JP2005500003A - ヒト免疫不全ウイルス(hiv)の表現型特性の新規な分析法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、幾つかのウイルス株、特にHIVウイルスを示す表現型特性の分析法に関する。
【0002】
迅速であり、かつウイルス遺伝子中で突然変異の存在を検出するために広く使用可能な遺伝子型テストは、例えばHIVのプロテアーゼ又は逆転写酵素をコードする遺伝子中に存在する突然変異を検出するために、開発された。
【0003】
幾つかの突然変異は、特殊なウイルス活性阻害物質に関連したが、その他の多数は、幾つかの分子による処理と関連している。その上、新規な阻害物質分子の発達により、処理を逃れるウイルス変異体の遺伝子型特定は、ますます複雑になっている。このことは、評価、及びどの阻害物質に対して、ウイルスが耐性を有するようになっているか、又は僅かな感受性をなおも保っているのか知ることを難しくする。この状況下、耐性を有する突然変異の存在及び蓄積は、確かに耐性変化の良好な指数となり得るが、遺伝子型レベルでこれらの突然変異を単に検出することは、抗ウイルス治療が機能しない患者の治療的方向付けを最適化するために決定的であることが判明するパラメータである、耐性レベルを定量的に評価するために、もはや十分でない。
【0004】
ウイルスの表現型特性は、様々なウイルスの行動局面と関連し、かつ前記ウイルス及びその環境の間の多数の相互作用に直接関与する。
【0005】
ウイルス活性の阻害のようなウイルスの表現型特性の変化を培地中で、例えば前記ウイルス活性の阻害化合物の存在下で直接測定する表現型テストのみが、耐性の定量的指数を提供する。
【0006】
特に医学的観点から分析が興味深いことが判明する他の表現型特性は、ウイルス活性に関与する少なくとも1つのメカニズムを阻止する可能性のある阻害剤に対する耐性をウイルスに与える特性、複製能力をウイルスに与える特性、特殊な標的に対する向性をウイルスに与える特性、又は抗体、ケモカイン又は阻害物質のような分子によって中和される能力をウイルスに与える特性である。
【0007】
本発明により、感染患者において行われた採取見本から組み換えウイルスを再構成することに基づき、かつ唯一のウイルス複製サイクルを介在させる迅速な方法を用いて、HIVの異なっているが相補的である幾つかの表現型特性をテストすることが可能になる。この発明は、決定を補助し、かつ抗レトロウイルス治療のウイルス学的失敗の状況にあるHIV感染患者、又は抗レトロウイルス治療を受けたことがない患者において治療戦略を最適化する過程に含まれる。ウイルスの様々な表現型特性の完全な知識のみが、患者の特殊な状況に最も適した治療的決定を行うことにおいて臨床医を効果的に補助し得る。
【0008】
医学的観点から分析が特別な重要性を有するHIVウイルスの表現型特性の中で、下記に列挙するような、ウイルスのゲノムのGAG、ENV、又はPOL領域に位置する、少なくとも1つの突然変異を受ける可能性がある遺伝子発現に関連した特性がある。
【0009】
I 感染力、複製能力及び毒性
HIVウイルスのこれらの表現型特性は、ウイルス複製サイクルの様々なメカニズム又はステップにおいて介在する領域、又はタンパク質をコードする部分であるウイルスのゲノムのあらゆる領域の機能に関連し得る。特に、ウイルス複製に対し、かつ特には抗ウイルス剤への耐性を発達させたウイルスにおいて、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ又は外被をコードする遺伝子中の突然変異によって生じる効果を評価することは重要である。
【0010】
その分析により、感染力又は「適応度」とも呼ばれるウイルスの複製能力を測定することが可能になる。
【0011】
II 逆転写酵素阻害物質感受性/耐性
HIVウイルスのこの表現型特性は、逆転写酵素をコードするPOL領域の1部分の発現に関連する。
【0012】
その分析により、ヌクレオシド類似体又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害物質(NNRTI)による抗レトロウイルス治療の調整が可能になる。
【0013】
III インテグラーゼ阻害物質感受性/耐性
HIVウイルスのこの表現型特性は、インテグラーゼをコードするPOL領域の1部分の発現に関連する。
【0014】
その分析により、インテグラーゼ阻害物質による抗レトロウイルス治療の調整のための指示が提供される。
【0015】
IV 標的細胞中へのウイルス侵入阻害物質感受性/耐性
HIVウイルスのこの表現型特性は、HIV外被の糖タンパク質の発現及び特にENV遺伝子の部分によってコードされる前記糖タンパク質の膜貫通型サブユニットの発現に関連する。
【0016】
この表現型特性の分析により、標的細胞膜とのウイルス膜の融合を阻止する阻害剤の作用を明らかにすることが可能になる。
【0017】
V HIVウイルスのコレセプターを標的とする阻害物質感受性/耐性
