistance, severe muscle Asthenia, myotonic dystrophy (myotonic dystrophy), catatonia, tardive dyskinesia, dystonia, peripheral neuropathy, brain tumor, prostate cancer, transport-related heart disease (eg, angina, bradyarrhythmia, Tachyarrhythmia, hypertension, prolonged QT syndrome, myocarditis, cardiomyopathy, nemarine myopathy, central myopathy, lipid myopathy Mitochondrial myopathy, thyroid toxic myopathy, ethanol myopathy, dermatomyositis, inclusion body myositis, infectious myositis, polymyositis), transport related neurological diseases (eg Alzheimer's disease, memory loss, bipolar disorder, dementia, depression, epilepsy , Tourette's disease, paranoid psychosis, and schizophrenia (schizophrenia)), other diseases related to transport (eg neurofibromatosis, postherpetic neuralgia, trigeminal neuropathy, sarcoidosis, sickle cell anemia, Wilson disease, Cataract, infertility, pulmonary artery stenosis, sensory autosomal deafness, hyperglycemia, hypoglycemia, Graves' disease, goiter, Cushing's disease, Addison's disease, glucose galactose malabsorption syndrome, hypercholesterolemia, adrenal white matter dystrophy , Zerweger syndrome, Menkes disease, occipital horn syndrome, vo n Gierke disease, cystinuria, iminoglycinuria, Hartup disease, and Fanconi disease), neurological diseases include epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, pick Disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa (retinitis pigmentosa), heredity Ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural abscess, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and nerve Rhinitis, viral central nervous system diseases, prion diseases (including Kuru, Creutzfeldt-Jakob disease, and Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), lethal familial insomnia, neurotrophic and metabolic diseases, nerve fibers Tumor, nodule Sclerosis, cerebelloretinal hemangioblastomatosis, trigeminal hemangioblastoma syndrome, central nervous system mental retardation including Down syndrome and other developmental disorders, cerebral palsy, neuroskeletal disorders, autonomic nervous system disorders , Cranial nerve disease, spinal cord disorder, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, peripheral neuropathy, dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine and addictive myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis , Mental disorders (moodness, anxiety disorder, schizophrenia), seasonal emotional disorder (SAD), restlessness, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, tardive dyskinesia, dystonia, paranoid psychosis, zonal Post-herpetic neuralgia and Tourette's disease, progressive supranuclear palsy, cortical basal ganglia degeneration, and familial frontotemporal dementia are included. Inflammation, Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, myotonic dystrophy, central core disease, nemarine myopathy, centronuclear myopathy, lipid myopathy, mitochondrial myopathy, infectious myositis, polymyositis, dermatomyositis, inclusion body myositis , Thyroid toxic myopathy and ethanol myopathy, angina, anaphylactic shock, arrhythmia, asthma, cardiovascular shock, Cushing disease, hypertension, hypoglycemia, myocardial infarction, migraine, pheochromocytoma, encephalopathy, epilepsy, Kearns -Seiya syndrome, lactic acidosis, myoclonic disease, ocular palsy, and acid maltase deficiency (AMD, also known as Pompe disease), including immune acquired syndrome (AIDS), Addison's disease, Adult respiratory distress syndrome, allergy, strong Ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyendocrine candidiasis ectoderm dystrophy (APECED), bronchitis , Cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes mellitus, pulmonary emphysema, lymphocytic factor-induced accidental lymphopenia, fetal erythroblastosis (neolytic hemolysis), erythema nodosum , Atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, Osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis (Scleroderma), thrombocytopenic purpura, ulcerative colitis, uveitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasitic infection , Protozoan infections, helminth infections, trauma, and cell proliferation abnormalities include actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), Myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and cancers such as adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically , Adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, gastrointestinal tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, Includes testicular, thymic, thyroid, and uterine cancers. Suferin hyperinsulinemia (hypotransferrinaemia), acaeruloplasminaemia, adults include children, and infants Hema chromatography over cis (haemochromatosis). Polynucleotide sequences encoding TRICH are Southern, Northern, dot blot, or other membrane-based technologies, PCR methods that use body fluids or tissues collected from patients to detect altered TRICH expression And can be used for dipstick, pin, and multi-format ELISA-based assays, and microarrays. Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
[0248]
In certain embodiments, nucleotide sequences encoding TRICH will be useful in assays to detect related diseases, particularly those described above. Nucleotide sequences encoding TRICH can be labeled by standard methods and added to body fluids or tissue samples taken from patients under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient sample is significantly different compared to the control sample, the altered level of the nucleotide sequence encoding TRICH in the sample reveals the presence of the associated disease. Such assays can also be used to estimate specific therapeutic effects in animal experiments, clinical trials, or to monitor individual patient treatment.
[0249]
In order to provide a basis for the diagnosis of diseases associated with the expression of TRICH, a normal or standard profile of expression is established. This can be accomplished by mixing bodily fluids or cells extracted from either normal animal or human subjects with sequences encoding TRICH or fragments thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from experiments conducted with known amounts of substantially purified polynucleotides to values obtained from normal subjects. The standard value thus obtained can be compared with the value obtained from a sample obtained from a patient showing signs of disease. Deviation from standard values is used to determine the presence of the disease.
[0250]
Once the presence of the disease is established and the treatment protocol is initiated, the hybridization assay can be repeated periodically to determine whether the patient's expression level has begun to approach that observed by normal subjects. The results obtained from continuous assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
[0251]
For cancer, the presence of an abnormal amount of transcripts (underexpressed or overexpressed) in living tissue from an individual indicates a predisposition to the disease or a method to detect the disease before clinical symptoms appear. Can be provided. This type of clearer diagnosis allows medical professionals to take advantage of preventive or aggressive treatment early on, thereby preventing the development or further progression of cancer.
[0252]
Further diagnostic uses of oligonucleotides designed from sequences encoding TRICH can include the use of PCR. These oligomers can be synthesized chemically, produced enzymatically, orin vitroCan yield. Oligomers preferably contain a fragment of a polynucleotide encoding TRICH or a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding TRICH and are used to identify specific genes and conditions under optimized conditions Is done. Oligomers can also be used for the detection, quantification, or both of closely related DNA or RNA sequences under moderately stringent conditions.
[0253]
In certain embodiments, oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding TRICH can be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause human congenital or acquired genetic diseases. Although not limited, SNP detection methods include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, DNA is amplified by polymerase chain reaction (PCR) using an oligonucleotide primer derived from a polynucleotide sequence encoding TRICH. DNA can be derived from, for example, diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. SNPs in DNA make a difference in the secondary and tertiary structure of single-stranded PCR products. Differences can be detected using gel electrophoresis in non-denaturing gels. In fSSCP, oligonucleotide primers are fluorescently labeled. This makes it possible to detect amplimers with high-throughput equipment such as DNA sequencing machines. Furthermore, a sequence database analysis method called in silico SNP (in silico SNP, isSNP) identifies polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as assembled into a common consensus sequence. Can do. These computer-based methods filter out sequence variations that result from sequencing errors in the laboratory preparation of DNA or using statistical models and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another embodiment, SNPs are detected and characterized, for example, by mass spectrometry using a high throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0254]
SNPs can be used to study the genetic basis of human disease. For example, at least 16 common SNPs are associated with non-insulin dependent diabetes mellitus. SNPs are also useful in studying differences in disease outcomes of single gene diseases such as cystic fibrosis, sickle cell anemia or chronic granulomatosis. For example, a mutant of mannose-binding lectin, MBL2, has been shown to correlate with adverse outcomes in cystic fibrosis lungs. SNPs are also useful for pharmacogenomics (identification of genetic variants that affect a patient's response to drugs, such as life-threatening toxicities). For example, mutations in N-acetyltransferase are associated with a high incidence of peripheral neuropathy in response to antituberculosis agent isoniazid, whereas mutations in the core promoter of ALOX5 gene are anti-asthma drugs that target the 5-lipoxygenase pathway Reduces clinical response to treatment with Analyzing the distribution of SNPs in different populations is useful for investigating genetic drift, mutations, recombination and selection, and tracking population origin and population movement (Taylor, JG et al. (2001) Trends Mol. Med. 7: 507-512; Kwok, P.-Y. and Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5: 538-543; Nowotny, P. et al. (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11 : 637-641).
