JP2005503756A5

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Publication number: JP2005503756A5
Application number: JP2002555211A
Authority: JP
Filing date: 2001-12-31
Publication date: 2005-06-09

Description

【発明の名称】硫酸化部分を含むエピトープを含む単離分子、当該エピトープに対する抗体、及びその使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】以下の式：
【化１】

（式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化２】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但しアスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
qは、1〜6であり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であり、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0; q=1ならばr=1であり、またq>1ならば1以上のYが硫酸化している; さらに、単離エピトープには抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、断片又は複合体が結合しうる。)
を含む単離エピトープ。
【請求項２】硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートである、請求項1の単離エピトープ。
【請求項３】 Wがグリシンであり、Yがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、qが1、2又は3である、請求項1の単離エピトープ。
【請求項４】 Yがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qが3であり、rが1である、請求項3の単離エピトープ。
【請求項５】以下の式：
【化３】

（式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化４】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここでn=0ならばm>0; m=0ならばn>0である; 1以上のYが硫酸化している; さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。)
を含む単離エピトープ。
【請求項６】硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートである、請求項5の単離エピトープ。
【請求項７】 Wがグリシンであり、Yがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンである、請求項5の単離エピトープ。
【請求項８】 Yがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qが3であり、rが1である、請求項7の単離エピトープ。
【請求項９】以下の式：
【化５】

（式中、
Gは、グリシンであり、
Eは、グルタミン酸であり、
Dは、アスパラギン酸であり、
Yは、チロシンであり、
Sは、スルフェート又は硫酸分子であり、
Xは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
zは、0、1又は2であり、
tは、1、2又は3であり、
rは、0又は1であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、1以上のYが硫酸化している; n=0ならばm>0; m=0ならばn>0;さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。)
を含む単離エピトープ。
【請求項１０】 rが1である、請求項9の単離エピトープ。
【請求項１１】硫酸化Yでありうる天然部分が脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、及び/又はリポ多糖分子を含む、請求項1〜8のいずれか1項の単離エピトープ。
【請求項１２】請求項1〜10のいずれか1項の単離エピトープの同族体又は模倣体。
【請求項１３】硫酸化に加えて1以上の翻訳後修飾を含む、請求項1〜10のいずれか1項の単離エピトープ。
【請求項１４】請求項1〜10のいずれか1項の単離エピトープを含む組成物。
【請求項１５】エピトープの結合能を改善することができる上流又は下流領域をさらに含む、請求項14の組成物。
【請求項１６】上流又は下流領域がエピトープに隣接する、請求項15の組成物。
【請求項１７】請求項1〜10のいずれか1項の単離エピトープの少なくとも一部分をコードする単離ヌクレオチド。
【請求項１８】請求項1の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１９】請求項5の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２０】請求項9の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２１】請求項2〜4、6〜8又は10〜13のいずれか1項の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２２】請求項1〜13のいずれか1項の単離エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する方法であって、
(a) ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを準備する;
(b) 請求項1〜13のいずれか1項の単離エピトープを準備する;
(c) ファージ・ディスプレイ・ライブラリーをパニングして、該単離エピトープと結合しうるオリゴペプチド又はポリペプチドを提示するファージ粒子を選び出す; 及び
(d) 該単離エピトープと結合しうる該オリゴペプチド又はポリペプチドを含む抗体、その結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する
ステップを含む方法。
【請求項２３】 SEQ ID NO:25又はSEQ ID NO:203のscFv抗体断片の結合能を有する抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２４】 SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつことを特徴とするペプチド又はポリペプチドの結合能を有する抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２５】ペプチド又はポリペプチドがSEQ ID NO:115を含む第2超可変領域及び/又はSEQ ID NO:114を含む第3超可変領域をもつことをさらなる特徴とする、請求項23〜24のいずれか1項の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２６】 2以上の酸性アミノ酸と1以上の硫酸化チロシンとを含むおよそ3〜126アミノ酸残基の長さのペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープに結合しうる抗体、抗体結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２７】エピトープがさらにプロリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、グリシン又はフェニルアラニン残基を含むことを特徴とする、請求項26の抗体、抗体結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２８】抗体又はその抗原結合性断片がさらに糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子上のエピトープに結合しうることを特徴とする、請求項23〜27のいずれか1項の抗体、抗体結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項２９】糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子上のエピトープが1以上の硫酸化部分を含むことをさらなる特徴とする、請求項28の抗体、抗体結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３０】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３１】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に結合し、かつB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型にも結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３２】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα及びヘパリンの各々に結合しうる、請求項31の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３３】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα及びヘパリンの各々に結合し、かつB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型にも結合しうる、請求項32の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３４】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に結合し、かつさらに脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子上のエピトープにも結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３５】脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子上のエピトープが1以上の硫酸化部分を含むことを特徴とする、請求項34の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３６】 2以上のエピトープすなわち各々1つ又は複数の硫酸化チロシン残基と2以上の酸性アミノ酸からなる1以上のクラスターとを含む2以上のエピトープと交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３７】 PSGL-1と交差反応しうる、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３８】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むQATEYEYLDY DFLPETEに結合する、請求項37の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項３９】 GB1b-αと交差反応しうる、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４０】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むDEGDTDLY DYYPEEDTEGDに結合する、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４１】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むTDLYDYY PEEDTEに結合する、請求項39の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４２】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むGDEGDTD LYDYYPに結合する、請求項39の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４３】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むYDYYPEEに結合する、請求項39の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４４】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むTDLYDYYPに結合する、請求項39の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４５】フィブリノゲンγ’と交差反応しうる、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４６】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むEPHAETE YDSLYPEDに結合する、請求項45の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４７】ヘパリンと交差反応しうる、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４８】補体複合体4(CC4) と交差反応しうる、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項４９】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むMEANEDYED YEYDELPAKに結合する、請求項48の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５０】 B-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型と交差反応しうる、請求項36の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５１】細胞ローリングを阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５２】炎症を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５３】自己免疫疾患を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５４】血栓症を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５５】再狭窄を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５６】転移を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５７】腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５８】腫瘍細胞の死亡率を高めうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項５９】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害しうる請求項18〜20、23〜 2 5のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６０】白血病細胞の死亡率を高めうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６１】抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６２】抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６３】抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６４】腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６５】がん患者の腫瘍細胞数を減少させうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６６】白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６７】白血病患者の白血病細胞数を減少させうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６８】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の複合体形成を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項６９】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の接着を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７０】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の凝集を阻害しうる請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７１】抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７２】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項71に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７３】薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓/再狭窄薬であることを特徴とする、請求項71に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７４】薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項71に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７５】薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項71に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７６】薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着/抗凝集薬であることを特徴とする、請求項71に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７７】薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項71に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７８】毒素がgelonin、Pseudomonas外毒素(PE)、PE40、PE38、リシン(ricin)、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項77に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項７９】放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、X線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする請求項77に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項８０】放射性同位体が¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項77に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項８１】治療薬がドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルフォリノダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項77に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項８２】 1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項８３】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項８４】放射性同位体又は又は他の造影剤と結合又は複合した請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項８５】請求項84に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含む診断キット。
【請求項８６】請求項18〜20、23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞ローリングを阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項８７】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、炎症を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項８８】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、自己免疫疾患を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項８９】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、血栓症を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９０】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、再狭窄を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９１】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、転移を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９２】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９３】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍細胞の死亡率を高める有効量含有する製剤組成物。
【請求項９４】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９５】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病細胞の死亡率を高める有効量含有する製剤組成物。
【請求項９６】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９７】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９８】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進する有効量含有する製剤組成物。
【請求項９９】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項１００】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させる有効量含有する製剤組成物。
【請求項１０１】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項１０２】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、白血病患者の白血病細胞数を減少させる有効量含有する製剤組成物。
【請求項１０３】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の凝集を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項１０４】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の複合体形成を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項１０５】請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の接着を阻害する有効量含有する製剤組成物。
【請求項１０６】抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１０７】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項106に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１０８】薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓/再狭窄薬であることを特徴とする、請求項106に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１０９】薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項106に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１１０】薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項106に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１１１】薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着/抗凝集薬であることを特徴とする、請求項106に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１１２】薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択される、請求項106に記載の製剤組成物。
【請求項１１３】毒素がgelonin、Pseudomonas外毒素(PE)、PE40、PE38、リシン(ricin)、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項106に記載の製剤組成物。
【請求項１１４】放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、X線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項106に記載の製剤組成物。
【請求項１１５】放射性同位体が¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹ ⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶ ⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項106に記載の製剤組成物。
【請求項１１６】治療薬がドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項106に記載の製剤組成物。
【請求項１１７】 1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物。
【請求項１１８】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする、請求項117に記載の製剤組成物。
【請求項１１９】細胞ローリングを阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２０】炎症を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２１】自己免疫疾患を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２２】再狭窄を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２３】血栓症を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２４】転移を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２５】腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２６】腫瘍細胞の死亡率を高めうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２７】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１２８】白血病細胞の死亡率を高めうる医薬の使用への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体使用。
【請求項１２９】抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３０】抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３１】抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３２】腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３３】腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３４】白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３５】白血病患者の白血病細胞数を減少させうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３６】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の複合体形成を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３７】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の凝集を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３８】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の接着を阻害しうる医薬の製造への、請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の使用。
【請求項１３９】抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合することを特徴とする、請求項119〜138のいずれか1項の方法。
【請求項１４０】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４１】薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓/再狭窄薬であることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４２】薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４３】薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４４】薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着/抗凝集薬であることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４５】薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４６】毒素がgelonin、Pseudomonas外毒素(PE)、PE40、PE38、リシン(ricin)、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４７】放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、X線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４８】放射性同位体が¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹ ⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶ ⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１４９】治療薬がドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項139の方法。
【請求項１５０】抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を、1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合させることを特徴とする、請求項119〜138のいずれか1項の方法。
【請求項１５１】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする、請求項150の方法。
【請求項１５２】細胞ローリングを阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５３】炎症を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５４】自己免疫疾患を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５５】再狭窄を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５６】血栓症を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５７】転移を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５８】腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１５９】腫瘍細胞の死亡率を高めうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６０】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６１】白血病細胞の死亡率を高めうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６２】抗疾病薬による傷害への病変細胞の感受性を増進しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６３】抗がん薬による傷害への腫瘍細胞の感受性を増進しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６４】抗白血病薬による傷害への白血病の感受性を増進しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６５】腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６６】腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６７】白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６８】白血病患者の白血病細胞数を減少させうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１６９】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の複合体形成を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７０】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の凝集を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７１】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の接着を阻害しうる医薬として用いる請求項18〜20、又は23〜 25のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７２】抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した、請求項152〜171のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７３】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７４】薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓/再狭窄薬であることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７５】薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７６】薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７７】薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着/抗凝集薬であることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７８】薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１７９】毒素がgelonin、Pseudomonas外毒素(PE)、PE40、PE38、リシン(ricin)、及びそれらの修飾体、誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８０】放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、X線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８１】放射性同位体が¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹ ⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶ ⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８２】治療薬がドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、及びその誘導体・組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項172の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８３】 1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した、請求項152〜171のいずれか1項に記載の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８４】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする、請求項183の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８５】アミノ酸276、278及び279のうち少なくとも1つが硫酸化していることを特徴とするGPIbαアミノ酸配列Tyr276〜Glu282を含む単離エピトープ。
【請求項１８６】 GPIbαアミノ酸283〜285をさらに含む、請求項185の単離エピトープ。
【請求項１８７】請求項185のエピトープに結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、請求項185のエピトープがGPIbαアミノ酸283〜285をさらに含むときに該結合が増進されることを特徴とする抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体。
【請求項１８８】配列YDYYPEEのエピトープを含む見掛け分子質量約40kDaの単離GPIbα N末端側ペプチドであって、該配列中1以上のチロシン残基が硫酸化していることを特徴とするペプチド。
【請求項１８９】アミノ酸1〜282からなり、アミノ酸276、278及び279のうち少なくとも1つが硫酸化している単離GPIbαペプチド。
【請求項１９０】少なくとも第1及び第2抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、少なくとも第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が以下の式：
【化６】

（式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化７】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、ただしアスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
qは、1〜6であり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0; q=1ならばr=1であり、またq>1ならば1以上のYが硫酸化している。)
を含むエピトープと結合又は交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
【請求項１９１】 Wがグリシンであり、Yがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、qが1、2又は3であるエピトープと第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項190の抗体多量体。
【請求項１９２】 Yがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qが3であり、rが1であるエピトープと第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項190の抗体多量体。
【請求項１９３】少なくとも第1及び第2抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が以下の式：
【化８】

（式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化９】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0である; 1以上のYが硫酸化している。)
を含むエピトープと結合又は交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
【請求項１９４】 Wがグリシンであり、Yがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであるエピトープと第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項193の抗体多量体。
【請求項１９５】 Yがチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qが3であり、rが1であるエピトープと第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項193の抗体多量体。
【請求項１９６】少なくとも第1及び第2抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、少なくとも第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が以下の式：
【化１０】

（式中、
Gは、グリシンであり、
Eは、グルタミン酸であり、
Dは、アスパラギン酸であり、
Yは、チロシンであり、
Sは、スルフェート又は硫酸分子であり、
Xは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
zは、0、1又は2であり、
tは、1、2又は3であり、
rは、0又は1であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、1以上のYが硫酸化している; n=0ならばm>0; m=0ならばn>0。)
を含むエピトープと結合又は交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
【請求項１９７】 rが1であるエピトープと第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が結合又は交差反応することを特徴とする、請求項196の抗体多量体。
【請求項１９８】二量体、三量体又は四量体である、請求項190、193又は196の抗体多量体。
【請求項１９９】二量体である、請求項198の抗体多量体。
【請求項２００】第1及び第2抗原結合性断片のうち少なくとも1つがY1及びY17のscFvフラグメントより選択される、請求項199の二量体。
【請求項２０１】第1及び第2抗原結合性断片がジスルフィド結合によって結合される、請求項199の二量体。
【請求項２０２】第1及び第2抗原結合性断片がY1-Cys-KAKである、請求項201の二量体。
【請求項２０３】第1及び第2抗原結合性断片が、5〜20アミノ酸のポリペプチドリンカーによって結合される、請求項199の二量体。
【請求項２０４】ポリペプチドリンカーが5アミノ酸を含む、請求項203の二量体。
【請求項２０５】ポリペプチドリンカーがGly₄Serである、請求項204の二量体。
【請求項２０６】三量体である、請求項198の抗体多量体。
【請求項２０７】 3つの抗原結合性断片を含み、そのうち少なくとも1つはY1 scFvフラグメント又はY17 scFvフラグメントである、請求項206の三量体。
【請求項２０８】抗原結合性断片がポリペプチドリンカーによって結合される、請求項207の三量体。
【請求項２０９】ポリペプチドリンカーが1〜5アミノ酸を含む、請求項208の三量体。
【請求項２１０】四量体である、請求項198の抗体多量体。
【請求項２１１】 4つの抗原結合性断片を含み、そのうち少なくとも1つはY1 scFvフラグメント又はY17 scFvフラグメントである、請求項210の四量体。
【請求項２１２】抗原結合性断片がポリペプチドリンカーによって結合される、請求項211の四量体。
【請求項２１３】ポリペプチドリンカーが1〜5アミノ酸を含む、請求項212の四量体。
【請求項２１４】 4つの抗原結合性断片がストレプトアビジン-ビオチン会合を介して複合体を形成する、請求項210の四量体。
【請求項２１５】同一の抗原結合性断片を含む、請求項198の抗体多量体。
【請求項２１６】少なくとも第1又は第2抗原結合性断片がSEQ ID NO:8を含む第1超可変領域をもつ、請求項198の抗体多量体。
【請求項２１７】少なくとも第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片がSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ、請求項198の抗体多量体。
【請求項２１８】少なくとも第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片がSEQ ID NO:115を含む第2超可変領域及び/又はSEQ ID NO:114を含む第3超可変領域及をもつ、請求項216又は217の抗体多量体。
【請求項２１９】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に結合しうる、請求項190、193、196、216及び217のいずれか1項の抗体多量体。
【請求項２２０】 PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に結合し、かつB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型にも結合しうる、請求項190、193、196、216及び217のいずれか1項の抗体多量体。
【請求項２２１】第1及び第2抗原結合性断片を含む抗体二量体であって、該第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片がSEQ ID NO:8 [Y1 CDR3]のアミノ酸配列を含む超可変領域をもつことを特徴とする抗体二量体。
【請求項２２２】第1及び第2抗原結合性断片を含む抗体二量体であって、該第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片がSEQ ID NO:20 [Y17 CDR3]のアミノ酸配列を含む超可変領域をもつことを特徴とする抗体二量体。
【請求項２２３】第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片がSEQ ID NO:115を含む第2超可変領域及び/又はSEQ ID NO:114を含む第3超可変領域及をもつ、請求項221又は222の抗体二量体。
【請求項２２４】第1及び第2抗原結合性断片を含む抗体多量体であって、該第1又は第2抗原結合性断片が、もしくは両断片が2以上のエピトープすなわち各々1つ又は複数の硫酸化チロシン残基と2以上の酸性アミノ酸からなる1以上のクラスターとを含む2以上のエピトープと交差反応しうることを特徴とする抗体多量体。
【請求項２２５】 PSGL-1と交差反応しうる、請求項224の抗体多量体。
【請求項２２６】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むQATEYEYL DYDFLPETEに結合する、請求項224の抗体多量体。
【請求項２２７】 GB1b-αと交差反応しうる、請求項224の抗体多量体。
【請求項２２８】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むDEGDTDLY DYYPEEDTEGDに結合する、請求項224の抗体多量体。
【請求項２２９】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むTDLYDYYP EEDTEに結合する、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３０】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むGDEGDTD LYDYYPに結合する、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３１】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むYDYYPEEに結合する、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３２】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むTDLYDYYPに結合する、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３３】フィブリノゲンγ’と交差反応しうる、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３４】 1以上の硫酸化チロシン残基を含むEPHAET EYDSLYPEDに結合する、請求項233の抗体複合体。
【請求項２３５】ヘパリンと交差反応しうる、請求項224抗体多量体。
【請求項２３６】補体複合体4(CC4)と交差反応しうる、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３７】 B-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型と交差反応しうる、請求項224の抗体多量体。
【請求項２３８】請求項1、4、7、27及び28のいずれか1項に記載の抗体多量体を含有する製剤組成物。
【請求項２３９】腫瘍細胞の死亡率を高める又は腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２４０】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２４１】異常な細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板、及び/又は血小板-細胞間の接着を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２４２】病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２４３】白血病細胞の死亡率を高める又は白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２４４】抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した、請求項190、193、196、216及び217のいずれか1項に記載の抗体多量体を含有する製剤組成物。
【請求項２４５】薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択される、請求項244に記載の製剤組成物。
【請求項２４６】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬である、請求項244の製剤組成物。
【請求項２４７】薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓/再狭窄薬である、請求項244の製剤組成物。
【請求項２４８】薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬である、請求項244の製剤組成物。
【請求項２４９】薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬である、請求項244の製剤組成物。
【請求項２５０】薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着/抗凝集薬である、請求項244の製剤組成物。
【請求項２５１】放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、X線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択される、請求項245の製剤組成物。
【請求項２５２】放射性同位体が¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹ ⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶ ⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムからなる群より選択される、請求項251の製剤組成物。
【請求項２５３】治療薬がドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せからなる群より選択される、請求項245の製剤組成物。
【請求項２５４】 1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した、請求項244の製剤組成物。
【請求項２５５】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択される、請求項254の製剤組成物。
【請求項２５６】細胞ローリングを阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２５７】炎症を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２５８】自己免疫疾患を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２５９】血栓症を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６０】再狭窄を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６１】転移を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６２】腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害し、腫瘍細胞の死亡率を高め、又は腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６３】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害し、白血病細胞の死亡率を高め、又は白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６４】病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６５】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板、及び/又は細胞-血小板間の凝集、接着又は複合体形成を阻害する有効量の抗体多量体を含有する、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６６】抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６７】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬である、請求項266の製剤組成物。
【請求項２６８】抗体多量体が1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した、請求項238の製剤組成物。
【請求項２６９】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択される、請求項238の製剤組成物。
【請求項２７０】細胞ローリングを阻害する医薬の製造への、請求項1、4、7、27及び28のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７１】炎症を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７２】自己免疫疾患を阻害する医薬の製造への、請求項1、4、7、27及び28のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７３】再狭窄を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７４】血栓症を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７５】転移を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７６】腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７７】腫瘍細胞の死亡率を高める医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７８】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２７９】白血病細胞の死亡率を高める医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８０】病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８１】腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８２】白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８３】腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８４】腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させる医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８５】白血病患者の白血病細胞数の増加を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８６】白血病患者の白血病細胞数を減少させる医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８７】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板、及び/又は細胞-血小板間の複合体形成を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８８】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板、及び/又は細胞-血小板間の凝集を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２８９】細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板、及び/又は細胞-血小板間の接着を阻害する医薬の製造への、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体の使用。
【請求項２９０】抗体多量体を抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合させることを特徴とする請求項270〜289のいずれか1項の方法。
【請求項２９１】薬剤がアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス薬であることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９２】薬剤がシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリンからなる群より選択される抗血栓/再狭窄薬であることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９３】薬剤がザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドからなる群より選択される抗炎症薬であることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９４】薬剤がレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミドからなる群より選択される抗自己免疫薬であることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９５】薬剤がリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸からなる群より選択される抗接着/抗凝集薬であることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９６】薬剤が毒素、放射性同位体及び治療薬からなる群より選択されることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９７】毒素がgelonin、Pseudomonas外毒素(PE)、PE40、PE38、リシン(ricin)、もしくはそれらの修飾体又は誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９８】放射性同位体がγ放出体、陽電子放出核、X線放出体、β放出体及びα放出体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項２９９】放射性同位体が¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹ ⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶ ⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項３００】治療薬がドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項290の方法。
【請求項３０１】抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその抗原結合性断片を含むその複合体を、1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合させることを特徴とする、請求項270〜289のいずれか1項の方法。
【請求項３０２】基剤又は担体がデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームからなる群より選択されることを特徴とする請求項301の方法。
【請求項３０３】細胞ローリングを阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３０４】炎症を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３０５】自己免疫疾患を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３０６】再狭窄を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３０７】血栓症を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３０８】転移を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３０９】腫瘍細胞の成長及び/又は複製を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１０】腫瘍細胞の死亡率を高める医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１１】白血病細胞の成長及び/又は複製を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１２】白血病細胞の死亡率を高める医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１３】病変細胞の抗疾病薬による傷害への感受性を高める医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１４】腫瘍細胞の抗がん薬による傷害への感受性を高める医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１５】白血病細胞の抗白血病薬による傷害への感受性を高める医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１６】腫瘍患者の腫瘍細胞数の増加を阻害する医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１７】腫瘍患者の腫瘍細胞数を減少させる医薬として用いる、請求項190、193、196、及び216〜 218のいずれか1項に記載の抗体多量体。
【請求項３１８】ヒト・モノクローナル抗体scFv-Y1の可変長分子鎖と交差反応するポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体。
【請求項３１９】ヒト・モノクローナル抗体scFv-Y1の可変長分子鎖のNdeI-EcoRI制限断片と交差反応する、請求項318のポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体。
【請求項３２０】請求項318又は319の抗体又は抗体断片又は複合体を含む診断キット。
【請求項３２１】ドキソルビシンと結合した請求項318又は319の抗体又は抗体断片又は複合体を含む組成物。
【請求項３２２】請求項318又は319の抗体又は抗体断片又は複合体を含む組成物とデキストラン、HPMA、疎水性ポリマー、親油性ポリマー、及びリポソームからなる群より選択される製薬上許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項３２３】ドキソルビシン修飾リポソームと混和した請求項318又は319の抗体又は抗体断片又は複合体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景技術
[1.] 本発明は、がん細胞、転移性細胞、白血病細胞及び血小板などの細胞表面に存在し、かつ細胞ローリングや転移、炎症、自己免疫疾患たとえば特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、凝集など多様な生理現象で重要な役目を果たすエピトープに関連する。本発明は該エピトープへの抗体を使用した治療診断方法及び治療診断用組成物に関連する。本発明はまた、ターゲット細胞に特異的に結合するペプチド及びポリペプチドの、ファージ提示型ライブラリー技術の援用による、組織ターゲッティング及び同定という分野に関連する。さらに詳細には、該ペプチド及びポリペプチドは抗がん活性、抗転移活性、抗白血病活性、抗ウイルス活性、抗感染活性、及び/又は他疾患たとえば炎症性疾患、異常な又は病因性の細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄を伴う疾患、異常又は病因性凝集を伴う疾患、及び自己免疫疾患、心臓血管疾患たとえば心筋梗塞、網膜疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質-タンパク質相互作用に起因する疾患、及び病変細胞一般に対抗する活性を有するであろう。
【０００２】
発明の背景技術
抗体、ファージ提示、及び組織ターゲッティング
[2.] 治療薬の組織選択的ターゲティングは製薬産業の新分野である。ターゲッティングを基礎にした新しいがん治療は副作用を緩和しながら治療の特異性と効能を強めることにより、全般的な有効性を高めることを狙っている。腫瘍関連抗原へのマウス・モノクローナル抗体(MAb)は腫瘍への毒素、放射性ヌクレオチド及び化学療法用コンジュゲートのターゲティングに使用されてきた。また分化抗原のCD19やCD20、CD22、CD25は造血組織悪性腫瘍の治療でがん特異的ターゲットとされてきた。広範囲にわたる研究にもかかわらず、このアプローチにはいくつかの限界がある。第1に選択的結合を示す好適なモノクローナル抗体の単離が困難である。第2に抗体の単離を成功させる前提条件として高い抗体免疫原性が求められる。第3に最終生成物は非ヒト配列を含むため、非ヒト物質への免疫応答(たとえばヒト抗マウス抗体-HAMA応答)を引き起こす。このHAMA応答はしばしば血清半減期を短縮する結果となり反復治療の妨げとなるため、抗体の治療上の価値を減じる。そのため、マウス起源のキメラ又はヒト化モノクローナル抗体の設計とヒト抗体の発見に関心が向けられようになった。このアプローチには既知の精製抗原だけを対象とする単一抗体種しか単離できないという限界もある。また、この方法は悪性細胞だけでなく正常細胞にも存在する細胞表面マーカーへの抗体の単離を許すという意味で非選択的である。
【０００３】
[3.] がん治療面でのMAbの治療有効性を左右する因子はたくさんある。たとえば腫瘍細胞表面での抗原発現の特異性や発現レベル、抗原異質性、腫瘤のアクセスビリティーなどである。白血病とリンパ腫は一般に充実性腫瘍たとえばがん腫よりも抗体治療への感受性が高い。MAbは血流中で白血病及びリンパ腫細胞と急速に結合し、リンパ組織内の悪性細胞へと容易に侵入するので、リンパ腫はMAb療法の格好の候補となる。理想的なシステムは、悪性子孫細胞を産生する幹細胞の表面マーカーを認識するMAbの同定を伴う。
【０００４】
[4.] ファージ提示型ライブラリーは単離された所定のターゲットタンパク質たとえば抗体、ホルモン及び受容体に結合するランダム単鎖Fv(scFv)の選択に使用する。さらに、一般に抗体ライブラリーの使用、特にファージ提示型scFvライブラリーの使用は、特異的な(ただし未認識、未判明の)細胞表面部分をターゲッティングするための独特の分子を発見する代替手段を容易にする。
【０００５】
[5.] 白血病、リンパ腫及び骨髄腫は骨髄及びリンパ組織に起源をもつがんであり、細胞の無制約的な増殖を伴う。急性リンパ性白血病(ALL)は特異な臨床的、免疫学的特徴によって定義される不均一な疾患である。ほとんどのB細胞ALL(B-ALL)の決定的な原因は他種ALLの場合と同様不明であるが、この疾患は多くの場合、単細胞DNAに生じた後天的遺伝子変異に起因し、該細胞を異常化し連続的に増殖させる。B-ALL患者の予後は小児、成人どちらの場合も他の白血病患者に比して著しく悪い。
【０００６】
[6.] 急性骨髄性白血病(AML)は、正常条件下で骨髄性系の最終分化細胞(赤血球、顆粒球、単球及び血小板)となる前駆細胞をもつ不均一腫瘍群である。AMLは他の腫瘍形成と同様に後天性遺伝子変異に関連し、そうした変異の結果として比較的未分化の芽細胞が正常分化骨髄性細胞に取って代わり、1つ又は複数のタイプの初期骨髄性分化を示す。AMLは一般に骨髄で、またある程度まで二次造血器でも起こる。AML患者は主に成人であり、罹患率のピーク年齢層は15〜40歳であるが、小児と高齢者もAMLにかかることが判明している。ほぼすべてのAML患者は、循環未分化芽細胞の異常レベルが解消された臨床的寛解期を迎えるためには、診断後ただちに治療を受ける必要がある。
【０００７】
[7.] これまでに、腫瘍細胞への細胞溶解活性を誘発するような多様なモノクローナル抗体が開発されてきた。P185増殖因子受容体(HER2)の細胞外ドメインへのヒト化モノクローナル抗体MuMAb4D5はFDA(米国食品治療薬品局)の承認をすでに受け、ヒト乳がんの治療に使用されている(米国特許第5,821,337号及び5,720,954号)。この抗体は結合後、増殖因子受容体HER2に依存する腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。加えて、リンパ腫に関連するものを含めた末梢血B細胞の急速な減少を引き起こすCD20へのキメラ抗体も最近FDAの承認を受けた(米国特許第5,843,439号)。この抗体はターゲット細胞に結合すると補体依存性溶解を招く。この抗体製品は最近承認され、現在、軽度悪性B細胞非ホジキンリンパ腫の治験に使用されている。
【０００８】
[8.] 他に数種のヒト化及びキメラ抗体が開発中又は治験段階にある。また、ほとんどのタイプの骨髄性白血病細胞だけでなく正常骨髄性細胞の表面でも発現するCD33抗原と特異的に反応するヒト化Igを抗がん薬カリケアマイシン(calicheamicin)に結合したCMA-676も生まれている[Sievers et al., Blood Supplement, 308, 504a (1997)]。このコンジュゲートはMYLOTARG(登録商標)という商品名で知られ、すでにFDAの承認を受けている[Caron et al., Cancer Supplement, 73, 1049-1056 (1994)]。その細胞溶解活性に照らして追加の抗CD33抗体(HumM195)(目下治験段階にある)が、ゲロニン(gelonin)毒素を含む数種の細胞毒に結合されたり[McGraw et al., Cancer Immunol. Immunother., 39, 367-374 (1994)]、放射性同位体¹³¹I [Caron et al., Blood 83, 1760-1768 (1994)]、⁹⁰Y [Jurcic et al., Blood Supplement, 92, 613a (1998)]、及び²¹³Bi [Humm et al., Blood Supplement, 38:231P (1997)]に結合されたりしている。
【０００９】
[9.] 白血球抗原CD45へのキメラ抗体(cHuLym3)はヒト白血病及びリンパ腫の治験段階にある[Sun et al., Cancer Immunol. Immunother., 48, 595-602 (2000)]。in vitroのADCC (抗体依存性細胞媒介性細胞障害)アッセイでは特異的細胞溶解が観察された[Henkart, Immunity, 1, 343-346 (1994); Squier and Cohen, Current Opin. Immunol., 6, 447-452 (1994)]。
【００１０】
[10.] マウスモノクローナル抗体のヒト化やキメラ抗体の構築とは対照的に、ファージ提示技術の使用は完全ヒト配列を含むscFvの単離を可能にする。ファージ提示技術に由来するscFvクローンを土台にしたヒトTGFb2受容体への完全ヒト抗体が最近開発された。このscFvは、TGFb2の結合と競合しうる完全ヒトIgG4へと変換されると[Thompson et al., J. Immunol. Methods, 227, 17-29 (1999)]、強い抗増殖活性をもつ。この周知技術は以下の出版物にさらに詳しく記載されている: Smith, Science, 228, 1315 (1985); Scott et al., Science, 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS, 87, 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249, 404-406 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 13(14), 3245-3260 (1994); Bass et al., Proteins, 8, 309-314 (1990); McCafferty et al., Nature, 348, 552-554 (1990); Nissim et al., EMBO J., 13, 692-698 (1994); 米国特許第5,427,908号、5,432,018号、5,223,409号及び5,403,384号明細書。
【００１１】
単離 scFv 抗体分子に対応するリガンド
[11.] 血小板、フィブリノゲン、GPIb、セレクチン及びPSGL-1は各々、いくつかの病因性状態又は病態たとえば異常又は病因性炎症、異常又は病因性免疫反応、自己免疫反応、転移、異常な又は病因性の細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、異常又は病因性凝集で重要な役割を果たす。従って、血小板やこれらの分子と交差反応する抗体はこれらや他の病因性状態を伴う疾患及び障害の診断治療に有用であろう。
【００１２】
血小板
[12.] 血小板は特性の解明が進んだ血液系成分であり、止血や血栓症及び/又は再狭窄、及び再狭窄でいくつかの重要な役割を果たす。血管の損傷は一連の連続事象を特徴とする止血過程を発動させる。血管損傷への最初の反応は血管内壁患部への血小板の接着である。次の段階では、前段階で接着した血小板の上に多層の血小板が凝集し、止血栓を形成する。この血小板の塊が血管壁をふさぐ。止血栓はフィブリンポリマーの沈着により強化される。この凝血塊は損傷が修復されて初めて分解される。
【００１３】
転移における血小板の重要性
[13.] 腫瘍の転移はおそらくがん患者の生存を限定する最大の因子である。蓄積データによれば、腫瘍細胞の宿主血小板との相互作用能は不可欠の転移決定因である。Leslie Oleksowicz, Z.M., “Characterization Of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role Of Immunorelated GPIb and GPIIb/III a Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells,”(血小板の腫瘍凝集の解析: MCF-7乳がん細胞による免疫関連GPIb及びGPIIb/III a発現の役割) Thrombosis Research 79: 261-274 (1995).
【００１４】
[14.] 腫瘍細胞の血小板凝集能が腫瘍細胞の転移能と相関することは証明済みであり、血小板の腫瘍凝集の阻害が転移の抑制と相関することもすでにげっ歯類モデルで示されている。すでに証明されているように、腫瘍細胞と血小板の相互作用は膜接着分子とアゴニスト分泌に関連する。腫瘍細胞株では免疫関連血小板糖タンパク質の発現がすでに確認されている。免疫関連血小板糖タンパク質GPIb、GPIIb/III a、GPIb/IX及びインテグリンα_vサブユニットが乳がん細胞株の表面で発現することは証明済みである。Oleksowicz, Z.M., “Characterization Of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role Of Immunorelated GPIb and GPIIb/III a Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells,”(血小板の腫瘍凝集の解析: MCF-7乳がん細胞による免疫関連GPIb及びGPIIb/III a発現の役割) Thrombosis Research 79: 261-274 (1995); Kamiyama, M. et al., “Inhibition of platelet GPIIb/III a binding to fibrinogen by serum factors: studies of circulating immune complexes and platelet antibodies in patients with hemophilia, immune thrombocytopenic purpura, human immunodeficiency virus-related immune thrombocytopenic purpura, and systemic lupus erythematosus,”(血小板GPIIb/III a−フィブリノゲン結合の血清因子による阻害: 血友病、免疫性血小板減少紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス関連免疫性血小板減少紫斑病及び全身性エリテマトーデスの患者を対象とした循環免疫複合体及び血小板抗体の研究) J. Lab Cli Med 117(3): 209-17 (1991).
【００１５】
[15.] Gasic [J.T.B. Gasic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 46-52 (1968)]と共同研究者たちは、抗体誘発血小板減少症がCT26大腸腺がん、Lewis肺腺がん及びB16メラノーマによって産生される転移巣の数と体積を著しく減少させることを示した。Karpatkin, S. et al., “Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro and metastasis formation in vivo,”(in vitro血小板腫瘍相互作用及びin vivo転移巣形成における接着タンパク質の役割) J. Cli. Invest. 81 (4): 1012-9 (1998); Clezardin, P. et al., “Role of platelet membrane glycoproteins Ib/IX and IIb/III a, and of platelet alpha-granule proteins in platelet aggregation induced by human osteosarcoma cells,”(ヒト骨肉種細胞が誘発する血小板凝集における血小板膜糖タンパク質Ib/IX 及び IIb/III aと血小板α顆粒タンパク質の役割) Cancer Res. 53(19): 4695-700 (1993). さらに、GPIbと密接に関連しかつ不完全又は異常O-グリコシル化GPIbαサブユニットに対応する単鎖ポリペプチド (60kd)がHEL細胞の表面膜上で発現することが見い出された。Krieffer, N. et al., “Expression of platelet glycoprotein Ib alpha in HEL cells,”(HEL細胞での血小板GPIbαの発現) J. Biol. Chem. 261(34): 15854-62 (1986).
【００１６】
GPIb 複合体
[16.] 止血過程の各段階は血小板表面受容体の存在を必要とする。止血で重要な一受容体はGP(糖タンパク質)Ib-IX複合体(別名CD42)である。この受容体は血管内皮下層中のフォンビルブラント因子(vWF)を結合することにより損傷部位血管壁への血小板の接着(初期結合)を媒介する。この受容体はまた、止血で重要な他の2つの血小板機能すなわち(a)動脈狭窄部の高ずり応力により誘発される血小板凝集及び(b)低トロンビン濃度により誘発される血小板活性化でも決定的な役割を担う。
【００１７】
[17.] GPIb-IX複合体は血小板細胞膜外表面の主要成分でもある。GPIb-IX複合体は3つの膜スパンポリペプチドすなわちジスルフィド結合したGPIbの130kDa α鎖と25kDa β鎖、それに非共有的に結合したGPIX(22kDa)を含む。血小板膜上には4ユニットすべてが等量比で存在し細胞表面でのCD42複合体の効率的な発現と機能を実現するが、このことは細胞膜上での完全な発現には3サブユニットが複合体へと適正に構成される必要があることを示唆する。GPIbのα鎖は3つの明確な構造ドメインからなる: (1)ロイシンリッチリピート配列とCys結合隣接配列とを含む球状のN末端側ペプチドドメイン; (2)高グリコシル化ムチン様マクログリコペプチドドメイン; 及び(3)GPIbβとのジスルフィド結合と膜貫通及び細胞質内配列を含む膜会合C末端側領域。
【００１８】
[18.] いくつかの証拠によれば、GPIb-IX複合体のvWF及びトロンビン結合ドメインはGPIbαのN末端側の約300アミノ酸にまたがる球状ドメインに存在する。ヒト血小板GPIb-IX複合体は血小板の機能と反応性の両方を媒介する重要な膜受容体である。内皮下層vWFのGPIbによる認識は血管損傷部への血小板の接着を可能にする。さらにGPIbαへのvWFの結合もまた、GPIb-IXの細胞質内ドメインの細胞骨格又はホスホリパーゼA2との相互作用を伴う場合もある血小板の活性化を誘発する。さらに、GPIbαはαトロンビンの高アフィニティー結合部位を含むが、αトロンビンもまた、未解明の点が多い機構により、血小板の活性化を促す。
【００１９】
[19.] GPIbαのN末端側球状ドメインは負荷電アミノ酸群を含む。いくつかの証拠によれば、GPIb-IX複合体を発現する形質転換CHO細胞と血小板GPIbαでは、このドメインに含まれる3個のチロシン残基(Tyr-276、Tyr-278、Tyr-279)が硫酸化している。
【００２０】
タンパク質の硫酸化
[20.] タンパク質の硫酸化は広く見られる翻訳後修飾であり、糖側鎖又はポリペプチド骨格への硫酸基の酵素的共有結合を伴う。この修飾はゴルジ体トランス層で起こるので、トランス層を横断するタンパク質だけに影響する。そうしたタンパク質の例は分泌タンパク質、顆粒へと導かれるタンパク質、及び細胞膜タンパク質の細胞外領域などである。硫酸化されることが目下判明しているアミノ酸はチロシンである。J.W. Kehoe et al., Chemistry and Biol. 7: R51-R61 (2000). おそらく他のアミノ酸たとえばトレオニンもまた、特に病変細胞では硫酸化されるであろう。
【００２１】
[21.] 多数のタンパク質がチロシン硫酸化をこうむると判明しているが、GPIbのように単一ポリペプチド中に3個以上の硫酸化チロシンが存在するのは珍しい。GPIbα (CD42)は血小板と巨核球により発現され、vWFとの結合を介して内皮下層への、また内皮下層上での、血小板の結合とローリングを媒介するが、それに加えてN末端側ドメインに多数の負電荷を含む。そうした高酸性及び親水性環境は硫酸化の必要条件であると考えられる。というのは、チロシン硫酸化酵素は酸性アミノ酸残基に隣接するチロシンを特異的に認識し硫酸化するからである。J.R. Bundgaard et al., JBC 271: 21700-21705 (1997). GPIbαの酸性領域の完全硫酸化により著しく高い負電荷密度の領域(19アミノ酸の区間に13の負電荷)が出現し、そこが他タンパク質との静電的相互作用の候補部位となる。
【００２２】
セレクチンと PSGL-1
[22.] P-、E-及びL-セレクチンは、血管内皮細胞上での白血球ローリングの媒介などを行う細胞接着分子ファミリーである。P-セレクチンは血小板の顆粒中に貯蔵され、トロンビン、ヒスタミン、ホルボールエステル又は他の刺激分子による活性化後に表面へと運ばれる。P-セレクチンは活性化内皮細胞上でも発現される。E-セレクチンは内皮細胞上で、またL-セレクチンは好中球、単球、T細胞及びB細胞上で、それぞれ発現される。
【００２３】
[23.] PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1、別名CD162)はP-セレクチン、E-セレクチン及びL-セレクチンのムチン糖タンパク質リガンドである。PSGL-1はPACE(塩基性アミノ酸対変換酵素)切断部位をもつジスルフィド結合ホモ二量体である。PSGL-1はまた3つの潜在的なチロシン硫酸化部位とそれに続く、プロリン、セリン及びトレオニンに富む約15の十量体繰返し配列をもつ。PSGL-1の細胞外部分は3つのN結合型グリコシル化部位を含み、また多数のシアリル化、フコシル化O結合型オリゴ糖分枝鎖をもつ。K.L. Moore et al., JBC 118:455-456 (1992). 大部分のN-グリカン部位と多数のO-グリカン部位は占有されている。ヒトHL-60細胞に由来するPSGL-1のO-グリカンの構造はすでに決定されている。これらのO-グリカンのサブセットは、セレクチンへの結合に必要とされるコア-2、シアリル化及びフコシル化構造である。P-セレクチンとL-セレクチンへの結合ではPSGL-1のN末端側領域のチロシン硫酸化もまた必要とされる。さらに、おそらく翻訳後に切断されると思われるN末端側ポリペプチドが存在する。
【００２４】
[24.] PSGL-1はHL60細胞では361残基を有し、うち267残基は細胞外領域に、25残基は膜貫通領域に、また69残基は細胞内領域に、それぞれ存在する。PSGL-1のコード配列は単一エキソン内にあるため選択的スプライシングは不可能なはずである。しかし、PSGL-1はHL-60細では、また大部分の細胞株でも、細胞外領域に存在する10残基コンセンサス配列からなる15の連続繰返し配列をもつが、多形核白血球、単球、及び他の数種の細胞株たとえば大部分の天然白血球ではこの繰返し配列が14及び16である。PSGL-1は細胞表面でジスルフィド結合ホモ二量体を形成する。V. Afshar-Kharghan et al., Blood 97:3306-3312 (2001).
【００２５】
[25.] PSGL-1は好中球表面では250kDa及び160kDaの両見かけ分子質量の二量体として発現するが、HL-60表面では二量体型は〜220kDaである。還元条件下で分析すると各サブユニットは分子質量が半減する。分子質量の差は、異なる数の十量体繰返し配列の存在に起因する分子の多形性によるものであろう。Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997).
【００２６】
[26.] PSGL-1はほとんどの血中白血球たとえば好中球、単球、白血球、B細胞サブセット及び諸々のT細胞の表面で発現し、P-セレクチン上での好中球ローリングを媒介する。Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997). PSGL-1はまたL-セレクチンとの結合を介して好中球-好中球相互作用を媒介し、もって炎症を媒介する可能性もある。Snapp, et al., Blood 91(1):154-64 (1998).
【００２７】
[27.] PSGL-1は活性化内皮細胞上、活性化血小板上、及び他の白血球及び炎症部位上での白血球ローリングを媒介する。
【００２８】
[28.] ヒトPSGL-1への市販のモノクローナル抗体(KPL1)が生成され、PSGL-1とP-セレクチンとの、またPSGL-1とL-セレクチンとの相互作用を阻害することが示された。KPL1のエピトープをマッピングによりPSGL-1のチロシン硫酸化コンセンサスモチーフ(YEYLDYD)と同定した(Snapp et al., Blood 91 (1) : 154-164 (1998))。KPL1はこの特定エピトープだけを認識し、他の細胞たとえばB-CLL細胞、AML細胞、転移性細胞、多発性骨髄腫細胞などの表面に存在する硫酸化エピトープとは交差反応しない。
【００２９】
[29.] 白血球ローリングは炎症で重要であり、血管壁上での白血球の係留とローリングには(活性化内皮細胞により、また傷害部位に動員される赤血球上で、発現される) P-セレクチンとPSGL-1の相互作用が関係している。Ramachandran et al., PNAS 98 (18):10166-71 (2001); Afshar-Kharghan et al., Blood 97(10):3306-7 (2001).
【００３０】
[30.] 白血球ローリングは転移でも重要であり、内皮細胞上のP-及びE-セレクチンは転移細胞に結合して、血流から周囲組織への溢出を容易にする。
【００３１】
[31.] 血小板もまた転移過程に関与する。すなわち、転移がん細胞が血流に入ると、腫瘍細胞を被覆する血小板と白血球からなる多細胞複合体が形成される。これらの複合体は、微小栓子といってもよいが、腫瘍が免疫系から逃れるのを手助けする。血小板による腫瘍細胞の被覆では血小板によるP-セレクチンの発現が必要となる。
【００３２】
[32.] P-及びL-セレクチンの阻害物質であるヘパリンによる処理は腫瘍細胞-血小板相互作用を阻害する。シアリル化、フコシル化ムチンリガンドを解離するO-シアロ糖タンパク質分解酵素による腫瘍の前処理もまた、腫瘍細胞-血小板間の複合体の形成を阻害した。in vivo実験ではいずれの処理も単球の循環腫瘍細胞との会合を増進する結果となるが、これは血小板の結合を抑制すると免疫細胞による循環腫瘍細胞へのアクセスが増すことを示唆する。Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34(6): 711-7 (2001).
【００３３】
[33.] PSGL-1とGPIbは構造的に類似しており、ムチン様の高グリコシル化リガンド結合領域を有する。Afshar-Kharghan et al., Blood 97(10): 3306-7 (2001).
【００３４】
[34.] PSGL-1は各種の白血球すなわち単球、リンパ球、活性化末梢血T細胞、顆粒球、好酸球、血小板の表面で、またある種のCD34陽性幹細胞やB細胞サブセットの表面でも検出されている。P-セレクチンは活性化血小板及び内皮細胞の表面で発現される。P-セレクチンとPSGL-1の間の相互作用は血管壁上での白血球ローリングを促進し、また血管部位への白血球の異常集積は種々の病理的炎症を招く。P-セレクチンのPSGL-1への結合ではPSGL-1上の個別チロシン硫酸の立体特異的寄与が重要である。結合には電荷もまた重要であり、NaClを(150mMから50mMへと)薄めると結合が強まった(Kd〜75nM)。PSGL-1上でのチロシン硫酸化はPSGL-1のP-セレクチンへの接着を強めるが、究極の必要条件ではない。PSGL-1チロシン硫酸化はあらゆるずり速度でローリング接着の減速を支援し、またずっと大きいずり速度でのローリング接着を支援する。Rodgers SD, et al., Biophys J. 81:2001-9(2001).
【００３５】
フィブリノゲン
[35.] 正常ヒト・フィブリノゲンには2つの型がある。すなわち、フィブリノゲンγメジャーとフィブリノゲンγ’マイナー変異体であり、どちらも正常個体で検出される。正常フィブリノゲンは存在量が多く(人体で検出されるフィブリノゲンの〜90%)、2個の同一55kDaアルファ(α)鎖、2個の同一95kDaベータ(β)鎖、及び2個の同一49.5kDaガンマ(γ)鎖からなる。正常変異体フィブリノゲンは存在量が少なく(人体で検出されるフィブリノゲンの〜10%)、2個の同一55kDaアルファ(α)鎖、2個の同一95kDaベータ(β)鎖、及び1個の49.5kDaガンマ(γ)鎖と1個の50.5kDaガンマプライム(γ’)鎖からなる。γ鎖とγ’鎖はどちらも同一の遺伝子がコードするが、3’末端で選択的スプライシングが起こる。正常γ鎖はアミノ酸1〜411からなる。正常変異体γ’鎖は427アミノ酸からなり、うちアミノ酸1〜407は正常γ鎖と同じであり、またアミノ酸408〜427はVRPEHPAET EYDSLYPEDDLである。通常、この領域はトロンビン分子が占める。
【００３６】
[36.] フィブリノゲンはイオン化カルシウムの存在下にトロンビンの作用でフィブリンへと変換され、血液の凝固を引き起こす。フィブリンは血栓や急性炎症性滲出液の成分でもある。
【００３７】
[37.] 血小板や(フィブリノゲン、GPIb、セレクチン、PSGL-1などのような)細胞-細胞相互作用や細胞-マトリックス相互作用、血小板-血小板相互作用、血小板-細胞相互作用、血小板-マトリックス相互作用、細胞ローリング及び接着、止血で重要な役割を果たす分子はまた、種々の病因的状態又は病態、たとえば異常又は病因的炎症、異常又は病因的免疫反応、自己免疫反応、転移、異常な又は病因的な細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、異常又は病因的凝集などでも重要な役割を果たす。従って血小板と、またこれらの分子と、交差反応する抗体はこれらや他の病因的状態を伴う疾患や障害の治療診断に有用であろう。従ってこれらの分子に共通するエピトープを同定し、またそれと交差反応しうる抗体を同定する必要がある。
【００３８】
[38.] 抗体は断片、複合体及び多量体など多様な形態で提供してもよい。抗体断片の例は単鎖Fv (scFv)フラグメントやFabフラグメントなどである。
【００３９】
[39.] scFvはフルサイズの抗体よりも小さいため、より短時間で組織に侵入し血液から排泄されることが立証済みである。Adams, G.P. et al., Br. J. Cancer 77, 1405-1412 (1988); Hudson, P.J., Curr. Opin. Immunol. 11(5), 548-557 (1999); Wu, A.M. et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999). 従ってscFvはしばしば、放射性標識の体外排泄を速める目的で腫瘍画像診断など放射性標識を使用する診断に使用される。最近、多数のがんターゲッティングscFv多量体がin vivo安定性及び効能に関する前臨床評価を受けた。Adams, G.P. et al., Br. J. Cancer 77, 1405-1412 (1988); Wu, A.M. et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999).
【００４０】
[40.] 単鎖Fv (scFv)フラグメントは抗体の重鎖可変ドメイン(V_H)と軽鎖可変ドメイン(V_L)からなり、両者はポリペプチドリンカーで結合されている。該リンカーは十分に長いので(V_H)及び(V_L)ドメインは機能的Fvドメインへと折りたたまれる。そのためscFvはそのターゲットを認識し、親抗体に優るとも劣らないアフィニティーでターゲットと結合することができる。
【００４１】
[41.] 一般にscFv単量体はV_HドメインのC末端をポリペプチドリンカーでV_LドメインのN末端に結合した形に設計する。あるいはその逆に、V_LドメインのC末端をポリペプチドリンカーでV_HドメインのN末端に結合してもよい。Power, B. et al., J. Immun. Meth. 242, 193-204 (2004). ポリペプチドリンカーは一般に長さが約15アミノ酸である。リンカーを約3〜7アミノ酸に短縮すると、scFvは機能的Fvドメインへと折りたたまれなくなり、その代わりに第2のscFvと会合してダイアボディ(diabody)を形成する。リンカーの長さを3アミノ酸未満へとさらに短縮すると、scFvの会合によりリンカーの長さや、組成、Fvドメインの向きに応じて三量体、四量体が形成される。B.E. Powers, P.J. Hudson, J. Immun. Meth. 242 (2000) 193-194.
【００４２】
[42.] 最近、多価抗体断片たとえばscFvの二量体、三量体及び四量体はしばしば、親抗体のターゲットへの結合よりも高いアフィニティーを示すことが発見された。腫瘍ターゲッティング用途ではこの高アフィニティーは薬物動態の改善など潜在的利点につながる。さらに科学者たちは、白血球の係留やローリングに関与するP-セレクチンとそのリガンドPSGL-1の研究から、二量体型PSGL-1を発現する細胞のほうがこの高結合アフィニティーのために、より安定的なローリング接着を示すと結論した。これらの接着はよりずり抵抗が大きく、ローリング速度の変動も少ない。Ramachandran et al., PNAS, vol. 98 (18): 10166-71 (2001).
【００４３】
[43.] これら多価体の結合アフィニティーの向上は診断や治療計画にも有利であろう。たとえばscFvは、ターゲット受容体に結合して「天然」リガンドの結合を阻む遮断薬として使用される場合もあろう。その場合には、scFvと受容体の間の会合アフィニティーを高めて解離しにくくし、天然リガンドのターゲットへの望ましくない結合を防げるようにするのがよい。さらに、この高アフィニティーはターゲット受容体が接着やローリングに関与する場合又はターゲット受容体が高ずり流動領域内の細胞たとえば血小板の表面にある場合にも有利であろう。
【００４４】
[44.] 本発明の一目的は単離エピトープを提供することであるが、該エピトープは細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、凝集などの過程に有用であってかつ病変細胞たとえばAML細胞、B-CLL細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞などの表面に存在する多様な分子に由来する。
【００４５】
[45.] 本発明の別の目的はそうした単離エピトープの使用方法を提供することであるが、該方法の目的は細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、凝集などの過程に有用であってかつ病変細胞たとえばAML細胞、B-CLL細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞などの表面に存在する分子上のエピトープを認識しそうしたエピトープと交差反応するような抗体の開発である。
【００４６】
[46.] 本発明の他の目的は、細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、凝集などを阻害するための薬、及び疾患たとえばAML、B-CLL、多発性骨髄腫、転移、心臓血管疾患たとえば心筋梗塞、網膜疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質-タンパク質相互作用に起因する疾患、及び前記のような細胞機能又は作用が重要な役割を果たす他疾患を治療するための薬の開発と提供へのそうした抗体の使用を含む。
【００４７】
[47.] 個人の多様の病態たとえばAML、B-CLL、多発性骨髄腫及び転移、又は細胞ローリングや炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、凝集などのような細胞機能又は作用が重要な役割を果たす他疾患の診断方法に前記エピトープ及び抗体を利用することも本発明の目的である。
【００４８】
[48.] 多価体の抗体、断片及び複合体の提供も本発明の目的である。より具体的には、本明細書でそれぞれダイアボディ(diabody)、トライアボディ(triabody)及びテトラボディ(tetrabody)とも呼ぶ二量体、三量体及び四量体を提供することが本発明の一目的である。
【００４９】
[49.] 本明細書では本発明のこれらや他の目的について記載する。
【００５０】
発明の要約
[50.] 本発明は炎症、免疫反応、転移、細胞接着、血栓症、再狭窄、凝集など多様な過程で重要な役割を果たすリガンド及び受容体上で検出されるエピトープを提供する。本発明のエピトープは白血病/腫瘍細胞特に骨髄性白血病細胞の表面でも検出される。従って、これらのエピトープはこれらの過程の治療的媒介のための有用なターゲットである。こうしたエピトープへの抗体はがん治療薬(抗腫瘍薬、抗転移薬)や、白血病、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患たとえば心筋梗塞、網膜疾患及び血小板機能異常を伴う他疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質-タンパク質相互作用に起因する疾患の治療薬として有用である。本発明は該抗体、該抗体を含む組成物、該抗体を使用する治療診断方法を提供する。
【００５１】
[51.] 本発明は以下の式：
【化１１】

を含む単離エピトープを提供する。式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化１２】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【００５２】
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
qは、1〜6であり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0; q=1ならばr=1であり、またq>1ならば1以上のYが硫酸化している; さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【００５３】
[52.] 本発明は、式(I)を含む単離エピトープであって、硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートもしくはそれらの複合体である単離エピトープを提供する。
【００５４】
[53.] 本発明はまた、式Iを含む単離エピトープであって、Wがグリシンであり、Yがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、qが1、2又は3である単離エピトープを提供する。これらのうちある種の実施態様ではYはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qは3、rは1である。
【００５５】
[54.] 本発明は以下の式：
【化１３】

を含む単離エピトープを提供する。式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化１４】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【００５６】
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0である; 1以上のYが硫酸化している; さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【００５７】
[55.] 本発明は、式（II）を含む単離エピトープであって、硫酸化部分がペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートもしくはそれらの複合体である単離エピトープを提供する。
【００５８】
[56.] 本発明はまた、式（II）を含む単離エピトープであって、Wがグリシンであり、Yがチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aがグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンである単離エピトープを提供する。これらのうちある種の実施態様ではYはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qは3、rは1である。
【００５９】
[57.] 本発明は以下の式：
【化１５】

