JP2005501047A - ペプチド又はペプチド模倣物質と結合したatp模倣物質を含むプロテインキナーゼ阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、ペプチド又はペプチド模倣物質と結合したATP模倣物質、特にイソキノリン誘導体、そのイソキノリン誘導体及び結合体を含む薬剤組成物、プロテインキナーゼの阻害剤としてのそれらの使用、並びにこうした分子の調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロテインキナーゼは、正常な状態下においても病的な状態下においても、増殖因子、ホルモン及び他の細胞調節分子を、細胞の増殖、生存及び代謝に関連付けるシグナル伝達経路に関与している。プロテインキナーゼのスーパーファミリーには、プロテインキナーゼA及びプロテインキナーゼC、並びについ最近発見されたプロテインキナーゼB(PKB)がある。
【0003】
PKBは、ヒト悪性腫瘍中でその活性が激しく高い、新しく確認された抗アポトーシスプロテインキナーゼである。PKBは最初に、ラットT細胞白血病中のウィルスの癌遺伝子v−Aktとして発見された。後に、v−Aktは、切断されたウィルスグループ特異抗原、gagが完全長Akt−1にフレームを合わせて融合している、細胞酵素PKB/c−Aktの癌遺伝子変種であり、膜結合型であるが、PKB/c−Aktは細胞質型であることが証明された。Aktの配列決定により、PKA(〜75%)及びPKCアイソザイム(〜50%)に対する高度な相同性が明らかになり、このことからPKBへの名称変更に至った。
【0004】
PKB活性化には、2つのアミノ酸残基、Ser473及びThr308のリン酸化を要する。この酵素は、PI’−3−キナーゼによって生成される二次メッセンジャーPIP3により活性化される。PIP3は、PKBのプレクストリン相同(PH)ドメインに結合し、PKBを膜に補充し、そこでPKBはリン酸化され、その活性型に変換される。PKB活性化はPI’−3−キナーゼ依存性なので、IGF−1受容体、EGF受容体、PDGF受容体、pp60c−Srcなどのある種のプロテインチロシンキナーゼの持続的活性化により、多くの腫瘍で実際に生じるPKBの持続的活性化がもたらされる。癌抑制遺伝子PTENをコードする遺伝子に欠失があると、PKB/c−Aktの持続的活性化も誘導される。というのは、PTENがこの酵素の負の調節遺伝子であるからである。又、PKBは卵巣癌の15%、膵臓癌の12%及び乳癌の3%で過剰発現され、アポトーシスから細胞を保護し、したがって化学療法への耐性に寄与する生存シグナルを生成することが示された。
【0005】
PKBは、アポトーシス、増殖、分化及び代謝を含む広く多岐にわたる細胞プロセスの重要な調節因子として明らかになった。今や正常なPKB/Aktシグナル伝達の破壊は様々なヒト癌における高頻度の出来事として記載されており、この酵素がそれらの進行に重要な役割を演じるように思われる(Nicholson及びAnderson、Cellular Signalling 14、381、2002)。したがって、PKBは、基本的には、癌の治療に関する魅力的な薬物標的である。理想的には、PKBを阻害する薬物は、細胞周期の停止とアポトーシスの促進のどちらも引き起こすべきである。このような活性の結果、PKBが高い腫瘍組織の細胞死が増大し、化学療法剤への耐性が低減するはずである。
【0006】
PKBのこれらの分子特性及び腫瘍形成におけるその主要な役割から、このプロテインキナーゼが新規な抗癌剤の魅力的な標的であり得ることが示唆される。これまで、当技術分野でPKBの特異的な阻害剤は知られておらず、又開示されているプロテインキナーゼA及びCの阻害剤のいずれもPKBに作用することは知られていない。
【0007】
Hidaka H.ら(Biochemistry、32、5036、1984)は、環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼ(PKA及びPKG)及びプロテインキナーゼC(PKC)に対する阻害活性を有する、あるクラスのイソキノリンスルホンアミドについて記載している。同一クラスの化合物が欧州特許第061673号に特許請求されており、そこでは前記化合物を心血管活性を有するものとして開示している。イソキノリンスルホニルの別の誘導体が、Hidakaによって欧州特許第109023号、米国特許第4456757号、第4525589号、及び第4560755号に開示されている。
【0008】
抗腫瘍活性が、これらのイソキノリンスルホンアミドのあるものについて示唆されている。Martell R.E.ら(Biochem.Pharm.、37、635、1988)は、それぞれPKC及び環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼに対してある種の選択性がある2種のイソキノリンスルホンアミド、すなわち1−(5−イソキノリンスルホニル)−2−メチルピペラジン(H−7)及びN−[2−グアニジノエチル]−5−イソキノリンスルホンアミド(HA−1004)のカルシトリオール誘発性細胞分化に対する作用を発見した。さらに、Nishikawa M.ら(Life Sci.、39、1101、1986)は、同一の化合物H−7が、ホルボールジエステルによって誘発された細胞分化を阻害することを実証している。
【0009】
国際PCT出願公開WO93/13072は、5−イソキノリンスルホンアミド誘導体をプロテインキナーゼ阻害剤として開示している。その中で特許請求されている化合物はすべて2種のスルホニル基を含む。
【0010】
従来技術(欧州特許EP−A−397060、ドイツ特許DE−A−3914764及び欧州特許EP−A−384349)で周知の他のクラスの化合物はプロテインキナーゼを阻害する能力を示したが、前記化合物は、本発明の化合物のものと完全に異なる化学構造を有する。さらに、国際PCT出願公開WO98/53050は、セリン/スレオニンキナーゼの活性を調節するセリン/スレオニンキナーゼのHJループから誘導された短いペプチドについて開示している。
【0011】
PKBによる効率的なリン酸化のための最小コンセンサス配列がAlessiら(Fed.Eur.Biochem.Soc.、399、333、1996)によって発見された。これは、配列Arg−Pro−Arg−Thr−Ser−Ser−Pheを有する最も活性なペプチド基質を含む7量体モチーフである。国際出願公開WO97/22360は、PKB活性を測定するための基質として有用な、7アミノ酸長のある種のPKB基質ペプチドについて開示している。
【0012】
Obataら(J.Biol.Chem.、17、36108、2000)は、PKB基質の最適なアミノ酸配列を決定するための配向ペプチドライブラリ手法の使用について記載している。同定されたすべての基質には、配列Arg−Xaa−Arg−Xaa−Saa−Ser/Thrを有する既知のモチーフが含まれていた。
【0013】
Ricouartら(J.Med.Chem.1991、34、73〜78)は、PKAを阻害するイソキノリンスルホンアミドとペプチドの結合体について記載している。Loogら(Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 1999、9、1447〜1452)は、PKA及びPKCを阻害する、アデノシン及びペプチドを含むキメラについて記載している。この開示された化合物で得られる阻害作用は非常に弱い。Schlitzerら(Bioorganic and Medicinal Chemistry、2000、1991〜2006)は、基質のペプチド部分を置換すると想定される非ペプチド系長鎖基に連結した小分子を扱っている。この開示された化合物は、弱い阻害活性を示す。
【0014】
Parangら(Nature Structural Biology 8、37、2001)は、ATPがプロテインキナーゼペプチド基質に連結した、プロテインキナーゼA阻害剤のペプチド−ATP二基質類似体について記載している。それにもかかわらず、この手法には、薬物動態学的特性が最適でないという制限がある。WO01/70770は、インシュリン受容体チロシンキナーゼの二基質阻害剤、及び2個の炭素スペーサーを介してペプチド基質類似体に連結したATP−γ−Sを含む特異的な強力で選択的な阻害剤について開示している。
【0015】
背景技術及び本発明者らの1人による同時係属の国際特許出願公開WO01/91754における多くの開示は、PKB阻害剤である特異的なイソキノリン誘導体に関するものである。本発明は、新規なイソキノリン誘導体、より具体的にはイソキノリン結合体を対象としており、PKBを阻害するそれらの能力に関してすでに特許請求されているすべての既知の化合物を除外している。
【0016】
本発明は、タンパク質標的特異性をもつATP代用物及びペプチド模倣物質を生成することにより、既知の阻害剤の制限を克服している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0017】
医療、治療及び薬物設計用のプロテインキナーゼの特異的な阻害剤を提供することが、本発明の目的である。プロテインキナーゼBの選択的な阻害剤であるこのような分子を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【0018】
本発明の一態様は、プロテインキナーゼの活性を阻害する新規な化合物の調製を含む。プロテインキナーゼ阻害剤であるイソキノリンスルホンアミドのある種の新規な誘導体は、ペプチド又はペプチド模倣物質と結合すると、予想外に、特定のタイプのプロテインキナーゼ、すなわちプロテインキナーゼBに対して活性であることが今回判明した。
【0019】
本発明は、PKBの基質を模倣するペプチド又はペプチド模倣基と結合している、PKBのATP結合部位と高い親和性がある小分子を提供する。これらの化合物は、本明細書で「キメラ」化合物と称されている。本発明によるキメラ化合物は、改善された活性及び選択性をもつPKB阻害剤として働くことが好ましい。
【0020】
本発明の別の態様は、有効成分としてプロテインキナーゼの新規な阻害剤を含む薬剤組成物並びにプロテインキナーゼのこれらの新規な阻害剤を含む薬剤組成物の調製方法及び使用を対象とする。
【0021】
本発明の別の態様は、疾患及び障害の治療又は診断に有用な医薬品を製造するためのこれらのプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物の使用を対象とする。本発明は、癌、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患を含むがそれだけには限定されない、プロテインキナーゼに関与する障害の治療方法について開示する。
【0022】
本発明はさらに、治療有効量のプロテインキナーゼ阻害剤を投与することを含む、被験体中のプロテインキナーゼ活性を調節する方法を提供する。
【0023】
本発明のさらなる態様は、本発明の化合物を用いたin−vitro診断、及び本発明の原理によって調製した診断上有用な量のプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物を投与することを含むin−vivo診断を含めた疾患の診断方法を対象とする。
【0024】
改善された安定性及び細胞透過性を有するペプチド模倣化合物を含むプロテインキナーゼ阻害剤を提供することが、本発明のさらに別の目的である。こうした化合物の非限定的な例には、選択したペプチド残基のN−アルキル化、選択したペプチド残基、非天然アミノ酸の副鎖修飾、ペプチド結合置換のためのカルバメート、尿素、スルホンアミド及びヒドラジンの使用、並びにペプチド又は非ペプチド結合による、ピペリジン、ピペラジン及びピロリジンを含むがそれだけには限定されない非ペプチド基の取り込みが含まれる。これらのペプチド模倣化合物は、本発明に基づき、キメラ化合物のペプチド基質部分として使用することができる。さらに、これらのペプチド模倣化合物は、それ自体プロテインキナーゼ阻害剤として使用することができる。