[0255]
Methods that can be used to quantify TRICH expression also include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, coamplification of control nucleic acids and interpolation of the results obtained from standard curves (eg Melby, PC et al. (1993) J. Immunol. Methods 159: 235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229-236). To accelerate the quantification rate of multiple samples, the oligomer or polynucleotide of interest can be placed in various dilutions and assayed in a high-throughput format that allows rapid quantitation by spectrophotometric or colorimetric reactions .
[0256]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as elements in the microarray. Microarrays can be used in transcriptional imaging techniques that simultaneously monitor the associated expression levels of multiple genes. This is described below. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. Use this information to determine gene function, understand the genetic basis of the disease, diagnose the disease, monitor disease progression / regression as a function of gene expression, and develop drug activity in disease treatment And can be monitored. In particular, this information can be used to develop a pharmacogenomic profile of the patient to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, a therapeutic agent that is highly effective for the patient and that exhibits few side effects can be selected.
[0257]
In another example, TRICH, a fragment of TRICH, or an antibody specific for TRICH can be used as an element on the microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0258]
Some embodiments relate to the use of the polynucleotides of the present invention to generate a transcript image of a tissue or cell type. A transcript image represents a global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Comprehensive gene expression patterns can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at a given time under given conditions (Seilhamer et al. US Pat. No. 5,840,484 “Comparative Gene Transcript Analysis”). Which is hereby incorporated by reference). Thus, a transcript image can be generated by hybridizing a polynucleotide of the invention or its complement to the entire transcription or reverse transcription of a particular tissue or cell type. In certain embodiments, hybridization is generated in a high throughput format such that a polynucleotide of the invention or its complement comprises a plurality of subsets of elements on a microarray. The resulting transcript image can provide a profile of gene activity.
[0259]
Transcript images can be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies or biological samples thereof. Transcript images are therefore in the case of tissue or biopsy samplesin vivoIn the case of cell linesin vitroReflects gene expression in
[0260]
Transcript images that produce the expression profiles of the polynucleotides of the present invention are not only toxicological tests of industrial or natural environmental compounds,in vitroIt can be used in conjunction with model systems and preclinical evaluation of drugs. All compounds elicit characteristic gene expression patterns that indicate mechanisms of action and toxicity, often referred to as molecular fingerprints or toxicant signatures (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog 24: 153-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, which is specifically incorporated herein by reference). If a test compound has a signature similar to that of a compound with known toxicity, it may share toxic properties. A fingerprint or signature is most useful and accurate when it contains expression information from multiple genes and gene families. Ideally, the highest quality signature is obtained by measuring expression across the genome. Even if there are genes whose expression is not altered by any tested compound, those genes are important because their expression levels can be used to normalize the remaining expression data. The normalize procedure is useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene functions to elements of toxicity signatures helps to interpret toxicity mechanisms, but knowledge of gene functions is not required for statistical matching of signatures leading to toxicity prediction (eg, US National Environment on February 29, 2000) See Press Release 00-02 issued by the National Institute of Environmental Health Sciences, available at http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm Is possible). Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences in toxicological screening using toxicity signatures.
[0261]
In one embodiment, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing nucleic acid with the test compound. Nucleic acid expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for the polynucleotide of the invention, thereby quantifying the transcript level corresponding to the polynucleotide of the invention. . The transcript level in the treated biological sample is compared to the level in the untreated biological sample. Differences in transcript levels between the two samples indicate a toxic response caused by the test compound in the treated sample.
[0262]
Another embodiment relates to analyzing the proteome of a tissue or cell type using the polypeptide sequences of the present invention. The term proteome refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein component of the proteome can be individually subject to further analysis. Proteome expression patterns or profiles can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of proteins expressed at a given time under given conditions. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by isolating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, the separation is achieved by two-dimensional gel electrophoresis in which the protein is separated from the sample by one-dimensional isoelectric focusing and separated according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis. (Steiner and Anderson, above). Proteins are visualized in the gel as dispersed, unique points by staining the gel with a substance such as Coomassie Blue, or silver stain or fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. Compare the optical density of equally located protein spots from different samples, such as biological samples treated or untreated with test compounds or therapeutic agents, and identify changes in protein spot density associated with treatment To do. Proteins within the spot are partially sequenced using standard methods using, for example, chemical or enzymatic cleavage followed by mass spectrometry. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its subsequence, preferably at least 5 consecutive amino acid residues, to the polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequence data is obtained for definitive protein identification.
[0263]
Proteomic profiles can also be generated by quantifying the expression level of TRICH using an antibody specific for TRICH. In some embodiments, these antibodies are used as elements on the microarray, and protein expression levels are quantified by exposing the microarray to the sample and detecting the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999). Anal. Biochem. 270: 103-111; Mendoze, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed in a variety of ways known in the art, for example, a thiol or amino reactive fluorescent compound can be reacted with a protein in a sample to detect the amount of fluorescent binding in each array element.
[0264]
Toxicity signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with the toxicity signature at the transcriptional level. For some proteins in several tissues, the transcript and protein abundance may be poorly correlated (Anderson, NL and J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18: 533-537) Proteome toxicity signatures may be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect the proteome but alter the proteome profile. Moreover, since analysis of transcripts in body fluids is difficult due to rapid degradation of mRNA, proteome profiling can be more reliable and informative in such cases.
[0265]
In another example, the toxicity of a test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins expressed in the treated biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. The difference in protein content of both samples indicates a toxic response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing the amino acid residues of the individual proteins and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0266]
In another example, the toxicity of a test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The protein obtained from the biological sample is incubated with an antibody specific for the polypeptide of the present invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. The difference in protein content of both samples indicates a toxic response to the test compound in the treated sample.
[0267]
Microarrays are prepared, used and analyzed by methods known in the art (eg, Brennan, TM et al. (1995) US Pat. No. 5,474,796, Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 35505, Heller, RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 2150-2155, Heller, MJ et al. (1997) US Pat. No. 5,605,662). Various types of microarrays are known, for detailsDNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, edited. (1999) Oxford University Press, London. This document is incorporated herein by reference in particular.
[0268]
In another embodiment of the invention, the nucleic acid sequence encoding TRICH can also be used to create hybridization probes useful for mapping the native genomic sequence. Either coding or non-coding sequences can be used, and in some cases, non-coding sequences are preferred over coding sequences. For example, conservation of coding sequences within members of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosomal mapping. The sequence may be on a particular chromosome, or on a particular region of a chromosome, or an artificially formed chromosome such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), Bacterial P1 products, or mapped to single chromosome cDNA libraries (eg Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127-134 ; See Trask, BJ (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Once mapped, a genetic linkage map can be generated using the nucleic acid sequences of the present invention to correlate, for example, the inheritance of a disease state with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP) (eg, Lander, ES And D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357).
[0269]
Fluorescence in situ hybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see, for example, Heinz-Ulrich, et al. (1995) pp. 965-968 in Meyers, supra). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) website. Since the correlation between the location of the gene encoding TRICH on the physical chromosomal map and the predisposition to a specific disease or a specific disease can help determine the DNA region associated with such a disease, The following positional cloning can be performed.
[0270]
Genetic maps can be expanded using physical mapping techniques such as linkage analysis with established chromosomal markers, and in situ hybridization of chromosomal specimens. By placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, the associated markers can often be revealed even if the exact chromosomal locus is unknown. This information is valuable for researchers searching for disease genes using gene discovery techniques such as positional cloning. When a gene involved in a disease or syndrome is roughly positioned by genetic linkage to a specific genomic region, such as the 11q22-23 region of vasodilatory ataxia, any sequence mapped to that region May present related or regulatory genes for further investigation (see, eg, Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580). The nucleotide sequence of the present invention may be used to find a difference in the chromosomal position among the healthy person, the owner, and the infected person due to translocation, inversion, etc.
[0271]
In another embodiment of the invention, TRICH, its catalytic fragment or immunogenic fragment or its oligopeptide can be used for screening a library of compounds in any of a variety of drug screening techniques. Fragments used for drug screening can be free in solution, fixed to a solid support, retained on the cell surface, or located intracellularly. Complex formation by binding of TRICH to the drug being tested may be measured.
[0272]
Another drug screening method is used to screen compounds with suitable binding affinity for the protein of interest with high throughput (see, eg, Geysen, et al. (1984) PCT application WO 84/03564). . In this method, a large number of different small molecule test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is washed after reacting with TRICH or a fragment thereof. The bound TRICH is then detected by methods well known in the art. Purified TRICH can also be coated directly onto plates used in the aforementioned drug screening techniques. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize the peptide on a solid support.
