JP2005500016A - ウィングレス・シグナル伝達経路の新規な必須下流成分 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ウィングレス・シグナル伝達経路の新たな必須下流成分に関する。特に、本発明は、キイロショウジョウバエのdaughter of legless(doll)遺伝子のヌクレオチド配列、そのコードされるタンパク質、並びにそれらの誘導体、断片、及び類似体に関する。本発明には、ショウジョウバエDoll遺伝子に類似したアミノ酸のストレッチを含有するタンパク質を含んでなる、脊椎動物及び無脊椎動物のDollタンパク質の相同体が含まれる。Dollタンパク質、誘導体、及び類似体を例えば組換え法により産生する方法と、Dollへの抗体も本発明により提供される。本発明はまた、Doll機能をWnt経路において変調させる化合物のハイスループットスクリーニングアッセイを実施する方法に関する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウィングレス・シグナル伝達経路の新規な必須下流成分に関する。特に、本発明は、キイロショウジョウバエのdaughter of legless(doll)遺伝子のヌクレオチド配列、そのコードされるタンパク質、並びにそれらの誘導体、断片、及び類似体に関する。本発明には、ショウジョウバエDoll遺伝子に類似したアミノ酸のストレッチを含有するタンパク質を含んでなる、脊椎動物及び無脊椎動物のDollタンパク質の相同体が含まれる。Dollタンパク質、誘導体、及び類似体を例えば組換え法により産生する方法と、Dollへの抗体も本発明により提供される。本発明はまた、Doll機能をWnt経路において変調させる化合物のハイスループットスクリーニングアッセイを実施する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Wnt遺伝子は、多種多様な生物学的プロセスにおける細胞間シグナル伝達分子として主要な役割を担う、大きなファミリーの分泌性システインリッチタンパク質をコードする(広範な概説については、WodarzとNusse 1998を参照のこと)。最初のWnt遺伝子、マウスwnt−1は、マウス乳房腫瘍ウイルスの乳房腫瘍における組込みにより活性化される癌原遺伝子として発見された(NusseとVarmus 1998)。必然的に、Wnt経路の癌における関与が広く研究されてきた。ショウジョウバエのポラリティー遺伝子、ウィングレス(wg)のwnt−1相同体としての同定(Cabrera,Alonso et al.1987;PerrimonとMahowald 1987;Rijse-wijk,Schuermann et al.1987)により、wnt遺伝子が重要な発生レギュレーターであることが明らかになった。このように、一見すると似ていないが、胚発生と発癌のような生物学的プロセスは、いずれも同一のシグナル伝達経路を介した細胞情報伝達に依存する。この経路の現行モデルにおいては、分泌されるWntタンパク質がFrizzle細胞表面受容体へ結合し、細胞質タンパク質のDishevelled(Dsh)を活性化する。するとDshは、プロテインキナーゼShaggy/GSK3、骨格タンパク質のAxin及びβ−カテニン、Armadilloの脊椎動物相同体を含む、いくつかのタンパク質の複合体へこのシグナルを伝達する。この複合体において、β−カテニンは、Sggによりリン酸化された後で分解の標的になる。Wntシグナル伝達と生じるSgg活性のダウンレギュレーションの後で、β−カテニン(又はそのショウジョウバエ相同体のArmadillo)は分解から逃れ、細胞質中に蓄積する。フリーの細胞質β−カテニンは依然として不明瞭な機序により核へ転座し、Tcf/Lefファミリーの転写因子へ結合することにより遺伝子転写を変調させる(Grosschedl R 1999)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
重要なトランスデューサーが絶えず抑制されているこの状況は、その阻害成分において突然変異をきわめて受けやすい。β−カテニン破壊複合体の3つの要素のいずれかの喪失は、β−カテニンレベルの増加、故にこの経路の構成的な活性化をもたらす。このことは、GSK−3機能の喪失と同時に細胞の生存能力を抑制する場合があるが、それはまた、APC及びAxinの場合のように、細胞運命の変化、非制御の増殖と腫瘍形成性の挙動をもたらすことも可能である(Barker N 1999;Morin 1999;Potter 1999;RooseとClevers 1999;WalzerとBienz 1999)。これらの有害な状況に対抗する試みは、β−カテニン−TCF複合体の形成を防止することか、又はその転写アクチベータ機能に干渉することのいずれかによってβ−カテニンの核活性を抑制することを目的としなければならない。
【0004】
今のところ、β−カテニン転写活性化を有効に阻害する既知の治療薬剤は存在しない。これは、一部は、その完全な活性化と核転座に要求される必須成分の多くが依然として不明であるという事実のためである。必然的に、これらのきわめて悪性の疾患に抗する有効な薬物を開発することを可能にするために、この経路についてより多くのことを理解することが要請されている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
ウィングレス活性化に要求される新規成分を同定するために、発明者たちは、ショウジョウバエの遺伝アプローチを使用して、ウィングレス(ショウジョウバエのWnt相同体)の眼発生の間の異所性発現により引き起こされるラフ眼表現型の優性サプレッサーをスクリーニングした。3つの遺伝子を同定した:β−カテニン相同体のarmadillo(arm)、tcf/lef−1相同体のpangolin(pan)、及び、完全に新しい遺伝子のレッグレス(lgs)である(米国09/915,543)。引き続き、このlgs遺伝子をクローニングして、それが胚と発生中の組織におけるウィングレスシグナル伝達にin vivoで必須であることを確かめた。転写活性のArm/Pangolin複合体にはLgsの存在が要求され、Lgsの過剰発現は、この二極(bipartite)転写因子の転写アウトプットを強く刺激する。ヒトゲノムは、少なくとも2つのヒトLgs相同体を含有する。そのうちの1つであるBc19は、以前からB細胞悪性腫瘍に関係があるとされてきた(Willis,Zalcberg et al,1998)。また、ヒト細胞においてdLgsとhLgsがArmadillo及びβ−カテニンへ結合し、Wntシグナル伝達に機能的に要求されることが遺伝学的に、そして生化学的に実証された。しかしながら、遺伝実験は、Lgsへ結合し、活性β−カテニン−Pangolin−Lgs複合体の機能に必須である第二のタンパク質の存在を強く示唆した。
【0006】
本発明は、Lgsへ結合してWntシグナル伝達に要求される、Daughter of Legless(Doll)と名付けた新規のショウジョウバエタンパク質のクローニング及び機能特性決定を記載する。さらに、本発明は、機能及び構造上のヒト及びマウス相同体の配列、並びに、Wnt経路においてDoll機能を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【0007】
諸定義
用語「Dollポリペプチド」、「Dollタンパク質」には、本明細書において使用される場合、ネーティブな無脊椎動物及び脊椎動物のDoll及びDoll変異体の配列(これは、本明細書においてさらに明確にされる)が含まれる。
【0008】
「野生型配列Doll」は、天然に由来のDollタンパク質と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。Dollのそのような野生型配列は、天然から単離することが可能であるか、又は組換え及び/又は合成の手段により産生することが可能である。用語「野生型配列Doll」には、特に、Dollの天然に存在する先端切断型、天然に存在する変異型(例、選択的にスプライスされた形)、及び天然に存在する対立遺伝子変異型が含まれる。本発明の1つの態様において、野生型Doll配列は、dDollのアミノ酸1〜815(図1)、又はhDoll−1の1〜419、又はhDoll−2の1〜406(図2)、又はmDoll−1の1〜417、又はmDoll−2の1〜407(図3)を含んでなる成熟若しくは完全長のDoll配列である。
【0009】
「Doll変異体」は、図1、2、及び3の野生型Dollタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約50%のアミノ酸配列同一性を有する、活性Dollを意味する。しかしながら、用語「Doll変異体」にはまた、Wnt経路におけるDollの機能的相同体も含まれる。
【0010】
本明細書において同定されるDoll配列に関する「アミノ酸配列同一性比率(%)」は、配列を並置して、必要ならば、最大の配列同一性比率を達成するためにギャップを導入し、そして保守的アミノ酸置換を配列同一性の一部とみなさない場合に、Doll配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。本明細書に使用される%同一性値は、(Tatusova TA 1999)から入手したWU−BLAST−2により生成することが可能である。WU−BLAST−2は、いくつかの検索変数を使用し、そのほとんどがデフォルト値を設定している。
【0011】
上記のように実施される配列比較の文脈において、用語「陽性」には、同一ではないが、類似の特性(例えば、保守的置換の結果として)を有する、比較された配列中の残基が含まれる。陽性の%値は、BLOSUM62マトリックスにおいて陽性値を記録する残基を、上記に定義されるようなより長い配列中の残基の全数により割った分数により決定される。
【0012】
類似のやり方で、本明細書において同定されるDollポリペプチドのコーディング配列に関する「核酸配列同一性比率(%)」は、本発明のDollコーディング配列のいずれかにおけるヌクレオチド配列と同一である候補配列中のヌクレオチド残基の比率として定義される。本明細書に使用される同一性値は、デフォルト変数を設定したWU−BLAST−2のBLASTモジュールを使用して算出することが可能である。
【0013】
用語「エピトープタグ」は、「タグポリペプチド」へ融合したDollポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドへ言及する。タグポリペプチドは、それに対して抗体を作製することが可能であるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合するDollポリペプチドの活性には干渉しないほど十分に短い。
【0014】
核酸は、別の核酸配列と機能上の関連性があるように配置される場合、「機能可能的に連結」している。
【0015】
用語「エピスタシス」は、遺伝子作用におけるヒエラルキーを意味する。エピスタシス実験は、シグナル伝達経路の諸成分を正しい順序に置くために実施する。
【0016】
用語「レスキュー実験」は、どの遺伝子が特定の突然変異体の表現型の原因であるかを決定するために設計される。特に、突然変異体の胚にコーディング若しくはゲノムDNAを注射し、導入したDNAの効果を、突然変異体の表現型を復帰させる能力を基にして決定する。
【0017】
「活性の」又は「活性」は、生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するDollポリペプチドの諸形態へ言及する。好ましい活性には、例えば、Wntシグナル伝達経路を変調させる能力が含まれる。
【0018】
用語「アンタゴニスト」は、広い意味で使用され、本明細書に記載されるDollポリペプチドの生物学的活性を一部又は全部阻害する、阻止する、又は中和する分子が含まれる。同じように、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、活性Dollポリペプチドの生物学的活性を模倣するか又は支援する分子が含まれる。
【0019】
「処置」は、治療的処置と予防若しくは防止の手段の両方に言及し、ここでその目的は、標的となる病理学的状態若しくは障害を予防するか又は遅らせることである。処置の必要な人には、すでに障害のある人、並びに障害にかかりやすい人、又は障害を予防すべき人が含まれる。
【0020】
本発明は、以後「Daughter of Legless(Doll)」タンパク質と呼ぶ、昆虫及び脊椎動物の生物に存在する新規なタンパク質のファミリーに関する。これらのタンパク質は、Wntシグナル伝達経路において、従って、発生期の組織の空間配置及び増殖の形成及び維持において、そして多くのヒト腫瘍の形成及び増殖において、必須の役割を担っている。
【0021】
特に、本発明は、キイロショウジョウバエdoll遺伝子のヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質、並びにその断片、誘導体、そして機能及び構造の類似体に関する。
【0022】
好ましい態様において、本発明は、ヒト及びマウスのdoll相同体、それぞれhdoll−1、hdoll−2及びmdoll−1、mdoll−2のヌクレオチド及びタンパク質の配列に関する。
【0023】
1つの態様において、単離核酸は、(a)図1に示すDollポリペプチドの断片又は全タンパク質配列、又は(b)(a)をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、なおさらにより好ましくは少なくとも約98%の配列同一性、そして最も好ましくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【0024】
もう1つの態様において、単離核酸は、(a)図2a/bの部分若しくは全体のヒトDollポリペプチドであるポリペプチド、又は(b)(a)をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは約70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは約95%の配列同一性、なおさらにより好ましくは約98%の配列同一性、そして最も好ましくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【0025】
もう1つの態様において、単離核酸は、(a)図3a/bの全マウスDollタンパク質の一部をコードするポリペプチド、又は(b)(a)をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは約70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは約95%の配列同一性、なおさらにより好ましくは約98%の配列同一性、そして最も好ましくは100%の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードする。
【0026】
さらなる態様において、単離核酸は、低い全体アミノ酸配列同一性をもったポリペプチドをコードする配列を含むが、保存ドメインのDHD及びPHDにおいては、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、そして最も好ましくは100%の配列同一性を示す(図4)。
【0027】
本発明のなおもう1つの態様において、単離核酸は、doll遺伝子の機能に類似する機能を有するポリペプチドをコードする。
【0028】
もう1つの態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブとして適用される、ショウジョウバエ若しくは脊椎動物のdoll核酸配列の断片に関する。そのような核酸断片は、約20〜約100ヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜約60ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは20〜50ヌクレオチドの長さであり、図1、2、及び3に示すヌクレオチド配列に由来する。
【0029】
さらに本発明は、図1,2、及び3に示すようなショウジョウバエ若しくは脊椎動物のdoll又はその断片をコードする核酸分子を含んでなる、真核及び原核の発現ベクターを提供する。このベクターは、上記に記載される分子又はその断片のいずれも含むことが可能である。
【0030】
本発明にはまた、そのようなベクターを含んでなる宿主細胞が含まれる。例を挙げると、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は細菌細胞であり得る。
【0031】
例えば、組換え手段による、Dollタンパク質、誘導体、類似体の産生、単離、及び精製の方法も提供される(以下の実施例VIを参照のこと)。特定の側面において、本発明は、図1、2、及び3のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なお最も好ましくは100%の同一性のアミノ酸配列を含んでなる、単離Dollペプチドに関する。
【0032】
なおもう1つの態様において、本発明は、異種のポリペプチド若しくはアミノ酸配列へ融合したDollポリペプチドを含んでなるキメラタンパク質に関する。そのようなキメラ分子の例は、以下の実施例VIに記載されるように、エピトープタグ付き配列、グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質、又はβ−ガラクトシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような、酵素活性のあるタンパク質へ融合したDollポリペプチドを含む。
【0033】
さらなる側面において、本発明は、図1、2、及び3のアミノ酸配列を含んでなる、(実施例VIに記載のように調製した)単離された完全長Dollポリペプチド、又は抗Doll抗体へ結合部位を提供するのに十分な、本発明に記載の任意のDollポリペプチド、又はその断片に関する。