【0025】
本発明による好ましい実施形態は、スペーサーによって連結されたATP模倣基とペプチド基質模倣基のどちらも含むキメラ化合物を含む。
【0026】
ATP模倣コアは、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンを含むがそれだけには限定されない。スペーサーは、様々な長さ及びアミン、アミド、チオエーテル、オキシエーテル、スルホンアミド結合などを含むがそれだけには限定されない任意の適当な化学構造からなる。こうしたスペーサーの非限定的な例には、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体がある。ペプチド基は、ペプチド又はペプチド模倣物質を含む。こうした阻害性ペプチドは、PKB基質として働くことができる任意のペプチドに基づいて設計される。
【0027】
本発明のより好ましい実施形態は、式I
【化1】
(式中、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、置換した又は非置換のフェニル基、フェニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、シアノ、又はアミノ基からなる群から選択される少なくとも1種の置換基で置換された低級アルキルからなる群から選択され、
m及びnは、それぞれ独立に0〜3であり、
Xは、SO2−NH、S及びOからなる群から選択され、
Mは、1〜4個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yは、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Wは、存在せず、あるいは1〜18個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lは、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Zは、PKBの基質部位に結合可能な長さの4〜12残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である)
の化合物を含む。
【0028】
好ましくは、R1及びR2は、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
m及びnは、それぞれ1であり、
Xは、SO2−NH及びSからなる群から選択され、
Mは、2個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yは、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Wは、存在せず、あるいは1〜5個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lは、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、
Zは、PKBの基質部位に結合可能な長さの6〜10残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である。
【0029】
現在のある種のより好ましい実施形態によれば、式IでZとして表されるペプチド基質模倣物質は、本明細書でAA1〜AA7と称される7種の残基の配列を含む。それぞれのAAは、配列に組み込まれて改善された薬理学的特性をもつペプチド模倣基を形成するアミノ酸、アミノ酸類似体、あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択される。
【0030】
AA1及びAA3は、それぞれ独立に、アルギニン又はアルギニン類似体、リジン又はリジン類似体、オルニチン又はオルニチン類似体、あるいはアミン、グアニジン又はアミジン、ホモアルギニン、アルギニノールなど生理的pHで正に帯電した基を含む脂肪族、芳香族、又は複素環基からなる群から選択される。
【0031】
AA2は、プロリン、プロリン類似体あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基、ヒドロキシプロリン、ニペコ酸、アラニン、アミノ酪酸からなる群から選択される。
【0032】
AA4、AA5、AA6は、それぞれ独立に、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、オルニチン、GlyNH2、Tyr又はTyr類似体、Thr又はThr類似体、Ser又はSer類似体、Ala又はAla類似体、Glu又はGlu類似体、Gly又はGly類似体、アルキル、ベンジル、ヒドロキシ、フェノキシアルコキシ、スルホン、スルホキシド、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、アミド又はカルバモイル官能基、アミノ酪酸、シトルリン、セリノール、ホスホチロシン及びホスホチロシンジメチルエステルを含む脂肪族、芳香族又は複素環残基からなる群から選択される。
【0033】
AA7は、Phe又はPhe類似体、Trp又は類似体、Tyr又は類似体、Leu又は類似体、ホモロイシン又は類似体、Ile又は類似体、アミノ酸の芳香族基エステル又は芳香族置換基、芳香族、複素環基又は分枝状脂肪族基、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン、グルタミン酸ベンジルエステル、ナフチルアラニンからなる群から選択される。
【0034】
本発明による好ましい実施形態はペプチド模倣の性質をもつため、AA間の結合は、アミド、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミド結合からなる群から選択することができる。現在のより好ましい実施形態では、特に明記しない限り、AA間の結合はすべてアミド結合である。
【0035】
本発明の別の好ましい実施形態は、式IIa〜IId
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
[式中、
R4、R5、及びR6は、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、GlyNH2、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のNα−ω−官能化誘導体であり、
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wは、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、
Lは、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される]
の化合物を含む。式IIbに記載のように、WはR5に連結していることが好ましい。
【0036】
本発明の現在最も好ましい実施形態は、式III〜VIIのキメラ化合物である。
【0037】
【化6】
【0038】
【化7】
【0039】
【化8】
【0040】
【化9】
【0041】
【化10】
【0042】
以下のものから選択される配列を有する化合物が現在最も好ましい。
【0043】
プロテインキナーゼ阻害剤の、従来技術で周知の又は考えられる本質的にすべての用途は、本発明の分子を用いて達成することができる。これらの用途には、治療及び診断技術が含まれる。
【0044】
例示として、プロテインキナーゼBを阻害するために本発明で開示した化合物を選択した。本明細書で開示した調製物及び方法を用いることにより、他のタイプのプロテインキナーゼの活性を阻害する化合物を得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0045】
本発明によるキメラ化合物が、プロテインキナーゼの阻害剤であることを今回開示した。ある種の構造モチーフが共通する小分子が「ATP模倣」阻害剤として働くことができることが知られている。こうした基が、本発明によるプロテインキナーゼ、特にPKBの強力な阻害剤である基質模倣基も含むキメラ化合物の一部であり得ることを今回発見した。
【0046】
開示したプロテインキナーゼ阻害剤は、ある種のプロテインキナーゼサブタイプに対して高い親和性を示すキメラ分子である。基本的には、本発明はプロテインキナーゼBの極めて活性な(ナノモル範囲において)阻害剤を初めて提供する。好ましい分子の分子量は、一般に約1100ダルトン未満である。背景技術に勝る上記及びさらなる利点は、本発明の現在好ましい実施形態の詳細から明らかになるであろう。
【0047】
本発明による好ましい化合物は、PKBの基質を模倣するペプチド又はペプチド模倣基と結合している、PKBのATP結合部位と高い親和性を有する小分子から構成される。本発明によるキメラ化合物は、改善された活性及び選択性をもつPKB阻害剤として働くことが好ましい。
【0048】
本発明による組成物の効用は、当技術分野でよく知られている様々な検定を用いて証明することができる。本発明の好ましい化合物は、プロテインキナーゼの活性阻害及び癌細胞のアポトーシスの誘発に関して、in−vitro検定のパネルで活性であることが判明した。
【0049】
薬理学的に活性なプロテインキナーゼ阻害剤及び薬剤として許容される担体又は希釈剤を含む本発明による薬剤組成物は、本発明の別の実施形態を表し、有効量の本発明によるプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物を用いて、治療を必要とする哺乳動物を治療する方法も同様である。本発明の組成物を用いた治療方法は、こうした組成物を用いた癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患の治療に有用である。
【0050】
本発明による薬剤組成物は、乳癌(Perez−Tenorio及びStal、Br.J.cancer 2002 86、540〜45、Salhら、Int.J.cancer 2002 98、148〜54)、卵巣癌(Liuら、cancer res.1998 15、2973〜7)、前立腺癌(Zinら、Clin.cancer.res.2001 7、2475〜9)、大腸癌(Sembaら、clin.cancer.res.2002 8、1957〜63)、黒色腫及び皮膚癌(Walderman、Wecker及びDiechmann、Melanoma res.2002 12、45〜50)、肺癌(Zinら、Clin.cancer.res.2001 7、2475〜9)、並びに肝臓癌(Fangら、Eur.J.Biochem.2001 268、4513〜9)の群から選択される悪性腫瘍の予防及び治療に使用することが最も好ましいかもしれない。
【0051】
本発明による薬剤組成物は、少なくとも1種のプロテインキナーゼ阻害剤を含むと有利である。これらの薬剤組成物は、局所又は全身を含めて、どんな適当な投与経路によっても投与することができる。好ましい投与モードは、静脈内及び筋肉内注射などの非経口経路、並びに経鼻又は経口摂取による経路を含むがそれだけには限定されない。
【0052】
当業者に周知のように、薬剤組成物は、治療すべき症状に対して、そのもの単独で又は追加の治療薬と併用して投与することができる。
【0053】
用語及び定義