[0273]
In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of specific binding to TRICH compete with the test compound for binding to TRICH. In this way, the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with TRICH can be detected using antibodies.
[0274]
In another embodiment, the nucleotide sequence encoding TRICH is a molecular biology technique to be developed in the future, and features of the nucleotide sequence currently known (including but not limited to triplet genetic code, specific base pairs It can be used for new technologies that depend on (including interactions).
[0275]
Without further details, those skilled in the art will be able to make full use of the present invention with the above description. Accordingly, the examples described below are for illustrative purposes only and do not limit the invention in any way.
[0276]
Includes all patent applications, patents, publications, U.S. Patent Application Nos. 60 / 296,881, 60 / 305,105, 60 / 293,722, and 60 / 304,593 described above and below. And are hereby incorporated by reference.
【Example】
[0277]
1 cDNA Library creation
The Incyte cDNA group is derived from the cDNA library group described in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA). Some tissues were homogenized and dissolved in guanidinium isothiocyanate solution, and other tissues were homogenized and dissolved in phenol or a suitable mixture of denaturants. TRIZOL (Invitrogen), which is an example of a mixed solution, is a single-phase solution of phenol and guanidine isothiocyanate. The resulting lysate was overlaid on a cesium chloride cushion solution and centrifuged or extracted with chloroform. RNA was precipitated from the lysate using either isopropanol, sodium acetate and ethanol, or another conventional method.
[0278]
In order to increase the purity of RNA, extraction and precipitation of RNA with phenol was repeated as many times as necessary. In some cases, RNA was treated with DNase. In most libraries, poly (A) + RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Chatsworth CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, RNA was isolated directly from tissue lysates using another RNA isolation kit, such as POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0279]
In some cases, RNA was provided to Stratagene and Stratagene produced the corresponding cDNA library. Otherwise, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or SUPERSCRIPT plasmid system (Invitrogen) by the recommended method known in the art or a similar method to prepare a cDNA library (Ausubel, supra). (See 1997, 5.1-6.6 units). Reverse transcription was initiated using oligo d (T) or random primers. A synthetic oligonucleotide adapter was ligated to double stranded cDNA and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme or group of enzymes. For most libraries, cDNA size (300-1000 bp) selection was performed using SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Biosciences) or preparative agarose gel electrophoresis. The cDNA was ligated into compatible restriction enzyme sites of a suitable plasmid polylinker. Suitable plasmids include, for example, PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene), PSPORT1 plasmid (Invitrogen), PCDNA2.1 plasmid (Invitrogen, Carlsbad CA), PBK-CMV plasmid (Stratagene), PCR2-TOPOTA plasmid (Invitrogen), PCMV-ICIS plasmid ( Stratagene), pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA), pRARE (Incyte Genomics), plNCY (Incyte Genomics) or derivatives thereof. The recombinant plasmid was transformed into qualified E. coli cells such as Stratagene XL1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR, or Invitrogen DH5α, DH10B or ElectroMAX DH10B.
[0280]
2 cDNA Clone isolation
Using UNIZAP vector system (Stratagene)in vivoBy excision or by cell lysis,Example 1The plasmid obtained as described above was recovered from the host cells. At least one of the following was used for purification of the plasmid. That is, Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep Purification Kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAWELL QIAWELL 8 Plasmid, QIAWELL 8 Plus Plasmid and QIAWELL 8 Ultra Plasmid Purification System, REAL Prep 96 Plasmid Purification Kit Either. The plasmid was precipitated and then resuspended in 0.1 ml distilled water and stored at 4 ° C. either lyophilized or not lyophilized.
[0281]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates using direct binding PCR in a high-throughput format (Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). Host cell lysis and thermal cycling processes were performed in a single reaction mixture. Samples are processed and stored in 384-well plates, and the concentration of amplified plasmid DNA is measured fluorimetrically using PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and FLUOROSKAN II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) Quantified.
[0282]
3 Sequencing and analysis
Example 2The Incyte cDNA recovered from the plasmid as described in 1 was sequenced as shown below. Sequencing of cDNA can be performed using standard methods or high-throughput equipment such as the ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) or PTC-200 thermal cycler (MJ Research) or the HYDRA microdispenser (Robbins Scientific) or MICROLAB 2200 (Hamilton) liquid transfer. Processed in conjunction with the system. The cDNA sequencing reaction was prepared using a reagent provided by Amersham Biosciences or a reagent of an ABI sequencing kit such as ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems). For electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and for detection of labeled polynucleotides, ABI PRISM 373 or MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Amersham Biosciences) or using standard ABI protocol and base pairing software A 377 sequencing system (Applied Biosystems) or other sequence analysis system known in the art was used. Reading frames within the cDNA sequences were identified using standard methods (reviewed in Ausubel, 1997, 7.7 units supra). Select several cDNA sequences,Example 8The sequence was extended with the technique disclosed in.
[0283]
Polynucleotide sequences derived from Incyte cDNA sequences were validated by removing vectors, linkers and poly (A) sequences and masking ambiguous bases. In doing so, algorithms and programs based on BLAST, dynamic programming and adjacent dinucleotide frequency analysis were used. Secondly, Incyte cDNA sequences, or translations thereof, into public databases (eg GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotes and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM) and humans PROTEOME database (Incyte Genomics, Palo Alto CA) containing sequences from rat, mouse, nematode, budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), and Candida albicans, and hidden markovs such as PFAM Protein family database based on model (HMM) and SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5857-5864, Letunic, I. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 242- We queried against a database selected from HMM-based protein domain databases such as 244). (HMM is a probabilistic approach to analyzing the consensus primary structure of gene families. See, eg, Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365). Queries were made using programs based on BLAST, FASTA, BLIMPS, and HMMER. The Incyte cDNA sequence was assembled to yield the full length polynucleotide sequence. Alternatively, GenBank cDNA, GenBank EST, stitched sequence, stretched sequence or Genscan predicted coding sequence (Examples 4 and 5The Incyte cDNA assembly was extended to full length. Assembly was performed using programs based on Phred, Phrap and Consed, and cDNA assemblies were screened for open reading frames using programs based on GenMark, BLAST and FASTA. The full length polynucleotide sequence was translated and the corresponding full length polypeptide sequence was derived. Alternatively, the polypeptides of the present invention can begin at any methionine residue of the full-length translated polypeptide. Next, queries for analysis of full-length polypeptide sequences can be made using databases such as GenBank protein databases (genpept), SwissProt, PROTEOME databases, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, PFAM, INCY, and TIGRFAM. Hidden Markov Model (HMM) based protein family database group, and HMM based protein domain database group such as SMART. Full-length polynucleotide sequences are also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Sequence alignments between polynucleotides and polypeptides are generated using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm incorporated into the MEGALIGN multi-sequence alignment program (DNASTAR). This also calculates the percent identity between aligned sequences.
[0284]
Table 7 gives an overview of the tools, programs and algorithms used for analysis and assembly of Incyte cDNA and full-length sequences, as well as applicable descriptions, references and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of Table 7 and a brief description thereof in column 2. Column 3 is a preferred reference, all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Where applicable, column 4 indicates the score, probability value, and other parameters used to evaluate the strength with which the two sequences match (the higher the score or the lower the probability value, the distance between the two sequences). The homology is increased).
[0285]
The above program group used for the assembly and analysis of the full-length polynucleotide sequence group and the polypeptide sequence group was also used to identify the polynucleotide sequence fragment group of SEQ ID NO: 10-18. A group of fragments of about 20 to about 4000 nucleotides useful for hybridization and amplification techniques is shown in column 2 of Table 4.
[0286]
4 Genome DNA And editing of coding sequences from
Putative transporters and ion channels were first identified by running the Genscan gene identification program in public genome sequence databases (eg gbpri and gbhtg). Genscan is a universal gene identification program that analyzes genomic DNA sequences from various organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94, Burge, C. and S Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). The program links predicted exons to form an assembled cDNA sequence from methionine to the stop codon. The output of Genscan is a FASTA database of polynucleotide and polypeptide sequences. The maximum range of sequences that Genscan analyzes at one time was set to 30 kb. In order to determine which of these Genscan predicted cDNA sequences encode transporters and ion channels, the encoded polypeptides were queried and analyzed for transporters and ion channels in the PFAM model. Potential transporters and ion channels were also identified based on homology to the insight cDNA sequences annotated as transporters and ion channels. These selected Genscan predicted sequences were then compared to the public databases genpept and gbpri by BLAST analysis. If necessary, Genscan predicted sequences were edited by comparison with the top BLAST hits from genpept to correct sequence errors predicted by Genscan, such as extra or omitted exons. BLAST analysis was also used to find public cDNA coverage of any Incyte cDNA or Genscan predicted sequence, thus providing evidence of transcription. . This information was used to correct or confirm the Genscan predicted sequence when the Incyte cDNA coverage was available. The full-length polynucleotide sequence isExample 3The Genscan predicted coding sequence was assembled with Incyte cDNA sequences and / or public cDNA sequences using the assembly process described in. Alternatively, the full-length polynucleotide sequence is completely derived from the edited or unedited Genscan predicted coding sequence.