を含む単離エピトープを提供する。式中、
Gは、グリシンであり、
Eは、グルタミン酸であり、
Dは、アスパラギン酸であり、
Yは、チロシンであり、
Sは、スルフェート又は硫酸分子であり、
Xは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
zは、0、1又は2であり、
tは、1、2又は3であり、
rは、0又は1であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、1以上のYが硫酸化している; n=0ならばm>0; m=0ならばn>0;さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【００６０】
[58.] 本発明は式（III）を含み、式中rが1である単離エピトープを提供する。
【００６１】
[59.] 以上いずれの実施態様でも、Yは脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、及び/又はリポ多糖分子を含んでもよい。
【００６２】
[60.] 本発明はまた前記エピトープの誘導体、同族体、模倣体又は変異体を提供し、また硫酸化に加えて1以上の翻訳後修飾を受けた前記エピトープを提供する。
【００６３】
[61.] 本発明は1つ又は複数の前記単離エピトープを含む組成物を提供する。前記エピトープの少なくとも一部分をコードする単離ヌクレオチドもまた提供される。
【００６４】
[62.] 本発明はまた、1以上の前記エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００６５】
[63.] 1以上の前記エピトープと結合又は交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する方法もまた提供される。該方法は次のステップを含む: (a)ファージ提示型ライブラリーを準備する、(b)前記エピトープのうちの1つを準備する、(c)該ファージ提示型ライブラリーをパニングして、該単離エピトープと結合しうるオリゴペプチド又はポリペプチドを提示するファージ粒子を選び出す、及び(d) 該単離エピトープと結合しうる該オリゴペプチド又はポリペプチドを含む抗体、その結合性断片、又は該抗体又はその結合性断片を含むその複合体を生産する。
【００６６】
[64.] 本発明はまた、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、SEQ ID NO: 25 [Y1 scFv]及び/又はSEQ ID NO: 203 [Y17 scFv]のscFv抗体断片の結合能を有する抗体、その断片又は複合体を提供する。
【００６７】
[65.] SEQ ID NO: 8 [Y1 CDR3]又はSEQ ID NO: 20 [Y17 CDR3]を含む第1超可変領域をもつペプチド又はポリペプチドの結合能を有する抗体、抗体断片又は抗体複合体が提供される。これらのうちある種の実施態様では、該ペプチド又はポリペプチドはSEQ ID NO: 115を含む第2超可変領域及び/又はSEQ ID NO: 114を含む第3超可変領域をもつ。
【００６８】
[66.] 1以上の硫酸化チロシンと2以上の酸性アミノ酸とを含むおよそ3〜126アミノ酸残基の長さのペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープに結合しうる抗体、抗体断片又は抗体複合体が提供される。これらのうちある種の実施態様では、該エピトープはさらに1以上のロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシン残基を含む。これらのうちある種の実施態様では、2以上の酸性アミノ酸残基のうち1つ又は複数がロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシン残基に置き換わる。他実施態様では該エピトープはDYD又はEYEを含む。ある種の実施態様では該エピトープはDYD又はEYEである。さらに別の実施態様では該エピトープはDYE又はEYDを含む。
【００６９】
[67.] ある種の実施態様では、本発明に基づいて提供される抗体、抗体断片及び抗体複合体は脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子上のエピトープに結合することができる。好ましくは、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖エピトープに結合することができる。数多くの実施態様では、該脂質、糖質、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質及び/又はリポ多糖分子は1以上の硫酸化部分を含む。
【００７０】
[68.] 本発明は、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に、必ずしも同時にではないが、結合しうる抗体、その断片又はその複合体を提供する。また本発明の抗体、抗体断片又は複合体は、受容体エピトープが原型を保つ限り、これらのタンパク質の任意の類縁体にも結合しよう。
【００７１】
[69.] ある種の好ましい実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ルミカン、補体複合体4、インターαインヒビター、プロトロンビン及びヘパリンからなる群より選択される2以上のタンパク質に結合しうる、また病変細胞たとえばB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞に結合しうる抗体、その断片又はその複合体が提供される。ある種の実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα、ヘパリン、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンの各々に結合しうる抗体、その断片又はその複合体が提供される。ある種の実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、PSGL-1、フィブリノゲンγ’、GPIbα及びヘパリンの各々に結合しうる抗体、その断片又はその複合体が提供されるし、またある種の好ましい実施態様ではこれらの抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は病変細胞たとえばB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞にも結合しうる。
【００７２】
[70.] 本発明は、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、PSGL-1、フィブリノゲンγ’、ヘパリン、GPIbα、ルミカン、補体複合体4(CC4)、インターαインヒビター及びプロトロンビンからなる群より選択される2以上の異なる分子に結合しうる、かつさらに糖質及び/又は脂質分子上のエピトープに結合しうる抗体、その断片又はその複合体を提供する。これらのうちある種の実施態様では、糖質及び/又は脂質分子上のエピトープは1以上の硫酸化部分を含む。
【００７３】
[71.] 本発明は抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体であって、各々酸性アミノ酸群内に1つ又は複数の硫酸化チロシン残基を含む2以上のエピトープと交差反応しうる抗体、その断片又はその複合体を提供する。これらのうちある種の実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は、B-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型と交差反応しうる。これらのうちある種の他実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体はPSGL-1と交差反応しうる。好ましくは、PSGL-1と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープQATEYEYLDYDFLPETEに結合する。
【００７４】
[72.] これらのうちある種の他実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体はGPIb-αと交差反応しうる。好ましくは、GPIb-αと交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープDEGDTDLYDYYPEEDTEGD、1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープTDLYDYYPEEDTE、1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープGDEGDTDLYDYYP、1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープYDYYPEE、及び/又は1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープTDLYDYYPに結合する。
【００７５】
[73.] これらのうちさらなる他実施態様では、抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体はフィブリノゲンγ’と交差反応しうる。好ましくは、フィブリノゲンγ’と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープEPHAETEYDSLYPEDに結合する。
【００７６】
[74.] これらのうちさらなる他実施態様では、ヘパリンと交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が提供される。
【００７７】
[75.] これらのうちさらなる他実施態様では、補体複合体4 (CC4)と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体が提供される。好ましくは、CC4と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は1以上の硫酸化チロシン残基を含むエピトープMEANEDYEDYEYDELPAKに結合する。
【００７８】
[76.] 本発明はまた、前述のタンパク質の断片、類縁体、変異体及び模倣体に、エピトープが本質的に原型を保つ限りで、結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００７９】
[77.] 本発明は、B-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞及び転移性細胞からなる群より選択される1以上の細胞型と交差反応しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８０】
[78.] 本発明はまた、以下の能力を有する抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する: 細胞ローリング阻害; 炎症阻害; 自己免疫疾患阻害; 血栓症阻害; 再狭窄阻害; 転移阻害; 腫瘍細胞成長及び/又は複製阻害; 腫瘍細胞死増進; 白血病細胞成長及び/又は複製阻害; 白血病細胞死増進; 病変細胞の抗疾病薬への感受性の増進; 腫瘍細胞の抗がん薬への感受性の増進; 白血病細胞の抗白血病薬への感受性の増進; 腫瘍患者における腫瘍細胞数増加の抑制; がん患者における腫瘍細胞数の減少; 白血病患者における白血病細胞数増加の抑制; 白血病患者における白血病細胞数の減少; 細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の複合体形成の阻害; 細胞-細胞、細胞-マトリックス、血小板-マトリックス、血小板-血小板及び/又は細胞-血小板間の接着の阻害; 凝集。
【００８１】
[79.] 着目する疾患及び/又は状態の作用を阻害し、治療し又は緩和し、もしくは着目する疾患及び/又は状態を予防する有効量の、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含有する製剤組成物が提供される。
【００８２】
[80.] 本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体の、着目する疾患及び/又は状態の作用を阻害、治療又は緩和し、もしくは着目する疾患及び/又は状態を予防するための薬の製造への使用を規定する。
【００８３】
[81.] 本発明は、着目する疾患及び/又は状態の作用を阻害、治療又は緩和し、もしくは着目する疾患及び/又は状態を予防する医薬として用いる、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８４】
[82.] 本発明は、着目する疾患及び/又は状態の作用を阻害、治療又は緩和し、もしくは着目する疾患及び/又は状態を予防する方法であって、そうした処置を必要とする患者に、本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を有効量含有する製剤組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００８５】
[83.] 本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体は薬剤と複合又は結合してもよい。
【００８６】
[84.] 本発明は、抗がん薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾病薬、抗接着薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗菌薬、抗ウイルス薬及び抗炎症薬からなる群より選択される薬剤と複合又は結合した抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８７】
[85.] 本発明はまた、1つ又は複数の毒素、放射性同位体及び治療薬と複合又は結合した抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。
【００８８】
[86.] 本発明は、1つ又は複数の薬剤との結合又は複合が可能な基剤又は担体と結合又は複合した抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。そうした基剤又は担体の例はデキストラン、親油性ポリマー、疎水性ポリマー、HPMA及びリポソームなどである。
【００８９】
[87.] 本発明はまた、放射性同位体又は他の造影剤と結合又は複合した抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供する。本発明の抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を含む診断キットもまた提供される。
【００９０】
[88.] 本発明は、アミノ酸276、278及び279のうちの1以上のアミノ酸が硫酸化されたGPIbαアミノ酸配列Tyr276〜Glu282を含む単離エピトープを提供する。好ましい実施態様では、該エピトープはGPIbαアミノ酸283〜285をさらに含む。
【００９１】
[89.] 本発明はまた、アミノ酸276、278及び279のうちの1以上のアミノ酸が硫酸化されたGPIbαアミノ酸配列Tyr276〜Glu282を含むエピトープに結合しうる抗体、その抗原結合性断片、又は1以上の抗体又はその結合性断片を含むその複合体を提供するが、該エピトープがGPIbαアミノ酸283〜285をさらに含むと該結合は強化される。
【００９２】
[90.] 配列YDYYPEEのエピトープを含み該エピトープ中の1以上の硫酸化チロシン残基を含む見掛け分子質量約40kDaの単離GPIbα N末端側ペプチド、及びアミノ酸276、278及び279のうちの1以上のアミノ酸が硫酸化しているアミノ酸1〜282からなる単離GPIbαペプチドもまた提供される。
【００９３】
[91.] 本発明はまた、ヒト・モノクローナル抗体scFv Y1の軽鎖可変領域と相互反応するポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体を提供する。ある種の実施態様では、該ポリクローナル抗体、抗体断片又は抗体複合体はヒト・モノクローナル抗体Y-1の軽鎖可変領域のNdeI-EcoRI制限断片によりコードされたペプチドと交差反応する。そうしたポリクローナル抗体を含む診断キットもまた提供される。
【００９４】
用語の定義
[92.] 抗体(Ab)又は免疫グロブリン(Ig)は抗原に結合するタンパク質分子であり、ジスルフィド結合で連結された4個のポリペプチド鎖(2×重鎖、2×軽鎖)からなる。各ポリペプチド鎖は定常領域と可変領域をもつ。抗体又は免疫グロブリンはその軽鎖成分に応じてIgG、IgM、IgA、IgD及びIgEの5クラスにわけられる。IgGにはIgG₁、IgG₂、IgG₃及びIgG₄などを含むいくつかのサブクラスがある。免疫グロブリンは生体内でBリンパ球により産生され、特定の外来抗原決定基を認識し、また該抗原の排泄を容易にする。
【００９５】
[93.] 抗体は抗体複合体などを含む多様な形態で生産、使用されよう。ここで使用する「抗体複合体」は1つ又は複数の抗体と別の抗体との、又は単数・複数の抗体断片との複合体、もしくは2以上の抗体断片からなる複合体を意味する。抗体断片の例はFv、F(ab’)₂、F(ab’)及びFdフラグメントなどである。
【００９６】
[94.] 本明細書と特許請求の範囲で使用するFvは、ヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域とからなる分子であって、重鎖可変領域が軽鎖可変領域へと連結、結合、融合又は共有結合もしくは会合している分子をいうが、両ヒト抗体は同じでも異なってもよい。Fvは単鎖Fv(scFv)でもジスルフィド安定化Fv(dsFv)でもよい。scFvはフレキシブルなアミノ酸ポリペプチドスペサー又はリンカーで結合された抗体重鎖、軽鎖各々の可変ドメインからなる。リンカーは分枝型でも直鎖型でもよい。リンカーは0〜15アミノ酸残基からなるのが好ましく、(Gly₄Ser)₃であるのが最も好ましい。
【００９７】
[95.] Fv分子自体は第1鎖と第2鎖からなり、各鎖は第1、第2及び第3超可変領域をもつ。重鎖及び軽鎖の可変ドメイン内のこれらの超可変ループは相補性決定領域(CDR)という。重鎖、軽鎖にはそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3領域が存在する。これらの領域は抗原結合部位を形成すると考えられており、特異的に修飾することにより結合活性を高めることができる。これらの領域のうち天然で最も可変的なのは重鎖のCDR3領域である。このCDR3領域はIg分子で最も露出した領域であると考えられており、また本明細書に記載するように、、観測された選択的及び/又は特異的結合特性に主に寄与する部位である。
【００９８】
[96.] Fv分子の断片は、原Fvより小さな任意の分子であって、原Fvの選択的及び/又は特異的結合特性をなお維持している分子と定義される。そうした断片の非限定的な例は、(1) Fv重鎖だけの断片を含むミニボディー(minibody)、(2)抗体重鎖可変領域の小さな部分単位を含むマイクロボディー(microbody)(PCT出願番号PCT/IL99/ 00581)、(3)軽鎖断片を含む類似体、及び(4)軽鎖可変領域の機能的単位を含む類似体である。
【００９９】
[97] ここで使用する「Fabフラグメント」は免疫グロブリンの一価抗原結合性断片である。Fabフラグメントは軽鎖と重鎖の一部とからなる。
【０１００】
[98.] F(ab’)₂フラグメントはペプシン消化によって得られる免疫グロブリンの二価抗原結合性断片である。両軽鎖と両重鎖の一部とからなる。
【０１０１】
[99.] Fcフラグメントは免疫グロブリンの非抗原結合性部分である。重鎖のカルボキシル末端側部分とFc受容体に対応する結合部位とを含む。
【０１０２】
[100.] Fdフラグメントは免疫グロブリン重鎖の可変領域と第1定常領域である。
【０１０３】
[101.] ポリクローナル抗体は免疫応答産物であり、多数の異なるBリンパ球により形成される。モノクローナル抗体は単一細胞に由来する。
【０１０４】
[102.] カセットは、ポリペプチドに適用し本発明で定義する意味では、フレームワークとして機能する所定配列の連続アミノ酸をいい、また単一単位とみなされ、そのようなものとして操作される。その一端又は両端ではアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。同様に、その一端又は両端では一連のアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。
【０１０５】
[103.] ここで使用する用語「エピトープ」は抗原決定基又は抗原結合部位であって、抗体、抗体断片、抗体複合体又はその結合性断片を含む複合体、又はT細胞受容体と相互作用するものをいう。エピトープという用語はここではリガンド、ドメイン及び結合領域という用語と互換的に使用している。
【０１０６】
[104.] 選択性はここでは、ターゲティング分子が細胞型又は細胞時期の混合物すなわち諸々の細胞型又は細胞時期から該ターゲッティング分子に対し特異的である1つの細胞型又は細胞時期を選択しそれと結合する能力をいう。
【０１０７】
[105.] ここで使用する用語「アフィニティー」は受容体(抗体上の一結合部位など)とリガンド(抗原決定基など)の結合力の指標(結合定数)である。抗体上の単一抗原結合部位と単一エピトープの間の非共有相互作用の力の合計が該エピトープへの抗体のアフィニティーである。低アフィニティー抗体は抗原との結合が弱いため解離しやすく、高アフィニティー抗体は抗原との結合がより強いため、より長く結合状態を維持する。用語「アビディティー」は抗原-抗体相互作用の結合価を反映するものであり、アフィニティーとは異なる。
【０１０８】
[106.] 抗体-抗原相互作用の特異性: 抗原-抗体反応は特異的であるとはいえ、ある抗原によって誘発された抗体が別の無関係の抗原と交差反応する場合もある。そうした交差反応が起こるのは、2つの異なる抗原が相同又は類似のエピトープ又はそのアンカー領域を共有する場合、又はあるエピトープに対して特異的な抗体が、類似の化学的性質をもつ無関係のエピトープに結合する場合である。
【０１０９】
[107.] 血小板は巨核球の円板様細胞質断片であり、骨髄腔で産生され、その後末梢血流中を循環する。血小板には血栓の形成で果たす大きな役割などを含めていくつかの生理的機能がある。血小板は中心部に顆粒を、周辺部に透明な原形質を含むが、はっきりした核はない。
【０１１０】
[108.] 凝集反応(agglutination)はここでは懸濁した細菌、細胞、円板又は類似サイズの他粒子が互いに接着し塊を形成する過程を意味する。この過程は沈降に類似するが、粒子は沈降の場合よりも大きいし、溶液状態ではなく懸濁状態にある。
【０１１１】
[109.] 凝集(aggregation)はin vitroで誘発させた血小板の塊状化及び血栓又は止血栓の形成につながる連続機構の一部としてのトロンビンとコラーゲンの塊状化を意味する。
【０１１２】
[110.] 保存的アミノ酸置換はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、もしくはそれらの断片の1個又は2個のアミノ酸を変化させることによるアミノ酸組成の変化である。これは、性質(たとえば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負荷電、極性、非極性など) が一般に類似したアミノ酸同士の置換であり、この置換によってペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の性質(電荷、等電点、アフィニティー、アビディティー、立体構造、可溶性など)又は活性が実質的に大きく変わることはない。こうした保存的アミノ酸置換は一般に以下のアミノ酸グループ間の置換となろう:
(i) グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)及びイソロイシン(I)
(ii) アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)
(iii) アラニン(A)、セリン(S)及びトレオニン(T)
(iv) ヒスチジン(H)、リシン(K)及びアルギニン(R)
(v) アスパラギン(N)及びグルタミン(Q)
(vi) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)及びトリプトファン(W)
【０１１３】
[111.] 保存的アミノ酸置換は、該分子の選択的及び/又は特異的結合特性に主に寄与する超可変領域の両側や、他の部分たとえば重鎖可変領域のカセットなどでも可能である。追加的又は代替的に、分子を再構成することで変異を起こし、フルサイズの抗体、ダイアボディー(二量体)、トライアボディー(三量体)及び/又はテトラボディー(四量体)を、又はミニボディーやマイクロボディーを、形成することもできる。
【０１１４】
[112.] ファスミドはプラスミドDNAをもつファージ粒子である。ファスミドは繊維状ファージ由来の複製起点たとえばm13又はfdを含むよう設計されたプラスミドベクターである。ファスミド粒子はプラスミドDNAをもつため、ファージゲノム全体を収めるにはスペースが足りない。ファージゲノムから欠落させる部分はファージ粒子のパッケージングに不可欠の情報である。従ってファージを増殖させるには、欠落パッケージング情報を補ってくれるヘルパーファージ株と一緒に所望のファージ粒子を培養する必要がある。
【０１１５】
[113.] プロモーターはDNA上の、RNAポリメラーゼが結合し転写を開始する領域である。
【０１１６】
[114.] ファージ提示型ライブラリー(ファージペプチド/抗体ライブラリー、ファージライブラリー、又はペプチド/抗体ライブラリーともいう)は、各ファージ粒子が異なるペプチド又はポリペプチド配列を提示している大個体群のファージ(一般に10⁸〜10⁹個)を含む。これらのペプチド又はポリペプチド断片は可変長に構築してもよい。提示のペプチド又はポリペプチドはヒト抗体重鎖又は軽鎖に由来してもよいが、それだけに限らない。
【０１１７】
[115.] 製剤組成物は本発明のペプチド又はポリペプチドと製薬上許容しうるその担体、賦形剤又は希釈剤とを含む製剤である。
【０１１８】
[116.] 薬剤はヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ又は他の任意の温血動物を非限定的に含む哺乳動物の疾患予防、治療又は診断に有用な物質をいう。薬剤は放射性同位体、毒素、オリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、抗体断片及び抗がん薬を含む群より選択される。そうした薬剤の非限定的な例は抗ウイルス薬たとえばアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジン; 抗血栓/再狭窄薬たとえばシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリン; 抗炎症薬たとえばザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリド; 抗自己免疫薬たとえばレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミド; 及び抗接着/抗凝集薬たとえばリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸などである。
【０１１９】
[117.] 抗白血病薬は抗白血病活性をもつ薬剤である。抗白血病薬はたとえば白血病細胞又は未熟な前白血病細胞の成長を阻害し又は停止させる薬剤、白血病又は前白血病細胞を傷害する薬剤、白血病又は前白血病細胞の他抗白血病薬への感受性を増進する薬剤、及び白血病細胞の転移を阻害する薬剤などである。本発明では、抗白血病薬は腫瘍の血管新生を予防、阻害、抑制し又は停止させる抗血管新生薬でもよい。
【０１２０】
[118.] 遺伝子の発現パターンは、たとえば多様な条件下で、特定の時期に、又は多様な組織中で産生される遺伝子産物の量を分析することによって研究することができる。遺伝子が「過剰発現」とみなされるのは遺伝子産物の量が正常対照又は非異常対照に見られる量を上回る場合である。
【０１２１】
[119.] 特定の細胞はその表面に特定の抗体に対応する結合部位をもつタンパク質を発現するであろうが、その結合部位は第1段階(段階I)とも呼べる状態にある細胞では隠れた形で存在しよう(たとえば立体障害を受ける、又は抗体の結合に必要とされる機構を欠く)。段階Iはたとえば正常、健康な非異常状態であろう。エピトープは、隠れた形で存在するときは、所定の抗体によって認識されない。すなわちこのエピトープには、又は段階Iの所定の細胞には、抗体は結合しない。しかし、エピトープはたとえば自ら変異を受けることにより、又は近くの又は会合した分子が変異を受けることにより、露出することもあろう。変異の例は折りたたみの変化、翻訳後修飾の変化、リン脂質化の変化、硫酸化の変化、グリコシル化の変化などである。そうした変異は細胞が第2段階(段階II)とも呼べる異なる状態に移るときに起こることもあろう。段階IIの例は活性化、増殖、形質転換、又は悪性状態などである。変異を受けたエピトープは露出するので、抗体が結合しよう。
【０１２２】
[120.] ペプチド模倣体(mimetics)は小分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、多糖又はそれらのコンジュゲートであって、別の化学種たとえば抗体と同じ機能的作用又は活性をもつものである。
【０１２３】
発明の詳細な説明
[173.] 本発明では、特異的受容体が未判明又は未解明である場合に、全細胞を使用して白血病細胞表面の決定基を認識する特異的抗体を選択するようにした。さらに、多段階バイオパニング法を利用して1以上の細胞型へのパニングによりファージを選択した。これは、抗原特異的ファージ抗体の選択が固定化単一抗原へのバイオパニングに大きく依存し、ターゲットとしての全細胞を使用する選択の比重が小さかった先行技術の方法と比べると著しい改善である。
【０１２４】
[174.] この多段階法で同定されたある種のエピトープは、好ましくは2個以上の酸性アミノ酸からなるアミノ酸群内の硫酸化部分たとえば硫酸化チロシン残基又は硫酸化糖質又は脂質部分の存在を特徴とし、また炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、細胞接着、血栓症及び/又は再狭窄、細胞ローリング、及び凝集などの多様な過程で重要な役割を果たすリガンドや受容体の表面で検出される。この種のエピトープは病変細胞たとえばB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞、及び転移性細胞などの表面でも検出される。これらのエピトープはこれらの過程の治療的調節のターゲット及び診断方法のターゲットとして有用である。
【０１２５】
[175.] これらのエピトープは可変の一次アミノ酸配列を有するものの、この種の硫酸化エピトープに対して産生される抗体はしばしば複数個の分子上の複数個のこの種エピトープと、必ずしも同時ではないにせよ、結合又は交差反応する。そうした抗体は(抗腫瘍薬、抗転移薬としての)がん治療薬や、白血病、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、異常凝集を伴う疾患、異常接着を伴う疾患、梗塞、心臓血管疾患及び炎症性疾患などの治療薬として有効である。
【０１２６】
[176.] 血小板に結合する抗体の同定を目的に固定化ヒト血小板スクリーニング用のファージ提示型ヒト抗体ライブラリーからヒトscFv Y1抗体を単離した。数クローン(異なるscFv抗体)を単離し解析した。そのうちの1クローン(Y1と命名)は意外にも、AML患者及びある種の他白血病患者に由来する白血病細胞と結合することが判明した。固定化血小板へのパニングにより単離された別のクローン(Y17)もまたヒト血液に結合することが判明した。
【０１２７】
[177.] ヒト血小板から抽出したタンパク質を、SDA-PAGE上でY1 scFv抗体とY17 scFv抗体を使用したウェスタンブロット解析にかけ、両抗体が結合する血小板表面上のエピトープの同定を試みた。この方法により、血小板上のY1 scFv及びY17 scFvエピトープはCD42複合体のサブユニットの1つ、グリコカリシンであることが判明した。
【０１２８】
[178.] ヒト血小板由来グリコカリシンの細胞外断片を活性化血小板から精製した。それを種々のプロテアーゼたとえばフィシン、モカラギン、カテプシンGなどで切断し、グリコカリシン分子上のY1結合エピトープの位置を正確に特定するようにした。Y1抗体を検出手段としてウェスタンブロット解析を行った。さらに、市販の抗グリコカリシン抗体類(グリコカリシンの様々なエピトープに結合することが知られている抗体類)を使用して、グリコカリシン上のY1結合エピトープを決定するためのY1抗体との競合的結合を評価した。
【０１２９】
[179.] その結果から、Y1のグリコカリシンへの結合ではグリコカリシンのアミノ酸272〜285が大きな役割を果たしているとの結論に達した。また、E. coli由来組換えグリコカリシンのN末端側ポリペプチド(アミノ酸1〜340及び1〜480)はY1抗体によっては検出されなかったので、Y1のエピトープへの結合はE. coliでは起こることが知られていないグリコシル化又は硫酸化などの翻訳後修飾に依存するとの結論に達した。
【０１３０】
[180.] この仮説を検証するために、タンパク質からN結合型及びO結合型の糖鎖を遊離させる酵素(グリコシダーゼ)及びタンパク質から硫酸基を遊離させる酵素(スルファターゼ)で精製グリコカリシンを処理した。グリコカリシン又はグリコカリシン断片へのY1抗体の結合はグリコシダーゼの影響を受けなかった。この結果はグリコカリシンへのY1の結合には硫酸基が不可欠であることを示唆する。
【０１３１】
[181.] これらの結果をさらに検証するために、同定したエピトープ(グリコカリシンのアミノ酸272〜285)を基に硫酸化及び非硫酸化合成ペプチドを調製、使用して、その存在下にグリコカリシンへのY1抗体の結合特異性を評価した(ELISA法)。硫酸化ペプチドはグリコカリシンへのY1抗体の結合を関連の非硫酸化ペプチドの場合よりも何倍も強く阻害したが、そのことは結合には硫酸化が必要であることを示唆した。
【０１３２】
[182.] 以上の実験結果から、Y1抗体に対応するエピトープはグリコカリシン上の、負荷電アミノ酸群が存在するアミノ酸272と285の間に位置すると結論した。
【０１３３】
[183.] 平行して、KG-1細胞(AML患者由来のヒト細胞株)、種々のヒト血漿由来タンパク質及び白血病患者の一次血液試料へのY1抗体の結合を調べた。
【０１３４】
[184.] Y1抗体は、2種類のヒト血漿由来タンパク質すなわちフィブリノゲンγ’と同定された分子質量〜50kDのタンパク質と補体複合体4(CC4)及びヒト・ルミカンと同定された分子質量〜80kDのタンパク質に比較的低いアフィニティーで結合すると判明した。これらのタンパク質は硫酸化チロシン残基とそれらに付随する一連の負荷電アミノ酸群を含んでいる。
【０１３５】
[185.] KG-1細胞表面のY1リガンドは、E-、L-及びP-セレクチンの受容体であるPSGL-1と同定された。PSGL-1をKG-1細胞表面のY1抗体リガンドであると同定した根拠は競合的結合測定法 (種々の市販抗PSGL-1抗体の存在下にKG-1細胞へのY1抗体の結合を検定した)及びPSGL-1のN末端側部位に由来する硫酸化及び非硫酸化合成ペプチドを使用した一連の実験の結果である。PSGL-1のN末端側部位は硫酸化チロシン残基とそれらに付随する一連の負荷電アミノ酸群を含んでいる。
【０１３６】
[186.] Y1抗体はいくつかの分子たとえば血小板表面のグリコカリシン、フィブリノゲンγ’、ヒト血漿の補体複合体4、及びGK-1細胞表面のPSGL-1分子などに結合するものの、AML患者か又は多発性骨髄腫患者に由来する一次白血病細胞へのそのアフィニティーは前述のエピトープの場合と比べて何桁も高い。さらに、市販の抗PSGL-1抗体(KPL1)は患者由来血液試料中の病変した一次白血病細胞をすべて認識するわけではない(12中7を認識)がY1抗体はそれらを特異的、選択的に認識するという事実は、原発生白血病細胞の表面にはKG-1細胞表面のエピトープとは異なる追加のY1抗体対応エピトープが存在することを示唆する。
【０１３７】
[187.] 本発明の硫酸化エピトープの例は式(I)、(II)及び(III)で示されるものや、その誘導体、同族体、模倣体、変異体などである。
式(I):
【化１６】

式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化１７】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【０１３８】
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
qは、1〜6であり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0; q=1ならばr=1であり、またq>1ならば1以上のYが硫酸化している; さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【０１３９】
[188.] 好ましいエピトープは式Iで示されエピトープであって、式中Wはグリシンであり、Yはチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aはグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、qは1、2又は3である。ある種の実施態様ではYはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qは3、rは1である。
【０１４０】
式(II):
【化１８】

式中、
Wは、アスパラギン酸とグルタミン酸とを除く任意のアミノ酸であり、
Yは、硫酸化可能な任意の天然部分であり、
Pは、
【化１９】

であり、
Sは、スルフェート又は硫酸化分子であり、
Xは、任意のアミノ酸であり、但し、アスパラギン酸、グルタミン酸又はチロシンを除く、
【０１４１】
Aは、任意の負荷電アミノ酸、もしくはロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンであり、
zは、0、1又は2であり、
rは、0又は1であり、
tは、1、2又は3であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、n=0ならばm>0; m=0ならばn>0である; 1以上のYが硫酸化している; さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【０１４２】
[189.] 好ましいエピトープは式(II)で示されるエピトープであり、式中Wはグリシンであり、Yはチロシンのペプチドコンジュゲートもしくはアスパラギン、セリン又はトレオニンのグリココンジュゲートであり、Aはグルタミン酸、γカルボキシグルタミン酸又はアスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、セリン又はグリシンである。ある種の実施態様では、Yはチロシンのペプチドコンジュゲートであり、qは3、rは1である。
【０１４３】
式(III):
【化２０】

式中、
Gは、グリシンであり、
Eは、グルタミン酸であり、
Dは、アスパラギン酸であり、
Yは、チロシンであり、
Sは、スルフェート又は硫酸分子であり、
Xは、前記以外の任意のアミノ酸であり、
zは、0、1又は2であり、
tは、1、2又は3であり、
rは、0又は1であり、
uは、0〜2であり、
nは、0〜3であり、
mは、0〜3
であるが、ここで、1以上のYが硫酸化している; n=0ならばm>0; m=0ならばn>0である;さらに、単離エピトープにはSEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:20を含む第1超可変領域をもつ抗体、その抗原結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含むその複合体が結合しうる。
【０１４４】
[190.] 好ましいエピトープは式(III) で示され、rが1である。
【０１４５】
[191.] いずれの式でも、硫酸化部分はペプチドコンジュゲート又はグリココンジュゲート又はリポコンジュゲートでよい。Yは脂質及び/又は糖質分子を含んでもよい。エピトープは硫酸化に加えて1以上の翻訳後修飾を受けてもよい。
【０１４６】
[192.] こうしたエピトープはGPIbやPSGL-1などのような多様な分子上で検出されるし、またある種の病変細胞たとえばB-CLL細胞、AML細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞の表面でも検出される。これらのエピトープへの結合ではチロシン及び/又は他分子の硫酸化が特に重要である。チロシン硫酸化を受けることが知られているヒトタンパク質の例は次のとおりである:
【０１４７】
ペプチド配列
トロンボモジュリン(408-426) ECPEGYILDDGFICTDIDE
ヒトGPIbα (269-287) DEGDTDLYDYYPEEDTEGD
ヒトヘパリン補因子II(56-75) GEEDDDYLDLEEDDDYIDIVD
ヒトフィブリノゲンγ’(408-427) VRPEHPAETEYDSLYPEDOL
α-2-アンチプラスミン PPMEEDYPQFGSP
コレシストキニン(CCK) RISDRDYMGWMDF
α-2-コリオゴナドトロピン CHCSTCYYHKS-COOH
補体C4 MEANEDYEDYEYDELPAK
PSGL-1 QATEYEYLDYDFLPET
血液凝固第VIII因子(716-731) GDYYEDSYEDISAYLL
ルミカン GYYDYDFPL
【０１４８】
Y1 −産生と選択
[193.] 式(Ｉ)〜(III) のエピトープに結合する本発明の抗体の一例は完全ヒト・モノクローナル抗体Y1である。Y1の選択、産生及び初期解析は米国特許出願第09/751,181号及び60/258,948号に詳しく記載されている。簡単に言えば、scFv抗体断片を提示するファージ提示型ライブラリーを利用してターゲッティング分子を獲得、生産し、フローサイトメトリー特に蛍光活性化セルソーティング(FACS)によりターゲット細胞を認識するペプチド又はポリペプチドを提示する特異的ファージクローンを同定、単離した。ここで使用したファージ提示型ライブラリーは非免疫ドナーのヒト末梢血リンパ球から構築した。
【０１４９】
[194.] ファージクローンは多段階バイオパニング法により選択し同定した。バイオパニングは、タンパク質リガンド変異体を提示するファージ(ファージ提示型ライブラリー)をターゲットと共にインキュベートし、洗浄により未結合ファージを除去し、結合ファージを特異的に溶出するという方法で行った。溶出したファージは随意に増幅した後、追加の結合及び随意増幅サイクルにかけて特異的配列の集まりを濃縮し、ターゲットへの最良結合を示す抗体断片を含むファージクローンの濃度を高めるようにした。数ラウンド後、個別ファージクローンの特性解析を行い、クローンによって提示されたペプチドの配列をファージビリオンの対応DNAの配列解析によって決定した。
【０１５０】
[195.] 本発明では、当初のバイオパニングステップ用に不確定エピトープを対象とする血小板のスクリーニングを行い、それに続くクローン選択は細胞表面マーカー未判明の所望のターゲット細胞(たとえばB-CLL細胞やAML細胞、多発性骨髄腫細胞、転移性細胞など)を用いて行った。
【０１５１】
[196.] 悪性及び病変(白血病又は骨髄腫などの)血液細胞は、通常は部分的に分化した造血前駆細胞で検出されるような細胞表面タンパク質を発現する未熟細胞として位置付けられる。従って、血小板は病変又は悪性血液細胞で発現される未熟細胞表面マーカーを同定するための格好の材料である。
【０１５２】
[197.] 血小板及び骨髄性白血病細胞特にAML細胞に結合するscFvクローン、Y1を選択した。Y1 scFvはSEQ ID NO: 25の配列をもつ。Y1の結合特性は主にその重鎖CDR3に由来するが、それはSEQ ID NO: 8の配列をもつ。完全Y1-IgG抗体も産生させた。
【０１５３】
[198.] 血小板及びヒト骨髄性白血病細胞特にAML細胞に由来する細胞株に結合する第2のscFvクローン、Y17もまた選択した。Y17 scFvはSEQ ID NO: 203の配列をもつ。Y17の結合特性は主にその重鎖CDR3に由来するが、それはSEQ ID NO: 20の配列をもつ。
【０１５４】
抗体の産生
[199.] 本発明のCDRをカセットに挿入して抗体を産生するようにしてもよい。カセットは、ポリペプチドに適用し本発明で定義する意味では、フレームワークとして機能する所定配列の連続アミノ酸をいい、また単一単位とみなされ、そのようなものとして操作される。その一端又は両端ではアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。同様に、その一端又は両端では一連のアミノ酸の置換、挿入、除去又は付加が可能である。
【０１５５】
[200.] カセットのアミノ酸配列は表向き固定して、置換、挿入又は付加配列をきわめて可変的にしてもよい。カセットは、それぞれが最終構成体に不可欠の機能を担ういくつかのドメインからなってもよい。
【０１５６】
[201.] 本発明の抗体の超可変領域は本発明の抗体の抗原結合部位を形成する。抗原結合部位は抗体の結合相手となるエピトープの構造と相補的であるため、相補性決定領域(CDR)ともいう。抗体の重鎖と軽鎖には各々3つのCDRがあり、各CDRはV_HドメインとV_Lドメインのβストランドを結合するループ上に位置する。
【０１５７】
[202.] 本発明の一実施態様のカセットはN末端から順にフレームワーク領域1 (FR1)、CDR1、フレームワーク領域2 (FR2)、CDR2及びフレームワーク領域3 (FR3)を含む。
【０１５８】
[203.] 本発明の一実施態様では、カセット内の識別可能な領域を置き換えることができる。たとえばカセットのCDR2及びCDR1超過変領域は非保存的又は好ましくは保存的アミノ酸置換によって置き換え又は変更してもよい。もっと具体的には、SEQ ID NO: 30〜113又はその断片からなる群より選択される連続アミノ酸配列のカセットのCDR2及びCDR1領域はそれぞれSEQ ID NO: 115及び114で置き換えることができる。さらに具体的には、SEQ ID NO: 30〜32、35、37〜39、41、43、45、46、48、51、54、57、59〜68、70、71、76〜85、87、98〜92、94、97、99、103、106、112及び113又はその断片からなる群より選択される連続アミノ酸配列のカセットのCDR2及びCDR1領域はそれぞれSEQ ID NO: 115及び114で置き換えることができる。
【０１５９】
[204.] 本発明の好ましい実施態様では、ペプチド又はポリペプチドは重鎖と軽鎖を含み、各鎖はそれぞれCDR1、CDR2及びCDR2にほかならない第1、第2及び第3超可変領域をもつ。その結合選択性及び特異性は特にCDR3領域により、おそらくは軽鎖のCDR3により、好ましくは重鎖のCDR3領域により、また二次的には軽鎖の、また好ましくは重鎖のCDR2及びCDR2領域により、決まる。この結合選択性及び特異性は二次的には第1、第2及び/又は第3超可変領域に隣接する上流又は下流領域による影響を受ける場合もある。
【０１６０】
[205.] 好ましい実施態様ではペプチド又はポリペプチドのCDR3領域はSEQ ID NO: 8〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつ。
【０１６１】
[206.] より好ましい実施態様では、重鎖のCDR3領域はSEQ ID NO: 8〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列をもち、CDR2はSEQ ID NO: 115と同一のアミノ酸配列をもち、またCDR1はSEQ ID NO: 114と同一のアミノ酸配列をもつ。
【０１６２】
[207.] 最も好ましい実施態様ではCDR3領域はSEQ ID NO:8と同一のアミノ酸配列をもつ。
【０１６３】
[208.] 本発明の好ましい実施態様は、SEQ ID NO:8と同一のCDR3配列をもつscFv及びSEQ ID NO:25と同一の完全scFv配列である。
【０１６４】
[209.] 本発明の最も好ましい実施態様では、CDR3、CDR2及びCDR1領域はそれぞれSEQ ID NO: 8、115及び114のアミノ酸配列をもつ。
【０１６５】
[210.] 本発明の一実施態様ではFvペプチドは、それ自体SEQ ID NO: 30〜113からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつカセットを含む重鎖可変領域のCDR1及びCDR2領域; SEQ ID NO:8〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列をもつ、好ましくは重鎖可変領域のCDR3領域; SEQ ID NO:117のアミノ酸配列をもつCDR3領域の隣接下流領域; SEQ ID NO:116のアミノ酸配列をもつCDR3領域の隣接上流領域; SEQ ID NO:123又は124の0〜20アミノ酸残基のスペーサー; 及びSEQ ID NO:7の配列をもつ軽鎖可変領域を含む。
【０１６６】
[211.] 同様に、別の実施態様では、CDR2に隣接する上流領域はSEQ ID NO: 119のアミノ酸配列をもち、CDR2に隣接する下流領域はSEQ ID NO: 118のアミノ酸配列をもち、CDR1に隣接する上流領域はSEQ ID NO: 121のアミノ酸配列をもち、またCDR1に隣接する下流領域はSEQ ID NO: 120のアミノ酸配列をもつ。
【０１６７】
[212.] 本発明の好ましい実施態様は、ペプチド又はポリペプチドであって、第2及び第3超可変領域がそれぞれCDR2及びCDR1であり、CDR3のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 8、CDR2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:115、CDR1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:114、CDR3に隣接する上流領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:117、CDR3に隣接する下流領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:116、CDR2に隣接する上流領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:119、CDR2に隣接する下流領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:118、CDR1に隣接する上流領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:121、CDR1に隣接する下流領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO:120であるペプチド又はポリペプチドを提供する。
【０１６８】
[213.] 本発明の別の好ましい実施態様は、随意に1つ又は複数のタグをもつFv分子であって、第1、第2及び第3超過変領域を有する第1鎖と第1、第2及び第3超過変領域を有する第2鎖とを含み、第1鎖の超可変領域の1つがSEQ ID NO: 8〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列をもち、第2鎖の超可変領域の1つがSEQ ID NO: 1〜6及び125〜202からなる群より選択されるアミノ酸配列をもち、また第1、第2及び第3超過変領域がそれぞれCDR3、CDR2及びCDR1であり、さらにFvがscFv又はscFvであるFv分子を提供する。
【０１６９】
[214.] 本発明の別の実施態様は、ペプチド又はポリペプチドであって、(i)第1及び第2鎖が各々SEQ ID NO:8〜24からなる群より選択される第1超可変領域をもつか、又は(ii) 第1及び第2鎖の第1超可変領域が同一であり、SEQ ID NO:8〜24からなる群より選択されるか、又は(iii)第1鎖の第1超可変領域がSEQ ID NO:8〜24からなる群より選択され、第2鎖の第1超可変領域がSEQ ID NO:1〜6及び125〜202からなる群より選択されるか、又は(iv) 第1鎖の第1超可変領域がSEQ ID NO:1〜6及び125〜202からなる群より選択され、第2鎖の第1超可変領域がSEQ ID NO:8〜24からなる群より選択されるペプチド又はポリペプチドを提供する。
本発明のさらなる実施態様は、第1鎖の第2及び第3超可変領域がそれぞれSEQ ID NO:114及び115であるペプチド又はポリペプチドを提供する。
【０１７０】
[215.] 本発明のさらなる実施態様として、ここで開示し詳述する25アミノ酸残基以下のすべてのアミノ酸配列(CDR領域、CDR隣接領域など)は、その範囲内に1つ又は2つのアミノ酸置換を含むものとし、また該置換は好ましくは保存的アミノ酸置換であるものとする。本発明のさらなる実施態様として、ここで開示し詳述する25アミノ酸残基超のすべてのアミノ酸配列は、その範囲内に原配列に対して90%以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むものとする[Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402 (1997)]。類似又は相同アミノ酸は、類似の性質たとえば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負荷電、極性、非極性などの性質を示す非同一アミノ酸をいう。
【０１７１】
[216.] 百分率アミノ酸類似性又は相同性もしくは配列類似性は2つの異なるペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列を比較して決定する。2つの配列のアラインメントを、通常は専用のコンピュータプログラムを用いて行い、各位置のアミノ酸残基を比較する。次にアミノ酸の同一性又は相同性を決定する。次いでアルゴリズムを用いて百分率アミノ酸類似性を決定する。一般にアミノ酸配列を比較するほうが、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の間の微妙な関係の検出感度が大幅に増すので好ましい。タンパク質の比較では、非同一アミノ酸が類似の物理的及び/又は化学的性質をもっているとミスマッチでもなおプラスの得点を生み出しかねないような保存的アミノ酸置換の存在を計算に入れることができる[Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402 (1997)]。
【０１７２】
[217.] 本発明の一実施態様では、軽鎖、重鎖各々の3つの超可変領域は2鎖間でも、また鎖内及び/又は鎖間の3超可変領域間でも、互換可能である。
【０１７３】
V _L (Y1 由来 ) へのポリクローナル抗体
[218.] ヒト抗体のV_Lドメイン(軽鎖可変領域)をコードするDNA断片を、Y1クローンからPCRクローニングした[同一DNA断片はNissimＩライブラリー(Nissim et al., 「免疫化学試薬としての ‘シングルポット’ ファージ提示型ライブラリーに由来する抗体断片」“Antibody fragments from a ‘single pot’ phage display library as immunochemical reagents,” EMBO J. 13(3): 692-698, 1994)中の他の任意のクローンから、又は同じ方法によりヒトゲノムからでさえも、得ることができる]。このPCRには次の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた: オリゴ5’-NdeI (TTT CAT ATG GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT)及びオリゴ3’-EcoRI (TTT GAA TTC CTA TTT TGC TTT TGC GGC)。PCRによる増幅(PCR条件: 94℃1’, 56℃2’, 72℃2’を30回、次いで65℃5’)、得られたDNA断片をNdeI及びEcoRI制限酵素で消化し同じ酵素で消化済みのプラスミドにクローニングした。該プラスミドは組換えタンパク質のE. coli中での原核発現に使用されるIPTG誘導性発現ベクターである。E. coli細胞はライゲーション混合液で形質転換し、陽性クローンを前記オリゴヌクレオチドプライマー使用のPCR増幅で選択した。このプラスミドを収めた細胞を増殖させ、IPTGで発現を誘導した。IPTGによる発現誘導後の培養液1リットルから遠心で集菌し、封入体を単離し、グアニジン-HCl+DTTに溶かし、トリス-アルギニン-EDTAを含む緩衝液で希釈して再生した。5〜10℃で48時間再生した後、タンパク質を含む溶液を20mMグリシンpH 9に透析、濃縮した。タンパク質を含む透析液を、イオン交換カラムHiTrapQを用いて再精製しNaClのグラジエントで溶出した。主ピークをSDA-PAGEで、またゲルろ過で解析した。当初の1リットル培養液から少なくとも10mgの精製V_Lが得られた。
【０１７４】
[219.] ウサギの免疫処理を、まずCFA(フロイント完全アジュバント)の存在下にV_L(400mg)で、次いで2〜4週間の間隔でIFA(フロイント不完全アジュバント)の存在下にV_L(200mg)で、それぞれ行った。得られた力価は低かった(1:50〜1:100)。おそらくヒト及びウサギ由来V_L間の高相同性のためであろう。
scFv抗体へのポリクローナル抗体
【０１７５】
[220.] NissimＩファージ提示型抗体ライブラリー(Nissim et al. 前掲)に由来する2つの個別scFv抗体クローン(Y1とN14)を別々に培養した。IPTGによる発現誘導後、菌株を22℃で16時間増殖させた。細菌細胞の周辺質からscFv抗体断片を回収し、Protein A-Sepharoseカラムで精製した。細菌クローン培養、発現誘導プロトコール、scFv抗体断片の回収及び精製の手順はすべてHarrison J.L., Williams S.C., Winter G., and Nissim A. Methods Enzymol. 267:83-109 (1996)に従って実行した。基本的に、任意の2以上の個別scFvクローンをNissimＩファージ提示型抗体ライブラリーから選択して、Nissimライブラリー中に存在する任意の個別scFv抗体を認識する、もしくは同じV_L又はその断片を含む限りで任意のIgG又はその断片を認識する、ウサギ由来ポリクローナル抗体を調製することができる。
【０１７６】
[221.] ウサギの免疫処理を、まずCFAの存在下に精製scFv抗体断片の1:1混合物400mgで、次いで2〜4週間の間隔でIFAの存在下に同じ混合物200mgで、それぞれ行った。
【０１７７】
[222.] 細胞へのscFv抗体結合のフローサイトメトリー(FACS)による検出又はSDS-PAGE上での各種タンパク質画分へのscFv抗体結合のウェスタンブロット法による検出では、ポリクローナル抗scFv抗体を免疫ウサギの血清から直接、又はProtein A-Sepharoseカラムで精製後に、用いた。
【０１７８】
血小板上の Y1 結合部位の解析
[223.] 循環血小板は巨核球の周縁から放出される細胞質粒子である。血小板は止血で重要な役割を果たす。血管が損傷すると損傷組織表面に血小板が接着し、また互いに付着し合う(粘着)。この一連の事象は急速に起こり、血管損傷部に無構造の塊(一般に血小板栓又は血栓という)を形成する。この粘着現象は凝集ともいうが、種々の物質又はアゴニストたとえばコラーゲン、アデノシン二リン酸(ADP)、エピネフリン、セロトニン及びリストセチンなどによってin vitroで起こすことができる。凝集は血小板機能を調べる様々なin vitro試験の1つである。
【０１７９】
[224.] 先行技術中のいくつかの証拠によれば、GPIbαのAsp269とAsp287の間の負荷電アミノ酸群は血小板へのウォンビルラント因子(vWF)の結合にとって重要であり、該結合自体は損傷血管への血小板の接着、動脈狭窄部位における高ずり応力によって誘発される血小板凝集、及び低濃度のトロンビンによって誘発される血小板活性化を媒介する。Ward, C.M. et al., Biochemistry 35(15): 4929-39 (1996). vWFとGPIbの相互作用は、マトリックスに結合したとき又はずり応力を受けたときのvWF構造の活性化事象又はコンホメーション変化に依存する。この過程はvWFに結合する特異的モジュレーターたとえばリストセチン及びボトロセチンによりin vitroでほぼ再現される。
【０１８０】
血小板抽出物への Y1 の反応性
[225.] 血小板表面膜上のY1対応エピトープの同定には免疫ブロット法及びエンドプロテアーゼ切断法を使用した。GPIbα分子上のエンドプロテアーゼ切断部位は図1に示す。
【０１８１】
ウェスタンブロット解析
[226.] Y1 scFvをファージ抗体ライブラリーからヒト血小板へのパニングにより選択し、それが固定及び洗浄ヒト血小板に結合することを見い出した。Y1の解析はELISA法とFACS法で実施した。
【０１８２】
[227.] Y1と結合する血小板上のエピトープを解析するために、血小板表面タンパク質を(還元、非還元の両条件下で)SDS-PAGEにより分離し、ビオチン標識Y1を使用して免疫ブロット法にかけた。この実験の結果は、Y1が還元条件下で分子質量135kDaのタンパク質と反応し、また非還元条件下で分子質量〜160kDaのタンパク質と反応することを示している。これらの分子質量は還元条件下で135kDaの分子質量をもつ血小板GPIbαに対応する。非還元条件下では、GPIbβ鎖とジスルフィド結合したGPIbα鎖の分子質量は160kDa(図2)である。
【０１８３】
[228.] GPIbα鎖はGPIbβ鎖とジスルフィド結合して血小板膜タンパク質GPIbを形成している。モノクローナル抗体のMCA466S (Serotec)とS.C.7071 (Santa Cruz)はそれぞれGPIbαのC末端側断片とN末端に結合することが知られているが、還元及び非還元条件下でY1の反応相手となる同じ断片に結合することを見い出した(S.C.は非還元条件下だけで使用した)。これらの結果は、Y1がGPIbα血小板表面タンパク質に結合することをさらに確認するものである。
【０１８４】
[229.] 半精製GPIb断片(グリコカリシン)をウェスタン法でさらに解析し、Y1がGPIb複合体のαサブユニットに確かに結合することを確認した。
【０１８５】
[230.] E. coliで発現させた組換えGPIbはY1とは反応しないことがウェスタン解析で証明された。従ってY1の結合にはE. coliでは起こらない翻訳後修飾が必要となる模様である。N-又はO-グリカナーゼのいずれもKG-1へのY1結合には影響しない。しかし、Y1の結合はアリールスルファターゼによるリガンドの処理により又はプロテアーゼにより不活性化( 除去 )することができる(図3)。
【０１８６】
グリコカリシン (GC) GPIb α断片上の Y1 エピトープ部位の定位
[231.] Y1結合部位をさらに定位するために、切断部位が判明している特異的プロテアーゼでGPIbを消化し、その断片についてY1結合試験を行った。
【０１８７】
血小板 GPIb αへの Y1 結合への O- シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼの効果
[232.] Pasteurella haemolytica (Cedarlan CLE 100)由来の酵素O-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼはヒト血小板GPIbαを選択的に切断し、しかもシアリル化したO-結合型グリカンを含むタンパク質だけを特異的に切断する。O-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼはN結合型糖タンパク質又は非グリコシル化タンパク質を切断しない。この酵素は、高O-グリコシル化GPIbを切断するがGPIIb-III a又は他の血小板上受容体は切断しないことが報告されている。GPIbαをO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼで切断したのは、GPIbα分子へのY1結合をさらに立証するためである。
【０１８８】
[233.] 免疫ブロット(図4及び5)及びFACS解析(図6)から、洗浄血小板をO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼとインキュベートするとGPIbαへのモノクローナル抗体MCA466S (Serotec)だけでなくY1もまた結合しなくなることが証明された。該エンドプロテアーゼはGPIIb/III aへの(抗CD61)モノクローナル抗体の結合には影響を及ぼさない(図4)。これらの結果は、血小板膜上のY1受容体がGPIbαであることを示す追加の証拠となる。
【０１８９】
GPIb のモカラギン切断− Y1 エピトープのマッピング
[234.] モカラギン(Sigma L4515a)はコブラ毒メタロプロテアーゼであり、血小板GPIbαを残基glu-282とasp-283の間の単一部位で特異的に切断して2つの安定産物すなわち上清中に放出される〜45kDa N末端側断片(His1-Glu282)と膜結合〜95kDa C末端側断片を生成する。
【０１９０】
[235.] 洗浄血小板をモカラギンで処理して、血小板溶解物をSDS-PAGEで電気泳動し、ニトロセルロースに転写した。モカラギン処理洗浄血小板の溶解物をY1によりウェスタンブロット解析するとGPIbαに対応するバンド(135kDa)の消失とN末端側〜45kDa断片へのY1の結合が見られた。GPIbαのC末端側断片に対して産生させモノクローナル抗体(MCA466S)は〜95kDa C末端側断片と反応し、またGPIbαのN末端側断片に対して産生させたモノクローナル抗体(S.C.7071)はY1が認識したのと同じ〜45kDa断片と反応した(図7)。
【０１９１】
[236.] グリコカリシン(GPIbαの可溶性細胞外断片)のモカラギン処理は洗浄血小板で観察されたものと類似する結果をもたらした。これはGPIbαの〜45kDa N末端側断片へのY1及びモノクローナル抗体S.C.7071の結合を示す(図8)。以上の結果はY1のエピトープが配列His1-Glu282内に含まれることを示唆する。
【０１９２】
Y17 クローンの解析− GPIb への結合
[237.] 本発明の第2のscFvヒト抗体断片Y17をY1の場合と同じ要領で選択し、Y1の場合と同じ方法を用いて解析した(実施例17参照)。簡単に言えば、ファージ抗体ライブラリーからY17を、ヒト血小板へのパニングにより選択した。Y17の特性解析にはELISA法とFACS解析を用いた。Y17は固定、洗浄両ヒト血小板に結合することが判明した。Y17と結合する血小板上の受容体をさらに解析するために、血小板タンパク質をSDS-PAGEで分離し、還元及び非還元条件下でビオチン標識Y17を使用して免疫ブロット法にかけた。その結果から、Y17が還元条件下で見掛け分子質量135kDaのタンパク質と反応し、また非還元条件下で見掛け分子質量〜160kDaのタンパク質と反応することが証明された。これらの結果は血小板GPIbαに対応する。すなわち、GPIbαは還元条件下で135kDaの分子質量をもち、非還元条件下でGPIbβにジスルフィド結合し160kDa分子質量をもつ。GPIbαのC末端側断片へのモノクローナル抗体MCA466S (Serotec)とGPIbαのN末端側断片を認識するモノクローナル抗体S.C.7071 (Santa Cruz)は還元及び非還元条件下でY17と同じバンドに反応する(図2)。
【０１９３】
[238.] ウェスタンブロット解析によればY1とY17は同じように血小板溶解物に結合する(図9)。
【０１９４】
[239.] Y1とY17はまた、O-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ又はフィシンによる切断後のグリコカリシンにも同じように結合する(図5及び10)。
【０１９５】
[240.] FACS解析によれば、Y1は血小板とKG-1に対して類似の結合プロフィールを示す。さらに、どちらもRaji及びT2細胞には結合しない。対照的に、TM1 (SEQ ID NO:209)、Y16 (SEQ ID NO:210)及びY45は前述のいずれのヒト細胞株にも結合しない。
【０１９６】
[241.] これらの結果から、本発明の2つのモノクローナル抗体であるY1とY17は種々の細胞でエピトープを共有すること、及びそれら以外の試験モノクローナル抗体はいずれもこのエピトープを認識しないことが明らかである。
【０１９７】
GPIb のカテプシン G による切断− Y1 エピトープのマッピング
[242.] 好中球セリンプロテアーゼのカテプシンG (Sigma C4428)はグリコカリシンを、残基Leu-275とTyr-276の間の第1切断部位と残基Val-296とLys-297の間の第2切断部位で切断する。グリコカリシンをカテプシンGで処理すると、2つのN末端側断片すなわち42kDaの小さなN末端側断片(His1-Leu275)と45kDaの大きなN末端側断片(His1-Val-296)、及び対応する〜95kDa C末端側断片が生成する(図1)。
【０１９８】
[243.] グリコカリシンとカテプシンGによる消化で生成されるグリコカリシン断片とをSDS-PAGE電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写してウェスタンブロット法で解析した。免疫ブロットでは、Y1は大きいN末端側断片(His1-Val-275)に結合したが、小さいN末端側断片(His1-Leu275)にもC末端側断片にも結合しなかった。同様に、GPIbα上の残基Tyr276とGlu282の間のエピトープを認識するはずの市販モノクローナル抗体SZ2 (Immunotech 0719)もまた大きいN末端側断片としか反応しない(図11及び12)。
【０１９９】
[244.] さらに、His1とLeu275の間のエピトープを認識することが知られているモノクローナル抗体S.C.7071は両N末端側断片に結合した。Y1はS.C.7071が結合したHis1-Leu275断片には結合しない。これらの結果は、Y1のエピトープが第1及び第2カテプシンG切断部位の間に、すなわち配列Tyr276-Val296内に、又はより確からしくはアミノ酸〜276-282の間に、位置することを示唆する。
【０２００】
精製グリコカリシン及び洗浄血小板 (WP) への Y1 結合への合成部分 GPIb αペプチドの効果
[245.] 精製グリコカリシンへのY1結合へのGPIb由来合成ペプチドの効果を評価するためにELISA法を実施した。加えて、洗浄血小板を使用するFACS解析も実施した。競合的結合FACS解析はGPIbのY1結合部位内の硫酸化チロシンの重要性を評価することを目的に実施した。すなわち、濃度1μgのY1-scFvを濃度2.5及び200 μMの種々のペプチドとプレインキュベートした。室温で30分間のプレインキュベーション後、洗浄血小板〜10⁷個の入ったチューブに混合液を加え、ポリクローナル・ウサギ抗scFv-PEを用いて洗浄血小板へのY1結合を評価した。対照結合(Y1単独)と比較したペプチドの阻害効果を、洗浄血小板へのY1の残余結合を測定することにより評価した。使用ペプチドと結果は、それぞれ、表1と表 3に記すとおりであり、同じペプチドを使用したELISA法での観測結果(表2)と類似している。いずれの評価方法でも対照Y1結合レベルは次の要領で決定した。ポリスチレン製マイクロタイターMaxiSorp( 商標 )プレートを(a)精製グリコカリシン又は(b)洗浄血小板でコートし、十分に洗浄後、0.5μg/ウェルのY1を添加した。次にプレートをウサギ抗scFvとインキュベートし、次いで抗ウサギ-HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)及びHRP基質を添加した。抗ウサギ-HRPの結合レベルを発色強度によって測定した。抗ウサギ-HRPの結合レベルは抗Y1-scFvの結合レベル及びY1の結合レベルと相関する。405nmでの吸光度A₄₀₅を測定した。各試料は2回検定し、その平均値を求めた。
【０２０１】
[246.] 精製グリコカリシンへのY1結合への合成GPIbαペプチドの効果を次の要領で評価した。種々の濃度のペプチドを定量のY1と混和した。室温で30分間プレインキュベートした後に混合液を、ペプチド不存在下でのY1結合の評価に関する前述の要領で、精製グリコカリシンをコートしたポリスチレン製マイクロタイターMaxiSorpプレートに添加した。ペプチドの阻害効果は、ペプチド不存在下でのY1結合の評価に関する前述の要領で、ウサギ抗Y1scFv及び抗ウサギ-HRP抗体を用いてY1の残余結合を測定して評価した。この研究では配列268〜285の多様なサブセットに対応する4つのペプチドと対照ペプチドを使用した。各ペプチドを種々の濃度すなわち200μM、25μM、2.5μM及び0.5μMで試験した。
【０２０２】
[247.] 前記5ペプチドは表1のとおりである:
【０２０３】
【表１】