【0034】
もう1つの態様において、本発明は、Dollポリペプチドを特異的に認識する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル調製物、又はその断片であり得る。ポリクローナル抗体は、実施例VIに記載されるように調製した精製Dollポリペプチドを用いたウサギの免疫化により調製する。
【0035】
本発明はまた、トランス遺伝子を有するトランスジェニック動物(例、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジ)、例えば、本明細書に記載のDoll遺伝子の異種型を含み、好ましくは発現するか、又は内因性若しくはトランスジェニックdoll遺伝子を誤って発現する動物に関する。そのようなトランスジェニック動物は、Wntシグナル伝達経路が破壊された疾患を研究するためのモデルとして、Dollタンパク質の産生のため、又は薬物スクリーニングのために役立つことが可能である。
【0036】
なおもう1つの態様において、本発明はまた、doll遺伝子における突然変異、例えば欠失、点突然変異、異種DNA挿入、又は逆位を有する動物(例、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジ)を特徴とする。そのような動物は、破壊されたWnt機能により特徴づけられる疾患を研究するために、又は薬物スクリーニングにおいて役立つことが可能である。
【0037】
さらに、本発明は、Dollタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片、並びに核酸、その誘導体、及び断片の、治療及び診断の方法及び化合物における使用に関する。特に、本発明は、細胞の運命、分化、又は増殖の障害の、本発明の治療化合物の投与による処置のための方法及び化合物を提供する。そのような治療化合物には:ショウジョウバエ及び脊椎動物のDollタンパク質相同体又はその断片、それへの抗体又は抗体断片、dollアンチセンスDNA若しくはRNA、doll二本鎖RNA、及びDollの機能、合成、又は分解に干渉する化学的若しくは天然に存在する化合物が含まれる。特に、本発明は、Wnt経路においてDoll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドをスクリーニングする方法を提供する。好ましい態様において、スクリーニング方法は、細胞レポーター遺伝子アッセイ又はタンパク質−タンパク質相互作用アッセイであろう。
【0038】
もう1つの態様においては、タンパク質−タンパク質相互作用に基づいたスクリーニングアッセイを使用して、Doll−Lgs又はDoll−相互作用パートナーXを特異的に阻害する化合物をスクリーニングする。
【0039】
本発明はまた、Wnt経路においてDoll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
【0040】
さらに、本発明は、in vitroタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ、又は宿主細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用のようなスクリーニングアッセイにおけるDHDドメインの使用を含む。前記アッセイは、Wnt経路においてDoll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、ポリペプチド、又はペプチドの同定に適用される。
【0041】
好ましい態様において、本発明に記載の治療産物は、癌性状態を処置するか、又は前新生物若しくは非悪性状態から新生物若しくは悪性状態への進行を予防するために投与される。
【0042】
他の特定の態様において、本発明の治療産物は、血液疾患を処置するか、又は組織の再生及び修復を促進するために投与される。最後に、細胞運命の障害、特に、Dollタンパク質の異常であるか若しくは望まれない発現、又は局在化、又は活性が関与する、過剰増殖性若しくは低増殖性の障害は、そのようなレベルを検出することによって診断することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0043】
Wntシグナル伝達カスケードは、無脊椎動物と脊椎動物の両方の発生に必須であり、腫瘍形成に関係があるとされてきた。ショウジョウバエwg遺伝子は、100より多い遺伝子を含むWntタンパク質ファミリー内で最もよく特徴づけられた遺伝子の1つである。ショウジョウバエの胚において、wgは、パラセグメント境界の形成と隣接細胞におけるエングレイルド(en)発現の維持に要求される。wg機能の欠損した胚の表皮は、未発達の体節化しか示さず、これは異常な体表パターンに反映される。野生型幼虫の腹側の体表がむき出しの領域と交互に現れる歯状突起帯を示すのに対し、wg突然変異幼虫の体表は、歯状突起で完全に覆われる。成虫盤の発生の間、wgは、背−腹の位置情報を制御する。leg盤において、wgは、腹側の運命の誘導により将来の足をパターン化する(StruhlとBasler 1993)。wg活性が低下した動物では、足の腹側半分が背側の鏡像へ発達する(Baker 1988)。従って、低下したwg活性は、翅の胸背板組織へのトランシフォーメーションをもたらすので、この遺伝子の名称がある(SharmaとChopra 1976)。眼の盤においては、wgは頭部表皮の発達を優先して複眼分化を抑制し、眼の領域を通る背腹軸を確定させることに関与する(Heberlein,Borod et al.1998)。
【0044】
追加の遺伝子がWgシグナル伝達の分泌、受容、又は解釈に関係があるとされてきた。例えば、ショウジョウバエにおける遺伝研究は、frizzled(Dfz)、Dishevelled(dsh)、shaggy/zeste−white−3(sgg/zw−3)、armadillo(arm)、adenomatous polyposis coli(E−apc)、axin、及びpangolin(pan)のWgシグナル伝達における関与を明らかにした。これらトランスデューサーの遺伝子序列が確定されているが、そこでは、WgはDshを介してSggを阻害するように作用し、これによりSggによるArmの抑圧を解除し、Armの細胞質蓄積とその核への転座をもたらす。核において、ArmはPanと相互作用して標的遺伝子の転写を活性化する。これらの成分すべてについて、脊椎動物の相同体が同定されていて(更新された概説については、PeiferとPolakis 2000を参照のこと)、ショウジョウバエシグナル伝達経路の新規に同定されるメンバーに脊椎動物の対照物がある可能性があることを示唆する。
【0045】
結腸癌、乳癌、メラノーマ、肝細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、髄芽腫、毛基質細胞腫、及び前立腺癌を含む多くのタイプの癌には、Arm、β−カテニンの哺乳動物相同体の核蓄積、そして必然的に、Wnt経路の構成的な活性をもたらす突然変異が観察されている(Morin 1999;Polakis,Hart et al.1999)。β−カテニンシグナル伝達の脱調節(deregulation)がこれら悪性腫瘍の発生において重要なイベントであることは今や明らかである。しかしながら、それでも、β−カテニン転写活性化を有効に阻害する既知の治療薬剤はまだ存在していない。これは、一部は、その完全な活性化と核転座に要求される必須成分の多くが依然として不明であるという事実のためである。
【0046】
ウィングレス活性化に要求される新たな成分を同定するために、発明者たちは、ショウジョウバエの遺伝アプローチを使用して、ウィングレス(ショウジョウバエのWnt相同体)の眼発生の間の異所性発現により引き起こされるラフ眼表現型の優性サプレッサーをスクリーニングした。新たな遺伝子、レッグレス(lgs,米国09/915,543)を、ラフ眼表現型の強い優性サプレッサーとして同定した。引き続き、この遺伝子をクローニングして、それが胚と発生中の組織におけるWgシグナル伝達にin vivo で必須であることを確かめた。ヒトゲノムは、少なくとも2つのヒトLgs相同体、hLgs/Bc19及びhLgs−1を含有する。dLgsとhLgsは、Armadilloとβ−カテニンへ結合し、無脊椎動物及び脊椎動物の細胞におけるWntシグナル伝播に機能的に要求される(米国09/915,543)。特に、転写活性のArm/Pangolin複合体にはLgsの存在が要求され、Lgsの過剰発現は、この転写アウトプットを強く刺激する。
【0047】
後に、発明者たちは、β−カテニン相互作用ドメインが欠失しているLgsタンパク質の突然変異型が、野生型幼虫においてトランス遺伝子から発現されるときに、Wg依存性のパターン形成プロセスに対して強い優性ネガティブ効果を示すという興味深い観察をした(データ示さず)。このことは、Lgsが正常にはArmとだけでなく少なくとも1つの追加成分とも相互作用することを強く示唆した。そのような成分を同定しようとする努力において、相互作用するタンパク質について酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。Lgsの全タンパク質かN末端半分のいずれかを餌(bait)として使用する2つの独立したスクリーニングにおいて、Daughter−of−Legless(Doll)と呼ぶ新規のPHDフィンガータンパク質を、Lgs結合タンパク質として同定した(図4)。815アミノ酸残基のDollタンパク質は60アミノ酸のC末端ドメインを担い(図4a)、これはLAP(白血病関連タンパク質)ドメイン(Aasland,Gibson et al.1995)としても知られるPHD(植物相同性ドメイン)フィンガーに対して広範な相同性を示す。このドメインは、システインリッチのZn結合モチーフを含み、これはクロマチン仲介性の転写調節に関与するタンパク質と関連づけられてきた。DollのPHDフィンガーは、Lgsへの相互作用を仲介するのに必要であり十分である(図4c〜d)。発明者たちはまた、本明細書において、この相互作用がDoll機能に必須であることを明示する。
【0048】
Doll結合の原因となるLgsの領域をHD1配列にマップした(図4d)。さらに、ショウジョウバエdoll遺伝子の2つのヒト相同体を同定して単離した(図4a)。両方のヒト遺伝子,hDOLL−1及びhDOLL−2、並びにそれらのマウス相同体のタンパク産物は、hLgs/BCL9のHD1と相互作用する高度保存PHDフィンガーを保有する(図4d)。ショウジョウバエDoll、hDoll−1/hDoll−2、及びmDoll−1/mDoll−2において有意な配列相同性を示す他の唯一のドメインは、N末端領域にある50アミノ酸ストレッチであり、本明細書ではこれを「Doll相同性ドメイン」(DHD、図4a,b)と呼ぶ。
【0049】
HD1が欠失しているLgsの突然変異型はlgs突然変異動物をレスキューすることができなかったので、Dollとの相互作用はLgsの in vivo 機能に関連しているようである。DollとLgsの物理的な関連性は、Dollが、Lgsと同じように、in vivoでのWgシグナル伝達に要求される可能性があることを示唆した。この仮説を探究するために、sev−wg表現型のサプレッサーの専用コレクションを、doll遺伝子の位置である、第3染色体の右アームの先端に対してマップする突然変異について検索した。1つのそのようなサプレッサー、Sup130をこの位置に対してマップしたが、大変興味深いことに、それは、lgs対立遺伝子のlgs17Eと組み合わせると優性の致死性を示した(米国09/915,543)(Sup130/+lgs17E/+トランスヘテロ接合動物は生存しない)。ホモ接合Sup130突然変異幼虫由来のゲノムDNAを使用してdollコーディング領域を配列決定し、アミノ酸751位から始まる14bpの欠失を同定した。故に、この対立遺伝子はdoll130と呼ばれ、C末端PHDフィンガーを欠落する末端切断Dollタンパク質をコードする。
【0050】
ホモ接合doll130遺伝子型により引き起こされる致死性は、ショウジョウバエdoll遺伝子のコーディング領域又はその2つのヒト相同体hDoll−1及びhDoll−2のうち1つのそれのいずれかを含有するチューブリン1プロモーター推進トランス遺伝子により完全にレスキューすることが可能である(図7)。このように、dollの脊椎動物相同体がDollの真の機能性相同体であることを遺伝学的に確かめたので、この脊椎動物相同体は本発明の一部となる。
【0051】
発生期のWgシグナル伝達におけるDollの可能な役割をアッセイするために、dollについて等しく突然変異体である雌性生殖細胞に由来する、doll130突然変異についてホモ接合の胚を産生した。Doll mRNAは母方からもたらされ、すべての発生段階の間、強く、普遍的に発現されている。必然的に、胚と母方のdollの両方を欠落している胚だけが重篤なセグメントポラリティー表現型により特徴づけられ(図5A〜C)、一方、doll機能の欠失がより弱い突然変異体は、触角及び足が一部若しくは完全に損失した蛹の致死性を示す。接合機能のみを欠落する突然変異体の個体は初期蛹段階まで生存し、異常に小さい成虫盤を示す。これらの盤では、Hh標的遺伝子のptcが野生型レベルで発現されたが、Wg標的D11の発現は検出し得なかった(図5F〜I)。これらの盤は、推定の翅根フィールドを欠落するようであり、胸背板への2つの原基を保有する(図5G及びI)。wg、dsh、arm、又はlgsの機能の損失により同様の表現型が引き起こされるという事実により、Wgシグナル伝達経路におけるdollの必須の役割が確かめられる。
【0052】
β−カテニン仲介性の転写におけるDollの役割に取り組むために、不死化ヒト胚腎臓細胞(HEK293細胞)においてTCFレポーター遺伝子(TOPFLASH,(Morin,Sparks et al.1997))を使用した。安定した突然変異型の低レベルのβ−カテニン(ΔN−β−カテニン;(van de Wetering,Cavallo et al.1997))を上記の細胞に導入し、この経路を一部刺激した。hDoll−1(図8)又はhDoll−2(示さず)の追加の発現は、ルシフェラーゼ活性の大きな増加(30倍)をもたらす。これらのレベルは、一方の処置単独により産生されるレベルの合計より有意に高い(図8)。hDoll−1及び2によるβ−カテニン活性のこの効力増加は、内因性TCFタンパク質のそのDNA標的部位との相互作用により仲介されるようである。なぜなら、それは5つの最適TCF結合部位を含有するTOPFLASHでのみ観察され、5つの突然変異部位を含有する対照レポーターFOPFLASHでは観察されないからである(Morin,Sparks et al.1997)。このように、この実験は、Dollタンパク質がβ−カテニン依存的なやり方でTCF標的遺伝子を活性化させることによってWntシグナルを変換するという考え方への裏づけ証拠を加える。
【0053】
まとめると、ショウジョウバエのDoll及びLgs間で明示されたタンパク質−タンパク質相互作用とそのヒト相同体、ヒトDoll及びhLgs/Bc19間での相互作用は、それぞれ、遺伝子や細胞生物学のデータとともに、Dollタンパク質がそれぞれWg及びWntシグナル伝達経路の正のレギュレーターであることを示す。
【実施例】
【0054】
実施例I:doll cDNAの単離
ショウジョウバエcDNAライブラリーの、Lgsへ直接結合するタンパク質についての2つの独立した酵母遺伝子スクリーニングにおいて、Daughter of Legless(Doll)のcDNAを単離した。脊椎動物及び無脊椎動物の生物由来のゲノム及びcDNAライブラリーのような、他のDNAライブラリーも同様に使用可能である。酵母ツーハイブリッドスクリーニング以外の方法も同様に使用可能である。そのような方法には、限定されないが、遺伝子特異的プライマーを使用する直接増幅法と当業者に知られた標準法が含まれる。Lgsへ結合するタンパク質についての酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施するために、第一の732アミノ酸(「LgsN」)と1464アミノ酸の完全長タンパク質(「LgsFL」)をコードするcDNA配列を、酵母発現ベクター(pLexA,クローンテク)へサブクローニングし、それらをLexA
【0055】