[0287]
5 Genome sequence data cDNA Assembly with array data
Stitch arrangement ( Stitched Sequence )
The partial cDNA sequence isExample 4Extension using exons predicted by the Genscan gene identification program described in 1.Example 3The assembled partial cDNA groups as described in 1. were mapped to genomic DNA and decomposed into cluster groups with related cDNA groups and exons predicted from Genscan from one or more genomic sequences. To integrate the cDNA and genome information, each cluster was analyzed using an algorithm based on graph theory and dynamic programming to generate a set of potential splice variants. The sequences were subsequently confirmed, edited or extended to create a full length sequence. A sequence segment group in which the total length of the segment is in two or more sequences was identified in the cluster, and the segment groups identified as such were considered to be equal due to transitivity. For example, if a section exists in one cDNA and two genomic sequences, all three sections were considered equal. This process allows unrelated but contiguous genomic sequences to be cross-linked by joining them with cDNA sequences. The sections thus identified are stitched together with a stitching algorithm so that they appear along the parent sequence to create the longest possible sequence and variant sequence. The linkage between the sections generated along one type of parent sequence (cDNA-cDNA or genomic sequence-genomic sequence) prevailed over the linkage changing the type of parent (cDNA-genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated and compared into public databases genpept and gbpri by BLAST analysis. The incorrect exon predicted by Genscan was corrected by comparing it to the top BLAST hit from genpept. If necessary, the sequences were further extended using additional cDNA sequences or by examination of genomic DNA.
[0288]
Stretch arrangement ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First, using the BLAST program, GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes, such as public databases,Example 3We interrogated partial cDNAs assembled as described in. The closest GenBank protein homologue is then analyzed by BLAST analysis using the Incyte cDNA sequence orExample 4Compared to any of the GenScan exon predicted sequences described in. The resulting high scoring segment pair (HSP) was used to produce a chimeric protein and the translated sequence was mapped onto the GenBank protein homologue. Insertions or deletions can occur in the chimeric protein in relation to the original GenBank protein homologue. Homologous genomic sequences were searched from public human genome databases using GenBank protein homologues, chimeric proteins or both as probes. In this way, the partial DNA sequence was stretched or extended by the addition of homologous genomic sequences. The resulting stretch sequence was examined to determine whether it contained the complete gene.
[0289]
6 TRICH Chromosome Mapping of Polynucleotides Encoding DNA
The sequences used to assemble SEQ ID NO: 10-18 were compared to sequences in the Incyte LIFESEQ database and the public domain database using BLAST and other Smith-Waterman algorithm implementations. The sequences in these databases that matched SEQ ID NO: 10-18 were assembled into clusters of contiguous and overlapping sequences using an assembly algorithm such as Phrap (Table 7). Clustered sequences have already been mapped using radiation hybrids and genetic map data available from official sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Research Institute (WIGR), and Genethon. I confirmed. If the mapped sequence was contained in a cluster, the entire sequence of that cluster was assigned to a map location along with the individual SEQ ID numbers.
[0290]
The location on the map is expressed as a range or section of the human chromosome. The location of a section of the map in centimorgan units is measured relative to the end of the short arm (p-arm) of the chromosome (centiorgan (cM) is a unit of measurement based on the frequency of recombination between chromosomal markers. On average, 1 cM is approximately equal to 1 megabase (Mb) of DNA in humans, although this value varies widely due to recombination hot and cold spots.) CM distance Are based on genetic markers mapped by Genethon that provide boundaries for radiation hybrid markers that contain sequences within each cluster. Disease genes that have already been identified using publicly available human genetic maps and other sources such as NCBI “GeneMap'99” (http: //www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/) It can be determined whether a class is mapped in or near the above interval.
[0291]
7 Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcribed genetic information and involves the hybridization of labeled nucleotide sequences to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. (See, for example, Sambrook, Chapter 7 and Ausubel (1995) chapters 4 and 16 above).
[0292]
Using similar computer technology to which BLAST was applied, the same or related molecules were searched in cDNA databases such as GenBank and LifeSeq (Incyte Genomics). Northern analysis is much faster than some membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of computer searches can be modified to determine whether any particular match is classified as exact or homologous. The search criterion is a product score, which is defined by the following equation.
[0293]
[Expression 1]
Figure 2005507238
[0294]
The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length with which the sequences match. The product score is a normalized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the nucleotide sequence identity and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. To calculate the BLAST score, a score of +5 is assigned to each matching base in a high scoring segment pair (HSP) and -4 is assigned to each mismatched base. Two sequences can share two or more HSPs (separated by gaps). If there are two or more HSPs, the product score is calculated using the segment pair with the highest BLAST score. The product score represents the balance between the fractional overlap and the quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is obtained only if there is a 100% match over the shorter length of the two sequences compared. The product score 70 is obtained when either one end is 100% coincident and 70% overlap, or the other end is 88% coincident and 100% overlap. The product score 50 is obtained when either one end is 100% coincident and 50% overlap, or the other end is 79% coincident and 100% overlap.
[0295]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding TRICH is analyzed against the tissue from which it was derived. For example, one full-length sequence is an Incyte cDNA sequence (Example 3And at least a portion of the assembly. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue consists of cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryonic structure, endocrine system, exocrine gland, female genital organ, male genital organ, germ cell, blood and immune system, liver, musculoskeletal system, nervous system, pancreas, respiratory Classified into one organ / tissue category such as organ system, sensory organ, skin, stomatognathic system, non-classifiable / mixed, or urinary tract. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is classified into one of the following disease / condition categories: cancer, cell line, development, inflammation, nervousness, trauma, cardiovascular, pool, etc. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. The resulting percentage reflects tissue-specific and disease-specific expression of the cDNA encoding TRICH.
[0296]
8 TRICH Of a polynucleotide encoding
Full-length polynucleotide sequences were also generated by extending the fragments using multiple oligonucleotide primers designed from the appropriate fragments of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate 5 ′ extension of a known fragment and the other primer was synthesized to initiate 3 ′ extension of a known fragment. The starting primer is about 22-30 nucleotides in length, has a GC content greater than about 50%, and is annealed to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. or OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or another suitable Was designed from cDNA using a simple program. All nucleotide extensions that resulted in hairpin structures and primer-primer dimers were avoided.
[0297]
A selected human cDNA library was used to extend the sequence. Where more than one extension was necessary or desirable, additional primers or nested sets of primers were designed.
[0298]
High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those skilled in the art. PCR was performed in 96 well plates using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture has template DNA and 200 nmol of each primer. Mg2 +And (NHFour)2SOFourAnd a buffer containing 2-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Biosciences), ELONGASE enzyme (Invitrogen), Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters. Step 1: 94 ° C, 3 minutes, Step 2: 94 ° C, 15 seconds, Step 3: 60 ° C, 1 minute, Step 4: 68 ° C, 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times . Step 6: Store at 68 ℃, 5 minutes, Step 7: Store at 4 ℃. Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters: Step 1: 94 ° C, 3 minutes, Step 2: 94 ° C, 15 seconds, Step 3: 57 ° C, 1 minute, Step 4: 68 ° C, 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times . Step 6: Store at 68 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C.
[0299]
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25 (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to an opaque fluorometer plate ( Corning Costar, Acton MA) is distributed to each well and measured so that the DNA can bind to the reagent. Plates were scanned with Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) to measure sample fluorescence and quantify DNA concentration. Aliquots of 5-10 μl of the reaction mixture were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel to determine which reaction was successful in extending the sequence.
[0300]
The extended nucleotides are desalted and concentrated, transferred to a 384 well plate, digested with CviJI cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and prior to religation reaction into pUC 18 vector (Amersham Biosciences) Sonicated or sheared. For shotgun sequencing, digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, fragments were excised, and agar was digested with Agar ACE (Promega). Elongated clones were religated to pUC 18 vector (Amersham Biosciences) using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA), treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene) to fill restriction site overhangs, and qualified E. coli cells were transfected. Transfected cells were selected and transferred to a medium containing antibiotics, and each colony was excised and cultured overnight at 37 ° C. in a 384 well plate of LB / 2X carbenicillin culture.