【０２０４】
[248.] これらのアッセイから得られた結果は次の表2及び3のとおりである。
【０２０５】
【表２】

【０２０６】
[249.] これらの結果から明らかなように、硫酸化チロシンをもつペプチドの阻害効果は非硫酸化ペプチドのそれを大幅に上回る。この効果は用量依存的であり、より長いN’(上流)隣接配列をもつペプチドは延長C’(下流)隣接配列をもつペプチドよりも阻害効果が大きい。これらの結果は、GPIbαへのY1結合には硫酸化チロシンが必要であり、また硫酸化領域の上流及び下流がGPIbαへのY1結合を強化するという結論を明らかに支持する。
【０２０７】
【表３】

【０２０８】
[250.] これらの結果は、GPIb上でのY1認識には特定領域内の硫酸化チロシンが重要であることをさらに裏付ける。概して、モカラギン及びカテプシンGによるN末端側ペプチドのタンパク質分解断片の解析結果は、GPIbαアミノ酸配列Tyr276-Glu282がY1結合のための重要なエピトープそのものであるか又はそうしたエピトープを含むことを示唆する(FIG 3)。さらなる解析からY1認識部位にはグリコカリシンの残基276-282 (硫酸化陰イオン配列)に加えて上流アミノ酸283-285も関与するらしいと判明した。
【０２０９】
血小板機能への Y1 scFv 、 Y17 scFv 及び IgG Y1 の生物活性
[251.] 定位実験では、Y1結合部位は血小板凝集にとって重要であるαトロンビン及びvWF結合部位に存在することが示唆された。そこで、洗浄血小板及び多血小板血漿(PRP)へのY1 scFv、Y17 scFv及びIgG Y1の結合を調べ、該結合の血小板凝集への効果を評価することにした。
【０２１０】
洗浄血小板 (W.P.) 凝集反応への Y1 scFv 及び Y17 scFv の効果
[252.] 凝集はPRP中で凝集誘発物質の存在下に測定し、凝集反応は洗浄血小板中で測定した。洗浄血小板の凝集反応へのY1(scFv)の効果を種々のY1濃度で試験した。血小板はY1 scFV、Y17 scFv、Y16 scFv又は対照TM-1 scFvとプレインキュベート(37℃、4分間)後に血小板凝集反応及び凝集の誘発物質であるリストセチンに接触させた。
【０２１１】
[253.] この研究の結果は表4及び図15のとおりである。血小板のY1 scFv(濃度25μg/ml)とのプレインキュベーションはリストセチン誘発性の洗浄血小板凝集反応を阻害した。Y1濃度12.5μg/mlでは血小板凝集反応の部分的阻害が観測されたにすぎない。Y1濃度4μg/mlでは血小板凝集反応がまったく観測されなかった。これらの結果は洗浄血小板凝集反応へのY1の阻害活性が用量に依存することを示唆する。血小板の陰性対照scFv TM1とのインキュベーションはリストセチン誘発性の血小板凝集反応への効果がまったくなかった。Y1の場合と同じファージ提示ライブラリーから同じ多段階パニング法で選択した別のscFvクローンであるY17もY16も洗浄血小板凝集反応をほとんど阻害しなかった。
【０２１２】
【表４】

【０２１３】
多血小板血漿 (PRP) 凝集への Y1 scFv 及び Y17 scFv の効果
[254.] 多血小板血漿(PRP)凝集へのY1 (scFv)効果を種々のY1濃度で試験した。PRPをY1 scFV、Y17 scFv又は対照TM-1 scFvとプレインキュベート(37℃、4分間)後に血小板凝集反応及び凝集の誘発物質であるリストセチンに接触させた。PRPにscFvを添加してからリストセチンを添加すると、用量依存的な可逆的阻害効果が観測された。
【０２１４】
[255.] この研究の結果は表5及び図16のとおりである。終濃度50μg/mlのY1は最初の4分間でPRP中での血小板のリストセチン凝集を〜80%阻害した。Y1濃度25μg/mlでは血小板凝集の阻害があまり見られなかった。Y17は血小板凝集を阻害しなかった。濃度50μg/mlの陰性対照TM-1 scFvと血小板をインキュベートしてもリストセチン凝集には効果がなかった(表5)。
【０２１５】
[256.] 洗浄血小板とPRPの比較からは次のことが窺えた: (1)scFv Y1はリストセチン誘発性の血小板凝集及び凝集反応への阻害効果をもつ; (2)その効果は用量依存的である; (3)阻害効果はPRP中よりも洗浄血小板中のほうが高かった; (4)PRP中では可逆的阻害効果が観測された; (5)TM1、Y16いずれのscFv抗体断片も効果がなかった; 及び(6)このアッセイではY17は陰性対照である。
【０２１６】
【表５】

【０２１７】
洗浄血小板 (W.P.) 凝集反応への Y1-IgG の効果
[257.] 全Y1-IgGはその天然構造のためにGPIbαに関して2つの結合部位とFc受容体に対応する1つの結合部位をもつ。全Y1-IgGは、もしも2つのGPIbα分子に結合するとすれば、血小板を活性化し血小板凝集反応を誘発する可能性が高い。さらに、血小板はFc受容体をもつため、Y1-IgGはGPIbαに結合しFc受容体にも結合することにより血小板凝集反応を誘発し、もって各Y1-IgGが血小板3個に結合することにより血小板凝集反応を引き起こすことができる。そこで、洗浄血小板凝集へのY1-IgGの効果を種々のY1-IgG濃度でリストセチンの存在及び不存在下に試験した。Y1-IgGによる血小板凝集の誘発を37℃で4分間試験し、次にリストセチンを添加した。
【０２１８】
[258.] その結果は表6及び図17のとおりである。Y1-IgG単独(終濃度50μg/ml)で通常の洗浄血小板凝集反応の〜39%を誘発した。Y1-IgGによる血小板凝集反応の誘発を37℃で4分間試験し、次いでリストセチンを添加した。リストセチン添加後は血小板凝集反応への追加効果がまったく見られず、通常の血小板凝集反応が観測された。しかし、血小板を濃度1μg/mlのY1とインキュベートしても血小板凝集反応の誘発はまったくなかった。
【０２１９】
[259.] 上述の要領でGPIbα (CD42)への市販の(血小板凝集反応を阻害する)モノクローナル抗体(Pharmigen)、又は対照ヒトIgG-Lambda (Sigma)を使用しても血小板凝集反応の阻害はなかった。
【０２２０】
【表６】

【０２２１】
多血小板血漿 (PRP) 凝集への Y1-IgG の効果
[260.] PRP凝集へのY1-IgGの効果を種々のY1-IgG濃度でリストセチンの存在及び不存在下に試験した。Y1-IgGによる血小板凝集の誘発を37℃で4分間試験し、次にリストセチンを添加した。
【０２２２】
[261.] 結果は表7及び図18のとおりである。リストセチン添加後は血小板凝集への効果が見られず、通常の血小板凝集が観測された。終濃度50μg/mlのY1-IgGはリストセチン添加前、PRP中で血小板凝集を誘発した。濃度25μg/mlのY1-IgGはリストセチン添加前、血小板凝集を部分的に誘発したにすぎない。濃度10μg/ml、4μg/ml又は1μg/mlのY1-IgGでは血小板凝集の阻害は見られなかった。濃度20μg/mlで血小板凝集を阻害する市販の、GPIbα (CD42)へのモノクローナル抗体(Pharmigen)は、血小板凝集を誘発しなかった。Y1-IgGと同じ濃度の対照ヒトIgG-Lambda (Sigma)もまた血小板凝集を誘発しなかった。
【０２２３】
【表７】

【０２２４】
Y1 血漿可溶性リガンド及び細胞株の同定
[262.] GPIbα(CD42b)への抗体は血小板溶解物とグリコカリシンを認識するが、KG-1細胞溶解物(Y1結合陽性の骨髄腫細胞株)又はRAJI細胞溶解物(KG-1細胞がY1結合陽性となる濃度でY1結合陰性であるB細胞株)を認識しない。それに対して、Y1はグリコカリシン、血小板溶解物及びKG-1細胞をいずれも認識するが、RAJI細胞抽出物を認識しない。陰性対照のscFv-181はいずれの関連タンパク質も認識しない(図20)。
【０２２５】
[263.] Y1の交差反応性のこうした独自性は、Y1とSZ2 (GPIbの硫酸化領域へのMAb)の比較分析でも明らかにされた。SZ2とは対照的に、Y1はGPIbに結合するだけでなく、以下述べるように血漿タンパク質や骨髄腫由来細胞抽出物にも結合する。
【０２２６】
ヒト血漿中の Y1 リガンド
[264.] 正常血漿、白血病患者血漿のいずれでも2種類のタンパク質がY1と免疫反応した。すなわち(1)還元条件下での分子質量が〜50kDa、非還元条件下での分子質量が>300kDaであり、凝固後は血清から完全に消滅する H P-リガンド1、及び(1) 還元、非還元両条件下での分子質量が〜80kDaであり、凝固後も血清中にとどまる H P-リガンド2である。〜50kDaリガンドはQ-Sepharoseカラム逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC) 2Dゲル電気泳動による精製及びペプチドマッピング後に、ヒト・フィブリノゲンγ鎖の正常変異体(γ’)と同定された。その配列VRPEHPAETEYDSLYPEDDLはフィブリノゲンγ’中に存在するだけであるが、豊富に存在するフィブリノゲンγ型ではなく、また硫酸化チロシンを含むGPIb陰イオン領域に類似する。これはたぶんY1結合部位であろう。〜80kDaは補体複合体4 (CC4)及びルミカンと同定された。それは前述のように、硫酸化チロシン残基と付随する負荷電アミノ酸群とを含む。
【０２２７】
一次白血病細胞への Y1 の結合
[265.] FACS解析によれば、Y1は白血病細胞に選択的に結合するが、正常血液試料中の正常血液細胞と白血病血液試料中の正常細胞には結合しない。患者試料の解析結果をまとめると以下の表のようになる。
【０２２８】
【表８】

【０２２９】
【表９】

【０２３０】
骨髄性細胞 (KG-1) 上の Y1 エピトープの解析
[266.] KG-1細胞膜からのY1エピトープの精製を目的に約250億個のKG-1細胞を回収した。KG-1膜調製品は、Y1の結合先となる少なくとも2つのサブユニットすなわち〜110kDaサブユニットと〜120kDaサブユニットを含んでいた。Y1は、該〜110kDaサブユニットの二量体であると見られる〜220kDaサブユニットにも結合する。Y1エピトープの精製はY1使用の免疫沈降法、及びRP-HPLCで行った。集めた画分のうち2μlはscFv Y1使用のウェスタンブロット法に、また40μlは銀染色に用いた。(図21)
【０２３１】
[267.] Y1のさらなる特性解析を行った。その方法はプロテアーゼ、グリカナーゼ及びスルファターゼによる酵素的処理; Y1、抗CD42抗体、抗CD162抗体及び181の使用によるウェスタンプロット法; Y1及び抗CD162抗体の使用による免疫沈降法; Y1及び抗CD162抗体の使用によるFACS解析; 及び配列解析であった。
[268.] 次の表はKG-1細胞上のY1結合部位の解析と定位を目的に実行した生化学実験のまとめである。
【０２３２】
SDS-PAGE 還元ゲル上での Y1 によるウェスタンブロット解析
【０２３３】
【表１０】

【０２３４】
[269.] 要するに、エンドペプチダーゼで処理するとY1シグナルは切断され、検出不能になる( 図 22)。おそらくY1結合部位を含む画分はN’末端側にあるが、前記実験に使用した条件の下では小さすぎて検出できないのであろう。同様に、 Mocarhagin による処理後、 Y1 シグナルは、切断され、そして検出不能になる ( 図 33) 。これは、 Y1 のエピトープが、上記リガンドの N' 末端上にあることを示唆するものである。さらに、硫酸基を(KG-1細胞抽出物内の)タンパク質から遊離させるものの(ヘパリン上の)糖部分からは遊離させないアリールスルファターゼ処理で得られた結果は、Y1の認識には硫酸基が必要であるとの仮説を裏付ける( 図 23)。興味深いことに、O-シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼはGC切断産物中のY1シグナルを増強する。この処理により、Y1結合部位がC’末端側に位置するようになり、Y1結合にさらに好都合なように露出されるためと考えられる。
【０２３５】
Y1 と PSLG-1 抗体 KPL1 の相関 : ウェスタンプロット解析
[270.] scFv Y1抗体及び市販抗PSGL-1モノクローナル抗体(KPL1)の、KG-1細胞由来のKPL1免疫沈降(IP)膜タンパク質への結合を評価した。Raji細胞溶解物をY1及びKPL1陰性対照として使用した。
【０２３６】
[271.] KG-1細胞の膜画分をKPL1で免疫沈降した。そのIP画分をさらにscFv Y1抗体又はKPL1で免疫沈降した。非沈降(溶出液)画分をscFv Y1又はKPL1抗体の使用によるウェスタンブロット法で解析した。
【０２３７】
[272.] 免疫沈降スキームと結果を共に図24に示す。KPL1はグリコカリシンを認識しない。しかし、scFv Y1、KPL1両抗体はKG-1細胞上の膜タンパク質を認識する。
【０２３８】
[273.] 細胞株及び一次白血球に由来する溶解物をCD162抗体で免疫沈降し、遠心分離により上清と溶出液を生成した。scFv Y1及び抗CD162抗体を使用して溶出液及び上清に含まれるタンパク質のウェスタンブロット解析を行った。KG-1膜調製品は、抗CD162 (PSGL-1)抗体の結合相手となる2つのサブユニット(〜110kDaと〜120kDa)を含む。それに対して、正常白血球膜調製品はもっと小さなサブユニットだけを含む。AML患者由来の膜調製品はもっと大きなサブユニットだけを含む。scFv Y1はある明確な化学種に結合するが、それは免疫沈降法の上清に存在し抗CD162抗体の結合相手とはならない(図25)。
【０２３９】
FACS 解析
[274.] 抗PSGL-1 (抗CD162)抗体(KPL1)の存在下でのKG-1細胞へのY1抗体(scFv型とIgG型の両方)の結合を競合的結合測定法とFACS解析で評価した。この目的には、種々の市販抗PSGL-1抗体すなわちKPL1 (PSGL-1の硫酸化チロシンN末端側ドメインを識別する抗体)、PL1 (PSGL-1の非硫酸化N末端側ドメインを識別する抗体)及びPL2 (PSGL-1受容体の非硫酸化内側ドメインを識別する抗体)を使用した。KG-1細胞へのY1の結合を完全に阻害するのはKPL1だけであり、PL1は部分的に結合を阻害する。PL2抗体の存在下では結合阻害は見られない(図26)。Raji細胞はKPL1抗体に結合しなかった。同様に、種々の濃度の全IgG Y1はKG-1細胞へのKPL1抗体の結合を用量依存的に阻害する(図27)。同様に、KPL-1抗体はKG-1細胞への全IgG Y1の結合を用量依存的に阻害する(図28)。
【０２４０】
一次白血病細胞への Y1 結合と KPL1 結合の相関
[275.] 病変細胞へのscFv Y1抗体と抗CD162抗体の結合を解析すると、scFv Y1と抗CD162抗体は結合特性が異なることもわかる。特にヒト患者由来の前駆B-ALL、HCL、AML、B-ALL、B-CLL、未分化性白血病、B-PLL及び多発性骨髄腫の各細胞へのY1及び抗CD162の結合をFACS解析すると、2抗体は異なる結合プロフィールを示した(表F)。白血病細胞へのY1の結合は12中10試料で見られるが、抗CD162の結合は12中5試料に限られる。12中5試料はY1に結合するが、抗CD162には結合しない。従って、白血病細胞ではscFv Y1は抗CD162が認識するリガンドとは別のリガンドに結合するとの結論になろう。
【０２４１】
【表１１】

【０２４２】
[276.] 概して、GPIbα、フィブロネクチン、及びPSGL-1内の含硫酸化チロシンY1結合ドメインはそれぞれDEGDTDLYDYYPEED TEGD (アミノ酸269-287)、EHPAETEYDSLYPED (アミノ酸411-427)及びQATEYELDYDFLPETE (アミノ酸1-17)である。おそらく一次白血病細胞の表面ではY1へのアフィニティーがもっと高い追加の結合部位が発現するであろう。興味深いことに、scFv Y1と抗CD162の両方に対して陽性の血液試料はAML患者に由来するが、B細胞は抗CD162に対して陰性である。
【０２４３】
Y1 への硫酸化ペプチド結合の解析
[277.] Y1へのペプチドの結合における硫酸化チロシンの存在と位置の重要性を競合的結合ELISA法で評価した。
【０２４４】
[278.] グリコカリシンをMaxiSorpプレート上に固定化した。scFv Y1を着目ペプチドと10分間、3つの異なる濃度(1μM、10μM及び100μM)でプレインキュベートし用量応答を調べた(表12)。プレインキュベーション後、この混合液(Y1+ペプチド)をプレートに添加し、scFv Y1のV_L鎖を認識するポリクローナル・ウサギ抗V_Lを、次いで抗ウサギHRPを、用いてscFv Y1の結合を評価した。該ペプチドがscFv Y1に結合した混合液では、グリコカリシンへのscFv Y1の結合が対照結合に比して増大した。該ペプチドがscFv Y1に結合しなかった混合液では、グリコカリシンへのscFv Y1の結合は対照結合に比して変化しなかった。
【０２４５】
[279.] 実験は2回実施した。その結果をELISAグラフで示す(図29)。フィブリノゲン由来ペプチドは硫酸化にもかかわらずY1の結合を阻害しなかった。PSGL-1由来の非硫酸化ペプチドはグリコカリシンへのY1の結合を阻害しなかった。PSGL-1由来の硫酸化ペプチドはみなグリコカリシンへのY1の結合を阻害した。阻害効果が最も高いのはペプチドP-YYY*及びP-YY*Y*であり、以下順にP-Y*YY*、P-YY*Y、P-Y*Y*Y、P-Y*YYと続いた。グリコカリシン由来の非硫酸化ペプチドはグリコカリシンへのY1の結合を阻害しなかったが、同じ配列でチロシンが3個とも硫酸化しているグリコカリシン由来ペプチド(G-Y*Y*Y*)はP-YY*Yと同程度の結合阻害効果があった。
【０２４６】
[280.] 従って明らかなように、すべての硫酸化ペプチドがscFv Y1に同程度に結合するわけではない。また重要なことに、これらの結果は、ペプチドP-Y*YY及びP-YYY*の例で明らかなように、結合に必要なのはただ1個の硫酸化チロシンであることを示す。さらに硫酸化チロシンを取り巻くアミノ酸配列もY1結合に影響することがわかる。たとえば(配列EY*E中に1個の硫酸化チロシンを含む) P-Y*YYは100μMの濃度でようやく結合を効果的に阻害するのに対して、(配列DY*D中に1個の硫酸化チロシンを含む)P-YYY*は1μMの濃度で結合を効果的に阻害する。
【０２４７】
【表１２】

【０２４８】
仮説 / 結論
[281.] (1) Y1は硫酸化タンパク質と糖部分の両方を認識するL-セレクチンに類似し、また硫酸化チロシンだけを認識するP-セレクチンとは異なる。従ってY1は両タンパク質の結合をめぐり競合しうる。
【０２４９】
[282.] (2) 分化及び細胞増殖時の硫酸化の変異はY1結合に影響を及ぼすであろう。従ってY1はP-、L-両セレクチンとそれぞれの硫酸化リガンドへの結合をめぐり競合するであろう。
【０２５０】
白血病特異的抗体の有効性を評価するための in vivo モデル
[283.] 免疫不全マウスとアッセイ系で2つのヒト白血病モデルを発現させた。
【０２５１】
[284.] 使用したヒト細胞株はT細胞白血病患者由来のMOLT4細胞とAML患者由来のKG-1細胞である。移植悪性細胞の同定と定量は各細胞株上の関連ヒト抗原に対して特異的な抗体を使用して行った。
【０２５２】
T-ALL (MOLT4) モデル
[285.] T-ALLのin vivoマウスモデルには、T細胞白血病患者由来のMOLT4細胞を注射したSCIDマウス(Jackson Laboratories)を使用する。
【０２５３】
[286.] 一実験では、SCIDマウスをCytoxen (CTX、注射用シクロホスファミド、Mead Johnson) 100mg/kgで前処置した。そして上記マウスに、２×10⁷ MOLT-4 細胞／マウスを静脈内注射し、シクロホスファミドによる処理から５日後に、抗癌剤又はPBS(ネガティブ・コントロール動物)を、MOLT-4細胞注射から５日後以降、３回／週、静脈内注射した。35日目に、血液を動物から採取し、その動物を殺し、そして動物の肝臓を摘出し、そして計量した。未処理、PBS処理MOLT-4細胞担持動物においては、肝臓は、ひじょうに重度の腫瘍増殖を示し、そしてそのサイズは、PBS対照非感染動物に比較して２〜３倍増加していた。この実験において、５つの処置群があった：
表 13
１．MOLT-4細胞による注射なし、PBS処理。
２．MOLT-4注射対照、PBS処理。
３．MOLT-4注射、Y1 scFv (CONY1)、75μg／マウスで処理。
４．MOLT-4注射、CONY 1 scFv−ドキソルビシン、75μg／マウスで処理。
５．MOLT-4注射、ドキソルビシン、0.1mg／kgで処理。
【０２５４】
【表１３】

【０２５５】
[287.] マウスは細胞接種の32日後に死に始めたので、その時点で生存マウスを犠牲にした。抗ヒトCD44-FITC及びY1-ビオチン/SAV-PE使用のフローサイトメトリーで骨髄細胞を解析した。数頭の動物に由来する血液試料を調べて血小板と白血球を計数した。肝臓を計量し、腫瘍発現の有無を調べた。他器官についても腫瘍発現の有無を調べた。
【０２５６】
[288.] 結果は図30〜32のとおりである。MOLT-4細胞を注射したすべてのマウスの肝臓に大きな腫瘍成長(白色の瘤塊)が見られた。
【０２５７】
[289.] 骨髄中に検出されたMOLT-4細胞の百分率はきわめて低かった(図31)。
【０２５８】
[290.] 概して、これらの結果はMOLT-4モデルが白血病細胞の肝臓転移の有用モデルとして使用しうることを証明する。
【０２５９】
[291.] 平行して、肝組織の一部を組織学用、及びFACS解析のための細胞分離用に採取した。別の処置マウス群の生存率を対照無処置マウス群のそれと比較して記録した。
【０２６０】
[292.] 35日目の肝重量を図30に示す。図に示すように、肝重量は腫瘍マウスの陰性対照PBS注射群では対照PBS注射・非MOLT-4注射群に比してほぼ3倍に増加した。低用量Doxで処置したマウスの肝重量はPBS注射腫瘍マウスとほぼ同じであった。他方、CONY1 scFv及びCONY1 scFv-Doxコンジュゲートによる処置は肝臓の腫瘍成長を著しく阻害した(肝重量の増大がずっと小幅)。
【０２６１】
[293.] 同じSCID/MOLT-4プロトコールによる第2の実験では、次の6群を使用した:
1. MOLT-4細胞と PBS を注射しなかった。
2. MOLT-4細胞を注射しPBSで処理した。
3. MOLT-4 を注射し、CONY1 scFv 75μg/マウスで処理。
4. MOLT-4 を注射し、NissimＩライブラリー由来の非特異的scFv抗体 75μg/マウスで処理 ( 対照 ) 。
5. MOLT-4 を注射し、Y1-IgG 5μg/マウスで処理。
6. 非特異的ヒト IgG ， 5 μ g/ マウスで処置した MOLT-4 群 ( 対照 ) 。
【０２６２】
[294.] 図34に示す結果から、CONY1 scFv又はY1 IgGによる処置は(肝重量に基づく限り)腫瘍の成長を阻害する一方で、非特異的抗体による処置はほとんど又はまったく効果がなかったことが窺える。
【０２６３】
[295.] 継続的処置を受けた3群のマウスで生存を評価したが、結果は図35のとおりである。図に示すように、CONY1 scFvで処置したマウスの生存だけが延びた。
【０２６４】
AML KG-1 モデル
[296.] ヒトAMLのin vivoマウスモデルには、ヒトAML細胞株由来のKG-1細胞を注射したSCID/NODマウス(Jackson Laboratories)を使用する。
【０２６５】
[297.] 第1の実験では、NOD/SCIDマウスをCYTOXAN(登録商標) 100mg/kgで前処置した。CYTOXAN注射の4日後、KG-1細胞を6群のマウスの尾部に静脈注射した(表14、群2及び5-9)。1群のマウス(表14、群1)にはPBSだけを注射した(対照)。
KG-1注射の14日後からマウスを次のうちいずれかで処置した: CONY1、Dox(ドキソルビシン)、CONY1-Doxコンジュゲート又はMYLOTARG (登録商標) [MYLOTARGはカルキアマイシンにモノクローナル抗体(抗CD33抗体)を化学的に結合したコンジュゲートであり、最初の再発に見舞われた60歳以上のAML患者の治療用として最近FDAの承認がおりた]。マウスは週1回又は3回、3週間にわたり処置した。KG-1接種マウスのうち1群(群2)は無処置のままとした(表14)。他の2群(群3及び4)のマウスには、1% BSA添加の無血清RPMI中、4℃で1時間 CONY1又は181-scFv (陰性対照の非特異的抗体)とプレインキュベートしておいたKG-1細胞を注射した。抗体の使用濃度は0.25mg-scFv/10⁸個-細胞(75μg/マウス)であった。プレインキュベートしたKG-1細胞はマウスに注射する前に洗浄し、RPMI中に再懸濁した。RPMIに再懸濁したKG-1細胞を75μg-scFv/0.2ml-RPMI/マウスの濃度でマウスに注射した。群3マウスにはKG-1+CONY1を、また群4マウスにはKG-1+181-scFvをそれぞれ接種した(表14)。この処置(群3及び4)は群1-2及び5-9の接種の1日後に、すなわちCYTOXAN( 商標 )注射の5日後に、実施した。
【０２６６】
【表１４】