DNA結合ドメインへ融合させた。引き続き、これらの構築体を、lacZ−レポータープラスミドpSH18−34と、酸性転写活性化ドメインへ融合したキイロショウジョウバエ胚性cDNAライブラリー(「RFLY−1」ライブラリー、PNAS93, 3011-3015)と一緒に、LEU2−レポーター酵母株EGY48へ入れて形質転換した。第一の工程において、LgsN−若しくはLgsFL−LexA−融合構築体をそれぞれ含有する三重形質転換体コロニー、pSH18−34レポーター、及びRFLY−1ライブラリープラスミドを、最少選択培地プレートで2日間増殖させ、採取し、徹底的に混合し、そして均一なアリコートして保存した。次いで、これらアリコートの1つからの細胞を許容ガラクトース/ラフィノース最少選択液体培地へ移し、振り混ぜながら30℃で数時間インキュベートし、それによりライブラリーcDNA―活性化ドメイン融合のGAL1−誘導プロモーターからの発現を誘導した。最後に、これらの「誘導された」細胞を、アミノ酸のl−ロイシンを欠くガラクトース/ラフィノース最少選択培地プレートにおいてプレート培養した。これらのプレートで細胞増殖が維持されるのは、それぞれのLexA−融合と活性化ドメイン−融合タンパク質との分子相互作用によりLEU2−セレクター遺伝子が活性化されるときだけである。LEU2−遺伝子は、ロイシンの他のアミノ酸前駆体からの生合成に必要とされる必須代謝酵素をコードする。これらの制限条件下で増殖するクローンをすべて単離し、腸内細菌E.coli由来の代謝酵素β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ−レポーター遺伝子の活性について、標準的なX−Galアッセイ(例、BartelとFields(編)、オックスフォードユニバーシティプレス、1997年)により分析した。上記2つの選択工程に合格したすべての候補クローンから、再び標準技術(例、「酵母遺伝学の方法」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1997年)によりcDNA−ライブラリープラスミドを単離し、無関係のLexA−融合タンパク質を陰性対照として使用して、Lgsとの特異的な相互作用をX−Galアッセイにおいて再試験した。この方法により、Lgsとのみ強力かつ特異的に相互作用し、一部重複する配列を含有する、3つの独立したcDNAクローン:BK12b、BK14b、及びTK5.35hを同定した。ショウジョウバエゲノムのデータベースを、blastnアルゴリズム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/)を使用して検索することによって、我々は、この3つの単離cDNAを長さ815アミノ酸のタンパク産物をコードするCG11518座へマップした。このcDNAクローンは、Dollタンパク質の異なる部分をコードしたが、BK12bは、コンピューター操作により予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)のヌクレオチド(nt)2223〜2448を、BK14bはnt2191〜2448を、そしてTK4.35hはnt749〜2448を含有していた。さらなるバイオインフォマティクス分析(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)により、このLgs結合クローンの3つすべてにおいて存在する、タンパク質配列のまさにC末端部分(ほぼ、アミノ酸745〜805)が、異なるレベルでの転写調節に関与する他のタンパク質において同定されている、PHDフィンガーフォールドに適合することが予測された。
【0056】
実施例II:ショウジョウバエDollのヒト及びマウス相同体の同定
ショウジョウバエDollアミノ酸配列の同定の後で、tblastnアルゴリズム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/)を使用して、他の種にある類似のタンパク質配列について、公的に利用可能なデータベースを検索した。それぞれ、Mus musculusとHomo sapiens由来のESTにおいて2つの候補配列をそれぞれ見出した。そのC末端ドメインにおいてDollとの高い類似性を示す推定タンパク産物である。これらの高い類似性のストレッチも、同様にPHDフィンガーフォールドに適合すると予測された(図4)。Dollタンパク質は、そのN末端配列において他の既知の構造モチーフを示さないが、それらは第二の高い相同性ドメインを示し、従って、これをDOLL相同性ドメイン(DHD)と命名した(図4)。無脊椎動物と脊椎動物の両方の起源のDollタンパク質はこれまでに詳しく記載されていないし、実験的に研究されてもいないので、これまでにある特定の生物学的プロセスとの関連が示唆されたこともない。
【0057】
実施例III:ショウジョウバエdoll対立遺伝子の単離及びマッピング
EMS処理オスを、2コピーのsevenlessエンハンサー(Basler,Christen et al.1991)により推進されるwgトランス遺伝子(sev−wg)を担うメスへ交配した。2x105の子孫についてラフ眼表現型のサプレッサーをスクリーニングした。第三染色体のサプレッサーを、P[y+]インサートのパネルを使用する減数分裂組換えにより粗くマップした。1つのそのようなサプレッサー、Sup130は、lgs対立遺伝子のlgs17E(米国09/915.543)との組み合わせにおいて、大変興味深いほどに優性の致死性を示し(Sup130/+lgs17E/+トランスヘテロ接合動物は生存しない)、緊密な遺伝子相互作用を強く示唆した。変性HPLC(WAVEシステム、トランスゲノミック社)を使用してこの突然変異を細かくマッピングすると、それがdoll遺伝子内に局在化することが実証された。故に、このdollコーディング領域を、ホモ接合Sup130突然変異幼虫からのゲノムDNAに由来するdollコーディング領域をカバーするPCR断片を使用して、配列決定した。Sup130における欠損は、アミノ酸751へ後続するフレームシフトを誘導し、未成熟の停止コドンの形成をもたらす、dollオープンリーディングフレーム内の14bp欠失(ヌクレオチド2253〜2266:5’CATGTGCCACAAGG3’)であることが判明した。故に、この対立遺伝子はdoll130と呼ばれ、C末端PHDフィンガーを欠落する末端切断Dollタンパク質をコードする。
【0058】
極細胞移植、染色体押しつぶし(squash)、及び染色体in situハイブリダイゼーションの実験は、標準プロトコール(Ashburner 1989)に従って行った。
【0059】
実施例IV:dollのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、dollの非反復ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。この方法は、他の生物においてdoll相同体をスクリーニングすることにも同様に適用可能である。(図1、2、3に示すような)dollの配列を含んでなるDNAを(cDNA若しくはゲノムライブラリーに含まれるような)相同体DNAをスクリーニングするためのプローブとして利用する。いずれかのライブラリーDNAを含有するフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を、標準的な高ストリンジェンシー条件(Sambrook,Fritsch et al.1989)の下で実施する。陽性クローンを使用して、より大きなcDNAライブラリー平板培養物(platings)をさらにスクリーニングすることが可能である。引き続き、代表的なcDNAクローンをpBluescript(ストラタジーン)又は類似のクローニングベクターへクローニングして、配列決定をする。
【0060】
実施例V:in situハイブリダイゼーション用ハイブリダイゼーションプローブとしてのdollの使用
ショウジョウバエdoll mRNAのin situハイブリダイゼーションは、(TautzとPfeifle 1989)に記載のように胚において実施することが可能である。しかしながら、わずかな変更を加えれば、それは、ショウジョウバエ幼虫の成虫盤や脊椎動物の組織切片において任意のmRNA転写物を検出するためにも使用可能である。標識化RNAプローブは、(図1、2、3に示されるような)直線化doll cDNA又はその断片から、DIG RNA標識化キット(SP6/T7)(ベーリンガーマンハイム)を製造業者の推奨に従って使用して、調製することが可能である。
【0061】
実施例VI:キイロショウジョウバエにおけるdollの発現
Dollは、ショウジョウバエにおいて、その全生物体において、特定の臓器において、又は特定の細胞型において、全生活の間か、又はある特定の発生段階のみに、そして様々なレベルで発現させることが可能である。ショウジョウバエの遺伝学において使用される標準法の概説は、(BrandとPerrimon 1993;Perrimon 1998;Perrimon 1998)に見出すことが可能である。
【0062】
doll突然変異胚の産生
FLP組換え酵素を介した部位特異的組換えを利用して、モザイク生殖系列を産生する(XuとRubin 1993)。遺伝子型hsp70:flp,FRT82 doll130/FRT82 ubi−GFPのメスを、第三齢幼虫期の間に、37℃で1時間熱ショック処理し、FLP指向性組換えを誘導してから、doll130/TM6b[y+]のオスと交配する。生殖系列モザイクが誘導される。組換え酵素の供給源は、hsp70プロモーター(「hsp70」により示される)のFLPコーディング配列への融合物の第一染色体インサートである。FRT82部位での体細胞組換えは成体メス生殖系列を生じさせるが、これは機能性dDollタンパク質の産生についての情報を接合からも母系貢献からも含有しない胚を受精時にもたらす卵細胞を産生する。これらの胚は、TM6b[y+]父方バランサー(balancer)染色体により提供される黄色+表現型の非存在によって同定することが可能である。分析のためには、標準技術により突然変異胚から体表を調製し、暗視野顕微鏡により検査する。
【0063】
dAPC2 doll二重突然変異生殖系列クローンは、FRT82 dAPC2 DS doll130染色体を用いて産生した。FRT82 ovoD1染色体(ChouとPerrimon 1996)を使用して、突然変異生殖細胞を選択した。また、FRT82 doll130染色体を使用して、FRT82 arm−lacZ染色体とともに、doll突然変異体クローンをディスク中に作製した。
【0064】
構成的に活性なArmを発現するdoll突然変異胚の産生
構成的に活性なArm(「ΔArm」)を発現させるために、上記に記載の遺伝子型のメスを後期蛹段階の間に37℃で1時間熱ショック処理し、遺伝子型UAS:ΔArm hsp70−Gal4/UAS:ΔArm hsp70−Gal4;doll/TM6b[y+]のオスへ交配する。追加のトランス遺伝子のこれらのオスにおける存在により、doll突然変異卵細胞及びdoll突然変異精子から生まれた子孫は、熱処理のときに、構成的に活性なArmタンパク質を発現し、これはウィングレス標的遺伝子を一過的に誘導した。
【0065】
実施例VII:hdoll−1及びhdoll−2 cDNA発現を用いたddoll−/−ハエのレスキュー
ショウジョウバエ及びヒトのDoll−1とヒトDoll−2との機能相同性を確かめるために、2つの突然変異体doll対立遺伝子を担うショウジョウバエ(ddoll−/−ハエ)へ、このヒト遺伝子を導入した。特に、例えば、tub:hdollトランス遺伝子と、2つの突然変異体doll対立遺伝子、例えばdoll130及びEP(3)1076(公的に利用可能)を担うハエを産生した。ddoll−/−突然変異体のハエは、幼虫若しくは蛹の致死性を示す。対照的に、少なくとも1つのコピーのtub:hdoll−1若しくはtub:hdoll−2トランス遺伝子を担うddoll−/−突然変異体のハエは、成虫まで生存する。このことは、hDoll−1とhDoll−2の両方が、ハエにおける内因性dDoll機能に置き換わることが可能であることを明示するので、ショウジョウバエ及びヒトのDollの間の機能相同性を証明する(図7)。
【0066】
実施例VIII:E.coliにおけるタンパク質産生とDollの精製
以下の方法は、細菌細胞におけるDollタンパク質の組換え発現を記載する。完全長若しくは末端切断型DollをコードするDNAを、例えば、エピトープタグ若しくはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)cDNAと、誘導可能細菌発現ベクター内に含まれるトロンビン若しくはエンテロキナーゼ切り離し部位の下流で融合させる。そのようなエピトープタグには、ポリ−his、S−タンパク質、チオレドキシン、及び免疫グロブリンのタグが含まれる。pGEX−4T(ファルマシア)若しくはpET−32a(ノヴァーゲン)のような市販のプラスミドを含む、多様なプラスミドを利用することが可能である。
【0067】
簡潔には、例えばGST配列へ融合したdoll配列を含有する細菌の発現プラスミドを、慣用法により、BL21(ストラタジーン)のようなプロテアーゼ欠損 E.coliへ入れて形質転換させる。次いで、このプラスミドを含有する細菌コロニーを、選択培地において、飽和に達するまで一晩増殖させる。翌朝、この培養物を100倍希釈し、0.6の光学密度(OD600)まで細菌を増殖させる。GST−Doll融合タンパク質がその下で発現されるプロモーターの誘導物質の添加により、タンパク質産生を開始する。使用する発現ベクターに依存して、IPTGを含む、多様な誘導物質が利用可能である。
【0068】
次いで、発現されたGSTタグ付きDollは、例えば、グルタチオンビーズ(ファルマシアから市販されている)のような、アフィニティービーズ又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製可能である。Doll発現細菌を音波処理緩衝液(10mM トリスHCl pH8.0,150mM NaCl,1mM EDTA,1.5% サルコシル、2% Triton−X−100,1mM DTT,及びプロテアーゼ阻害剤)において溶菌させることによって抽出物を調製した後で、氷上での短い音波処理(例えば、中位のパワーで20秒、3回)と遠心分離を行う。次いで、澄明な上清を、例えばグルタチオンビーズとともに、穏やかに回転させながら、4℃で1時間インキュベートする。次いで、洗浄緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM
【0069】
EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,0.5% NP40)においてビーズを数回洗浄し、最後に保存緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,10% グリセロール、0.5% NP40,及びプロテイナーゼ阻害剤)に保存する。
【0070】
他のやり方では、His−タグ付き、S−タンパク質、チオレドキシン、又はIgGタグ付きのDollを、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することが可能である。
【0071】
調製物の品質は、例えば、SDS−ゲル電気泳動と銀染色若しくはウェスタンブロットにより、チェックすることが可能である。
【0072】
エピトープタグを切り離さなければならない場合は、エピトープタグとDollタンパク質の間の切り離し部位の存在に依存して、いくつかの方法が利用可能である。例えば、第一のDollアミノ酸の直前にトロンビン切り離し部位を含有するGST−Doll融合タンパク質を産生することが可能である。簡潔には、グルタチオン−アフィニティービーズ上のGST−Doll調製物を、切り離し緩衝液(50mM トリスHCl pH7.0,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT)において数回洗浄する。次いで、トロンビンを加え、このサンプルを室温で16時間以上の間インキュベートする。次いで、上清を採取し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色若しくはウェスタンブロットにより、Dollのビーズからの成功した切り離しについて分析する。
【0073】
実施例IX:Dollが関与するタンパク質−タンパク質相互作用
GST−融合タンパク質in vitro結合アッセイを実施して、結合ドメインをマップし、追加の相互作用パートナーを見出すことが可能である。この目的のためには、[35S]メチオニンを含有する網状赤血球溶解液(例えば、TNT溶解液、プロメガ社)を製造業者により提供される指示書に従って使用して、タンパク質をin vitroで翻訳する。他のやり方では、培養細胞の[35S]メチオニンと一緒のインキュベーションにより、細胞タンパク質を標識化することが可能である。実施例VIIIに例示されるように産生した、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をグルタチオン−セファロースに固定化し、結合緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,10% グリセロール、0.5% NP40,0.05% BSA,及びプロテイナーゼ阻害剤)において45分間阻止する。次いで、2μgの固定化GSTタンパク質を、結合緩衝液中0.5〜6μlのin vitro翻訳タンパク質、又は[35S]メチオニン標識化細胞抽出物とともに1.5時間インキュベートする。このビーズを洗浄緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,0.5% NP40)において4回洗浄し、Laemmli SDSサンプル緩衝液において煮沸した。Dollへのタンパク質結合を、オートラジオグラフィーにより検出する。細胞溶解液を使用して新規のDoll結合パートナーを同定した場合は、ゲル上のタンパク質バンドを当技術分野において知られた方法により単離することが可能であり、タンパク質配列は、例えば質量分光測光分析により、決定することが可能である。
【0074】
酵母ツーハイブリッドアッセイを追加的に実施して、上記のin vitro結合アッセイの結果を確認するか、又は新たな結合パートナーについてcDNAライブラリーをスクリーニングすることが可能である(FieldsとSternglanz 1994)。この文脈においては、所望のcDNAを、Lex DNA結合ドメイン(例、pLexA,クローンテク)又は酸性活性化ドメイン(例、pGJ4−5,クローンテク)のいずれかへそれらを連結させる適正な酵母発現ベクター中へサブクローニングする。次いで、酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法により、この適正なプラスミドの対をレポータープラスミド(例、pSH18−34,クローンテク)と一緒に適正な酵母株(例、EGY48)へ入れて形質転換させ、選択培地で増殖させる(Sambrook,Fritsh et al.1989)。使用するベクター−レポータープラスミドの製造業者により記載されるように、形質転換体についてレポーター遺伝子活性を分析する。再現性を確立するために、この相互作用は両方向において試験する。他のやり方では、この方法を使用して新規Doll相互作用パートナーをスクリーニングする。この文脈においては、例えばpLexA−Dollを、上記のように、例えばpGJ4−5へクローニングされたcDNAライブラリーと一緒に酵母へトランスフェクトする。陽性クローンを単離することが可能であり、それらが含有するcDNAについて、当業者に知られた方法により配列決定することが可能である。