[0301]
Cells were lysed and DNA was PCR amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Biosciences) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) as follows. Step 1: 94 ° C, 3 minutes, Step 2: 94 ° C, 15 seconds, Step 3: 60 ° C, 1 minute, Step 4: 72 ° C, 2 minutes, Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 29 times . Step 6: Store at 72 ° C for 5 minutes, Step 7: Store at 4 ° C. DNA was quantified with PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. Samples are diluted with 20% dimethyl sulfoxide (1: 2, v / v), DYENAMIC energy transfer sequencing primer, and DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Biosciences) or ABI PRISM BIGDYE terminator cycle sequencing ready reaction kit (Terminator cycle sequencing ready reaction kit) (Applied Biosystems).
[0302]
Similarly, full-length nucleotide sequences are verified using the above procedure, or 5 ′ regulatory sequences are obtained using oligonucleotides designed for such extensions and appropriate genomic libraries.
[0303]
9 TRICH Of the polynucleotide encoding SNP ( Single nucleotide polymorphism ) Identification
A common DNA sequence variant known as a single nucleotide polymorphism (SNP) was identified in SEQ ID NO: 10-18 using the LIFESEQ database (Incyte Genomics). As described in Example 3, sequences from the same gene were clustered together to identify all sequence variants of the gene. An algorithm consisting of a series of filters is used to distinguish SNPs from other sequence variants. Pre-filter eliminates most basecall errors by requiring a minimum Phred quality score of 15, eliminating sequence alignment errors and errors caused by improper trimming of vector sequences, chimeras and splice variants . The original chromatogram file in the vicinity of the putative SNP was analyzed by an advanced chromosomal analysis automation procedure. Clone error filters used statistically generated algorithms to identify errors introduced during the experimental process, such as those caused by reverse transcriptase, polymerase, or somatic mutation. The cluster error filter used a statistically generated algorithm to identify errors due to clustering of nearby homologs or pseudogenes, or errors caused by contamination with non-human sequences. The final set of filters removed duplicates and SNPs found in immunoglobulins or T cell receptors.
[0304]
Several SNPs were selected for further characterization by mass spectrometry using the high-speed MASSARRAY system (Sequenom, Inc.) and analyzed for allelic frequency at SNP sites in four different human populations. The white population consisted of 92 people (46 men and 46 women), including 83 Utah, 4 French, 3 Venezuela and 2 Amish. The African group consists of 194 people (97 men and 97 women), all African-Americans. The Hispanic population is comprised of 324 Mexican Hispanics (162 men and 162 women). The Asian group is composed of 126 people (64 men and 62 women), with a report of 43% Chinese, 31% Japanese, 13% Korean, 5% Vietnamese, and other 8% Asian parents. Has been. The frequency of alleles was first analyzed in the white population, and in some cases, SNPs that did not show allelic variance in this population were not further examined in the other three populations.
[0305]
10 Labeling and use of individual hybridization probes
CDNA, mRNA, or genomic DNA is screened using a hybridization probe from SEQ ID NO: 10-18. Although specifically described for labeling oligonucleotides of about 20 base pairs, essentially the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using the latest software, such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences).32Label by mixing 250 μCi of P] adenosine triphosphate (Amersham Biosciences) with T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is substantially purified using a SEPHADEX G-25 ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). In a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one of Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba1 or Pvu II (DuPont NEN) endonuclease 107An aliquot containing a count of labeled probes is used.
[0306]
DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. In order to remove non-specific signal groups, the blot groups are washed sequentially at room temperature, for example under conditions of up to 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Visualize and compare hybridization patterns using autoradiography or alternative imaging means.
[0307]
11 Microarray
Binding or synthesis of array elements on a microarray can be accomplished using photolithography, piezo printing (see inkjet printing, Baldeschweiler, etc.), mechanical microspotting techniques and derivatives thereof. is there. In each of the above technologies, the substrate should be a uniform, non-porous solid (Schena (1999) supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, elements similar to dot blot or slot blot methods may be utilized to place and bind elements to the surface of the substrate using thermal, ultraviolet, chemical or mechanical bonding procedures. Conventional arrays can be made using available methods and machinery known to those skilled in the art and can have any suitable number of elements (eg, Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470 Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645; see Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31).
[0308]
Full-length cDNAs, expressed sequence tags (ESTs), or fragments or oligomers thereof can be microarray elements. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art such as LASERGENE software (DNASTAR). The array element group is hybridized with the polynucleotide group in the biological sample. The polynucleotide in the biological sample is conjugated to a molecular tag such as a fluorescent label to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides from the biological sample are removed and hybridization at each array element is detected using a fluorescent scanner. Alternatively, hybridization can also be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is detailed below.
[0309]
Tissue or cell sample preparation
Isolate total RNA from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) using the oligo (dT) cellulose method+Purify RNA. Each poly (A)+RNA samples were MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21mer), 1 × first strand synthesis buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, 500 μM Reverse transcription using 2M dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Biosciences). Reverse transcription reaction was performed using GEMBRIGHT kit (Incyte) and 200 ng poly (A).+Perform in a volume of 25 ml containing RNA. Specific control poly (A)+RNA groups are derived from non-coding yeast genomic DNAin vitroSynthesize by transcription. After incubation at 37 ° C for 2 hours, each reaction sample (one Cy3 and the other Cy5 labeled) was treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 85 ° C for 20 minutes to react. To break down RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After mixing, the two reaction samples are ethanol precipitated using 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. The sample is then completely dried using SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl of 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0310]
Microarray preparation
Array elements are made using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from a vector-containing bacterial cell with a cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence adjacent to the cDNA insert. Array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg in 30 cycles of PCR. Amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Biosciences).
[0311]
The purified array element is fixed on a polymer-coated slide glass. Microscope slides (Corning) are sonicated in 0.1% SDS and acetone during and after treatment and thoroughly washed with distilled water. The slides were etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed thoroughly in distilled water, and 0.05% aminopropylsilane (Sigma) in 95% ethanol. ) To coat. Coated slides are cured in an oven at 110 ° C.
[0312]
Array elements are added to the coated glass substrate using the procedure described in US Pat. No. 5,807,522. This patent is hereby incorporated by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed machine. The instrument now places approximately 5 nl of array element samples per slide.
[0313]
The microarray is UV crosslinked using a STRATALINKER UV crosslinking agent (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS and three times with distilled water at room temperature. To block non-specific binding sites, microarray incubation was performed in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) at 60 ° C. for 30 minutes before Wash with 0.2% SDS and distilled water as done.
[0314]
Hybridization
The 9 μl sample mixture used for the hybridization reaction contains 0.2 μg of each of the cDNA synthesis products labeled with Cy3 or Cy5 in 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture is heated to 65 ° C. for 5 minutes and aliquoted onto the microarray surface to 1.8 cm.2Cover with a cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. The chamber interior is kept at 100% humidity by adding 140 μl of 5 × SSC to the corner of the chamber. The chamber containing the array is incubated for about 6.5 hours at 60 ° C. The array was washed in the first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) for 10 minutes at 45 ° C. and in the second wash buffer (0.1 × SSC) for 10 minutes each at 45 ° C. 3 Wash once and dry.
[0315]
detection
The reporter labeled hybridization complex is equipped with an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) capable of generating spectral lines at 488 nm for Cy3 excitation and 632 nm for Cy5 excitation. Detect with a microscope. A 20 × microscope objective (Nikon, Inc., Melville NY) is used to focus the excitation laser light on the array. The slide containing the array is placed on the microscope's computer-controlled XY stage and raster scanned through the objective lens. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example scans with a resolution of 20 μm.
[0316]
In two different scans, the mixed gas multiline laser sequentially excites the two fluorophores. The emitted light is separated based on wavelength and sent to two photomultiplier detectors (PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two fluorophores. A suitable filter group is placed between the array and the photomultiplier tube to filter the signal. The maximum emission wavelength of the fluorophore used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorophores simultaneously, but with a suitable filter in the laser source, it scans once per fluorophore and typically scans each array twice.