【０２６７】
[298.] マウスは細胞接種の60〜65日後に犠牲にした。骨髄及び血液試料をマウス抗ヒトCD34-FITC (IQP 144F) [又は抗CD44-FITC (MCA89F, Serotec)]及びY1-ビオチン/SAV-PE使用のフローサイトメトリーで解析した。マウスIgG1-FITC (IQP 191-F)をアイソタイプ対照として使用し、またマウスIgG2a-FITC (MCA 929F, Serotec)を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーにはFACSCaliburシステムとCellQwestソフトウェア(Bectin Dickinson)を使用した。
【０２６８】
[299.] 結果はFIGS. 36 及び 37に示すとおりである。遊離Dox 5mg/kgで処置したKG-1細胞注射マウス(群7)10頭のうち9頭は処置開始後3週間以内に死んだ。
【０２６９】
[300.] KG-1細胞注射・無処置マウス(群2)の骨髄は骨髄細胞総数の平均30%程度のKG-1細胞を含んでいた。群2のマウスはすべて白血病を発現した。
【０２７０】
[301.] 該して、骨髄中のKG-1細胞が平均30%(FACS解析で測定)になるとほぼすべてのKG- 1 注射マウスが白血病を発現した。一般に移植KG-1細胞は骨髄中に限定されたが、10%未満のKG-1細胞が血液中で検出された。1例では腹膜壁に充実性腫瘍が観察された。
【０２７１】
[302.] KG-1細胞注射・遊離Dox 0.1mg/kg処置マウス(群6)は群2に比して骨髄中KG-1細胞率が統計的に有意に(p<0.05)低かった。
【０２７２】
[303.] KG-1細胞注射・CONY1-Doxコンジュゲート処置マウス(群5)は群2に比して骨髄中KG-1細胞率が低かった(16.3%対30.4%)。しかし、この差は統計的に有意とは認められなかった。実験中にCONY1-Doxがリポ多糖(LPS)で汚染されていたことが判明したためである。従って最適濃度のCONY1-Doxの使用が不可能となったので、実験終了前にこの処置を中止した。
【０２７３】
[304.] CONY1又は181-scFvとin vitroでプレインキュベートしたKG-1細胞を注射したマウス(それぞれ群3及び4)は骨髄中KG-1細胞率が有意に低かった。
【０２７４】
[305.] PBSだけを注射したマウス(陰性対照)とKG-1細胞を注射しMYLOTARG( 商標 )で処置したマウス(群9)はどちらも骨髄中にKG-1細胞が検出されなかった。これらの結果はこのin vivoモデルが有用なAMLモデルであることを証明している。
【０２７５】
[306.] 種々のマウス群の血流中の全KG-1細胞率は総じてきわめて低く、また群内の差異が大きかった。なお、MYLOTARG( 商標 )で処置した1頭のマウスは骨髄中ではなく血中で比較的高いKG-1細胞率を示した。
【０２７６】
[307.] マウスの骨髄中及び血流中での(KG-1起源)ヒト白血病細胞の同定をFACS解析で行ったが、これにはY1 scFv抗体と平行して市販の抗ヒトCD34又はCD44抗体を使用した。
【０２７７】
[308.] 解析1日目には、KG-1細胞だけを注射したマウス(群2)はより高い骨髄中KG-1細胞率を示し、CONY1-Doxで処置したマウス(群8)に比して著しい差が見られた。解析3日目にはこの状況が逆転し、骨髄中KG-1細胞率は群8のマウスのほうが群2のマウスよりも高くなった。これは次のような事情に起因した可能性がある: A)全身状態がより悪いマウスを1日目に選択した、B)処置終了後の期間中に群8のマウスでKG-1細胞が増殖した、及びC)各群のマウスが少なすぎて統計的に有意の結果を出せなかった。
【０２７８】
マウスにおける CONY1 の薬物動態
[309.] CONY1 scFvを¹²⁵I-Bolton Hunter試薬(対リシン)で標識した。¹²⁵I-Bolton Hunter試薬と4℃、ホウ酸緩衝液(pH9.2)中で標識させた¹²⁵I-CONY1をPD-10クロマトグラフィーカラムで精製した。この放射性タンパク質を次に無標識CONY1と混合して生理食塩水中に2.5×10⁶ CPM/mlを含むCONY1濃度75μg/mlの溶液とする。
【０２７９】
[310.] 雄のBalb-Cマウスを0.9% NaI 0.5ml/マウスの腹腔内注射で前処置した。2時間後、マウスに標識CONY1溶液0.2mlを静脈内注射した。これにより¹²⁵I-CONY1の投与量は結果的に15μg (2.5×10⁵ CPM)/マウスとなった。
【０２８０】
[311.] 注射後、様々な時点でEDTA採血してからマウスを犠牲にし、組織を摘出した。試料及び器官は注射の5、15及び30分後と1、2、4、8及び24時間後に採取、摘出した。時点あたり2〜4頭のマウスを使用した。血漿を分離し、ガンマ線放射能を測定するか又はトリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させるかした。遠心後、TCA沈殿のガンマ線放射能を測定した。肝臓、肺、腎臓、脾臓及び骨髄試料を計量し、ガンマ放射能を測定した。血漿TCA沈殿の放射能と時間の関係をグラフにし、2コンパートメント薬物動態モデルをあてはめた。器官/組織の全放射能及び非放射能の値を計算した。その結果を図39〜41に示す。
【０２８１】
[312.] 血液と血漿の放射能値を比較すると、CONY1はほぼ全量が血漿中に存在し、赤血球には接着しないことがわかった。血漿の放射能値はTCA沈殿の放射能値とほぼ同じであったが、これは両者が非分解タンパク質に関連していることを示唆する。図39は投与後の血漿中CONY1レベルを時系列に示している。その値を2コンパートメント・モデルへと統計的にあてはめると、得られた血液クリアランス半減期の値はそれぞれ35分、190分であった。
【０２８２】
[313.] 投与後の所定時点の多様な組織における放射能分布を比放射能及び全放射能として、それぞれ図40及び41に示す。ほとんどの組織では、血液との比放射能比較から明らかなように、放射能の特異的蓄積は見られなかった。やや高い値が4時間後の腎臓と4及び8時間後の骨髄で見られたが、これはおそらく分解産物の排出に関連するものであろう。
【０２８３】
[314.] 諸結果は、マウスではCONY1が35分の半減期で排出されることを示唆している。第2コンパートメントの排出速度は重要性が小さいし、また注射物質の何らかのポリマー体の存在に起因する可能性がある。体組織へのCONY1の大きな特異的取込みはなく、例外として骨髄中での若干の上昇が見られる。
【０２８４】
抗体及び断片の産生
[315.] 抗体、その断片、それらの構成体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及びそれらの断片及び構成体は原核又は真核発現系で産生させることができる。原核及び真核発現系で抗体や断片を産生させる方法は技術上周知である。
【０２８５】
[316.] 真核細胞系は本発明の定義及び以下の説明では、遺伝子工学的方法により真核宿主細胞中でペプチド又はポリペプチドを産生させるための発現系をいう。真核発現系は哺乳動物系でもよいが、哺乳動物系で発現させたペプチド又はポリペプチドは精製後、哺乳動物の汚染物質を実質的に含まないのが好ましい。他の有用な真核発現系の例は酵母発現系などである。
【０２８６】
[317.] 本発明のペプチド又はポリペプチドを産生させる好ましい原核発現系は発現ベクター用宿主としてE. coliを使用する。E. coli系で産生されるペプチド又はポリペプチドは精製後、E. coliの汚染タンパク質を実質的に含まない。原核発現系の使用は、本発明で提供されるいくつかの、又はすべての配列のN末端側にメチオニン残基の付加を伴う場合がある。ペプチド又はポリペプチド産生後のN末端側メチオニン残基の解離によるペプチド又はポリペプチドの完全な発現は技術上周知の要領で、たとえば好適条件下でのAeromonas aminopeptidaseの使用により実現することができる。
【０２８７】
抗体、断片及び構成体の種類
[318.] 本発明は抗体又はその抗原結合性断片、その構成体、又は断片の構成体を提供する。本発明の抗体の例はIgG、IgA、IgD、IgE又はIgMなどである。IgGクラスはIgG₁、IgG₂、IgG₃及びIgG₄などのサブクラスに分かれる。
【０２８８】
[319.] 本発明の抗体断片の例はFv、scFv、dsFv、Fab、Fab₂及びFdフラグメントなどである。もっと小さな断片たとえばFvフラグメント類の断片もまた、それらが元の抗体又はフラグメントの結合特性を保持している限り、本発明の「断片」に属する。そうした断片の例は、(1) Fv重鎖だけの断片を含むミニボディー、(2)抗体重鎖可変領域の小さな部分単位を含むマイクロボディー (PCT出願番号PCT/IL99/ 00581)、(3)軽鎖断片を含む類似体、及び(4)軽鎖可変領域の機能的単位を含む類似体である。構成体の例はダイアボディー、トラアボディー及びテトラボディーなどの多量体である。用語「抗体、その結合性断片、又は抗体又はその結合性断片を含む複合体」及び「抗体又は断片」は、特に断らない限り又は文脈や技術的な知見に照らして不適切でない限り、これらすべての分子だけでなく、その誘導体や同族体、模倣体、変異体をも包含する。
【０２８９】
[320.] 所望の結合能をもつ抗体、断片又は構成体がひとたび選択及び/又は作製されてしまえば、当業者は本明細書を手引きにして原抗体の特性を保持した構成体や断片を作製することができる。たとえば、当初に選択又は作製された抗体、断片又は構成体の所望特性を保持するような完全な抗体分子、Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab₂フラグメント、二量体、三量体又は他の構成体などを作製することができる。
【０２９０】
[321.] 抗体又は断片の特性を保持しながらもアミノ酸を置換するのが望ましいのであれば、保存的アミノ酸置換という周知の技術がある。抗体又は断片には、その結合特性を変えずに治療薬又は診断薬への結合といった改変を加えてもよい。抗体又は断片には、その特異性を変えずに他の改変たとえば抗体又は断片の安定化を目的とした改変を加えてもよい。たとえばペプチド修飾、セミペプチド修飾、環状ペプチド修飾、N末端修飾、C末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾及び残基修飾などである。また当業者は本明細書を手引きにすれば、改変抗体又は断片の結合特性が変質したかどうかを試験して評価することができる。
【０２９１】
[322.] 同様に、当業者は本明細書を手引きにすれば、抗体、断片又は構成体の結合特性を変えて、より望ましい特性を備えた分子を得ることもできる。たとえば望ましい特性をもつある抗体がひとたび同定されたら、ランダム又は特異的突然変異誘発法により該抗体の変異体を生成し、そこからさらに望ましい性質をもつ変異体をスクリーニングすることができる。
【０２９２】
[323.] 本発明の抗体及び断片はまた、その調製や識別及び診断に役立つタグを挿入又は付加した分子でもよい。該タグは後で分子から除去することができる。有用なタグの例はAU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、Protein C、S-Tag(登録商標)、T7、V5及びVSV-Gなどである[Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-618 (1998)]。タグはc-myc又は KAKであるのが好ましい。
【０２９３】
多量体型の抗体
[324.] 本発明はscFv分子を含むY1又はY17ペプチド又はポリペプチドを提供する。scFvはここでは、ヒト抗体の重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖可変領域とからなる分子であって、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と連結、結合、融合又は共有結合もしくは会合している分子をいうが、両ヒト抗体は同じでも異なっていてもよい。
【０２９４】
[325.] Y1及びY17 scFv構成体は、Y1及びY17抗体の1つ又は複数の超可変領域をもつscFv分子の多量体(二量体、三量体、四量体など)でもよい。scFv由来の構成体及び断片はすべて増進結合特性を維持することにより、他細胞に優先してターゲット細胞に選択的及び/又は特異的に結合する。この結合選択性及び/又は特異性は主に超可変領域によって決まる。
【０２９５】
[326.] 軽鎖及び重鎖の可変領域内の超可変ループは相補性決定領域(CDR)という。軽鎖と重鎖には各々CDR1、CDR2及びCDR3領域がある。これらの領域のうち最も可変的なのは重鎖のCDR3領域である。このCDR3領域はIg分子中の最も露出された領域であると考えらており、また本明細書で規定するように、、観測された選択的及び/又は特異的結合特性に主に寄与する部位である。
【０２９６】
[327.] 本発明のY1及びY17ペプチド又はポリペプチドは多価型Fvへと折りたたまれるように構築することができる。Y1及びY17多量体型を構築した目的は、結合アフィニティー及び特異性の改善と血中半減期の延長である。
【０２９７】
[328.] 多価型scFvはすでにほかでも作製されている。まず2つのscFvをリンカーで連結するというアプローチがある。別のアプローチでは2つのscFvをジスルフィド結合で連結する。二量体又は三量体型のFvを作製する最も単純なアプローチはHolliger et al., PNAS, 90, 6444-6448 (1993)及びA. Kortt et al., Protein Eng., 10, 423-433 (1997)が報告している。そうした方法の1つは、scFvのC末端にFOS及びJUNタンパク質領域を付加して両者の間にロイシンジッパーを形成することによりscFv二量体を作製するというものである。Kostelny SA et al., J. Immunol. 1992 Mar 1, 148(5):1547-53; De Kruif et al., J. Biol. Chem. 1996 Mar 29, 271 (13):7630-4. 別の方法は、scFvのC末端にストレプトアビジン・コード配列を付加して四量体を作製するというものである。ストレプトアビジンは4つのサブユニットからなるため、scFv-ストレプトアビジンが折りたたまれるとき4つのサブユニットはそれに順応して変化し四量体を形成する。Kipriyanov SM et al., Hum Antibodies Hybridomas, 1995, 6(3):93-101. さらに別の方法では、二量体、三量体及び四量体の作製を目的に着目のタンパク質に遊離システインを導入する。着目のタンパク質を遊離システインへと結合させるには可変数(2〜4)のマレイミド基をもつペプチド系架橋試薬が使用された。Cochran JR et al., Immunity, 2000 Mar, 12(3):241-50.
【０２９８】
[329.] 本発明のシステムでは、抗体Fv領域の一価型への折りたたみが可能なscFvを提示するようにファージライブラリー(前述)を設計した。さらに、またやはり前述のように、該構成体は細菌での発現に好適である。この遺伝子組換えによるscFvは、連続15アミノ酸のフレキシブルペプチドスペーサーによって連結された重鎖と軽鎖の可変領域を含む。好ましいスペーサーは(Gly₄Ser)₃である。このスペーサーの長さはアミノ酸構成とも相俟って非かさ高スペーサーをもたらすことになるが、それはV_H及びV_L領域がターゲットへの効果的な結合を実現する機能的Fvドメインへと折りたたまることを可能にする。
【０２９９】
[330.] 本発明は任意の公知技術の方法によって形成されるY1及びY17多量体に関連する。好ましい多量体(特に二量体)形成方法ではシステイン残基を使用して2単量体間にジスルフィド結合を形成させる。この実施態様では、二量体を形成しやすくするためにscFvのカルボキシル基末端にシステインを付加して二量体を形成する(Y1-cys scFv又はY1二量体という)。DNAコンストラクトの作製(Example 2D及び6Dを参照)とトランスフェクションへの使用により、Y1二量体を生産ベクター中で発現させ、in vitroでタンパク質を再生するようにした。このタンパク質をSDS-PAGE、HPLC及びFACSで解析した。しかし、二量体が形成されたことを示す結果はいずれでも得られなかった。そこで、同じ手順を繰返したが、今度は2リットルの回分発酵による抗体産生を試みた。Y1-cysをE. coli中で発現させた後、アルギニン中で再生した。再生したタンパク質をQ-Sepharoseとゲルろ過(Sephadex 75)で透析、精製した。SDS-PAGE (非還元)とゲルろ過により2つのピークが検出された。2つのピークを別々に回収し、FACSで解析した。単量体と二量体のJurkat細胞への結合をFACSで調べた。二量体による結合は同レベルの染色に1/100の量の単量体型抗体を必要としただけであり、これは二量体のほうが高アビディティーであることを示唆した。二量体の再生条件を決定し、また後続の透析、クロマトグラフィー及びゲルろ過ステップを経て二量体含有量(mg単位の量)が90%超の物質を得た。この精製二量体をゲルろ過と酸化条件下でのSDS-PAGEにより解析した。二量体の結合能を放射受容体測定、ELISA及びFACS解析で確認した。
【０３００】
[331.] scFv単量体(別名CONY1)とY1二量体の結合を比較するために、KG-1細胞上でin vitro結合競合実験を行った。また、この実験では全Y1 IgGとscFv Y1の結合も比較した。この研究ではY1 IgGをビオチンで標識した。この研究によりY1 IgGはY1 IgG-ビオチンと競合することが判明した。非関連ヒトIgGは標識Y1 IgGと競合しなかった。Y1 scFv (5μg及び10μg)はY1 IgG-ビオチン(50ng)と部分的に競合した。この研究では、無血清では1ngのY1 IgG-FITCがKG-1細胞に1μgのY1 scFv-FITCと同程度に結合するが、血清の存在下ではこの結合がほぼ阻止されることも判明した。また、放射受容体測定、ELISA及びFACS解析からY1二量体の結合はY1 scFv単量体の結合より20倍以上も強いと判明した。
【０３０１】
[332.] さらに別の実施態様では、カルボキシル基末端にシステインとは別にリシン-アラニン-リシンを付加した(これはY1-cys-kak scFvと呼ぶ)。このscFv構成体のアミノ酸配列は次のとおりである(SEQ ID NO:212)。
【０３０２】
1 MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
APGKGLEWVS GINWNGGSTG 60
61 YADSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARM
RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG 120
121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
YASWYQQKPG QAPVLVTYGK 180
181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR
DSSGNHVVFG GGTKLTVLGG 240
241 GGCKAK
【０３０３】
[333.] Y1-cys-KAKは細菌中λ-pLベクターで産生させた。λ-pLベクターでの発現は温度を42℃に高めて誘発した。発現誘発培養液から封入体を回収し、水溶液により半精製して不要の可溶性タンパク質を除去した。封入体をグアニジンで可溶化し、DTTで還元し、アルギニン/酸化-グルタチオン系の溶液でin vitro再生した。再生したタンパク質はTFF(クロスフローろ過)法で尿素/燐酸緩衝液を含む緩衝液に透析、濃縮した。このタンパク質をSPカラムでイオン交換クロマトグラフィーにより再精製、濃縮した。
【０３０４】
[334.] 血小板由来の抗原GPIb(グリコカリシン)への二量体(Y1 scFv、別名Y1-kak)と二量体Y1-cys-kak (システイン二量体)の結合の違いをELISA法で確認した。GPIbへの結合の検出にはポリクローナル抗単鎖抗体及び/又は新規ポリクローナル抗V_L(ウサギ由来)及び抗ウサギHRPを使用した。二量体は単量体よりも結合活性が約100倍高かった。たとえば0.8 ODの実現に使用された単量体は12.8μg/mlであるのに対し、二量体は0.1μg/mlにすぎない。図19を参照。
【０３０５】
[335.] さらにKG-1細胞への結合に関するFACS解析から、2段階又は3段階の結合検定では二量体のほうが単量体より高感度であると判明した。FITCで直接標識した二量体は単量体よりもやや有利であった(使用量が10分の1)。二量体を競合物質として使用したKG-1細胞への放射受容体測定では、二量体のほうが単量体よりも30倍も効率的であると判明した。
【０３０６】
[336.] スペーサーの長さを加減するのも二量体、三量体及び四量体(当業界ではそれぞれダイアボディー、トライアボディー、テトラボディーともいう)を形成する好ましい方法である。二量体は、同じscFvの2本の可変鎖を連結するスペーサーを一般に5〜12アミノ酸残基に短縮するような条件下で形成する。この短縮スペーサーは同じ分子に由来する2本の可変鎖が1つの機能的Fvドメインへと折りたたまれるのを防ぐ。代わりに両ドメインはそれぞれもう1つの分子の相補ドメインとペアを組んで2つの結合ドメインを形成する。好ましい方法では、わずか5アミノ酸残基のスペーサー(Gly₄Ser)をダイアボディーの構築に使用した。この二量体は2個の同種scFvから、又は2個の異種scFvから、形成することができ、また親scFvの増進型の選択的及び/又は特異的結合活性を維持したり、さらに高い結合力又はアフィニティーを示したりすることができる。
【０３０７】
[337.] 同様にトライアボディーは、同じscFvの2本の可変鎖を連結するスペーサーを一般に5未満のアミノ酸残基に短縮するような条件下で形成される。これにより同じ分子に由来する2本の可変鎖が1つの機能的Fvドメインへと折りたたまれるのを防ぐ。代わりに3個のscFv分子が会合して三量体を形成する。好ましい方法では、このフレキシブルスペーサーを完全になくすことによりトラアボディーが得られた。トライアボディーは3個の同種scFvから、又は2〜3種のscFvから形成することができ、また親scFvの増進型の選択的及び/又は特異的結合活性を維持したり、さらに高い結合力又はアフィニティーを示したりすることができる。
【０３０８】
[338.] テトラボディーもまた、同じscFvの2本の可変鎖を連結するスペーサーを一般に5未満のアミノ酸残基に短縮するような条件下で形成される。これにより同じ分子に由来する2本の可変鎖が1つの機能的Fvドメインへと折りたたまれるのを防ぐ。代わりに4個のscFv分子が会合して四量体を形成する。テトラボディーは4個の同種scFvから、又は1〜4個の異種scFvから形成することができ、また親scFvの増進型の選択的及び/又は特異的結合活性を維持したり、さらに高い結合力又はアフィニティーを示したりすることができる。
【０３０９】
[339.] スペーサーの長さを一般に5未満のアミノ酸残基とする条件下でトラアボディー又はテトラボディーが形成されるかどうかは混合液中の特定scFvのアミノ酸配列と反応条件とに依存する。
【０３１０】
[340.] 好ましい方法では、ビオチン/ストレプトアビジン会合を利用して四量体を形成する。酵素的にビオチン標識することができる新規の発酵構成体(ここではY1-Biotag又はY1-Bと呼ぶ)を創製した。BirA酵素の基質に当る配列をY1のC末端に付加した。BirA酵素は該配列内のリシン残基にビオチンを付加する。このY1-BiotagをE. coli中で発現させた。封入体のタンパク質を単離し、再生した。折りたたまれた状態のこのタンパク質は純度が95%超であり、1リットルの培養液(小規模、非至適条件)から100 mg余りが得られた。その分子質量はscFvとほぼ同じであることがHPLC、SDS-PAGE及びMSから判明した。Y1-Biotagは最も安定したFACS解析用試薬であると判明した。しかし、KG-1細胞へのY1-Biotagの結合を血清の存在下で調べるときの所要量は血清不存在下での同等の結合に比して多くなる(約10倍)。それにもかかわらず、この構成体は特異的ビオチニル化の利点、すなわち分子の結合部位が原型のまま残されるという利点をもたらす。また、各分子はビオチン1個だけで標識され、各分子がC末端で1個のビオチンを受け取るにすぎない。
【０３１１】
[341.] 所望位置に分子あたり1個のビオチンという限定標識法はストレプトアビジンとの併用による四量体の生産を可能にした。この四量体はY1-Bをストレプトアビジン-PEとインキュベートして形成した。
【０３１２】
[342.] FACS解析によれば、Y1-Bとストレプトアビジン-PEによって作製される四量体はY1 scFv単量体と比べて100〜1000倍も高感度であった。Y1-B/ストレプトアビジン-PE四量体はY1-反応性細胞株の1つ(KG-1)に特異的に結合する模様である。この反応のバックグラウンド結合との差異はきわめて大きいため、少量の受容体を高感度で検出することができた。Y1BSAV四量体を使用した正常全血のFACS評価によれば、高反応性の化学種は存在しなかった。単球と顆粒球はわずかに陽性であったが、結果が陽性と出た細胞株たとえばKG-1細胞では該四量体の反応性はその100倍以上であった。
【０３１３】
[343.] 次に、四量体を細胞試料とインキュベートした。Y1四量体は低用量(5ng)で細胞株(KG-1)によく結合し、その応答は以前に他の抗体型で観測された応答より10〜20倍も高かった。
【０３１４】
診断治療用のコンジュゲート
[344.] 本発明の抗体及びその断片は多様な薬剤たとえば薬物、毒素及び放射性同位体へと、随意に製薬用担体と共に、会合、結合、融合又は連結させて疾病予防及び/又は抗がん活性を有する薬剤-ペプチド組成物、融合体又はコンジュゲートを形成することができる。そうしたコンジュゲート及び融合体はまた診断目的に使用してもよい。
【０３１５】
[345.] 本発明に有用な担体の例はデキストラン、HPMA(親油性ポリマー)又は他の任意のポリマーなどである。あるいは修飾リポソームたとえばscFv Y1分子で修飾したリポソーム(例: 多量のドキソルビシンを含有する市販リポソームDoxil)などを使用することもできる。その種のリポソームは1つ又は複数の薬剤を含有するように調製し、高薬剤/抗体比となるように本発明の抗体と混和することができる。
【０３１６】
[346.] あるいは、抗体又はその断片と薬剤との結合は直接結合でもよい。2以上の隣接分子の直接結合は分子中の要素又は要素群の間の化学結合を介して実現してもよい。化学結合はたとえばイオン結合、共有結合、疎水結合、親水結合、静電結合又は水素結合でもよい。それらの結合はたとえばアミン結合、カルボキシル結合、アミド結合、ヒドロキシル結合、ペプチド結合及び/又はジスルフィド結合でもよい。直接結合はプロテアーゼ抵抗性結合であるのが好ましい。
【０３１７】
[347.] ペプチドと薬剤との、又はペプチドと担体との、又は担体と薬剤との結合はリンカー化合物を介した結合でもよい。リンカー化合物は、本明細書及び特許請求の範囲では、2以上の部分を結合する化合物をいう。リンカーは直鎖型でも分枝型でよい。分岐型リンカー化合物は二分枝、三分枝、又は四分枝以上の化合物からなってもよい。本発明に有用なリンカー化合物は、たとえばジカルボン酸、マレイミドヒドラジド、PDPH、カルボン酸ヒドラジド及び小ペプチドを含む群より選択される。
【０３１８】
[348.] 本発明の有用リンカーのもっと具体的な例は次のとおりである:
a. ジカルボン酸たとえばコハク酸、グルタル酸及びアジピン酸など;
b. マレイミドヒドラジドたとえばN-[ -マレイミドカプロン酸]ヒドラジド、4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシルヒドラジド、及びN-[ -マレイミドウンデカン酸]ヒドラジドなど;
c. PDPHリンカーたとえばスルフヒドリル反応性タンパク質と結合した(3-[2-ピリジルジチオ]プロピオニルヒドラジド); 及び
d. 炭素原子数2〜5のカルボン酸ヒドラジド。
【０３１９】
[349.] 小ペプチドを使用したダイレクトカップリングによる結合もまた有用である。たとえば、抗がん薬ドキソルビシンなどの遊離糖とscFvとのダイレクトカップリングは小ペプチドを使用して実現してもよい。小ペプチドの例はAU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、Protein C、S-Tag(登録商標)、T7、V5及びVSV-Gなどである。
【０３２０】
[350.] 本発明の抗体及びその断片は造影剤(指示マーカーともいう)たとえば放射性同位体と結合、抱合、複合し、又は他の形で結び付けてコンジュゲートとし、それを診断及び画像解析目的に使用してもよい。そうした放射性同位体-抗体(又は抗体断片)コンジュゲートを含むキットが提供される。
【０３２１】
[351.] 診断に有用な放射性同位体の例は¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムなどである。好ましいはのは、X線又は常磁性イオンを通さない放射性同位体である。
【０３２２】
[352.] 指示マーカー分子は蛍光マーカー分子でもよい。蛍光マーカー分子の例はフルオレセイン、フィコエリトリン又はローダミンもしくはそれらの修飾体又はコンジュゲートなどである。
【０３２３】
[353.] 指示マーカーに結合した抗体又は断片は病態の診断又はモニタリングに使用してもよい。そうしたモニタリングはin vivo、in vitro又はex vivoいずれで行ってもよい。モニタリング又は診断をin vivo又はex vivoで行う場合には、造影剤は患者に許容限度を超える害を及ぼさないという意味で生理的に許容しうるものが好ましい。許容レベルの害は、臨床医が病気の重篤度や代替品の利用可能性といった基準を用いて決定することになろう。
【０３２４】
[354.] 本発明は治療前・中・後のin vitro治療有効性解析用の診断キットであって、指示マーカー(又は造影剤)に結合した本発明のペプチドを含む造影剤などからなる診断キットを提供する。本発明はさらに、がん特に腫瘍の診断的定位及び画像解析に造影剤を使用する方法であって、
a) 細胞を造影剤と接触させるステップ
b) 細胞に結合した放射能を計測するステップ、及び
c) 腫瘍を視覚化するステップ
を含む方法を提供する。
【０３２５】
[355.] 好適な造影剤の例はFITC、PEなどの蛍光色素、及びグリーン蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質である。他の例は、基質と反応して識別可能な変化たとえば色の変化を引き起こす放射性分子及び酵素などである。
【０３２６】
[356.] 一例では、キットの造影剤はFITCなどの蛍光色素であり、キットはがん特に血液関連のがんたとえば白血病、リンパ腫及び骨髄腫の治療有効性の解析に供する。疾患の各段階たとえば診断時、治療時、寛解期及び再発期に造影剤で染色された細胞の百分率及び染色強度の決定にはFACS解析を用いる。
【０３２７】
[357.] 本発明の抗体及びその断片は抗がん薬、抗白血病薬、抗ウイルス薬、抗転移薬、抗炎症薬、抗血栓薬、抗再狭窄薬、抗凝集薬、抗自己免疫薬、抗接着薬、抗心臓血管病薬、又は他の抗疾病薬又は薬剤と結合し、複合し又は他の形で結び付けてもよい。薬剤は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ又は他の任意の温血動物を非限定的に含む哺乳動物の疾患予防、治療又は診断に有用な物質をいう。
【０３２８】
[358.] そうした薬剤の非限定的な例は抗ウイルス薬たとえばアシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジン; 抗血栓/再狭窄薬たとえばシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム及びアスピリン; 抗炎症薬たとえばザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、acetyl salicylic 17、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリド; 抗自己免疫薬たとえばレフルノマイド、デニロイキンジフチトクス(denileukin diftitox)、スブロイム(subreum)、WinRho SDF、デフィブロチド及びシクロホスファミド; 及び抗接着/抗凝集薬たとえばリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸などである。
【０３２９】
[359.] 他の薬剤例はドキソルビシン（アドリアマイシン）、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せなどである。
【０３３０】
[360.] 抗がん薬は抗がん活性を有する物質である。抗がん薬の例は、がん細胞又は未成熟前がん細胞の成長を阻害し又は停止させる物質、がん細胞又は前がん細胞を傷害する物質、がん細胞又は前がん細胞の他抗がん薬への感受性を増進する物質、及びがん細胞の転移を阻害する物質などである。本発明では、抗がん薬は腫瘍の血管新生を防止、阻害又は抑制する抗血管新生活性を有する物質でもよい。
【０３３１】
[361.] がん細胞の成長の阻害はたとえば(i)がん又は転移細胞の成長防止、(ii)がん又は転移細胞の成長抑制、(iii)がん細胞を無傷のまま生存させた状態での、その成長過程又は転移過程の完全防止、又は(iv)がん細胞の傷害を含む。
【０３３２】
[362.] 抗白血病薬は抗白血病活性を有する物質である。抗白血病薬の例は、白血病細胞又は未成熟前白血病細胞の成長を阻害し又は停止させる物質、白血病細胞又は前白血病細胞を傷害する物質、白血病細胞又は前白血病細胞の他抗白血病薬への感受性を増進する物質、及び白血病細胞の転移を阻害する物質などである。本発明では、抗白血病薬は腫瘍の血管新生を防止、阻害又は抑制する抗血管新生活性を有する物質でもよい。
【０３３３】
[363.] 白血病細胞の成長の阻害はたとえば(i)白血病又は転移細胞の成長防止、(ii)白血病又は転移細胞の成長抑制、(iii)白血病細胞を無傷のまま生存させた状態での、その成長過程又は転移過程の完全防止、又は(iv)白血病細胞の傷害を含む。
【０３３４】
[364.] 本発明の抗体又は断片を有用に結合してもよい抗疾病薬、抗がん薬、及び抗白血病薬の例には毒素、放射性同位体及び治療薬が含まれる。
【０３３５】
[365.] 毒素の例はgelonin、Pseudomonas外毒素(PE)、PE40、PE38、ジフテリア毒、リシン(ricin)、もしくはそれらの修飾体又は誘導体などである。
【０３３６】
[366.] 放射性同位体の例は、診断及び/又は治療用のγ放出体、陽電子放出核及びX線放出体、それに治療用のβ放出体及びα放出体などである。
【０３３７】
[367.] 治療用の放射性同位体の具体例は¹¹¹インジウム、¹¹³インジウム、^99mレニウム、¹⁰⁵レニウム、¹⁰¹レニウム、^99mテクネチウム、^121mテルル、^122mテルル、^125mテルル、¹⁶⁵ツリウム、¹⁶⁷ツリウム、¹⁶⁸ツリウム、¹²³ヨウ素、¹²⁶ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹³³ヨウ素、^81mクリプトン、³³キセノン、⁹⁰イットリウム、²¹³ビスマス、⁷⁷臭素、¹⁸フッ素、⁹⁵ルテニウム、⁹⁷ルテニウム、¹⁰³ルテニウム、¹⁰⁵ルテニウム、¹⁰⁷水銀、²⁰³水銀、⁶⁷ガリウム及び⁶⁸ガリウムなどである。
【０３３８】
[368.] 抗がん薬又は抗白血病薬の非限定的な例はドキソルビシン( アドリアマイシン )、モルホリノドキソルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン(Ara-C)、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド及びブレオマイシン、並びにその誘導体及び組合せなどである。
【０３３９】
製剤組成物
[369.] 本発明の抗体、構成体、コンジュゲート、及び断片はそれを必要とする患者に任意好適の方法で投与してよい。投与方法の例は静脈内、筋内、皮下、局所、髄腔内、腹腔内、リンパ管内、経鼻、舌下、経口、直腸、膣、呼吸器、口腔、皮内、経皮又は胸腔内投与などである。
【０３４０】
[370.] 静脈内投与用の組成物は、約0.1mg〜約1000mgの有効量の所望組成物が患者に投与されるよう調製するのが好ましい。より好ましくは、投与量が約1mg〜約500mgの範囲の所望組成物となるようにする。本発明の組成物は広い投与量範囲にわたり有効であるが、該範囲は種々の因子たとえば治療対象疾患の詳細、ペプチド又はポリペプチド系製剤組成物の患者体内での半減期、薬剤や製剤組成物の物理化学的性質、製剤組成物の投与方法、治療又は診断対照患者の詳細、及び/又は主治医が重要と判断する他のパラメーターなどに依存する。
【０３４１】
[371.] 経口投与用の組成物は任意好適の剤型でよい。例は錠剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、丸剤、カプレット剤及びカプセル剤などである。製剤方法は技術上周知であり、たとえばRemington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennnaro (Ed.), Lippincott, Williams & Wilkins (Pub.)を参照。
【０３４２】
[372.] 製剤組成物は時限、持続、間欠又は連続放出を容易にするように調製してもよい。製剤組成物はまた時限、持続、間欠又は連続放出手段に収めて投与してもよい。
【０３４３】
[373.] 局所投与用の製剤組成物は任意好適の剤型たとえばクリーム、軟膏、ローション、パッチ、溶液、懸濁液及びジェルなどとすることができる。
【０３４４】
[374.] 本発明の抗体、構成体、コンジュゲート及び断片を含む組成物は慣用の、製薬上許容しうる希釈剤、賦形剤、担体等を含んでもよい。錠剤、丸剤、カプレット剤及びカプセル剤は慣用の賦形剤たとえばラクトース、デンプン及びステアリン酸マグネシウムなどを含んでもよい。座剤はワックスやグリセリンなどの賦形剤を含んでもよい。注射剤は発熱物質を含まない滅菌溶媒たとえば生理食塩水などを含んでよいし、緩衝剤、安定化剤又は防腐剤を含んでもよい。慣用の腸溶コーティングも使用してよい。
【０３４５】
[375.] 以下の実施例は本発明の理解に資するのが目的であり、その範囲を何ら限定するものではない。具体的な試薬や反応条件を挙げてはいるが、種々の変更が可能であり、それらもまた本発明の範囲に包摂されるものとする。従って、以下の実施例は本発明のさらなる説明が目的である。
【０３４６】
実施例 1: 血小板の調製
1.1 洗浄血小板の調製
[376.] ACD(酸性クエン酸-デキストロース)加濃縮血小板を血液センターから入手し、血小板を分離して、ACDと生理食塩水を7:1の比で含む緩衝液で1回洗浄した。血小板は各洗浄後に800×gで10分、遠心分離し、タイロード液(2mM MgCl₂、137mM NaCl、2.68 mM KCl、3mM NaH₂PO₄、0.1%グルコース、5mM Hepes及び0.35%アルブミン、pH 7.35)に再懸濁し、細胞数をカウントした。
【０３４７】
1.2 多血小板血漿の調製
[377.] 3.8%クエン酸ナトリウム入りチューブに採血し、250×g、10分の遠心で多血小板血漿を調製した。
【０３４８】
実施例 2: 血小板凝集
[378.] 血小板凝集研究では、多血小板血漿(PRP)と洗浄血小板を全血Lumiaggregometer (Chronolog, Havertown, PA)により37℃、500rpmでかき混ぜた。血小板懸濁液と懸濁媒の透光度の差を100%凝集とした。血小板凝集へのY1の効果を、種々の濃度のY1をアゴニスト添加前に添加して評価し、またその効果を4分間記録した。
【０３４９】
実施例 3: 血小板のエンドプロテアーゼ処理
3.1 モカラギンによる血小板の処理
[379.] モカラギン消化では、1mM塩化カルシウム添加TS緩衝液(0.01M Tris、0.15M塩化ナトリウム、pH 7.4)に懸濁させた洗浄血小板10⁸個を(終濃度)12μg/mlのモカラギンにより22℃で1時間処理し、EDTAを0.01Mまで加えて消化を止めた。
【０３５０】
3.2 カテプシン G によるグリコカリシンの処理
[380.] 1mM塩化カルシウム添加TS緩衝液に懸濁させた洗浄血小板10⁸個を(終濃度)1.8μg/mlのカテプシンGにより22℃で4時間処理し、PMSFを1mMまで加えて消化を止めた。
【０３５１】
O- シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼによるグリコカリシンの処理
[381.] 0.2%アルブミンとプロテアーゼインヒビター(10μMロイペプチン、0.24mM PMSF)とを含む0.1M Tris緩衝液(pH7.4)に懸濁させた血小板10⁶個をO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ0.14 mg/ml(終濃度)と37℃で45分間インキュベートし、試料緩衝液の添加と沸騰により消化を停止させた。使用した試料緩衝液は3% SDS、12%グリセリン、50mM Tris-HCl、2% βメルカプトエタノール及び0.03%ブロモフェノールブルーを含む。
【０３５２】
実施例 4: エンドプロテアーゼによるグリコカリシンの切断
モカラギンによるグリコカリシンの切断
[382.] モカラギン消化では、1mM塩化カルシウム添加TS緩衝液に溶かしたグリコカリシンを(終濃度)10μg/mlのモカラギンにより22℃で1時間処理し、EDTAを0.01Mまで加えて消化を止めた。
【０３５３】
カテプシン G による
[383.] 1mM塩化カルシウム添加TS緩衝液に溶かしたグリコカリシンを(終濃度)3.4μg/mlのカテプシンGにより22℃で4時間処理した後、PMSFを1mMまで加えて消化を止めた。
【０３５４】
O- シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼによる
[384.] 0.05M Tris緩衝液(pH 7.4)に溶かしたグリコカリシンをO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ1.2mg/ml(終濃度)と37℃で15分間インキュベートし、(実施例3(YH)で述べた)試料緩衝液の添加と沸騰により消化を止めた。
【０３５５】
実施例 5: フルサイズ Y1 IgG の構築
[385.] 全IgG分子はFv型に比して、長いin vivo半減期やin vitro細胞応答たとえばADCC又はCDC(補体依存型細胞傷害性; Tomlinson, Current Opinions of Immunology, 5, 83-89, 1993)を介した細胞応答の誘発能などいくつかの利点をもつ。後述の分子クローニング手法により、Y1 Fv領域をフルサイズIgG1分子に変換した。Y1-IgG1の構築は次の順序でcDNAの断片を互いにつなぎ合わせることで実現した。なおY1-IgG重鎖及び軽鎖の配列は図48のとおりである。図ではY1-HCのヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム(ORF) (SEQ ID NO: 205)、Y1-HCのアミノ酸配列(SEQ ID NO:206)、Y1-LCのヌクレオチド配列のORF (SEQ ID NO:207)及びY1-LCのアミノ酸配列(SEQ ID NO:208)を示す。
【０３５６】
[386.] 哺乳動物発現系のためのリーダー配列: 全IgG分子に要求される諸エレメントの便利な挿入を可能にするよう、互換性のある系を設計した。推定リーダー配列をコードする以下の相補二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、pBJ-2哺乳動物発現ベクターの(SRα5プロモーター支配下の)XhoI部位にライゲートした:
【０３５７】
5’-TCGACC TCATCA CCATGG CCTGGG CTCTGC TGCTCC TCA CCC TCCTCA CTCAGG ACACAG GGTCCT GGGCCG AT及び
【０３５８】
5’-GATCGA TTGCAC CAGCTG GATATC GGCCCA GGACCC TGT GTC CTGAGT GAGGAG GGTGAG GAGCAG CAGAGC CCAGGC CATGGT GATGAG G。
【０３５９】
開始コドンATGの上流に2つのKozakエレメントを導入した。またリーダー配列の推定切断部位とXhoI部位の間に内部EcoRV部位を導入して、可変領域のサブクローニングができるようにした。この改変ベクターはpBJ-3と命名した。
【０３６０】
[387.] Y1 scFv cDNA配列に由来するV_Lコード配列をリーダー配列と軽鎖定常領域コード配列の間に挿入した。同様に、Y1 scFv cDNA配列に由来するV_Hコード配列をリーダー配列と重鎖定常領域コード配列の間に挿入した。これは原Y1をコードするベクターpHEN-Y1のPCR増幅によりV_L及びV_H領域を個別に獲得して実現した。
【０３６１】
オリゴヌクレオチド
[388.] V_L PCR反応には5’-TTTGAT ATCCAG CTGGTG GAGTCT GGGGGA (センス鎖)と5’-GCTGAC CTAGGA CGGTCA GCTTGGT (アンチセンス鎖)を使用した。期待サイズ〜350bpの産物cDNAを精製し、配列解析し、EcoRV及びAvrII制限酵素で消化した。同じ方法により、下記のセンス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドを用いてV_H cDNA領域を増幅し、精製した:
【０３６２】
[389.] 5’-GGGATA TCCAGC TG(C/G)(A/T)GG AGTCGG GC及び5’-GGACTC GAGACG GTGACC AGGGTA CCTTG。
【０３６３】
[390.] 定常領域: IgG1 cDNA用の定常λ3 (CL-λ3)領域と重鎖定常領域CH1-CH3を次の要領で個別に合成した:
【０３６４】
[391.] 定常CL-λ3領域を得るために、正常末梢血B細胞(CD19+細胞)プールから抽出したmRNAとセンス鎖5’-CCGTCC TAGGTC AGCCCA AGGCTG C及びアンチセンス鎖5’-TTTGCG GCCGCT CATGAA CATTCT GTAGGG GCCACT GTオリゴヌクレオチドを用いてRT-PCRを行った。期待サイズ〜400bpのPCR産物を精製、配列解析し、AvrII及びNotI制限酵素で消化した。
【０３６５】
[392.] 定常IgG1領域(γ鎖)を得るために、BTGで不死化させたヒトB細胞クローン(CMV-クローン#40)をPCR増幅用に選択した。このクローンはヒトCMVに対してIgG1を分泌すること、またin vitroアッセイでADCC応答を誘発することが明らかにされた。CH1-CH3 cDNA用に、オリゴヌクレオチド5’-ACCGCT CGAGTG C(T/C)TCCA CCAAGG GCCCAT C(G/C)G TCT TC (センス鎖)及び
5’-TTTGCG GCCGCT CATTTA CCC(A/G)GA GACAGG GAGAGG CT (アンチセンス鎖)を合成し、PCR増幅に使用した。CL cDNAコード配列の場合と同様に、期待配列〜1500bpのPCR産物を精製、配列解析し、AvrII及びNotI制限酵素で消化した。
【０３６６】
[393.] 最終発現ベクターを得るために、EcoRV-NotI消化済みpBJ-3ベクター、EcoRV-AvrII可変領域cDNA及びAvrII-NotI定常領域を用いて三重ライゲーションを実行した。重鎖及び軽鎖用の最終発現ベクターはそれぞれpBJ-Y1-HC及びpBJ-Y1-LCと命名した。
【０３６７】
[394.] ピューロマイシン耐性遺伝子(PAC)に基づく二重選択を可能にするため、pBJ-Y1-LCを基礎にして追加ベクターpBJ-Y1-LPを構築した。このベクターではpBJ-Y1-LCベクターのネオマイシン耐性遺伝子がPAC遺伝子に対応する〜1600bpの断片(pMCC-ZPベクターに由来)に置き換わっている。
【０３６８】
[395.] Y1-HC、Y1-LC双方のORFとそれぞれがコードしているアミノ酸配列はSEQ ID NO: 205〜208のとおりである。
【０３６９】
[396.] 下線部がリーダー配列である。V_H及びV_L領域は太字のアミノ酸配列に対応し、その後にはIgG1 (重鎖の場合)又はλ3(軽鎖の場合)定常領域配列が続く。
【０３７０】
[397.] CHO細胞でのY1重鎖及び軽鎖の発現: ベクターpBJ-Y1-HC及びpBJ-Y1-LCを個別に、重鎖又は軽鎖を発現する安定細胞のトランスフェクションと選択に使用した。G418に基づく選択と細胞増殖の後、上清中の分泌タンパク質についてIgG1の発現を、以下述べるようにキャプチャーEIA法及びウェスタンブロット法で解析した。
【０３７１】
[398.] キャプチャーEIA法: 96穴プレートのウェルをマウス抗ヒトIgG1 Fc (Sigma)でコートした。前記の上清をウェルに加え、重鎖IgG1の存在をビオチニル化ヤギ抗γ鎖特異抗体(Sigma)、ストレプトアビジン-HRP及び基質を用いて検出した。ELISAプレートリーダーでA₄₀₅での発色をモニターした。
【０３７２】
[399.] ウェスタンブロット解析: 前記細胞の上清を12.5% SDS-PAGE電気泳動にかけた。各鎖の発現を(a)重鎖検出用のヤギ抗ヒトIgG-HRP (H+L; Sigma Cat #A8667)及び(b)軽鎖検出用のビオチニル化ヤギ抗ヒトλ3鎖(Southern Biotechnology Association, Cat #2070-08)で検出した。
【０３７３】
[400.] 両鎖の発現を上記のアッセイで確認し、コトランスフェクションによりフルサイズY1-IgG1を得た。
【０３７４】
IgG-Y1 の発現と精製
[401.] 細胞培養とトランスフェクション: CHO細胞を、37℃、5% CO₂雰囲気中、10%ウシ胎仔血清と40μg/mlゲンタマイシンとを添加したF-12培地で培養した。トランスフェクションの1日前に、0.8〜1×10⁶細胞を90mmディッシュに植え込んだ。培養細胞に10μgの軽鎖及び重鎖DNAをFuGene (Roche)トランスフェクション試薬法でコトランスフェクションした。非選択培地で2日間増殖後、550μg/mlネオマイシンと3μg/mlピューロマイシンとを添加したF-12培地で細胞を10〜12日間培養した。細胞をトリプシン処理し、Costar 96穴プレートを用いて細胞0.5個/ウェルの限界希釈法でクローニングした。個別コロニーを取り出し、6穴ディッシュで増殖させ、フラスコに移した。
【０３７５】
[402.] 重鎖及び軽鎖分泌の測定: トランスフェクションしたCHO細胞の上清中に分泌された抗体の濃度をサンドウィッチELISA法で測定した。抗体濃度の測定には以下の試薬を使用した: コート抗体としてのモノクローナル抗ヒトIgG1(Fc) (Sigma)、検出試薬としてのヤギ抗ヒトIgG (γ鎖特異的)ビオチンコンジュゲート(Sigma)、及びスタンダードとしての純粋ヒトIgG1λ (Sigma)。このELISA法によれば産生速度は3〜4μg/mlの範囲であった。
【０３７６】
[403.] MAbの細胞からの産生と精製: 細胞をローラーボトルにより、10%ウシ胎仔血清とネオマイシン及びピューロマイシンを添加したF-12培地中で終濃度1〜2×10⁸細胞/ボトルとなるまで増殖させた。産生用として、細胞を同じ培地(ただし2%ウシ胎仔血清を添加)でさらに2日間培養した。
【０３７７】
[404.] 分泌抗体をProtein G-Sepharoseカラム(Pharmacia)で精製した。結合には20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0を、溶離には0.1Mグリシン緩衝液pH 2.5-3.0をそれぞれ用いた。精製抗体の量はUV吸光度法で求め、純度はSDS-PAGE電気泳動で分析した。非変性条件下では全IgG抗体は期待分子質量が160kDである。変性ゲル中では重鎖、軽鎖の期待サイズはそれぞれ55kD、28kDである。
【０３７８】
[405.] フルサイズIgG-Y1分子の結合: IgG-Y1分子とscFv-Y1分子の結合レベルを比較測定するために結合実験を行った。二段階染色法を採用して、5ngのIGG-Y1をRAJI細胞(陰性対照、図44-47a)及びJurkat細胞(Y1陽性細胞、図44-47b 及び 44-47c)の両方と反応させた。検出にはPE標識ヤギ抗ヒトIgGを使用した( 図 44-47c)。同様に、1μgのscFv-Y1をJurkat細胞と反応させ(図44-47b)、またPE標識ウサギ抗scFvを検出に使用した。IgG-Y1もscFv-Y1もJurkat細胞に結合するが、scFv-Y1ではIGG-Y1と同程度の検出レベルを実現するには約10³倍の量が必要になるとの結果が出た。
【０３７９】
実施例 6: 全 IgG-Y1 抗体由来の Fab 及び F(ab ’ ) ₂ フラグメントの調製
細胞培養と一過性トランスフェクション
[406.] CHO細胞を、37℃、5% CO₂雰囲気中、10%ウシ胎仔血清と40μg/mlゲンタマイシンとを添加したF-12培地で培養した。トランスフェクションの1日前に、1〜1.5×10⁶細胞を90mmディッシュに植え込んだ。培養細胞に、それぞれ別個の真核発現系に収めたY1抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする10μgのDNAをコトランスフェクションした。トランスフェクションにはFuGene (Roche)トランスフェクション試薬法を用いた。
【０３８０】
[407.] 非選択増殖培地で2日間増殖後、550μg/mlネオマイシンと3μg/mlピューロマイシンとを添加したF-12培地で細胞を10〜12日間培養した。細胞をトリプシン処理し、Costar 96穴プレートを用いて細胞0.5個/ウェルの限界希釈法でクローニングした。個別コロニーを取り出し、6穴ディッシュで増殖させ、フラスコに移し(発現レベルと増殖培地中抗体分泌レベルを測定するための)さらなる選択に回した。
【０３８１】
細胞培養と長期トランスフェクション
[408.] CHO細胞を、37℃、5% CO₂雰囲気中、10%ウシ胎仔血清と40μg/mlゲンタマイシンとを添加したF-12培地で培養した。トランスフェクションの1日前に、0.8〜1×10⁶細胞を90mmディッシュに植え込んだ。培養細胞に、CMV(サイトメガロウィルス)プロモーターの支配下にクローニングしたY1抗体の軽鎖及び重鎖をコードする10μgのDNAとsv-40プロモーターの支配下にクローニングしたdhfr遺伝子とをコトランスフェクションした。トランスフェクションはFuGene (Roche)トランスフェクション試薬法で行った。非選択培地で2日間増殖した後、100nM〜5μMメトトレキサート(MTX)と透析処理したウシ胎仔血清とを含む培地で細胞を培養し、(限界希釈法後に)全Y1抗体を一段と高レベルに発現するクローンを選択した。
【０３８２】
重鎖及び軽鎖分泌の測定
[409.] トランスフェクションしたCHO細胞の上清中に分泌される抗体の濃度を測定するためにサンドウィッチELISA法を確立した。抗体濃度の測定には以下の試薬を使用した: コート抗体としてのモノクローナル抗ヒトIgG1(Fc) (Sigma)、検出試薬としてのヤギ抗ヒトIgG (γ鎖特異的)ビオチンコンジュゲート(Sigma)、及びスタンダードとしての純粋ヒトIgG1λ (Sigma)。
【０３８３】
MAb の細胞からの産生と精製
[410.] 細胞をローラーボトルにより、(前述のように)10%ウシ胎仔血清とネオマイシン及びピューロマイシンを添加したF-12培地中で終濃度1〜2×10⁸細胞/ボトルとなるまで増殖させた。抗体産生用として、細胞を同じ培地(ただし2%ウシ胎仔血清)でさらに2日間培養した。
【０３８４】
[411.] 分泌抗体をProtein G-Sepharoseカラム(Pharmacia)とイオン交換カラム-Q Sepharose(Pharmacia)で精製した。結合には20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0を、溶離には0.1Mグリシン緩衝液pH 2.5-3.0をそれぞれ用いた。精製抗体の量はUV吸光度及びELISA法で求め、純度はSDS-PAGEとHPLCで分析した。非変性条件下では全IgG抗体は期待分子質量が160kDである。変性ゲル中では重鎖、軽鎖の期待サイズはそれぞれ55kD、28kDである。
【０３８５】
Y1 IgG の Fab 及び F(ab ’ ) ₂ フラグメントへの断片化
[412.] IgG分子は2個の同じ軽鎖と2個の同じ重鎖からなる。これらの軽鎖及び重鎖は非共有的相互作用と共有結合(ジスルフィド結合)の組合せによりまとめられて折りたたみ構造(ドメイン)をなす。軽鎖は1つの可変ドメインと1つの定常ドメインからなる。重鎖は1つの可変ドメイン(V_H)と3つの離れた定常ドメイン(CH 1、2及び3)からなる。重鎖定常ドメイン1(CH1)と重鎖定常ドメイン2 (CH2)の間の「ヒンジ」領域は酵素によるタンパク質分解作用を受けやすい。このヒンジ領域の切断によりFab又はF(ab’)₂フラグメントとFcフラグメントが生じる。Fabフラグメントは原型IgG分子の抗原結合能を保持するが、非特異的結合能は低い。Fabフラグメントは、エフェクター機能を欠く抗原結合能が求められるような状況に最適である。
【０３８６】
[413.] Fab及びF(ab’)₂フラグメントは診断又は治療薬としてin vivoで使用される。がん化学療法薬を、すべての細胞を傷害する薬剤ではなく腫瘍特異的薬剤にするには、薬剤を腫瘍の細胞表面抗原に結合する抗体に連結すればよい。原型IgGの使用ではなくFab又はF(ab’)2フラグメントの使用には次のような利点がある。
【０３８７】
[414.] (1)フラグメントは容易に毛管を通過し組織表面に拡散しうる。
【０３８８】
[415.] (2)コンジュゲートを結合していないフラグメントは同様の原型IgGよりもすみやかに排泄されよう。従って、ターゲット領域に到達するフラグメント-治療薬の量が多くなろう。
【０３８９】
Fab フラグメント調製の詳細手順
[416.] システインHCl濃度2mg/ml [F(ab’)2フラグメント調製用]及び20mg/ml (Fabフラグメント調製用)の消化用緩衝液を入れた2ml固定化フィシン・カラムに精製Y1抗体1mgを添加し、37℃で5時間(Fabの場合)及び20時間[F(ab’)の場合]反応させた。ImmunoPure結合用緩衝液4mlで消化物を溶離することにより反応を停止させた。Protein Aカラムと結合用緩衝液を使用して未消化IgG及びFcフラグメントからFab又はF(ab’)フラグメントを通過液として分離した。280nmでの吸光度を読み取ることで、フラグメントを含むピーク画分を集めた。10kDa又は30kDaをカットオフ分子質量とするマイクロコンセントレーターでフラグメントを濃縮しPBSに対して透析した。タンパク質の回収、純度測定及び解析は280nmでの吸光度、ゲル電気泳動及びHPLCで行った。
【０３９０】
細胞抽出物 ( 溶解物 ) の調製
[417.] 2×10⁶個の細胞を回収しマイクロ遠心機にかけた(1300rpm、4℃、5分間)。洗浄のため、ペレットに0.5〜1 ml PBS+piを加え静かに混合した。混合液を前述の要領で遠心した。0.5〜1 ml PBS+piによる洗浄を繰り返し、混合液を前述の要領で遠心した。ペレット化した細胞を溶解用緩衝液に再懸濁した(200μl/20×10⁶個細胞ペレット)。使用緩衝液は50mM Tris pH 7.4、1mM PMSF、1%NP-40及び1mM EDTAであるが、他の好適な緩衝液でもよい。懸濁液を氷上で約30分間インキュベートし、次いで遠心にかけた(3000rpm、4℃、5分間)。上清を回収して一定量に分割した。
【０３９１】
粗製膜画分の調製と膜タンパク質の抽出
[418.] 凝縮細胞に対し20倍量のホモジナイズ緩衝液を加えた。使用ホモジナイズ緩衝液は2%(w/v) Tween 20、1mM MgSO₄、2mM CaCl₂、150mM NaCl及び25mM Tris-HCl、pH 7.4であった。以下のプロテアーゼインヒビターを添加した: 1mM PMSF、5μg/mlロイペプチン及び5μg/mlアプロトニン。回転式Teflonペスル(Ultra Torex)付Potter-Elvehjemホモジナイザーで3〜5ストロークして細胞をホモジナイズした。試料はホモジナイズ処理時に保冷し続け、次いで氷浴で1時間かき混ぜた。ホモジナイザーで試料にさらに数ストローク加え、次いで試料を3000×g、4℃で30分間遠心した。上清を回収し、45000×g (19000rpmローターss-34)、4℃で1時間遠心した。上清を棄て、ペレットに50mM Tris pH 7.4、1mM EDTA、1%NP-40及びプロテアーゼインヒビターの溶液を加え、溶解ペレットを1時間氷上においた。
【０３９２】
HPLC による膜画分の精製
[419.] RPCカラム(Pharmacia Type PLRP-S 300A)を使用して膜画分を精製した。使用緩衝液は(A) 20mM Tris pH 8.0及び(B) 60%プロパノール+DDWである。流速は1ml/分としたが、洗浄ステップだけは2ml/分とした。全手順は周囲温度で実行した。
【０３９３】
[420.] Jurkat又はKG-1膜画分の免疫沈降(IP)後の溶出試料に、緩衝液Aで1:4希釈した試料緩衝液(62mM Tris pH 6.8、10%グリセリン、3%SDS、720mMメルカプトエタノール)を加えた。
【０３９４】
[421.] 試料をカラムに送り、通過液を回収した。カラムを緩衝液(A)で、流れの吸光度がゼロに下がるまで洗った。
【０３９５】
[422.] 次のプログラムに従ってカラムからタンパク質を溶離した: 80% (A)で5分間、次いで(A) 80-0%、(B) 20-100%のグラジエント40分間。次に第2グラジエントをかけて溶離液の組成を80% (A)とし、この組成を用いてカラムをさらに5回洗った。溶出液をフラクションコレクターで1mlずつ分画しながら回収した。
【０３９６】
[423.] 試料をSpeed-Vacエバポレーターで蒸発濃縮し、SDS-PAGEとウェスタンブロット解析で分析した。
【０３９７】
Q Sepharose カラムによる正常ヒト血漿の精製
[424.] 5mlの正常ヒト新鮮凍結血漿を開始緩衝液で1:10希釈し、0.45μmシリンジフィルター(Sartorius, cat #16555)でろ過した。開始緩衝液はプロテアーゼインヒビター(5μg/mlロイペプチン、5μg/mlアプロチニン及び1mM PMSF)を含む20mM Tris-HClである。
【０３９８】
[425.] 5ml HiTrap Q Sepharoseカラム(Amersham Pharmacia, cat #17-1154-01)をP-1ペリスタポンプ(Amersham Pharmacia)に取り付けた。カラムをメーカープロトコールに従って約4ml/分の流速で洗った。希釈ろ過血漿をカラムに通し、通過液を回収した。カラムを20容積分の0.3M NaCl/開始緩衝液で洗った。タンパク質を0.6M、0.8M及び1.0M NaCl/開始緩衝液で溶離した。溶離液量はそれぞれ50、20及び20mlであった。全手順は4℃で実施した。
【０３９９】
[426.] 溶出画分を二次元SDS-PAGEにかけ、次いでビオチニル化Y1及び陰性対照としての抗体181を使用するウェスタンブロット解析にかけた。0.6M NaCl溶出画分からはフィブリノゲンγ’が検出された。1.0M NaCl溶出画分には補体複合体4 (CC4)、ルミカン、プロトロンビン及びインターαインヒビターが含まれていた。
【０４００】
HPLC カラムによる正常ヒト血漿の精製
[427.] Q Sepharoseで精製した正常ヒト血漿を次の物質と、記載の終濃度となるよう混合した: 尿素(終濃度8M以上)、DTT (終濃度30mM)及びTFA (終濃度0.1%)。
【０４０１】
[428.] 精製血漿溶液を3ml RPCカラム(Amersham Pharmacia)に送り、通過液を回収した。カラムを緩衝液(A)で、流れの吸光度がゼロに下がるまで洗った。次のプログラムに従ってカラムからタンパク質を溶離した: 90% (A)で5分間、次いで(A) 90-0%、(B) 10-100%のグラジエント40分間。次に第2グラジエントをかけて溶離液の組成を90% (A)とし、この組成を用いてカラムをさらに5回洗った。使用緩衝液は(A) 0.1% TFA/DDW及び(B) 80% CANと0.1% TFA/DDWである。流速は1ml/分としたが、洗浄ステップだけは2ml/分とした。
【０４０２】
[429.] 溶出液をフラクションコレクターで1mlずつ分画しながら回収した。全手順を周囲温度で実施した。
【０４０３】
[430.] 試料をSpeed-Vacエバポレーターで蒸発濃縮し、SDS-PAGEとウェスタンブロット解析で分析した。
【０４０４】
非標識 CD162 抗体との間接免疫ブロット法
【０４０５】
Y1 受容体のウェスタンブロット解析−ブロット後のフィルターの処理
[431.] ニトロセルロースフィルターを5%スキムミルクにより室温で1時間ブロッキングした。次いでフィルターを0.05% Tween /PBSにより室温で3回、各5分間洗った。フィルターを2%スキムミルク/PBS中、室温で1時間、Y1-ビオチン(又は181-ビオチン) 5μg/mlとインキュベートした。次いでコールドルーム(約4〜10℃)でフィルターを冷0.05% Tween 20/PBSにより3回、各5分間洗った。次いでフィルターをコールドルームで、2%スキムミルク+ 0.05% Tweenで1:1000希釈したSAV-HRP(ストレプトアビジン-HRP)溶液とインキュベートした。希釈は室温(約25℃)で行い、希釈したSAV-HRPを10〜15分間氷冷してから使用した。インキュベーションは静かに撹拌しながら1時間行った。SAV-HRPとのインキュベーション後、フィルターを前述の要領で洗った。次いでフィルターをSuper Signal混合液(Pierce)と5分間、メーカープロトコールに従ってインキュベートし、次いで過剰液を乾燥除去した。フィルターをX線フィルム(富士写真フィルム)に露光した後、フィルムを現像した。
【０４０６】
実施例 7: 組換えグリコカリシンの原核系による発現
[432.] グリコカリシン(GC、GPIbαのアミノ酸1〜アミノ酸493)をIPTG誘導性原核ベクターカセット中にクローニングした。この新規構築プラスミドを収めたE. coli (BL21 DE3)細胞を37℃で吸光度0.7〜0.8まで増殖させ、次いで発現誘導用IPTGの存在下に37℃で3時間増殖させた。
【０４０７】
[433.] 半精製したヒト血小板由来グリコカリシン(GC)又は発現誘導又は非誘導細胞に由来するE. coli細胞溶解物(総体)を電気泳動した後のSDS-ポリアクリルアミドゲルを解析した。ビオチニル化Y1-scFv、ウサギ抗ヒトGCポリクローナル抗体、市販マウス抗ヒトCD42モノクローナル抗体(SZ2 Immunotech、PM640 Serotec、HIP1 Pharmigen、AN51 DAKO)及びGPIbαのN末端へのポリクローナル抗体(S.C.-7071、Santa Cruz)を用いてウェスタンブロット解析を行った。
【０４０８】
[434.] 2つのポリクローナル抗体は細菌由来組換えグリコカリシンとヒト血小板由来天然グリコカリシンの両方を認識した。Y1-scFvと市販抗体はヒト由来天然グリコカリシンを認識したが、細菌由来組換え血小板グリコカリシンを認識しなかった(図45)。
【０４０９】
[435.] 原核生物(たとえばE. coli)系は翻訳後修飾機構たとえばグリコシル化及び硫酸化機構を欠く。従って、細菌に産生させたグリコカリシンをY1-scFvが認識しないことはグリコシル化や硫酸化などの翻訳後修飾がグリコカリシンへのY1-scFvの結合には不可欠であるとの結論を裏付ける。
【０４１０】
血液 / 骨髄試料に関する FACS プロトコール
[436.] 試料は病院から提供を受ける。患者試料30μl/チューブ。5μl/チューブのCD33-APC(AML場合)又はCD19-APC(B-CLLの場合)又はCD38-APC(多発性骨髄腫の場合)を加える。5μl/チューブのCD45-PerCp及び5μlのscFv-Y1又は対照scFv-N31又はCD162-PE(KPL1)を加える。チューブを4℃で30分間、ゆっくり振とうしながらインキュベートする。2ml PBSを加えて洗い、1200rpmで5分間遠心する。上清を棄てる。
【０４１１】
[437.] ワンステップアッセイの場合には次の溶解ステップに進む:
【０４１２】
[438.] ddH₂O(患者試料に300μl)で1:10希釈した500μl BDリシン溶液を加える。高速でボルテックスし、4℃で12分間インキュベートする。前述の要領で洗う。上清を棄て500μl PBSを加える。国際規格に従った血液試料データ収集セットアップを使用してFACSで試料を読み取る。
【０４１３】
[439.] 2以上のアッセイの場合: ワーキングバッファーはPBS+1% BSA+0.05%アジ化ナトリウムである。インキュベーションと洗浄は前述のとおり。
【０４１４】
[440.] 赤血球の溶解は本アッセイの最終ステップであり、あとは500μl PBSに再懸濁する。
【０４１５】
実施例 8: トライアボディーの構築
[441.] 原Y1をコードするベクターpHEN-Y1を、V_L、V_H両領域を個別に対象とするPCRにより増幅した。V_L-PCRにはセンス鎖オリゴヌクレオチド5’-AACTCG AGTGAG CTGACA CAGGAC CCTとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド5’-TTTGTC GACTCA TTTCTT TTTTGC GGCCGC ACCを使用した。期待サイズ〜350bpの産物cDNAを増幅し、配列解析し、XhoI及びNotI制限酵素で消化した。
【０４１６】
[442.] 同じ手順でV_H領域を増幅した(センス鎖オリゴヌクレオチド5’-ATGAAA TACCTA TTGCCT ACGGとアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド5’-AACTCG AGACGG TGACCA GGGTAC Cを使用)。V_H-PCR産物をXhoI及びNotI制限酵素で消化した。NcoI-NotIで消化済みのpHENベクターへの三重ライゲーションを実施した。最終ベクターをpTria-Y1と命名した。
【０４１７】
[443.] E. coliの形質転換後、数クローンを選び出してさらなる解析によりDNA配列、タンパク質発現、細菌の細胞周辺腔からの抽出などを確認した。Y1トライアボディーのサイズの確認には還元条件下でのSDS-PAGE及びウェスタンブロット解析を行った。
【０４１８】
実施例 9: ダイアボディーの構築
[444.] 実施例8に由来するpTria-Y1ベクターをXhoI制限酵素で線状化し、2本の相補的合成オリゴヌクレオチド(5’-TCGAGA GGTGGA GGCGGTと5’-TCGAAC CGCCTC CACCTC)をプレアニール後に、Y1の重鎖と軽鎖の間のXhoI部位にライゲートした。この新しいベクターはpDia-Y1と命名した。トライアボディーの場合と同様にして、DNA配列とタンパク質の発現を確認した。
【０４１９】
実施例 10: ダイアボディーとトライアボディーの発現と精製
[445.] E. coliでの発現は本質的に、scFv-Y1に関する説明と同じであった。しかし、形質転換E. coliの周辺質由来Y1ダイアボディー及びトライアボディーの精製は異なった。scFv-Y1単量体型はタンパク質A Sepharoseビーズのアフィニティーカラムで精製することができる。しかし、多量体型Y1にはこの方法での精製は無効である。そこで細菌から抽出した周辺質タンパク質を60%硫酸アンモニウムで一晩沈殿させ、H₂Oに再懸濁し、0.1×PBSで予め平衡化したSephacryl-200 (Pharmacia)サイズ排除カラムに添加した。画分を回収し、HPLCで分析し、また二量体又は三量体を含む別個の画分を回収してFITC標識とFACS解析に回した。
【０４２０】
実施例 11: Y1 ダイアボディー及びトライアボディーの細胞への結合
[446.] 「三段階染色法」を用いてJurkat細胞のFACS解析を行った。まず粗製抽出物又は精製未標識scFvを、次いでマウス抗myc抗体を、最後にFITC-又はPE-結合抗マウス抗体を、それぞれ染色した。FACS解析には、PBS+1% BSAに再懸濁した5〜8×10⁵個の細胞が必要である。結合は4℃で1時間行った。各ステップ後に細胞を洗いPBS+1% BSAに再懸濁した。最終染色ステップ後、細胞をPBS、1%BSA、2%ホルムアミドに再懸濁して固定し、次いでFACS(Becton-Dickinson)で読み取った。
【０４２１】
[447.] Y1-scFvの結合をダイアボディー及びトライアボディーの結合と比較した。この解析では3つのY1型すべての結合プロフィールがきわめて類似していた。これは、前述のようなY1改変がY1のリガンドへの見掛け結合アフィニティーを変更、隠蔽又は破壊しないことを示唆する。
【０４２２】
実施例 12: 放射受容体測定による KG-1 細胞への S-S Y1 二量体のアフィニティーの、 CONY1 及び Y1-IgG との比較研究
[448.] この測定では、クロラミンTを使用してY1-IgG構成体又はBolton-Hunter(CONY1)試薬を¹²⁵Iでヨウ化して調製した放射性リガンドを使用した。測定用チューブには0.2mlあたり5×10⁶個のKG-1細胞と標識トレーサー+可変量の無標識競合物質とをPBS+0.1%BSA (pH 7.4)中に混ぜたものを入れた。かき混ぜながら4℃で1時間インキュベートした後、細胞を冷緩衝液で十分に洗い、放射能測定に回した。
【０４２３】
[449.] 放射受容体測定(RRA)には2ng/チューブの¹²⁵I-Y1-IgGを使用し、3分子それぞれとの競合を行わせた。結果は図46のとおりである。図が示すようにS-S Y1二量体はアフィニティーが全Y1抗体の大半よりも低く(2分の1)、またCONY1よりも30倍高かった。この実験ではY1-IgGのアフィニティー概算値は2×10^-8Mである。従って、対応する二量体のアフィニティーは4×10^-8Mである。
【０４２４】
[450.] 標識CONY1を使用した第2のRRAでは、100ng/チューブの¹²⁵I-Y1-IgGを使用し、3分子それぞれとの競合を行わせた。結果は図46のとおりである。図が示すようにS-S二量体はCONY1と比べてアフィニティーが20倍高かった。この実験ではCONY1のアフィニティー概算値は10^-6Mである。従って、対応する二量体のアフィニティーは5×10^-8Mである。
【０４２５】
実施例 13: Y1-cys-kak ( システイン二量体 ) の生産
[451.] 1リットルのλpL-yl-cys-KAK培養菌を42℃で2〜3時間誘導した。培養菌を5000rpmで30分間遠心した。ペレットを180mlのTE (50mM Tris-HCl pH 7.4、20mM EDTA)に再懸濁した。8mlのリゾチーム(5mg/mlストックに由来)を加え、1時間インキュベートした。20mlの5M NaClと25mlの25% Tritonを加え、さらに1時間インキュベートした。この混合液を4℃、13000rpmで60分間遠心し、上清を棄てた。ティッシュマイザー(又はホモジナイザー)を利用してペレットをTEに再懸濁した。この手順を封入体(ペレット)が灰/茶褐色になるまで3〜4回反復した。封入体を6MグアニジンHCl、0.1M Tris pH 7.4、2mM EDTAで可溶化した(1.5g-封入体/10ml-可溶化緩衝液から〜10mg/mlの可溶化タンパク質を得た)。これを少なくとも4時間インキュベートした。タンパク質を濃度測定して10mg/mlの濃度とした。DTTを加えて終濃度を65mMとし室温で一晩インキュベートした。タンパク質の再生を、10mlのタンパク質を0.5Mアルギニン、0.1M Tris pH 8、2mM EDTA、0.9mM GSSGを含む溶液に滴下して希釈することにより開始した。再生溶液を〜10℃で48時間インキュベートした。タンパク質を含む再生溶液を、25mMリン酸緩衝液pH 6と100mM尿素とを含む緩衝液中で透析し、500mlに濃縮した。この透析/濃縮溶液をSP-Sepharoseカラムに結合させ、NaClの(1Mまでの)グラジエントで溶出した。
【０４２６】
実施例 14: グリコカリシン (GC) への ELISA
[452.] 100mlの精製グリコカリシンを96穴平底MaxiSorpプレートにより4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBST (PBS+ 0.05% Tween)で3回洗い、次いで200mlのPBST-ミルク(PBST+ 2%脱脂乳)を室温で1時間にわたり添加した。プレートをPBSTで洗い、単量体又は二量体(100ml)を種々の濃度のPBST-ミルクに室温で1時間にわたり添加した。次いでプレートを洗い、(PBST-ミルクに1:100希釈した)抗V_Lポリクローナル抗体(Y1由来V_Lで免疫したウサギに由来)を1時間にわたり添加した。プレートを洗い、抗ウサギHRP抗体をさらに1時間にわたり添加した。プレートを5回洗い、100μl TMB基質を約15分間にわたり添加し、次に100μlの0.5M H₂SO₄を加えて反応を止めた。プレートの450nmでの吸光度をELISAリーダーで測定した。
【０４２７】
実施例 15: 組換えグリコカリシン (GC) の E. coli による発現
【０４２８】
[453.] scFv及び市販抗体のGCへの結合にはグリコシル化や硫酸化などの翻訳後修飾が不可欠である。原核(E. coli)系はグリコシル化や硫酸化などの翻訳後修飾機構を欠く。
【０４２９】
実施例 15: Y1 四量体の生産
[454.] Y1のC末端にPCRにより配列LNDIFEAQKIEWHEを付加した構成体を消化して、IPTG誘導性発現ベクターカセットにクローニングした。このクローンはY1-Biotagと命名した。この配列は酵素BirAの基質であり、該酵素は遊離ビオチンの存在下にビオチンをリシン(K)残基に共有結合させることができる(Altman JD et a., 「抗原特異的Tリンパ球の表現型分析」Phenotyic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science, 1996 Oct 4, 274 (5284): 94-6)。この構成体はBL21細菌細胞で封入体として産生された。タンパク質の再生を前述の要領で行った。封入体をグアニジン-DTTで可溶化した。再生はアルギニン-トリス-EDTAを含む緩衝液による希釈によって行った。透析、濃縮の後、HiTrapQイオン交換カラムで精製した。
【０４３０】
[455.] 精製Y1-biotag scFvをBirA酵素(Avidityより購入)及びビオチンと、メーカーの助言に従ってインキュベートした。ビオチニル化Y1-biotagを(分子あたりビオチン量を推計する)HABA試験で分析すると、およそ>0.8ビオチン残基/分子の存在が判明した。
【０４３１】
[456.] ビオチニル化Y1-biotagをストレプトアビジン-PE(フィコエリトリン)とインキュベートして複合体を形成し、また(Y1陽性) KG-1細胞によるFACS実験に使用した。結合感度はアビディティーの上昇により少なくとも100倍増大した。ストレプトアビジンからは4つのビオチニル化Y1-biotag分子が形成されうる。
【０４３２】
[457.] Y1-biotagの配列(SEQ ID NO:211)は次のとおりである:
1 MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
41 APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL
81 YLQMNSLRAE DTAVYYCARM RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG
121 SGGGGSGGGG SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
161 YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA
201 SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNNVVFG GGTKLTVLGG
241 GGLNDIFEAQ KIEWHE
【０４３３】
実施例 16: Y17 活性の解析
[458.] Pastoral haemolyticaに由来しヒト血小板GPIbを選択的に切断する酵素、O-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼを使用して、GPIbαへのY17の結合特異性の評価を試みた。O-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼはシアリル化したO結合型グリカンを含むタンパク質だけを特異的に切断し、N結合型糖タンパク質又は非グリコシル化タンパク質を切断しない。この酵素は、高度にO-グリコシル化したGPIbを切断するがGPIIb-III aや血小板表面の他受容体は切断しないと報告されている。免疫ブロット解析やFACS解析で示されたように、GPIbを切断したO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼを洗浄血小板とインキュベートするとY17も、GPIbαへのモノクローナル抗体(MCA466S、Serotec)も、GPIbに結合しなくなる。これらのエンドプロテアーゼはGPIIb/III aへの(抗CD61)モノクローナル抗体の結合能には変化を及ぼさなかった(図4)。
【０４３４】
実施例 17: 血小板 GPIb 上の Y17 エピトープの同定
[459.] 血小板GPIb上のY17エピトープの同定への興味深いアプローチでは、血小板GPIb上の切断部位が十分に解明されているエンドプロテアーゼ酵素を使用する。
【０４３５】
17.1: Y1 エピトープ・マッピングへのモカラギンの効果
[460.] コブラ毒メタロプロテイナーゼのモカラギンは血小板GPIbαを、残基glu-282とasp-283の間の単一部位で特異的に切断し、2つの安定生成物すなわち上清中に検出される45kDaのN末端側断片(His-1〜Glu-282)と膜に結合した100kDaのC末端側断片を生成する。
【０４３６】
[461.] 洗浄血小板をモカラギンで処理し、血小板溶解物をSDS-PAGEで分離しニトロセルロースに転写した。モカラギン処理した洗浄血小板のY1によるウェスタンブロット解析から、GPIb(135 kDa)に対応するバンドが消失し、N末端側45kDaトリプシン消化断片にY-17が結合していることが判明した。GPIbαのC末端側断片へのモノクローナル抗体MCA466SはC末端側100kDa断片と反応する一方で、GPIbαのN末端を認識するモノクローナル抗体S.C.7071はY1が認識したのと同じN末端側45kDa断片と反応した(図14)。
【０４３７】
[462.] グリコカリシンのモガラギン処理は洗浄血小板で観測された結果と同様の結果をもたらすが、それはY1とモノクローナル抗体S.C.7071がGPIbαのN末端側45kDa切断断片に結合することを示す(図8)。これらの結果はY17に対応するエピトープが配列His-1〜Glu-282内に含まれていることを示唆する。
【０４３８】
17.2: Y17 エピトープ・マッピングへのカテプシン G の効果
[463.] 好中球セリンプロテアーゼのカテプシンGはグリコカリシンを、残基Leu-275とTyr-276の間及び残基Val-296とLys-297の間の2つの部位で切断した。グリコカリシンをカテプシンGで処理すると2つのN末端側断片すなわち小さいほうの42kDa断片(His1〜Leu275)と大きいほうの45kDa断片(His1〜Val296)、それに1つのC末端側〜95kDa断片が生成する。グリコカリシンとカテプシンG消化で生成したグリコカリシン断片とをSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに転写した。Y17は大きいほうの断片(His1〜Val296)に結合したが、小さいほうの断片(His1〜Leu275)には結合しなかった。さらに、His1〜Leu275内のエピトープを認識するモノクローナル抗体S.C.7071は両断片をブロットした(図12)。モカラギン及びカテプシンGによるN末端側消化断片の解析結果は、GPIbαのアミノ酸配列Tyr276〜Glu282がY17結合のための重要な認識モチーフであることを示唆する。
【０４３９】
実施例 18: vWF 依存凝集反応への Y17-scFv の効果
[464.] vWF依存の血小板凝集反応へのY17-scFvの効果を種々のY17濃度で試験した。Y1とは対照的に、Y17は10、25又は50 μg/mlの終濃度ではリストセチン誘発性のvWF依存洗浄血小板凝集反応を阻害しなかった。モカラギン及びカテプシンGによるN末端側消化断片の解析結果は、GPIbαのアミノ酸配列Tyr276〜Glu282がY17及びY1結合のための重要な認識モチーフであることを示唆する。Y17は血小板凝集を阻害しないので、Y1とY17は同じ配列にではなく重複した配列に結合する模様である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
[121.] 図1はGPIbのα鎖上の、エンドプロテアーゼ類による切断部位を示す。
【図２】
[122.] 図2は還元及び非還元条件下での血小板へのY1及びY17の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図３】
[123.] 図3は血小板 GC の各種調製物と KG-1 細胞の膜画分 4 との Y1 の反応性の概略図である。
【図４】
[124.] 図4はO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼで血小板GPIbを切断するとY1、Y17両方が結合しなくなることを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図５】
[125.] 図5はY1とY17がO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼによる切断後の類似のグリコカリシン断片に結合することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図６】
[126.] 図6はGPIbの特異的タンパク質分解によりY1が血小板に結合しなくなることを示すFACS解析の結果である。
【図７】
[127.] 図7はモカラギン切断後の血小板GPIbαのN末端側断片(His1-Glu282)へのY1の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図８】
[128.] 図8はモカラギン切断後のグリコカリシンへのY1とY17の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図９】
[129.] 図9は血小板へのY1とY17の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１０】
[130.] 図10はフィシン(Ficin)分解後のグリコカリシンにY1とY17が同様に結合することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１１】
[131.] 図11はY1がGPIbaαのカテプシンG切断で生成した大きいほうの断片と反応することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１２】
[132.] 図12はY1とY17がGPIbaαのカテプシンG切断で生成した大きいほうの断片と反応することを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１３】
[133.] 図13はグリコカリシンをモカラギンとカテプシンGで切断するとY1が結合しなくなることを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１４】
[134.] 図14はモカラギンとカテプシンGで切断した洗浄血小板溶解物へのY1とY17の結合を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図１５】
[135.] 図15は洗浄血小板の凝集反応のY1-scFvによる阻害を示すグラフである。
【図１６】
[136.] 図16は多血小板血漿中の血小板凝集のY1-scFvによる阻害を示すグラフである。
【図１７】
[137.] 図17は洗浄血小板の凝集反応のY1-IgGによる誘発を示すグラフである。
【図１８】
[138.] 図18は多血小板血漿中の血小板凝集のY1-IgGによる誘発を示すグラフである。
【図１９】
[139.] 図19はELISA法の結果である。
【図２０】
[140.] 図20はY1及びα-CD42 (N1-19)の、それぞれのリガンドへの結合の特異性を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２１】
[141.] 図21は免疫沈降法とRP-HPLCを用いて精製したKG-1細胞膜上のY1-リガンドとのY1の反応性を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２２】
[142.] 図22はY1結合へのO-シアロ糖タンパク質エンドプロテアーゼ切断の効果を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２３】
[143.] 図23はRP-HPLC精製KG-1細胞溶解物及びヘパリン-BSAへのY1結合へのアリールスルファターゼ切断の効果を示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図２４】
[144.] 図24はY1結合の特異性の解析に使用した免疫沈降法の概要である。
【図２５】
[145.] 図25はY1及び抗CD162抗体の、AML患者由来細胞及び正常血液由来細胞への結合を比較したウェスタンブロット解析の結果である。
【図２６】
[146.] 図26は抗体KPL1、PL1及びPL2のY1との競合的結合能を示すFACS解析の結果である。
【図２７】
[147.] 図27はY1結合の特異性を示すFACS解析の結果である。
【図２８】
[148.] 図28もまたY1結合の特異性を示すFACS解析の結果である。
【図２９】
[149.] 図29は各種ペプチドの存在下でのY1結合阻害率を示すグラフである。
【図３０】
[150.] 図30は異なる処置群のマウスの肝重量を示すグラフである。
【図３１】
[151.] 図31は異なる処置群のマウスの骨髄中MOLT細胞率を示すグラフである。
【図３２】
[152.] 図32は異なる処置群のマウスの血中MOLT細胞率を示すグラフである。
【図３３】
[153.] 図33は、 Y1 結合に対するアリール・スルファターゼと Mocarhagin 解裂の効果を示すウェスタン・ブロットを表す。
【図３４】
[154.] 図34は35日目のマウス肝重量(平均±SEM)を示すグラフである。
【図３５】
[155.] 図35は処置の生存効果を示すグラフである。
【図３６】
[156.] 図36は異なる処置群の白血病発生率を示すグラフである。
【図３７】
[157.] 図37は異なる処置群の血中KG-1細胞率を示すグラフである。
【図３８】
[158.] 図38は実験動物の骨髄中KG-1細胞率を示すグラフである。
【図３９】
[159.] 図39はマウスへの¹²⁵I-CONY1静注後の血漿中TCA沈殿放射能の薬物動態を示すグラフである。CONY1の配列はSEQ ID NO: 204として示す。
【図４０】
[160.] 図40はマウスへの¹²⁵I-CONY1静注後の種々の器官/組織の比放射能を示すグラフである。
【図４１】
[161.] 図41はマウスへの¹²⁵I-CONY1静注後の種々の器官/組織の放射能分布を示すグラフである。
【図４２】
[162.] 図42はY1-cys-kakのSuperdex 75カラム溶出プロフィールである。
【図４３】
[163.] 図43は還元、非還元条件下での単量体と二量体のサイズ比較である。
【図４４】
[164.] 図44はIgG-Y1分子とscFv-Y1の結合レベルの比較を示すFACS解析結果である。
【図４５】
[165.] 図45はY1及び他抗体の、天然ヒト血小板由来グリコカリシン及びE. coli産生組換えグリコカリシンへの結合レベルを示すウェスタンブロット解析の結果である。
【図４６】
[166.] 図46はY1単量体、Y1 scFv (CONY1)及びY1 IgGの結合比較である。
【図４７】
[167.] 図47はY1ジスルフィド結合二量体とY1 scFv (CONY1)の結合比較である。
【図４８】
[168.] 図48はY1-IgGの重鎖(HC)と軽鎖(LC)のアミノ酸/ヌクレオチド配列である。Y1-HCのヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム(ORF)(SEQ ID NO: 205)、Y1-HCのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 206)、Y1-LCのヌクレオチド配列のORF (SEQ ID NO: 207)及びY1-LCのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 208)を示す。
【図４９】
[169.] 図49はTM1のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 209)である。
【図５０】
[170.] 図50はY16 scFvのアミノ酸/ヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 210)である。
【図５１】
[171.] 図51はY1 Biotagのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 211)である。
【図５２】
[172.] 図52はY1-cys-KAK scFvのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 212)である。Title: Isolated molecule comprising an epitope comprising a sulfated moiety, antibody against said epitope, and use thereof
[Claim of claim]
1. The following formula:
[Chemical formula 1]

(In the formula,
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Chemical formula 2]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  q is 1 to 6,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
Where, if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; if q = 1 then r = 1 and if q> 1 one or more Ys are sulfated Further, the isolated epitope comprises an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 20 Antibodies, fragments or complexes with hypervariable regions may be bound. )
An isolated epitope comprising
2. The isolated epitope of claim 1, wherein the sulfated moiety is a peptide conjugate or a glycoconjugate or a lipoconjugate.
3. A peptide conjugate of W wherein G is glycine and Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamic acid, gamma carboxy glutamic acid or aspartic acid, q is 1, 2 or 3 The isolated epitope of claim 1 which is 3.
4. The isolated epitope of claim 3, wherein Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3 and r is 1.
5. The following formula:
[Chemical formula 3]

(In the formula,
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Chemical formula 4]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
Where, if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; and one or more Y are sulfated; furthermore, the isolated epitope is SEQ ID NO: 8 or SEQ An antibody having a first hypervariable region comprising ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof may bind. )
An isolated epitope comprising
6. The isolated epitope of claim 5, wherein the sulfated moiety is a peptide conjugate or a glycoconjugate or a lipoconjugate.
7. A peptide conjugate of W is glycine and Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamic acid, gamma carboxyglutamic acid or aspartic acid, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, 6. The isolated epitope of claim 5, which is serine or glycine.
8. The isolated epitope of claim 7, wherein Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3 and r is 1.
9. The following formula:
[Chemical formula 5]