本明細書及び特許請求の範囲において、「プロテインキナーゼ」という用語は、上記の1種又は複数のタンパク質をリン酸化させるように機能する酵素スーパーファミリーのメンバーを意味する。
【0054】
本明細書及び特許請求の範囲では、「阻害剤」という用語は、「拮抗薬」を意味するものとして同義で用いられ、これらの用語は、ある種の酵素活性を低減させる能力、あるいは前記酵素基質の活性又は機能と競合する能力を有する組成物を定義している。
【0055】
本明細書及び特許請求の範囲では、「キメラ化合物」又は「キメラ分子」という用語は、PKB基質模倣部分と結合したATP模倣基を意味する。こうしたキメラ化合物又は結合体の例は、PKB基質模倣物質であるペプチド又はペプチド模倣基と結合した、PKBのATP分子を模倣する小分子(及びより特異的なイソキノリン誘導体)である。これらの分子は、好ましくは、改善された活性及び選択性をもつPKB阻害剤として働くことができる。
【0056】
本明細書では、「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸配列を示す。本発明のペプチド類似体は、3〜15アミノ酸残基、好ましくは4〜12残基、より好ましくは5〜10アミノ酸の配列を含み、それぞれの残基は、アミノ末端及びカルボキシ末端を有することを特徴とする。
【0057】
「ペプチド模倣物質」という用語は、本発明によるペプチドが、少なくとも1種の非コード残基又は非ペプチド結合を含むように改変されていることを意味する。このような改変には、例えば、1種又は複数の残基のアルキル化及びより特異的なメチル化、非天然アミノ酸の挿入又は非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換、アミド結合の他の共有結合との置換がある。本発明によるペプチド模倣物質は、任意選択で少なくとも1種の結合を含むことができ、それは、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合などのアミド置換結合、又は任意の他の共有結合である。適切な「ペプチド模倣物質」の設計は、コンピューターで支援することができる。
【0058】
「ペプチド類似体」という用語は、1種又は複数のアミノ酸変更あるいはアミド結合の1種又は複数の改変/置換を施したものを除き、本発明によるアミノ酸配列を有する分子を示す。
【0059】
本明細書及び特許請求の範囲では、「治療有効量」という用語は、宿主に投与して、それだけには限らないが、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患など本明細書に記載の適応症に対して望ましい結果が得られるのと同じ量を含む、プロテインキナーゼ阻害剤又は組成物の量を意味する。
【0060】
本発明並びにその製造及び使用方法を説明するために、本明細書ではいくつかの略語を使用している。例えば、ATPはアデノシン三リン酸を意味し、BSAはウシ血清アルブミンを意味し、BTCはビス−(トリクロロメチル)カーボネート又はトリホスゲンを意味し、DCMはジクロロメタンを意味し、DIEAはジイソプロピル−エチルアミンを意味し、DMFはジメチルホルムアミドを意味し、EDTはエタンジチオールを意味し、EDTAはエチレンジアミン四酢酸を意味し、ELISAは酵素結合免疫吸着検定法を意味し、EGFは上皮成長因子を意味し、FACSは蛍光標示式細胞分取器を意味し、HAは赤血球凝集素を意味し、HBTUは1−ヒドロキシベンズトリアゾリルテトラメチル−ウロニウムを意味し、HEPESは4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸を意味し、HOBTは1−ヒドロキシベンゾトリアゾールを意味し、HRPは西洋わさびペルオキシダーゼを意味し、IGFはインシュリン成長因子を意味し、MOPSは4−モルホリンプロパンスルホン酸を意味し、MPSは多重並行合成を意味し、NMPはN−メチルホルムアミドを意味し、OPDはo−フェニレンジアミンを意味し、PBSはリン酸緩衝塩類溶液を意味し、PKAはプロテインキナーゼAを意味し、PKBはプロテインキナーゼBを意味し、PKCはプロテインキナーゼCを意味し、rpmは毎分回転数を意味し、SARは構造活性相関を意味し、THFはテトラヒドロフランを意味し、TISはトリ−イソプロピル−シランを意味し、TFAはトリフルオロ酢酸を意味する。
【0061】
本発明で使用するアミノ酸は、市販されているもの又は通常の合成方法で入手可能なものである。ある種の残基は、ペプチドに組み込むための特殊な方法を必要とするかもしれない。又ペプチド配列に対する逐次、発散又は収束合成手法のいずれかが本発明で有用である。コードされた天然アミノ酸及びその誘導体は、IUPAC規則に基づく3文字表記によって表している。指示がない場合、L異性体を使用した。D異性体は、残基の略語の前の「D」で表している。
【0062】
当業者に周知のアミノ酸の保存的置換は、本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換には、例えば脂肪族、芳香族、正に帯電、負に帯電した同じタイプの官能基又は側鎖を有する一方のアミノ酸をもう一方のアミノ酸と置換することが含まれる。
【0063】
本発明で使用される非コードアミノ酸の非限定的な例のリストは以下の通りである。Abuは2−アミノ酪酸を意味し、Ape5はアミノペンタン酸を意味し、ArgOlはアルギニノールを意味し、bAlaはβ−アラニンを意味し、Bpaは4−ベンゾイルフェニルアラニンを意味し、Bipはβ−(4−ビフェニル)−アラニンを意味し、Dabはジアミノ酪酸を意味し、Dapはジアミノプロピオン酸を意味し、Dimはジメトキシフェニルアラニンを意味し、Dprはジアミノプロピオン酸を意味し、Holはホモロイシンを意味し、HPheはホモフェニルアラニンを意味し、Gabaはγ−アミノ酪酸を意味し、GlyNH2はアミノグリシンを意味し、Nleはノルロイシンを意味し、Nvaはノルバリンを意味し、Ornはオルニチンを意味し、PheCarboxyはp−カルボキシフェニルアラニンを意味し、PheClはp−クロロフェニルアラニンを意味し、PheFはp−フルオロフェニルアラニンを意味し、PheMeはp−メチルフェニルアラニンを意味し、PheNH2はp−アミノフェニルアラニンを意味し、PheNO2はp−ニトロフェニルアラニンを意味し、Phgはフェニルグリシンを意味し、Thiはチエニルアラニンを意味する。
【0064】
薬理学
本発明の化合物は、当技術分野でよく知られているいくつかの方法で被験体に投与することができる。以下、「被験体」という用語は、本発明の化合物を投与するヒト又は下等動物を意味する。
【0065】
本発明の新規な薬剤組成物は、有効成分の他に通常の薬剤として許容される担体、希釈剤などを含む。経口投与のための錠剤、丸剤、カプセル剤などの固体組成物は、有効成分を、薬剤として許容される希釈剤を含むコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム及びガムなど通常の薬剤として許容される成分と一緒に混合することによって調製することができる。錠剤又は丸剤は、コーティングして、あるいはその他の方法で当技術分野で周知の薬剤として許容される物質と一緒に混ぜ合わせて、長期作用又は徐放をもたらす剤形を得ることができる。他の固体組成物は、直腸投与のための坐剤として調製することができる。
【0066】
液体形態は、経口投与又は注射用に調製することができ、注射という用語には、皮下、経皮、静脈内、くも膜下腔内、及び他の非経口投与経路が含まれる。液体組成物には、有機補助溶剤を含む又は含まない水性液剤、水性又は油性懸濁剤、食用油を含む乳剤、並びに他のミセル分散剤及び同様の薬剤担体が含まれる。さらに、本発明の組成物は、鼻腔内などへの投与のためのエアロゾール剤として形成することができる。より好ましい製剤には、定常状態の薬物動態学的特徴をもたらし得る徐放性又は持効性製剤が含まれる。
【0067】
しかし、治療する疾患、投与方法、患者の年齢、体重、禁忌などに応じて、担当の医師によって投与量が決定されるであろうことは当業者には明らかである。
【0068】
上記で定義したすべての化合物は、プロテインキナーゼの阻害剤として有効であり、1種、又は同時に数種の、上記で定義した障害の症状を治療するための薬剤組成物の有効成分として使用することができる。
【0069】
本発明の化合物は、上記で定義した目的のために、生理学的に許容される製剤を生成するために必要とされる溶剤、希釈剤、賦形剤などを含む通常の剤形で投与する。これらは、通常の投与経路のいずれかによって投与することができる。
【0070】
本発明の薬剤組成物の最も適切な投与が、治療している障害又は疾患の種類によって決まるであろうことが理解されよう。
【0071】
化学的手法
いくつかの本発明の好ましい化合物を、好都合には溶液相合成法を用いて調製することができる。当技術分野で周知の、本発明のようなイソキノリン化合物を調製するための他の方法も使用することができ、かつ本発明の範囲に含まれている。本発明による好ましいペプチドは、ペプチド模倣物質法を含めた、当技術分野で周知のどんな方法を用いて合成することもできる。これらの方法には、固相並びに溶液相合成法が含まれる。ペプチド基及び小分子基の結合は、固相又は溶液相化学的手法のいずれかによって、当技術分野で周知のどんな方法を用いて行うこともできる。これらの方法の非限定的な例をここに記載する。
【0072】
本発明の原理の例示として、ある種の分子のSAR試験を重視した阻害性PKBキメラ化合物に関する調査を以下に例示した。
【0073】
好ましい実施形態
プロテインキナーゼは2つ以上の活性部位を有し、それらはATPの触媒部位及び基質結合部位をもつ。本発明による好ましい化合物は、両方の部位に同時に結合でき、特異的な効力及び選択特性が得られる相乗効果があるかもしれない。これらの好ましい化合物は、様々なスペーサーによって基質模倣部分と連結したATP模倣分子を含むように設計されたキメラ分子である。
【0074】
本発明による好ましい実施形態は、以下のスキームIに記載のように、スペーサーによって連結されたATP模倣基とペプチド基質模倣基のどちらも含むキメラ化合物を含む。
【0075】
【化11】
【0076】
ATP模倣コアは、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンを含むがそれだけには限定されない。スペーサーは、様々な長さ及びアミン、アミド、チオエーテル、オキシエーテル、スルホンアミド結合などを含むがそれだけには限定されない任意の適当な化学構造からなる。こうしたスペーサーの非限定的な例には、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体がある。ペプチド基は、ペプチド又はペプチド模倣物質を含む。こうした阻害性ペプチドは、PKB基質として働くことができる任意のペプチドに基づいて設計される。
【0077】
本発明の別のより好ましい実施形態は、式I
【化12】
(式中、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、置換した又は非置換のフェニル基、フェニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、シアノ、又はアミノ基からなる群から選択される少なくとも1種の置換基で置換された低級アルキルからなる群から選択され、
m及びnは、それぞれ独立に0〜3であり、
Xは、SO2−NH、S及びOからなる群から選択され、