[0317]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by the cDNA control species added to a known concentration of the sample mixture. A specific location on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that location is correlated with the hybridization species at a weight ratio of 1: 100,000. When two samples from different sources (eg, cells to be tested and control cells) are each labeled with a different fluorophore and hybridized to a single array to identify genes expressed differently from the others Calibrate by labeling a sample of cDNA to be calibrated with two fluorophores and adding equal amounts of each to the hybridization mixture.
[0318]
The output of the photomultiplier tube is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (A / D) conversion board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensity is mapped using a linear 20 color conversion from a blue (low signal) to red (high signal) pseudo color scale. Data is also analyzed quantitatively. When exciting and measuring two different fluorophores simultaneously, using the emission spectra of each fluorophore, the data first corrects for optical crosstalk between the fluorophores (due to overlapping emission spectra).
[0319]
A grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected on each element of the grid. The fluorescence signals within each element are integrated to give a numerical value depending on the average intensity of the signal. The software used for signal analysis is the GEMTOOLS gene expression analysis program (Incyte). Array elements that showed an expression change of at least about 2-fold, an SB ratio of 2.5 or greater, and an element spot size of at least 40% were identified in the GEMTOOLS program (Incyte Genomics) as showing differential expression.
[0320]
Expression
SEQ ID NO: 10 showed differential expression in relation to Jurkat cell lines treated with PMA and ionomycin compared to untreated Jurkat cell lines, as determined by microarray analysis. Expression of SEQ ID NO: 10 was reduced at least 2-fold in Jurkat cells treated with at least 100 mM PMA and at least 1 μg / ml ionomycin for 1 hour compared to controls. Thus, SEQ ID NO: 10 may be useful in diagnostic assays that monitor the treatment of immune response disorders.
[0321]
12 Complementary polynucleotides
A sequence complementary to a sequence encoding TRICH or any portion thereof is used to detect, reduce or inhibit the expression of native TRICH. Although the use of oligonucleotides containing about 15-30 base pairs is described, essentially the same procedure is used for smaller or larger sequence fragments. Appropriate oligonucleotides are designed using Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the TRICH coding sequence. In order to inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, a complementary oligonucleotide is designed to prevent the ribosome from binding to the transcript encoding TRICH.
[0322]
13 TRICH Expression
Expression and purification of TRICH can be performed using bacterial or viral based expression systems. To express TRICH in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an antibiotic resistance gene and an inducible promoter that increases the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter used in conjunction with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host such as BL21 (DE3). Antibiotic-resistant bacteria express TRICH when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of TRICH in eukaryotic cells is commonly known as baculovirus in insect cell lines or mammalian cell linesAutographica californicaInfected with a recombinant form of nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). The baculovirus nonessential polyhedrin gene is replaced with the TRICH-encoding cDNA by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid mediation. The infectivity of the virus is maintained and a high level of cDNA transcription is performed by a strong polyhedrin promoter. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda(Sf9) Used for infection of insect cells, but also used for infection of human hepatocytes. In the case of the latter infection, further genetic modification to the baculovirus is required (Engelhard, EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227; Sandig, V. et al. (1996) ) See Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945).
[0323]
In most expression systems, TRICH becomes a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, so recombinant fusion from unpurified cell lysates Protein affinity-based purification can be performed quickly in one step. GST is a 26 kDa enzyme from Schistosoma japonicum that allows purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Biosciences). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from TRICH at specific engineered sites. FLAG is an 8-amino acid peptide that allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His, in which 6 histidine residues are continuously extended, allows purification on metal chelate resins (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995) chapters 10 and 16 above. Directly using TRICH purified by these methods,Examples 17, 18 and 19Applicable assays can be performed.
[0324]
14 Functional assays
TRICH function is assessed by expression of sequences encoding TRICH at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses cDNA at high levels. Vectors selected include the PCMV SPORT plasmid (Invitrogen, Carlsbad CA) and the PCR 3.1 plasmid (Invitrogen), both of which have a cytomegalovirus promoter. Using a liposomal formulation or electroporation, 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line, eg, an endothelial or hematopoietic cell line. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is simultaneously transfected. The expression of the labeled protein provides a means to distinguish between transfected and non-transfected cells. Moreover, expression of cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by expressing the labeled protein. The labeled protein can be selected from, for example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells that express GFP or CD64-GFP using flow cytometry (FCM), an automated, laser-optical technology, and evaluate the apoptotic status and other cellular properties of the cells To do. FCM detects and measures the uptake of fluorescent molecules that diagnose phenomena that precede or occur simultaneously with cell death. These phenomena include changes in nuclear DNA content as measured by DNA staining with propidium iodide, changes in cell size and particle size as measured by forward and 90 ° side scatter, bromodeoxyuridine. Down-regulation of DNA synthesis measured by a decrease in the uptake of protein, alteration of protein expression in the cell surface and in cells measured by reactivity with specific antibodies, and fluorescein-conjugated annexin V protein to the cell surface There is a change in the plasma membrane composition measured by binding. For flow cytometry, see Ormerod, M.G. (1994).Flow Cytometry, There is a description in Oxford, New York NY.
[0325]
The effect of TRICH on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with either a sequence encoding TRICH and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transfected cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transfected and non-transfected cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or antibodies to CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods well known in the art. Expression of mRNA encoding TRICH and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0326]
15 TRICH Production of specific antibodies
Using TRICH substantially purified by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-495) or other purification techniques, using standard protocols Animals are immunized (eg, rabbits, mice, etc.) to produce antibodies.
[0327]
Alternatively, the TRICH amino acid sequence can be analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine highly immunogenic regions, the corresponding oligopeptides synthesized and used to generate antibodies in a manner well known to those skilled in the art. Produce. The selection of appropriate epitopes, such as those near the C-terminus or in adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, chapter 11 above).
[0328]
Typically, an oligopeptide of about 15 residues in length is synthesized using an ABI 431A peptide synthesizer using Fmoc chemistry (Applied Biosystems) and reacted with N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) Bind to KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see Ausubel, 1995, etc.). Rabbits are immunized with oligopeptide-KLH conjugate in complete Freund's adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-TRICH activity of the obtained antiserum, the peptide or TRICH is bound to a substrate, blocked with 1% BSA, washed with a rabbit antiserum, washed, and further radioactive. React with iodine labeled goat anti-rabbit IgG.
[0329]
16 Natural using specific antibodies TRICH Purification
Native or recombinant TRICH is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for TRICH. The immunoaffinity column is formed by covalently binding an activated chromatography resin such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Biosciences) and an anti-TRICH antibody. After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
[0330]
The culture medium containing TRICH is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of TRICH (for example, with a buffer having a high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that break the binding between the antibody and TRICH (eg, with a pH 2-3 buffer or a chaotrope such as high concentrations of urea or thiocyanate ions) and the TRICH is recovered.
[0331]
17 TRICH Of molecules that interact with
Molecules that interact with TRICH include transporter substrates, agonists or antagonists, regulatory proteins such as Gβγ protein (Reimann supra), or localization of TRICH such as MAGUKs (Craven supra) Alternatively, proteins involved in cluster formation can be included. TRICH or biologically active TRICH fragment,125Label with I Bolton Hunter reagent (see, eg, Bolton A.E. and W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529-539). Candidate molecules previously arranged in the wells of a multi-well plate are incubated with labeled TRICH, washed, and all wells with labeled TRICH complex are assayed. Using the data obtained at various TRICH concentrations, calculate the quantity, affinity, and association value of TRICH bound to the candidate molecule.
[0332]
Alternatively, molecules that interact with TRICH can be obtained by using the yeast two-hybrid system described in Fields, S. and O. Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech ) And other commercial kits based on 2-hybrid systems. TRICH or a fragment thereof is expressed as a fusion protein with a Gal4 or lexA DNA binding domain, and a potential interacting protein is expressed as a fusion protein with an activation domain. The interaction between the TRICH fusion protein and the TRICH interacting protein (a fusion protein with an activation domain) reverses the transactivation function observed by expression of the reporter gene. Yeast two-hybrid systems are commercially available and methods for using yeast two-hybrid systems with ion channel proteins are described in Niethammer, M. and M. Sheng (1998, Methods Enzymol. 293: 104-122). Has been described.
[0333]
TRICH also uses the PATHCALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a high-throughput yeast two-hybrid system to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) US Pat. No. 6,057,101).
[0334]
Potential TRICH agonists or antagonists are:Example 18Can be tested for activation or inhibition of TRICH ion channel activity.