(In the formula,
  G is glycine,
  E is glutamate,
  D is aspartic acid,
  Y is tyrosine,
  S is a sulfate or sulfate molecule,
  X is any amino acid other than the above,
  z is 0, 1 or 2;
  t is 1, 2 or 3 and
  r is 0 or 1;
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But where one or more Y's are sulfated; m> 0 if n = 0; n> 0 if m = 0; furthermore, the isolated epitope is SEQ ID NO: 8 or SEQ ID An antibody having a first hypervariable region comprising NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof may bind. )
An isolated epitope comprising
10. The isolated epitope of claim 9, wherein r is 1.
11. The method according to claim 1, wherein the natural moiety which may be sulfated Y comprises lipids, carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins, and / or lipopolysaccharide molecules. Isolated epitope.
12. A homologue or mimetic of the isolated epitope of any one of claims 1 to 10.
13. An isolated epitope according to any one of the preceding claims, which comprises one or more post-translational modifications in addition to the sulfation.
A composition comprising the isolated epitope of any one of claims 1 to 10.
15. The composition of claim 14, further comprising an upstream or downstream region capable of improving the binding ability of the epitope.
16. The composition of claim 15, wherein the upstream or downstream region is adjacent to the epitope.
17. An isolated nucleotide encoding at least a portion of the isolated epitope of any one of claims 1-10.
18. An antibody capable of binding or cross-reacting with the isolated epitope of claim 1, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
19. An antibody capable of binding or cross-reacting with the isolated epitope of claim 5, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
20. An antibody capable of binding or cross-reacting with the isolated epitope of claim 9, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
21. An antibody capable of binding or cross-reacting with the isolated epitope according to any one of claims 2 to 4, 6 to 8 or 10 to 13, an antigen binding fragment thereof, or one or more antibodies or binding thereof Its complex containing sexual fragments.
22. An antibody capable of binding or cross-reacting with the isolated epitope according to any one of claims 1 to 13, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof A method of producing,
(a) preparing a phage display library;
(b) preparing the isolated epitope of any one of claims 1 to 13;
(c) panning the phage display library to pick out phage particles displaying oligopeptides or polypeptides capable of binding to the isolated epitope;
(d) producing an antibody comprising said oligopeptide or polypeptide capable of binding to said isolated epitope, a binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof
How to include the steps.
An antibody capable of binding to the scFv antibody fragment of SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 203, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
24. An antibody capable of binding to a peptide or polypeptide characterized by having a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or one or more thereof Antibody or its conjugate comprising a binding fragment thereof.
25. The method of claim 23, wherein the peptide or polypeptide has a second hypervariable region comprising SEQ ID NO: 115 and / or a third hypervariable region comprising SEQ ID NO: 114. 24. The antibody of any one of 24, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
26. An antibody, antibody binding fragment, or 1 capable of binding to a peptide epitope or polypeptide epitope of about 3 to 126 amino acid residues in length comprising two or more acidic amino acids and one or more sulfated tyrosines. A complex comprising the above antibody or a binding fragment thereof.
27. The antibody, antibody binding fragment, or one or more antibodies or binding fragments thereof according to claim 26, characterized in that the epitope further comprises a proline, leucine, isoleucine, serine, glycine or phenylalanine residue. Including its complex.
28. The method according to claim 23, characterized in that the antibody or antigen binding fragment thereof is further capable of binding to an epitope on carbohydrate, peptide, glycolipid, glycoprotein, lipoprotein and / or lipopolysaccharide molecule. 27. The antibody of any one of 27, an antibody binding fragment, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
29. The antibody of claim 28, further characterized in that the epitope on carbohydrate, peptide, glycolipid, glycoprotein, lipoprotein and / or lipopolysaccharide molecule comprises one or more sulfated moieties. Binding fragment or complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
30. An antibody capable of binding to two or more different molecules selected from the group consisting of PSGL-1, fibrinogen γ ′, GPIbα, heparin, lumican, complement complex 4 (CC4), an interα inhibitor and prothrombin An antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
31. Binding to two or more different molecules selected from the group consisting of PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα, heparin, lumican, complement complex 4 (CC4), inter-α inhibitor and prothrombin, and An antibody that can also bind to one or more cell types selected from the group consisting of B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells, and metastatic cells, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies or conjugates thereof Its complex containing sexual fragments.
32. The antibody of claim 31, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is capable of binding to each of PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα and heparin. .
33. One or more selected from the group consisting of B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells, which bind to each of PSGL-1, fibrinogen γ ′, GPIbα and heparin and 33. The antibody of claim 32, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is also capable of binding to a cell type.
34. Binding to two or more different molecules selected from the group consisting of PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα, heparin, lumican, complement complex 4 (CC4), inter-α inhibitor and prothrombin, and It further comprises antibodies capable of binding also to lipids, carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins and / or epitopes on lipopolysaccharide molecules, antigen-binding fragments thereof, or one or more antibodies or binding fragments thereof The complex.
35. The antibody according to claim 34, characterized in that the epitope on lipids, carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins and / or lipopolysaccharide molecules comprises one or more sulfated moieties. An antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
36. An antibody capable of cross-reacting with two or more epitopes, that is, two or more epitopes each comprising one or more sulfated tyrosine residues and one or more clusters of two or more acidic amino acids, and an antigen-binding thereof A sexual fragment, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
37. The antibody of claim 36, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is capable of cross-reacting with PSGL-1.
38. The antibody of claim 37, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to QATEYEYLDY DFLPETE comprising one or more sulfated tyrosine residues.
39. The antibody of claim 36, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is capable of cross-reacting with GB1b-α.
40. The antibody of claim 36, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to DEGDTDLY DYYPEEDTEGD comprising one or more sulfated tyrosine residues.
41. The antibody of claim 39, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to TDLYDYY PEEDTE comprising one or more sulfated tyrosine residues.
42. The antibody of claim 39, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to GDEGDTDLYDYYP comprising one or more sulfated tyrosine residues.
43. The antibody of claim 39, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to YDYYPEE comprising one or more sulfated tyrosine residues.
44. The antibody of claim 39, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to TDLYDYYP comprising one or more sulfated tyrosine residues.
45. The antibody of claim 36, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is capable of cross-reacting with fibrinogen γ '.
46. The antibody of claim 45, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to EPHATETE YDSLYPED comprising one or more sulfated tyrosine residues.
47. The antibody of claim 36, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is capable of cross-reacting with heparin.
48. The antibody of claim 36, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is capable of cross-reacting with complement complex 4 (CC4).
49. The antibody of claim 48, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to MEANEDYED YEYDELPAK comprising one or more sulfated tyrosine residues.
50. The antibody of claim 36, which is capable of cross-reacting with one or more cell types selected from the group consisting of B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells, antigen binding thereof Fragment, or complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
51. The method according to any one of claims 18 to 20, which can inhibit cell rolling.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
52. The method according to claim 18, which can inhibit inflammation.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
53. The method according to any one of claims 18 to 20, which can inhibit an autoimmune disease.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
54. The method according to any one of claims 18 to 20, which can inhibit thrombosis.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
55. Can inhibit restenosis 18 to 20, 23~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
56. The method according to any one of claims 18 to 20, which can inhibit metastasis.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
57. It can inhibit the growth and / or replication of tumor cells.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
58. The method according to claim 18, wherein the mortality rate of the tumor cells can be increased.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
59. The method according to any one of claims 18 to 20, which can inhibit the growth and / or replication of leukemia cells.~ 2 FiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
60. The method according to claim 18, wherein the mortality rate of leukemia cells can be increased.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
61. The method according to any one of claims 18 to 20, which can increase the sensitivity of a diseased cell to injury caused by an anti-disease drug~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
62. The method according to any one of claims 18 to 20, which can increase the sensitivity of tumor cells to injury caused by an anticancer drug.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
63. The method according to any one of claims 18 to 20, which can increase the sensitivity of leukemia to injury by an anti-leukemic agent.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
64. The method of claim 18, which can inhibit the increase in the number of tumor cells in a tumor patient.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
65. The method according to any one of claims 18 to 20, which can reduce the number of tumor cells in a cancer patient.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
66. The method according to any one of claims 18 to 20, which can inhibit the increase in the number of leukemia cells in leukemia patients.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
67) The number of leukemia cells in a leukemia patient can be reduced.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
68. The cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet complex formation may be inhibited.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
69. It is capable of inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet adhesion.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
70. Cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet aggregation may be inhibited.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
An anti-cancer drug, an anti-metastatic drug, an anti-leukemic drug, an anti-disease drug, an anti-adhesive drug, an anti-thrombotic drug, an anti-restenotic drug, an anti-autoimmune drug, an anti-coagulant drug, an antibacterial drug, an antiviral The agent according to any one of claims 18 to 20, 23 complexed or conjugated to a drug selected from the group consisting of a drug and an anti-inflammatory drug.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
72. The antibody according to claim 71, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies, characterized in that the agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine. The complex containing the binding fragment.
73. The antibody according to claim 71, wherein the drug is an antithrombotic / restenotic drug selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium and aspirin. A sexual fragment, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
74. The anti-inflammatory agent selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtormetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 72. The antibody according to claim 71, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, characterized in that it is a drug.
75. The agent is an anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide 72. The antibody of claim 71, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
76. The antibody according to claim 71, an antigen-binding fragment thereof, characterized in that the agent is an anti-adhesive / anti-agglutinating agent selected from the group consisting of limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid. Or a complex comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
77. The antibody according to claim 71, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies or conjugates thereof, characterized in that the agent is selected from the group consisting of toxins, radioactive isotopes and therapeutic agents. Its complex containing sexual fragments.
78. The method according to claim 77, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, ricin, and their modifications and derivatives. Or an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
79. The antibody according to claim 77, wherein the radioactive isotope is selected from the group consisting of a γ emitter, a positron emitting nucleus, an X-ray emitter, a β emitter and an α emitter, Antigen binding fragment or complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
80. A radioactive isotope is¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶⁵thulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸78. The antibody according to claim 77, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, characterized in that it is selected from the group consisting of gallium.
The therapeutic agent is doxorubicin(Adriamycin), morpholino doxo Rubicin,Methoxymorpholinyl doxorubicin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholino daunorubicin, methoxymorpholino daunorubicin,The antibody according to claim 77, an antigen-binding fragment thereof, characterized in that it is selected from the group consisting of idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and their derivatives and combinations thereof. Or a complex comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
82. Conjugated or conjugated with a base or carrier capable of conjugated or conjugated with one or more agents.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
83. A base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer,The method according to any one of claims 18 to 20, 23 selected from the group consisting of HPMA and liposome.~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
84. Combined or conjugated to a radioactive isotope or or other contrast agent~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
85. A diagnostic kit comprising the antibody according to claim 84, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
86. Claims 18 to 20, 23~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit cell rolling.
87. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to inhibit inflammation.
88. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to inhibit an autoimmune disease.
89. The method according to claim 18,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit thrombosis.
90. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an amount effective to inhibit restenosis.
91. The method according to claim 18,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit metastasis.
92. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit the growth and / or replication of tumor cells. object.
93. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to increase the mortality of tumor cells.
94. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit the growth and / or replication of leukemia cells. object.
95. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to increase the mortality of leukemia cells.
96. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveContaining the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to enhance the sensitivity of a diseased cell to injury by an anti-disease drug Formulation composition.
97. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveAn effective amount of the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof, for enhancing the sensitivity of tumor cells to injury caused by an anticancer drug Pharmaceutical composition containing.
98. The method according to claim 18,Ortwenty three~ twenty fiveThe antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to enhance the sensitivity of leukemia to injury by an anti-leukemic drug Pharmaceutical composition.
99. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit an increase in the number of tumor cells in a tumor patient object.
100. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to reduce the number of tumor cells in a tumor patient.
101. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof in an effective amount to inhibit an increase in the number of leukemia cells in leukemia patients. object.
102. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, in an effective amount to reduce the number of leukemia cells in a leukemia patient.
103. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveThe antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising: cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or Or a pharmaceutical composition containing an effective amount to inhibit cell-platelet aggregation.
104. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveThe antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising: cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or Or a pharmaceutical composition containing an effective amount to inhibit cell-platelet complex formation.
105. Claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveThe antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising: cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or Or a pharmaceutical composition containing an effective amount to inhibit cell-platelet adhesion.
Anti-cancer drug, anti-metastatic drug, anti-leukemic drug, anti-disease drug, anti-adhesive drug, anti-thrombotic drug, anti-restenosis drug, anti-autoimmune drug, anti-coagulant drug, antibacterial drug, antiviral 21 or 20, which is complexed or conjugated to a drug selected from the group consisting of a drug and an anti-inflammatory drugOrtwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
107. The antibody according to claim 106, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies, wherein the agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine. A pharmaceutical composition comprising the complex comprising the binding fragment.
108. The antibody according to claim 106, characterized in that the drug is an antithrombotic / restenotic drug selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium and aspirin. A pharmaceutical composition comprising a sex fragment, or one or more antibodies or conjugates thereof comprising a binding fragment thereof.
109. The anti-inflammatory agent selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtrumetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 107. A pharmaceutical composition comprising the antibody according to claim 106, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, characterized in that it is a drug.
110. The agent is characterized in that the drug is an anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide. 108. A pharmaceutical composition comprising the antibody according to claim 106, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
111. The antibody according to claim 106, an antigen-binding fragment thereof, characterized in that the agent is an anti-adhesive / anti-agglutinating agent selected from the group consisting of limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid. Or a pharmaceutical composition comprising one or more antibodies or conjugates thereof comprising a binding fragment thereof.
112. The pharmaceutical composition according to paragraph 106, wherein the agent is selected from the group consisting of toxins, radioactive isotopes and therapeutic agents.
113. The apparatus according to claim 106, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, ricin, and their modifications and derivatives. Formulation composition.
114. The pharmaceutical composition according to claim 106, wherein the radioactive isotope is selected from the group consisting of a gamma emitter, a positron emitting nucleus, an X-ray emitter, a beta emitter and an alpha emitter. object.
A radioactive isotope is¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹ ⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶ ^Fivethulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸107. A pharmaceutical composition according to claim 106, selected from the group consisting of gallium.
The therapeutic agent is doxorubicin(Adriamycin), morpholino doki Sorubicin,Methoxymorpholinyl doxorubicin, adriamycin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholinodaunorubicin, methoxymorpholini Ludaunorubicin,107. The pharmaceutical composition according to claim 106, which is selected from the group consisting of idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof.
117. The method according to any one of claims 18 to 20, wherein the agent is bound or conjugated to a base or carrier capable of binding or conjugation with one or more agents.Ortwenty three~ twenty fiveA pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
The base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer ,120. A pharmaceutical composition according to claim 117, selected from the group consisting of HPMA and liposomes.
119. For the manufacture of a medicament capable of inhibiting cell rolling,or Istwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
120. For the manufacture of a medicament capable of inhibiting inflammation,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
121. The manufacture of a medicament capable of inhibiting an autoimmune disease, the method according to claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
122. Production of a medicament capable of inhibiting restenosis according to claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
123. The manufacture of a medicament capable of inhibiting thrombosis, according to claims 18-20,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
124. For the manufacture of a medicament capable of inhibiting metastasis,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
125. Production of a medicament capable of inhibiting the growth and / or replication of tumor cells according to claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
126. For the manufacture of a medicament capable of increasing the mortality of tumor cells,or Istwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
127. Production of a medicament capable of inhibiting the growth and / or replication of leukemia cellsOrtwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
128. Use of a medicament capable of increasing the mortality rate of leukemia cells according to claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
129. Production of a medicament capable of enhancing the sensitivity of a diseased cell to an injury caused by an anti-disease,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
130. The manufacture of a medicament capable of enhancing the sensitivity of tumor cells to injury caused by an anticancer drug,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
131. The manufacture of a medicament capable of enhancing the sensitivity of leukemia to injury by an anti-leukemic agent,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
132. The manufacture of a medicament capable of inhibiting an increase in the number of tumor cells in a tumor patient,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
133. The manufacture of a medicament capable of reducing the number of tumor cells in a tumor patient,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
134. The manufacture of a medicament capable of inhibiting an increase in the number of leukemia cells in a leukemia patient,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
135. The manufacture of a medicament capable of reducing the number of leukemia cells in a leukemia patient according to any one of claims 18 to 20,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
136. The manufacture of a medicament capable of inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet complex formation,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
137 to the manufacture of a medicament capable of inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet aggregation,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
138. The manufacture of a medicament capable of inhibiting adhesion between cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet,Ortwenty three~ twenty fiveUse of an antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
An antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which is an anticancer drug, an anti-metastatic drug, an anti-leukemic drug, an anti-disease drug, an anti-adhesive drug, Claim characterized in that it is complexed or combined with an agent selected from the group consisting of antithrombotic agents, antirestenotic agents, antiautoimmune agents, anticoagulants, antibacterial agents, antiviral agents and antiinflammatory agents. The method of any one of 119-138.
140. The method of claim 139, wherein the agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine.
141. The method of claim 139, wherein the agent is an antithrombotic / restenotic agent selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium and aspirin.
142. The anti-inflammatory agent selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtormetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 140. The method of claim 139, wherein said method is a drug.
The agent is characterized in that it is an anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide. 140. The method of claim 139.
144. The method of claim 139, wherein the agent is an anti-adhesion / anti-agglutination agent selected from the group consisting of limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid.
145. The method of claim 139, wherein the agent is selected from the group consisting of toxins, radioactive isotopes and therapeutic agents.
146. The method of claim 139, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, ricin, and modifications and derivatives thereof. .
147. The method of claim 139, wherein the radioactive isotope is selected from the group consisting of gamma emitters, positron emitting nuclei, x-ray emitters, beta emitters and alpha emitters.
A radioactive isotope is¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹ ⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶ ^Fivethulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸140. The method of claim 139, wherein the method is selected from the group consisting of gallium.
The therapeutic agent is doxorubicin(Adriamycin), morpholino doki Sorubicin,Methoxymorpholinyl doxorubicin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholino daunorubicin, methoxymorpholinyl daunorubicin,140. The method of claim 139, characterized in that it is selected from the group consisting of idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof.
An antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof is bound to a base or carrier capable of binding or complexing with one or more agents. 139. A method according to any one of claims 119 to 138, characterized in that it is combined or combined.
151. A base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer ,151. The method of claim 150, wherein said method is selected from the group consisting of HPMA and liposomes.
152. Use as a medicine capable of inhibiting cell rolling,or Istwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
153. Use as a medicine capable of inhibiting inflammation,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
154. Use as a medicine capable of inhibiting an autoimmune disease,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
155. Use as a medicine capable of inhibiting restenosis,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
156. Use as a medicine capable of inhibiting thrombosis,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
157. Use as a medicine capable of inhibiting metastasis,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
158. Use as a medicine capable of inhibiting the growth and / or replication of a tumor cell,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
159. Use as a medicine capable of enhancing the mortality rate of tumor cells,or Istwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
160. Use as a medicine capable of inhibiting the growth and / or replication of leukemia cells,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
161. Use as a medicine capable of increasing the mortality rate of leukemia cells,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
162. Use as a medicine capable of enhancing the sensitivity of diseased cells to injury caused by anti-disease agents,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
The pharmaceutical composition of the present invention is used as a medicine capable of enhancing the sensitivity of tumor cells to injury caused by an anticancer drug.Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
164. Use as a medicine capable of enhancing the sensitivity of leukemia to injury by an anti-leukemic agent,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
165. Use as a medicine capable of inhibiting an increase in the number of tumor cells in a tumor patient,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
166. Use as a medicine capable of reducing the number of tumor cells in a tumor patient,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
167. Use as a medicine capable of inhibiting an increase in the number of leukemia cells in a leukemia patient,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
168. Use as a medicine capable of reducing the number of leukemia cells in a leukemia patient,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
169. Use as a medicine capable of inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet complex formation,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
170. Use as a medicine capable of inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet aggregation.Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
171. Use as a medicine capable of inhibiting adhesion between cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet,Ortwenty three~ twenty fiveAn antibody according to any one of the preceding claims, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
Anti-cancer drug, anti-metastatic drug, anti-leukemic drug, anti-disease drug, anti-adhesive drug, anti-thrombotic drug, anti-restenotic drug, anti-autoimmune drug, anti-coagulant drug, antibacterial drug, antiviral The antibody according to any one of claims 152 to 171, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies or binding fragments thereof, conjugated or conjugated to a drug selected from the group consisting of a drug and an anti-inflammatory drug Including its complex.
173. The antibody of claim 172, an antigen binding fragment thereof, or one or more antibodies or conjugates thereof, wherein the agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine. Its complex containing sexual fragments.
174. The antibody of claim 172, an antigen-binding fragment thereof, wherein the agent is an antithrombotic / restenotic agent selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, rebiparin sodium and aspirin. Or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
175. The anti-inflammatory agent selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtormetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 173. The antibody of Claim 172, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, characterized in that it is a drug.
The agent is characterized in that it is an anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide 174. The antibody of Claim 172, an antigen-binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
177. The antibody of claim 172, or an antigen binding fragment thereof, or 1 thereof, wherein the agent is an anti-adhesive / anti-agglutinating agent selected from the group consisting of limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid. A complex comprising the above antibody or a binding fragment thereof.
178. The antibody of claim 172, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies or binding fragments thereof, characterized in that the agent is selected from the group consisting of toxins, radioactive isotopes and therapeutic agents. Including its complex.
179. The antibody of claim 172, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, ricin, and their modifications and derivatives. An antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
180. The antibody of claim 172, wherein the radioactive isotope is selected from the group consisting of a gamma emitter, a positron emitting nucleus, an X-ray emitter, a beta emitter and an alpha emitter. Binding fragment or complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
(181) A radioactive isotope is¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹ ⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶ ^Fivethulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸173. The antibody of claim 172, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, wherein the antibody is selected from the group consisting of gallium.
The therapeutic agent is doxorubicin(Adriamycin), morpholino doki Sorubicin,Methoxymorpholinyl doxorubicin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholino daunorubicin, methoxymorpholinyl daunorubicin,173. The antibody of claim 172, an antigen-binding fragment thereof, or 1 characterized in that it is selected from the group consisting of idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof. A complex comprising the above antibody or a binding fragment thereof.
The antibody according to any one of claims 152 to 171, an antigen-binding fragment thereof, which is conjugated or conjugated to a base or carrier capable of conjugation or conjugation to one or more agents. Or a complex comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
184. A base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer ,184. The antibody of claim 183, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, wherein the antibody is selected from the group consisting of HPMA and a liposome.
185. An isolated epitope comprising the GPIbα amino acid sequence Tyr276 to Glu282 characterized in that at least one of amino acids 276, 278 and 279 is sulfated.
186. The isolated epitope of claim 185, further comprising GPIbα amino acids 283-285.
187. An antibody capable of binding to the epitope of claim 185, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, wherein the epitope of claim 185 is GPIbα amino acid 283. An antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, characterized in that said binding is enhanced when it further comprises ̃285.
188. An isolated GPIbα N-terminal peptide having an apparent molecular mass of about 40 kDa and comprising an epitope of the sequence YDYYPEE, wherein one or more of the tyrosine residues in the sequence are sulfated.
189. An isolated GPIbα peptide consisting of amino acids 1-282, wherein at least one of amino acids 276, 278 and 279 is sulfated.
190. An antibody multimer comprising at least a first and a second antigen binding fragment, wherein at least the first or the second antigen binding fragment, or both fragments have the following formula:
[Chemical formula 6]

(In the formula,
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Chemical formula 7]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine,
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  q is 1 to 6,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; if q = 1 then r = 1 and if q> 1 one or more of Y are sulfated There is. )
An antibody multimer characterized in that it can bind or cross react with an epitope comprising
191. W is glycine, Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamic acid, gamma carboxy glutamic acid or aspartic acid, q is 1, 2 or 3 191. The antibody multimer of claim 190, wherein the epitope of 3 and the first or second antigen-binding fragment, or both fragments bind or cross react.
192. An epitope of which Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3 and r is 1 and the first or second antigen-binding fragment or both fragments are bound or cross-reacted 191. The antibody multimer of claim 190, wherein the antibody multimer is characterized.
193. An antibody multimer comprising at least a first and a second antigen binding fragment, wherein the first or second antigen binding fragment or both fragments have the following formula:
[Image 8]

(In the formula,
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
Embedded image

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
However, here, if n = 0, then m> 0; if m = 0, then n> 0; one or more of Y are sulfated. )
An antibody multimer characterized in that it can bind or cross react with an epitope comprising
194. A peptide conjugate of W being glycine and Y being a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamic acid, gamma carboxy glutamic acid or aspartic acid, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, 194. The antibody multimer of claim 193, wherein the epitope which is serine or glycine and the first or second antigen-binding fragment, or both fragments bind or cross react.
The peptide conjugate of Y is a peptide of tyrosine, q is 3 and r is 1 and the first or second antigen-binding fragment or both fragments are bound or cross-reacted 194. The antibody multimer of claim 193, wherein the antibody multimer is characterized.
196. An antibody multimer comprising at least a first and a second antigen binding fragment, wherein at least the first or the second antigen binding fragment, or both fragments have the following formula:
[Image 10]

(In the formula,
  G is glycine,
  E is glutamate,
  D is aspartic acid,
  Y is tyrosine,
  S is a sulfate or sulfate molecule,
  X is any amino acid other than the above,
  z is 0, 1 or 2;
  t is 1, 2 or 3 and
  r is 0 or 1;
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But where one or more Y's are sulfated; m> 0 if n = 0; n> 0 if m = 0. )
An antibody multimer characterized in that it can bind or cross react with an epitope comprising
197. The antibody multimer of claim 196, wherein the epitope in which r is 1 and the first or second antigen-binding fragment, or both fragments bind or cross react.
198. The antibody multimer of claim 190, 193 or 196, which is a dimer, trimer or tetramer.
199. The antibody multimer of claim 198, which is a dimer.
200. The dimer of claim 199, wherein at least one of the first and second antigen binding fragments is selected from scFv fragments of Y1 and Y17.
201. The dimer of claim 199, wherein said first and second antigen binding fragments are linked by a disulfide bond.
202. The dimer of claim 201, wherein said first and second antigen binding fragments are Y1-Cys-KAK.
203. The dimer of claim 199, wherein said first and second antigen binding fragments are linked by a 5-20 amino acid polypeptide linker.
204. The dimer of claim 203, wherein said polypeptide linker comprises 5 amino acids.
205. The polypeptide linker is GIy_Four205. The dimer of claim 204 which is a Ser.
206. The antibody multimer of claim 198, which is a trimer.
207. The trimer of claim 206, comprising three antigen binding fragments, at least one of which is a Y1 scFv fragment or a Y17 scFv fragment.
208. The trimer of claim 207, wherein said antigen binding fragments are linked by a polypeptide linker.
209. The trimer of claim 208, wherein the polypeptide linker comprises 1 to 5 amino acids.
210. The antibody multimer of claim 198, which is a tetramer.
211. The tetramer of claim 210, comprising four antigen binding fragments, at least one of which is a Y1 scFv fragment or a Y17 scFv fragment.
212. The tetramer of claim 211, wherein said antigen binding fragments are linked by a polypeptide linker.
213. The tetramer of claim 212, wherein the polypeptide linker comprises 1 to 5 amino acids.
214. The tetramer of claim 210, wherein the four antigen binding fragments form a complex via streptavidin-biotin association.
215. The antibody multimer of claim 198, wherein said antibody multimer comprises the same antigen binding fragment.
216. The antibody multimer of claim 198, wherein at least said first or second antigen binding fragment has a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 8.
217. The antibody multimer of claim 198, wherein at least the first or second antigen binding fragment, or a first hypervariable region, wherein both fragments comprise SEQ ID NO: 20.
218. A second hypervariable region comprising at least a first or second antigen binding fragment or both fragments comprising SEQ ID NO: 115 and / or a third hypervariable region comprising SEQ ID NO: 114 217. The antibody multimer of claim 216 or 217.
219. It may bind to two or more different molecules selected from the group consisting of PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα, heparin, lumican, complement complex 4 (CC4), inter-alpha inhibitor and prothrombin, 210. The antibody multimer of any one of claims 190, 193, 196, 216 and 217.
220. Binding to two or more different molecules selected from the group consisting of PSGL-1, fibrinogen γ ′, GPIbα, heparin, lumican, complement complex 4 (CC4), inter-α inhibitors and prothrombin, and 220. Any one of claims 190, 193, 196, 216 and 217 also capable of binding to one or more cell types selected from the group consisting of B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells. Item antibody multimer.
An antibody dimer comprising a first and a second antigen-binding fragment, wherein the first or second antigen-binding fragment, or both fragments, of SEQ ID NO: 8 [Y1 CDR3] An antibody dimer characterized by having a hypervariable region containing an amino acid sequence.
222. An antibody dimer comprising a first and a second antigen-binding fragment, wherein said first or second antigen-binding fragment, or both fragments, of SEQ ID NO: 20 [Y17 CDR3] An antibody dimer characterized by having a hypervariable region containing an amino acid sequence.
223. A first or second antigen binding fragment, or a second hypervariable region wherein both fragments comprise SEQ ID NO: 115 and / or a third hypervariable region comprising SEQ ID NO: 114. 223. The antibody dimer of claim 221 or 222.
224. An antibody multimer comprising first and second antigen binding fragments, wherein said first or second antigen binding fragments, or both fragments are two or more epitopes, ie one or more each. An antibody multimer characterized in that it can cross-react with two or more epitopes comprising a sulfated tyrosine residue and one or more clusters of two or more acidic amino acids.
225. The antibody multimer of paragraph 224, which is capable of cross-reacting with PSGL-1.
226. The antibody multimer of claim 224, which binds QATEYEYL DYDFLPETE comprising one or more sulfated tyrosine residues.
227. The antibody multimer of claim 224, which is capable of cross-reacting with GB1b-α.
228. The antibody multimer of claim 224, which binds to DEGDTDLY DYYPEEDTEGD comprising one or more sulfated tyrosine residues.
229. The antibody multimer of claim 224, which binds to a TDLYD YPG EEDTE comprising one or more sulfated tyrosine residues.
230. The antibody multimer of paragraph 224, which binds to GDEGBTDYLYDYYP comprising one or more sulfated tyrosine residues.
231. The antibody multimer of claim 224, which binds to YDYYPEE comprising one or more sulfated tyrosine residues.
232. The antibody multimer of claim 224, which binds to TDLYDYYP comprising one or more sulfated tyrosine residues.
233. The antibody multimer of claim 224, which is capable of cross-reacting with fibrinogen γ '.
234. The antibody complex of paragraph 233 which binds to EPHAET EYDSLYPED comprising one or more sulfated tyrosine residues.
235. The antibody multimer capable of cross-reacting with heparin.
236. The antibody multimer of paragraph 224, which is capable of cross-reacting with complement complex 4 (CC4).
237. The antibody multimer of paragraph 224, which is capable of cross-reacting with one or more cell types selected from the group consisting of B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells.
A pharmaceutical composition comprising the antibody multimer according to any one of claims 1, 4, 7, 27 and 28.
239. The pharmaceutical composition of claim 238, which comprises an effective amount of an antibody multimer to increase tumor cell mortality or sensitize tumor cells to damage by anti-cancer drugs.
240. The pharmaceutical composition of claim 238, which comprises an effective amount of an antibody multimer which inhibits growth and / or replication of leukemia cells.
241. The preparation of claim 238, which comprises an effective amount of the antibody multimer to inhibit abnormal cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or platelet-cell adhesion. Composition.
242. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of an antibody multimer which sensitizes the diseased cells to damage by the anti-disease drug.
243. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of the antibody multimer to increase leukemia cell mortality or sensitize leukemia cells to injury by an anti-leukemic agent.
Anti-cancer drug, anti-metastatic drug, anti-leukemic drug, anti-disease drug, anti-adhesive drug, anti-thrombotic drug, anti-restenosis drug, anti-autoimmune drug, anti-coagulant drug, antibacterial drug, antiviral 217. A pharmaceutical composition comprising the antibody multimer of any one of claims 190, 193, 196, 216 and 217 complexed or conjugated to a drug selected from the group consisting of a drug and an anti-inflammatory drug.
245. The pharmaceutical composition of claim 244, wherein the agent is selected from the group consisting of toxins, radioactive isotopes and therapeutic agents.
246. The pharmaceutical composition of claim 244, wherein the agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine.
247. The pharmaceutical composition of claim 244, wherein the agent is an antithrombotic / restenotic agent selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium and aspirin.
248. The anti-inflammatory agent selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtormetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 246. The pharmaceutical composition of claim 244, which is a drug.
249. The anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide. Formulation composition.
250. The pharmaceutical composition of claim 244, wherein the agent is an anti-adhesive / anti-aggregant selected from the group consisting of limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid.
251. The pharmaceutical composition of claim 245, wherein said radioactive isotope is selected from the group consisting of gamma emitters, positron emitting nuclei, x-ray emitters, beta emitters and alpha emitters.
A radioactive isotope is¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹ ⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶ ^Fivethulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸253. The pharmaceutical composition of claim 251, wherein said pharmaceutical composition is selected from the group consisting of gallium.
The therapeutic agent is doxorubicin(Adriamycin), morpholino doki Sorubicin,Methoxymorpholinyl doxorubicin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholino daunorubicin, methoxymorpholinyl daunorubicin,246. The pharmaceutical composition of claim 245 selected from the group consisting of idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof.
254. The pharmaceutical composition of claim 244 bound or conjugated to a base or carrier capable of binding or conjugation with one or more agents.
The base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer ,The pharmaceutical composition of claim 254, wherein said pharmaceutical composition is selected from the group consisting of HPMA and liposomes.
256. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of an antibody multimer to inhibit cell rolling.
257. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of the antibody multimer to inhibit inflammation.
258. The pharmaceutical composition of claim 238, which comprises an effective amount of an antibody multimer to inhibit autoimmune disease.
259. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of the antibody multimer to inhibit thrombosis.
260. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of an antibody multimer to inhibit restenosis.
261. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of an antibody multimer to inhibit metastasis.
262. Containing an effective amount of an antibody multimer which inhibits the growth and / or replication of tumor cells, increases the mortality of tumor cells, or sensitizes tumor cells to injury by an anticancer drug, 238. The pharmaceutical composition of claim 238.
263. Containing an effective amount of an antibody multimer which inhibits growth and / or replication of leukemia cells, increases leukemia cell mortality, or sensitizes leukemia cells to injury by an anti-leukemic drug. The formulation composition of item 238.
264. The pharmaceutical composition of claim 238, comprising an effective amount of an antibody multimer which sensitizes the diseased cells to damage by the anti-disease drug.
265. An antibody multimer comprising: an effective amount of an antibody multimer which inhibits cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet aggregation, adhesion or complex formation. The formulation composition of item 238.
Anti-cancer drug, anti-metastatic drug, anti-leukemic drug, anti-disease drug, anti-adhesive drug, anti-thrombotic drug, anti-restenotic drug, anti-autoimmune drug, anti-coagulant drug, antibacterial drug, antiviral 238. The pharmaceutical composition of claim 238, conjugated or conjugated to a drug selected from the group consisting of a drug and an anti-inflammatory drug.
267. The pharmaceutical composition of claim 266, wherein the agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine.
268. The pharmaceutical composition of claim 238, wherein the antibody multimer is conjugated or conjugated to a base or carrier capable of conjugation or conjugation with one or more agents.
The base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer ,238. The pharmaceutical composition of claim 238, selected from the group consisting of HPMA and a liposome.
270. Use of an antibody multimer according to any one of paragraphs 1, 4, 7, 27 and 28 for the manufacture of a medicament for inhibiting cell rolling.
271. The manufacture of a medicament for inhibiting inflammation, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
272. Use of an antibody multimer according to any one of claims 1, 4, 7, 27 and 28 for the manufacture of a medicament for inhibiting an autoimmune disease.
273. The manufacture of a medicament for inhibiting restenosis, 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
274. The manufacture of a medicament for inhibiting thrombosis, 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
275. The manufacture of a medicament for inhibiting metastasis, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
276. The manufacture of a medicament for inhibiting the growth and / or replication of tumor cells, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
277. The manufacture of a medicament for increasing the mortality of tumor cells, 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
278. The manufacture of a medicament for inhibiting the growth and / or replication of leukemic cells, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
279. The manufacture of a medicament for increasing the mortality of leukemia cells, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
280. The manufacture of a medicament for increasing the susceptibility of a diseased cell to damage by an anti-disease drug, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
281. The manufacture of a medicament for enhancing the susceptibility of tumor cells to damage by anti-cancer drugs, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
282. The manufacture of a medicament for enhancing the sensitivity of leukemia cells to injury by an anti-leukemic drug, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
283. The manufacture of a medicament for inhibiting an increase in the number of tumor cells in a tumor patient, claim 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
284. The manufacture of a medicament for reducing the number of tumor cells in a tumor patient, claim 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
285. The manufacture of a medicament for inhibiting an increase in the number of leukemia cells in a leukemia patient, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
286. The manufacture of a medicament for reducing the number of leukemia cells in a leukemia patient, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
287. The manufacture of a medicament for inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet complex formation according to claim 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
288. The manufacture of a medicament for inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet aggregation, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
289. The manufacture of a medicament for inhibiting cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet adhesion, claims 190, 193, 196,as well as216~ 218Use of the antibody multimer according to any one of the above.
An antibody multimer is used as an anticancer drug, anti-metastatic drug, anti-leukemic drug, anti-disease drug, anti-adhesive drug, anti-thrombotic drug, anti-restenotic drug, anti-autoimmune drug, anti-aggregation drug, antibacterial The method of any one of claims 270-289 characterized in that it is conjugated or conjugated to a drug selected from the group consisting of a drug, an antiviral drug and an anti-inflammatory drug.
291. The method of claim 290, wherein said agent is an antiviral selected from the group consisting of acyclovir, ganciclovir and zidovudine.
292. The method of claim 290, wherein the agent is an antithrombotic / restenotic agent selected from the group consisting of cilostazol, dalteparin sodium, rebiparin sodium and aspirin.
293. The anti-inflammatory agent selected from the group consisting of zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtolumetin, celotoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide 290. The method of claim 290, wherein said method is a drug.
294. The agent is an anti-autoimmune drug selected from the group consisting of leflunomide, denileukin diftitox, subreum, WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide 290. The method of claim 290, wherein:
295. The method of claim 290, wherein said agent is an anti-adhesive / anti-agglutinating agent selected from the group consisting of limaprost, chlorchromene and hyaluronic acid.
296. The method of claim 290, wherein said agent is selected from the group consisting of toxins, radioactive isotopes and therapeutic agents.
297. The method of claim 290, wherein the toxin is selected from the group consisting of gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, ricin, or a modification or derivative thereof. .
298. The process of claim 290, wherein the radioactive isotope is selected from the group consisting of gamma emitters, positron emitting nuclei, x-ray emitters, beta emitters and alpha emitters.
299. A radioactive isotope is¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹ ⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶ ^Fivethulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸290. The method of claim 290, wherein said method is selected from the group consisting of gallium.
The therapeutic agent is doxorubicin(Adriamycin), morpholino doki Sorubicin,Methoxymorpholinyl doxorubicin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholino daunorubicin, methoxymorpholinyl daunorubicin,290. The method of claim 290, wherein the method is selected from the group consisting of idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof.
An antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing an antibody or an antigen-binding fragment thereof is bound or complexed to a base or carrier capable of binding or complexing with one or more agents. The method of any one of claims 270-289, which is characterized by:
The base or carrier is dextran, a lipophilic polymer,Hydrophobic polymer ,304. The method of claim 301, wherein said method is selected from the group consisting of HPMA and liposomes.
303. Use as a medicament for inhibiting cell rolling, 190, 193, 196,as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
A pharmaceutical composition for inhibiting inflammation, which is used in medicine, 190, 193, 196,as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The method according to any one of claims 190, 193, 196, which is used as a medicament for inhibiting an autoimmune disease.as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
306. Use as a medicament for inhibiting restenosis, 190, 193, 196,And The216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The method according to claim 190, 193, 196, which is used as a medicament for inhibiting thrombosis.And The216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The method according to any one of claims 190, 193, 196, which is used as a medicament for inhibiting metastasis.as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
309. Use as a medicament for inhibiting the growth and / or replication of a tumor cell according to claim 190, 193, 196,as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
310. Use as a medicine for increasing the mortality rate of tumor cells, 190, 193, 196,as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a medicament for inhibiting the growth and / or replication of leukemia cells (190, 193, 196).as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a drug to increase the mortality of leukemia cells (190, 193, 196).as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a medicine for enhancing the sensitivity of a diseased cell to injury by an anti-disease drug.as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a drug for enhancing the sensitivity of a tumor cell to damage by an anticancer drug (190, 193, 196, 314).as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a medicine for enhancing the sensitivity of leukemia cells to injury by an anti-leukemic drug.as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a medicament for inhibiting an increase in the number of tumor cells in a tumor patient, (190, 193, 196).as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
The drug is used as a medicament for reducing the number of tumor cells in a tumor patient (190, 193, 196).as well as216~ 218The antibody multimer according to any one of the above.
A polyclonal antibody, antibody fragment or antibody complex which cross-reacts with the variable-length molecule chain of human monoclonal antibody scFv-Y1.
319. The polyclonal antibody, antibody fragment or antibody complex of claim 318, which cross-reacts with an NdeI-EcoRI restriction fragment of the variable length chain of human monoclonal antibody scFv-Y1.
320. A diagnostic kit comprising the antibody or antibody fragment or complex of claims 318 or 319.
321. A composition comprising the antibody or antibody fragment or complex of claims 318 or 319 conjugated to doxorubicin.
A composition comprising the antibody or antibody fragment or complex of claim 318 or 319, dextran, HPMA, Hydrophobic polymer,Lipophilic polymer, And liposomesAnd a pharmaceutically acceptable carrier selected from the group consisting of
323. A composition comprising the antibody or antibody fragment or conjugate of any one of claims 318 or 319 in admixture with doxorubicin modified liposomes.
Detailed Description of the Invention
[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
[1.] The present invention is present on cell surfaces such as cancer cells, metastatic cells, leukemia cells and platelets, and cell rolling, metastasis, inflammation, autoimmune diseases such as idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) It relates to an epitope that plays an important role in various physiological phenomena such as cell adhesion, thrombosis and / or restenosis, and aggregation. The present invention relates to a therapeutic diagnostic method and a therapeutic diagnostic composition using an antibody to the epitope. The invention also relates to the field of tissue targeting and identification of peptides and polypeptides which specifically bind to target cells, with the aid of phage display library technology. More particularly, said peptides and polypeptides have anti-cancer activity, anti-metastatic activity, anti-leukemic activity, anti-viral activity, anti-infective activity, and / or other diseases such as inflammatory diseases, abnormal or pathogenic cell adhesion Diseases associated with thrombosis and / or restenosis, diseases associated with abnormal or pathogenic aggregation, and diseases caused by autoimmune diseases, cardiovascular diseases such as myocardial infarction, retinal diseases, sulfated tyrosine-dependent protein-protein interactions , And disease cells generally will have opposing activities.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  Antibodies, phage display, and tissue targeting
[2.] Tissue selective targeting of therapeutic agents is a new area of the pharmaceutical industry. A new targeting-based cancer treatment aims to increase the overall effectiveness by increasing the specificity and efficacy of the treatment while reducing side effects. Mouse monoclonal antibodies (MAbs) to tumor associated antigens have been used to target toxins, radionucleotides and chemotherapeutic conjugates to tumors. The differentiation antigens CD19, CD20, CD22 and CD25 have been targeted as cancer-specific targets in the treatment of hematologic malignancies. Despite extensive research, this approach has some limitations. First, isolation of suitable monoclonal antibodies exhibiting selective binding is difficult. Second, high antibody immunogenicity is required as a precondition for successful antibody isolation. Third, because the final product contains non-human sequences, it causes an immune response (eg, human anti-mouse antibody-HAMA response) to non-human agents. This HAMA response often reduces the serum half-life and interferes with repeated treatment, thus reducing the therapeutic value of the antibody. Therefore, interest has been directed to the design of chimeric or humanized monoclonal antibodies of murine origin and to the discovery of human antibodies. This approach also has the limitation that only a single antibody species that targets only known purified antigens can be isolated. Also, this method is non-selective in the sense that it allows the isolation of antibodies to cell surface markers which are present not only in malignant cells but also in normal cells.
[0003]
[3.] There are many factors that influence the therapeutic efficacy of MAbs in cancer treatment. For example, the specificity and expression level of antigen expression on the surface of tumor cells, antigen heterogeneity, and the accessibility of a tumor mass. Leukemias and lymphomas are generally more sensitive to antibody therapy than solid tumors, such as carcinomas. Lymphomas are good candidates for MAb therapy because MAbs rapidly bind to leukemia and lymphoma cells in the bloodstream and readily invade malignant cells in lymphoid tissues. An ideal system involves the identification of MAbs that recognize surface markers of stem cells that produce malignant progeny cells.
[0004]
[4.] The phage display type library is used for selection of isolated predetermined target proteins such as antibodies, hormones and random single chain Fv (scFv) binding to the receptor. In addition, the use of antibody libraries in general, and in particular the use of phage-displayed scFv libraries, facilitates alternative means of discovering unique molecules for targeting specific (but unrecognized, unknown) cell surface moieties. Make it
[0005]
[5.] Leukemias, lymphomas and myelomas originate from bone marrow and lymphatic tissues and involve unrestricted growth of cells. Acute lymphocytic leukemia (ALL) is a heterogeneous disease defined by unique clinical and immunological characteristics. Although the definitive cause of most B-cell ALL (B-ALL) is unknown as in the case of allogeneic ALL, this disease is often attributed to acquired genetic mutations in unicellular DNA and the cells Abnormal and continuously proliferate. The prognosis for B-ALL patients, both children and adults, is significantly worse than for other leukemia patients.
[0006]
[6.] Acute myelogenous leukemia (AML) is a heterogeneous tumor group with precursor cells that become terminally differentiated cells of the myeloid line (red blood cells, granulocytes, monocytes and platelets) under normal conditions. AML is associated with acquired gene mutations as well as other tumorigenesis, and as a result of such mutations, relatively undifferentiated blast cells replace normal differentiated myeloid cells, and one or more types of primary myeloid type Indicates differentiation. AML generally occurs in the bone marrow and, to some extent, also in secondary hematopoietic organs. Although AML patients are primarily adults, and the peak age group for morbidity is 15 to 40 years, children and the elderly have also been found to have AML. Almost all AML patients need to be treated immediately after diagnosis to reach a clinical remission phase where abnormal levels of circulating undifferentiated blasts have been resolved.
[0007]
[7.] Heretofore, various monoclonal antibodies have been developed which induce cytolytic activity on tumor cells. Humanized monoclonal antibody MuMAb 4D5 to the extracellular domain of the P185 growth factor receptor (HER2) has been approved by the FDA (US Food and Drug Administration) and is being used to treat human breast cancer (US Pat. Nos. 5,821,337 and 5, 720, 954). After binding, this antibody can inhibit the growth of tumor cells dependent on the growth factor receptor HER2. In addition, chimeric antibodies to CD20 that cause a rapid loss of peripheral blood B cells, including those associated with lymphoma, have also recently received FDA approval (US Pat. No. 5,843,439). This antibody causes complement dependent lysis when bound to target cells. This antibody product has recently been approved and is currently being used in clinical trials for mild malignant B-cell non-Hodgkin's lymphoma.
[0008]
[8.] Several other humanized and chimeric antibodies are in development or in clinical trials. In addition, CMA-676 in which a humanized Ig that specifically reacts with the CD33 antigen that is expressed on the surface of most types of myeloid leukemia cells as well as normal myeloid cells is conjugated to the anticancer drug calicheamicin. Are also born [Sievers et al., Blood Supplement, 308, 504a (1997)]. This conjugate isMYLOTARGIt is known under the tradename (registered trademark) and has already been approved by the FDA [Caron et al., Cancer Supplement, 73, 1049-1056 (1994)]. In light of its cytolytic activity, an additional anti-CD33 antibody (HumM195) (now at the trial stage) is bound to several cytotoxins, including gelonin toxin [McGraw et al., Cancer Immunol. ., 39, 367-374 (1994)], radioactive isotopes¹³¹I [Caron et al., Blood 83, 1760-1768 (1994)],⁹⁰Y [Jurcic et al., Blood Supplement, 92, 613a (1998)], and²¹³It is bound to Bi [Humm et al., Blood Supplement, 38: 231 P (1997)].
[0009]
[9.] The chimeric antibody (cHuLym3) to the leukocyte antigen CD45 is in the trial stage of human leukemia and lymphoma [Sun et al., Cancer Immunol. Immunother., 48, 595-602 (2000)]. Specific cell lysis was observed in the in vitro ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) assay [Henkart, Immunity, 1, 343-346 (1994); Squier and Cohen, Current Opin. Immunol., 6, 447-452 (1994)].
[0010]
[10.] In contrast to the humanization of murine monoclonal antibodies and the construction of chimeric antibodies, the use of phage display technology allows the isolation of scFv containing fully human sequences. A fully human antibody to human TGFb2 receptor based on scFv clones derived from phage display technology has recently been developed. This scFv has strong antiproliferative activity when converted to fully human IgG4 that can compete for TGFb2 binding [Thompson et al., J. Immunol. Methods, 227, 17-29 (1999)]. This well-known technique is described in more detail in the following publication: Smith, Science, 228, 1315 (1985); Scott et al., Science, 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS, 87, 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249, 404-406 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 13 (14), 3245-3260 (1994); Bass et al. , Proteins, 8, 309-314 (1990); McCafferty et al., Nature, 348, 552-554 (1990); Nissim et al., EMBO J., 13, 692-698 (1994); U.S. Patent No. 5,427,908. Nos. 5,432,018, 5,223,409 and 5,403,384.
[0011]
  Isolation scFv Ligand corresponding to antibody molecule
[11.] Platelets, fibrinogen, GPIb, selectin and PSGL-1 are each of several pathogenic states or conditions such as abnormal or pathogenic inflammation, abnormal or pathogenic immune response, autoimmune reaction, metastasis, abnormal or pathogenesis It plays an important role in sexual cell adhesion, thrombosis and / or restenosis, abnormal or pathogenic aggregation. Thus, antibodies that cross-react with platelets and these molecules would be useful in the diagnostic treatment of diseases and disorders associated with these and other pathogenic conditions.
[0012]
  platelet
[12.] Platelets are well-characterized blood-system components and play several important roles in hemostasis, thrombosis and / or restenosis, and restenosis. Vascular injury triggers a hemostatic process characterized by a series of consecutive events. The first response to vascular injury is adhesion of platelets to the affected area of the blood vessel wall. In the next step, multi-layered platelets aggregate on the platelets adhered in the previous step to form a blood clot. The platelet mass blocks the blood vessel wall. The thrombus is strengthened by the deposition of fibrin polymer. This clot is only broken up after the damage has been repaired.
[0013]
  Importance of platelets in metastasis
[13.] Tumor metastasis is probably the largest factor limiting survival of cancer patients. According to accumulated data, the ability of tumor cells to interact with host platelets is an essential metastatic determinant. Leslie Oleksowicz, ZM, “Characterization of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role of Immunogenetic GPIb and GPIIb / III Expression by MCF-7 Breast Cancer Cells,” (Analysis of tumor aggregation in platelets: Immunity-related by MCF-7 breast cancer cells Role of GPIb and GPIIb / IIIa expression) Thrombosis Research 79: 261-274 (1995).
[0014]
[14.] The ability of tumor cells to aggregate platelets has been shown to correlate with the metastatic potential of tumor cells, and inhibition of tumor aggregation in platelets has also been shown to correlate with suppression of metastasis in rodent models There is. As already demonstrated, the interaction between tumor cells and platelets is associated with membrane adhesion molecules and agonist secretion. In tumor cell lines, expression of immune-related platelet glycoproteins has already been confirmed. Immune-related platelet glycoproteins GPIb, GPIIb / IIIa, GPIb / IX and integrin alpha_vIt has been demonstrated that the subunits are expressed on the surface of breast cancer cell lines. Oleksowicz, ZM, “Characterization of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role of Immunoregulated GPIb and GPIIb / III Expression by MCF-7 Breast Cancer Cells,” (Analysis of tumor aggregation of platelets: Immunity-related GPIb by MCF-7 breast cancer cells And the role of GPIIb / IIIa expression) Thrombosis Research 79: 261-274 (1995); Kamiyama, M. et al., “Inhibition of platelet GPIIb / III binding to fibrinogen by serum factors: studies of circulating immune complexes and platelets antibodies in patients with hemophilia, immune lymphocyte, purpura, human immunodeficiency virus-related immune thromboviral open purpura, and systemic lupus erythematosus, "(inhibition of platelet GPIIb / III a-fibrinogen binding by serum factor: hemophiliac immune disorder Study of circulating immune complexes and platelet antibodies in patients with human immunodeficiency virus-related immune thrombocytopenic purpura and systemic lupus erythematosus) J. Lab Cli Med 117 (3): 209-1 7 (1991).
[0015]
[15.] Gasic [JTB Gasic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 46-52 (1968)] and colleagues found that antibody-induced thrombocytopenia is CT26 colorectal adenocarcinoma, Lewis. It was shown to significantly reduce the number and volume of metastases produced by lung adenocarcinoma and B16 melanoma. Karpatkin, S. et al., “Role of adhesive proteins in platelet tumor interaction in vitro and metabolism formation in vivo,” (Role of adhesion proteins in platelet tumor interaction and in vivo metastasis formation) J. Cli. Invest 81 (4): 1012-9 (1998); Clezardin, P. et al., “Role of platelet membranes glycoproteins Ib / IX and IIb / III a, and of platelet alpha-granule proteins in platelet aggregation induced by human osteosarcoma cells, "(The role of platelet membrane glycoproteins Ib / IX and IIb / IIIa and platelet alpha granule protein in platelet aggregation induced by human osteosarcoma cells) Cancer Res. 53 (19): 4695-700 (1993). It was found that a single chain polypeptide (60 kd) closely related to GPIb and corresponding to an incomplete or abnormal O-glycosylated GPIb α subunit was expressed on the surface membrane of HEL cells. Krieffer, N. et al., “Expression of platelet glycoprotein I b alpha in HEL cells,” (expression of platelet GPIbα in HEL cells) J. Biol. Chem. 261 (34): 15854-62 (1986).
[0016]
  GPIb Complex
[16.] Each step in the hemostasis process requires the presence of platelet surface receptors. One receptor important for hemostasis is the GP (glycoprotein) Ib-IX complex (also known as CD42). This receptor mediates platelet adhesion (early binding) to the injury site blood vessel wall by binding von Willebrand factor (vWF) in the vascular subendothelium. This receptor is also critical for two other platelet functions important in hemostasis: (a) platelet aggregation induced by high shear stress in arterial stenosis and (b) platelet activation induced by low thrombin concentration Play an important role.
[0017]
[17.] The GPIb-IX complex is also a major component of the platelet cell membrane outer surface. The GPIb-IX complex contains three membrane-spaned polypeptides: the 130 kDa α and 25 kDa β chains of disulfide linked GPIb, and GPIX (22 kDa) noncovalently linked thereto. All four units are present in equal proportions on the platelet membrane to achieve efficient expression and function of the CD42 complex on the cell surface, which has three subunits for full expression on the cell membrane Suggests that it needs to be properly configured into a complex. The α chain of GPIb consists of three distinct structural domains: (1) a globular N-terminal peptide domain comprising a leucine rich repeat sequence and a Cys binding flanking sequence; (2) a hyperglycosylated mucin-like macroglycopeptide domain; And (3) a membrane-associated C-terminal region including disulfide bond with GPIbβ and transmembrane and cytoplasmic sequences.
[0018]
[18.] According to some evidence, the vWF and thrombin binding domains of the GPIb-IX complex are present in a globular domain spanning approximately 300 amino acids N-terminal to GPIbα. Human platelet GPIb-IX complex is an important membrane receptor that mediates both platelet function and reactivity. GPIb recognition of subendothelial vWF enables platelet adhesion to vascular injury. Furthermore, binding of vWF to GPIbα also induces platelet activation which may involve interaction with the cytoskeleton of the cytoplasmic domain of GPIb-IX or with phospholipase A2. Furthermore, although GPIbα contains a high affinity binding site for α-thrombin, α-thrombin also promotes platelet activation by a mechanism that has many unknown points.
[0019]
[19.] The N-terminal globular domain of GPIbα contains negatively charged amino acid groups. According to some evidence, in transformed CHO cells that express the GPIb-IX complex and platelet GPIbα, the three tyrosine residues (Tyr-276, Tyr-278, Tyr-279) contained in this domain are It is sulfated.
[0020]
  Protein sulfation
[20.] Protein sulfation is a widespread post-translational modification that involves the enzymatic covalent attachment of a sulfate group to a sugar side chain or polypeptide backbone. Since this modification occurs in the Golgi trans layer, it affects only proteins that cross the trans layer. Examples of such proteins are secreted proteins, proteins which are led to granules, and the extracellular domain of cell membrane proteins. The amino acid currently known to be sulfated is tyrosine. J. W. Kehoe et al., Chemistry and Biol. 7: R51-R61 (2000). Perhaps other amino acids, such as threonine, will also be sulfated, especially in diseased cells.
[0021]
[21.] Although many proteins have been shown to undergo tyrosine sulfation, it is rare that more than two sulfated tyrosines are present in a single polypeptide, such as GPIb. GPIbα (CD42) is expressed by platelets and megakaryocytes and mediates platelet binding and rolling to the subendothelial layer and on the subendothelial layer through binding to vWF, but additionally to the N-terminal domain Contains a large number of negative charges. Such highly acidic and hydrophilic environments are considered to be a prerequisite for sulfation. This is because tyrosine sulfating enzymes specifically recognize and sulfate tyrosine adjacent to an acidic amino acid residue. JR Bundgaard et al., JBC 271: 21700-21705 (1997). Complete sulfation of the acidic region of GPIbα causes a region of significantly high negative charge density (13 negative charges in the 19 amino acid segment) to appear, among others It is a candidate site for electrostatic interaction with proteins.
[0022]
  With Selectin PSGL-1
[22.] P-, E- and L-selectin is a family of cell adhesion molecules that mediate, among other things, leukocyte rolling on vascular endothelial cells. P-selectin is stored in platelet granules and is brought to the surface after activation with thrombin, histamine, phorbol esters or other stimulatory molecules. P-selectin is also expressed on activated endothelial cells. E-selectin is expressed on endothelial cells and L-selectin on neutrophils, monocytes, T cells and B cells, respectively.
[0023]
[23.] PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1, aka CD162) is a mucin glycoprotein ligand of P-selectin, E-selectin and L-selectin. PSGL-1 is a disulfide-linked homodimer with a PACE (basic amino acid pair converting enzyme) cleavage site. PSGL-1 also has three potential tyrosine sulfation sites followed by approximately 15 decameric repeat sequences rich in proline, serine and threonine. The extracellular part of PSGL-1 contains three N-linked glycosylation sites and has multiple sialylated, fucosylated O-linked oligosaccharide branches. K. L. Moore et al., JBC 118: 455-456 (1992). Most N-glycan sites and many O-glycan sites are occupied. The structure of PSGL-1 O-glycan derived from human HL-60 cells has already been determined. A subset of these O-glycans are core-2, sialylated and fucosylated structures required for binding to selectins. Tyrosine sulfation of the N-terminal region of PSGL-1 is also required for binding to P-selectin and L-selectin. In addition, there are N-terminal polypeptides that are likely to be cleaved post-translationally.
[0024]
[24.] PSGL-1 has 361 residues in HL60 cells, of which 267 are in the extracellular domain, 25 in the transmembrane domain and 69 in the intracellular domain. . Alternative splicing should not be possible since the PSGL-1 coding sequence is within a single exon. However, PSGL-1 has 15 continuous repeat sequences consisting of a 10-residue consensus sequence present in the extracellular domain in HL-60 cells and in most cell lines, but polymorphonuclear leukocytes, monocytes, And in some other cell lines, such as most naturally occurring leukocytes, the repeat sequences are 14 and 16. PSGL-1 forms disulfide-linked homodimers at the cell surface. V. Afshar-Kharghan et al., Blood 97: 3306-3312 (2001).
[0025]
[25.] PSGL-1 is expressed as a dimer of both 250 kDa and 160 kDa apparent molecular mass on the neutrophil surface, while the dimer form is -220 kDa on the HL-60 surface. When analyzed under reducing conditions, each subunit has a half molecular weight. The difference in molecular mass may be due to the polymorphism of the molecules due to the presence of different numbers of decameric repeat sequences. Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997).
[0026]
[26.] PSGL-1 is expressed on the surface of most blood leukocytes such as neutrophils, monocytes, leukocytes, B cell subsets and T cells, and mediates neutrophil rolling on P-selectin . Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997). PSGL-1 also mediates the neutrophil-neutrophil interaction through binding to L-selectin and thus may mediate inflammation There is also. Snapp, et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998).
[0027]
[27.] PSGL-1 mediates leukocyte rolling on activated endothelial cells, activated platelets, and other leukocytes and sites of inflammation.
[0028]
[28.] A commercially available monoclonal antibody (KPL1) to human PSGL-1 has been generated and shown to inhibit the interaction of PSGL-1 with P-selectin and with PSGL-1 with L-selectin The Mapping the epitope of KPL1 identified a tyrosine sulfation consensus motif (YEYLDYD) of PSGL-1(Snapp et al., Blood 91 (1): 154-164 (1998)). KPL1 recognizes only this specific epitope, and does not cross react with sulfated epitopes present on the surface of other cells such as B-CLL cells, AML cells, metastatic cells, multiple myeloma cells and the like.
[0029]
[29.] Leukocyte rolling is important in inflammation and for anchoring and rolling of leukocytes on blood vessel walls (expressed by activated endothelial cells and also on erythrocytes recruited to the site of injury) P-selectin And PSGL-1 interaction is involved. Ramachandran et al., PNAS 98 (18): 10166-71 (2001); Afshar-Kharghan et al., Blood 97 (10): 3306-7 (2001).
[0030]
[30.] Leukocyte rolling is also important in metastasis, P- and E-selectin on endothelial cells bind to metastatic cells and facilitate extravasation from the bloodstream to surrounding tissues.
[0031]
Platelets are also involved in the metastatic process. That is, when metastatic cancer cells enter the bloodstream, a multicellular complex consisting of platelets and white blood cells covering tumor cells is formed. These complexes, like microtubules, help the tumor escape from the immune system. Coating of tumor cells with platelets requires expression of P-selectin by platelets.
[0032]
Treatment with heparin, which is an inhibitor of P- and L-selectin, inhibits tumor cell-platelet interaction. Pretreatment of tumors with O-sialoglycoprotease, which dissociates sialylated, fucosylated mucin ligands, also inhibited the formation of tumor cell-platelet complexes. Both in vivo experiments result in enhanced monocyte association with circulating tumor cells, suggesting that inhibiting platelet binding increases immune cell access to circulating tumor cells. Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34 (6): 711-7 (2001).
[0033]
[33.] PSGL-1 and GPIb are structurally similar and have a mucin-like hyperglycosylated ligand binding domain. Afshar-Kharghan et al., Blood 97 (10): 3306-7 (2001).
[0034]
[34.] PSGL-1 is on the surface of various leukocytes: monocytes, lymphocytes, activated peripheral blood T cells, granulocytes, eosinophils, platelets, and on the surface of certain CD34 positive stem cells and B cell subsets. But it has been detected. P-selectin is expressed on the surface of activated platelets and endothelial cells. The interaction between P-selectin and PSGL-1 promotes leukocyte rolling on the vascular wall, and abnormal accumulation of leukocytes at the vascular site leads to various pathological inflammations. The stereospecific contribution of individual tyrosine sulfates on PSGL-1 is important for the binding of P-selectin to PSGL-1. Charge is also important for binding, and dilution of NaCl (from 150 mM to 50 mM) enhanced binding (K d ̃75 nM). Tyrosine sulfation on PSGL-1 enhances adhesion of PSGL-1 to P-selectin but is not the ultimate requirement. PSGL-1 tyrosine sulfation assists in slowing rolling adhesion at any shear rate and also supports rolling adhesion at much higher shear rates. Rodgers SD, et al., Biophys J. 81: 2001-9 (2001).
[0035]
  Fibrinogen
[35.] There are two forms of normal human fibrinogen. That is, fibrinogen γ major and fibrinogen γ 'minor variants, both of which are detected in normal individuals. Normal fibrinogen is abundant (̃90% of fibrinogen detected in the human body), two identical 55 kDa alpha (α) chains, two identical 95 kDa beta (β) chains, and two identical 49.5 kDa gamma It consists of (γ) chains. The normal mutant fibrinogen is low in abundance (-10% of fibrinogen detected in the human body), two identical 55 kDa alpha (α) chains, two identical 95 kDa beta (β) chains, and one 49.5 kDa It consists of a gamma (γ) chain and one 50.5 kDa gamma prime (γ ') chain. The γ and γ 'chains are both encoded by the same gene, but alternative splicing occurs at the 3' end. The normal gamma chain consists of amino acids 1-411. The normal variant γ 'chain consists of 427 amino acids, of which amino acids 1-407 are the same as the normal γ chain, and amino acids 408-427 are VRPEHPAET EYDSLYPEDDL. Usually this region is occupied by thrombin molecules.
[0036]
[36.] Fibrinogen is converted to fibrin by the action of thrombin in the presence of ionized calcium, causing blood to clot. Fibrin is also a component of thrombus and acute inflammatory exudate.
[0037]
[37.] Platelet and cell-cell interaction (such as fibrinogen, GPIb, selectin, PSGL-1, etc.) or cell-matrix interaction, platelet-platelet interaction, platelet-cell interaction, platelet-matrix interaction Molecules that play an important role in cell rolling and adhesion, hemostasis, may also be used in various etiologic states or conditions, such as abnormal or etiological inflammation, abnormal or etiological immune response, autoimmune reaction, metastasis, abnormal or etiological Cell adhesion, thrombosis and / or restenosis, abnormal or pathogenic aggregation, etc. also play an important role. Thus, antibodies that cross-react with platelets, and with these molecules, may be useful for the therapeutic diagnosis of diseases and disorders associated with these and other etiologic conditions. Therefore, there is a need to identify epitopes common to these molecules and to identify antibodies that can cross react with it.
[0038]
[38.] The antibodies may be provided in various forms such as fragments, complexes and multimers. Examples of antibody fragments are single chain Fv (scFv) fragments and Fab fragments.
[0039]
[39.] Since the scFv is smaller than a full size antibody, it has been proved to enter tissues and excrete from blood in a shorter time. Adams, GP et al., Br. J. Cancer 77, 1405-1412 (1988); Hudson, PJ, Curr. Opin. Immunol. 11 (5), 548-557 (1999); Wu, AM et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999). Therefore, scFv are often used in diagnostics using radiolabels, such as tumor imaging, in order to accelerate the extracorporeal excretion of radiolabels. Recently, a number of cancer targeting scFv multimers have undergone preclinical evaluation for in vivo stability and efficacy. Adams, G. P. et al., Br. J. Cancer 77, 1405-1412 (1988); Wu, A.M. et al., Tumor Targeting 4, 47 (1999).
[0040]
[40.] Single-chain Fv (scFv) fragments of the antibody heavy chain variable domain (V_HAnd light chain variable domains (V_LAnd the two are linked by a polypeptide linker. Since the linker is sufficiently long (V_HAnd (V)_L) Domains are folded into functional Fv domains. Therefore, scFv can recognize its target and bind to the target with an affinity equal to or better than that of the parent antibody.
[0041]
[41.] Generally, scFv monomer is V_HThe C-terminus of the domain is V with a polypeptide linker_LIt is designed to be bound to the N terminus of the domain. Or vice versa_LThe C-terminus of the domain is V with a polypeptide linker_HIt may be linked to the N-terminus of the domain. Power, B. et al., J. Immun. Meth. 242, 193-204 (2004). The polypeptide linker is generally about 15 amino acids in length. When the linker is shortened to about 3 to 7 amino acids, the scFv will not fold into a functional Fv domain and instead will associate with the second scFv to form a diabody. When the length of the linker is further shortened to less than 3 amino acids, the assembly of scFv forms a trimer or tetramer depending on the linker length, composition, and Fv domain orientation. B. E. Powers, P. J. Hudson, J. Immun. Meth. 242 (2000) 193-194.
[0042]
[42.] Recently, it has been discovered that multivalent antibody fragments, such as dimers, trimers and tetramers of scFv often exhibit higher affinity than the binding of a parent antibody to a target. In tumor targeting applications this high affinity leads to potential benefits such as improved pharmacokinetics. In addition, scientists have shown that cells expressing dimeric PSGL-1 are more stable due to this high binding affinity, from studies of P-selectin and its ligand PSGL-1 involved in leukocyte tethering and rolling. It is concluded that it shows good rolling adhesion. These bonds are more resistant to shear and have less variation in rolling speed. Ramachandran et al., PNAS, vol. 98 (18): 10166-71 (2001).
[0043]
[43.] Increasing the binding affinity of these multivalent products may be advantageous for diagnosis and treatment planning. For example, the scFv may be used as a blocking agent that binds to the target receptor and blocks the binding of the "native" ligand. In that case, the association affinity between the scFv and the receptor should be increased to make it difficult to dissociate and prevent undesired binding of the natural ligand to the target. Furthermore, this high affinity may also be advantageous when the target receptor is involved in adhesion or rolling or when the target receptor is on the surface of cells, eg platelets, in high shear flow areas.
[0044]
[44.] One object of the present invention is to provide an isolated epitope, which comprises cell rolling and inflammation, immune reaction, infection, autoimmune reaction, metastasis, cell adhesion, thrombosis and / or restenosis. It is useful for processes such as aggregation and derived from various molecules present on the surface of diseased cells such as AML cells, B-CLL cells, multiple myeloma cells, metastatic cells and the like.
[0045]
[45.] Another object of the present invention is to provide methods of using such isolated epitopes, wherein the object of the method is cell rolling or inflammation, immune response, infection, autoimmune reaction, metastasis, cell adhesion, It is useful for processes such as thrombosis and / or restenosis, aggregation and recognizes epitopes on molecules present on the surface of diseased cells such as AML cells, B-CLL cells, multiple myeloma cells, and metastatic cells. And the development of antibodies that cross-react with such epitopes.
[0046]
[46.] Another object of the present invention is a drug for inhibiting cell rolling and inflammation, immune reaction, infection, autoimmune reaction, metastasis, cell adhesion, thrombosis and / or restenosis, aggregation and the like, and a disease For example, AML, B-CLL, multiple myeloma, metastasis, cardiovascular disease such as myocardial infarction, retinal disease, disease caused by sulfated tyrosine-dependent protein-protein interaction, and cell function or action as described above are important Use of such antibodies in the development and delivery of drugs to treat other diseases that play a
[0047]
[47.] Individuals' various disease states such as AML, B-CLL, multiple myeloma and metastasis, or cell rolling and inflammation, immune reaction, infection, autoimmune reaction, metastasis, cell adhesion, thrombosis and / or restenosis It is also an object of the present invention to use the above epitopes and antibodies in diagnostic methods for other diseases in which cellular functions or actions such as, aggregation, etc. play an important role.
[0048]
[48.] The provision of multivalent antibodies, fragments and complexes is also an object of the present invention. More specifically, it is an object of the present invention to provide dimers, trimers and tetramers, also referred to herein as diabodies, triabodies and tetrabodies, respectively. It is the purpose.
[0049]
[49.] These and other objects of the invention are described herein.
[0050]
Summary of the invention
[50.] The present invention provides ligands and receptors detected on ligands and receptors that play important roles in various processes such as inflammation, immune reaction, metastasis, cell adhesion, thrombosis, restenosis, aggregation and the like. The epitopes of the invention are also detected on the surface of leukemia / tumor cells, in particular myeloid leukemia cells. Thus, these epitopes are useful targets for therapeutic mediation of these processes. Antibodies against such epitopes may be cancer drugs (anti-tumor drugs, anti-metastatic drugs), leukemia, autoimmune diseases, inflammatory diseases, cardiovascular diseases such as myocardial infarction, other diseases with retinal diseases and platelet dysfunction, sulfate It is useful as a therapeutic agent for diseases caused by altered tyrosine-dependent protein-protein interactions. The present invention provides the antibody, a composition containing the antibody, and a therapeutic diagnostic method using the antibody.
[0051]
[51.] The present invention has the following formula:
[Image 11]