この表現型特性は、標的細胞のコレセプターとの結合に関与するポリペプチドをコードするHIVウイルスのENV領域の少なくとも1部分の発現に同様に関連する。外被/コレセプターの相互作用により、前記標的細胞中へのHIVウイルスの侵入が可能になる。
【0018】
その分析により、標的細胞中への侵入を行うためにHIVによって使用されるコレセプターを阻止する阻害物質の作用に対するHIVウイルスの耐性を測定することが可能になる。
【0019】
阻害剤は、HIV外被との相互作用を阻害して、コレセプターに干渉する。
【0020】
特に、HIVの標的細胞のCXCR4又はCCR5レセプターにより外被タンパク質の幾つかの領域の相互作用を変更するENV領域中の突然変異の効果を評価することは、重要である。
【0021】
VI 向性
この表現型特性もまた、標的細胞の1つ又は幾つかのレセプター、特にCXCR4又はCCR5コレセプターとの結合に関与する、HIVウイルス外被のポリペプチドをコードするENV領域の少なくとも1部分の発現に関連する。
【0022】
その分析により、種々の細胞型中で異なるように発現される、前記レセプター、特にCXCR4又はCCR5を使用する、HIVウイルスの能力を生体内で測定することが可能になり、かつウイルスがレセプターの一方若しくは他方、又は両方を使用するか知ることが可能になる。
【0023】
この分析によって提供される指示により、HIVの天然標的である、幾つかの細胞型におけるウイルス行動を推論することが可能になる。
【0024】
VII 毒性
この表現型特性もまた、HIVウイルス外被のポリペプチドをコードするENV領域の全部又は部分の発現に関連する。
【0025】
その分析によりHIVウイルスの細胞変性力を評価することが可能になる。
【0026】
VIII 中和能力
この表現型特性もまた、HIVウイルス外被のタンパク質の発現に関連する。
【0027】
その分析により、抗体、又は生体中に天然に存在し、かつ血清又は他の体液中に存在する物質の阻害作用へのウイルスの感受性を評価することが可能になる。
【0028】
例えば、HIVウイルスの抗ウイルス治療耐性の表現型特性を検出するための第1のテストは、困難であり、かつ再現可能になり難い手順により、植物性凝集素(PHA)によって刺激される末梢血リンパ球(PBL)及び1次分離株を使用して行われた。これらのテストの革新的な代替案である、以下にRVAと呼ぶ組み換えウイルステストが、1994年にKellam及びLarderによって提案された。
【0029】
このRVA分析法は、逆転写酵素が欠失し、かつ十分に確立された多様な細胞系統中で複製能力がある、実験室で得られるウイルスのクローンで、重合連鎖反応(PCR)によってしかるべく増幅されたウイルス配列の同時トランスフェクションによってウイルス保有患者の血漿から分離された逆転写酵素を有する組み換えウイルスの耐性を測定した。
【0030】
この方法の幾つかの変更が今では記載された(Boucher,C.,Keulen,W.,Bommel,T.,Nijhuis,M.,Jong,D.,Jong,M.,Schipper,P.及びBack,N.,K(1996)「細胞致死アッセイ中でテストする患者の血清から発生する組み換えウイルスを使用することによるHIV−1薬剤感受性決定。抗菌剤及び化学療法」40(10),2404‐2409)(Shi,C.及びMellors,J.W.(1997)「逆転写酵素阻害物質へのヒト免疫不全ウイルス1型感受性の迅速な生体内分析のための組み換えレトロウイルス系」。Antimicrob Agents Chemother 41(12),2781‐5)(Hertogs,K.,de Bethune,M.P.,Miller,V.,Ivens,T.,Schel,P.,Van Cauwenberge,A.,Van Den Eynde,C.,Van Gerwen,V.,Azijn,H.,Van Houtte,M.,Peeters,F.,Staszewski,S.,Conant,M.,Bloor,S.,Kemp,S.,Larder,B.及びPauwels,R.(1998)「組み換えヒト免疫不全ウイルス1型中のプロテアーゼ及び逆転写酵素阻害物質への表現型耐性の迅速な同時検出法は、抗レトロウイルス薬剤で治療される患者から分離する」。Antimicrob Agents Chemother 42(2),269−76)(Hecht,F.M.,Grant.R.M.,Petropoulos,C.J.,Dillon,B.,Chesney,M.A.,Tian,H.,Hellmann,N.S.,Bandrapalli,N.I.,Digilio,L.,Branson,B.及びKahn,J.O.(1998)「複数の逆転写酵素及びプロテアーゼ阻害物質に耐性を有するHIV−1変異体の性的伝染」。N Engl J Med 339(5),307−11)(Medina,D.J.,Tung,P.P.,Nelson,C.J.,Sathya,B.,Casareale,D.及びStrair,R.K.(1998)「薬剤耐性HIV分析用の組み換えレトロウイルス系の特徴付け及び使用」。J Virol Methods 71(2),169−76)。
【0031】