Mは、1〜4個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yは、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Wは、存在せず、あるいは1〜18個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lは、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Zは、PKBの基質部位に結合可能な長さの4〜12残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である)
の化合物を含む。
【0078】
好ましくは、R1及びR2は、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
m及びnは、それぞれ1であり、
Xは、SO2−NH及びSからなる群から選択され、
Mは、2個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yは、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Wは、存在せず、あるいは1〜5個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lは、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、
Zは、PKBの基質部位に結合可能な長さの6〜10残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である。
【0079】
キメラ化合物の一部を形成する、本発明による好ましいペプチド基質及びペプチド基質模倣物質を以下のスキームに記載する。
【0080】
【化13】
【0081】
このスキームによれば、AAは、配列に組み込まれて改善された薬理学的特性をもつペプチド模倣基を形成するアミノ酸、アミノ酸類似体、あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択される。
【0082】
AA1及びAA3は、それぞれ独立に、アルギニン又はアルギニン類似体、リジン又はリジン類似体、オルニチン又はオルニチン類似体、あるいはアミン、グアニジン又はアミジン、ホモアルギニン、アルギニノールなど生理的pHで正に帯電した基を含む脂肪族、芳香族、又は複素環基からなる群から選択される。
【0083】
AA2は、プロリン、プロリン類似体あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基、ヒドロキシプロリン、ニペコ酸、アラニン、アミノ酪酸からなる群から選択される。
【0084】
AA4、AA5、AA6は、それぞれ独立に、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、オルニチン、GlyNH2、Tyr又はTyr類似体、Thr又はThr類似体、Ser又はSer類似体、Ala又はAla類似体、Glu又はGlu類似体、Gly又はGly類似体、アルキル、ベンジル、ヒドロキシ、フェノキシアルコキシ、スルホン、スルホキシド、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、アミド又はカルバモイル官能基、アミノ酪酸、シトルリン、セリノール、ホスホチロシン及びホスホチロシンジメチルエステルを含む脂肪族、芳香族又は複素環残基からなる群から選択される。
【0085】
AA7は、Phe又はPhe類似体、Trp、Tyr、Leu、ホモロイシン、Ile、及びこれらの類似体、アミノ酸の芳香族基エステル又は芳香族置換基、芳香族、複素環基又は分枝状脂肪族基、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン、グルタミン酸ベンジルエステル、ナフチルアラニンからなる群から選択される。
【0086】
本発明による好ましい実施形態はペプチド模倣の性質をもつため、AA間の結合はペプチド結合だけではなく、アミド、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミド結合からなる群から選択することができる。
【0087】
本発明の別の好ましい実施形態は、式IIa〜IId
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
[式中、
R4、R5、及びR6は、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、GlyNH2、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のNα−ω−官能化誘導体であり、
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wは、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、
Lは、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される]
の化合物を含む。式IIbに記載のように、WはR5に連結していることが好ましい。
【0088】
本発明の現在最も好ましい実施形態には、以下に記載の式III〜VIIの化合物から選択されるキメラ化合物がある。
【0089】
【化18】
【0090】
【化19】
【0091】
【化20】
【0092】
【化21】
【0093】
【化22】
【0094】
PKB及びPKA活性を阻害する、式III〜VIIに基づく最も好ましい化合物並びに本発明の追加の最も好ましい実施形態の活性を、表1に記載する。
【0095】
以下のものから選択される配列を含む化合物が現在最も好ましい。
【0096】
【表1】
【0097】
図1は、PKBを不十分にしか阻害しないATP模倣部分と、活性が4μMのペプチド基質部分を結合させて、活性が0.9μM活性のキメラ化合物PTR6016を得るという相乗効果を示している。
【0098】
追加のキメラ化合物は、活性なペプチドを含み様々なリンカーでそのペプチド基領域をスペーサーに連結させている(スキームIに基づく)。有利なリンカーは、ペプチド及びATP模倣物質の両方を、それらの基質及びATP結合部位に同時に適合できるようにし、活性及び特異性の改善を可能にする。
【0099】
本発明による追加の好ましいペプチドは、キメラの基質ドメイン及びペプチド模倣物質設計の基準として使用することができる。例えば、PKBに対するIC50が4〜5μMの直鎖状7量体ペプチドを、参考文献のKmが15μMの7量体基質と比較して開示している。これらのペプチドは、PKBに特異的であり、60μMにおいてPKA活性を阻害しない。開示した追加のペプチドは、PKBの阻害に対して0.5〜10μMの活性を示し、約100nMのIC50でPKAを阻害する。
【0100】
改善された安定性及び細胞透過性を有するペプチド模倣化合物は、本発明の別の実施形態である。こうした化合物を生成する非限定的な例には、選択したペプチド残基のNアルキル化、カルバメート、尿素及びヒドラジン結合の置換、並びにペプチド又は非ペプチド結合によるピペリジン、ピペラジン、ピロリジンなどの複素環式非ペプチド基の取り込みがある。
【0101】
一般的な方法
合成法:
ペプチド合成及びカルバメート結合形成のための一般的な方法
以下の手順は、カルバメート形成にはビス−(トリクロロメチル)カーボネート(BTC)、又通常のカップリングにはHBTU/HOBTを用いた、1ウェル当り6μmolのスケールにおける、96ウェルプレート(MPSプレート)中、Rinkアミド樹脂上でのペプチド合成について説明している。
【0102】
0.6mmol/gのRinkアミド1gを、穏やかに振盪させながらNMP中で終夜膨潤させた。この樹脂を96ウェルプレート(1ウェル当り約10mg)に分けた。
【0103】
Fmoc脱保護は、25%ピペリジンのNMP溶液500μlをそれぞれのウェルに加え、650rpmで15分混合することによって行い、ピペリジン溶液を窒素圧によって除去し、ピペリジン溶液の別の一部を加え、15分間振盪させる。Fmoc脱保護後及びカップリング後の樹脂洗浄は、それぞれのウェルにNMP600μlを入れ、2分間混合し、窒素圧によってNMPを除去することによって行う。この洗浄手順を4回繰り返す。
【0104】
通常のカップリングは、樹脂にFmoc保護アミノ酸のHOBT/NMP溶液(150μl、0.2M)を加え、続いてHBTUのDMF溶液(150μl、0.2M)及びDIEAのNMP溶液(150μl、0.4M)を加えることによって行う。反応器ブロックを650rpmで1時間混合し、次いで窒素圧によって除去する。この手順を1回繰り返す。
【0105】
BTCを用いたカルバメート形成は、Fmoc保護アミノアルコールのジオキサン溶液(150μl、0.2M)を予備活性化ディープウェルプレートに加え、続いてBTC(0.07M)の1,3−ジクロロプロパン溶液150μl、コリジン(0.6M)の 1,3−ジクロロプロパン溶液150μl及びCH2Br2200μlを加えることによって行う。次いで、イソシアネート溶液を反応器ブロック中に移し、60℃で40分間混合する。40分後に反応混合物を窒素圧で除去し、続いてCH2Cl2洗浄を行う(3×400μl)。この手順をさらに2回繰り返す。
【0106】
切断及び完全な脱保護は、樹脂を反応器ブロックからディープウェルマイクロタイタープレート(切断プレート)に移すことによって行う。このプレートに、92.5%TFA、2.5%H2O、2.5%TIS、2.5%EDTの溶液350μlを加える。このプレートを1000rpmで1時間混合し、次いでTFA溶液を蒸発乾固させる。
【0107】
Sep−Pakによる精製は、ペプチドを含む樹脂の残基を溶液A(0.1%TFA水溶液)900μlに溶解させ、C−18Sep−Pakカラムに加えることによって行う。ペプチドは、溶液A+CH3CN 1:1 900μlを加えることによって、C−18カラムからディープウェルプレートに溶出させる。プレートを液体窒素中で少なくとも15分間凍結させ、ペプチドを凍結乾燥する。
【0108】
MPSフォーマットでキメラを合成するための一般的な方法
以下の手順は、通常のカップリングにHBTU/HOBTを用いた、1ウェル当り6μmolのスケールにおける、96ウェルプレート(MPSプレート)中、Rinkアミド樹脂上でのペプチド合成について説明している。
【0109】
0.6mmol/gのRinkアミド1gを、穏やかに振盪させながらNMP中で終夜膨潤させた。この樹脂を96ウェルプレート(1ウェル当り約10mg)に分けた。
【0110】
Fmoc脱保護は、25%ピペリジンのNMP溶液500μlをそれぞれのウェルに加え、650rpmで15分混合することによって行い、ピペリジン溶液を窒素圧によって除去し、ピペリジン溶液の別の一部を加え、15分間振盪させる。Fmoc脱保護後及びカップリング後の樹脂洗浄は、それぞれのウェルにNMP600μlを入れ、2分間混合し、窒素圧によってNMPを除去することによって行った。この洗浄手順を4回繰り返す。
【0111】