Providing an isolated epitope comprising During the ceremony
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Chemical formula 12]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
[0052]
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  q is 1 to 6,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; if q = 1 then r = 1 and if q> 1 one or more of Y are sulfated Furthermore, the isolated epitope has an antibody with a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising the antibody or a binding fragment thereof It can bind.
[0053]
[52.] The present invention provides an isolated epitope comprising Formula (I), wherein the sulfated moiety is a peptide conjugate or glycoconjugate or lipoconjugate or complexes thereof.
[0054]
[53.] The present invention is also an isolated epitope comprising Formula I, wherein W is glycine and Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamate, Provided is an isolated epitope which is gamma carboxy glutamic acid or aspartic acid and q is 1, 2 or 3. In certain of these embodiments, Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3, and r is 1.
[0055]
[54.] The present invention has the following formula:
Embedded image

Providing an isolated epitope comprising During the ceremony
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Image 14]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
[0056]
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
Where, if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; and one or more Y are sulfated; and further, the isolated epitope is SEQ ID NO: 8 or An antibody having a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising an antibody or binding fragment thereof may bind.
[0057]
[55.] The present invention provides an isolated epitope comprising Formula (II), wherein the sulfated moiety is a peptide conjugate or glycoconjugate or lipoconjugate or complexes thereof.
[0058]
[56.] The present invention is also an isolated epitope comprising Formula (II), wherein W is glycine and Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, wherein A is Provided is an isolated epitope which is glutamic acid, gamma carboxy glutamic acid or aspartic acid, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine. In certain of these embodiments, Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3, and r is 1.
[0059]
[57.] The present invention has the following formula:
[Image 15]

Providing an isolated epitope comprising During the ceremony
  G is glycine,
  E is glutamate,
  D is aspartic acid,
  Y is tyrosine,
  S is a sulfate or sulfate molecule,
  X is any amino acid other than the above,
  z is 0, 1 or 2;
  t is 1, 2 or 3 and
  r is 0 or 1;
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But where one or more Y's are sulfated; m> 0 if n = 0; n> 0 if m = 0; furthermore, the isolated epitope is SEQ ID NO: 8 or SEQ ID An antibody having a first hypervariable region containing NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing an antibody or a binding fragment thereof may bind.
[0060]
[58.] The present invention provides an isolated epitope comprising Formula (III), wherein r is 1.
[0061]
[59.] In any of the above embodiments, Y may contain lipids, carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins, and / or lipopolysaccharide molecules.
[0062]
[60.] The present invention also provides derivatives, homologs, mimetics or variants of the above epitopes, and also provides the above epitopes that have undergone one or more post-translational modifications in addition to sulfation.
[0063]
[61.] The present invention provides a composition comprising one or more of the above-mentioned isolated epitopes. Also provided is an isolated nucleotide encoding at least a portion of the epitope.
[0064]
[62.] The present invention also provides an antibody capable of binding or cross-reacting with one or more of the above epitopes, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
[0065]
[63.] Also provided is a method of producing an antibody capable of binding or cross-reacting with one or more of the above epitopes, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof. The method comprises the steps of: (a) preparing a phage display library, (b) preparing one of the epitopes, (c) panning the phage display library to Selecting a phage particle displaying an oligopeptide or polypeptide capable of binding to the isolated epitope, and (d) an antibody comprising the oligopeptide or polypeptide capable of binding to the isolated epitope, or a binding fragment thereof, or the antibody Or produce a complex comprising the binding fragment.
[0066]
[64.] The present invention is also an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which comprises SEQ ID NO: 25 [Y1 scFv] and / or SEQ ID An antibody, a fragment or a complex thereof which has the ability to bind a scFv antibody fragment of NO: 203 [Y17 scFv] is provided.
[0067]
[65.] An antibody, antibody fragment or antibody complex capable of binding to a peptide or polypeptide having a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 8 [Y1 CDR3] or SEQ ID NO: 20 [Y17 CDR3] Provided. In certain of these embodiments, the peptide or polypeptide has a second hypervariable region comprising SEQ ID NO: 115 and / or a third hypervariable region comprising SEQ ID NO: 114.
[0068]
[66.] An antibody, antibody fragment or antibody complex capable of binding to a peptide epitope or polypeptide epitope of about 3 to 126 amino acid residues in length comprising one or more sulfated tyrosines and two or more acidic amino acids is provided. Be done. In certain of these embodiments, the epitope further comprises one or more leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine residues. In certain of these embodiments, one or more of the two or more acidic amino acid residues replace leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine residues. In another embodiment, the epitope comprises DYD or EYE. In certain embodiments, the epitope is DYD or EYE. In yet another embodiment, the epitope comprises DYE or EYD.
[0069]
[67.] In certain embodiments, the antibodies, antibody fragments and antibody complexes provided according to the present inventionLipid,It can be linked to an epitope on carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins and / or lipopolysaccharide molecules. Preferably, the antibody of the present invention, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereofLipid,It can be linked to carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins and / or lipopolysaccharide epitopes. In many embodiments, theLipid,Carbohydrates, peptides, glycolipids, glycoproteins, lipoproteins and / or lipopolysaccharide molecules contain one or more sulfated moieties.
[0070]
[68.] The present invention relates to an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα, heparin, lumican, complement An antibody, a fragment thereof or a complex thereof capable of binding to two or more different molecules selected from the group consisting of body complex 4 (CC4), inter-alpha inhibitor and prothrombin, but not necessarily simultaneously. The antibodies, antibody fragments or complexes of the invention will also bind to any analogues of these proteins as long as the receptor epitope remains intact.
[0071]
[69.] In certain preferred embodiments, the antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα, lumican Can bind to two or more proteins selected from the group consisting of complement complex 4, inter-alpha inhibitor, prothrombin and heparin, and also diseased cells such as B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic An antibody, a fragment thereof or a complex thereof capable of binding to a cell is provided. In certain embodiments, the antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα, heparin, lumican, complement An antibody, a fragment thereof or a complex thereof which can bind to each of complex 4 (CC4), an interalpha inhibitor and prothrombin is provided. In certain embodiments, an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, which binds to each of PSGL-1, fibrinogen γ ', GPIbα and heparin Potential antibodies, fragments thereof or complexes thereof are provided, and in certain preferred embodiments these antibodies, antigen binding fragments thereof, or complexes thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof It can also bind to cells such as B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells.
[0072]
[70.] The present invention relates to an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprising PSGL-1, fibrinogen γ ', heparin, GPIbα, lumican, cog- Antibody that can bind to two or more different molecules selected from the group consisting of body complex 4 (CC4), inter-alpha inhibitors and prothrombin, and can further bind to an epitope on carbohydrate and / or lipid molecules, fragments thereof Or provide the complex. In certain of these embodiments, the epitope on carbohydrate and / or lipid molecules comprises one or more sulfated moieties.
[0073]
[71.] The present invention relates to an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, wherein each of the one or more sulfated tyrosine residues in the acidic amino acid group And antibodies or fragments thereof or complexes thereof that can cross-react with two or more epitopes. In certain of these embodiments, the antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof comprises B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastases. It may cross react with one or more cell types selected from the group consisting of sexual cells. In certain other of these embodiments, the antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof may cross-react with PSGL-1. Preferably, an antibody capable of cross-reacting with PSGL-1, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof binds to the epitope QATEYEYLDYDFLPETE comprising one or more sulfated tyrosine residues .
[0074]
[72.] In certain other of these embodiments, the antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof may cross-react with GPIb-α. Preferably, an antibody capable of cross-reacting with GPIb-α, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, comprises one or more of the epitopes DEGDTDLYDYYPEEDTEGD, comprising one or more sulfated tyrosine residues Epitope TDLYDYYPEEDTE containing sulfated tyrosine residues, Epitope GDEGDTDLYDYYP containing one or more sulfated tyrosine residues, Epitope YDYYPEE containing one or more sulfated tyrosine residues, and / or one or more sulfated tyrosine residues It binds to the epitope TDLYDYYP.
[0075]
[73.] In yet another of these embodiments, the antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof may cross-react with fibrinogen γ '. Preferably, an antibody capable of cross-reacting with fibrinogen γ ', an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof binds to an epitope EPHAETEYDSLYPED comprising one or more sulfated tyrosine residues .
[0076]
[74.] Among these other embodiments, an antibody capable of cross-reacting with heparin, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof is provided.
[0077]
[75.] In still other embodiments of these, an antibody capable of cross-reacting with complement complex 4 (CC4), an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof Provided. Preferably, an antibody capable of cross-reacting with CC4, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof binds to the epitope MEANEDYEDYEYDELPAK comprising one or more sulfated tyrosine residues.
[0078]
[76.] The present invention also provides an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies that can bind to the aforementioned protein fragments, analogs, variants and mimetics as long as the epitope is essentially intact. And a complex thereof comprising the antibody or binding fragment thereof.
[0079]
[77.] The present invention provides an antibody capable of cross-reacting with one or more cell types selected from the group consisting of B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells and metastatic cells, an antigen-binding fragment thereof, Alternatively, provided is a complex comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
[0080]
[78.] The present invention also provides an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof, having the following capabilities: cellular rolling inhibition; inflammation inhibition; Disease inhibition; thrombosis inhibition; restenosis inhibition; metastasis inhibition; tumor cell growth and / or replication inhibition; tumor cell death enhancement; leukemia cell growth and / or replication inhibition; leukemia cell death enhancement; Increased sensitivity of tumor cells to anti-cancer drugs; increased sensitivity of leukemia cells to anti-leukemic drugs; suppression of increased number of tumor cells in tumor patients; decreased number of tumor cells in cancer patients; leukemia Suppression of leukemia cell number increase in patients; reduction of leukemia cell numbers in leukemia patients; inhibition of cell-cell, cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet complex formation; cell-cell , Inhibition of cell-matrix, platelet-matrix, platelet-platelet and / or cell-platelet adhesion; aggregation.
[0081]
[79.] An antibody of the present invention, an antigen-binding fragment thereof, or an effective amount thereof for inhibiting, treating or alleviating the action of a disease and / or condition of interest, or preventing a disease and / or condition of interest. Pharmaceutical compositions are provided which contain one or more antibodies or conjugates thereof comprising binding fragments thereof.
[0082]
[80.] The present invention inhibits, treats or acts the action of a disease and / or condition of interest of an antibody of the present invention, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof. It prescribes the use in the manufacture of a medicament for the alleviation or prevention of a disease and / or condition of interest.
[0083]
[81.] The antibody of the present invention, an antigen-binding fragment thereof, which is used as a medicament for inhibiting, treating or alleviating the action of a targeted disease and / or condition, or preventing a targeted disease and / or condition Or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
[0084]
[82.] The present invention is a method of inhibiting, treating or alleviating the action of a disease and / or condition of interest, or preventing a disease and / or condition of interest, in a patient in need of such treatment, There is provided a method comprising the step of administering a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an antibody of the invention, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies or conjugates thereof comprising the antibody.
[0085]
[83.] The antibody of the present invention, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof containing one or more antibodies or binding fragments thereof may be conjugated or conjugated to an agent.
[0086]
[84.] The present invention relates to an anticancer drug, an antimetastatic drug, an anti-leukemic drug, an anti-disease drug, an anti-adhesive drug, an anti-thrombotic drug, an anti-restenotic drug, an anti-autoimmune drug, an anti-coagulant drug, and an antibacterial drug An antibody complexed or conjugated to an agent selected from the group consisting of an antiviral agent and an anti-inflammatory agent, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
[0087]
[85.] The present invention is also directed to one or more toxins, radioisotopes and antibodies complexed or conjugated to a therapeutic agent, antigen-binding fragments thereof, or complexes thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof I will provide a.
[0088]
[86.] The present invention relates to an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or one or more antibodies or binding fragments thereof, which is bound or conjugated to a base or carrier capable of binding or conjugation with one or more agents. Provide the complex that it contains. Examples of such bases or carriers are dextrans, lipophilic polymers,Hydrophobic Rimmer,Such as HPMA and liposomes.
[0089]
[87.] The present invention also provides an antibody conjugated or conjugated with a radioactive isotope or another imaging agent, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof. Also provided is a diagnostic kit comprising an antibody of the invention, an antigen binding fragment thereof, or a conjugate thereof comprising one or more antibodies or binding fragments thereof.
[0090]
[88.] The present invention provides an isolated epitope comprising the GPIbα amino acid sequence Tyr276-Glu282 in which one or more of the amino acids 276, 278 and 279 is sulfated. In a preferred embodiment, the epitope further comprises GPIbα amino acids 283-285.
[0091]
[89.] The present invention also provides an antibody capable of binding to an epitope comprising the GPIbα amino acid sequence Tyr276 to Glu282 in which one or more of the amino acids 276, 278 and 279 is sulfated, an antigen-binding fragment thereof, or 1 The above antibody or a conjugate thereof comprising the binding fragment thereof is provided, but the binding is enhanced when the epitope further comprises GPIbα amino acids 283 to 285.
[0092]
[90.] An isolated GPIbα N-terminal peptide of apparent molecular mass about 40 kDa, comprising an epitope of the sequence YDYYPEE, comprising one or more sulfated tyrosine residues in the epitope, and one or more of the amino acids 276, 278 and 279 Also provided is an isolated GPIbα peptide consisting of amino acids 1 to 282, wherein
[0093]
[91.] The present invention also provides a polyclonal antibody, antibody fragment or antibody complex that interacts with the light chain variable region of human monoclonal antibody scFv Y1. In certain embodiments, the polyclonal antibody, antibody fragment or antibody complex is an NdeI-EcoRI restriction fragment of the light chain variable region of human monoclonal antibody Y-1.Encoded byCross react with. Diagnostic kits comprising such polyclonal antibodies are also provided.
[0094]
Definition of terms
[92.] An antibody (Ab) or an immunoglobulin (Ig) is a protein molecule that binds to an antigen, and consists of four polypeptide chains (2 × heavy chain, 2 × light chain) linked by disulfide bonds. Each polypeptide chain has a constant region and a variable region. Antibodies or immunoglobulins can be divided into five classes, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, depending on their light chain components. IgG for IgG₁, IgG₂, IgG₃And IgG_FourThere are several subclasses, including Immunoglobulins are produced by B lymphocytes in vivo, recognize specific foreign antigenic determinants, and facilitate excretion of the antigens.
[0095]
[93.] Antibodies may be produced and used in a variety of forms, including antibody complexes. As used herein, "antibody complex" means a complex of one or more antibodies and another antibody, or a complex of one or more antibody fragments, or a complex consisting of two or more antibody fragments. Examples of antibody fragments are Fv, F (ab ')₂, F (ab ') and Fd fragments.
[0096]
[94.] Fv used in the present specification and claims is a molecule consisting of the heavy chain variable region of human antibody and the light chain variable region of human antibody, wherein the heavy chain variable region is the light chain variable region It refers to a molecule linked, linked, fused or covalently linked or associated, but both human antibodies may be the same or different. Fv may be single chain Fv (scFv) or disulfide stabilized Fv (dsFv). The scFv consists of the variable domain of each of the antibody heavy chain and light chain linked by a flexible amino acid polypeptide spacer or linker. The linker may be branched or linear. The linker preferably consists of 0 to 15 amino acid residues (Gly_FourSer)₃Is most preferred.
[0097]
[95.] Fv molecules themselves consist of a first strand and a second strand, each strand having first, second and third hypervariable regions. These hypervariable loops within the heavy and light chain variable domains are referred to as complementarity determining regions (CDRs). In the heavy chain and light chain, there are CDR1, CDR2 and CDR3 regions, respectively. These regions are believed to form an antigen binding site, and specific modification can enhance binding activity. Of these regions, the most naturally occurring variable is the heavy chain CDR3 region. This CDR3 region is believed to be the most exposed region in an Ig molecule and, as described herein, is the site that primarily contributes to the observed selective and / or specific binding properties. .
[0098]
[96.] Fragments of Fv molecules are defined as any molecule smaller than the original Fv and still maintaining the selective and / or specific binding properties of the original Fv. Non-limiting examples of such fragments are: (1) minibodies comprising fragments only of Fv heavy chains, (2) microbodies comprising small partial units of antibody heavy chain variable regions (PCT application no. PCT / IL99 / 00581), (3) analogs comprising light chain fragments, and (4) analogs comprising functional units of the light chain variable region.
[0099]
[97] As used herein, a "Fab fragment" is a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin. Fab fragments consist of the light chain and part of the heavy chain.
[0100]
[98.] F (ab ')₂The fragment is a bivalent antigen binding fragment of an immunoglobulin obtained by pepsin digestion. It consists of both light chains and part of both heavy chains.
[0101]
[99.] Fc fragments are non-antigen binding portions of immunoglobulins. It contains the carboxyl terminal part of the heavy chain and the binding site corresponding to the Fc receptor.
[0102]
[100.] The Fd fragment is the variable region and first constant region of an immunoglobulin heavy chain.
[0103]
[101.] Polyclonal antibodies are products of immune response and are formed by a large number of different B lymphocytes. Monoclonal antibodies are derived from single cells.
[0104]
[102.] A cassette, as applied to a polypeptide and defined in the present invention, refers to a contiguous amino acid of a given sequence that functions as a framework, also considered as a single unit, and manipulated as such. Amino acids may be substituted, inserted, removed or added at one or both ends thereof. Similarly, substitution, insertion, removal or addition of a series of amino acids is possible at one or both ends.
[0105]
[103.] As used herein, the term "epitope" is an antigenic determinant or antigen binding site that interacts with an antibody, an antibody fragment, a complex comprising an antibody complex or a binding fragment thereof, or a T cell receptor. Say what to do. The term epitope is used interchangeably herein with the terms ligand, domain and binding region.
[0106]
[104.] The selectivity here is to select and bind to one cell type or cell phase that is specific for the targeting molecule from the cell type or mixture of cell types or cell types or cell stages. Say the ability to
[0107]
[105.] As used herein, the term "affinity" is an index (binding constant) of the avidity of a receptor (such as one binding site on an antibody) and a ligand (such as an antigenic determinant). The sum of the noncovalent interactions between a single antigen binding site on an antibody and a single epitope is the affinity of the antibody to the epitope. Low affinity antibodies are susceptible to dissociation due to weak binding to the antigen, and high affinity antibodies maintain binding longer because they are more strongly bound to the antigen. The term "avidity" reflects the valency of an antigen-antibody interaction, which is different from affinity.
[0108]
[106.] Specificity of antibody-antigen interactions: Although antigen-antibody reactions are specific, antibodies elicited by one antigen may cross-react with another unrelated antigen. Such cross-reactivity occurs when two different antigens share homologous or similar epitopes or their anchor regions, or antibodies specific for one epitope are related to unrelated epitopes with similar chemical properties. It is a case of bonding.
[0109]
Platelets are disc-like cytoplasmic fragments of megakaryocytes that are produced in the marrow cavity and then circulate in the peripheral blood stream. Platelets have several physiological functions, including a large role in thrombus formation. Platelets contain granules in the center and clear protoplasms in the periphery, but without clear nuclei.
[0110]
[108.] Agglutination here refers to the process by which suspended bacteria, cells, discs or other particles of similar size adhere to one another to form a mass. This process is similar to sedimentation, but the particles are larger than in sedimentation and are in suspension rather than in solution.
[0111]
[109.] Aggregation refers to the aggregation of thrombin and collagen as part of a continuous mechanism leading to in vitro induced aggregation of platelets and the formation of a thrombus or thrombus.
[0112]
[110.] Conservative amino acid substitutions are changes in amino acid composition by altering one or two amino acids of a peptide, polypeptide or protein, or fragments thereof. This is a substitution between amino acids that is generally similar in nature (eg, acidic, basic, aromatic, size, positive or negative, polar, nonpolar, etc.), and this substitution results in the nature of the peptide, polypeptide or protein ( charge,Isoelectric point, Affinity, avidity, conformation, solubility, etc.) or activity does not change substantially substantially. Such conservative amino acid substitutions will generally be substitutions between the following amino acid groups:
(i) glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L) and isoleucine (I)
(ii) aspartic acid (D) and glutamic acid (E)
(iii) alanine (A), serine (S) and threonine (T)
(iv) histidine (H), lysine (K) and arginine (R)
(v) Asparagine (N) and glutamine (Q)
(vi) phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W)
[0113]
[111.] Conservative amino acid substitutions can also be made on both sides of the hypervariable region mainly contributing to the selective and / or specific binding properties of the molecule, as well as other parts such as cassettes of heavy chain variable regions. Additionally or alternatively, the full-sized antibody, diabody (dimer), triabody (trimer) and / or tetrabody (tetramer) are mutated by molecular rearrangement. Alternatively, minibodies or microbodies can be formed.
[0114]
[112.] A phagemid is a phage particle carrying plasmid DNA. A phagemid is a plasmid vector designed to contain an origin of replication from filamentous phage, such as m13 or fd. Since the phagemid particles carry plasmid DNA, they do not have enough space to accommodate the entire phage genome. The part missing from the phage genome is information essential for phage particle packaging. Therefore, in order to propagate the phage, it is necessary to culture the desired phage particle with a helper phage strain that complements the missing packaging information.
[0115]
[113.] A promoter is a region of DNA on which RNA polymerase binds and initiates transcription.
[0116]
[114.] A phage display library (also referred to as phage peptide / antibody library, phage library or peptide / antibody library) is a large population in which each phage particle is displaying a different peptide or polypeptide sequence. Of the phage (generally 10⁸~Ten⁹Each). These peptides or polypeptide fragments may be constructed of variable length. The displayed peptide or polypeptide may be derived from human antibody heavy or light chain, but is not so limited.
[0117]
[115.] The pharmaceutical composition is a formulation comprising the peptide or polypeptide of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent thereof.
[0118]
[116.] The term "agent" refers to a substance useful for preventing, treating or diagnosing a disease in a mammal including, but not limited to, human, cow, horse, pig, mouse, dog, cat or any warm-blooded animal. The agent is selected from the group comprising radioactive isotopes, toxins, oligonucleotides, recombinant proteins, antibody fragments and anticancer drugs. Non-limiting examples of such agents are antivirals such as acyclovir, ganciclovir and zidovudine; antithrombotic / restenotic agents such as cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium and aspirin; antiinflammatory agents such as zaltoprofen, pranoprofen, droxicam, acetylyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtormetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib, nimesulide; anti-autoimmune agents such as leflunomide, denileukin diftitox, sblomu, SDF, defibrotide and cyclophosphamide; and anti-adhesive / anti-agglutinating agents such as limaprost, chlorchromen and hyaluronic acid.
[0119]
[117.] Anti-leukemic agents are drugs with anti-leukemic activity. Anti-leukemic agents are, for example, agents that inhibit or arrest the growth of leukemia cells or immature pre-leukemia cells, agents that injure leukemia or pre-leukemia cells, agents that enhance the sensitivity to leukemia or other pre-leukemia cells and other anti-leukemia agents And drugs that inhibit leukemia cell metastasis. In the present invention, the anti-leukemic drug may be an anti-angiogenic drug that prevents, inhibits, suppresses or arrests tumor angiogenesis.
[0120]
[118.] Gene expression patterns can be studied, for example, by analyzing the amount of gene product produced at various times, at specific times, or in various tissues. A gene is considered "overexpressed" if the amount of gene product exceeds that found in normal or non-abnormal controls.
[0121]
[119.] Although specific cells will express a protein on their surface with a binding site corresponding to a specific antibody, that binding site is hidden in cells that can also be called the first step (step I). It may be present in a form (eg steric hindrance or lack the mechanism required for antibody binding). Stage I may be, for example, a normal, healthy non-abnormal condition. An epitope is not recognized by a given antibody when present in a hidden manner. That is, the antibody does not bind to this epitope, or to predetermined cells of phase I. However, epitopes may also be exposed, for example, by self-mutation or by mutation of nearby or associated molecules. Examples of mutations are changes in folding, changes in post-translational modification, changes in phospholipidation, changes in sulfation, changes in glycosylation and the like. Such mutations may occur when cells move to a different state, which can also be referred to as Stage II (Stage II). Examples of Stage II are activation, proliferation, transformation, or malignant conditions. The mutated epitope is exposed so let the antibody bind.
[0122]
[120.] A peptidomimetic is a small molecule, a peptide, a polypeptide, a lipid, a polysaccharide or a conjugate thereof, which has the same functional action or activity as another chemical species, such as an antibody.
[0123]
Detailed Description of the Invention
[173.] In the present invention, whole cells were used to select a specific antibody that recognizes a determinant on the surface of a leukemia cell when the specific receptor is unknown or unknown. In addition, phage were selected by panning into one or more cell types using a multistep biopanning method. This is a significant improvement compared to prior art methods where selection of antigen-specific phage antibodies was largely dependent on biopanning to immobilized single antigen and the specific gravity of selection using whole cells as a target was small. .
[0124]
[174.] Certain epitopes identified in this multi-step method are preferably sulfated moieties, such as sulfated tyrosine residues or sulfated carbohydrates or lipid moieties within an amino acid group consisting of two or more acidic amino acids. Ligands and receptors that are characterized by their presence and play an important role in various processes such as inflammation, immune response, infection, autoimmune reaction, metastasis, cell adhesion, thrombosis and / or restenosis, cell rolling, and aggregation. Is detected on the surface of This type of epitope is also detected on the surface of diseased cells such as B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells, and metastatic cells. These epitopes are useful as targets for therapeutic modulation of these processes and targets for diagnostic methods.
[0125]
[175.] Although these epitopes have variable primary amino acid sequences, antibodies produced against this type of sulfated epitope are often not always simultaneous with multiple such epitopes on multiple molecules. However, they bind or cross react. Such antibodies can be used as anti-cancer drugs (as anti-metastatic drugs), cancer therapeutics, leukemia, autoimmune diseases, viral diseases, diseases with abnormal aggregation, diseases with abnormal adhesion, infarct, cardiovascular diseases and inflammatory It is effective as a therapeutic drug for diseases and the like.
[0126]
[176.] Human scFv Y1 antibody was isolated from a phage-displayed human antibody library for immobilized human platelet screening for the purpose of identifying an antibody that binds to platelets. Several clones (different scFv antibodies) were isolated and analyzed. One of them (designated as Y1) was unexpectedly found to bind to leukemia cells derived from AML patients and certain other leukemia patients. Another clone (Y17) isolated by panning on immobilized platelets was also found to bind human blood.
[0127]
[177.] Proteins extracted from human platelets are subjected to Western blot analysis using Y1 scFv antibody and Y17 scFv antibody on SDA-PAGE, on the platelet surface to which both antibodies bindEpitoe TheAn attempt was made to identify By this method, it was revealed that the Y1 scFv and Y17 scFv epitopes on platelets were glycocalicin, one of the subunits of the CD42 complex.
[0128]
[178.] Extracellular fragments of human platelet-derived glycocalicin were purified from activated platelets. It was cleaved with various proteases such as ficin, mokaragin, cathepsin G etc to ensure that the location of the Y1 binding epitope on the glycocalicin molecule was pinpointed. Western blot analysis was performed using the Y1 antibody as a detection means. In addition, commercially available anti-glycocalysin antibodies (antibodies known to bind to different epitopes of glycocalicin) are used to competitively bind Y1 antibodies to determine Y1 binding epitopes on glycocalicin. evaluated.
[0129]
[179.] From the results, it was concluded that amino acids 272 to 285 of glycocalicin play a major role in binding of Y1 to glycocalicin. Moreover, since the N-terminal polypeptide (amino acids 1-340 and 1-480) of E. coli-derived recombinant glycocalicin was not detected by the Y1 antibody, binding to the epitope of Y1 may occur in E. coli. We came to the conclusion that it depends on posttranslational modifications such as unknown glycosylation or sulfation.
[0130]
[180.] In order to test this hypothesis, purified glycocalicin was treated with an enzyme that releases N-linked and O-linked sugar chains from proteins (glycosidase) and an enzyme that releases sulfate groups from proteins (sulfatase). The binding of the Y1 antibody to glycocalicin or glycocalicin fragments was not affected by glycosidases. This result suggests that the sulfate group is essential for the binding of Y1 to glycocalicin.
[0131]
[181.] In order to further validate these results, sulfated and non-sulfated synthetic peptides are prepared based on the identified epitope (amino acids 272 to 285 of glycocalicin), and used to glycoglycin in the presence thereof. The binding specificity of the Y1 antibody was evaluated (ELISA method). Although the sulfated peptide inhibited the binding of the Y1 antibody to glycocalicin many times more strongly than in the case of the related non-sulfated peptide, it suggested that the binding required the sulfation.
[0132]
From the above experimental results, it was concluded that the epitope corresponding to the Y1 antibody is located on glycocalicin between the amino acids 272 and 285 in which the negatively charged amino acid group is present.
[0133]
[183.] In parallel, the binding of Y1 antibody to KG-1 cells (a human cell line from AML patients), various human plasma derived proteins and primary blood samples of leukemia patients was examined.
[0134]
[184.] The Y1 antibody has two human plasma-derived proteins, a protein with a molecular mass of -50 kD identified as fibrinogen γ ', and a molecular mass of -80 kD identified with complement complex 4 (CC4) and human lumican It has been found that it binds with relatively low affinity to proteins of These proteins contain sulfated tyrosine residues and a series of negatively charged amino acids associated with them.
[0135]
[185.] The Y1 ligand on the KG-1 cell surface was identified as PSGL-1, a receptor for E-, L- and P-selectin. The basis for identifying PSGL-1 as a Y1 antibody ligand on the surface of KG-1 cells is a competitive binding assay (testing the binding of Y1 antibody to KG-1 cells in the presence of various commercial anti-PSGL-1 antibodies And the results of a series of experiments using sulfated and non-sulfated synthetic peptides derived from the N-terminal site of PSGL-1. The N-terminal site of PSGL-1 contains sulfated tyrosine residues and a series of negatively charged amino acids associated with them.
[0136]
[186.] Although the Y1 antibody binds to several molecules such as glycocalicin on the platelet surface, fibrinogen γ 'on human platelets, complement complex 4 in human plasma, and PSGL-1 molecules on the surface of GK-1 cells, etc.? Or its affinity to primary leukemia cells derived from multiple myeloma patients is orders of magnitude higher than in the case of the aforementioned epitopes. Furthermore, the commercially available anti-PSGL-1 antibody (KPL1) does not recognize all the affected primary leukemia cells in the patient-derived blood sample (7 out of 12), but the Y1 antibody specifically and selectively The fact of recognition suggests that there is an additional Y1 antibody corresponding epitope different from the epitope on the KG-1 cell surface on the surface of the primordial leukemic cells.
[0137]
[187.] Examples of the sulfated epitope of the present invention are those represented by the formulas (I), (II) and (III), their derivatives, homologues, mimetics, variants and the like.
Formula (I):
Embedded image

During the ceremony
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Image 17]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
[0138]
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  q is 1 to 6,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; if q = 1 then r = 1 and if q> 1 one or more of Y are sulfated Furthermore, the isolated epitope has an antibody with a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising the antibody or a binding fragment thereof It can bind.
[0139]
[188.] A preferred epitope is the epitope shown in Formula I, wherein W is glycine, Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamic acid, γ It is carboxy glutamic acid or aspartic acid, q is 1, 2 or 3. In certain embodiments, Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3, and r is 1.
[0140]
Formula (II):
[Image 18]

During the ceremony
  W is any amino acid except aspartic acid and glutamic acid,
  Y is any natural moiety that can be sulfated,
  P is
[Image 19]

And
  S is a sulfate or sulfated molecule,
  X is any amino acid except for aspartic acid, glutamic acid or tyrosine
[0141]
  A is any negatively charged amino acid or leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine,
  z is 0, 1 or 2;
  r is 0 or 1;
  t is 1, 2 or 3 and
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
Where, if n = 0 then m> 0; if m = 0 then n> 0; and one or more Y are sulfated; and further, the isolated epitope is SEQ ID NO: 8 or An antibody having a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising an antibody or binding fragment thereof may bind.
[0142]
[189.] A preferred epitope is the epitope of formula (II), wherein W is glycine, Y is a peptide conjugate of tyrosine or a glycoconjugate of asparagine, serine or threonine, A is glutamic acid, γ carboxy glutamic acid or aspartic acid, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, serine or glycine. In certain embodiments, Y is a peptide conjugate of tyrosine, q is 3, and r is 1.
[0143]
Formula (III):
[Image 20]

During the ceremony
  G is glycine,
  E is glutamate,
  D is aspartic acid,
  Y is tyrosine,
  S is a sulfate or sulfate molecule,
  X is any amino acid other than the above,
  z is 0, 1 or 2;
  t is 1, 2 or 3 and
  r is 0 or 1;
  u is 0-2 and
  n is 0 to 3,
  m is 0 to 3
But where one or more Y's are sulfated; n> 0 if m> 0; m = 0 if n> 0; furthermore, the isolated epitope is SEQ ID NO: 8 or An antibody having a first hypervariable region comprising SEQ ID NO: 20, an antigen-binding fragment thereof, or a complex thereof comprising an antibody or binding fragment thereof may bind.
[0144]
[190.] A preferred epitope is shown in Formula (III), where r is 1.
[0145]
[191.] In any of the formulas, the sulfated moiety may be a peptide conjugate or a glycoconjugate or a lipoconjugate. Y may comprise lipids and / or carbohydrate molecules. Epitopes may undergo one or more post-translational modifications in addition to sulfation.
[0146]
[192.] Such epitopes are detected on a variety of molecules such as GPIb and PSGL-1, and also in certain diseased cells such as B-CLL cells, AML cells, multiple myeloma cells, metastatic cells Is also detected on the surface of Sulfation of tyrosine and / or other molecules is particularly important for binding to these epitopes. Examples of human proteins that are known to undergo tyrosine sulfation are:
[0147]
peptide                                      Array
Thrombomodulin (408-426) ECPEGYILDDGFICTDIDE
Human GPIbα (269-287) DEGDTDLYDYYPEEDTEGD
Human heparin cofactor II (56-75) GEEDDDYLDLEEDED YDI DIV
Human fibrinogen γ '(408-427) VRPEHPAETEYDSLYPEDOL
α-2-antiplasmin PPMEEDYPQFGSP
Cholecystokinin (CCK) RISDRDYMGWMDF
α-2-Coriogonadotropin CHCSTCYYHKS-COOH
Complement C4 MEANEDYEDYEYDELPAK
PSGL-1 QATEYEYLDYDFLPET
Blood coagulation factor VIII (716-731) GDYYEDSYEDISAYLL
Rumican GYYDYDFPL
[0148]
  Y1 -Production and selection
[193.] An example of an antibody of the invention that binds to an epitope of Formulas (I)-(III) is the fully human monoclonal antibody Y1. The selection, production and initial analysis of Y1 is described in detail in US patent application Ser. Nos. 09 / 751,181 and 60 / 258,948. Briefly, a peptide or polypeptide that utilizes a phage display library displaying scFv antibody fragments to acquire and produce targeting molecules and recognizes target cells by flow cytometry, particularly fluorescence activated cell sorting (FACS) Specific phage clones displaying were identified and isolated. The phage display library used here was constructed from human peripheral blood lymphocytes of non-immune donors.
[0149]
[194.] Phage clones were selected and identified by multistep biopanning method. Biopanning was carried out by incubating phages displaying protein ligand variants (phage-displayed library) with the target, removing unbound phage by washing, and specifically eluting bound phage. The eluted phages were optionally amplified and then subjected to additional binding and optional amplification cycles to concentrate the collection of specific sequences and to increase the concentration of phage clones containing antibody fragments exhibiting the best binding to the target. After several rounds, characterization of the individual phage clones was performed and the sequence of the peptides displayed by the clones was determined by sequence analysis of the corresponding DNA of the phage virion.
[0150]
[195.] In the present invention, screening of platelets targeting an indeterminate epitope for the initial biopanning step is performed, and subsequent clonal selection is performed on desired target cells with unknown cell surface markers (eg, B-CLL cells or AML cells, multiple myeloma cells, metastatic cells, etc.) were used.
[0151]
[196.] Malignant and diseased blood cells (such as leukemia or myeloma) are usually positioned as immature cells that express cell surface proteins as detected in partially differentiated hematopoietic progenitor cells. Thus, platelets are a valuable material for identifying immature cell surface markers expressed on lesions or malignant blood cells.
[0152]
[197.] A scFv clone, Y1, was selected that binds to platelets and myeloid leukemia cells, particularly AML cells. The Y1 scFv has the sequence of SEQ ID NO: 25. The binding property of Y1 is mainly derived from its heavy chain CDR3, which has the sequence of SEQ ID NO: 8. A full Y1-IgG antibody was also raised.
[0153]
[198.] A second scFv clone, Y17, was also selected which binds to cell lines derived from platelets and human myeloid leukemia cells, particularly AML cells. The Y17 scFv has the sequence of SEQ ID NO: 203. The binding property of Y17 is mainly derived from its heavy chain CDR3, which has the sequence of SEQ ID NO: 20.
[0154]
  Antibody production
[199.] The CDRs of the invention may be inserted into a cassette to produce antibodies. A cassette, as applied to a polypeptide and in the sense defined in the present invention, refers to a contiguous amino acid of a given sequence which functions as a framework, and is regarded as a single unit and manipulated as such. Amino acids may be substituted, inserted, removed or added at one or both ends thereof. Similarly, substitution, insertion, removal or addition of a series of amino acids is possible at one or both ends.
[0155]
[200.] The amino acid sequence of the cassette may be fixed face up, making the substitution, insertion or addition sequences highly variable. The cassette may consist of several domains, each of which carries an essential function in the final construction.
[0156]
[201.] The hypervariable region of the antibody of the present invention forms the antigen binding site of the antibody of the present invention. The antigen binding site is also referred to as a complementarity determining region (CDR) because it is complementary to the structure of the epitope to which the antibody binds. There are three CDRs each in the heavy and light chains of the antibody, and each CDR is V_HDomain and V_LLocated on the loop that joins the beta strands of the domain.
[0157]
[202.] The cassette of an embodiment of the present invention comprises, from N terminus, framework region 1 (FR1), CDR1, framework region 2 (FR2), CDR2 and framework region 3 (FR3) in order.
[0158]
[203.] In one embodiment of the present invention, identifiable regions in the cassette can be replaced. For example, the CDR2 and CDR1 hypervariable regions of the cassette may be replaced or altered by non-conservative or preferably conservative amino acid substitutions. More specifically, the CDR2 and CDR1 regions of the cassette of contiguous amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 30-113 or fragments thereof can be replaced by SEQ ID NO: 115 and 114, respectively. More specifically, SEQ ID NOS: 30 to 32, 35, 37 to 39, 41, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 57, 59 to 68, 70, 71, 76 to 85, 87, Replacing the CDR2 and CDR1 regions of the cassette of consecutive amino acid sequences selected from the group consisting of 98-92, 94, 97, 99, 103, 106, 112 and 113 or fragments thereof with SEQ ID NO: 115 and 114, respectively it can.
[0159]
[204.] In a preferred embodiment of the present invention, the peptide or polypeptide comprises heavy and light chains, each chain having first, second and third hypervariable regions unique to CDR1, CDR2 and CDR2, respectively. . The binding selectivity and specificity are in particular by the CDR3 region, possibly by the CDR3 of the light chain, preferably by the CDR3 region of the heavy chain, and also by the CDR2 and CDR2 regions of the light chain and preferably of the heavy chain. It will be decided. This binding selectivity and specificity may also be influenced secondarily by upstream or downstream regions adjacent to the first, second and / or third hypervariable regions.
[0160]
[205.] In a preferred embodiment, the CDR3 region of the peptide or polypeptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8-24.
[0161]
[206.] In a more preferred embodiment, the CDR3 region of the heavy chain has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8-24, CDR2 has an amino acid sequence identical to SEQ ID NO: 115, CDR1 also has the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 114.
[0162]
[207.] In a most preferred embodiment, the CDR3 region has the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 8.
[0163]
[208.] A preferred embodiment of the present invention is a scFv having the same CDR3 sequence as SEQ ID NO: 8 and a complete scFv sequence identical to SEQ ID NO: 25.
[0164]
[209.] In the most preferred embodiment of the present invention, the CDR3, CDR2 and CDR1 regions have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 115 and 114, respectively.
[0165]
[210.] In one embodiment of the present invention, the Fv peptide is a CDR1 and CDR2 region of a heavy chain variable region comprising a cassette having an amino acid sequence itself selected from the group consisting of SEQ ID NO: 30-113; Preferably the amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 8-24, preferably the CDR3 region of the heavy chain variable region; the flanking downstream region of the CDR3 region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117; A contiguous upstream region of the CDR3 region having an amino acid sequence; a spacer of 0 to 20 amino acid residues of SEQ ID NO: 123 or 124; and a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 7.
[0166]
[211.] Similarly, in another embodiment, the upstream region adjacent to CDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119 and the downstream region adjacent to CDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 118, CDR1 Has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 121, and a downstream region adjacent to CDR1 has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 120.
[0167]
[212.] A preferred embodiment of the present invention is a peptide or polypeptide, wherein the second and third hypervariable regions are CDR2 and CDR1, respectively, and the amino acid sequence of CDR3 is SEQ ID NO: 8, amino acid of CDR2. Amino acid sequence of SEQ ID NO: 115, amino acid sequence of CDR1 of SEQ ID NO: 114, amino acid sequence of upstream region adjacent to CDR3 is SEQ ID NO: 117, amino acid sequence of downstream region adjacent to CDR3 is SEQ ID NO: 116 The amino acid sequence of the upstream region adjacent to CDR2 is SEQ ID NO: 119, the amino acid sequence of the downstream region adjacent to CDR2 is SEQ ID NO: 118, the amino acid sequence of the upstream region adjacent to CDR1 is SEQ ID NO: 121, CDR1 The present invention provides a peptide or polypeptide in which the amino acid sequence of the downstream region adjacent to SEQ ID NO: 120.
[0168]
[213.] Another preferred embodiment of the present invention is an Fv molecule optionally having one or more tags, wherein the first strand and the first strand have first, second and third excess regions, And a second chain having second and third hypervariable regions, wherein one of the hypervariable regions of the first chain has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8 to 24, and One of the hypervariable regions has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and 125-202, and the first, second and third hypervariable regions are CDR3, CDR2 and CDR1 respectively And further provide Fv molecules wherein Fv is scFv or scFv.
[0169]
[214.] Another embodiment of the present invention is a peptide or polypeptide, wherein (i) the first hypervariable wherein the first and second chains are each selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8-24. With regions, or (ii) the first hypervariable regions of the first and second chains are identical and selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8-24, or (iii) of the first chain Whether the first hypervariable region is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8-24 and the first hypervariable region of the second strand is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-6 and 125-202, Or (iv) the first hypervariable region of the first chain is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 125 to 202, and the first hypervariable region of the second chain from SEQ ID NOs: 8 to 24 The present invention provides a peptide or polypeptide selected from the group consisting of
  A further embodiment of the invention provides a peptide or polypeptide wherein the second and third hypervariable regions of the first chain are SEQ ID NO: 114 and 115 respectively.
[0170]
[215.] As a further embodiment of the present invention, all amino acid sequences (CDR regions, CDR adjacent regions, etc.) of 25 amino acid residues or less disclosed and detailed herein include one or two amino acids within the range. It is intended to include substitutions, which are preferably conservative amino acid substitutions. In a further embodiment of the present invention, all amino acid sequences greater than 25 amino acid residues disclosed and detailed herein shall include within their scope amino acid sequences having 90% or more sequence similarity to the original sequence. [Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402 (1997)]. Similar or homologous amino acids refer to non-identical amino acids that exhibit similar properties, such as acidic, basic, aromatic, size, positive or negative, polar, nonpolar, etc. properties.
[0171]
[216.] Percentage amino acid similarity or homology or sequence similarity is determined by comparing the amino acid sequences of two different peptides or polypeptides. Alignment of the two sequences is usually performed using a dedicated computer program, and amino acid residues at each position are compared. The amino acid identity or homology is then determined. The algorithm is then used to determine percent amino acid similarity. Generally, comparing amino acid sequences is preferred as it significantly increases the sensitivity of detection of subtle relationships between peptides, polypeptides or protein molecules. Protein comparisons can take into account the presence of conservative amino acid substitutions such that if non-identical amino acids have similar physical and / or chemical properties, a mismatch may still produce a positive score [Altschul et al. al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402 (1997)].
[0172]
[217.] In one embodiment of the present invention, the three hypervariable regions of each of the light chain and the heavy chain can be interchanged between two chains, and also between three chains of intrachain and / or interchain. .
[0173]
  V _L (Y1 Origin ) Polyclonal antibody to
[218.] V of human antibody_LA DNA fragment encoding a domain (light chain variable region) was PCR cloned from the Y1 clone [The same DNA fragment was cloned into a Nissim I library (Nissim et al., 'A single-pot' phage-displayed library as an immunochemical reagent) Derived from any other clone in "Antibody fragments from the 'single pot' phage display library as immunochemical reagents," EMBO J. 13 (3): 692-698, 1994) or by the same method Even from you can get it]. The following synthetic oligonucleotide primers were used for this PCR: Oligo 5'-NdeI (TTTCAT ATG GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT) and oligo 3'-EcoRI (TTT)GAA TTCCTA TTT TGC TTT TGC GGC). Amplification by PCR (PCR conditions: 94 ° C. 1 ′, 56 ° C. 2 ′, 72 ° C. 2 ′ 30 times, then 65 ° C. 5 ′), the resulting DNA fragment is digested with NdeI and EcoRI restriction enzymes and digested with the same enzymes It cloned in the plasmid which has been completed. The plasmid is an IPTG inducible expression vector used for prokaryotic expression of the recombinant protein in E. coli. E. coli cells were transformed with the ligation mixture and positive clones were selected by PCR amplification using the oligonucleotide primers. Cells containing this plasmid were grown and expression was induced with IPTG. Bacterial cells are collected by centrifugation from 1 liter of culture solution after induction of expression by IPTG to isolate inclusion bodies, guanidine-HCl + DTTAnd regenerated by diluting with a buffer containing Tris-arginine-EDTA. After regeneration at 5-10 ° C. for 48 hours, the protein-containing solution was dialyzed into 20 mM glycine pH 9 and concentrated. The dialysate containing protein was repurified using ion exchange column HiTrapQ and eluted with a gradient of NaCl. The main peak was analyzed by SDA-PAGE and also by gel filtration. At least 10 mg of purified V from the original 1 liter culture broth_Lwas gotten.
[0174]
[219.] Immunization of rabbits was carried out by first V-_L(400 mg) then at intervals of 2 to 4 weeks V in the presence of IFA (Freund's incomplete adjuvant)_LEach was done at (200 mg). The titer obtained was low (1:50 to 1: 100). Probably human and rabbit derived V_LIt may be because of the high homology between them.
  Polyclonal antibody to scFv antibody
[0175]
[220.] Two individual scFv antibody clones (Y1 and N14) derived from the Nissim I phage display antibody library (Nissim et al. Supra) were cultured separately. After induction of expression by IPTG, the strain was grown at 22 ° C. for 16 hours. The scFv antibody fragment was recovered from the periplasm of bacterial cells and purified on a Protein A-Sepharose column. Procedures for bacterial clone culture, expression induction protocol, recovery and purification of scFv antibody fragments were all carried out according to Harrison J. L., Williams S. C., Winter G., and Nissim A. Methods Enzymol. 267: 83-109 (1996). Basically, any two or more individual scFv clones are selected from the Nissim I phage display antibody library to recognize any individual scFv antibody present in the Nissim library, or the same V_LAlternatively, rabbit-derived polyclonal antibodies can be prepared that recognize any IgG or fragment thereof as long as it contains a fragment thereof.
[0176]
[221.] Immunization of rabbits was performed first with 400 mg of a 1: 1 mixture of purified scFv antibody fragments in the presence of CFA and then with 200 mg of the same mixture in the presence of IFA at intervals of 2 to 4 weeks.
[0177]
[222.] Detection of scFv antibody binding to cells by flow cytometry (FACS) or Western blot detection of scFv antibody binding to various protein fractions on SDS-PAGE, rabbits immunized with polyclonal anti-scFv antibodies The product was used directly from serum of or after purification on a Protein A-Sepharose column.
[0178]
  On platelets Y1 Analysis of binding sites
[223.] Circulating platelets are cytoplasmic particles released from the periphery of megakaryocytes. Platelets play an important role in hemostasis. When the blood vessel is damaged, platelets adhere to the surface of the damaged tissue and adhere to each other (stick). This series of events occurs rapidly and forms an unstructured mass (generally referred to as a platelet plug or thrombus) at the vascular injury site. This adhesion phenomenon, also called aggregation, can be caused in vitro by various substances or agonists such as collagen, adenosine diphosphate (ADP), epinephrine, serotonin and ristocetin. Aggregation is one of a variety of in vitro tests that examine platelet function.
[0179]
[224.] According to some evidence in the prior art, the negatively charged amino acid group between Asp 269 and Asp 287 of GPIbα is important for the binding of wontillant factor (vWF) to platelets, which itself It mediates platelet adhesion to damaged blood vessels, high shear stress induced platelet aggregation at the site of arterial stenosis, and platelet activation induced by low concentrations of thrombin. Ward, CM et al., Biochemistry 35 (15): 4929-39 (1996). The interaction of vWF with GPIb is an activation event or confirmation of vWF structure when bound to a matrix or subjected to shear stress. It depends on the transformation change. This process is nearly reproduced in vitro by specific modulators that bind vWF such as ristocetin and botrocetin.
[0180]
  To platelet extract Y1 Reactivity of
[225.] Immunoblotting and endoprotease cleavage were used to identify Y1 corresponding epitopes on platelet surface membranes. The endoprotease cleavage site on the GPIbα molecule is shown in FIG.
[0181]
  Western blot analysis
[226.] The Y1 scFv was selected from a phage antibody library by panning on human platelets and found to bind to fixed and washed human platelets. Analysis of Y1 was performed by ELISA and FACS.
[0182]
[227.] To analyze epitopes on platelets that bind to Y1, platelet surface proteins are separated by SDS-PAGE (both under reducing and non-reducing conditions) and immunoblotted using biotin-labeled Y1 I put it on. The results of this experiment show that Y1 reacts with a protein of molecular mass 135 kDa under reducing conditions and with a protein of molecular mass ̃160 kDa under non-reducing conditions. These molecular masses correspond to platelet GPIbα with a molecular mass of 135 kDa under reducing conditions. Under non-reducing conditions, the molecular mass of the GPIbα chain disulfide linked to the GPIbβ chain is 160 kDa (FIG. 2).
[0183]
[228.] The GPIb alpha chain is disulfide linked to the GPIb beta chain to form the platelet membrane protein GPIb. The monoclonal antibodies MCA466S (Serotec) and SC7071 (Santa Cruz) are known to bind to the C-terminal fragment and the N-terminus of GPIbα, respectively, but under the same conditions as Y1's reaction partner under reducing and non-reducing conditions It was found to bind to the fragment (SC was used only under non-reducing conditions). These results further confirm that Y1 binds to GPIbα platelet surface protein.
[0184]
[229.] The semi-purified GPIb fragment (glycocalysin) was further analyzed by Western method to confirm that Y1 indeed binds to the α subunit of the GPIb complex.
[0185]
[230.] Western analysis has shown that recombinant GPIb expressed in E. coli does not react with Y1. Therefore, binding of Y1 seems to require post-translational modification that does not occur in E. coli. Neither N- or O-glycanases affect Y1 binding to KG-1. However, binding of Y1 is inactivated by treatment of the ligand with arylsulfatase or by protease( Removal )Can be done (Figure 3).
[0186]
  Glycocalicin (GC) GPIb on alpha fragment Y1 Localization of the epitope site
[231.] To further localize the Y1 binding site, GPIb was digested with a specific protease whose cleavage site was known, and the Y1 binding test was performed on the fragment.
[0187]
  platelet GPIb to α Y1 To bond O- Effect of sialoglycoprotein endoprotease
[232.] The enzyme O-sialoglycoprotein endoprotease from Pasteurella haemolytica (Cedarlan CLE 100) selectively cleaves human platelet GPIbα and specifically cleaves only proteins containing sialylated O-linked glycans Do. The O-sialoglycoprotein endoprotease does not cleave N-linked glycoproteins or non-glycosylated proteins. This enzyme has been reported to cleave high O-glycosylated GPIb but not GPIIb-IIIa or other platelet receptors. Cleavage of GPIbα with O-sialoglycoprotein endoprotease is to further demonstrate Y1 binding to the GPIbα molecule.
[0188]
[233.] From immunoblot (Figures 4 and 5) and FACS analysis (Figure 6), incubation of the washed platelets with the O-sialoglycoprotein endoprotease binds not only the monoclonal antibody MCA466S (Serotec) to GPIbα but also Y1 It proved to be impossible. The endoprotease does not affect the binding of the (anti-CD61) monoclonal antibody to GPIIb / IIIa (FIG. 4). These results provide additional evidence that the Y1 receptor on the platelet membrane is GPIbα.
[0189]
  GPIb Mokaragin cutting- Y1 Epitope mapping
[234.] Mokaragin (Sigma L4515a) is a cobra venom metalloprotease, which specifically cleaves platelet GPIbα at a single site between residues glu-282 and asp-283 to produce two stable products, ie, in the supernatant. A-45 kDa N-terminal fragment (His1-Glu282) and a membrane-bound ~ 95 kDa C-terminal fragment are released.
[0190]
[235.] Washed platelets were treated with mokaragin and platelet lysates were electrophoresed on SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose. Western blot analysis of mokaragin-treated washed platelet lysates by Y1 revealed disappearance of the band (135 kDa) corresponding to GPIbα and binding of Y1 to the N-terminal to 45 kDa fragment. The monoclonal antibody (MCA 466 S) produced against the C-terminal fragment of GPIbα reacts with the ~ 95 kDa C-terminal fragment, and the monoclonal antibody (SC7071) produced against the N-terminal fragment of GPIbα is recognized by Y1 It reacted with the same .about.45 kDa fragment as did (FIG. 7).
[0191]
[236.] Mokaragin treatment of glycocalicin (a soluble extracellular fragment of GPIbα) produced results similar to those observed with washed platelets. This shows the binding of Y1 and monoclonal antibody SC 7071 to the ̃45 kDa N-terminal fragment of GPIbα (FIG. 8). The above results suggest that the epitope of Y1 is contained within the sequence His1-Glu282.
[0192]
  Y17 Analysis of clones- GPIb Binding to
[237.] The second scFv human antibody fragment Y17 of the present invention was selected in the same manner as in the case of Y1, and analyzed using the same method as in the case of Y1 (see Example 17). Briefly, Y17 was selected from a phage antibody library by panning on human platelets. ELISA and FACS analysis were used to characterize Y17. Y17 was found to bind to both fixed and washed human platelets. To further analyze the receptors on platelets that bind Y17, platelet proteins were separated by SDS-PAGE and subjected to immunoblotting using biotin-labeled Y17 under reducing and non-reducing conditions. The results demonstrate that Y17 reacts with proteins with an apparent molecular mass of 135 kDa under reducing conditions, and with an apparent molecular mass of ~ 160 kDa under non-reducing conditions. These results correspond to platelet GPIbα. That is, GPIbα has a molecular mass of 135 kDa under reducing conditions, and has a 160 kDa molecular mass and a disulfide bond to GPIbβ under non-reducing conditions. The monoclonal antibody MCA466S (Serotec) to the C-terminal fragment of GPIbα and the monoclonal antibody SC7071 (Santa Cruz) which recognizes the N-terminal fragment of GPIbα react to the same band as Y17 under reducing and nonreducing conditions (FIG. 2) ).
[0193]
[238.] Western blot analysis indicates that Y1 and Y17 bind similarly to platelet lysates (FIG. 9).
[0194]
[239.] Y1 and Y17 also bind similarly to glycocalicin after cleavage with O-sialoglycoprotein endoprotease or ficin (Figures 5 and 10).
[0195]
[240.] According to FACS analysis, Y1 shows similar binding profiles to platelets and KG-1. Furthermore, neither bind to Raji and T2 cells. In contrast, TM1 (SEQ ID NO: 209), Y16 (SEQ ID NO: 210) and Y45 do not bind to any of the aforementioned human cell lines.
[0196]
[241.] From these results, it is clear that the two monoclonal antibodies of the present invention, Y1 and Y17, share an epitope in various cells, and that none of the other test monoclonal antibodies recognize this epitope. It is.
[0197]
  GPIb Cathepsin G Cutting by- Y1 Epitope mapping
[242.] Cathepsin G (Sigma C4428), a neutrophil serine protease, is a glycocalicin, the first cleavage site between residues Leu-275 and Tyr-276, and the second between residues Val-296 and Lys-297. 2Cleavage at the cleavage site. Treatment of glycocalicin with cathepsin G results in two N-terminal fragments, a small N-terminal fragment of 42 kDa (His1-Leu275) and a large N-terminal fragment of 45 kDa (His1-Val-296), and the corresponding ̃95 kDa C-terminal Side fragments are generated (Figure 1).
[0198]
[243.] Glycocalicin and glycocalicin fragments generated by digestion with cathepsin G were subjected to SDS-PAGE electrophoresis, transferred to nitrocellulose, and analyzed by Western blotting. In immunoblot, Y1 bound to the large N-terminal fragment (His1-Val-275) but not to the small N-terminal fragment (His1-Leu275) or C-terminal fragment. Similarly, the commercial monoclonal antibody SZ2 (Immunotech 0719), which should recognize an epitope between residues Tyr276 and Glu282 on GPIbα, also reacts only with the large N-terminal fragment (FIGS. 11 and 12).
[0199]
[244.] Furthermore, monoclonal antibody SC 7071, which is known to recognize an epitope between His1 and Leu275, bound to both N-terminal fragments. Y1 does not bind to S. C. 7071 bound His1-Leu 275 fragment. These results suggest that the epitope of Y1 is located between the first and second cathepsin G cleavage sites, ie within the sequence Tyr276-Val296, or more probably between amino acids 276-282 .
[0200]
  Purified glycocalicin and washed platelets (WP) To Y1 Synthetic part to bond GPIb Effect of alpha peptide
[245.] ELISA was performed to evaluate the effect of GPIb derived synthetic peptides on Y1 binding to purified glycocalicin. In addition, FACS analysis using washed platelets was also performed. Competitive binding FACS analysis was performed to assess the importance of sulfated tyrosine within the Y1 binding site of GPIb. That is, 1 μg of Y1-scFv was preincubated with various peptides at concentrations of 2.5 and 200 μM. After pre-incubation for 30 minutes at room temperature, washed platelets-10⁷The mixture was added to individual tubes and polyclonal rabbit anti-scFv-PE was used to assess Y1 binding to the washed platelets. The inhibitory effect of the peptide compared to control binding (Y1 alone) was evaluated by measuring the residual binding of Y1 to the washed platelets. Use peptide and result,Each,table 1And table 3As described in, the results of observation by ELISA using the same peptide (Table2It is similar to). The control Y1 binding level was determined as follows in any of the evaluation methods. Polystyrene microtiter plate MaxiSorp( Trademark )Plates were coated with (a) purified glycocalicin or (b) washed platelets and after thorough washing, 0.5 μg / well of Y1 was added. The plates were then incubated with rabbit anti-scFv and then anti-rabbit-HRP (horseradish peroxidase) and HRP substrate were added. The level of anti-rabbit-HRP binding was determined by color intensity. The binding level of anti-rabbit-HRP correlates with the binding level of anti-Y1-scFv and the binding level of Y1. Absorbance A at 405 nm₄₀₅Was measured. Each sample was tested twice and the mean value was calculated.
[0201]
[246.] The effect of synthetic GPIbα peptide on Y1 binding to purified glycocalicin was evaluated as follows. Various concentrations of peptide were mixed with Y1 of quantification. After pre-incubation for 30 minutes at room temperature, the mixture was added to purified glycocalicin-coated polystyrene microtiter titres MaxiSorp plates as described above for the evaluation of Y1 binding in the absence of peptide. The inhibitory effect of the peptide was evaluated by measuring the residual binding of Y1 using rabbit anti-Y1 scFv and anti-rabbit-HRP antibody as described above for the evaluation of Y1 binding in the absence of peptide. In this study, four peptides corresponding to various subsets of sequences 268-285 and a control peptide were used. Each peptide was tested at various concentrations: 200 μM, 25 μM, 2.5 μM and 0.5 μM.
[0202]
[247.] The five peptides are as shown in Table 1:
[0203]
[Table 1]