【0075】
実施例X:免疫組織化学
Dollタンパク質の位置決定は、本発明により提供される抗Doll抗体を使用して、ショウジョウバエ胚、成虫盤、無脊椎動物及び脊椎動物の生体組織断片、又は腫瘍細胞系について実施する。例えば、腫瘍細胞系を使用する場合、細胞は、ポリリジンでコートした8穴チャンバ(Nalge−Nunc Internat.)へ播き、37℃で一晩増殖させることが可能である。陽性対照として、293MEK細胞(ATCC)を、例えばリポフェクチン法(例、リポフェクタミン、ギブコテクノロジーズ)により、pcDNA3.1(インビトロゲン)のようなDoll発現プラスミドでトランスフェクトしてもよい。トランスフェクションから2日後、細胞を洗浄し、PBS中3.7%ホルムアルデヒドで10分間固定し、0.5% Triton−X−100においてさらに10分間透過させ、2% BSA−PBS中のプレ免疫血清の1000倍希釈液で、室温で1時間阻止する。次いで、細胞を抗Doll免疫血清の1000倍希釈液とともに室温で2時間インキュベートした後で、PBSにおいて洗浄し、抗ウサギ二次抗体で染色する。この洗浄工程を繰り返し、調製物を、PBS/0.1% Triton−X−100中3% BSAの溶液において1時間阻止する。次いで、このスライドをPBSにおいて5分間、3回洗浄し、TRITC共役ブタ抗ウサギ免疫グロブリン(Dako社)の200倍(v/v)希釈液とともにインキュベートする。この洗浄工程を繰り返してから、Vectashield(登録商標)マウント培地(ベクターラボラトリーズ社)を使用してカバースリップを付ける。β−カテニン、hLgs、又はTcfのような他のタンパク質の検出は、それぞれ、抗β−カテニン(市販)、抗hLgs(米国09/915.543)、又は抗Tcf(市販)特異抗体を使用して、同じやり方で実施することが可能である。
【0076】
実施例XI:ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Tcfトランス活性化活性に対するDollの効果は、Tcf応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用する細胞培養系において実施することが可能である。使用する発現ベクターに依存して、このプロトコールは、ショウジョウバエ細胞系だけでなく、哺乳動物にも適用可能である。例えば、HEK293細胞(ATCC)は、十分に適した系である。これによって、Doll完全長cDNAを、pcDNA3(インビトロゲン)のような哺乳動物発現ベクターへクローニングし、TOPFLASHルシフェラーゼレポータープラスミド(アップステートバイオテクノロジー、ニューヨーク、アメリカ)と一緒に293細胞へトランスフェクトする。リポフェクタミントランスフェクション試薬(ライフテクノロジーズ社)のようなリポフェクション剤がこの目的に使用可能である。レニラルシフェラーゼレポータープラスミド、例えばpRL−SV40(プロメガ・コーポレーション、マジソン、アメリカ)を同時トランスフェクトして、トランスフェクション効率を正規化する。トランスフェクションから48時間後に細胞抽出物を調製し、製造業者により記載されるようにして(二元ルシフェラーゼレポーターアッセイ系、プロメガ・コーポレーション)、ホタル及びレニラのルシフェラーゼ活性をアッセイする。すべてのルシフェラーゼ値をレニラルシフェラーゼ活性に対して正規化する(図8を参照のこと)。
【0077】
実施例XII:Doll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドのスクリーニング
実施例XIの記載に類似しているが、ハイスループットスクリーニングとして実施するためにスケールダウンしたプロトコールで、レポーター遺伝子アッセイを実施する。この目的のために、突然変異した、及び/又は構成的に活性なβ−カテニンを有する結腸癌細胞系を、実施例XIに記載のTopflashベクターとDoll cDNAで安定的にトランスフェクトする。最も信頼できる一定のレポーター遺伝子活性を与える安定したモノクローナル集団を、後のアッセイ用に選択する。プレート培養から1日後、化合物若しくはペプチドのライブラリーに由来する単一化合物で細胞を処理する。1〜24時間後、レポーター遺伝子の活性を測定する。次いで、レポーター遺伝子活性を阻害することが見出された化合物を、Doll含有転写複合体への比活性についてさらに特性決定する。他のやり方では、Wnt経路活性は、標的遺伝子、例えばmycのmRNA若しくはタンパク質レベルを検出することによって測定することが可能である(He,Sparks et al.1998)。
【0078】
実施例XIII:タンパク質−タンパク質相互作用に基づいた、Doll−Lgs若しくはDoll相互作用パートナーXを阻害する化合物のスクリーニングアッセイ
Dollとその相互作用パートナー又はその断片を、例えばE.coli培養物から(例えば、実施例VIIIに記載のように)産生して精製する。タンパク質は、例えば、6−ヒスチジン、S−タンパク質、GST、又はチオレドキシンでタグを付ける。精製したタンパク質の小アリコートを適正な結合緩衝液においてインキュベートする。この時点で、この混合物へ化学的化合物を加え、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊するその能力を、例えば以下に記載の方法のいずれかによりモニターする。引き続き、この相互作用を阻害する化合物について、その特異性とin vivo毒性を試験する。タンパク質−タンパク質相互作用をモニターするための十分確立した方法は、例えば以下である:
【0079】
・ランタニドキレート標識を用いる、時間分割フルオロメトリー(Hemmila IとWebb S.DDT 2:373-381(1997))。
・シンチレーション近似アッセイ(SPA)(アマーシャム・ライフサイエンス)。
・蛍光偏光法
【0080】
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【図面の簡単な説明】
【0081】
【図1】ショウジョウバエdollのcDNA及びタンパク質配列。
【図2】ヒトdoll−1及びdoll−2のcDNA及びタンパク質配列。
【図3】マウスdoll−1及びdoll−2のcDNA及びタンパク質配列。
【図4】ショウジョウバエ及びヒトのDollタンパク質は、PHDフィンガーモチーフを含有し、それによりそれらはLgs/BCL9のHD1へ結合する。 (A)上:Doll、ヒトDOLL−1、及びヒトDOLL−2の概略図。高い配列類似性を示す2つのドメインを暗い灰色(DHD:Doll相同性ドメイン)と赤色(PHD:植物相同性ドメイン)で強調する。DHDは、発明者が他のショウジョウバエ若しくはヒトのタンパク質に類似の配列を見出すことができなかったので、ユニークであるらしい。Doll、hDoll−1、hDoll−2のGenBank受入れ番号は、それぞれAF457206、AF457207、AF457208である。下:ショウジョウバエ、ヒト、及びマウスDollタンパク質配列の多重並置。 (B)Dollとそのヒト相同体におけるDHD及びPHDのアミノ酸配列の並置。類似部分を箱で囲み、同一部分は灰色で陰影をつける。左の数字はDHD及びPHDのそのそれぞれのタンパク質配列内での位置を示す。DHDの並置では、22のアミノ酸のギャップをショウジョウバエDHDに導入した((X)5として表す)。 (C)Lgs/BCL9相互作用部位のDollにおけるマッピング。酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、そのLgs及びBCL9との相互作用を試験したタンパク質の概略図。結果を右側に示す(「bdg」)。 (D)dLgs及びhLgs/BCL9におけるDoll相互作用部位のマッピング。酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、そのLgsとの相互作用を試験したタンパク質の概略図。下に示した2つのタンパク質を、プルダウンアッセイにより、dLgs(括弧なしの数字)及びhLgs/BCL9(括弧中の数字)の両方について試験し、同じ結果を得た(「bdg」)。HD1を除去する欠失部分は、Lgsではアミノ酸318〜345を、hLgs/BCL9ではアミノ酸177〜204を含む。使用した融合タンパク質は、S−タグ−dDoll(アミノ酸542〜815)とGST−hDOLL−2(アミノ酸301〜406)であった。
【図5】dollは、Wgシグナル伝達に要求されるセグメントポラリティー遺伝子である。 (A〜C)野生型(A)、wg突然変異体(B)、及びdoll突然変異体(C)の胚に由来する幼虫の体表調製物。(C)のdoll130/doll130胚は、ホモ接合doll130突然変異生殖系列クローンに由来し(実験方法を参照のこと)、wg様の表現型を示す。 (D,E)dAPC2の下流のdoll機能。母系接合の野生型dAPC2機能の非存在下に発生した幼虫に由来する2つの体表調製物を示す(McCartney et al.,1999)。(E)の胚は、さらに、dollの母系接合機能を欠いている(実施例を参照のこと)。強く抑制された歯状突起帯を有するdAPC単一突然変異動物とは対照的に、二重突然変異体は、doll様の表現型を示す。 (F−1)Doll(F,G)とPtc(H,I)に対する抗体で染色した、第三齢の翅(ウィング)の成虫盤調製物の共焦イメージ。野生型動物は、これらの遺伝子の正常は発現を示す(F,H)。doll130突然変異幼虫由来の盤は小さく、それでもPtc(I)を発現するが、D11(H)を発現し得ない。D11発現の欠落は、doll130幼虫におけるより早期の翅から胸背板へのトランスフォーメーションの間接的な結果である可能性がある。しかしながら、我々はまた、モザイク動物由来のdoll130突然変異細胞においてはD11発現の著しい低下を見ている(示さず)。
【図6】DollのLgs及びPHDフィンガーは、Doll及びArmを組立てることに役立つ。 lgs若しくはdoll突然変異動物をレスキューする能力を評価するトランス遺伝子アッセイに使用したLgs(黄色)及びDoll(明緑色)構築体の概略図。1:完全長Lgs(pOP216,アミノ酸1〜1464)。2:C末端先端切断Lgs(pTK131,アミノ酸1〜583)。3:HD1−Gal11−HD2(pTK153,アミノ酸268〜395(HD1)、アミノ酸369〜500(Gal11)、アミノ酸465〜596(HD2))。4:HD1−(HA)3−HD2(pTK143,アミノ酸268〜395(HD1)、アミノ酸465〜596(HD2))。5:完全長Doll(pTK56,アミノ酸1〜815)。6:Doll[DPHD]−HD2(pTK135,アミノ酸1〜740(Doll[DPHD]、アミノ酸483〜561(HD2))。トランス遺伝子1〜4は、lgs20Fホモ接合体をレスキューすることができる。トランス遺伝子3によりレスキューされた成体動物の例を右側に示す。トランス遺伝子5は、doll130ホモ接合体をレスキューすることができる。トランス遺伝子6は、lgs20Fホモ接合体だけでなくdoll130もレスキューすることができる(右側の写真)。
【図7】ヒトdollトランス遺伝子の発現による、ddoll−/−ハエのレスキュー。doll130/EP(3)1076遺伝子型により引き起こされる致死性は、ショウジョウバエdoll遺伝子のコーディング領域(示さず)又はその2つのヒト相同体hdoll−1及びhdoll−2のうち1つのそれのいずれかを含有するチューブリン1プロモーター推進トランス遺伝子により完全にレスキューすることが可能である。
【図8】ヒトDoll1及び2のTcf転写に及ぼす効果。293細胞を、指定のように、pTOPFLASH若しくはpFOPFLASHルシフェラーゼレポーターと様々なエフェクタープラスミドで一過的にトランスフェクトした。β−カテニンの構成活性型(ΔN−β−カテニン、50ng)又はヒトDoll−1若しくはhDoll−2(350ng)は、pTOPFLASHレポーターを活性化する。ヒトDollのΔN−β−カテニンとの同時トランスフェクションは、この応答を強く亢進させる。
【0001】
本発明は、ウィングレス・シグナル伝達経路の新規な必須下流成分に関する。特に、本発明は、キイロショウジョウバエのdaughter of legless(doll)遺伝子のヌクレオチド配列、そのコードされるタンパク質、並びにそれらの誘導体、断片、及び類似体に関する。本発明には、ショウジョウバエDoll遺伝子に類似したアミノ酸のストレッチを含有するタンパク質を含んでなる、脊椎動物及び無脊椎動物のDollタンパク質の相同体が含まれる。Dollタンパク質、誘導体、及び類似体を例えば組換え法により産生する方法と、Dollへの抗体も本発明により提供される。本発明はまた、Doll機能をWnt経路において変調させる化合物のハイスループットスクリーニングアッセイを実施する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Wnt遺伝子は、多種多様な生物学的プロセスにおける細胞間シグナル伝達分子として主要な役割を担う、大きなファミリーの分泌性システインリッチタンパク質をコードする(広範な概説については、WodarzとNusse 1998を参照のこと)。最初のWnt遺伝子、マウスwnt−1は、マウス乳房腫瘍ウイルスの乳房腫瘍における組込みにより活性化される癌原遺伝子として発見された(NusseとVarmus 1998)。必然的に、Wnt経路の癌における関与が広く研究されてきた。ショウジョウバエのポラリティー遺伝子、ウィングレス(wg)のwnt−1相同体としての同定(Cabrera,Alonso et al.1987;PerrimonとMahowald 1987;Rijse-wijk,Schuermann et al.1987)により、wnt遺伝子が重要な発生レギュレーターであることが明らかになった。このように、一見すると似ていないが、胚発生と発癌のような生物学的プロセスは、いずれも同一のシグナル伝達経路を介した細胞情報伝達に依存する。この経路の現行モデルにおいては、分泌されるWntタンパク質がFrizzle細胞表面受容体へ結合し、細胞質タンパク質のDishevelled(Dsh)を活性化する。するとDshは、プロテインキナーゼShaggy/GSK3、骨格タンパク質のAxin及びβ−カテニン、Armadilloの脊椎動物相同体を含む、いくつかのタンパク質の複合体へこのシグナルを伝達する。この複合体において、β−カテニンは、Sggによりリン酸化された後で分解の標的になる。Wntシグナル伝達と生じるSgg活性のダウンレギュレーションの後で、β−カテニン(又はそのショウジョウバエ相同体のArmadillo)は分解から逃れ、細胞質中に蓄積する。フリーの細胞質β−カテニンは依然として不明瞭な機序により核へ転座し、Tcf/Lefファミリーの転写因子へ結合することにより遺伝子転写を変調させる(Grosschedl R 1999)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
重要なトランスデューサーが絶えず抑制されているこの状況は、その阻害成分において突然変異をきわめて受けやすい。β−カテニン破壊複合体の3つの要素のいずれかの喪失は、β−カテニンレベルの増加、故にこの経路の構成的な活性化をもたらす。このことは、GSK−3機能の喪失と同時に細胞の生存能力を抑制する場合があるが、それはまた、APC及びAxinの場合のように、細胞運命の変化、非制御の増殖と腫瘍形成性の挙動をもたらすことも可能である(Barker N 1999;Morin 1999;Potter 1999;RooseとClevers 1999;WalzerとBienz 1999)。これらの有害な状況に対抗する試みは、β−カテニン−TCF複合体の形成を防止することか、又はその転写アクチベータ機能に干渉することのいずれかによってβ−カテニンの核活性を抑制することを目的としなければならない。
【0004】
今のところ、β−カテニン転写活性化を有効に阻害する既知の治療薬剤は存在しない。これは、一部は、その完全な活性化と核転座に要求される必須成分の多くが依然として不明であるという事実のためである。必然的に、これらのきわめて悪性の疾患に抗する有効な薬物を開発することを可能にするために、この経路についてより多くのことを理解することが要請されている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
ウィングレス活性化に要求される新規成分を同定するために、発明者たちは、ショウジョウバエの遺伝アプローチを使用して、ウィングレス(ショウジョウバエのWnt相同体)の眼発生の間の異所性発現により引き起こされるラフ眼表現型の優性サプレッサーをスクリーニングした。3つの遺伝子を同定した:β−カテニン相同体のarmadillo(arm)、tcf/lef−1相同体のpangolin(pan)、及び、完全に新しい遺伝子のレッグレス(lgs)である(米国09/915,543)。引き続き、このlgs遺伝子をクローニングして、それが胚と発生中の組織におけるウィングレスシグナル伝達にin vivoで必須であることを確かめた。転写活性のArm/Pangolin複合体にはLgsの存在が要求され、Lgsの過剰発現は、この二極(bipartite)転写因子の転写アウトプットを強く刺激する。ヒトゲノムは、少なくとも2つのヒトLgs相同体を含有する。そのうちの1つであるBc19は、以前からB細胞悪性腫瘍に関係があるとされてきた(Willis,Zalcberg et al,1998)。また、ヒト細胞においてdLgsとhLgsがArmadillo及びβ−カテニンへ結合し、Wntシグナル伝達に機能的に要求されることが遺伝学的に、そして生化学的に実証された。しかしながら、遺伝実験は、Lgsへ結合し、活性β−カテニン−Pangolin−Lgs複合体の機能に必須である第二のタンパク質の存在を強く示唆した。
【0006】