しかしながら、PBMCを利用する方法のように、検出し、かつ測定しようと試みる特殊な表現型特性を発現する感染粒子の予備を生成することは、リンパ球の指数増殖によるウイルス増幅を必要とするので、大部分のこれらの組み換え系は、不都合を有する。その場合、ウイルスは、複製中に遺伝子浮動を受け、かつ調査する表現型特性の発現に必要不可欠な突然変異を失う可能性があり、このようにして方法の信頼性を減少させる。
【0032】
先行技術の分析法に存在する、例えば耐性の表現型特性を明らかにするためのもう一つの不都合は、様々なレトロウイルス阻害物質に対する耐性を与える可能性のある幾つかの突然変異が同時に存在することが、ウイルスの複製能力を減少させることから生じる。
【0033】
発明者は、唯一の複製サイクルしか必要としないHIVウイルスの表現型特性の新規な分析法を発展させた。
【0034】
単一のウイルス複製サイクルしか必要としないこの方法は、得られる組み換えウイルスの培養条件を選択することによって実施される。
【0035】
これらの培養条件は、第1サイクルを超えてウイルス複製を妨げるために選択される培養時間の制御に関し、この培養時間は、12時間から72時間であり、好ましくは24時間から48時間である。
【0036】
培養条件は、第1の細胞系の細胞選択に同様に関し、それらは、ウイルス感染を許容しないように選択され、例えばかかる細胞は、細胞中へのHIVウイルス侵入に必要なCD4レセプターを有さない。かかる細胞の例は、HeLa又は293T細胞である。
【0037】
最後に、これらの培養条件は、外被タンパク質不足を示す、本発明の方法により構成される組み換えウイルスにも関する。これらのウイルスは、一旦第1の細胞系で生成されると、実際この第1の細胞系の細胞を再度感染させることが不可能である。
【0038】
この分析法は:
a)調査する表現型特性を変更する可能性のある突然変異を含む可能性のある分析するHIVから得られるDNA配列であって、前記ウイルスの保有患者の血漿、血清、唾液、精液又はその他の分泌物のような生体媒質から抽出される配列、
b)HIV複製を可能にする配列の特異な欠失、及びHIVに調査する表現型特性を与える配列の全部又は部分の欠失を有する第1ベクター、
c)前記ウイルスの複製に必要な配列を補い、かつ第1ベクターに欠ける配列を含む第2ベクター、例えばプラスミドによる相同的組み換え及びトランスフェクションによって得られる組み換えウイルス(RAV)の構成に基づく。
【0039】
発明者が発展させた方法は、迅速であり、実施されるために約7日を必要とし、かつ従ってHIV感染患者のウイルス活性阻害物質感受性の測定のような常用決定に使用され得る。
【0040】
このようにして、発明者は、HIVウイルスのプロテアーゼ阻害物質感受性を決定するための、特殊な組み換えウイルスの形成に基づくこの分析法の第1の応用を、米国特許6103462に既に記載した。
【0041】
HIVの本発明の範囲内で実施される新規な分析法は、遺伝子gag、pol、プロテアーゼ、逆転写酵素、RNA分解酵素H、インテグラーゼ、vif、vpr、tat、rev、vpu、env、nef、シス活性配列、LTR、二量化配列、スプライシング調整配列、特別組み換えウイルスによるRREを含む群から選択される、少なくとも遺伝子中に存在する可能性のある突然変異に関連したHIVウイルスの表現型特性の決定に基づく。
【0042】
従って本発明は、ウイルス感染に影響を及ぼす可能性のあるウイルスのゲノムの1つ又は幾つかの突然変異から生じる、患者の生体試料中に存在するHIVウイルスの表現型特性の分析法であって:
a)生体試料中に含まれる核酸の抽出、
b)各々が少なくとも1つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む1対のプライマーを有する、ステップ(a)の核酸セグメントのPCRによる少なくとも1つの増幅、
c)ステップ(b)で増幅されたセグメントを除いて、かつ場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を除いて、ウイルス複製に必要なHIVウイルスのゲノムの部分を含むベクターの調製、
d)相同的組み換えによってキメラウイルスを得るために:
−ステップ(b)で得られる核酸、
−ステップ(c)で調製されるベクター、
−外被遺伝子がステップ(c)で調製されるベクターから欠失するならば、場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第2ベクター、による第1細胞宿主のトランスフェクション、
e)単一の複製サイクル中にウイルス粒子を生成することを可能にする条件における前記第1細胞宿主の培養、
f)HIVウイルス、又はHIV偽型ウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を場合により含む少なくとも1つの第2細胞宿主の、ステップ(e)で得られるウイルス粒子による感染、及び
g)生体試料中に存在するHIVウイルスの少なくとも1つの表現型特性を明らかにするための、ステップ(f)で発現されたマーカーの検出及び/又は定量化を含むことを特徴とする分析法に関する。
【0043】