[0204]
[248.] The results obtained from these assays are in Tables 2 and 3 below.
[0205]
【Table 2】

[0206]
[249.] As evident from these results, the inhibitory effect of peptides with sulfated tyrosine is significantly greater than that of non-sulfated peptides. This effect is dose dependent and peptides with longer N '(upstream) flanking sequences are more inhibitory than peptides with extended C' (downstream) flanking sequences. These results clearly support the conclusion that sulfated tyrosine is required for Y1 binding to GPIbα, and that upstream and downstream of the sulfated region enhance Y1 binding to GPIbα.
[0207]
[Table 3]

[0208]
[250.] These results further support the importance of sulfated tyrosine within specific regions for Y1 recognition on GPIb. In general, the results of analysis of proteolytic fragments of N-terminal peptides by mokaragin and cathepsin G suggest that the GPIbα amino acid sequence Tyr276-Glu282 is or is an important epitope for Y1 binding (FIG.3). Further analysis revealed that in addition to residues 276-282 (sulphated anion sequence) of glycocalicin, the upstream amino acids 283-285 also seem to be involved in the Y1 recognition site.
[0209]
Platelet function Y1 scFv , Y17 scFv as well as IgG Y1 Biological activity of
[251.] Localization experiments suggested that the Y1 binding site is at the alpha thrombin and vWF binding sites that are important for platelet aggregation. Therefore, it was decided to investigate the binding of Y1 scFv, Y17 scFv and IgG Y1 to washed platelets and platelet rich plasma (PRP) to evaluate the effect of the binding on platelet aggregation.
[0210]
Washed platelets (WP) To the agglutination reaction Y1 scFv as well as Y17 scFv Effect of
[252.] Aggregation was measured in PRP in the presence of aggregation inducers and aggregation response was measured in washed platelets. The effect of Y1 (scFv) on the agglutination of washed platelets was tested at various Y1 concentrations. Platelets were contacted with ristocetin which is an inducer of platelet aggregation reaction and aggregation after preincubation (37 ° C., 4 minutes) with Y1 scFV, Y17 scFv, Y16 scFv or control TM-1 scFv.
[0211]
[253.] The results of this study are shown in Table 4 and Figure 15. Pre-incubation of platelets with Y1 scFv (concentration 25 μg / ml) inhibited the ristocetin-induced washed platelet aggregation reaction. Only partial inhibition of the platelet aggregation reaction was observed at a Y1 concentration of 12.5 μg / ml. No platelet aggregation reaction was observed at a Y1 concentration of 4 μg / ml. These results suggest that the inhibitory activity of Y1 on the washed platelet aggregation response is dose dependent. Incubation of platelets with the negative control scFv TM1 had no effect on ristocetin-induced platelet aggregation. Neither Y17 nor Y16, another scFv clone selected by the same multi-step panning procedure from the same phage display library as in Y1, hardly inhibited the washed platelet aggregation reaction.
[0212]
[Table 4]

[0213]
Platelet rich plasma (PRP) To aggregation Y1 scFv as well as Y17 scFv Effect of
[254.] The Y1 (scFv) effect on platelet rich plasma (PRP) aggregation was tested at various Y1 concentrations. PRP was contacted with ristocetin, which is an inducer of platelet aggregation reaction and aggregation, after preincubation with Y1 scFV, Y17 scFv or control TM-1 scFv (37 ° C., 4 minutes). When ristocetin was added after adding scFv to PRP, a dose-dependent reversible inhibitory effect was observed.
[0214]
[255.] The results of this study are shown in Table 5 and Figure 16. A final concentration of 50 μg / ml of Y1 inhibited platelet aggregation of ristocetin in PRP by ̃80% in the first 4 minutes. The inhibition of platelet aggregation was not seen so much at a Y1 concentration of 25 μg / ml. Y17 did not inhibit platelet aggregation. Incubating platelets with a negative control TM-1 scFv at a concentration of 50 μg / ml had no effect on ristocetin aggregation (Table 5).
[0215]
[256.] Comparison of washed platelets with PRP shows that: (1) scFv Y1 has an inhibitory effect on ristocetin-induced platelet aggregation and agglutination; (2) its effect is dose dependent (3) The inhibitory effect was higher in washed platelets than in PRP; (4) A reversible inhibitory effect was observed in PRP; (5) Both scFv antibody fragments of TM1 and Y16 were effective And (6) Y17 is a negative control in this assay.
[0216]
[Table 5]

[0217]
Washed platelets (WP) To the agglutination reaction Y1-IgG Effect of
[257.] All Y1-IgG has GPIbα due to its native structureForIt has two binding sites and one binding site corresponding to the Fc receptor. All Y1-IgG, if bound to two GPIbα molecules, is likely to activate platelets and induce a platelet aggregation reaction. Furthermore, since platelets have an Fc receptor, Y1-IgG binds to GPIbα and also binds to an Fc receptor to induce a platelet aggregation reaction, whereby each Y1-IgG binds to three platelets, thereby causing platelets to bind. It can cause agglutination reaction. Therefore, the effect of Y1-IgG on washed platelet aggregation was examined at various Y1-IgG concentrations in the presence and absence of ristocetin. The induction of platelet aggregation by Y1-IgG was tested at 37 ° C. for 4 minutes, then ristocetin was added.
[0218]
[258.] The results are shown in Table 6 and FIG. Y1-IgG alone (final concentration 50 μg / ml) induced ̃39% of the normal washed platelet aggregation reaction. The induction of the platelet aggregation reaction by Y1-IgG was tested at 37 ° C. for 4 minutes and then ristocetin was added. After the addition of ristocetin, no additional effect on platelet aggregation was observed, and normal platelet aggregation was observed. However, incubation of platelets with Y1 at a concentration of 1 μg / ml did not induce any platelet aggregation reaction.
[0219]
[259.] The inhibition of platelet aggregation is also obtained using a commercially available (inhibiting platelet aggregation) monoclonal antibody (Pharmigen) to GPIbα (CD42) as described above, or the control human IgG-Lambda (Sigma) It was not.
[0220]
[Table 6]

[0221]
Platelet rich plasma (PRP) To aggregation Y1-IgG Effect of
[260.] The effect of Y1-IgG on PRP aggregation was tested at various Y1-IgG concentrations in the presence and absence of ristocetin. The induction of platelet aggregation by Y1-IgG was tested at 37 ° C. for 4 minutes, then ristocetin was added.
[0222]
[261.] The results are as shown in Table 7 and FIG. After addition of ristocetin, no effect on platelet aggregation was observed, and normal platelet aggregation was observed. Final concentration 50 μg / ml of Y1-IgG added with ristocetinPrevious, Induced platelet aggregation in PRP. The 25 μg / ml concentration of Y1-IgG only partially induced platelet aggregation before adding ristocetin. At 10 μg / ml, 4 μg / ml or 1 μg / ml of Y1-IgGInhibition isI could not see it. A commercially available monoclonal antibody (Pharmigen) to GPIbα (CD42), which inhibits platelet aggregation at a concentration of 20 μg / ml, did not induce platelet aggregation. Control human IgG-Lambda (Sigma) at the same concentration as Y1-IgG also did not induce platelet aggregation.
[0223]
[Table 7]

[0224]
  Y1 Identification of plasma soluble ligands and cell lines
[262.] An antibody to GPIbα (CD42b) recognizes platelet lysate and glycocalicin, but KG-1 cell lysate (Y1 binding-positive myeloma cell line) orRAJIIt does not recognize cell lysates (a B cell line that is negative for Y1 binding at a concentration at which KG-1 cells become positive for Y1 binding). In contrast, Y1 recognizes glycocalicin, platelet lysate and KG-1 cells, butRAJIDoes not recognize cell extract. Negative control scFv-181 does not recognize any related protein (FIG. 20).
[0225]
[263.] This uniqueness of the cross-reactivity of Y1 was also revealed in the comparative analysis of Y1 and SZ2 (MAbs to the sulfated region of GPIb). In contrast to SZ2, Y1 not only binds to GPIb, but also to plasma proteins and myeloma-derived cell extracts as described below.
[0226]
  In human plasma Y1 Ligand
[264.] Two types of proteins immunoreacted with Y1 in both normal plasma and leukemia patient plasma. That is, (1) the molecular mass under reducing conditions is 50 kDa, the molecular mass under non-reducing conditions is> 300 kDa, and it disappears completely from serum after coagulation HP-ligand 1, and (1) reduction, The molecular mass under non-reducing conditions is ̃80 kDa, and it remains in serum after coagulation. The .about.50 kDa ligand was identified as a normal mutant (.gamma. ') Of human fibrinogen gamma chain after purification by Q-Sepharose column reverse phase chromatography (RP-HPLC) 2D gel electrophoresis and peptide mapping. Its sequence VRPEHPAETEYDSLYPEDDL is only present in fibrinogen γ ', but is similar to the GPIb anion region which contains sulfated tyrosine, but not the abundant fibrinogen γ form. This is probably the Y1 binding site. The -80 kDa was identified as complement complex 4 (CC4) and lumican. It contains a sulfated tyrosine residue and an associated negatively charged amino acid group as described above.
[0227]
  To primary leukemia cells Y1 Binding of
[265.] According to FACS analysis, Y1 binds selectively to leukemia cells but not to normal blood cells in normal blood samples and normal cells in leukemia blood samples. The analysis results of patient samples are summarized in the following table.
[0228]
[Table 8]

[0229]
[Table 9]

[0230]
Myeloid cells (KG-1) upper Y1 Analysis of epitopes
[266.] About 25 billion KG-1 cells were recovered for the purpose of purification of Y1 epitope from KG-1 cell membranes. The KG-1 membrane preparation contained at least two subunits to which Y1 was attached: the ̃110 kDa subunit and the ̃120 kDa subunit. Y1 also binds to a -220 kDa subunit which appears to be a dimer of the -110 kDa subunit. Purification of the Y1 epitope was performed by immunoprecipitation using Y1 and RP-HPLC. Of the fractions collected, 2 μl was used for Western blotting using scFv Y1 and 40 μl for silver staining. (Figure 21)
[0231]
[267.] Further characterization of Y1 was performed. The method is enzymatic treatment with protease, glycanase and sulfatase; Western blot by use of Y1, anti-CD42 antibody, anti-CD162 antibody and 181; immunoprecipitation by use of Y1 and anti-CD162 antibody; use of Y1 and anti-CD162 antibody By FACS analysis; and sequence analysis.
[268.] The following table summarizes the biochemical experiments performed to analyze and localize Y1 binding sites on KG-1 cells.
[0232]
SDS-PAGE On a reducing gel Y1 Western blot analysis
[0233]
[Table 10]

[0234]
[269.] In summary, treatment with endopeptidase cleaves the Y1 signal and makes it undetectable( Figure twenty two). The fraction containing the Y1 binding site is probably N'-terminal but too small to be detected under the conditions used in the experiment.Similarly, Mocarhagin After processing by Y1 The signal is cut off and becomes undetectable ( Figure 33) . this is, Y1 The epitope of Of the ligand N ' It is suggested to be on the end.Furthermore, the results obtained with the arylsulfatase treatment that liberates sulfate from the protein (within KG-1 cell extract) but not from the sugar moiety (on heparin) show that the sulfate group is required for Y1 recognition Support the hypothesis that( Figure twenty three). Interestingly, O-sialoglycoprotein endopeptidase enhances the Y1 signal in the GC cleavage product. It is believed that this treatment causes the Y1 binding site to be located at the C 'end and is exposed in a more convenient manner to Y1 binding.
[0235]
  Y1 When PSLG-1 antibody KPL1 Correlation of : Western plot analysis
[270.] The binding of scFv Y1 antibody and a commercially available anti-PSGL-1 monoclonal antibody (KPL1) to KPL-1 immunoprecipitated (IP) membrane proteins derived from KG-1 cells was evaluated. Raji cell lysates were used as Y1 and KPL1 negative controls.
[0236]
[271.] The membrane fraction of KG-1 cells was immunoprecipitated with KPL1. The IP fraction was further immunoprecipitated with scFv Y1 antibody or KPL1. The non-precipitated (eluate) fractions were analyzed by Western blotting using scFv Y1 or KPL1 antibodies.
[0237]
[272.] Both the immunoprecipitation scheme and the results are shown in FIG. KPL1 does not recognize glycocalicin. However, both scFv Y1 and KPL1 antibodies recognize membrane proteins on KG-1 cells.
[0238]
[273.] Lysates from cell lines and primary leukocytes were immunoprecipitated with CD162 antibody, and supernatants and eluates were generated by centrifugation. Western blot analysis of proteins contained in the eluate and supernatant was performed using scFv Y1 and anti-CD162 antibodies. The KG-1 membrane preparation contains two subunits (̃110 kDa and ̃120 kDa) to which anti-CD162 (PSGL-1) antibodies bind. In contrast, normal leukocyte membrane preparations contain only smaller subunits. Membrane preparations from AML patients contain only larger subunits. Although scFv Y1 binds to a well-defined chemical species, it is present in the immunoprecipitation supernatant and is not a binding partner for anti-CD162 antibodies (FIG. 25).
[0239]
  FACS analysis
[274.] Binding of Y1 antibody (both scFv and IgG type) to KG-1 cells in the presence of anti-PSGL-1 (anti-CD162) antibody (KPL1) by competitive binding assay and FACS analysis evaluated. For this purpose, various commercially available anti-PSGL-1 antibodies, namely KPL1 (an antibody which identifies the sulfated tyrosine N-terminal domain of PSGL-1), PL1 (an antibody which identifies the non-sulfated N-terminal domain of PSGL-1 And PL2 (an antibody that recognizes the non-sulfated inner domain of PSGL-1 receptor) were used. Only KPL1 completely inhibits Y1 binding to KG-1 cells, and PL1 partially inhibits binding. No binding inhibition is seen in the presence of PL2 antibody (Figure 26). Raji cells did not bind to the KPL1 antibody. Similarly, various concentrations of total IgG Y1 dose dependently inhibit the binding of KPL1 antibody to KG-1 cells (FIG. 27). Similarly, KPL-1 antibody dose dependently inhibits the binding of total IgG Y1 to KG-1 cells (FIG. 28).
[0240]
  To primary leukemia cells Y1 Bonding and KPL1 Coupling correlation
[275.] Analysis of the binding of scFv Y1 and anti-CD162 antibodies to diseased cells also shows that scFv Y1 and anti-CD162 antibodies have different binding properties. In particular, FACS analysis of binding of Y1 and anti-CD162 to each cell of precursor B-ALL, HCL, AML, B-ALL, B-CLL, anaplastic leukemia, B-PLL and multiple myeloma cells derived from human patients The two antibodies showed different binding profiles (Table F). Binding of Y1 to leukemia cells is seen in 10 out of 12 samples, while binding of anti-CD162 is limited to 5 out of 12 samples. 5 out of 12 binds to Y1 but not to anti-CD162. Therefore, in leukemia cells, it may be concluded that scFv Y1 binds to a ligand other than the ligand that anti-CD162 recognizes.
[0241]
[Table 11]

[0242]
[276.] Generally, GPIbα,Fibronectin,And PSGL-1InsideThe sulfated tyrosine Y1 binding domain of is DEGDTLYDYYPEED TEGD (amino acids 269-287), EHPAETESYDSLYPED (amino acids 411-427) and QATEYELDYDFLPETE (amino acids 1-17), respectively. Presumably, additional binding sites with higher affinity to Y1 will be expressed on the surface of primary leukemia cells. Interestingly, blood samples positive for both scFv Y1 and anti-CD162 are from AML patients, while B cells are negative for anti-CD162.
[0243]
Y1 Analysis of sulfated peptide binding to
[277.] The importance of the presence and location of sulfated tyrosine in binding of the peptide to Y1 was assessed by a competitive binding ELISA.
[0244]
[278.] Glycocalicin was immobilized on MaxiSorp plates. The dose response was determined by preincubating scFv Y1 with the peptide of interest for 10 minutes at three different concentrations (1 μM, 10 μM and 100 μM) (Table 12). After preincubation, this mixture (Y1 + peptide) is added to the plate, and the V of scFv Y1 is added._LPolyclonal rabbit anti-V that recognizes chains_LThen, anti-rabbit HRP was used to evaluate the binding of scFv Y1. In the mixture in which the peptide was bound to scFv Y1, the binding of scFv Y1 to glycocalicin was increased as compared to the control binding. In a mixture in which the peptide did not bind to scFv Y1, the binding of scFv Y1 to glycocalicin was unchanged as compared to control binding.
[0245]
[279.] The experiment was performed twice. The results are shown by ELISA graph (FIG. 29). The fibrinogen derived peptide did not inhibit Y1 binding despite sulfation. The non-sulfated peptide derived from PSGL-1 did not inhibit the binding of Y1 to glycocalicin. All PSGL-1 derived sulfated peptides inhibited the binding of Y1 to glycocalicin. The highest inhibitory effects were the peptides P-YYY * and P-YY * Y *, followed by P-Y * YY *, P-YY * Y, P-Y * Y * Y, P-Y * YY in this order. Glycocalicin-derived non-sulfated peptides did not inhibit the binding of Y1 to glycocalicin but the glycocalicin-derived peptide (GY * Y * Y *) in which all three tyrosines were sulfated in the same sequence was P-YY * Y There was a similar binding inhibitory effect.
[0246]
[280.] Thus it is clear that not all sulfated peptides bind to scFv Y1 to the same extent. Also importantly, these results show that only one sulfated tyrosine is required for binding, as is evident in the example of the peptides P-Y * YY and P-YYY *. Furthermore, it can be seen that the amino acid sequence surrounding sulfated tyrosine also affects Y1 binding. For example, PY * YY (containing one sulfated tyrosine in the sequence EY * E) only effectively inhibits binding at a concentration of 100 μM, whereas (one sulfated in the sequence DY * D P-YYY * (containing tyrosine) effectively inhibits binding at a concentration of 1 μM.
[0247]
[Table 12]

[0248]
  hypothesis / Conclusion
[281.] (1) Y1 is similar to L-selectin, which recognizes both sulfated protein and sugar moiety, and is different from P-selectin, which recognizes only sulfated tyrosine. Thus, Y1 can compete for binding of both proteins.
[0249]
[282.] (2) Mutations in sulfation during differentiation and cell proliferation will affect Y1 binding. Thus, Y1 will compete with P- and L-selectins for binding to their respective sulfated ligands.
[0250]
  To evaluate the efficacy of leukemia-specific antibodies in vivo model
[283.] Two human leukemia models were expressed in immunodeficient mice and assay systems.
[0251]
[284.] The human cell lines used are MOLT4 cells from T cell leukemia patients and KG-1 cells from AML patients. Identification and quantification of transplanted malignant cells were performed using an antibody specific for the relevant human antigen on each cell line.
[0252]
  T-ALL (MOLT4) model
[285.] For in vivo mouse models of T-ALL, use SCID mice (Jackson Laboratories) injected with MOLT4 cells from T-cell leukemia patients.
[0253]
[286.] In one experiment, a SCID mouseCytoxen (CTX, cyclophosphamide for injection, Mead Johnson) Pretreated with 100 mg / kg. And to the above mouse, 2 × 10⁷ Intravenous injection of MOLT-4 cells / mouse, 5 days after treatment with cyclophosphamide, anticancer agent or PBS (negative control animal), 5 days after injection of MOLT-4 cells, 3 times / week, intravenous Internally injected. On day 35, blood was collected from the animals, the animals were killed and their livers removed and weighed. In untreated, PBS-treated MOLT-4 cell-bearing animals, the liver showed very severe tumor growth, and its size was increased 2-3 fold compared to PBS control non-infected animals. In this experiment, there were five treatment groups:
                                table 13
  1. No injection with MOLT-4 cells, PBS treated.
  2. MOLT-4 injection control, PBS treated.
  3. MOLT-4 injection, Y1 scFv (CONY1), treated with 75 μg / mouse.
  4. MOLT-4 injection, treated with CONY 1 scFv-doxorubicin, 75 μg / mouse.
  5. MOLT-4 injection, treated with doxorubicin, 0.1 mg / kg.
[0254]
[Table 13]

[0255]
[287.] Since mice began to die 32 days after cell inoculation, surviving mice were sacrificed at that time. Bone marrow cells were analyzed by flow cytometry using anti-human CD44-FITC and Y1-biotin / SAV-PE. Blood samples from several animals were examined to count platelets and white blood cells. The livers were weighed and examined for tumor development. Other organs were also examined for tumor development.
[0256]
[288.] The results are as in Figures 30-32. Large tumor growth (white lumps) was seen in the livers of all mice injected with MOLT-4 cells.
[0257]
[289.] The percentage of MOLT-4 cells detected in the bone marrow was very low (Figure 31).
[0258]
[290.] In general, these results demonstrate that the MOLT-4 model can be used as a useful model for liver metastasis of leukemia cells.
[0259]
[291.] In parallel, a portion of liver tissue was harvested for histology and for cell separation for FACS analysis. The survival rate of another treated group of mice was recorded relative to that of a control untreated group of mice.
[0260]
[292.] Figure 35 liver weight on day30Shown in. As shown in the figure, the liver weight in the negative control PBS-injected group of tumor mice increased almost threefold compared to the control PBS-injected non-MOLT-4-injected group. Liver weights of mice treated with low dose Dox were approximately the same as PBS injected tumor mice. On the other hand, treatment with CONY1 scFv and CONY1 scFv-Dox conjugates significantly inhibited liver tumor growth (the increase in liver weight is much smaller).
[0261]
[293.] The same SCID / MOLT-4 protocol2The following six groups were used in the experiment:
  1. MOLT-4 cellsWhen PBS TheinjectionI did not.
  2. Injection of MOLT-4 cells into PBSProcessed bydid.
  3.MOLT-4 AndTreatment with CONY1 scFv 75 μg / mouseReason.
  Four. MOLT-4 AndNonspecific scFv antibody derived from Nissim I library at 75 μg / mouseReason ( Control ) .
  Five. MOLT-4 AndY1-IgG 5μg / mouseReason.
  6. Nonspecific human IgG , Five μ g / Treated with mouse MOLT-4 group ( Control ) .
[0262]
[294.] The results shown in FIG. 34 indicate that treatment with CONY1 scFv or Y1 IgG inhibited tumor growth (based on liver weight) while treatment with nonspecific antibodies had little or no effect I can see you.
[0263]
[295.] Survival was assessed in three groups of mice that received continuous treatment, and the results are shown in FIG. As shown, only survival of mice treated with CONY1 scFv was extended.
[0264]
  AML KG-1 model
[296.] For in vivo mouse models of human AML, use SCID / NOD mice (Jackson Laboratories) injected with KG-1 cells from human AML cell lines.
[0265]
[297.] In the first experiment, NOD / SCID mice were pretreated with CYTOXAN 100 mg / kg. Four days after CYTOXAN injection, KG-1 cells were intravenously injected into the tail of 6 groups of mice (Table14, Groups 2 and 5-9). 1 group of mice14, Group 1) was injected with PBS alone (control).
  KG-1 injection14Day after day mice were treated with any of the following: CONY1, Dox (doxorubicin), CONY1-Dox conjugate orMYLOTARG (Registered trademark) [MYLOTARGIs a conjugate in which a monoclonal antibody (anti-CD33 antibody) is chemically linked to carquiamycin, and has recently been approved by the FDA for treatment of AML patients over 60 years of age who experienced first relapse. The mice were treated once or three times a week for 3 weeks. One group (group 2) of KG-1 inoculated mice was left untreated (table14). The other two groups (groups 3 and 4) of mice were preincubated with CONY1 or 181-scFv (non-specific antibody negative control) in serum free RPMI with 1% BSA for 1 hour at 4 ° C. Were injected. The concentration of antibody used is 0.25 mg-scFv / 10⁸Were single cells (75 μg / mouse). The preincubated KG-1 cells were washed prior to injection into mice and resuspended in RPMI. KG-1 cells resuspended in RPMI were injected into mice at a concentration of 75 μg-scFv / 0.2 ml-RPMI / mouse. Group 3 mice were inoculated with KG-1 + CONY1 and group 4 mice were inoculated with KG-1 + 181-scFv (Table14). This treatment (groups 3 and 4) is one day after inoculation of groups 1-2 and 5-9, ie CYTOXAN( Trademark )It was performed 5 days after the injection.
[0266]
[Table 14]