本発明は、Lgsへ結合してWntシグナル伝達に要求される、Daughter of Legless(Doll)と名付けた新規のショウジョウバエタンパク質のクローニング及び機能特性決定を記載する。さらに、本発明は、機能及び構造上のヒト及びマウス相同体の配列、並びに、Wnt経路においてDoll機能を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【0007】
諸定義
用語「Dollポリペプチド」、「Dollタンパク質」には、本明細書において使用される場合、ネーティブな無脊椎動物及び脊椎動物のDoll及びDoll変異体の配列(これは、本明細書においてさらに明確にされる)が含まれる。
【0008】
「野生型配列Doll」は、天然に由来のDollタンパク質と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。Dollのそのような野生型配列は、天然から単離することが可能であるか、又は組換え及び/又は合成の手段により産生することが可能である。用語「野生型配列Doll」には、特に、Dollの天然に存在する先端切断型、天然に存在する変異型(例、選択的にスプライスされた形)、及び天然に存在する対立遺伝子変異型が含まれる。本発明の1つの態様において、野生型Doll配列は、dDollのアミノ酸1〜815(図1)、又はhDoll−1の1〜419、又はhDoll−2の1〜406(図2)、又はmDoll−1の1〜417、又はmDoll−2の1〜407(図3)を含んでなる成熟若しくは完全長のDoll配列である。
【0009】
「Doll変異体」は、図1、2、及び3の野生型Dollタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約50%のアミノ酸配列同一性を有する、活性Dollを意味する。しかしながら、用語「Doll変異体」にはまた、Wnt経路におけるDollの機能的相同体も含まれる。
【0010】
本明細書において同定されるDoll配列に関する「アミノ酸配列同一性比率(%)」は、配列を並置して、必要ならば、最大の配列同一性比率を達成するためにギャップを導入し、そして保守的アミノ酸置換を配列同一性の一部とみなさない場合に、Doll配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。本明細書に使用される%同一性値は、(Tatusova TA 1999)から入手したWU−BLAST−2により生成することが可能である。WU−BLAST−2は、いくつかの検索変数を使用し、そのほとんどがデフォルト値を設定している。
【0011】
上記のように実施される配列比較の文脈において、用語「陽性」には、同一ではないが、類似の特性(例えば、保守的置換の結果として)を有する、比較された配列中の残基が含まれる。陽性の%値は、BLOSUM62マトリックスにおいて陽性値を記録する残基を、上記に定義されるようなより長い配列中の残基の全数により割った分数により決定される。
【0012】
類似のやり方で、本明細書において同定されるDollポリペプチドのコーディング配列に関する「核酸配列同一性比率(%)」は、本発明のDollコーディング配列のいずれかにおけるヌクレオチド配列と同一である候補配列中のヌクレオチド残基の比率として定義される。本明細書に使用される同一性値は、デフォルト変数を設定したWU−BLAST−2のBLASTモジュールを使用して算出することが可能である。
【0013】
用語「エピトープタグ」は、「タグポリペプチド」へ融合したDollポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドへ言及する。タグポリペプチドは、それに対して抗体を作製することが可能であるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合するDollポリペプチドの活性には干渉しないほど十分に短い。
【0014】
核酸は、別の核酸配列と機能上の関連性があるように配置される場合、「機能可能的に連結」している。
【0015】
用語「エピスタシス」は、遺伝子作用におけるヒエラルキーを意味する。エピスタシス実験は、シグナル伝達経路の諸成分を正しい順序に置くために実施する。
【0016】
用語「レスキュー実験」は、どの遺伝子が特定の突然変異体の表現型の原因であるかを決定するために設計される。特に、突然変異体の胚にコーディング若しくはゲノムDNAを注射し、導入したDNAの効果を、突然変異体の表現型を復帰させる能力を基にして決定する。
【0017】
「活性の」又は「活性」は、生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するDollポリペプチドの諸形態へ言及する。好ましい活性には、例えば、Wntシグナル伝達経路を変調させる能力が含まれる。
【0018】
用語「アンタゴニスト」は、広い意味で使用され、本明細書に記載されるDollポリペプチドの生物学的活性を一部又は全部阻害する、阻止する、又は中和する分子が含まれる。同じように、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で使用され、活性Dollポリペプチドの生物学的活性を模倣するか又は支援する分子が含まれる。
【0019】
「処置」は、治療的処置と予防若しくは防止の手段の両方に言及し、ここでその目的は、標的となる病理学的状態若しくは障害を予防するか又は遅らせることである。処置の必要な人には、すでに障害のある人、並びに障害にかかりやすい人、又は障害を予防すべき人が含まれる。
【0020】
本発明は、以後「Daughter of Legless(Doll)」タンパク質と呼ぶ、昆虫及び脊椎動物の生物に存在する新規なタンパク質のファミリーに関する。これらのタンパク質は、Wntシグナル伝達経路において、従って、発生期の組織の空間配置及び増殖の形成及び維持において、そして多くのヒト腫瘍の形成及び増殖において、必須の役割を担っている。
【0021】
特に、本発明は、キイロショウジョウバエdoll遺伝子のヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質、並びにその断片、誘導体、そして機能及び構造の類似体に関する。
【0022】
好ましい態様において、本発明は、ヒト及びマウスのdoll相同体、それぞれhdoll−1、hdoll−2及びmdoll−1、mdoll−2のヌクレオチド及びタンパク質の配列に関する。
【0023】
1つの態様において、単離核酸は、(a)図1に示すDollポリペプチドの断片又は全タンパク質配列、又は(b)(a)をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、なおさらにより好ましくは少なくとも約98%の配列同一性、そして最も好ましくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【0024】
もう1つの態様において、単離核酸は、(a)図2a/bの部分若しくは全体のヒトDollポリペプチドであるポリペプチド、又は(b)(a)をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは約70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは約95%の配列同一性、なおさらにより好ましくは約98%の配列同一性、そして最も好ましくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【0025】
もう1つの態様において、単離核酸は、(a)図3a/bの全マウスDollタンパク質の一部をコードするポリペプチド、又は(b)(a)をコードする核酸分子の相補体に対して、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは約70%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは約95%の配列同一性、なおさらにより好ましくは約98%の配列同一性、そして最も好ましくは100%の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードする。
【0026】
さらなる態様において、単離核酸は、低い全体アミノ酸配列同一性をもったポリペプチドをコードする配列を含むが、保存ドメインのDHD及びPHDにおいては、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、そして最も好ましくは100%の配列同一性を示す(図4)。
【0027】
本発明のなおもう1つの態様において、単離核酸は、doll遺伝子の機能に類似する機能を有するポリペプチドをコードする。
【0028】
もう1つの態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブとして適用される、ショウジョウバエ若しくは脊椎動物のdoll核酸配列の断片に関する。そのような核酸断片は、約20〜約100ヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜約60ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは20〜50ヌクレオチドの長さであり、図1、2、及び3に示すヌクレオチド配列に由来する。
【0029】
さらに本発明は、図1,2、及び3に示すようなショウジョウバエ若しくは脊椎動物のdoll又はその断片をコードする核酸分子を含んでなる、真核及び原核の発現ベクターを提供する。このベクターは、上記に記載される分子又はその断片のいずれも含むことが可能である。
【0030】
本発明にはまた、そのようなベクターを含んでなる宿主細胞が含まれる。例を挙げると、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は細菌細胞であり得る。
【0031】
例えば、組換え手段による、Dollタンパク質、誘導体、類似体の産生、単離、及び精製の方法も提供される(以下の実施例VIを参照のこと)。特定の側面において、本発明は、図1、2、及び3のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なお最も好ましくは100%の同一性のアミノ酸配列を含んでなる、単離Dollペプチドに関する。
【0032】
なおもう1つの態様において、本発明は、異種のポリペプチド若しくはアミノ酸配列へ融合したDollポリペプチドを含んでなるキメラタンパク質に関する。そのようなキメラ分子の例は、以下の実施例VIに記載されるように、エピトープタグ付き配列、グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質、又はβ−ガラクトシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような、酵素活性のあるタンパク質へ融合したDollポリペプチドを含む。
【0033】
さらなる側面において、本発明は、図1、2、及び3のアミノ酸配列を含んでなる、(実施例VIに記載のように調製した)単離された完全長Dollポリペプチド、又は抗Doll抗体へ結合部位を提供するのに十分な、本発明に記載の任意のDollポリペプチド、又はその断片に関する。
【0034】
もう1つの態様において、本発明は、Dollポリペプチドを特異的に認識する抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル調製物、又はその断片であり得る。ポリクローナル抗体は、実施例VIに記載されるように調製した精製Dollポリペプチドを用いたウサギの免疫化により調製する。
【0035】
本発明はまた、トランス遺伝子を有するトランスジェニック動物(例、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジ)、例えば、本明細書に記載のDoll遺伝子の異種型を含み、好ましくは発現するか、又は内因性若しくはトランスジェニックdoll遺伝子を誤って発現する動物に関する。そのようなトランスジェニック動物は、Wntシグナル伝達経路が破壊された疾患を研究するためのモデルとして、Dollタンパク質の産生のため、又は薬物スクリーニングのために役立つことが可能である。
【0036】
なおもう1つの態様において、本発明はまた、doll遺伝子における突然変異、例えば欠失、点突然変異、異種DNA挿入、又は逆位を有する動物(例、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジ)を特徴とする。そのような動物は、破壊されたWnt機能により特徴づけられる疾患を研究するために、又は薬物スクリーニングにおいて役立つことが可能である。
【0037】
さらに、本発明は、Dollタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片、並びに核酸、その誘導体、及び断片の、治療及び診断の方法及び化合物における使用に関する。特に、本発明は、細胞の運命、分化、又は増殖の障害の、本発明の治療化合物の投与による処置のための方法及び化合物を提供する。そのような治療化合物には:ショウジョウバエ及び脊椎動物のDollタンパク質相同体又はその断片、それへの抗体又は抗体断片、dollアンチセンスDNA若しくはRNA、doll二本鎖RNA、及びDollの機能、合成、又は分解に干渉する化学的若しくは天然に存在する化合物が含まれる。特に、本発明は、Wnt経路においてDoll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドをスクリーニングする方法を提供する。好ましい態様において、スクリーニング方法は、細胞レポーター遺伝子アッセイ又はタンパク質−タンパク質相互作用アッセイであろう。
【0038】
もう1つの態様においては、タンパク質−タンパク質相互作用に基づいたスクリーニングアッセイを使用して、Doll−Lgs又はDoll−相互作用パートナーXを特異的に阻害する化合物をスクリーニングする。
【0039】
本発明はまた、Wnt経路においてDoll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドをスクリーニングする方法を提供する。
【0040】
さらに、本発明は、in vitroタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ、又は宿主細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用のようなスクリーニングアッセイにおけるDHDドメインの使用を含む。前記アッセイは、Wnt経路においてDoll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、ポリペプチド、又はペプチドの同定に適用される。
【0041】
好ましい態様において、本発明に記載の治療産物は、癌性状態を処置するか、又は前新生物若しくは非悪性状態から新生物若しくは悪性状態への進行を予防するために投与される。
【0042】
他の特定の態様において、本発明の治療産物は、血液疾患を処置するか、又は組織の再生及び修復を促進するために投与される。最後に、細胞運命の障害、特に、Dollタンパク質の異常であるか若しくは望まれない発現、又は局在化、又は活性が関与する、過剰増殖性若しくは低増殖性の障害は、そのようなレベルを検出することによって診断することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0043】
Wntシグナル伝達カスケードは、無脊椎動物と脊椎動物の両方の発生に必須であり、腫瘍形成に関係があるとされてきた。ショウジョウバエwg遺伝子は、100より多い遺伝子を含むWntタンパク質ファミリー内で最もよく特徴づけられた遺伝子の1つである。ショウジョウバエの胚において、wgは、パラセグメント境界の形成と隣接細胞におけるエングレイルド(en)発現の維持に要求される。wg機能の欠損した胚の表皮は、未発達の体節化しか示さず、これは異常な体表パターンに反映される。野生型幼虫の腹側の体表がむき出しの領域と交互に現れる歯状突起帯を示すのに対し、wg突然変異幼虫の体表は、歯状突起で完全に覆われる。成虫盤の発生の間、wgは、背−腹の位置情報を制御する。leg盤において、wgは、腹側の運命の誘導により将来の足をパターン化する(StruhlとBasler 1993)。wg活性が低下した動物では、足の腹側半分が背側の鏡像へ発達する(Baker 1988)。従って、低下したwg活性は、翅の胸背板組織へのトランシフォーメーションをもたらすので、この遺伝子の名称がある(SharmaとChopra 1976)。眼の盤においては、wgは頭部表皮の発達を優先して複眼分化を抑制し、眼の領域を通る背腹軸を確定させることに関与する(Heberlein,Borod et al.1998)。
【0044】
追加の遺伝子がWgシグナル伝達の分泌、受容、又は解釈に関係があるとされてきた。例えば、ショウジョウバエにおける遺伝研究は、frizzled(Dfz)、Dishevelled(dsh)、shaggy/zeste−white−3(sgg/zw−3)、armadillo(arm)、adenomatous polyposis coli(E−apc)、axin、及びpangolin(pan)のWgシグナル伝達における関与を明らかにした。これらトランスデューサーの遺伝子序列が確定されているが、そこでは、WgはDshを介してSggを阻害するように作用し、これによりSggによるArmの抑圧を解除し、Armの細胞質蓄積とその核への転座をもたらす。核において、ArmはPanと相互作用して標的遺伝子の転写を活性化する。これらの成分すべてについて、脊椎動物の相同体が同定されていて(更新された概説については、PeiferとPolakis 2000を参照のこと)、ショウジョウバエシグナル伝達経路の新規に同定されるメンバーに脊椎動物の対照物がある可能性があることを示唆する。
【0045】