通常のカップリングは、樹脂にFmoc保護アミノ酸の HOBT/NMP溶液(150μl、0.2M)を加え、続いてHBTUのDMF溶液(150μl、0.2M)及びDIEAのNMP溶液(150μl、0.4M)を加えることによって行う。反応器ブロックを650rpmで1時間混合し、次いで窒素圧によって除去する。この手順を1回繰り返す。この構築に使用する最後のアミノ酸は、N−Boc保護されている。構築の終了時に、5%AcOH+2.5%NMMを含むPd(Pphe3)4(0.02Mのクロロホルム溶液500μlを入れ、1時間混合することによって、アリル脱保護を行う(Glu(OAllyl)又はC−構築単位から)。この手順を1回繰り返す。クロロホルム600μlをそれぞれのウェルに加え、5分間混合することによって、アリル脱保護後の樹脂洗浄を行う。溶媒を窒素圧によって除去する。この洗浄をさらに4回繰り返す。アリル保護リンカーとペプチド−樹脂のカップリングは、アリル保護リンカー(150μl、NMP中0.2M)を入れ、続いてPyBoP(NMP中0.2M)及びDIEA(NMP中0.4M)を加えることによって実施する。反応器ブロックを1時間混合し、溶液を窒素圧によって除去する。この手順を1回繰り返す。それぞれのウェルにNMP500μlを加えることによって、カップリング後の樹脂を洗浄する。リンカーからのアリル除去を、上記と同じ手順に従って行う。アリル脱保護後、イソキノリン誘導体溶液(150μl、NMP中0.2M)を加え、続いてByBoP(150μl、NMP中0.2M)及びDIEA(150μl、NMP中0.4M)を加える。この反応ブロックを2時間混合する。
【0112】
NMP 600μlをそれぞれのウェルに加え、2分間混合することによって、このカップリング後の樹脂洗浄を行う。溶媒を窒素圧によって除去する。この洗浄をさらに4回繰り返す。
【0113】
切断及び完全な脱保護は、樹脂を反応器ブロックからディープウェルマイクロタイタープレート(切断プレート)に移すことによって行う。このプレートに、92.5%TFA、2.5%H2O、2.5%TIS、2.5%EDTの溶液350μlを加える。このプレートを1000rpmで1時間混合し、次いでTFA溶液を蒸発乾固させる。
【0114】
Sep−Pakによる精製は、ペプチドを含む樹脂の残基を溶液A(0.1%TFA水溶液)+CH3CN 1:1 900μlに溶解させ、C−18Sep−Pakカラムに加えることによって行う。この手順をもう1回繰り返す。プレートを液体窒素中で少なくとも15分間凍結させ、ペプチドを凍結乾燥する。
【0115】
プロテインキナーゼ活性の阻害についての生物学的スクリーニング検定
無細胞系による方法
In vitro PKAキナーゼ活性検定:
1.PKA酵素をPromegaから購入した。PKA活性を、ケムプチドとして知られている7量体ペプチド、LRRASLGについて検定した。この検定は、96ウェルプレート中で1ウェル当りの最終体積50μlで行う。反応混合物には、様々な濃度の阻害剤、50mM MOPS、10mM MgAc、0.2mg/ml BSA、10μM ATP、20μM ケムプチド及び1μCiγ32P ATPが含まれている。反応は、0.1mg/ml BSA中に希釈したPKAの触媒サブユニット15μl、0.4U/ウェルを加えて開始させる。すべての検定に、酵素を含まない2つのブランク用ウェルを含める。プレートを、連続して30℃で10分間又は27℃で1時間攪拌する。200mM EDTA 12μlを加えることによって反応を停止させる。検定混合物のアリコート20μlを、2cm2ホスホセルロースストリップ(例えばワットマンP81)上にスポットし、75mM リン酸(1試料当り10ml)に浸す。ホスホセルロースストリップを6回洗浄する。5分間連続的にかき混ぜて洗浄し、最終的な洗浄はアセトン中で行う。ストリップを空気乾燥させた後、シンチレーション分光測定によって放射線を測定する。
【0116】
2.PKAを阻害する化合物のスクリーニングを、PKBについて以下に説明するように、下記の変更を加えて、SPAビーズを用いて96ウェルプレート中で行った。
酵素基質は、5μMビオチン標識−ケムプチドペプチド(ビオチン−KLRRASLG)であった。キナーゼ緩衝液は、50mM MOPS pH7、0.2mg/ml BSA、10mM 酢酸マグネシウムであった。0.1mg/ml BSA中に希釈したPKA(0.4ユニット)をそれぞれのウェルに加えた。
【0117】
PKB in vitroキナーゼ活性検定
1.PKB活性を、Alessiら(FEBS Letters 399、333、1996)によって記載されているように、下記の変更を加えて検定する。すなわち、ニッケルカラムでの沈降後、ビーズに結合したHA−PKBの代わりに可溶性His−HA−PKBを使用する。酵素活性測定は、PKAについての検定に記載の通りに行う。
【0118】
2.すでに記載の方法(Kumarら、BBA、1526:257〜268、2001)を、変更を加えて用いて、96ウェルプレート中でPKBを阻害する化合物のスクリーニングを行った。キナーゼ反応を最終体積50μlで実施した。それぞれのウェルは、2.5μMビオチン標識−crosstideペプチド(ビオチン−KGRPRTSSFA)を溶かしたキナーゼ緩衝液[50mMトリス−HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM DTT及び0.1mMオルトバナジン酸ナトリウム、0.01%トリトンX−100及び2%ジメチル(Me2SO)]、His−PKB酵素並びに潜在的阻害性化合物を含んでいた。キナーゼ反応は、2μM冷ATP及び0.25μCiの[γ33P]−ATPを溶かしたキナーゼ緩衝液10μlを加えることによって開始させた。プレートを27℃で1時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、0.1%トリトンX−100、5mM EDTA、1mM ATP及び0.3mg/mlのストレプトアビジン被覆SPAビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)を含むPBS200μlで反応を停止させた。室温での15分間のインキュベーション後、パッカードGF/B96ウェルプレートを用いて反応混合物をろ過した。プレートを2M NaCl及び1%オルトリン酸で2回洗浄し、続いてエタノール洗浄し、1時間空気乾燥させた。放射能は、マイクロプレートカウンターのパッカード社製トップカウントを用いてカウントした。
【0119】
PKB活性及び阻害を測定するためのトランスファーELISA検定
試験する阻害剤を水に溶解させて所望の濃度にする。阻害剤溶液5μlを、V型ポリプロピレンマイクロプレートのウェルに加える。次いで、濃度300μMの基質ペプチド(ビオチン−Lys−Gly−Arg−Pro−Arg−Thr−Ser−Ser−Phe−Ala−Glu−Gly)水溶液5μlをウェルに加える(最終検定濃度は100μM)。次いで、PKB酵素を溶解させた3×反応混合物(50mMトリスHCl pH7.5、0.1%βメルカプトエタノール、1μM PKI(Calbiochem)、10mM酢酸マグネシウム、ATP5μM)を、あらかじめ較正した量でウェルに加える。質量スペクトル分析によって評価して、反応が終わるまでに基質の10%未満がリン酸化されるように、酵素の量を較正する。プレートを接着テープで覆い、30℃で1mmIDボルテックス上に置き、必要に応じて30分〜1時間インキュベートする。インキュベーション期間終了時に、0.5M EDTA二ナトリウム5μlを加え、続いてPBS180μlを加える。
【0120】
ELISAのために、10μg/mlアビジンのPBS溶液20μlでマイクロプレート(Costar A/2)を被覆する(1mmIDボルテックス上で、4℃で終夜又は37℃で30分間)。次いで、プレートを脱イオン水で数回洗浄し、ペーパータオルで叩いて乾燥させる。ウェルをPBT(PBS+1%BSA+0.05%ツイーン20)20μlで充填する。酵素反応プレートから5μlをELISAプレートに移す。ELISAプレートを1mm IDボルテックス上に置き、室温で10分間インキュベートする。次いで、このプレートをすでに述べたように水で洗浄する。それぞれのウェルに、抗ホスホペプチド抗体(Cell Signaling Technology)を1:1000に希釈したPBT溶液20μlを加える。このプレートを又ボルテックス上に置き、30分間インキュベートし、すでに述べたように水で洗浄する。それぞれのウェルに、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗ウサギIg 20μlを加える。このプレートをボルテックス上に置き、20分間インキュベートし、すでに述べたように水で洗浄する。それぞれのウェルにHRP基質(Sigmafast OPD)20μlを加える。十分に発色した後(最大で約30分間の発色時間)、1ウェル当り4M HClの水溶液20μlを加えることによって反応を停止させる。次いで、ELISAリーダーを用いてこのプレートを490nmで読み取る。潜在的阻害剤を含むウェルから得られるシグナルを、酵素だけを含み阻害剤を含まないウェル(最大シグナル)及び酵素を含まないウェル(最小シグナル)から得られるシグナルと比較する。
【0121】
リン酸化ペプチドの画分をziptip(C18、Millipore i)で脱塩した後、質量スペクトルによって分析することもできる。二重荷電基質ペプチドの質量は759.3ダルトンであり、二重荷電リン酸化ペプチドの質量は799.3ダルトンである。
【0122】
PKC in vitroキナーゼ検定
PKCをPromega Corp.から入手し、このメーカーの説明書に従って、同じメーカーのキットを用いてリン脂質を含めて又含めずに検定した。PKC活性は、リン脂質を含む場合の活性からリン脂質を含まない場合の活性を引き算することによって決定した。検定でのATP濃度は10μMであった(ATP=50μMにおけるKm)。
【0123】
無傷細胞でのPKB活性の阻害に関する検定
いくつかの癌細胞系を用いて、無傷細胞でのPKB阻害剤の活性を測定した。例えば、OVCAR3は、PKB遺伝子が増幅された卵巣癌の細胞系であり、U87MGは、高PKB活性を引き起こすPTEN遺伝子を欠失した神経膠腫細胞系であり、PANC1は、PKB遺伝子が増幅された膵癌細胞系であり、PC−3、DU−145及びLNCaPは、PKB活性が変化した前立腺癌細胞系である。
【0124】
a.アネキシンV−アポトーシス検定
アネキシンV(Bender medsystems)を用いて、アポトーシスについて細胞を検定した。6ウェルプレート(0.3×106/ウェル)に細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。異なる時点で、細胞を、ラバーポリスマンを用いて掻き取り、注射針を通して分配し、PBSで2回洗浄し、アネキシンV結合緩衝液(10mM Hepes/NaOH pH7.4、140mM NaCl及び2.5mM CaCl2)中に懸濁させた。アネキシンVを1:40に希釈し、1μg/mlヨウ化プロピジウム(PI)と一緒にそれぞれの試料に加えた。アポトーシスを測定するためのFACS分析のために、1試料当り0.5×106細胞を利用した。
【0125】
代替法では、10cmプレート(2×106細胞/プレート)に細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。処理の40時間後、細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄し、アネキシンV緩衝液中に懸濁させた。アネキシンV(Roche)を、10mM HEPES pH7.4、140mM NaCl、5mM CaCl2及び0.2nMヨウ化プロピジウム(PI)を含む緩衝液中に1:250に希釈する。FACS分析によってアポトーシス測定を行った。
【0126】
b.ssDNAを検出するためのELISA検定−アポトーシス検定