特に、ステップ(b)のPCRによる増幅は、gag、pol、プロテアーゼ、逆転写酵素、RNA分解酵素H、インテグラーゼ、vif、vpr、tat、rev、vpu、env、nef、シス活性配列、LTR、二量化配列、スプライシング調整配列、又はRev応答要素(RRE)から選択されるウイルスのゲノム領域の全部又は部分を含む核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われる。
【0044】
本発明の分析法の特殊な実施態様によれば、ステップ(b)のPCRによる増幅は、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのgagタンパク質の1部分をコードする核酸配列及びプロテアーゼをコードする核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われ、かつステップ(c)のベクターは、プロテアーゼをコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したHIVウイルスのゲノムから構成される。
【0045】
好適には、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列の、本発明の分析法によるステップ(b)の増幅は、配列Fit A−:(5’ TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3’)(配列識別番号1)及びPro A−:(5’ GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3’ 3’)(配列識別番号2)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは突然変異を有するプロテアーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーにより行われ、配列:Fit B−:(5’ AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3’)(配列識別番号3)及びPro B−:(5’ GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3’)(配列識別番号4)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは突然変異を有するプロテアーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーによる第2の増幅が続く。
【0046】
非常に好ましくは、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列の、本発明の分析法によるステップ(b)の増幅は、1237から2725までの残渣に及ぶ1488塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
Fit A−:(5’ TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3’)(配列識別番号1)及び
Pro A−:(5’ GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3’ 3’)(配列識別番号2)により行われ、1対のプライマー:
Fit B:(5’ AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3’)(配列識別番号3)及び
Pro B−:(5’ GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3’)(配列識別番号4)による第2の増幅が続き、かつステップ(c)のベクターは、1505から2565までの残渣に及ぶHIV−1のプロテアーゼをコードするpol読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクターである。
【0047】
本発明の分析法の第2の特殊な実施態様によれば、本発明による分析法のステップ(b)のPCRによる増幅は、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われ、かつステップ(c)のトランスフェクションは、逆転写酵素をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したHIVウイルスのゲノムから構成される第1ベクターによって行われる。
【0048】