結腸癌、乳癌、メラノーマ、肝細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、髄芽腫、毛基質細胞腫、及び前立腺癌を含む多くのタイプの癌には、Arm、β−カテニンの哺乳動物相同体の核蓄積、そして必然的に、Wnt経路の構成的な活性をもたらす突然変異が観察されている(Morin 1999;Polakis,Hart et al.1999)。β−カテニンシグナル伝達の脱調節(deregulation)がこれら悪性腫瘍の発生において重要なイベントであることは今や明らかである。しかしながら、それでも、β−カテニン転写活性化を有効に阻害する既知の治療薬剤はまだ存在していない。これは、一部は、その完全な活性化と核転座に要求される必須成分の多くが依然として不明であるという事実のためである。
【0046】
ウィングレス活性化に要求される新たな成分を同定するために、発明者たちは、ショウジョウバエの遺伝アプローチを使用して、ウィングレス(ショウジョウバエのWnt相同体)の眼発生の間の異所性発現により引き起こされるラフ眼表現型の優性サプレッサーをスクリーニングした。新たな遺伝子、レッグレス(lgs,米国09/915,543)を、ラフ眼表現型の強い優性サプレッサーとして同定した。引き続き、この遺伝子をクローニングして、それが胚と発生中の組織におけるWgシグナル伝達にin vivo で必須であることを確かめた。ヒトゲノムは、少なくとも2つのヒトLgs相同体、hLgs/Bc19及びhLgs−1を含有する。dLgsとhLgsは、Armadilloとβ−カテニンへ結合し、無脊椎動物及び脊椎動物の細胞におけるWntシグナル伝播に機能的に要求される(米国09/915,543)。特に、転写活性のArm/Pangolin複合体にはLgsの存在が要求され、Lgsの過剰発現は、この転写アウトプットを強く刺激する。
【0047】
後に、発明者たちは、β−カテニン相互作用ドメインが欠失しているLgsタンパク質の突然変異型が、野生型幼虫においてトランス遺伝子から発現されるときに、Wg依存性のパターン形成プロセスに対して強い優性ネガティブ効果を示すという興味深い観察をした(データ示さず)。このことは、Lgsが正常にはArmとだけでなく少なくとも1つの追加成分とも相互作用することを強く示唆した。そのような成分を同定しようとする努力において、相互作用するタンパク質について酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。Lgsの全タンパク質かN末端半分のいずれかを餌(bait)として使用する2つの独立したスクリーニングにおいて、Daughter−of−Legless(Doll)と呼ぶ新規のPHDフィンガータンパク質を、Lgs結合タンパク質として同定した(図4)。815アミノ酸残基のDollタンパク質は60アミノ酸のC末端ドメインを担い(図4a)、これはLAP(白血病関連タンパク質)ドメイン(Aasland,Gibson et al.1995)としても知られるPHD(植物相同性ドメイン)フィンガーに対して広範な相同性を示す。このドメインは、システインリッチのZn結合モチーフを含み、これはクロマチン仲介性の転写調節に関与するタンパク質と関連づけられてきた。DollのPHDフィンガーは、Lgsへの相互作用を仲介するのに必要であり十分である(図4c〜d)。発明者たちはまた、本明細書において、この相互作用がDoll機能に必須であることを明示する。
【0048】
Doll結合の原因となるLgsの領域をHD1配列にマップした(図4d)。さらに、ショウジョウバエdoll遺伝子の2つのヒト相同体を同定して単離した(図4a)。両方のヒト遺伝子,hDOLL−1及びhDOLL−2、並びにそれらのマウス相同体のタンパク産物は、hLgs/BCL9のHD1と相互作用する高度保存PHDフィンガーを保有する(図4d)。ショウジョウバエDoll、hDoll−1/hDoll−2、及びmDoll−1/mDoll−2において有意な配列相同性を示す他の唯一のドメインは、N末端領域にある50アミノ酸ストレッチであり、本明細書ではこれを「Doll相同性ドメイン」(DHD、図4a,b)と呼ぶ。
【0049】
HD1が欠失しているLgsの突然変異型はlgs突然変異動物をレスキューすることができなかったので、Dollとの相互作用はLgsの in vivo 機能に関連しているようである。DollとLgsの物理的な関連性は、Dollが、Lgsと同じように、in vivoでのWgシグナル伝達に要求される可能性があることを示唆した。この仮説を探究するために、sev−wg表現型のサプレッサーの専用コレクションを、doll遺伝子の位置である、第3染色体の右アームの先端に対してマップする突然変異について検索した。1つのそのようなサプレッサー、Sup130をこの位置に対してマップしたが、大変興味深いことに、それは、lgs対立遺伝子のlgs17Eと組み合わせると優性の致死性を示した(米国09/915,543)(Sup130/+lgs17E/+トランスヘテロ接合動物は生存しない)。ホモ接合Sup130突然変異幼虫由来のゲノムDNAを使用してdollコーディング領域を配列決定し、アミノ酸751位から始まる14bpの欠失を同定した。故に、この対立遺伝子はdoll130と呼ばれ、C末端PHDフィンガーを欠落する末端切断Dollタンパク質をコードする。
【0050】
ホモ接合doll130遺伝子型により引き起こされる致死性は、ショウジョウバエdoll遺伝子のコーディング領域又はその2つのヒト相同体hDoll−1及びhDoll−2のうち1つのそれのいずれかを含有するチューブリン1プロモーター推進トランス遺伝子により完全にレスキューすることが可能である(図7)。このように、dollの脊椎動物相同体がDollの真の機能性相同体であることを遺伝学的に確かめたので、この脊椎動物相同体は本発明の一部となる。
【0051】
発生期のWgシグナル伝達におけるDollの可能な役割をアッセイするために、dollについて等しく突然変異体である雌性生殖細胞に由来する、doll130突然変異についてホモ接合の胚を産生した。Doll mRNAは母方からもたらされ、すべての発生段階の間、強く、普遍的に発現されている。必然的に、胚と母方のdollの両方を欠落している胚だけが重篤なセグメントポラリティー表現型により特徴づけられ(図5A〜C)、一方、doll機能の欠失がより弱い突然変異体は、触角及び足が一部若しくは完全に損失した蛹の致死性を示す。接合機能のみを欠落する突然変異体の個体は初期蛹段階まで生存し、異常に小さい成虫盤を示す。これらの盤では、Hh標的遺伝子のptcが野生型レベルで発現されたが、Wg標的D11の発現は検出し得なかった(図5F〜I)。これらの盤は、推定の翅根フィールドを欠落するようであり、胸背板への2つの原基を保有する(図5G及びI)。wg、dsh、arm、又はlgsの機能の損失により同様の表現型が引き起こされるという事実により、Wgシグナル伝達経路におけるdollの必須の役割が確かめられる。
【0052】
β−カテニン仲介性の転写におけるDollの役割に取り組むために、不死化ヒト胚腎臓細胞(HEK293細胞)においてTCFレポーター遺伝子(TOPFLASH,(Morin,Sparks et al.1997))を使用した。安定した突然変異型の低レベルのβ−カテニン(ΔN−β−カテニン;(van de Wetering,Cavallo et al.1997))を上記の細胞に導入し、この経路を一部刺激した。hDoll−1(図8)又はhDoll−2(示さず)の追加の発現は、ルシフェラーゼ活性の大きな増加(30倍)をもたらす。これらのレベルは、一方の処置単独により産生されるレベルの合計より有意に高い(図8)。hDoll−1及び2によるβ−カテニン活性のこの効力増加は、内因性TCFタンパク質のそのDNA標的部位との相互作用により仲介されるようである。なぜなら、それは5つの最適TCF結合部位を含有するTOPFLASHでのみ観察され、5つの突然変異部位を含有する対照レポーターFOPFLASHでは観察されないからである(Morin,Sparks et al.1997)。このように、この実験は、Dollタンパク質がβ−カテニン依存的なやり方でTCF標的遺伝子を活性化させることによってWntシグナルを変換するという考え方への裏づけ証拠を加える。
【0053】
まとめると、ショウジョウバエのDoll及びLgs間で明示されたタンパク質−タンパク質相互作用とそのヒト相同体、ヒトDoll及びhLgs/Bc19間での相互作用は、それぞれ、遺伝子や細胞生物学のデータとともに、Dollタンパク質がそれぞれWg及びWntシグナル伝達経路の正のレギュレーターであることを示す。
【実施例】
【0054】
実施例I:doll cDNAの単離
ショウジョウバエcDNAライブラリーの、Lgsへ直接結合するタンパク質についての2つの独立した酵母遺伝子スクリーニングにおいて、Daughter of Legless(Doll)のcDNAを単離した。脊椎動物及び無脊椎動物の生物由来のゲノム及びcDNAライブラリーのような、他のDNAライブラリーも同様に使用可能である。酵母ツーハイブリッドスクリーニング以外の方法も同様に使用可能である。そのような方法には、限定されないが、遺伝子特異的プライマーを使用する直接増幅法と当業者に知られた標準法が含まれる。Lgsへ結合するタンパク質についての酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施するために、第一の732アミノ酸(「LgsN」)と1464アミノ酸の完全長タンパク質(「LgsFL」)をコードするcDNA配列を、酵母発現ベクター(pLexA,クローンテク)へサブクローニングし、それらをLexA
【0055】
DNA結合ドメインへ融合させた。引き続き、これらの構築体を、lacZ−レポータープラスミドpSH18−34と、酸性転写活性化ドメインへ融合したキイロショウジョウバエ胚性cDNAライブラリー(「RFLY−1」ライブラリー、PNAS93, 3011-3015)と一緒に、LEU2−レポーター酵母株EGY48へ入れて形質転換した。第一の工程において、LgsN−若しくはLgsFL−LexA−融合構築体をそれぞれ含有する三重形質転換体コロニー、pSH18−34レポーター、及びRFLY−1ライブラリープラスミドを、最少選択培地プレートで2日間増殖させ、採取し、徹底的に混合し、そして均一なアリコートして保存した。次いで、これらアリコートの1つからの細胞を許容ガラクトース/ラフィノース最少選択液体培地へ移し、振り混ぜながら30℃で数時間インキュベートし、それによりライブラリーcDNA―活性化ドメイン融合のGAL1−誘導プロモーターからの発現を誘導した。最後に、これらの「誘導された」細胞を、アミノ酸のl−ロイシンを欠くガラクトース/ラフィノース最少選択培地プレートにおいてプレート培養した。これらのプレートで細胞増殖が維持されるのは、それぞれのLexA−融合と活性化ドメイン−融合タンパク質との分子相互作用によりLEU2−セレクター遺伝子が活性化されるときだけである。LEU2−遺伝子は、ロイシンの他のアミノ酸前駆体からの生合成に必要とされる必須代謝酵素をコードする。これらの制限条件下で増殖するクローンをすべて単離し、腸内細菌E.coli由来の代謝酵素β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ−レポーター遺伝子の活性について、標準的なX−Galアッセイ(例、BartelとFields(編)、オックスフォードユニバーシティプレス、1997年)により分析した。上記2つの選択工程に合格したすべての候補クローンから、再び標準技術(例、「酵母遺伝学の方法」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1997年)によりcDNA−ライブラリープラスミドを単離し、無関係のLexA−融合タンパク質を陰性対照として使用して、Lgsとの特異的な相互作用をX−Galアッセイにおいて再試験した。この方法により、Lgsとのみ強力かつ特異的に相互作用し、一部重複する配列を含有する、3つの独立したcDNAクローン:BK12b、BK14b、及びTK5.35hを同定した。ショウジョウバエゲノムのデータベースを、blastnアルゴリズム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/)を使用して検索することによって、我々は、この3つの単離cDNAを長さ815アミノ酸のタンパク産物をコードするCG11518座へマップした。このcDNAクローンは、Dollタンパク質の異なる部分をコードしたが、BK12bは、コンピューター操作により予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)のヌクレオチド(nt)2223〜2448を、BK14bはnt2191〜2448を、そしてTK4.35hはnt749〜2448を含有していた。さらなるバイオインフォマティクス分析(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)により、このLgs結合クローンの3つすべてにおいて存在する、タンパク質配列のまさにC末端部分(ほぼ、アミノ酸745〜805)が、異なるレベルでの転写調節に関与する他のタンパク質において同定されている、PHDフィンガーフォールドに適合することが予測された。
【0056】
実施例II:ショウジョウバエDollのヒト及びマウス相同体の同定
ショウジョウバエDollアミノ酸配列の同定の後で、tblastnアルゴリズム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/)を使用して、他の種にある類似のタンパク質配列について、公的に利用可能なデータベースを検索した。それぞれ、Mus musculusとHomo sapiens由来のESTにおいて2つの候補配列をそれぞれ見出した。そのC末端ドメインにおいてDollとの高い類似性を示す推定タンパク産物である。これらの高い類似性のストレッチも、同様にPHDフィンガーフォールドに適合すると予測された(図4)。Dollタンパク質は、そのN末端配列において他の既知の構造モチーフを示さないが、それらは第二の高い相同性ドメインを示し、従って、これをDOLL相同性ドメイン(DHD)と命名した(図4)。無脊椎動物と脊椎動物の両方の起源のDollタンパク質はこれまでに詳しく記載されていないし、実験的に研究されてもいないので、これまでにある特定の生物学的プロセスとの関連が示唆されたこともない。
【0057】
実施例III:ショウジョウバエdoll対立遺伝子の単離及びマッピング
EMS処理オスを、2コピーのsevenlessエンハンサー(Basler,Christen et al.1991)により推進されるwgトランス遺伝子(sev−wg)を担うメスへ交配した。2x105の子孫についてラフ眼表現型のサプレッサーをスクリーニングした。第三染色体のサプレッサーを、P[y+]インサートのパネルを使用する減数分裂組換えにより粗くマップした。1つのそのようなサプレッサー、Sup130は、lgs対立遺伝子のlgs17E(米国09/915.543)との組み合わせにおいて、大変興味深いほどに優性の致死性を示し(Sup130/+lgs17E/+トランスヘテロ接合動物は生存しない)、緊密な遺伝子相互作用を強く示唆した。変性HPLC(WAVEシステム、トランスゲノミック社)を使用してこの突然変異を細かくマッピングすると、それがdoll遺伝子内に局在化することが実証された。故に、このdollコーディング領域を、ホモ接合Sup130突然変異幼虫からのゲノムDNAに由来するdollコーディング領域をカバーするPCR断片を使用して、配列決定した。Sup130における欠損は、アミノ酸751へ後続するフレームシフトを誘導し、未成熟の停止コドンの形成をもたらす、dollオープンリーディングフレーム内の14bp欠失(ヌクレオチド2253〜2266:5’CATGTGCCACAAGG3’)であることが判明した。故に、この対立遺伝子はdoll130と呼ばれ、C末端PHDフィンガーを欠落する末端切断Dollタンパク質をコードする。
【0058】
極細胞移植、染色体押しつぶし(squash)、及び染色体in situハイブリダイゼーションの実験は、標準プロトコール(Ashburner 1989)に従って行った。
【0059】
実施例IV:dollのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、dollの非反復ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。この方法は、他の生物においてdoll相同体をスクリーニングすることにも同様に適用可能である。(図1、2、3に示すような)dollの配列を含んでなるDNAを(cDNA若しくはゲノムライブラリーに含まれるような)相同体DNAをスクリーニングするためのプローブとして利用する。いずれかのライブラリーDNAを含有するフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を、標準的な高ストリンジェンシー条件(Sambrook,Fritsch et al.1989)の下で実施する。陽性クローンを使用して、より大きなcDNAライブラリー平板培養物(platings)をさらにスクリーニングすることが可能である。引き続き、代表的なcDNAクローンをpBluescript(ストラタジーン)又は類似のクローニングベクターへクローニングして、配列決定をする。
【0060】
実施例V:in situハイブリダイゼーション用ハイブリダイゼーションプローブとしてのdollの使用
ショウジョウバエdoll mRNAのin situハイブリダイゼーションは、(TautzとPfeifle 1989)に記載のように胚において実施することが可能である。しかしながら、わずかな変更を加えれば、それは、ショウジョウバエ幼虫の成虫盤や脊椎動物の組織切片において任意のmRNA転写物を検出するためにも使用可能である。標識化RNAプローブは、(図1、2、3に示されるような)直線化doll cDNA又はその断片から、DIG RNA標識化キット(SP6/T7)(ベーリンガーマンハイム)を製造業者の推奨に従って使用して、調製することが可能である。