ssDNAアポトーシスELISAキット(Chemicon International Inc)を用いて、アポトーシスについて細胞を検定した。96ウェルプレート(5000細胞/ウェル)に細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。異なる時点で、プレートを200gで5分間遠心分離し、培地を除去し、細胞を室温で30分間、80%メタノールのPBS溶液で固定した。37℃で20分間、水浴中で浮遊させることによってプレートを乾燥させた。それぞれのウェルにホルムアミド50μlを加え、室温で10分間インキュベートした。プレートを75℃で10分間、循環式水浴中で加熱し、冷蔵庫で5分間冷却し、次いでホルムアミドを除去した。3%脱脂粉乳を溶かした蒸留水(w/v)によって、プレートを37℃で1時間ブロックした。ブロッキングを除去し、抗体混合物(ssDNAに対する一次モノクローナル抗体及びHRP標識抗マウスIgM)100μlをそれぞれのウェルに加えた。マイクロプレートリーダーを用いて、405nmでABTSによる発色についてプレートをモニターした。
【0127】
c.細胞生存度検定
96ウェルプレートに細胞を播いた。培養72時間後、1〜6日間3通りで、細胞を異なる濃度(1、5、10、25、50、100μM)の阻害剤で処理し、あるいは処理しなかった。3つの方法、すなわちA.メチレンブルーによる生細胞の染色、B.WST−1試薬を用いた生細胞のミトコンドリア脱水素酵素活性の測定、c.3H−チミジンの取り込みを用いて細胞生存度を試験した。
【0128】
メチレンブルーによる生細胞の染色:細胞を0.5%グルタルジアルデヒドで固定し、続いて1%メチレンブルーを溶かしたホウ酸塩緩衝液(Sigma)で1時間染色した。次いで、細胞を蒸留水で数回洗浄し、空気乾燥し、37℃で1時間、0.1M HClを加えて色を抽出した。ELISAリーダーによる620nmにおける光学密度の測定によって、発色強度の定量化を行った。
【0129】
細胞増殖試薬WST−1:培養中の適切な時間に培地を廃棄し、WST−1試薬(Boeheringer mannheim)を1:10に希釈した増殖培地100ulを37℃で1〜2時間加えた。マイクロプレートELISAリーダーによって、基準波長690nmで450nmにおいてホルマザン生成物の吸光度を測定した。
【0130】
3H−チミジンの取り込み:培養中の適切な時間に、3H−チミジン(5Ci/ミリモルのストック、Amersham)1uciを、培地100ulを含むそれぞれのウェルに5時間加えた。培養終了時に、細胞をPBSで数回洗浄し、数時間空気乾燥し、シンチレーション液50ulを加えた。放射能は、マイクロプレートカウンター、パッカード社製トップカウントを用いてカウントした。
【0131】
d.リン酸化の阻害
細胞(2×106)を25cm2フラスコに播き、通常の培地条件で2日間増殖させ、次いで飢餓条件(FCSなし)でさらに24時間増殖させた。この時点で、飢餓条件下において、GSK−3及びPKBリン酸化に対する作用を分析するために阻害性化合物を加えた。処理の終了時に、細胞を10分間150ng/ml IGF−1で刺激し、溶解緩衝液(20mMトリス−HCl pH7.4、150mM NaCl、0.5%トリトン−x100、25mM NaF、2mM AEBSF、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mMβ−グリセロリン酸、1μg/mlアプロトニン(aprotonin)及び5μg/mlロイペプチン)を用いて溶解させた。等量の細胞タンパク質を10%SDS−PAGEによって分離し、PVDF膜にエレクトロブロットした。Cell Signaling Technologyから入手したphospho−Akt1(Ser473)、又は(Thr308)及びphospho−GSK3α(Ser21)に対する抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。
【0132】
代替法では、6ウェルプレートに細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。血清含有培地下又は飢餓下で異なる期間処理を行った。処理後、細胞を10分間IGF−1(HEK−293及びPANC1細胞)又はEGF(OVCAR3及びU89MG細胞)で刺激する。煮沸した試料緩衝液を用いて細胞可溶化物を調製する。αphospho−GSK3を用いたウェスタンブロット分析では、GSK3リン酸化の低下が示された。HEK−293細胞におけるkinase−dead−PKBの発現により、GSK3リン酸化に対する作用についての試験も行った。
【0133】
PKB阻害剤の活性を評価するためのin vivoモデル
本発明の化合物を、腫瘍増殖及び退縮に対して影響があるかどうか、
1.ヌードマウスの前立腺癌細胞PC3、LNCAP及びDU145、
2.ヌードマウスの卵巣癌細胞(OVCAR)、
3.ヌードマウスの膵臓癌細胞(PUNC1)
などの癌性細胞系由来の異種移植片中で試験する。
【0134】
簡単に言えば、細胞を動物の皮下に移植し、腫瘍を約0.5mmまで増殖させる。急性毒性試験によって実験的に決定される適切な投与量の化合物を、腫瘍に、その増殖の様々な段階で注入することになる。初期段階での注入では、腫瘍増殖に対する化合物の影響が反映されるはずであり、定着腫瘍への注入では、退縮に対する影響が決定されるはずである。さらに、PKB阻害によってアポトーシスが増大することから化学療法に対する腫瘍の感受性が増大することによって生じる相乗効果を評価するために、化合物を既知の化学療法剤と共に腫瘍に注入する相乗作用試験を計画している。
【0135】
以下の実施例は例示するためのものに過ぎず、本発明の原理の非限定的な例示であり、かつ下記の特許請求の範囲によって定義される現在特許請求している発明の範囲内で多くの変形形態及び変更形態が可能であることが当業者には理解されよう。
【実施例】
【0136】
実施例1.PKB阻害についてのPKA阻害剤のスクリーニング
既知のPKB阻害剤がないので、PKBと他のプロテインキナーゼの間の構造類似性を利用して、他のプロテインキナーゼ、例えば、PKA及びPKCの市販の阻害剤をPKB阻害についてスクリーニングした。候補化合物のコンビナトリアルライブラリーの初期設計の助けとなるはずの活性化合物中のいくつかの構造モチーフを定義するために、予備的なスクリーニングを行った。
【0137】
ただし、この手段は主要な分子の迅速な同定に非常に有用であるが、同定された分子が他のキナーゼに対しても同様に阻害活性をもつであろうことに留意されたい。すなわち、この手法では、阻害活性の最適化を対象とした研究だけでなく、又、おそらく最も重要なことには、特異性を指向した研究が必須となる。すなわち、PKBに対する選択性又は特異性のプロフィルを得るために、選択性のプロフィルを改変することに大きな労力が実際に払われている。
【0138】
スクリーニングにより、2〜3μM範囲でPKBを阻害する2つの化合物が得られた。既知のPKA阻害剤であるH−89を、その構造並びに合成及び特異性の考慮に基づき、第1のライブラリの設計のための基礎として選択した。
【0139】
イスラエル出願第136458号に記載の合理的な設計及び並行合成法を用いて、H−89をさらに最適化した。5−イソキノリン−スルホンアミドエチレンジアミンコアが活性に不可欠であり、スルホンアミド又はカルボキサミド誘導体である任意の他のコアで置換すると活性がなくなると結論付けられた。基質模倣領域Cも調べ、この領域は、疎水性基又は複素環基あるいはPKBと結合できるペプチドを含むことができると結論付けられた。これらの発見の概要を以下の実施例に示す。これらの化合物を、本発明によるキメラ化合物のATP模倣基の設計の基礎として使用した。
【0140】
実施例2.ATP及び基質模倣部位を有するキメラ化合物
キメラ分子は、架橋によって連結させたATP模倣領域と基質模倣領域を共に含むように設計する。これらのキメラ分子は、同時にプロテインキナーゼの触媒部位と基質部位の両方に結合でき、特異的な効力及び選択特性をもたらす相乗効果を有する可能性がある。これらの化合物は、様々なスペーサーによって基質模倣部分と連結したATP模倣分子を含むように設計する。
【0141】
これらの化合物は、合成及びそれぞれのライブラリが上記のスキームIに基づく異なる領域における改変を検討するコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングサイクルの後に同定する。
【0142】
ATP模倣コアは、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンを含むがそれだけには限らない。スペーサーは、様々な長さ及びアミン、アミド、チオエーテル、オキシエーテル、スルホンアミド結合などを含むがそれだけには限らない任意の適当な化学構造からなる。こうしたスペーサーの非限定的な例には、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体がある。ペプチド基は、ペプチド又はペプチド模倣物質を含む。こうした阻害性ペプチドは、PKB基質として働くことができる任意のペプチドに基づいて設計することができる。
【0143】
実施例3.キメラ化合物の詳細な合成
PTR6013
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、4−(4−ホルミル−3−メトキシフェノキシ)ブチリル(NovaGel HL)400mgをジクロロエタン/オルトギ酸トリメチル(1:1)中で1.5時間膨潤させた。N−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミン352mg(9当量)のDMF溶液12mlを樹脂に加え、続いてNaBH(OAc)3を加え、終夜振盪し続けた。樹脂をDMF、続いてDCMで洗浄した。BTC(77mg、1.66当量)及び2,4,6−コリジン(290μl、14当量)のTHF溶液を用いて50℃で2回予備活性化させたFmoc−フェニルアラニノール(291mg、5当量)を加えることによって、カルバメート結合の形成を行った。25%ピペリジンのNMP溶液(3ml)を用いて15分間、2回Fmocを樹脂から除去し、続いてNMP(5ml)で7回、それぞれ2分間慎重に洗浄した。Abu、Ser、Thr、Arg、Pro、Argの構築は、それぞれFmoc−Abu−OH、Fmoc−Ser(t−Bu)−OH、Fmoc−Thr(t−Bu)−OH、Fmoc−Arg(Pmc)−OH、及びFmoc−Pro−OHを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸(3当量)をNMPに溶解させ、PyBroP(3当量)及びDIEA(6当量)で活性化させた。第1のカップリングについて上記で説明したように、カップリングに続いて、ペプチド−樹脂を洗浄し、次いでFmocを除去し、続いてNMPで大幅に洗浄した。構築の終了時に、65%TFA、20%DCM、5%チオアニソール、3%EDT、2%TIS及び5%水の全体積7mlの反応混液を用いて、アルゴン下で0℃で15分間、次いで室温で2時間、ペプチドを樹脂から切断した。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂を60%TFAのDCM溶液3mlで洗浄し、N2流によって混合溶液を蒸発させて、冷Et2Oで処理すると凝固する油性残基を得た。Et2O層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Et2Oの追加部分による処理とそれに続く遠心分離、デカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、PTR6013と名付ける以下の構造を有する粗製材料が得られた。
【0144】
【化23】
【0145】
PTR6014