[0335]
18 TRICH Demonstration of activity
The ion channel activity of TRICH is demonstrated using an ionic conductance electrophysiological assay. TRICH is a eukaryotic expression vector encoding TRICH and can be expressed by transforming a mammalian cell line such as COS7, HeLa, or CHO. Eukaryotic expression vectors are commercially available, and techniques for introducing them into cells are well known to those skilled in the art. A second plasmid that expresses any one of a number of marker genes, such as β-galactosidase, is cotransformed into the cells, allowing rapid identification of those cells that take up and express foreign DNA. Cells are incubated for 48-72 hours after transformation under conditions suitable for the cell line to express and accumulate TRICH and β-galactosidase.
[0336]
Transformed cells that express β-galactosidase stain blue when a suitable colorimetric substrate is added to the medium under conditions known in the art. Stained cells are tested for differences in membrane electrical conductivity using electrophysiological techniques known in the art. Untransformed cells and / or cells transformed with either vector sequences alone or β-galactosidase sequences alone are used as controls and tested in parallel. Cells expressing TRICH will have a higher cation conductance than control cells. The contribution of TRICH to conductivity can be confirmed by incubating cells with an antibody specific for TRICH. The antibody binds to the extracellular surface of TRICH, thereby blocking pores in the ion channel and the associated conductance.
[0337]
Alternatively, the channel activity of TRICH can be measured using the two-electrode potential clamp technique (Ishi et al.Above, Jegla, T. and L. Salkoff (1997) J. Neurosci. 17: 32-44)XenopusMeasured as current through the oocyte membrane. TRICH is subcloned into an appropriate Xenopus oocyte expression vector, such as pBF, and 0.5-5 ng of mRNA is injected into the mature stage 4 oocyte. Injected oocytes are incubated at 18 ° C. for 1-5 days. The inside-out macropatch is cut and transferred to an intracellular solution containing 116 mM K-gluconic acid, 4 mM KC1, and 10 mM Hepes (pH 7.2). For intracellular solutions, cAMP, cGMP, or Ca+2 (CaCl2Are appropriately supplemented with various concentrations of TRICH mediators. The resistance of the electrode is set to 2-5 MΩ and the electrode is filled with an intracellular solution without a mediator. The experiment is performed from a holding potential of 0 mV at room temperature. Voltage ramps from -100 mV to 100 mV (2.5 seconds) are obtained at a sampling frequency of 500 Hz. The current measured is proportional to the activity of TRICH in the assay.
[0338]
For example, TRICH-3 activity is measured as proton conductance and TRICH-4 activity is measured as calcium conductance.
[0339]
The transport activity of TRICH is assayed by measuring the incorporation of labeled substrate into Xenopus oocytes. Oocytes in stages 5 and 6 were injected with TRICH mRNA (10 ng per oocyte) and OR2 medium (82.5 mM NaCl, 2.5 mM KC1, 1 mM CaCl).2, 1 mM MgCl2, 1mM Na2HPOFour, 5 mM Hepes, 3.8 mM NaOH, 50 μg / ml gentamicin, pH 7.8) for 3 days at 18 ° C. to allow expression of TRICH. The oocytes are then loaded with standard uptake medium (100 mM NaCl, 2 mM KC1, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Hepes / Tris, pH 7.5). Incorporation of various substrates (eg, amino acids, sugars, drugs, ions, and neurotransmitters) can result in labeled substrates (eg,ThreeIt is initiated by the addition of H (radiolabeled with H or fluorescently labeled with rhodamine). After a 30 minute incubation, uptake was performed by occluding the oocyte three times with Na.+Finish by washing with no culture medium and measure the incorporated label and compare to control. TRICH activity is proportional to the level of labeled substrate internalized. Test substrates include, but are not limited to, Melibios and other sugars for TRICH-1, and sulfuric acid for TRICH-6.
[0340]
The ATPase activity associated with TRICH is radioactively labeled ATP- [γ-32P] hydrolysis, separation of hydrolysis products by chromatographic methods, and recovery using a scintillation counter32It can be measured by quantifying P. The reaction mixture is placed in a suitable buffer with ATP- [g-32P] and various amounts of TRICH and incubated at 37 ° C. for a suitable time. The reaction is terminated by precipitation with trichloroacetic acid, then neutralized with base, and an aliquot of the reaction mixture is subjected to membrane or filter paper based chromatography to separate the reaction products. Released32The amount of P is counted with a scintillation counter. In this assay, the amount of radioactivity recovered is proportional to the ATP-degrading enzyme activity of TRICH.
[0341]
Alternatively, the iron uptake activity of TRICH is assayed at room temperature in 100 mM HEPES / NaOH buffer (pH 7.0) containing Fe 2+ and TRICH in a molar ratio of 1000: 1. Iron uptake is monitored by measuring absorption at 310 nm using a UV spectrophotometer (Masuda, T. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 19575-19579).
[0342]
19 TRICH Identification of agonists and antagonists
TRICH is expressed in eukaryotic cell lines such as CHO (Chinese hamster ovary) or HEK (human embryonic kidney) 293. The ion channel activity of the transformed cells is measured in the presence or absence of a candidate agonist or candidate antagonist. Ion channel activity is measured using patch clamp methods known in the art, orExample 17Tested as described in. Alternatively, ion channel activity is assayed using fluorescence techniques that measure ion flow through the cell membrane (Velicelebi, G. et al. (1999) Meth. Enzymol. 294: 20-47; West, MR and CR Molloy ( 1996) Anal. Biochem. 241: 51-58). These assays can be adapted for high throughput screening using microplates. The change in internal ion concentration is Ca2+ Using a fluorescent dye such as the indicator Fluo-4 AM (available from Molecular Probes), measurement is performed in combination with the FLIPR fluorescence quantitative plate reading system (Molecular Device). In a more general alternative to the assay, changes in membrane potential caused by ion flow through the plasma membrane areFourMeasured using oxonyl dyes such as (Molecular Probes). DiBACFourIs equilibrated between the extracellular solution and the cell site according to the cell membrane potential. The fluorescence intensity of the dye increases 20 times when bound to a hydrophobic intracellular site, and DiBAC enters the cell.FourInflow (Gonzalez, J. E. and P. A. Negulescu (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 624-631). Candidate agonists or antagonists may be selected from known ion channel agonists or antagonists, peptide libraries, or combination chemical libraries.
[0343]
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations of the described method and system of the invention can be made without departing from the scope or spirit of the invention. While the invention has been described with reference to several embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. . Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
[0344]
(Short description of the table)
Table 1 outlines the nomenclature for the full-length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0345]
Table 2 shows the GenBank identification number and the GenBank homologue annotation closest to the polypeptide of the invention. The probability score that each polypeptide and its homologue match is also shown.
[0346]
Table 3 shows the structural features of the polynucleotide sequences of the invention, such as predicted motifs and domains, along with methods, algorithms and searchable databases used for polypeptide analysis.
[0347]
Table 4 shows the cDNA and genomic DNA fragments used to assemble the polynucleotide sequences of the present invention, along with selected fragments of the polynucleotide sequences.
[0348]
Table 5 shows a representative cDNA library of the polynucleotides of the present invention.
[0349]
Table 6 is an appendix explaining the tissues and vectors used for preparing the cDNA library shown in Table 5.
[0350]
Table 7 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with applicable descriptions, references, and threshold parameters.