【0061】
実施例VI:キイロショウジョウバエにおけるdollの発現
Dollは、ショウジョウバエにおいて、その全生物体において、特定の臓器において、又は特定の細胞型において、全生活の間か、又はある特定の発生段階のみに、そして様々なレベルで発現させることが可能である。ショウジョウバエの遺伝学において使用される標準法の概説は、(BrandとPerrimon 1993;Perrimon 1998;Perrimon 1998)に見出すことが可能である。
【0062】
doll突然変異胚の産生
FLP組換え酵素を介した部位特異的組換えを利用して、モザイク生殖系列を産生する(XuとRubin 1993)。遺伝子型hsp70:flp,FRT82 doll130/FRT82 ubi−GFPのメスを、第三齢幼虫期の間に、37℃で1時間熱ショック処理し、FLP指向性組換えを誘導してから、doll130/TM6b[y+]のオスと交配する。生殖系列モザイクが誘導される。組換え酵素の供給源は、hsp70プロモーター(「hsp70」により示される)のFLPコーディング配列への融合物の第一染色体インサートである。FRT82部位での体細胞組換えは成体メス生殖系列を生じさせるが、これは機能性dDollタンパク質の産生についての情報を接合からも母系貢献からも含有しない胚を受精時にもたらす卵細胞を産生する。これらの胚は、TM6b[y+]父方バランサー(balancer)染色体により提供される黄色+表現型の非存在によって同定することが可能である。分析のためには、標準技術により突然変異胚から体表を調製し、暗視野顕微鏡により検査する。
【0063】
dAPC2 doll二重突然変異生殖系列クローンは、FRT82 dAPC2 DS doll130染色体を用いて産生した。FRT82 ovoD1染色体(ChouとPerrimon 1996)を使用して、突然変異生殖細胞を選択した。また、FRT82 doll130染色体を使用して、FRT82 arm−lacZ染色体とともに、doll突然変異体クローンをディスク中に作製した。
【0064】
構成的に活性なArmを発現するdoll突然変異胚の産生
構成的に活性なArm(「ΔArm」)を発現させるために、上記に記載の遺伝子型のメスを後期蛹段階の間に37℃で1時間熱ショック処理し、遺伝子型UAS:ΔArm hsp70−Gal4/UAS:ΔArm hsp70−Gal4;doll/TM6b[y+]のオスへ交配する。追加のトランス遺伝子のこれらのオスにおける存在により、doll突然変異卵細胞及びdoll突然変異精子から生まれた子孫は、熱処理のときに、構成的に活性なArmタンパク質を発現し、これはウィングレス標的遺伝子を一過的に誘導した。
【0065】
実施例VII:hdoll−1及びhdoll−2 cDNA発現を用いたddoll−/−ハエのレスキュー
ショウジョウバエ及びヒトのDoll−1とヒトDoll−2との機能相同性を確かめるために、2つの突然変異体doll対立遺伝子を担うショウジョウバエ(ddoll−/−ハエ)へ、このヒト遺伝子を導入した。特に、例えば、tub:hdollトランス遺伝子と、2つの突然変異体doll対立遺伝子、例えばdoll130及びEP(3)1076(公的に利用可能)を担うハエを産生した。ddoll−/−突然変異体のハエは、幼虫若しくは蛹の致死性を示す。対照的に、少なくとも1つのコピーのtub:hdoll−1若しくはtub:hdoll−2トランス遺伝子を担うddoll−/−突然変異体のハエは、成虫まで生存する。このことは、hDoll−1とhDoll−2の両方が、ハエにおける内因性dDoll機能に置き換わることが可能であることを明示するので、ショウジョウバエ及びヒトのDollの間の機能相同性を証明する(図7)。
【0066】
実施例VIII:E.coliにおけるタンパク質産生とDollの精製
以下の方法は、細菌細胞におけるDollタンパク質の組換え発現を記載する。完全長若しくは末端切断型DollをコードするDNAを、例えば、エピトープタグ若しくはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)cDNAと、誘導可能細菌発現ベクター内に含まれるトロンビン若しくはエンテロキナーゼ切り離し部位の下流で融合させる。そのようなエピトープタグには、ポリ−his、S−タンパク質、チオレドキシン、及び免疫グロブリンのタグが含まれる。pGEX−4T(ファルマシア)若しくはpET−32a(ノヴァーゲン)のような市販のプラスミドを含む、多様なプラスミドを利用することが可能である。
【0067】
簡潔には、例えばGST配列へ融合したdoll配列を含有する細菌の発現プラスミドを、慣用法により、BL21(ストラタジーン)のようなプロテアーゼ欠損 E.coliへ入れて形質転換させる。次いで、このプラスミドを含有する細菌コロニーを、選択培地において、飽和に達するまで一晩増殖させる。翌朝、この培養物を100倍希釈し、0.6の光学密度(OD600)まで細菌を増殖させる。GST−Doll融合タンパク質がその下で発現されるプロモーターの誘導物質の添加により、タンパク質産生を開始する。使用する発現ベクターに依存して、IPTGを含む、多様な誘導物質が利用可能である。
【0068】
次いで、発現されたGSTタグ付きDollは、例えば、グルタチオンビーズ(ファルマシアから市販されている)のような、アフィニティービーズ又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製可能である。Doll発現細菌を音波処理緩衝液(10mM トリスHCl pH8.0,150mM NaCl,1mM EDTA,1.5% サルコシル、2% Triton−X−100,1mM DTT,及びプロテアーゼ阻害剤)において溶菌させることによって抽出物を調製した後で、氷上での短い音波処理(例えば、中位のパワーで20秒、3回)と遠心分離を行う。次いで、澄明な上清を、例えばグルタチオンビーズとともに、穏やかに回転させながら、4℃で1時間インキュベートする。次いで、洗浄緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM
【0069】
EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,0.5% NP40)においてビーズを数回洗浄し、最後に保存緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,10% グリセロール、0.5% NP40,及びプロテイナーゼ阻害剤)に保存する。
【0070】
他のやり方では、His−タグ付き、S−タンパク質、チオレドキシン、又はIgGタグ付きのDollを、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することが可能である。
【0071】
調製物の品質は、例えば、SDS−ゲル電気泳動と銀染色若しくはウェスタンブロットにより、チェックすることが可能である。
【0072】
エピトープタグを切り離さなければならない場合は、エピトープタグとDollタンパク質の間の切り離し部位の存在に依存して、いくつかの方法が利用可能である。例えば、第一のDollアミノ酸の直前にトロンビン切り離し部位を含有するGST−Doll融合タンパク質を産生することが可能である。簡潔には、グルタチオン−アフィニティービーズ上のGST−Doll調製物を、切り離し緩衝液(50mM トリスHCl pH7.0,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT)において数回洗浄する。次いで、トロンビンを加え、このサンプルを室温で16時間以上の間インキュベートする。次いで、上清を採取し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色若しくはウェスタンブロットにより、Dollのビーズからの成功した切り離しについて分析する。
【0073】
実施例IX:Dollが関与するタンパク質−タンパク質相互作用
GST−融合タンパク質in vitro結合アッセイを実施して、結合ドメインをマップし、追加の相互作用パートナーを見出すことが可能である。この目的のためには、[35S]メチオニンを含有する網状赤血球溶解液(例えば、TNT溶解液、プロメガ社)を製造業者により提供される指示書に従って使用して、タンパク質をin vitroで翻訳する。他のやり方では、培養細胞の[35S]メチオニンと一緒のインキュベーションにより、細胞タンパク質を標識化することが可能である。実施例VIIIに例示されるように産生した、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質をグルタチオン−セファロースに固定化し、結合緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,10% グリセロール、0.5% NP40,0.05% BSA,及びプロテイナーゼ阻害剤)において45分間阻止する。次いで、2μgの固定化GSTタンパク質を、結合緩衝液中0.5〜6μlのin vitro翻訳タンパク質、又は[35S]メチオニン標識化細胞抽出物とともに1.5時間インキュベートする。このビーズを洗浄緩衝液(20mM トリス pH8.0,200mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,1mM MgCl2,0.5% NP40)において4回洗浄し、Laemmli SDSサンプル緩衝液において煮沸した。Dollへのタンパク質結合を、オートラジオグラフィーにより検出する。細胞溶解液を使用して新規のDoll結合パートナーを同定した場合は、ゲル上のタンパク質バンドを当技術分野において知られた方法により単離することが可能であり、タンパク質配列は、例えば質量分光測光分析により、決定することが可能である。
【0074】
酵母ツーハイブリッドアッセイを追加的に実施して、上記のin vitro結合アッセイの結果を確認するか、又は新たな結合パートナーについてcDNAライブラリーをスクリーニングすることが可能である(FieldsとSternglanz 1994)。この文脈においては、所望のcDNAを、Lex DNA結合ドメイン(例、pLexA,クローンテク)又は酸性活性化ドメイン(例、pGJ4−5,クローンテク)のいずれかへそれらを連結させる適正な酵母発現ベクター中へサブクローニングする。次いで、酢酸リチウム−ポリエチレングリコール法により、この適正なプラスミドの対をレポータープラスミド(例、pSH18−34,クローンテク)と一緒に適正な酵母株(例、EGY48)へ入れて形質転換させ、選択培地で増殖させる(Sambrook,Fritsh et al.1989)。使用するベクター−レポータープラスミドの製造業者により記載されるように、形質転換体についてレポーター遺伝子活性を分析する。再現性を確立するために、この相互作用は両方向において試験する。他のやり方では、この方法を使用して新規Doll相互作用パートナーをスクリーニングする。この文脈においては、例えばpLexA−Dollを、上記のように、例えばpGJ4−5へクローニングされたcDNAライブラリーと一緒に酵母へトランスフェクトする。陽性クローンを単離することが可能であり、それらが含有するcDNAについて、当業者に知られた方法により配列決定することが可能である。
【0075】
実施例X:免疫組織化学
Dollタンパク質の位置決定は、本発明により提供される抗Doll抗体を使用して、ショウジョウバエ胚、成虫盤、無脊椎動物及び脊椎動物の生体組織断片、又は腫瘍細胞系について実施する。例えば、腫瘍細胞系を使用する場合、細胞は、ポリリジンでコートした8穴チャンバ(Nalge−Nunc Internat.)へ播き、37℃で一晩増殖させることが可能である。陽性対照として、293MEK細胞(ATCC)を、例えばリポフェクチン法(例、リポフェクタミン、ギブコテクノロジーズ)により、pcDNA3.1(インビトロゲン)のようなDoll発現プラスミドでトランスフェクトしてもよい。トランスフェクションから2日後、細胞を洗浄し、PBS中3.7%ホルムアルデヒドで10分間固定し、0.5% Triton−X−100においてさらに10分間透過させ、2% BSA−PBS中のプレ免疫血清の1000倍希釈液で、室温で1時間阻止する。次いで、細胞を抗Doll免疫血清の1000倍希釈液とともに室温で2時間インキュベートした後で、PBSにおいて洗浄し、抗ウサギ二次抗体で染色する。この洗浄工程を繰り返し、調製物を、PBS/0.1% Triton−X−100中3% BSAの溶液において1時間阻止する。次いで、このスライドをPBSにおいて5分間、3回洗浄し、TRITC共役ブタ抗ウサギ免疫グロブリン(Dako社)の200倍(v/v)希釈液とともにインキュベートする。この洗浄工程を繰り返してから、Vectashield(登録商標)マウント培地(ベクターラボラトリーズ社)を使用してカバースリップを付ける。β−カテニン、hLgs、又はTcfのような他のタンパク質の検出は、それぞれ、抗β−カテニン(市販)、抗hLgs(米国09/915.543)、又は抗Tcf(市販)特異抗体を使用して、同じやり方で実施することが可能である。
【0076】
実施例XI:ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Tcfトランス活性化活性に対するDollの効果は、Tcf応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用する細胞培養系において実施することが可能である。使用する発現ベクターに依存して、このプロトコールは、ショウジョウバエ細胞系だけでなく、哺乳動物にも適用可能である。例えば、HEK293細胞(ATCC)は、十分に適した系である。これによって、Doll完全長cDNAを、pcDNA3(インビトロゲン)のような哺乳動物発現ベクターへクローニングし、TOPFLASHルシフェラーゼレポータープラスミド(アップステートバイオテクノロジー、ニューヨーク、アメリカ)と一緒に293細胞へトランスフェクトする。リポフェクタミントランスフェクション試薬(ライフテクノロジーズ社)のようなリポフェクション剤がこの目的に使用可能である。レニラルシフェラーゼレポータープラスミド、例えばpRL−SV40(プロメガ・コーポレーション、マジソン、アメリカ)を同時トランスフェクトして、トランスフェクション効率を正規化する。トランスフェクションから48時間後に細胞抽出物を調製し、製造業者により記載されるようにして(二元ルシフェラーゼレポーターアッセイ系、プロメガ・コーポレーション)、ホタル及びレニラのルシフェラーゼ活性をアッセイする。すべてのルシフェラーゼ値をレニラルシフェラーゼ活性に対して正規化する(図8を参照のこと)。
【0077】
実施例XII:Doll機能に干渉する化学的化合物、有機産物、又はペプチドのスクリーニング
実施例XIの記載に類似しているが、ハイスループットスクリーニングとして実施するためにスケールダウンしたプロトコールで、レポーター遺伝子アッセイを実施する。この目的のために、突然変異した、及び/又は構成的に活性なβ−カテニンを有する結腸癌細胞系を、実施例XIに記載のTopflashベクターとDoll cDNAで安定的にトランスフェクトする。最も信頼できる一定のレポーター遺伝子活性を与える安定したモノクローナル集団を、後のアッセイ用に選択する。プレート培養から1日後、化合物若しくはペプチドのライブラリーに由来する単一化合物で細胞を処理する。1〜24時間後、レポーター遺伝子の活性を測定する。次いで、レポーター遺伝子活性を阻害することが見出された化合物を、Doll含有転写複合体への比活性についてさらに特性決定する。他のやり方では、Wnt経路活性は、標的遺伝子、例えばmycのmRNA若しくはタンパク質レベルを検出することによって測定することが可能である(He,Sparks et al.1998)。
【0078】
実施例XIII:タンパク質−タンパク質相互作用に基づいた、Doll−Lgs若しくはDoll相互作用パートナーXを阻害する化合物のスクリーニングアッセイ
Dollとその相互作用パートナー又はその断片を、例えばE.coli培養物から(例えば、実施例VIIIに記載のように)産生して精製する。タンパク質は、例えば、6−ヒスチジン、S−タンパク質、GST、又はチオレドキシンでタグを付ける。精製したタンパク質の小アリコートを適正な結合緩衝液においてインキュベートする。この時点で、この混合物へ化学的化合物を加え、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊するその能力を、例えば以下に記載の方法のいずれかによりモニターする。引き続き、この相互作用を阻害する化合物について、その特異性とin vivo毒性を試験する。タンパク質−タンパク質相互作用をモニターするための十分確立した方法は、例えば以下である:
【0079】
・ランタニドキレート標識を用いる、時間分割フルオロメトリー(Hemmila IとWebb S.DDT 2:373-381(1997))。
・シンチレーション近似アッセイ(SPA)(アマーシャム・ライフサイエンス)。
・蛍光偏光法
【0080】
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【図面の簡単な説明】
【0081】
【図1】ショウジョウバエdollのcDNA及びタンパク質配列。
【図2】ヒトdoll−1及びdoll−2のcDNA及びタンパク質配列。
【図3】マウスdoll−1及びdoll−2のcDNA及びタンパク質配列。