[0267]
[298.] Mice were sacrificed 60-65 days after cell inoculation. Bone marrow and blood samples were analyzed by flow cytometry using mouse anti-human CD34-FITC (IQP 144F) [or anti-CD44-FITC (MCA89F, Serotec)] and Y1-biotin / SAV-PE. Mouse IgG1-FITC (IQP 191-F) was used as an isotype control and mouse IgG2a-FITC (MCA 929F, Serotec) was used as a negative control. For flow cytometry, FACSCalibur system and CellQwest software (Bectin Dickinson) were used.
[0268]
[299.] The result is FIG.36 as well as 37As shown in Nine out of 10 KG-1 cell injected mice (Group 7) treated with free Dox 5 mg / kg died within 3 weeks after the start of treatment.
[0269]
[300.] The bone marrow of KG-1 cells injected and untreated mice (group 2) contained approximately 30% of the total bone marrow cells, ie, KG-1 cells. Group 2 mice all expressed leukemia.
[0270]
[301.] Almost all KG-1 cells in the bone marrow average 30% (as measured by FACS analysis).KG- 1 injectionThe mice expressed leukemia. Generally, transplanted KG-1 cells were restricted in the bone marrow, but less than 10% of KG-1 cells were detected in blood. A solid tumor was observed in the peritoneal wall in one case.
[0271]
[302.] KG-1 cells injected / free Dox 0.1 mg / kg treated mice (group 6) had statistically significant (p <0.05) lower percentage of bone marrow KG-1 cells compared to group 2.
[0272]
[303.] KG-1 cell-injection / CONY1-Dox conjugate-treated mice (group 5) had a lower percentage of bone marrow KG-1 cells compared to group 2 (16.3% vs. 30.4%). However, this difference was not found to be statistically significant. This was because it was found that CONY1-Dox was contaminated with lipopolysaccharide (LPS) during the experiment. Therefore, this treatment was discontinued before the end of the experiment as it was not possible to use the optimal concentration of CONY1-Dox.
[0273]
[304.] Mice injected with KG-1 cells preincubated with CONY1 or 181-scFv in vitro (groups 3 and 4 respectively) had a significantly lower percentage of KG-1 cells in the bone marrow.
[0274]
[305.] Mice injected with PBS alone (negative control) and KG-1 cellsMYLOTARG ( Trademark )None of the mice treated with (group 9) had KG-1 cells detected in the bone marrow. These results demonstrate that this in vivo model is a useful AML model.
[0275]
[306.] The percentage of total KG-1 cells in the bloodstream of the various groups of mice was generally very low, and the differences within the groups were large. Note thatMYLOTARG ( Trademark )One mouse treated with had a relatively high KG-1 cell rate in the blood but not in the bone marrow.
[0276]
[307.] Identification of human leukemia cells (originated from KG-1) in the bone marrow and bloodstream of mice was performed by FACS analysis, which includes the commercially available anti-human CD34 or CD44 in parallel with the Y1 scFv antibody. An antibody was used.
[0277]
[308.] On the first day of analysis, mice injected with only KG-1 cells (Group 2) show higher percentages of KG-1 cells in bone marrow, compared to mice treated with CONY1-Dox (Group 8) There was a marked difference. On the third day of analysis, this situation was reversed, and the percentage of KG-1 cells in the bone marrow was higher in group 8 mice than in group 2. This may be due to the following circumstances: A) mice with worse general condition selected on day 1, B) KG-1 cells in group 8 mice during the period following the end of treatment There were too few mice in each group that grew and C) and did not give statistically significant results.
[0278]
  In the mouse CONY1 Pharmacokinetics of
[309.] CONY1 scFv¹²⁵It was labeled with I-Bolton Hunter reagent (against lysine).¹²⁵Labeled with I-Bolton Hunter reagent at 4 ° C in borate buffer (pH 9.2)¹²⁵I-CONY1 was purified on a PD-10 chromatography column. This radioactive protein is then mixed with unlabeled CONY1 in 2.5 × 10 6 in saline⁶ A solution containing 75 μg / ml CONY1 containing CPM / ml is prepared.
[0279]
[310.] Male Balb-C mice were pretreated with an intraperitoneal injection of 0.9% NaI 0.5 ml / mouse. Two hours later, mice were injected intravenously with 0.2 ml of labeled CONY1 solution. By this¹²⁵The resulting dose of I-CONY1 is 15 μg (2.5 × 10^Five CPM) / mouse.
[0280]
[311.] After injection, EDTA bleeds at various time points before sacrifice of mice and removal of tissue. Samples and organs were collected and removed at 5, 15, and 30 minutes and 1, 2, 4, 8 and 24 hours after injection. Two to four mice were used per time point. Plasma was separated and either gamma-radioactivity measured or precipitated with trichloroacetic acid (TCA). After centrifugation, the gamma radiation of TCA precipitate was measured. Liver, lung, kidney, spleen and bone marrow samples were weighed and gamma radioactivity was measured. The relationship between radioactivity and time of plasma TCA precipitation was graphed and a two-compartment pharmacokinetic model fitted. The total radioactivity and non-radioactivity values of organs / tissues were calculated. The results are shown in FIGS.
[0281]
[312.] Comparison of blood and plasma radioactivity values showed that almost all of CONY1 was present in plasma and did not adhere to red blood cells. The plasma radioactivity value was approximately the same as that of TCA precipitation, suggesting that both are related to non-degraded proteins. FIG. 39 shows plasma CONY1 levels in a time series after administration. Statistically fitting that value to a two-compartment model, the obtained blood clearance half-life values were 35 minutes and 190 minutes, respectively.
[0282]
[313.] The radioactivity distribution in various tissues at given time points after administration is shown in FIG. 40 and 41 as specific activity and total activity, respectively. In most tissues, no specific accumulation of radioactivity was found, as evidenced by specific activity comparisons with blood. Somewhat higher values were seen in the kidney after 4 hours and in the bone marrow after 4 and 8 hours, which is probably related to the elimination of degradation products.
[0283]
[314.] Results suggest that CONY1 is excreted with a half-life of 35 minutes in mice. The rate of withdrawal of the second compartment is less important and may also be due to the presence of some polymer body of the injectable substance. There is no large specific uptake of CONY1 into body tissues, with the exception of a slight elevation in the bone marrow.
[0284]
  Antibody and fragment production
[315.] The antibodies, their fragments, their components, peptides, polypeptides, proteins and fragments and components thereof can be produced in prokaryotic or eukaryotic expression systems. Methods of producing antibodies and fragments in prokaryotic and eukaryotic expression systems are well known in the art.
[0285]
[316.] A eukaryotic cell system, in the definition of the invention and in the following, refers to an expression system for producing peptides or polypeptides in eukaryotic host cells by genetic engineering methods. The eukaryotic expression system may be a mammalian system, but preferably the peptide or polypeptide expressed in a mammalian system is substantially free of mammalian contaminants after purification. Examples of other useful eukaryotic expression systems are yeast expression systems and the like.
[0286]
[317.] A preferred prokaryotic expression system for producing a peptide or polypeptide of the invention uses E. coli as a host for expression vectors. After purification, the peptide or polypeptide produced in the E. coli system is substantially free of contaminating proteins of E. coli. The use of a prokaryotic expression system may involve the addition of a methionine residue at the N-terminal side of some or all of the sequences provided herein. Complete expression of the peptide or polypeptide by dissociation of the N-terminal methionine residue after peptide or polypeptide production can be achieved in a manner well known in the art, for example by use of Aeromonas aminopeptidase under suitable conditions.
[0287]
  Types of antibodies, fragments and constructs
[318.] The present invention provides a construct of an antibody or an antigen-binding fragment thereof, a component thereof, or a fragment thereof. Examples of the antibody of the present invention are IgG, IgA, IgD, IgE or IgM. IgG class is IgG₁, IgG₂, IgG₃And IgG_FourDivide into subclasses etc.
[0288]
[319.] Examples of the antibody fragment of the present invention are Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab₂And Fd fragments. Smaller fragments, for example fragments of Fv fragments, also belong to the "fragments" of the invention, as long as they retain the binding properties of the original antibody or fragment. Examples of such fragments are (1) minibodies comprising fragments only of Fv heavy chain, (2) microbodies comprising small partial units of antibody heavy chain variable region (PCT application number PCT / IL99 / 00581), (3) Analogs, including light chain fragments, and (4) analogs containing functional units of the light chain variable region. Examples of constructs are multimers such as diabodies, torabodies and tetrabodies. The terms "antibody, binding fragment thereof, or complex comprising antibody or binding fragment thereof" and "antibody or fragment" are all unless otherwise specified or inappropriate in light of the context or technical knowledge. Not only molecules of the same, but also derivatives, homologues, mimetics and variants thereof.
[0289]
[320.] Once an antibody, fragment or construct having the desired binding ability has been selected and / or prepared, one skilled in the art will use the specification as a guide to identify the construct or fragment retaining the properties of the original antibody. It can be made. For example, complete antibody molecules, Fv fragments, Fab fragments, Fabs which retain the desired properties of the originally selected or produced antibody, fragment or construct₂Fragments, dimers, trimers or other constructs can be made.
[0290]
[321.] If it is desirable to substitute amino acids while retaining the properties of the antibody or fragment, there is a well known technique of conservative amino acid substitution. The antibody or fragment may be modified, such as conjugated to a therapeutic or diagnostic agent, without altering its binding properties. The antibody or fragment may be modified with another modification, for example, for stabilization of the antibody or fragment, without changing its specificity. For example, peptide modification, semi-peptide modification, cyclic peptide modification, N-terminal modification, C-terminal modification, peptide bond modification, backbone modification and residue modification. Also, one skilled in the art can use this specification as a guide to test and assess whether the binding properties of the modified antibody or fragment have been altered.
[0291]
[322.] Similarly, one skilled in the art, guided by the present specification, can alter the binding properties of antibodies, fragments or constructs to obtain molecules with more desirable properties. For example, once an antibody with desirable properties is identified, variants of the antibody can be generated by random or directed mutagenesis from which to screen variants with more desirable properties.
[0292]
[323.] The antibodies and fragments of the present invention may also be molecules into which tags having been inserted or added are useful for their preparation, identification and diagnosis. The tag can later be removed from the molecule. Examples of useful tags are AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Protein C, S-Tag®, T7, V5 and VSV -G et al. [Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-618 (1998)]. Tag is c-mycOr KAKIs preferred.
[0293]
  Multimeric antibody
[324.] The present invention provides a Y1 or Y17 peptide or polypeptide comprising a scFv molecule. Here, scFv is a molecule consisting of a heavy chain variable region of a human antibody and a light chain variable region of a human antibody, wherein the heavy chain variable region is linked, linked, fused or covalently linked or associated with the light chain variable region. Both human antibodies may be the same or different.
[0294]
[325.] The Y1 and Y17 scFv constructs may be multimers (dimers, trimers, tetramers, etc.) of scFv molecules with one or more hypervariable regions of the Y1 and Y17 antibodies. All scFv derived constructs and fragments selectively and / or specifically bind to target cells in preference to other cells by maintaining enhanced binding properties. This binding selectivity and / or specificity mainly depends on the hypervariable region.
[0295]
[326.] The hypervariable loops within the light chain and heavy chain variable regions are referred to as complementarity determining regions (CDRs). The light and heavy chains have CDR1, CDR2 and CDR3 regions respectively. The most variable of these regions is the heavy chain CDR3 region. This CDR3 region is considered to be the most exposed region in the Ig molecule and, as defined herein, a site that primarily contributes to the observed selective and / or specific binding properties. It is.
[0296]
[327.] The Y1 and Y17 peptides or polypeptides of the invention can be constructed to fold into multivalent Fv. The purpose of constructing the Y1 and Y17 multimeric forms is to improve binding affinity and specificity and to extend blood half-life.
[0297]
[328.] Multivalent scFv has already been produced elsewhere. The first approach is to link two scFvs with a linker. Another approach is to link the two scFvs by disulfide bonds. The simplest approach to generate dimeric or trimeric forms of Fv is Holliger et al., PNAS, 90, 6444-6448 (1993) and A. Kortt et al., Protein Eng., 10, 423-433 ( 1997) has reported. One such method is to create a scFv dimer by adding FOS and JUN protein regions at the C-terminus of the scFv and forming a leucine zipper between them. Kostelny SA et al., J. Immunol. 1992 Mar 1, 148 (5): 1547-53; De Kruif et al., J. Biol. Chem. 1996 Mar 29, 271 (13): 7630-4. The method is to add a streptavidin-coding sequence to the C-terminus of the scFv to make a tetramer. Streptavidin consists of four subunits, so when scFv-streptavidin is folded, the four subunits change accordingly to form a tetramer. Kipriyanov SM et al., Hum Antibodies Hybridomas, 1995, 6 (3): 93-101. In yet another method, free cysteines on the protein of interest for the purpose of producing dimers, trimers and tetramers Introduce. A peptide based crosslinking reagent with a variable number (2-4) of maleimide groups was used to attach the protein of interest to free cysteine. Cochran JR et al., Immunity, 2000 Mar, 12 (3): 241-50.
[0298]
[329.] In the system of the present invention, a phage library (described above) was designed to display scFv capable of folding into a monovalent form of antibody Fv region. In addition, and as also mentioned above, the construct is suitable for bacterial expression. This genetically modified scFv contains heavy and light chain variable regions linked by a continuous 15 amino acid flexible peptide spacer. The preferred spacer is (Gly_FourSer)₃It is. The length of this spacer, together with the amino acid configuration, will result in a non-bulky spacer, which_HAnd V_LAllows the region to fold into a functional Fv domain that achieves effective binding to the target.
[0299]
[330.] The present invention relates to Y1 and Y17 multimers formed by any known art method. A preferred multimer (especially dimer) formation method uses cysteine residues to form a disulfide bond between the two monomers. In this embodiment, in order to facilitate formation of a dimer, cysteine is added to the carboxyl group terminal of scFv to form a dimer (referred to as Y1-cys scFv or Y1 dimer). The Y1 dimer was expressed in the production vector and allowed to regenerate the protein in vitro by preparation of DNA constructs (see Examples 2D and 6D) and use for transfection. The protein was analyzed by SDS-PAGE, HPLC and FACS. However, none of the results showed that a dimer was formed. Thus, the same procedure was repeated, but this time an attempt was made to produce antibodies by batch fermentation of 2 liters. Y1-cys was expressed in E. coli and then regenerated in arginine. The regenerated protein was purified by dialysis through Q-Sepharose and gel filtration (Sephadex 75). Two peaks were detected by SDS-PAGE (non-reduced) and gel filtration. Two peaks were collected separately and analyzed by FACS. Binding of monomer and dimer to Jurkat cells was examined by FACS. Binding by the dimer only required 1/100 of the amount of monomeric antibody for the same level of staining, suggesting that the dimer had higher avidity. The conditions for regeneration of the dimer were determined, and through subsequent dialysis, chromatography and gel filtration steps, materials with a dimer content (in mg) in excess of 90% were obtained. The purified dimer was analyzed by gel filtration and SDS-PAGE under oxidative conditions. The binding ability of the dimer was confirmed by radioreceptor measurement, ELISA and FACS analysis.
[0300]
[331.] In vitro binding competition experiments were performed on KG-1 cells to compare the binding of scFv monomer (also known as CONY1) and Y1 dimer. The experiments also compared the binding of whole Y1 IgG to scFv Y1. In this study, Y1 IgG was labeled with biotin. This study showed that Y1 IgG competes with Y1 IgG-biotin. Unrelated human IgG did not compete with labeled Y1 IgG. Y1 scFv (5 μg and 10 μg) partially competed with Y1 IgG-biotin (50 ng). The study also found that in serum free 1 ng of Y1 IgG-FITC binds to KG-1 cells as well as 1 μg of Y1 scFv-FITC, but in the presence of serum this binding is nearly blocked. Moreover, it was revealed from the radioreceptor measurement, ELISA and FACS analysis that the binding of Y1 dimer is 20 times or more stronger than that of Y1 scFv monomer.
[0301]
[332.] In yet another embodiment, lysine-alanine-lysine was added to the carboxyl group end separately from cysteine (this is referred to as Y1-cys-kak scFv). The amino acid sequence of this scFv construct is as follows (SEQ ID NO: 212).
[0302]
1 MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
APGKGLEWVS GINWNGGSTG 60
61 YADSV KGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARM
RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG 120
121 SGGGGSGGGG SSELT QDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
YASWYQQKPG QAPVLVTYGK 180
181 NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR
DSSGNHVVFG GGTKLTVLGG 240
241 GGCKAK
[0303]
[333.]Y1-cys-KAKWas produced in bacteria in λ-pL vector. Expression in the λ-pL vector was induced by raising the temperature to 42 ° C. Inclusion bodies were recovered from the expression induced culture fluid and semi-purified by aqueous solution to remove unnecessary soluble proteins. Solubilize inclusion bodies with guanidine andDTTReduced by arginine /Oxidation-Regenerated in vitro with a solution of glutathione system. The regenerated protein was dialyzed and concentrated in a buffer containing urea / phosphate buffer by TFF (cross flow filtration) method. The protein was repurified and concentrated by ion exchange chromatography on an SP column.
[0304]
[334.] The difference in binding between dimer (Y1 scFv, aka Y1-kak) and dimer Y1-cys-kak (cysteine dimer) to platelet-derived antigen GPIb (glycocalysin) is confirmed by ELISA did. Polyclonal anti-single-chain antibody and / or novel polyclonal anti-V for detection of binding to GPIb_L(Rabbit origin) and anti-rabbit HRP were used. The dimer was about 100 times higher in binding activity than the monomer. For example, the monomer used to achieve 0.8 OD is 12.8 μg / ml, whereas the dimer is only 0.1 μg / ml. See FIG.
[0305]
[335.] Further, FACS analysis for binding to KG-1 cells revealed that dimers were more sensitive than monomers in a two or three step binding assay. The dimer directly labeled with FITC was somewhat more advantageous than the monomer (the amount used was 1/10). Radioreceptor measurements on KG-1 cells using the dimer as a competitor revealed that the dimer was 30 times more efficient than the monomer.
[0306]
[336.] Adjusting the length of the spacer is also a preferred method of forming dimers, trimers and tetramers (also referred to in the art as diabodies, triabodies and tetrabodies, respectively). The dimers are formed under conditions which generally shorten the spacer linking the two variable chains of the same scFv to 5 to 12 amino acid residues. This truncated spacer prevents the folding of two variable chains from the same molecule into one functional Fv domain. Instead, both domains are paired with the complementary domain of another molecule to form two binding domains. In a preferred method, a spacer of only 5 amino acid residues (Gly_FourSer) was used to construct a diabody. This dimer can be formed from two homologous scFvs, or from two heterologous scFvs, and also maintain enhanced selective and / or specific binding activity of the parent scFv, or higher binding. It can indicate force or affinity.
[0307]
[337.] Similarly, triabodies are formed under conditions that shorten the spacer linking two variable chains of the same scFv, generally to less than 5 amino acid residues. This prevents two variable chains derived from the same molecule from folding into one functional Fv domain. Instead, three scFv molecules associate to form a trimer. In the preferred method, the torrobody was obtained by completely eliminating this flexible spacer. The triabodies can be formed from three homologous scFvs, or from two to three scFvs, and maintain the enhanced selective and / or specific binding activity of the parent scFv, or higher avidity or It can indicate affinity.
[0308]
[338.] Tetrabodies are also formed under conditions which shorten the spacer linking two variable chains of the same scFv, generally to less than 5 amino acid residues. This prevents two variable chains derived from the same molecule from folding into one functional Fv domain. Instead, four scFv molecules associate to form a tetramer. The tetrabodies can be formed from 4 homologous scFvs, or from 1 to 4 heterologous scFvs, and maintain enhanced selective and / or specific binding activity of the parent scFv, or even higher avidity Or can indicate affinity.
[0309]
[339.] Whether a traabody or tetrabody is formed under conditions that the spacer length is generally less than 5 amino acid residues depends on the amino acid sequence of the specific scFv in the mixture and the reaction conditions.
[0310]
[340.] A preferred method utilizes biotin / streptavidin association to form tetramers. A new fermentation construct (herein called Y1-Biotag or Y1-B) which can be enzymatically biotin-labeled was created. The sequence corresponding to the substrate of BirA enzyme was added to the C-terminus of Y1. The BirA enzyme adds biotin to lysine residues within the sequence. This Y1-Biotag was expressed in E. coli. The proteins of inclusion bodies were isolated and regenerated. The protein in the folded state was> 95% pure, and over 100 mg was obtained from a 1 liter culture (small scale, non-optimum conditions). Its molecular mass was found to be approximately the same as that of scFv from HPLC, SDS-PAGE and MS. Y1-Biotag proved to be the most stable reagent for FACS analysis. However, when the binding of Y1-Biotag to KG-1 cells is determined in the presence of serum, the required amount is greater (about 10 times) than the equivalent binding in the absence of serum. Nevertheless, this construct offers the advantage of specific biotinylation, ie the binding site of the molecule is left intact. Also, each molecule is labeled with only one biotin, and each molecule receives only one biotin at the C-terminus.
[0311]
[341.] The limited labeling method with one biotin per molecule at the desired position allowed the production of tetramers in combination with streptavidin. The tetramer was formed by incubating Y1-B with streptavidin-PE.
[0312]
[342.] According to FACS analysis, the tetramer produced by Y1-B and streptavidin-PE was 100 to 1000 times more sensitive than Y1 scFv monomer. The Y1-B / streptavidin-PE tetramer appears to bind specifically to one of the Y1-reactive cell lines (KG-1). The difference between this reaction and background binding was so large that small amounts of receptor could be detected with high sensitivity. FACS assessment of normal whole blood using Y1 BSAV tetramer showed no highly reactive species. Monocytes and granulocytes were slightly positive, but in cell lines that gave positive results, such as KG-1 cells, the reactivity of the tetramer was more than 100 times that.
[0313]
[343.] Next, tetramers were incubated with cell samples. The Y1 tetramer bound well to the cell line (KG-1) at low doses (5 ng) and the response was 10-20 times higher than the response previously observed with other antibody types.
[0314]
  Conjugate for diagnostic treatment
[344.] The antibodies and fragments thereof of the present invention are associated, conjugated, fused or linked to various drugs such as drugs, toxins and radioactive isotopes, optionally together with pharmaceutical carriers, for disease prevention and / or anti-cancer Active agent-peptide compositions, fusions or conjugates can be formed. Such conjugates and fusions may also be used for diagnostic purposes.
[0315]
[345.] Examples of carriers useful in the present invention are dextran, HPMA (lipophilic polymer) or any other polymer. Alternatively, a modified liposome such as a liposome modified with scFv Y1 molecule (eg, a commercially available liposome Doxil containing a large amount of doxorubicin) can also be used. Such liposomes can be prepared to contain one or more drugs and be miscible with the antibodies of the invention to a high drug / antibody ratio.
[0316]
[346.] Alternatively, the binding of the antibody or fragment thereof to the agent may be direct binding. Direct attachment of two or more adjacent molecules may be achieved via a chemical bond between elements or groups of elements in the molecule. The chemical bond may be, for example, ionic bond, covalent bond, hydrophobic bond, hydrophilic bond, electrostatic bond or hydrogen bond. The bonds may be, for example, amine bonds, carboxyl bonds, amide bonds, hydroxyl bonds, peptide bonds and / or disulfide bonds. The direct linkage is preferably a protease resistant linkage.
[0317]
[347.] The bond between the peptide and the drug, or between the peptide and the carrier, or between the carrier and the drug may be a bond via a linker compound. A linker compound, in the present specification and claims, refers to a compound that links two or more moieties. The linker may be linear or branched. The branched linker compound may be composed of a bifurcated, trifurcated or quadruple or more compound. Linker compounds useful in the present invention are selected from the group comprising, for example, dicarboxylic acids, maleimide hydrazides, PDPH, carboxylic acid hydrazides and small peptides.
[0318]
[348.] A more specific example of a useful linker of the invention is:
  a. Dicarboxylic acids such as succinic acid, glutaric acid and adipic acid;
  b. Maleimido hydrazides such as N-[-maleimidocaproic acid] hydrazide, 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxyl hydrazide, and N-[-maleimidoundecanoic acid] hydrazide and the like;
  c. PDPH linker, for example (3- [2-pyridyldithio] propionyl hydrazide linked to sulfhydryl reactive protein;
  d. Carboxylic acid hydrazide having 2 to 5 carbon atoms.
[0319]
[349.] Coupling by direct coupling using small peptides is also useful. For example, direct coupling of free sugars such as the anticancer drug doxorubicin with scFv may be achieved using small peptides. Examples of small peptides are AU1, AU5, BTag, c-myc, FLAG, Glu-Glu, HA, His6, HSV, HTTPHH, IRS, KT3, Protein C, S-Tag (registered trademark), T7, V5 and VSV- G and so on.
[0320]
[350.] The antibodies and fragments thereof of the present invention may be conjugated, conjugated, conjugated or otherwise associated with a contrast agent (also referred to as an indicator marker) such as a radioactive isotope to form a conjugate, for diagnostic and image analysis purposes You may use it for Kits are provided that include such radioisotope-antibody (or antibody fragment) conjugates.
[0321]
[351.] Examples of radioactive isotopes useful for diagnosis are:¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶⁵thulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸Such as gallium. Preferred are radioactive isotopes that are impervious to X-rays or paramagnetic ions.
[0322]
[352.] The indicator marker molecule may be a fluorescent marker molecule. Examples of fluorescent marker molecules are fluorescein, phycoerythrin or rhodamine or modifications or conjugates thereof.
[0323]
[353.] The antibody or fragment bound to the indicator marker may be used in the diagnosis or monitoring of the pathological condition. Such monitoring may be performed in vivo, in vitro or ex vivo. When the monitoring or diagnosis is performed in vivo or ex vivo, the contrast agent is preferably physiologically acceptable in the sense that the patient is not harmed to an unacceptable extent. Acceptable levels of harm will be determined by clinicians using criteria such as disease severity and availability of replacements.
[0324]
[354.] The present invention is a diagnostic kit for in vitro therapeutic efficacy analysis before, during, and after treatment, which comprises an imaging agent comprising the peptide of the present invention conjugated to an indicated marker (or an imaging agent). Provide a kit. The invention further relates to a method of using a contrast agent for diagnostic localization and image analysis of a cancer, in particular a tumor,
a) contacting the cells with the contrast agent
b) measuring the radioactivity bound to the cells, and
c) visualizing the tumor
Provide a way that includes
[0325]
[355.] Examples of suitable contrast agents are FITC, fluorescent dyes such as PE, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein. Other examples are radioactive molecules and enzymes which react with the substrate to cause a distinguishable change, eg a change of color.
[0326]
[356.] In one example, the imaging agent of the kit is a fluorescent dye such as FITC, and the kit is used to analyze the therapeutic efficacy of cancer, particularly blood related cancers such as leukemia, lymphoma and myeloma. FACS analysis is used to determine the percentage of cells stained with contrast agent at each stage of the disease, eg at diagnosis, treatment, treatment, remission and relapse, and the staining intensity.
[0327]
[357.] The antibodies and fragments thereof of the present invention are anticancer drugs, anti-leukemic drugs, antiviral drugs, anti-metastatic drugs, anti-inflammatory drugs, anti-thrombotic drugs, anti-restenotic drugs, anti-aggregating drugs, anti-autoimmune drugs It may be combined, conjugated or otherwise associated with drugs, anti-adhesives, anti-cardiovascular drugs, or other anti-disease drugs or agents. The term "agent" refers to a substance useful for preventing, treating or diagnosing a disease in a mammal, including, but not limited to, human, cow, horse, pig, mouse, dog, cat or any other warm-blooded animal.
[0328]
[358.] Non-limiting examples of such agents are antivirals such as acyclovir, ganciclovir and zidovudine; antithrombotic / restenotic agents such as cilostazol, dalteparin sodium, reviparin sodium and aspirin; antiinflammatory agents such as zaltoprofen, pranopro Fen, droxicam, acetyl salicylic 17, diclofenac, ibuprofen, dexibuprofen, sulindac, naproxen, amtormetin, celecoxib, indomethacin, rofecoxib and nimesulide; subreum), WinRho SDF, defibrotide and cyclophosphamide; and anti-adhesive / anti-agglutinating agents such as limaprost, chlorchromen and hyaluronic acid.
[0329]
[359.] Other drug examples are doxorubicin(Adriamycin), morpholino doxorubicin ,Methoxymorpholinyl doxorubicin, cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholino daunorubicin, methoxymorpholinyl daunorubicin,Idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof and the like.
[0330]
[360.] Anti-cancer drugs are substances that have anti-cancer activity. Examples of anticancer drugs include substances that inhibit or arrest the growth of cancer cells or immature cancer cells, substances that injure cancer cells or cancer cells, cancer cells or cancer cells. These include substances that increase the sensitivity to other anticancer drugs, and substances that inhibit the metastasis of cancer cells. In the present invention, the anticancer drug may be a substance having anti-angiogenic activity that prevents, inhibits or suppresses tumor angiogenesis.
[0331]
[361.] Inhibition of cancer cell growth is, for example, (i) growth prevention of cancer or metastatic cells, (ii) growth suppression of cancer or metastatic cells, (iii) survival of cancer cells intact In the condition, complete prevention of its growth process or metastasis process, or (iv) cancer cell injury.
[0332]
[362.] Anti-leukemic agents are substances that have anti-leukemic activity. Examples of anti-leukemic agents include substances that inhibit or arrest the growth of leukemia cells or immature pre-leukemic cells, substances that damage leukemia cells or pre-leukemia cells, sensitivity to leukemia cells or other pre-leukemia cells, and other anti-leukemia agents And substances that promote metastasis of leukemia cells. In the present invention, the anti-leukemic drug may be a substance having anti-angiogenic activity that prevents, inhibits or suppresses tumor angiogenesis.
[0333]
[363.] Inhibition of leukemia cell growth is, for example, (i) growth prevention of leukemia or metastatic cells, (ii) growth suppression of leukemia or metastasis cells, (iii) with leukemia cells kept intact. Its complete prevention of its growth or metastasis process, or (iv) injury of leukemic cells.
[0334]
[364.] Examples of anti-disease agents, anti-cancer agents and anti-leukemic agents which may usefully bind the antibodies or fragments of the present invention include toxins, radioisotopes and therapeutic agents.
[0335]
[365.] Examples of toxins are gelonin, Pseudomonas exotoxin (PE), PE40, PE38, diphtheria toxin, ricin, or a modified form or derivative thereof.
[0336]
[366.] Examples of radioactive isotopes are gamma emitters for diagnosis and / or treatment, positron emitting nuclei and X-ray emitters, beta emitters for therapeutic use and alpha emitters, and the like.
[0337]
[367.] Specific examples of radioactive isotopes for treatment are¹¹¹indium,¹¹³indium,^99mrhenium,¹⁰⁵rhenium,¹⁰¹rhenium,^99mtechnetium,^{121 m}tellurium,^{122 m}tellurium,^{125 m}tellurium,¹⁶⁵thulium,¹⁶⁷thulium,¹⁶⁸thulium,^{one two Three}Iodine,¹²⁶Iodine,¹³¹Iodine,¹³³Iodine,^{81 m}krypton,³³xenon,⁹⁰yttrium,²¹³Bismuth,⁷⁷bromine,¹⁸Fluorine,⁹⁵ruthenium,⁹⁷ruthenium,¹⁰³ruthenium,¹⁰⁵ruthenium,¹⁰⁷mercury,²⁰³mercury,⁶⁷Gallium and⁶⁸Such as gallium.
[0338]
[368.] Non-limiting examples of anti-cancer agents or anti-leukemic agents are doxorubicin( Adriamycin ),Morphorino doxorubicin, methoxymorpholinyl doxorubicin,Cisplatin, taxol, calicheamicin, vincristine, cytarabine (Ara-C), cyclophosphamide, prednisone, daunorubicin,Morpholinodaunorubicin, methoxymorpholinylda Unorubicin,Idarubicin, fludarabine, chlorambucil, interferon alpha, hydroxyurea, temozolomide, thalidomide and bleomycin, and derivatives and combinations thereof and the like.
[0339]
  Pharmaceutical composition
[369.] The antibodies, constructs, conjugates, and fragments of the invention may be administered to a patient in need thereof in any suitable manner. Examples of administration methods include intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intrathecal, intraperitoneal, intralymphatic, intranasal, sublingual, oral, rectal, vaginal, respiratory, oral cavity, intradermal, transdermal or intrathoracic cavity Such as administration.
[0340]
[370.] Compositions for intravenous administration are preferably prepared such that an effective amount of the desired composition of about 0.1 mg to about 1000 mg is administered to the patient. More preferably, the dose will be in the range of about 1 mg to about 500 mg of the desired composition. Although the composition of the present invention is effective over a wide dose range, the range includes various factors such as details of the disease to be treated, half life of the peptide or polypeptide based pharmaceutical composition in the patient, drug and pharmaceutical composition The nature of the drug, the method of administration of the pharmaceutical composition, the particulars of the treated or diagnosed control patient, and / or other parameters which the attending physician deems important, etc.
[0341]
[371.] The composition for oral administration may be in any suitable form. Examples are tablets, solutions, emulsions, suspensions, syrups, pills, caplets and capsules. Methods of formulation are well known in the art, see, eg, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennnaro (Ed.), Lippincott, Williams & Wilkins (Pub.).
[0342]
[372.] The pharmaceutical composition may be formulated to facilitate timed, sustained, intermittent or continuous release. The pharmaceutical compositions may also be administered in a timed, sustained, intermittent or continuous release vehicle.
[0343]
[373.] Pharmaceutical compositions for topical administration can be in any suitable dosage form such as creams, ointments, lotions, patches, solutions, suspensions, gels and the like.
[0344]
[374.] Compositions comprising the antibodies, constructs, conjugates and fragments of the invention may comprise conventional, pharmaceutically acceptable diluents, excipients, carriers and the like. Tablets, pills, caplets and capsules may contain conventional excipients such as lactose, starch and magnesium stearate. Suppositories may also contain excipients such as wax and glycerin. The injection may contain a pyrogen-free sterile solvent such as physiological saline, etc., and may contain a buffer, a stabilizer or a preservative. Conventional enteric coatings may also be used.
[0345]
[375.] The following examples are intended to aid the understanding of the present invention, and in no way limit the scope thereof. Although specific reagents and reaction conditions are mentioned, various modifications are possible, which are also included in the scope of the present invention. Accordingly, the following examples are for the purpose of further illustrating the present invention.
[0346]
Example 1: Platelet preparation
1.1Preparation of washed platelets
[376.] ACD (Acid Citric Acid-Dextrose) -enriched platelets were obtained from a blood center, and the platelets were separated and washed once with a buffer containing ACD and saline in a ratio of 7: 1. Platelets are centrifuged at 800 × g for 10 minutes after each wash, and Tyrode's solution (2 mM MgCl 2)₂, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 3 mM NaH₂PO_Four, In 0.1% glucose, 5 mM Hepes and 0.35% albumin, pH 7.35), and the number of cells was counted.
[0347]
1.2Preparation of platelet rich plasma
[377.] Blood was collected into a tube containing 3.8% sodium citrate, and platelet-rich plasma was prepared by centrifugation at 250 × g for 10 minutes.
[0348]
Example 2: Platelet aggregation
[378.] In platelet aggregation studies, platelet-rich plasma (PRP) and washed platelets were agitated with whole blood Lumiaggregometer (Chronolog, Havertown, PA) at 37 ° C, 500 rpm. The difference in light transmittance between the platelet suspension and the suspension medium was taken as 100% aggregation. The effect of Y1 on platelet aggregation was evaluated by adding various concentrations of Y1 prior to agonist addition, and the effect was recorded for 4 minutes.
[0349]
Example 3: Platelet endoprotease treatment
3.1Treatment of platelets with mokaragin
[379.] For mokaragin digestion, washed platelets 10 suspended in 1 mM calcium chloride-added TS buffer (0.01 M Tris, 0.15 M sodium chloride, pH 7.4) 10⁸The pieces were treated with (final concentration) 12 μg / ml mokaragin for 1 hour at 22 ° C., and EDTA was added to 0.01 M to stop digestion.
[0350]
3.2Cathepsin G Treatment of glycocalicin
[380.] Washed platelets 10 suspended in TS buffer containing 1 mM calcium chloride 10⁸The pieces were treated with (final concentration) 1.8 μg / ml cathepsin G for 4 hours at 22 ° C., and PMSF was added to 1 mM to stop digestion.
[0351]
  O- Treatment of glycocalicin by sialoglycoprotein endoprotease
[381.] Platelets suspended in 0.1 M Tris buffer (pH 7.4) containing 0.2% albumin and protease inhibitor (10 μM leupeptin, 0.24 mM PMSF)⁶The pieces were incubated for 45 minutes at 37 ° C. with 0.14 mg / ml (final concentration) of O-sialoglycoprotein endoprotease, and the digestion was stopped by addition of sample buffer and boiling. The sample buffer used contains 3% SDS, 12% glycerol, 50 mM Tris-HCl, 2% β-mercaptoethanol and 0.03% bromophenol blue.
[0352]
Example Four: Cleavage of glycocalicin by endoprotease
  Cleavage of glycocalicin by mokaragin
[382.] For mokaragin digestion, glycocalicin dissolved in 1 mM calcium chloride-added TS buffer was treated with 10 μg / ml mokaragin (final concentration) at 22 ° C. for 1 hour, and EDTA was added to 0.01 M to stop digestion.
[0353]
  Cathepsin G by
[383.] After treating glycocalicin dissolved in 1 mM calcium chloride-added TS buffer with (final concentration) 3.4 μg / ml cathepsin G at 22 ° C for 4 hours, digestion was stopped by adding PMSF to 1 mM.
[0354]
  O- By sialoglycoprotein endoprotease
[384.] Incubate glycocalicin dissolved in 0.05 M Tris buffer (pH 7.4) with 1.2 mg / ml (final concentration) of O-sialoglycoprotein endoprotease for 15 minutes at 37 ° C. (Example 3 (YH) The digestion was stopped by the addition and boiling of sample buffer (described).
[0355]
Example Five: Full size Y1 IgG Construction of
[385.] All IgG molecules have longer in vivo half-lives and in vitro cellular responses than Fv, such as ADCC or CDC (complement dependent cytotoxicity; Tomlinson, Current Opinions of Immunology, 5, 83-89 , 1993) has several advantages such as the ability to induce cellular responses. The Y1 Fv region was converted to a full size IgG1 molecule by the molecular cloning method described later. The construction of Y1-IgG1 was realized by joining the fragments of cDNA together in the following order. The sequences of the Y1-IgG heavy chain and light chain are as shown in FIG. In the figure, the open reading frame (ORF) of the nucleotide sequence of Y1-HC (SEQ ID NO: 205), the amino acid sequence of Y1-HC (SEQ ID NO: 206), the ORF of the nucleotide sequence of Y1-LC (SEQ ID NO: 207) and the amino acid sequence of Y1-LC (SEQ ID NO: 208).
[0356]
[386.] Leader Sequences for Mammalian Expression Systems: Compatible systems were designed to allow convenient insertion of the required elements for all IgG molecules. The following complementary double stranded oligonucleotides encoding a putative leader sequence were synthesized, annealed and ligated to the XhoI site (under SRα5 promoter control) of the pBJ-2 mammalian expression vector:
[0357]
5'-TCGACC TCATCA CCATGG CCTGGG CTCTGC TGCTCC TCA CCC TCCTCA CTCAGG ACACAG GGTCCT GGGCCG AT &
[0358]
5'-GATCGA TTGCAC CAGCTG GATATC GGCACCAGGTCC TGT GTC CTGAGT GAGGAG GGTGAG GAGCAG CAGAGC CCAGGC CATGGT GATGAG G.
[0359]
  Two Kozak elements were introduced upstream of the initiation codon ATG. An internal EcoRV site was also introduced between the putative cleavage site of the leader sequence and the XhoI site to allow subcloning of the variable region. This modified vector was named pBJ-3.
[0360]
[387.] V derived from Y1 scFv cDNA sequence_LThe coding sequence was inserted between the leader sequence and the light chain constant region coding sequence. Similarly, V derived from Y1 scFv cDNA sequence_HThe coding sequence was inserted between the leader sequence and the heavy chain constant region coding sequence. This is V by PCR amplification of the vector pHEN-Y1 encoding the original Y1._LAnd V_HRealized by acquiring areas individually.
[0361]
  Oligonucleotide
[388.] V_L For the PCR reaction, 5'-TTTGAT ATCC AG CTGGTG GAGTCT GGGGGA (sense strand) and 5'-GCTGAC CTAGGA CGGTCA GCTTGGT (antisense strand) were used. Product cDNA of expected size ̃350 bp was purified, sequenced and digested with EcoRV and AvrII restriction enzymes. In the same manner, V with the sense and antisense strand oligonucleotides described below_H The cDNA region was amplified and purified:
[0362]
[389.] 5'- GGGATA TCCAGC TG (C / G) (A / T) GG AGTCGG GC and 5'- G GACT CGAGACG GTGACC AGGGTA CCTTG.
[0363]
[390.] Constant Region: The constant λ3 (CL-λ3) region for IgG1 cDNA and the heavy chain constant region CH1-CH3 were separately synthesized as follows:
[0364]
[391.] mRNA and sense strand 5′-CCGTCC TAGGTC AGCCCA AGGCTG C and antisense strand 5′-TTTGCG GCCGCT CATGAA CATTCT to obtain a constant CL-λ3 region RT-PCR was performed using GTAGGG GCCACT GT oligonucleotide. The expected size ̃400 bp PCR product was purified, sequenced and digested with AvrII and NotI restriction enzymes.
[0365]
[392.] BTG immortalized human B cell clones (CMV-clone # 40) were selected for PCR amplification to obtain a constant IgG1 region (gamma chain). This clone was shown to secrete IgG1 against human CMV and to elicit an ADCC response in an in vitro assay. Oligonucleotide 5'-ACCGCT CGAGTG C (T / C) TCCA CCAAGG GCCCAT C (G / C) G TCT TC (sense strand) and for CH1-CH3 cDNA and
5'-TTTGCG GCCGCT CATTTA CCC (A / G) GA GACAGG GAGAGG CT (antisense strand) was synthesized and used for PCR amplification. As in the case of the CL cDNA coding sequence, the PCR product of the expected sequence ̃1500 bp was purified, sequenced and digested with AvrII and NotI restriction enzymes.
[0366]
[393.] In order to obtain the final expression vector, triple ligation was performed using EcoRV-NotI digested pBJ-3 vector, EcoRV-AvrII variable region cDNA and AvrII-NotI constant region. The final expression vectors for heavy and light chains were named pBJ-Y1-HC and pBJ-Y1-LC, respectively.
[0367]
[394.] To enable double selection based on the puromycin resistance gene (PAC), an additional vector pBJ-Y1-LP was constructed based on pBJ-Y1-LC. In this vector, the neomycin resistance gene of the pBJ-Y1-LC vector is replaced with a -1600 bp fragment (derived from the pMCC-ZP vector) corresponding to the PAC gene.
[0368]
[395.] The ORFs of both Y1-HC and Y1-LC and the amino acid sequences encoded by each are as SEQ ID NO: 205-208.
[0369]
[396.] The underlined part is the leader sequence. V_HAnd V_LThe region corresponds to the bold amino acid sequence, followed by the IgG1 (for heavy chain) or λ3 (for light chain) constant region sequences.
[0370]
[397.] Expression of Y1 heavy and light chains in CHO cells: Vector pBJ-Y1-HC and pBJ-Y1-LC separately used for transfection and selection of stable cells expressing heavy or light chain did. After G418-based selection and cell growth, the expression of IgG1 was analyzed for the secreted proteins in the supernatant by capture EIA and Western blot as described below.
[0371]
[398.] Capture EIA method: The wells of a 96-well plate were coated with mouse anti-human IgG1 Fc (Sigma). The above supernatant was added to the wells and the presence of heavy chain IgG1 was detected using a biotinylated goat anti-γ chain specific antibody (Sigma), streptavidin-HRP and substrate. ELISA plate reader A₄₀₅The color development at was monitored.
[0372]
[399.] Western blot analysis: The cell supernatant was subjected to 12.5% SDS-PAGE electrophoresis. (A) Goat anti-human IgG-HRP (H + L; Sigma Cat #A 8667) for heavy chain detection and (b) biotinylated goat anti-human λ3 chain for light chain detection (Southern Biotechnology Association, Detected with Cat # 2070-08).
[0373]
[400.] The expression of both chains was confirmed by the above assay, and co-transfection yielded full size Y1-IgG1.
[0374]
  IgG-Y1 Expression and purification of
[401.] Cell culture and transfection: CHO cells at 37 ° C, 5% CO₂The cells were cultured in an atmosphere of F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 40 μg / ml gentamycin. One day before transfection, 0.8 to 1 x 10⁶Cells were implanted in a 90 mm dish. Cultured cells were cotransfected with 10 μg of light and heavy chain DNA with FuGene (Roche) transfection reagent method. After two days of growth in non-selective medium, cells were cultured for 10 to 12 days in F-12 medium supplemented with 550 μg / ml neomycin and 3 μg / ml puromycin. The cells were trypsinized and cloned in 0.5 cells / well using limiting dilution method using a Costar 96 well plate. Individual colonies were picked, grown in 6-well dishes and transferred to flasks.
[0375]
[402.] Measurement of Heavy and Light Chain Secretion: The concentration of antibody secreted in the supernatant of transfected CHO cells was measured by sandwich ELISA. The following reagents were used to determine the antibody concentration: monoclonal anti-human IgG1 (Fc) (Sigma) as a coat antibody, goat anti-human IgG (gamma chain specific) biotin conjugate (Sigma) as a detection reagent, and Pure human IgG1 λ (Sigma) as a standard. According to this ELISA method, the production rate was in the range of 3 to 4 μg / ml.
[0376]
[403.] Production and purification of MAbs from cells: The cells are roller bottled to a final concentration of 1-2 x 10 in F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and neomycin and puromycin.⁸Grow to cells / bottles. For production, cells were cultured for another 2 days in the same medium (but with 2% fetal calf serum).
[0377]
[404.] The secreted antibody was purified on a Protein G-Sepharose column (Pharmacia). 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 was used for binding, and 0.1 M glycine buffer pH 2.5-3.0 was used for elution. The amount of purified antibody was determined by UV absorbance and the purity was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis. Under non-denaturing conditions, all IgG antibodies have an expected molecular mass of 160 kD. In the denatured gel, the expected sizes of heavy and light chains are 55 kD and 28 kD, respectively.
[0378]
[405.] Binding of full size IgG-Y1 molecules: Binding experiments were performed to compare and measure the binding levels of IgG-Y1 molecules and scFv-Y1 molecules. Adopting a two-step staining method, 5 ng of IGG-Y1 was treated with RAJI cells (negative control, FIG. 44).-47a) And Jurkat cells (Y1 positive cells, FIG. 44).-47b as well as 44-47cIt reacted with both). PE labeled goat anti-human IgG was used for detection( Figure 44-47c). Similarly, 1 μg of scFv-Y1 was reacted with Jurkat cells (FIG. 44).-47bAnd PE labeled rabbit anti-scFv were used for detection. Both IgG-Y1 and scFv-Y1 bind to Jurkat cells, but scFv-Y1 achieves about 10 detection levels comparable to IGG-Y1.³The result shows that double amount is needed.
[0379]
Example 6: all IgG-Y1 Antibody derived Fab as well as F (ab ' ) ₂ Fragment preparation
  Cell culture and transient transfection
[406.] CHO cells at 37 ° C, 5% CO₂The cells were cultured in an atmosphere of F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 40 μg / ml gentamycin. 1 day before transfection, 1 to 1.5 x 10⁶Cells were implanted in a 90 mm dish. Cultured cells were cotransfected with 10 μg of DNA encoding the light and heavy chain variable regions of the Y1 antibody, each contained in a separate eukaryotic expression system. For transfection, FuGene (Roche) transfection reagent method was used.
[0380]
[407.] After two days of growth in non-selective growth medium, cells were cultured for 10 to 12 days in F-12 medium supplemented with 550 μg / ml neomycin and 3 μg / ml puromycin. The cells were trypsinized and cloned in 0.5 cells / well using limiting dilution method using a Costar 96 well plate. Individual colonies were picked, grown in 6-well dishes, transferred to flasks for further selection (to determine expression levels and antibody secretion levels in growth media).
[0381]
  Cell culture and long-term transfection
[408.] CHO cells at 37 ° C, 5% CO₂The cells were cultured in an atmosphere of F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 40 μg / ml gentamycin. One day before transfection, 0.8 to 1 x 10⁶Cells were implanted in a 90 mm dish. Cultured cells were cotransfected with 10 μg of DNA encoding the light and heavy chains of the Y1 antibody cloned under the control of the CMV (cytomegalovirus) promoter and the dhfr gene cloned under the control of the sv-40 promoter. . Transfection was performed with FuGene (Roche) transfection reagent method. After two days of growth in non-selective medium, culture the cells in medium containing 100 nM to 5 μM methotrexate (MTX) and dialyzed fetal bovine serum and express all Y1 antibody at a still higher level (after limiting dilution) A clone was selected.
[0382]
  Measurement of heavy and light chain secretion
[409.] A sandwich ELISA method was established to determine the concentration of antibody secreted into the supernatant of transfected CHO cells. The following reagents were used to determine the antibody concentration: monoclonal anti-human IgG1 (Fc) (Sigma) as a coat antibody, goat anti-human IgG (gamma chain specific) biotin conjugate (Sigma) as a detection reagent, and Pure human IgG1 λ (Sigma) as a standard.
[0383]
  MAb Production and purification from human cells
[410.] Cells are roller bottled (as described above) in F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, neomycin and puromycin to a final concentration of 1-2 x 10⁸Grow to cells / bottles. For antibody production, cells were cultured for another 2 days in the same medium (but with 2% fetal calf serum).
[0384]
[411.] The secreted antibody was purified with a Protein G-Sepharose column (Pharmacia) and an ion exchange column-Q Sepharose (Pharmacia). 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 was used for binding, and 0.1 M glycine buffer pH 2.5-3.0 was used for elution. The amount of purified antibody was determined by UV absorbance and ELISA, and the purity was analyzed by SDS-PAGE and HPLC. Under non-denaturing conditions, all IgG antibodies have an expected molecular mass of 160 kD. In the denatured gel, the expected sizes of heavy and light chains are 55 kD and 28 kD, respectively.
[0385]
  Y1 IgG of Fab as well as F (ab ' ) ₂ Fragmentation into fragments
[412.] IgG molecules consist of two identical light chains and two identical heavy chains. These light and heavy chains are organized into a folded structure (domain) by a combination of noncovalent interaction and covalent bond (disulfide bond). The light chain consists of one variable domain and one constant domain. The heavy chain contains one variable domain (V_HAnd three separate constant domains (CH 1, 2 and 3). The "hinge" region between heavy chain constant domain 1 (CH1) and heavy chain constant domain 2 (CH2) is susceptible to proteolytic degradation by the enzyme. Cleavage of this hinge region results in Fab or F (ab ')₂Fragments and Fc fragments are generated. Fab fragments retain the antigen binding ability of the native IgG molecule, but have low nonspecific binding ability. Fab fragments are best suited for situations where antigen binding ability lacking effector function is desired.
[0386]
[413.] Fab and F (ab ')₂The fragments are used in vivo as a diagnostic or therapeutic agent. To make a cancer chemotherapeutic drug a tumor specific drug rather than a drug that damages all cells, the drug may be linked to an antibody that binds to the cell surface antigen of the tumor. The use of Fab or F (ab ') 2 fragments rather than the use of native IgG has the following advantages.
[0387]
[414.] (1) The fragments can easily pass through the capillary and diffuse to the tissue surface.
[0388]
[415.] (2) Fragments that do not have conjugated conjugates will be excreted more quickly than similar prototype IgGs. Thus, the amount of fragment-therapeutic agent that reaches the target area will be high.
[0389]
  Fab Detailed procedure for fragment preparation
[416.] Cysteine HCl concentration 2 mg / ml [for preparation of F (ab ') 2 fragments] and 20 mg / ml (for preparation of Fab fragments) on a 2 ml immobilized ficin column containing digestion buffer 1 mg of purified Y1 antibody Were added and allowed to react at 37 ° C. for 5 hours (for Fab) and 20 hours [for F (ab ′)]. The reaction was stopped by eluting the digest with 4 ml of ImmunoPure binding buffer. Fab or F (ab ') fragments were separated as flowthrough from undigested IgG and Fc fragments using a Protein A column and binding buffer. The peak fraction containing the fragment was collected by reading the absorbance at 280 nm. The fragments were concentrated on a microconcentrator with a cutoff molecular mass of 10 kDa or 30 kDa and dialyzed against PBS. Protein recovery, purity determination and analysis were performed by absorbance at 280 nm, gel electrophoresis and HPLC.
[0390]
  Cell extract ( Melt ) Preparation of
[417.] 2 × 10⁶Individual cells were collected and microcentrifuged (1300 rpm, 4 ° C., 5 minutes). For washing, 0.5-1 ml PBS + pi was added to the pellet and mixed gently. The mixture was centrifuged as described above. Washing with 0.5 to 1 ml PBS + pi was repeated, and the mixture was centrifuged as described above. The pelleted cells were resuspended in lysis buffer (200 μl / 20 × 10)⁶Individual cell pellet). The buffer used is 50 mM Tris pH 7.4, 1 mM PMSF, 1% NP-40 and 1 mM EDTA, but may be any other suitable buffer. The suspension was incubated on ice for about 30 minutes and then centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 5 minutes). The supernatant was collected and divided into aliquots.
[0391]
  Preparation of crude membrane fraction and extraction of membrane protein
[418.] 20 volumes of homogenization buffer was added to the condensed cells. The homogenization buffer used is 2% (w / v) Tween 20, 1 mM MgSO 4_Four, 2 mM CaCl₂, 150 mM NaCl and 25 mM Tris-HCl, pH 7.4. The following protease inhibitors were added: 1 mM PMSF, 5 μg / ml leupeptin and 5 μg / ml aprotonin. The cells were homogenized by 3-5 strokes with a Potter-Elvehjem homogenizer with a rotating Teflon pe (Ultra Torex). The samples were kept cold during homogenization and then stirred in an ice bath for 1 hour. Several more strokes were added to the sample with the homogenizer, and then the sample was centrifuged at 3000 × g, 4 ° C. for 30 minutes. The supernatant was collected and centrifuged at 45000 × g (19000 rpm rotor ss-34) at 4 ° C. for 1 hour. The supernatant is discarded and a solution of 50 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 1% NP-40 and protease inhibitors is added to the pellet and the lysate pellet is placed on ice for 1 hour.
[0392]
  HPLC Of membrane fraction by
[419.] The membrane fraction was purified using an RPC column (Pharmacia Type PLRP-S 300A). The buffers used are (A) 20 mM Tris pH 8.0 and (B) 60% propanol + DDW. The flow rate was 1 ml / min, but only 2 ml / min for the wash step. The entire procedure was performed at ambient temperature.
[0393]
[420.] Sample buffer (62 mM Tris pH 6.8, 10% glycerol, 3% SDS, diluted 1: 4 with buffer A) as the elution sample after immunoprecipitation (IP) of Jurkat or KG-1 membrane fraction. 720 mM mercaptoethanol) was added.
[0394]
[421.] The sample was sent to the column and the flow through was collected. The column was washed with buffer (A) until the flow absorbance dropped to zero.
[0395]
[422.] The proteins were eluted from the column according to the following program: 80% (A) for 5 minutes, then (A) 80-0%, (B) 20-100% gradient for 40 minutes. Next, a second gradient was applied to make the composition of the eluent 80% (A), and the column was washed five more times using this composition. The eluate was collected while being fractionated by 1 ml with a fraction collector.
[0396]
[423.] Samples were evaporated on a Speed-Vac evaporator and analyzed by SDS-PAGE and Western blot analysis.
[0397]
  Q Sepharose Purification of normal human plasma by column
[424.] 5 ml of normal human fresh frozen plasma was diluted 1:10 with start buffer and filtered through a 0.45 μm syringe filter (Sartorius, cat # 16555). The initiation buffer is 20 mM Tris-HCl containing protease inhibitors (5 μg / ml leupeptin, 5 μg / ml aprotinin and 1 mM PMSF).
[0398]
[425.] A 5 ml HiTrap Q Sepharose column (Amersham Pharmacia, cat # 17-1154-01) was attached to a P-1 peristaltic pump (Amersham Pharmacia). The column was washed at a flow rate of about 4 ml / min according to the manufacturer's protocol. The diluted filtered plasma was passed through the column and the flow through was collected. The column was washed with 20 volumes of 0.3 M NaCl / start buffer. The proteins were eluted with 0.6 M, 0.8 M and 1.0 M NaCl / start buffer. The eluent volumes were 50, 20 and 20 ml respectively. The entire procedure was performed at 4 ° C.
[0399]
[426.] The eluted fractions were subjected to two-dimensional SDS-PAGE followed by Western blot analysis using biotinylated Y1 and antibody 181 as a negative control. Fibrinogen γ 'was detected from the 0.6 M NaCl elution fraction. The 1.0 M NaCl elution fraction contained complement complex 4 (CC4), lumican, prothrombin and an interalpha inhibitor.
[0400]
  HPLC Purification of normal human plasma by column
[427.] Q Sepharose purified normal human plasma was mixed with the following materials to the final concentrations described: urea (final concentration 8 M or higher), DTT (final concentration 30 mM) and TFA (final concentration 0.1%) .
[0401]
[428.] The purified plasma solution was sent to a 3 ml RPC column (Amersham Pharmacia) and the flow through collected. The column was washed with buffer (A) until the flow absorbance dropped to zero. The proteins were eluted from the column according to the following program: 90% (A) for 5 minutes, then (A) 90-0%, (B) 10-100% gradient 40 minutes. Next, a second gradient was applied to make the composition of the eluent 90% (A), and the column was washed five more times using this composition. The buffers used are (A) 0.1% TFA / DDW and (B) 80% CAN and 0.1% TFA / DDW. The flow rate was 1 ml / min, but only 2 ml / min for the wash step.
[0402]
[429.] The eluate was collected in 1 ml fractions using a fraction collector. The entire procedure was performed at ambient temperature.
[0403]
[430.] Samples were evaporated on a Speed-Vac evaporator and analyzed by SDS-PAGE and Western blot analysis.
[0404]
  Unmarked CD 162 Indirect immunoblot with antibody
[0405]
  Y1 Western blot analysis of the receptor-post-blotting filter treatment
[431.] The nitrocellulose filter was blocked with 5% skimmed milk for 1 hour at room temperature. The filters were then washed three times with 0.05% Tween / PBS at room temperature for 5 minutes each. The filters were incubated with 5 μg / ml of Y1-biotin (or 181-biotin) in 2% skimmed milk / PBS for 1 hour at room temperature. The filters were then washed three times with cold 0.05% Tween 20 / PBS for 5 minutes each in the cold room (about 4-10 ° C.). The filters were then incubated in a cold room with a solution of SAV-HRP (streptavidin-HRP) diluted 1: 1000 in 2% skimmed milk + 0.05% Tween. The dilution was performed at room temperature (about 25 ° C.) and the diluted SAV-HRP was used after ice cooling for 10-15 minutes. The incubation was performed for 1 hour with gentle agitation. After incubation with SAV-HRP, the filters were washed as described above. The filters were then incubated with Super Signal mix (Pierce) for 5 minutes according to the manufacturer's protocol, then the excess was dried off. After exposing the filter to X-ray film (Fuji Photo Film), the film was developed.
[0406]
Example 7: Prokaryotic expression of recombinant glycocalicin
[432.] Glycocalicin (GC, amino acids 1 to 493 of GPIbα) was cloned into the IPTG inducible prokaryotic vector cassette. E. coli (BL21 DE3) cells containing this newly constructed plasmid were grown at 37 ° C. to an absorbance of 0.7-0.8 and then grown for 3 hours at 37 ° C. in the presence of IPTG for induction of expression.
[0407]
[433.] The SDS-polyacrylamide gel was analyzed after electrophoresis of semi-purified human platelet-derived glycocalicin (GC) or E. coli cell lysate (total) derived from expression-induced or non-induced cells. Biotinylated Y1-scFv, rabbit anti-human GC polyclonal antibody, commercial mouse anti-human CD42 monoclonal antibody (SZ2 Immunotech, PM640 Serotec, HIP1 Pharmigen, AN51 DAKO) and polyclonal antibody to the N-terminus of GPIbα (SC-7071, Santa Cruz) Western blot analysis was performed using
[0408]
[434.] The two polyclonal antibodies recognized both bacterial-derived recombinant glycocalicin and human platelet-derived native glycocalicin. Y1-scFv and the commercially available antibody recognized human-derived natural glycocalicin but not bacterial-derived recombinant platelet glycocalicin (FIG. 45).
[0409]
[435.] Prokaryotic (eg, E. coli) systems lack post-translational modification mechanisms, such as glycosylation and sulfation mechanisms. Therefore, the fact that Y1-scFv does not recognize glycocalicin produced by bacteria supports the conclusion that post-translational modifications such as glycosylation and sulfation are essential for binding of Y1-scFv to glycocalicin.
[0410]
  blood / Regarding bone marrow samples FACS Protocol
[436.] Samples are provided by the hospital. Patient sample 30 μl / tube. Add 5 μl / tube of CD33-APC (for AML) or CD19-APC (for B-CLL) or CD38-APC (for multiple myeloma). Add 5 μl / tube of CD45-PerCp and 5 μl of scFv-Y1 or control scFv-N31 or CD162-PE (KPL1). The tubes are incubated for 30 minutes at 4 ° C. with gentle shaking. Add 2 ml PBS, wash, and centrifuge at 1200 rpm for 5 minutes. Discard the supernatant.
[0411]
[437.] Proceed to the next lysis step for a one-step assay:
[0412]
[438.] ddH₂Add 500 μl BD lysine solution diluted 1:10 in O (300 μl to patient sample). Vortex at high speed and incubate at 4 ° C. for 12 minutes. Wash as above. Discard the supernatant and add 500 μl PBS. Read samples by FACS using a blood sample data collection setup according to international standards.
[0413]
[439.] For two or more assays: The working buffer is PBS + 1% BSA + 0.05% sodium azide. Incubation and washing are as described above.
[0414]
[440.] Lysis of red blood cells is the final step of this assay, and resuspend in 500 μl PBS.
[0415]
Example 8: Constructing a trial body
[441.] The vector pHEN-Y1 encoding the original Y1, V_L, V_HBoth regions were amplified by PCR individually targeted. V_LFor the PCR, sense strand oligonucleotide 5'-AACTCG AGTGAG CTGACA CAGGAC CCT and antisense strand oligonucleotide 5'-TTTGTC GACTCA TTTCTT TTTTGC GGCGCCC ACC were used. Product cDNA of expected size ̃350 bp was amplified, sequenced and digested with XhoI and NotI restriction enzymes.
[0416]
[442.] Follow the same procedure V_HThe region was amplified (using sense strand oligonucleotide 5 '-ATGAAA TACCTA TTGCCT ACGG and antisense strand oligonucleotide 5'-AACTCG AGACGG TGACCA GGGTAC C). V_HPCR products were digested with XhoI and NotI restriction enzymes. A triple ligation to the NcoI-NotI digested pHEN vector was performed. The final vector was named pTria-Y1.
[0417]
[443.] After transformation of E. coli, several clones were selected and further analysis confirmed DNA sequence, protein expression, extraction from the periplasmic space of bacteria, and the like. For confirmation of the size of the Y1 triabody, SDS-PAGE and Western blot analysis under reducing conditions were performed.
[0418]
Example 9: Construction of diabody
[444.] The pTria-Y1 vector from Example 8 was linearized with XhoI restriction enzyme and after preannealing two complementary synthetic oligonucleotides (5'-TCGAGA GGTGGA GGCGGT and 5'-TCGAAC CGCCTC CACCTC), It was ligated to the XhoI site between the heavy and light chains of Y1. This new vector was named pDia-Y1. DNA sequence and protein expression were confirmed as in the case of triabody.
[0419]
Example Ten: Expression and purification of diabody and triabody
[445.] Expression in E. coli was essentially the same as described for scFv-Y1. However, the purification of periplasmic derived Y1 diabodies and triabodies of transformed E. coli was different. The scFv-Y1 monomer form can be purified on an affinity column of protein A Sepharose beads. However, purification by this method is ineffective for multimeric Y1. Therefore, periplasmic proteins extracted from bacteria are precipitated overnight with 60% ammonium sulfate, and H₂Resuspend in O and load on a Sephacryl-200 (Pharmacia) size exclusion column pre-equilibrated with 0.1 × PBS. Fractions were collected and analyzed by HPLC, and separate fractions containing dimers or trimers were collected and subjected to FITC labeling and FACS analysis.
[0420]
Example 11: Y1 Binding of diabodies and triabodies to cells
[446.] FACS analysis of Jurkat cells was performed using "three-step staining". First, crude extract or purified unlabeled scFv, then mouse anti-myc antibody, and finally FITC- or PE-conjugated anti-mouse antibody were stained, respectively. For FACS analysis, 5-8 x 10 resuspended in PBS + 1% BSA^FiveIndividual cells are required. Binding was performed at 4 ° C. for 1 hour. The cells were washed after each step and resuspended in PBS + 1% BSA. After the final staining step, cells were fixed by resuspension in PBS, 1% BSA, 2% formamide, and then read by FACS (Becton-Dickinson).
[0421]
[447.] Y1-scFv binding was compared to diabody and triabody binding. The binding profiles of all three types of Y1 were very similar in this analysis. This implies that the Y1 modification as described above does not alter, mask or destroy the apparent binding affinity of Y1 to the ligand.
[0422]
Example 12: By radiation receptor measurement KG-1 To cells SS Y1 Of dimer affinity, CONY1 as well as Y1-IgG Comparative study with
[448.] In this measurement, chloramine T is used to construct the Y1-IgG construct or the Bolton-Hunter (CONY1) reagent.¹²⁵A radioligand prepared by iodination with I was used. 5 x 10 per 0.2 ml for measuring tubes⁶A mixture of individual KG-1 cells and labeled tracer + variable amount of unlabeled competitor in PBS + 0.1% BSA (pH 7.4) was added. After incubation for 1 hour at 4 ° C. with agitation, cells were washed thoroughly with cold buffer and sent for radioactivity measurement.
[0423]
[449.] 2 ng / tube for radioreceptor measurement (RRA)¹²⁵I-Y1-IgG was used to compete with each of the three molecules. The results are as shown in FIG. As the figure shows, the S-S Y1 dimer had lower (half) affinity than the majority of all Y1 antibodies and 30 times higher than CONY1. The affinity estimate for Y1-IgG in this experiment is 2 × 10^-8It is M. Thus, the affinity of the corresponding dimer is 4 × 10^-8It is M.
[0424]
[450.] In the second RRA using labeled CONY1, 100 ng / tube¹²⁵I-Y1-IgG was used to compete with each of the three molecules. The results are as shown in FIG. As shown in the figure, the SS dimer had a 20-fold higher affinity than CONY1. The affinity estimate of CONY1 is 10 in this experiment^-6It is M. Thus, the affinity of the corresponding dimer is 5 × 10^-8It is M.
[0425]
Example 13: Y1-cys-kak ( Cysteine dimer ) Production of
[451.] 1 liter of λpL-yl-cys-KAKThe cultures were induced at 42 ° C. for 2-3 hours. The culture was centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes. The pellet was resuspended in 180 ml TE (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM EDTA). 8 ml lysozyme (from 5 mg / ml stock) was added and incubated for 1 hour. 20 ml of 5 M NaCl and 25 ml of 25% Triton were added and incubated for an additional hour. The mixture was centrifuged at 13000 rpm at 4 ° C. for 60 minutes, and the supernatant was discarded. The pellet was resuspended in TE using a tissuemizer (or homogenizer). This procedure was repeated 3-4 times until the inclusion bodies (pellets) were gray / brown. Inclusion bodies were solubilized with 6 M guanidine HCl, 0.1 M Tris pH 7.4, 2 mM EDTA (1.5 g inclusion body / 10 ml solubilization buffer to obtain ~ 10 mg / ml solubilized protein). This was incubated for at least 4 hours. The protein was measured to a concentration of 10 mg / ml.DTTTo a final concentration of 65 mM and incubated overnight at room temperature. Regeneration of the protein was initiated by diluting 10 ml of protein dropwise to a solution containing 0.5 M arginine, 0.1 M Tris pH 8, 2 mM EDTA, 0.9 mM GSSG. The regeneration solution was incubated for 48 hours at -10 ° C. The regeneration solution containing the protein was dialyzed in a buffer containing 25 mM phosphate buffer pH 6 and 100 mM urea and concentrated to 500 ml. The dialyzed / concentrated solution was bound to an SP-Sepharose column and eluted with a gradient of NaCl (to 1 M).
[0426]
Example 14: Glycocalicin (GC) To ELISA
[452.] 100 ml of purified glycocalicin was incubated overnight at 4 ° C in a 96 well flat bottom MaxiSorp plate. The plates were washed 3 times with PBST (PBS + 0.05% Tween) and then 200 ml PBST-milk (PBST + 2% non-fat milk) was added over 1 hour at room temperature. The plates were washed with PBST and monomers or dimers (100 ml) were added to various concentrations of PBST-milk at room temperature for 1 hour. The plates are then washed and anti-V (diluted 1: 100 in PBST-milk)_LPolyclonal antibody (Y1 derived V_LWas added over 1 hour). The plates were washed and anti-rabbit HRP antibody was added for an additional hour. Wash plate 5 times, add 100 μl TMB substrate for about 15 minutes, then 100 μl 0.5 M H 2₂SO_FourThe reaction was stopped by adding. The absorbance of the plate at 450 nm was measured with an ELISA reader.
[0427]
Example 15: Recombinant glycocalicin (GC) of E. coli Expression by
[0428]
[453.] Post-translational modifications such as glycosylation and sulfation are essential for the binding of scFv and commercially available antibodies to GC. Prokaryotic (E. coli) systems lack post-translational modification mechanisms such as glycosylation and sulfation.
[0429]
Example 15: Y1 Tetramer production
[454.] The construct in which the sequence LNDIFEAQKIEWHE was added by PCR to the C-terminus of Y1 was digested and cloned into the IPTG inducible expression vector cassette. This clone was named Y1-Biotag. This sequence is a substrate for the enzyme BirA, which is capable of covalently attaching biotin to lysine (K) residues in the presence of free biotin (Altman JD et a., “Expression of antigen-specific T lymphocytes” Type analysis "Phenotyic analysis of antigen-specific T. lymphocyte. Science, 1996 Oct 4, 274 (5284): 94-6). This construct was produced as inclusion bodies in BL21 bacterial cells. Regeneration of the protein was performed as described above. Inclusion body as guanidine-DTTSolubilized with Regeneration was performed by dilution with a buffer containing arginine-tris-EDTA. After dialysis and concentration, it was purified by HiTrap Q ion exchange column.
[0430]
[455.] Purified Y1-biotag scFv were incubated with BirA enzyme (purchased from Avidity) and biotin according to the manufacturer's advice. Analysis of the biotinylated Y1-biotag in the HABA test (which estimates the amount of biotin per molecule) revealed the presence of approximately> 0.8 biotin residues / molecule.
[0431]
[456.] Biotinylated Y1-biotag was incubated with streptavidin-PE (phycoerythrin) to form a complex, and was also used for FACS experiments with (Y1-positive) KG-1 cells. Binding sensitivity was increased by at least 100 fold with increased avidity. Four biotinylated Y1-biotag molecules can be formed from streptavidin.
[0432]
[457.] The sequence of Y1-biotag (SEQ ID NO: 211) is:
1 MEVQLVESGG GVVRPGGSLR LSCAASGFTF DDYGMSWVRQ
41 APGKGLEWVS GINWNGGSTG YADSVKGRFT ISRDNAKNSL
81 YLQMNSLRAE DTAVYYCARM RAPVIWGQGT LVTVSRGGGG
121 SGGGGSGGGG SSELT QDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY
161 YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA
201 SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNNVVFG GGTKLTVLGG
241 GGLNDIFEAQ KIEWHE
[0433]
Example 16: Y17 Analysis of activity
[458.] We tried to evaluate the binding specificity of Y17 to GPIbα using O-sialoglycoprotein endoprotease, an enzyme derived from Pastoral haemolytica that selectively cleaves human platelet GPIb. The O-sialoglycoprotein endoprotease specifically cleaves only proteins containing sialylated O-linked glycans and does not cleave N-linked glycoproteins or non-glycosylated proteins. This enzyme is reported to cleave highly O-glycosylated GPIb but not GPIIb-IIIa and other receptors on the platelet surface. As shown by immunoblot analysis and FACS analysis, incubation of the GPIb-cleaved O-sialoglycoprotein endoprotease with washed platelets results in the loss of both Y17 and GPIbα monoclonal antibodies (MCA466S, Serotec) from binding . These endoproteases did not alter the binding ability of the (anti-CD61) monoclonal antibody to GPIIb / IIIa (FIG. 4).
[0434]
Example 17: platelet GPIb upper Y17 Epitope identification
[459.] An interesting approach to the identification of Y17 epitopes on platelet GPIb uses endoprotease enzymes whose cleavage site on platelet GPIb is well understood.
[0435]
17.1: Y1 Effect of mokaragin on epitope mapping
[460.] The cobra venom metalloproteinase mokaragin cleaves platelet GPIbα specifically at a single site between residues glu-282 and asp-283 and is detected in two stable products, the supernatant A 45 kDa N-terminal fragment (His-1 to Glu-282) and a membrane-bound 100 kDa C-terminal fragment are generated.
[0436]
[461.] Washed platelets were treated with mokaragin, and platelet lysates were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose. Western blot analysis of mokaragin-treated washed platelets by Y1 revealed that the band corresponding to GPIb (135 kDa) disappeared and that Y-17 was bound to the N-terminal 45 kDa tryptic fragment. Monoclonal antibody MCA466S to the C-terminal fragment of GPIbα reacts with the C-terminal 100 kDa fragment while monoclonal antibody SC7071 which recognizes the N-terminus of GPIbα reacted with the same N-terminal 45 kDa fragment that Y1 recognized (Figure 14).
[0437]
[462.] Mogalagin treatment of glycocalicin produces results similar to those observed with washed platelets, but indicates that Y1 and monoclonal antibody SC7071 bind to the N-terminal 45 kDa truncated fragment of GPIbα (Figure 8). . These results suggest that the epitope corresponding to Y17 is contained within the sequence His-1 to Glu-282.
[0438]
17.2: Y17 Cathepsin to epitope mapping G Effect of
[463.] The neutrophil serine protease cathepsin G cleaved glycocalicin at two sites between residues Leu-275 and Tyr-276 and between residues Val-296 and Lys-297. Treatment of glycocalicin with cathepsin G generates two N-terminal fragments, the smaller 42 kDa fragment (His1 to Leu275) and the larger 45 kDa fragment (His1 to Val296), and one C-terminal to 95 kDa fragment. Glycocalicin and the glycocalicin fragment generated by cathepsin G digestion were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose. Y17 bound to the larger fragment (His1 to Val296) but not to the smaller fragment (His1 to Leu275). In addition, monoclonal antibody S.C. 7071, which recognizes an epitope within His1-Leu275, blotted both fragments (FIG. 12). The analysis results of the N-terminally digested fragment by mokaragin and cathepsin G suggest that the amino acid sequence Tyr276 to Glu282 of GPIbα is an important recognition motif for Y17 binding.
[0439]
Example 18: vWF Dependent aggregation reaction Y17-scFv Effect of
[464.] The effect of Y17-scFv on vWF-dependent platelet aggregation was tested at various Y17 concentrations. In contrast to Y1, Y17 did not inhibit ristocetin-induced vWF-dependent washed platelet aggregation at final concentrations of 10, 25 or 50 μg / ml. The analysis results of the N-terminally digested fragment by mokaragin and cathepsin G suggest that the amino acid sequence Tyr276 to Glu282 of GPIbα is an important recognition motif for Y17 and Y1 binding. Since Y17 does not inhibit platelet aggregation, it appears that Y1 and Y17 bind to overlapping but not to the same sequence.
Brief Description of the Drawings
[Fig. 1]
  [121.] Figure 1 shows cleavage sites by endoproteases on the alpha chain of GPIb.
[Fig. 2]
  [122.] Figure 2 is the result of Western blot analysis showing binding of Y1 and Y17 to platelets under reducing and non-reducing conditions.
[Fig. 3]
  [123.] Figure 3platelet GC With various preparations of KG-1 Membrane fraction of cells Four With Y1 Schematic of the reactivity of Ru.
[Fig. 4]
  [124.] Figure 4 shows the results of Western blot analysis showing that cleavage of platelet GPIb with O-sialoglycoprotein endoprotease results in the loss of both Y1 and Y17.
[Fig. 5]
  [125.] Figure 5 is the result of Western blot analysis showing that Y1 and Y17 bind to similar glycocalicin fragments after cleavage by O-sialoglycoprotein endoprotease.
[Fig. 6]
  [126.] Figure 6 shows the results of FACS analysis showing that Y1 does not bind to platelets due to specific proteolysis of GPIb.
[Fig. 7]
  [127.] FIG. 7 shows the results of Western blot analysis showing binding of Y1 to the N-terminal fragment of platelet GPIbα (His1-Glu282) after mokaragin cleavage.
[Fig. 8]
  [128.] FIG. 8 shows the results of Western blot analysis showing binding of Y1 and Y17 to glycocalicin after mokaragin cleavage.
[Fig. 9]
  [129.] Figure 9 shows the results of Western blot analysis showing binding of Y1 and Y17 to platelets.
[Fig. 10]
  [130.] FIG. 10 shows the results of Western blot analysis showing that Y1 and Y17 bind similarly to glycocalicin after Ficin degradation.
[Fig. 11]
  [131.] Figure 11 is the result of Western blot analysis showing that Y1 reacts with the larger fragment generated by cathepsin G cleavage of GPIbaα.
[Fig. 12]
  [132.] Figure 12 shows the results of Western blot analysis showing that Y1 and Y17 react with the larger fragment generated by cathepsin G cleavage of GPIbaα.
[Fig. 13]
  [133.] FIG. 13 shows the results of Western blot analysis showing that cleavage of glycocalicin with mokaragin and cathepsin G results in loss of binding of Y1.
[Fig. 14]
  [134.] Figure 14 shows the results of Western blot analysis showing binding of Y1 and Y17 to washed platelet lysates cleaved with mokaragin and cathepsin G.
[Fig. 15]
  [135.] Figure 15 is a graph showing Y1-scFv inhibition of the agglutination reaction of washed platelets.
[Fig. 16]
  [136.] FIG. 16 is a graph showing Y1-scFv inhibition of platelet aggregation in platelet-rich plasma.
[Fig. 17]
  [137.] Figure 17 is a graph showing Y1-IgG induction of the agglutination of washed platelets.
[Fig. 18]
  [138.] FIG. 18 is a graph showing Y1-IgG induction of platelet aggregation in platelet-rich plasma.
[Fig. 19]
  [139.] Figure 19 shows the results of ELISA.
[Fig. 20]
  [140.] Figure 20 shows the results of Western blot analysis showing the specificity of the binding of Y1 and α-CD42 (N1-19) to their respective ligands.
[Fig. 21]
  [141.] Figure 21 shows the results of Western blot analysis showing the reactivity of Y1 with Y1-ligand on KG-1 cell membranes purified using immunoprecipitation and RP-HPLC.
[Fig. 22]
  [142.] Figure 22 shows the results of Western blot analysis showing the effect of O-sialoglycoprotein endoprotease cleavage on Y1 binding.
[Fig. 23]
  [143.] Figure 23 shows the results of Western blot analysis showing the effect of arylsulfatase cleavage on RP-HPLC purified KG-1 cell lysates and Y1 binding to heparin-BSA.
[Fig. 24]
  [144.] FIG. 24 is an outline of the immunoprecipitation method used to analyze the specificity of Y1 bindingRu.
[Fig. 25]
   [145.] Figure 25 shows the results of Western blot analysis comparing the binding of Y1 and anti-CD162 antibodies to AML patient-derived cells and normal blood-derived cells.
[FIG. 26]
  [146.] FIG. 26 shows the results of FACS analysis showing the competitive binding ability of antibodies KPL1, PL1 and PL2 to Y1.
[Fig. 27]
  [147.] Figure 27 shows the results of FACS analysis showing the specificity of Y1 binding.
[Fig. 28]
  [148.] FIG. 28 is also the result of FACS analysis showing the specificity of Y1 binding.
[Fig. 29]
  [149.] FIG. 29 is a graph showing the Y1 binding inhibition rate in the presence of various peptides.
[FIG. 30]
  [150.] Figure 30 is a graph showing liver weights of mice in different treatment groups.
[FIG. 31]
  [151.] Figure 31 is a graph showing the percentage of MOLT cells in the bone marrow of mice in different treatment groups.
[Fig. 32]
  [152.] Figure 32 is a graph showing the blood MOLT cell rate of mice in different treatment groups.
[Fig. 33]
  [153.] Figure 33 shows, Y1 With aryl sulfatase for binding Mocarhagin The effect of tearing Figure 2 represents the Western blot shown.
[Fig. 34]
  [154.] Figure 34 is a graph showing the mouse liver weight (mean ± SEM) on day 35.
[Fig. 35]
  [155.] Figure 35 is a graph showing the survival effects of treatment.
[Fig. 36]
  [156.] Figure 36 is a graph showing the incidence of leukemia in different treatment groups.
[Fig. 37]
  [157.] FIG. 37 is a graph showing the blood KG-1 cell rate in different treatment groups.
[Fig. 38]
  [158.] FIG. 38 is a graph showing the percentage of KG-1 cells in the bone marrow of experimental animals.
[Fig. 39]
  [159.] Figure 39 shows the mouse¹²⁵It is a graph which shows the pharmacokinetics of TCA precipitation activity in plasma after I-CONY1 intravenous injection. The sequence of CONY1 is shown as SEQ ID NO: 204.
[Fig. 40]
  [160.] Figure 40 shows the mouse¹²⁵It is a graph which shows the specific activity of various organs / tissues after I-CONY1 intravenous injection.
[FIG. 41]
  [161.] Figure 41 shows the mouse¹²⁵It is a graph which shows the radiation distribution of various organs / tissue after I-CONY1 intravenous injection.
[Fig. 42]
  [162.] Figure 42 is a Superdex 75 column elution profile of Y1-cys-kak.
[FIG. 43]
  [163.] Figure 43 is a size comparison of monomer and dimer under reducing, non-reducing conditions.
[Fig. 44]
  [164.] FIG. 44 shows the results of FACS analysis showing comparison of the binding level of IgG-Y1 molecule and scFv-Y1.
[Fig. 45]
  [165.] FIG. 45 shows the results of Western blot analysis showing the binding levels of Y1 and other antibodies to native human platelet-derived glycocalicin and E. coli-produced recombinant glycocalicin.
[Fig. 46]
  [166.] Figure 46 is a binding comparison of the Y1 monomer, Y1 scFv (CONY1) and Y1 IgG.
[Fig. 47]
  [167.] Figure 47 is a binding comparison of the Y1 disulfide bond dimer and the Y1 scFv (CONY1).
[Fig. 48]
  [168.] Figure 48 is the amino acid / nucleotide sequence of heavy chain (HC) and light chain (LC) of Y1-IgG. Open reading frame (ORF) of nucleotide sequence of Y1-HC (SEQ ID NO: 205), amino acid sequence of Y1-HC (SEQ ID NO: 206), ORF of nucleotide sequence of Y1-LC (SEQ ID NO: 207) And the amino acid sequence of Y1-LC (SEQ ID NO: 208).
[Fig. 49]
  [169.] Figure 49 is the amino acid sequence of TM1 (SEQ ID NO: 209).
[FIG. 50]
  [170.] Figure 50 is the amino acid / nucleotide sequence (SEQ ID NO: 210) of Y16 scFv.
[FIG. 51]
  [171.] Figure 51 is the amino acid sequence of Y1 Biotag (SEQ ID NO: 211).
[Fig. 52]
  [172.] Figure 52 showsY1-cys-KAK Amino acid sequence of scFv (SEQ ID NO: 212).