[0351]
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Table 7
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Table 7 (continued)
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Table 7 (continued)
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Claims (73)

以下の（ａ）乃至（f）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-9（配列番号１乃至９）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO：1-3、SEQ ID NO:5-6、およびSEQ ID NO:8-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列に対して少なくとも95％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（e）SEQ ID NO：1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｆ）SEQ ID NO:1−9を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片An isolated polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 (SEQ ID NO: 1 to 9) (b) SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 5-6, And a polypeptide having a natural amino acid sequence which is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8-9 (c) at least relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Polypeptide having a natural amino acid sequence such that 91% is identical (d) Polypeptide having a natural amino acid sequence such that at least 95% is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (e) SEQ ID A biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 1-9 (f) an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-9 SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。2. The isolated polypeptide of claim 1 having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. 請求項1のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。2. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. 請求項2のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2. SEQ ID NO:10-18からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。5. The isolated polynucleotide of claim 4 having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18. 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。A cell transformed with the recombinant polynucleotide according to claim 6. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。A genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide according to claim 6. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程。A method for producing the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. Process,
(B) recovering the polypeptide so expressed. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。The method according to claim 9, characterized in that said polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. 請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する、単離された抗体。An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1. 以下の(a)乃至(e)からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:10-18からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物An isolated polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e):
(A) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 (b) at least 90% identical to a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10-18 A polynucleotide complementary to a polynucleotide of polynucleotide (d) (b) complementary to the polynucleotide of polynucleotide (c) (a) having a natural polynucleotide sequence such as d) RNA equivalent 請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。13. An isolated polynucleotide having at least 60 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 12. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。A method for detecting a target polynucleotide having the sequence of the polynucleotide of claim 12 in a sample comprising:
(A) hybridizing the sample with a probe having a group of at least 20 consecutive nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample, the probe comprising a hybridization complex Specifically hybridizing to the target polynucleotide under conditions where a body is formed between the probe and the target polynucleotide or fragments thereof;
(B) detecting the presence / absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex, if there is a high level between the probe and the target polynucleotide or fragment. A method wherein the probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions such that a hybridization complex is formed. 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。15. The method of claim 14, wherein the probe comprises at least 60 consecutive nucleotides. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。A method for detecting a target polynucleotide having the sequence of the polynucleotide of claim 12 in a sample comprising:
(A) amplifying the target polynucleotide or fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) detecting the presence or absence of the amplified target polynucleotide or a fragment thereof, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or a fragment thereof if present. . 請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。A composition comprising the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17の組成物。18. The composition of claim 17, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. 機能的なTRICHの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。A method of treating a disease or condition associated with a reduced expression of functional TRICH, comprising administering the composition of claim 17 to a patient in need of such treatment. Method. 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method of screening a compound to confirm the effectiveness of the polypeptide of claim 1 as an agonist, comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) A screening method comprising the step of detecting agonist activity in the sample. 請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。21. A composition comprising an agonist compound identified by the method of claim 20 and a pharmaceutically acceptable excipient. 機能的なTRICHの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。A method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional TRICH, comprising administering the composition of claim 21 to a patient in need of such treatment Method. 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method of screening a compound to confirm the effectiveness of the polypeptide of claim 1 as an antagonist comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) a screening method comprising the step of detecting antagonist activity in the sample. 請求項23の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。24. A composition comprising an antagonist compound identified by the method of claim 23 and a pharmaceutically acceptable excipient. 機能的TRICHの過剰発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。25. A method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional TRICH, comprising administering the composition of claim 24 to a patient in need of such treatment. 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させるステップと、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1, comprising:
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under suitable conditions;
(B) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying the compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. 請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。A method of screening for a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1 comprising:
(A) mixing the polypeptide of claim 1 with at least one test compound under conditions that permit the activity of the polypeptide of claim 1;
(B) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of a test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound, A method wherein the change in activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1. 請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含むことを特徴とする方法。A method of screening for compounds effective to alter the expression of a target polynucleotide having the sequence of claim 5 comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting altered expression of the target polynucleotide;
(C) comparing the expression of the target polynucleotide in the presence of a variable amount of the compound and in the absence of the compound. 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。A method for calculating the toxicity of a test compound comprising:
(A) treating a biological sample having a nucleic acid group with the test compound;
(B) hybridizing a nucleic acid group of the treated biological sample with a probe having at least 20 consecutive nucleotide groups of the polynucleotide of claim 12, wherein the hybridization comprises the probe and the probe 13. A polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 12 or a sequence thereof, wherein the target polynucleotide is formed under conditions that form a specific hybridization complex with a target polynucleotide of a biological sample. A polynucleotide comprising a fragment, the above process;
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the amount of the hybridization complex in the treated biological sample with the amount of the hybridization complex in an untreated biological sample, A difference in the amount of the hybridization complex in a biological sample is indicative of the toxicity of the test compound. 生物学的サンプル中のTRICHの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを請求項11に記載の抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。A diagnostic test for a condition or disease associated with the expression of TRICH in a biological sample, comprising:
(A) mixing the biological sample with the antibody of claim 11 under conditions suitable for the antibody to bind to the polypeptide and to form a complex of antibody and polypeptide; ,
(B) detecting the complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample. 請求項11の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')2 断片
（ｅ）ヒト化抗体 のいずれかであることを特徴とする抗体。The antibody of claim 11, comprising
An antibody comprising any one of (a) a chimeric antibody, (b) a single chain antibody, (c) a Fab fragment, (d) an F (ab ′) 2 fragment, and (e) a humanized antibody. 請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。12. A composition comprising the antibody of claim 11 and an acceptable excipient. 被検者のTRICHの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。A method for diagnosing a medical condition or disease associated with expression of TRICH in a subject, comprising the step of administering to the subject an effective amount of the compound according to claim 32. 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。33. The composition of claim 32, wherein the antibody is labeled. 被検者のTRICHの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。35. A method for diagnosing a medical condition or disease associated with the expression of TRICH in a subject, comprising the step of administering to the subject an effective amount of the compound according to claim 34. 請求項11の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。A method for preparing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody of claim 11, comprising:
(A) immunizing an animal with a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 or an immunogenic fragment thereof under conditions that elicit an antibody response The process of becoming
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) a polyclonal antibody that screens the isolated antibody with the polypeptide, thereby specifically binding to a polypeptide having a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 Identifying the antibody. 請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。37. A polyclonal antibody produced by the method of claim 36. 請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。38. A composition comprising the polyclonal antibody of claim 37 and a suitable carrier. 請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。A method for producing a monoclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 11,
(A) immunizing an animal with a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 or an immunogenic fragment thereof under conditions that elicit an antibody response The process of becoming
(B) isolating cells producing antibodies from said animal;
(C) fusing the immortalized cell with the antibody-producing cell to form a hybridoma cell that produces a monoclonal antibody;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from the culture a monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. 請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。40. A monoclonal antibody produced by the method of claim 39. 請求項40に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。41. A composition comprising the monoclonal antibody of claim 40 and a suitable carrier. Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項11に記載の抗体。12. The antibody of claim 11, wherein the antibody is produced by screening a Fab expression library. 組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする、請求項11に記載の抗体。12. Antibody according to claim 11, characterized in that it is produced by screening a recombinant immunoglobulin library. SEQ ID NO:1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-9からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。A method of detecting in a sample a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9,
(A) incubating the antibody of claim 11 with a sample under conditions that allow specific binding of the antibody to the polypeptide;
(B) detecting specific binding, the specific binding indicating that a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9 is present in the sample And how to. SEQ ID NO:1-9 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-9からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。A method for purifying a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9,
(A) incubating the antibody of claim 11 with a sample under conditions that allow specific binding of the antibody to the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having a certain amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-9. マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。14. A microarray, wherein at least one element of the microarray is a polynucleotide according to claim 13. ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作成する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程、とを含むことを特徴とする方法。A method for generating an expression profile of a sample comprising a polynucleotide comprising:
(A) labeling the polynucleotide group of the sample;
(B) contacting the elements of the microarray of claim 46 with the labeled polynucleotides of the sample under conditions suitable for formation of a hybridization complex;
(C) quantifying the expression of the polynucleotide group in the sample. 或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。An array having various nucleotide molecules attached at unique physical locations on a solid substrate, wherein at least one said nucleotide molecule is specific to at least 30 consecutive nucleotide groups of a target polynucleotide 13. An array comprising a first oligonucleotide or polynucleotide sequence capable of hybridizing to said target polynucleotide, wherein said target polynucleotide is the polynucleotide of claim 12. 請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, wherein the first oligonucleotide or polynucleotide sequence is completely complementary to at least 30 contiguous nucleotides of the target polynucleotide. 請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, wherein the sequence of the first oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to at least 60 contiguous nucleotides of the target polynucleotide. 請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, wherein the initial sequence of the oligonucleotide or polynucleotide is completely complementary to the target polynucleotide. 請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, wherein the array is a microarray. 請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, comprising the target polynucleotide hybridized to a nucleotide molecule having a first sequence of the oligonucleotide or polynucleotide. 請求項48に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, wherein a linker connects at least one of the nucleotide molecules and the solid substrate. 請求項48に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。49. The array of claim 48, wherein each unique physical location on the substrate comprises a plurality of nucleotide molecules, wherein the plurality of nucleotide molecules at any single unique physical location comprises the same sequence. Each of the unique physical locations on the substrate includes a group of nucleotide molecules having a sequence that is different from the sequence of the nucleotide molecules at another unique physical location on the substrate. An array. SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。The polypeptide of claim 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO:10のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 10. SEQ ID NO:11のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO:12のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO:13のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO:14のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO:15のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO:16のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO:17のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO:18のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。The polynucleotide of Claim 12 having the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
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