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、RinkアミドMBHA樹脂(0.55mMol/g)500mgをNMP中で2時間膨潤させた。25%ピペリジンのNMP溶液(4ml)を用いて15分間、2回Fmocを樹脂から除去し、続いてNMP(5ml)で7回、それぞれ2分間慎重に洗浄した。Phe、Glu、Ser、Thr、Arg、Pro、Argの構築は、それぞれFmoc−Phe−OH、Fmoc−Glu(OAllyl)−OH、Fmoc−Ser(t−Bu)−OH、Fmoc−Thr(t−Bu)−OH、Fmoc−Arg(Pmc)−OH、及びFmoc−Pro−OHを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸(3当量)をNMPに溶解させ、PyBroP(3当量)及びDIEA(6当量)で活性化させた。構築の終了時に、5%AcOH及び2.5%NMMを含むPd(PPh3)4のCH2Cl2溶液を用いてアリル脱保護を行った。PyBoP 3当量及びDIEA 3.1当量のNMP溶液によって、20分間遊離酸を活性化させ、続いてNMPで洗浄した。予備活性化後、小分子(3当量)及びDIEA(4.5当量)のNMP溶液を樹脂に加え、室温で1時間振盪させた。上記の第1のカップリングについて上記で説明したように、カップリングに続いて、ペプチド−樹脂をNMPで洗浄し、次いでFmocを除去し、続いてNMPで大幅に洗浄した。合成の終了時に、85%TFA、5%チオアニソール、3%EDT、2%TIS及び5%水の全体積5mlの反応混液を用いて、アルゴン下で0℃で15分間、次いで室温で2時間、ペプチドを樹脂から切断した。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂をTFA 2mlで洗浄した。N2流によって混合溶液を蒸発させて、冷Et2Oで処理すると凝固する油性残基を得た。Et2O層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Et2Oの追加部分による処理とそれに続く遠心分離、デカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、PTR6014と示した以下の構造を有する粗製材料が得られた。
【0146】
【化24】
【0147】
PTR6020
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、RinkアミドMBHA樹脂(0.55mMol/g)500mgをNMP中で2時間膨潤させた。25%ピペリジンのNMP溶液(4ml)を用いて15分間、2回Fmocを樹脂から除去し、続いてNMP(5ml)で7回、それぞれ2分間慎重に洗浄した。Phe、Glu、Ser、Thr、Arg、Pro、Argの構築は、それぞれFmoc−Phe−OH、Fmoc−Glu(OAllyl)−OH、Fmoc−Ser(t−Bu)−OH、Fmoc−Thr(t−Bu)−OH、Fmoc−Arg(Pmc)−OH、及びFmoc−Pro−OHを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸(3当量)をNMPに溶解させ、PyBroP(3当量)及びDIEA(6当量)で活性化させた。構築の終了時に、5%AcOH及び2.5%NMMを含むPd(PPh3)4のCH2Cl2溶液を用いてアリル脱保護を行った。PyBoP 3当量及びDIEA 3.1当量のNMP溶液によって、20分間遊離酸を活性化させ、続いてNMPで洗浄した。予備活性化後、γ−アミノ酪酸アリル(5当量)及びDIEA(6当量)のNMP溶液を加え、室温で1時間振盪させた。上記と同じ手順によって、アリル脱保護及び予備活性化を行った。小分子(3当量)及びDIEA(4.5当量)のNMP溶液を予備活性化ペプチド−樹脂に加え、室温で1時間振盪させた。第1のカップリングについて上記で説明したように、カップリングに続いて、ペプチド−樹脂をNMPで洗浄し、次いでFmocを除去し、続いてNMPで大幅に洗浄した。合成の終了時に、85%TFA、5%チオアニソール、3%EDT、2%TIS及び5%水の合計5mlの反応混液を用いて、アルゴン下で0℃で15分間、次いで室温で2時間、ペプチドを樹脂から切断した。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂をTFA 2mlで洗浄し、N2流によって混合溶液を蒸発させて、冷Et2Oで処理すると凝固する油性残基を得た。Et2O層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Et2Oの追加部分による処理とそれに続く遠心分離、デカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、PTR6020と示した以下の構造を有する粗製材料が得られた。
【0148】
【化25】
【0149】
実施例4.キメラ化合物の生体活性
4個のキメラ化合物を、PKB阻害活性についてスクリーニングした。表2は、それらの構造及び阻害活性を示している。B−11−1と示される化合物と同様に、これらの化合物はPKAに特異的ではない。
【0150】
【表2】
【0151】
PTR6013、6014、及び6020の構造を実施例11に示す。PTR6016の構造は以下の通りである。
【0152】
【化26】
【0153】
図1は、PKBを阻害しないATP模倣部分と、活性が4μMのペプチド基質部分を結合させると、活性が0.9μM活性のキメラ化合物PTR6016が得られるという相乗効果を示している。
【0154】
実施例5.追加のキメラ化合物
ペプチドと小分子(式IIのW)を連結している多様なリンカー(式IIのL)を含む、プレート60002、60003由来の活性なペプチドの96個のキメラ化合物の多重並行合成を行った。これらのペプチドは、ペプチド及びATP模倣物質の両方を、それらの基質及びATP結合部位に同時にはまり込むことができるようにして、活性及び特異性の改善を可能にする、適切なリンカーを解明するために設計した。
【0155】
合成した化合物は、上記で指定した式IIa〜IIdに記載されている。
【0156】
実施例6.ペプチド
追加のペプチドは、キメラの基質ドメインで使用するため、又ペプチド模倣物質を設計するために設計する。直鎖状7量体ペプチドの2つのプレートを合成し精製した。第1のプレート(6002)由来の4個のペプチドは、PKBに対するIC50が4〜5μMで活性であることが判明した(参考文献の7量体基質のIC50は15μMである)。これらすべてのペプチドは、60μMにおいてPKA活性を阻害しない。第2のプレート(6003)から約24個の活性ペプチドを同定し、60%より高い阻害を示すペプチドを再度試験すると、PKBに対して0.5〜10μMの活性を示した。PKAに対する特異性はまだ試験していない。マクロビーズライブラリ由来の追加の1152個のペプチドをスクリーニングし、150個が10μMにおいて50%より高い阻害を示した。次いで、3つの多重並行合成プレートを平らにし合成した。選択した結果を以下の表に示す。
【0157】
【表3】
【0158】
ELISAで決定したペプチドAR−60003−52のPKB阻害活性を図2に示す。
【0159】
実施例7.活性ペプチドに基づくペプチド模倣化合物
ペプチド結合を置換するカルバメート及び/又は尿素結合を含む以下のペプチド模倣化合物を合成した。
【0160】
実施例8.尿素結合を含む7量体PTR6046の詳細な合成
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、Rinkアミド樹脂100mg(0.055μmol)をNMP中で1.5時間膨潤させた。25%ピペリジンのNMP溶液(3ml)を用いて15分間、2回Fmocを樹脂から除去し、続いてNMP(2ml)で7回慎重に洗浄した。Arg−Thr−Ser−Dap−Holの構築は、それぞれFmoc−Hol−OH、Fmoc−Dap−OH、Fmoc−Ser(tBu)−OH、Fmoc−Thr(tBu)−OH、Fmoc−Arg(Pmc)−OHを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸(3当量)をNMPに溶解させ、PyBroP(3当量)及びDIEA(6当量)で活性化させた。カップリングに続いて、ペプチド−樹脂を洗浄し、次いでFmocを除去し、続いてNMPで大幅に洗浄した。
【0161】
尿素結合の形成:
【化27】
N−フルオレニルメトキシカルボニル−N’−ニトロフェノキシカルボニル−ジアミノエタン50mg(2当量)、DIEA 25μl(2.5当量)を溶かしたNMP 2mlを樹脂に加え、1.5時間振盪し続けた。樹脂をNMP(5回、それぞれ2分間)で洗浄した。尿素結合を形成した後、上記のようにFmoc−Arg(Pmc)−OHのカップリングを行い、続いてFmoc脱保護を行った。構築の終了時に、92.5%TFA、2.5%EDT、2.5%TIS及び2.5%水の全体積5mlの反応混液を用いてペプチドを樹脂から切断し、1時間振盪し続けた。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂をTFA 2mlで洗浄し、N2流によって混合溶液を蒸発させて、冷Et2Oで処理すると凝固する油性残基を得た。Et2O層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Et2Oの追加部分による処理とそれに続く遠心分離及びデカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、以下の構造を有する粗製PTR6046が得られた。
H−Arg−NH−(CH2)2−NH−CO−Arg−Thr−Ser−Dap−Hol−NH2
【0162】
実施例9.MPSフォーマットにおける96個のキメラ化合物の合成及びスクリーニング
上記の合成法に基づき以下の配列(TY−60020−と表し表4に示す)をMPSフォーマットで合成した。
【0163】
【表4】
【0164】
PKB及びPKA活性阻害(キナーゼ活性の阻害%)について、化合物濃度1μM(上記の方法に基づき)で96個の化合物をスクリーニングし、その結果を表5にまとめて示す。
【0165】
【表5】
【0166】
【表6】
【0167】
実施例10.19個のキメラ化合物の合成
アミノ酸側鎖ではなくN−誘導体化アミノ酸に連結させることによって、互いに関連するペプチド及び小分子の空間的位置を調整するために取り込んだ位置5のアミノ酸のNα−ω−官能化誘導体を含む、追加の19個の化合物を合成した(BP−60023−と表す)。この配列を表7に示す。
【0168】
【表7】
【0169】
実施例11.キメラPTRの構造及び活性
【0170】
【表8】
【0171】
実施例12.基質模倣阻害剤として働く選択したペプチド及びペプチド模倣化合物
いくつかのペプチド及びペプチド模倣化合物プレートを、PKB及びPKA阻害についてスクリーニングした。(これらの結果は、小分子との結合を含まない、ペプチド基だけに関するものである。)選択した結果を表9に示す。
【0172】
【表9】
【0173】
上記のスクリーニングから最も有望なペプチドを、正確なIC50曲線を得るために検定した。さらに、スクリーニング結果に基づきいくつかのPTR化合物を設計し、同様に検定した。IC50評価の結果を表10にまとめた。
【0174】
【表10】
【0175】
図3は、60018−16と名付ける活性で選択的なペプチドのPKB及びPKA阻害曲線(IC50)を示す。
【0176】
最も優れたペプチドPTR6158に基づき、表11に示した疎水性基を含むいくつかの類似体を合成した。さらに、表11のペプチド配列を含む、BP60023 20〜24と表される5個の化合物を合成した。これらは、細胞透過性の改善を目的とした、疎水性基をもつペプチドである。
【0177】
ペプチド単独では、1uM程度の活性を示し、選択性PKB/PKAが100倍であった。ペプチド単独では、基質部位に結合する。ATP基と結合している場合、ATPがまず結合し、ペプチドは転位し、したがって親和性はより高く、選択性はより低くなる。活性に対する相乗効果。ATP基は、PKA/PKB部位を区別せず、したがってATPドメインは選択的ではない。