【図4】ショウジョウバエ及びヒトのDollタンパク質は、PHDフィンガーモチーフを含有し、それによりそれらはLgs/BCL9のHD1へ結合する。 (A)上:Doll、ヒトDOLL−1、及びヒトDOLL−2の概略図。高い配列類似性を示す2つのドメインを暗い灰色(DHD:Doll相同性ドメイン)と赤色(PHD:植物相同性ドメイン)で強調する。DHDは、発明者が他のショウジョウバエ若しくはヒトのタンパク質に類似の配列を見出すことができなかったので、ユニークであるらしい。Doll、hDoll−1、hDoll−2のGenBank受入れ番号は、それぞれAF457206、AF457207、AF457208である。下:ショウジョウバエ、ヒト、及びマウスDollタンパク質配列の多重並置。 (B)Dollとそのヒト相同体におけるDHD及びPHDのアミノ酸配列の並置。類似部分を箱で囲み、同一部分は灰色で陰影をつける。左の数字はDHD及びPHDのそのそれぞれのタンパク質配列内での位置を示す。DHDの並置では、22のアミノ酸のギャップをショウジョウバエDHDに導入した((X)5として表す)。 (C)Lgs/BCL9相互作用部位のDollにおけるマッピング。酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、そのLgs及びBCL9との相互作用を試験したタンパク質の概略図。結果を右側に示す(「bdg」)。 (D)dLgs及びhLgs/BCL9におけるDoll相互作用部位のマッピング。酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて、そのLgsとの相互作用を試験したタンパク質の概略図。下に示した2つのタンパク質を、プルダウンアッセイにより、dLgs(括弧なしの数字)及びhLgs/BCL9(括弧中の数字)の両方について試験し、同じ結果を得た(「bdg」)。HD1を除去する欠失部分は、Lgsではアミノ酸318〜345を、hLgs/BCL9ではアミノ酸177〜204を含む。使用した融合タンパク質は、S−タグ−dDoll(アミノ酸542〜815)とGST−hDOLL−2(アミノ酸301〜406)であった。
【図5】dollは、Wgシグナル伝達に要求されるセグメントポラリティー遺伝子である。 (A〜C)野生型(A)、wg突然変異体(B)、及びdoll突然変異体(C)の胚に由来する幼虫の体表調製物。(C)のdoll130/doll130胚は、ホモ接合doll130突然変異生殖系列クローンに由来し(実験方法を参照のこと)、wg様の表現型を示す。 (D,E)dAPC2の下流のdoll機能。母系接合の野生型dAPC2機能の非存在下に発生した幼虫に由来する2つの体表調製物を示す(McCartney et al.,1999)。(E)の胚は、さらに、dollの母系接合機能を欠いている(実施例を参照のこと)。強く抑制された歯状突起帯を有するdAPC単一突然変異動物とは対照的に、二重突然変異体は、doll様の表現型を示す。 (F−1)Doll(F,G)とPtc(H,I)に対する抗体で染色した、第三齢の翅(ウィング)の成虫盤調製物の共焦イメージ。野生型動物は、これらの遺伝子の正常は発現を示す(F,H)。doll130突然変異幼虫由来の盤は小さく、それでもPtc(I)を発現するが、D11(H)を発現し得ない。D11発現の欠落は、doll130幼虫におけるより早期の翅から胸背板へのトランスフォーメーションの間接的な結果である可能性がある。しかしながら、我々はまた、モザイク動物由来のdoll130突然変異細胞においてはD11発現の著しい低下を見ている(示さず)。
【図6】DollのLgs及びPHDフィンガーは、Doll及びArmを組立てることに役立つ。 lgs若しくはdoll突然変異動物をレスキューする能力を評価するトランス遺伝子アッセイに使用したLgs(黄色)及びDoll(明緑色)構築体の概略図。1:完全長Lgs(pOP216,アミノ酸1〜1464)。2:C末端先端切断Lgs(pTK131,アミノ酸1〜583)。3:HD1−Gal11−HD2(pTK153,アミノ酸268〜395(HD1)、アミノ酸369〜500(Gal11)、アミノ酸465〜596(HD2))。4:HD1−(HA)3−HD2(pTK143,アミノ酸268〜395(HD1)、アミノ酸465〜596(HD2))。5:完全長Doll(pTK56,アミノ酸1〜815)。6:Doll[DPHD]−HD2(pTK135,アミノ酸1〜740(Doll[DPHD]、アミノ酸483〜561(HD2))。トランス遺伝子1〜4は、lgs20Fホモ接合体をレスキューすることができる。トランス遺伝子3によりレスキューされた成体動物の例を右側に示す。トランス遺伝子5は、doll130ホモ接合体をレスキューすることができる。トランス遺伝子6は、lgs20Fホモ接合体だけでなくdoll130もレスキューすることができる(右側の写真)。
【図7】ヒトdollトランス遺伝子の発現による、ddoll−/−ハエのレスキュー。doll130/EP(3)1076遺伝子型により引き起こされる致死性は、ショウジョウバエdoll遺伝子のコーディング領域(示さず)又はその2つのヒト相同体hdoll−1及びhdoll−2のうち1つのそれのいずれかを含有するチューブリン1プロモーター推進トランス遺伝子により完全にレスキューすることが可能である。
【図8】ヒトDoll1及び2のTcf転写に及ぼす効果。293細胞を、指定のように、pTOPFLASH若しくはpFOPFLASHルシフェラーゼレポーターと様々なエフェクタープラスミドで一過的にトランスフェクトした。β−カテニンの構成活性型(ΔN−β−カテニン、50ng)又はヒトDoll−1若しくはhDoll−2(350ng)は、pTOPFLASHレポーターを活性化する。ヒトDollのΔN−β−カテニンとの同時トランスフェクションは、この応答を強く亢進させる。
Claims (55)
- 昆虫及び脊椎動物における少なくとも1つのシグナル伝達経路の一部であるポリペプチドをコードする核酸配列であって、「Daughter of Legless」(DOLL)遺伝子、並びにその相同体、断片、誘導体、そして機能及び構造類似体であることを特徴とする、核酸配列。
- 前記シグナル伝達経路がWntシグナル伝達経路であることを特徴とする、請求項1に記載の核酸配列。
- 配列番号1に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)doll遺伝子(ddoll)であることを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- 配列番号6に示されるようなショウジョウバエDollポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項3に記載の核酸配列。
- 配列番号2に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるヒトdoll−1遺伝子(hdoll−1)であることを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- 配列番号7に示されるようなヒトDoll(hDoll−1)ポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項5に記載の核酸配列。
- 配列番号3に示されるようなヌクレオチド配列を有するヒトdoll−2遺伝子(hdoll−2)であることを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- 配列番号8に示されるようなヒトDollポリペプチド(hDoll−2)の断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項7に記載の核酸配列。
- 配列番号4に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるマウスdoll−1遺伝子(mdoll−1)であることを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- 配列番号9に示されるようなマウスDollポリペプチド(mDoll−1)の断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項9に記載の核酸配列。
- 配列番号5に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなるマウスdoll−2遺伝子(mdoll−2)であることを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- 配列番号10に示されるようなマウスDollポリペプチド(mDoll−2)の断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項11に記載の核酸配列。
- 昆虫及び脊椎動物における少なくとも1つのシグナル伝達経路の一部であるポリペプチドであって、「Daughter of Legless」(DOLL)タンパク質、並びにその相同体、断片、誘導体、そして機能及び構造類似体であることを特徴とする、ポリペプチド。
- 前記シグナル伝達経路がWntシグナル伝達経路であることを特徴とする、請求項13に記載のポリペプチド。
- 配列番号6に示されるようなアミノ酸配列を有するキイロショウジョウバエDollタンパク質であることを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
- 配列番号6に示されるようなDollポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項15に記載のポリペプチド。
- 配列番号7に示されるようなアミノ酸配列を有するヒトDollタンパク質(hDOLL−1)であることを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
- 配列番号7に示されるようなDollポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項17に記載のポリペプチド。
- 配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を有するヒトDollタンパク質(hDOLL−2)であることを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
- 配列番号8に示されるようなDollポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項19に記載のポリペプチド。
- 配列番号9に示されるようなアミノ酸配列を有するマウスDoll−1タンパク質(mDOLL−1)であることを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
- 配列番号9に示されるようなDollポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項21に記載のポリペプチド。
- 配列番号10に示されるようなアミノ酸配列を有するマウスDoll−2タンパク質(mDOLL−2)であることを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
- 配列番号10に示されるようなDollポリペプチドの断片又は全配列に対して50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項23に記載のポリペプチド。
- 低い全体アミノ酸配列同一性と、保存ドメインにおける50%〜100%、好ましくは100%の配列同一性を含んでなるポリペプチドをコードしていることを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- 前記保存ドメインがDHDドメインであることを特徴とする、請求項25に記載の核酸配列。
- 前記保存ドメインがPHDフィンガーであることを特徴とする、請求項26に記載の核酸配列。
- 配列番号1、2、3、4、又は5に由来する、長さ20〜100ヌクレオチド、好ましくは20〜60ヌクレオチド、及び最も好ましくは20〜50ヌクレオチドの断片を含むことを特徴とする、請求項2に記載の核酸配列。
- ハイブリダイゼーションプローブとして使用される、請求項28に記載の核酸配列。
- 配列番号1、2、3、4、又は5からなる群から選択される、ショウジョウバエ若しくは脊椎動物のdoll遺伝子又はその断片をコードする核酸分子を含んでなるベクター。
- 真核及び原核発現ベクターからなる群から選択される、請求項30に記載のベクター。
- 哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞からなる群から選択される、請求項31のベクターを含んでなる宿主細胞。
- a)完全なdoll cDNA配列又はその一部を含有する核酸配列を単離する工程;
b)doll cDNA又はその断片を細菌、哺乳動物、植物、酵母、又は昆虫の細胞において組換え的に発現させる工程;
c)前記細胞においてタンパク質産生を誘導する工程;
d)Dollタンパク質を精製する工程を含んでなる、Dollタンパク質、その断片、誘導体、及び類似体の調製方法。 - 工程a)が、脊椎動物若しくは無脊椎動物のcDNA若しくはゲノムライブラリーからのdoll cDNAを包含する核酸分子の単離を含む、請求項33に記載の方法。
- 工程b)が、完全長若しくは先端切断(truncated)dollをコードするDNAの、誘導可能な真核若しくは原核発現ベクター内に含有されるエピトープタグ及び切り離し部位への融合と、割り当てた宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換する工程を含む、請求項33に記載の方法。
- エピトープタグ付き配列、抗体、グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼからなる群から選択される異種アミノ酸配列へ融合したDollポリペプチドを含んでなるキメラタンパク質。
- Dollポリペプチドが、dDoll、hDoll−1、hDoll−2、mDoll−1、及びmDoll−2からなる群から選択されることを特徴とする、請求項36に記載のキメラタンパク質。
- 抗Doll抗体への抗体結合部位を含んでなる、完全長Dollポリペプチド又はその断片を含むことを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
- Dollポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、ポリクローナル及びモノクローナル抗体とその断片からなる群から選択される、前記抗体。
- ショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、カエル、ブタ、又はヒツジからなる群から選択される生物の使用を含んでなり、前記生物は、増加又は低下若しくは皆無のdoll発現を示すか、又は少なくとも1つの組織若しくは臓器において突然変異したDollポリペプチドを発現する、破壊されたWnt機能により誘導される疾患を研究するためか又は薬物スクリーニングのためのアッセイ。
- 前記生物がdoll遺伝子を異種トランス遺伝子として発現することを特徴とする、請求項40に記載のアッセイ。
- 前記doll遺伝子が、欠失、点突然変異、異種DNA挿入、及び逆位からなる群から選択される突然変異を含むことを特徴とする、請求項40に記載のアッセイ。
- 細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の処置への治療及び診断の方法の開発への、Dollタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
- 細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の診断への治療及び診断の化合物の開発への、Dollタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
- 前記治療若しくは診断の化合物が、ショウジョウバエ及び脊椎動物のDollタンパク質相同体とその断片、そしてその抗体及び抗体断片からなる群から選択されることを特徴とする、請求項43に記載のDollタンパク質、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
- 細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の処置への治療及び/又は診断の化合物の開発への、doll核酸、その相同体、誘導体、及び断片の使用と、個体へのその適用。
- 細胞の運命、分化、又は増殖の障害からなる群から選択される状態の処置への治療及び診断の方法の開発への、doll核酸、その相同体、誘導体、及び断片の使用と、個体へのその適用。
- 前記治療若しくは診断の化合物が、dollアンチセンスDNA若しくはRNA、doll二本鎖RNA、及び、doll機能に干渉する化学的若しくは天然に存在する化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項45に記載のdoll核酸、その相同体、誘導体、及び断片の使用。
- Dollポリペプチドの断片を含んでなるペプチド。
- hDoll−1、hDoll−2、mDoll−1、mDoll−2、及びショウジョウバエDollのN末端領域に40〜60のアミノ酸を含んでなる、請求項48に記載のペプチド。
- Doll相同性ドメイン(DHD)を含んでなる、請求項49に記載のペプチド。
- Wnt経路においてDoll機能に干渉する、化学的化合物、有機産物、ポリペプチド若しくはペプチドの同定へのスクリーニング方法における、DHDの使用。
- タンパク質−タンパク質相互作用に基づいたスクリーニングアッセイにおける、請求項51に記載のDHDの使用。
- 前記スクリーニングアッセイが、in vitro タンパク質−タンパク質相互作用アッセイと宿主細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを含んでなる群から選択される、請求項52に記載のDHDの使用。
- Dollともう1つのタンパク質との間の相互作用を特異的に阻害する化合物のスクリーニングアッセイにおける、請求項51に記載のDHDの使用。
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