【0178】
【表11】
【0179】
実施例13.前立腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導
アポトーシス細胞のDNAは、ネクローシス細胞とは対照的に、ホルムアミドによる変性に対して感受性がある。この感受性は、アポトーシス細胞染色質の変化が原因である。一本鎖DNAに対するモノクローナル抗体で特異的な変性が検出された。ssDNAアポトーシスELISAキット(Chemicon International、Inc.)を用いて、既知のアポトーシス剤(R&D Systems,Inc.)のTRAIL(TNF関連アポトーシス誘導リガンド)と比較して、PC−3細胞でアポトーシスを誘導する潜在能力があるかどうかキメラ化合物を分析した。処理した細胞及び未処理の細胞の光学密度を割り算することによって計算したアポトーシス指数の値で結果を示した。
【0180】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【0181】
【図1】ATP模倣物質とペプチド基質から構成されるキメラ化合物PTR6016の相乗効果を示す図である。
【図2】実施例6に記載したAR−60003−52の阻害活性曲線を示すグラフである。
【図3】60018−16と名付ける活性で選択的なペプチドのPKB及びPKA阻害曲線(IC50)を記載したグラフである。
Claims (35)
-
m及びnが、それぞれ独立に0〜3であり、
Xが、SO2−NH、S及びOからなる群から選択され、
Mが、1〜4個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yが、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいは1〜18個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lが、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、及び
Zが、PKBの基質部位に結合可能な長さの4〜12残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
式Iの化合物。 - R1及びR2が、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
m及びnが、それぞれ1であり、
Xが、SO2−NH及びSからなる群から選択され、
Mが、2個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yが、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいは1〜5個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lが、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、及び
Zが、PKBの基質部位に結合可能な長さの6〜10残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
式Iの化合物。 -
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式IIaの化合物。 -
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式IIbの化合物。 -
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式IIcの化合物。 -
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式IIdの化合物。 - 配列Arg−Pro−Arg−Thr−Glu−(bAla−5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Thr−Glu−(5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Orn−Glu−(5−アミノエチルスルホンアミドイソキノリン)−Ser−Pheを含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Nva−Glu−(5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Nle−Glu−(5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Orn−Glu−(Gly−5−アミノエチルスルホンアミド)−Dab−Hol−を含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Nle−Glu−(Gly−5−アミノエチルスルホンアミド)−Dab−Pheを含む請求項1記載の化合物。
- 配列Arg−Pro−Arg−Nle−Glu−(Gly−5−アミノエチルスルホンアミド)−Dab−Holを含む請求項1記載の化合物。
- 有効成分として、
m及びnが、それぞれ独立に0〜3であり、
Xが、SO2−NH、S及びOからなる群から選択され、
Mが、1〜4個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yが、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいは1〜18個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lが、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、及び
Zが、PKBの基質部位に結合可能な長さの4〜12残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
式Iの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。 - R1及びR2が、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
m及びnが、それぞれ1であり、
Xが、SO2−NH及びSからなる群から選択され、
Mが、2個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Yが、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいは1〜5個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Lが、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、及び
Zが、PKBの基質部位に結合可能な長さの6〜10残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
請求項8に記載の薬剤組成物。 - 有効成分として、
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式IIaの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。 - 有効成分として、
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式IIbの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。 - 有効成分として、
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式IIcの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。 - 有効成分として、
R7は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Wが、存在せず、あるいはN−(8−スルホンアミド−5−イソキノリン)エチレンジアミンであり、及び
Lが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式IIdの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。 - 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Thr−Glu−(bAla−5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Thr−Glu−(5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Orn−Glu−(5−アミノエチルスルホンアミドイソキノリン)−Ser−Pheを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Nva−Glu−(5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Nle−Glu−(5−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン)−Ser−Pheを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Orn−Glu−(Gly−5−アミノエチルスルホンアミド)−Dab−Holを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Nle−Glu−(Gly−5−アミノエチルスルホンアミド)−Dab−Pheを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、配列Arg−Pro−Arg−Nle−Glu−(Gly−5−アミノエチルスルホンアミド)−Dab−Holを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項15記載の薬剤組成物。
- 有効成分として、請求項1〜14のいずれか一項に記載の化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む、プロテインキナーゼを阻害する薬剤組成物。
- 治療を必要とする患者に、請求項1〜14のいずれか一項に記載の化合物を治療有効量含む薬剤組成物を投与することを含む、疾患の治療法。
- 前記疾患が、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患を含む群から選択される請求項30記載の方法。
- 診断を必要とする患者に、請求項1〜14のいずれか一項に記載の化合物を診断上有効な量含む薬剤組成物を投与することを含む、疾患の診断方法。
- 疾患を治療するための医薬品を調製するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の化合物の使用。
- 前記疾患が、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患を含む群から選択される請求項33記載の使用。
- 診断薬を調製するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の化合物の使用。
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