好適には、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ(b)の増幅は、配列MJ3(5’ AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3’)(配列識別番号5)及びRT−EXT(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(配列識別番号6)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する転写酵素の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーにより行われ、配列:A35(5’ TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3’)(配列識別番号7)及びRT−IN(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(配列識別番号8)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する逆転写酵素の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、1対のプライマーによる第2の増幅ステップが続く。
【0049】
非常に好ましくは、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ(b)の増幅は、プロテアーゼをコードする領域のコドン93を超えて、かつポリメラーゼ(POL)をコードする領域のコドン503を超えて及ぶ1530塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
MJ3(5’ AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3’)(配列識別番号5)及び
RT−EXT(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(配列識別番号6)により行われ、1対のプライマー:
A35(5’ TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3’)(配列識別番号7)及び
RT−IN(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(配列識別番号8)による第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のベクターは、2618から2872までの残渣に及ぶHIV−1の逆転写酵素をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクターである。
【0050】
第3の実施態様によれば、本発明は、ステップ(b)の増幅が、gagタンパク質、又はプロテアーゼ若しくは逆転写酵素をコードする核酸配列中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのgagタンパク質の1部分、プロテアーゼ及び逆転写酵素の1部分をコードする核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われる分析法を同様に目的とする。
【0051】
非常に好ましくは、gagタンパク質、又はプロテアーゼ若しくは逆転写酵素をコードする核酸配列中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのgagタンパク質の1部分、プロテアーゼ及び逆転写酵素の1部分をコードする核酸配列を取り囲む1対のプライマーによる、ステップ(b)の増幅は、1237から4062の残渣に及ぶ2825塩基対のDNAセグメントを得るために、プライマー対:
gag+1(5’ AGGGGCAAATGGTACATCA 3’)(配列識別番号31)及び
RT−EX(配列識別番号6)により行われ、1対のプライマー:
Fit B+(配列識別番号1)及び
RT−IN(配列識別番号8)による第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のトランスフェクションは、gag遺伝子の1部分、及び1507から3870までの残渣に及ぶHIV−1のプロテアーゼ及び逆転写酵素の1部分をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、外被領域中で欠失し、かつ唯一のNruI制限部位を含むレトロウイルスベクターによって行われる。
【0052】
好適には、上記トランスフェクションから生じるウイルスは、逆転写酵素及び/又はプロテアーゼ中に突然変異を有するウイルスの感染又は複製能力を決定するために使用され得る。この分析法によるウイルス粒子の定量化は、p24抗原の測定によって達成される。類似する分析法がいかなる場合も、逆転写酵素配列から単に欠失したベクターを使用して行われ得ないことを指摘すべきである。なぜならこれらの生育不能な組み換えウイルスが、p24抗原をなおも生成し得るからである。プロテアーゼに対応する領域の付加的欠失を有する組み換えウイルスを構成すると、正確に組み換えられたウイルスのみが、p24抗原を生成し、かつ生成されたウイルス粒子の確実かつ信頼できる測定をこのようにして可能にする。
【0053】
本発明は、HIVウイルスの逆転写酵素阻害化合物感受性を決定する分析法であって、ステップ(e)で得たウイルス粒子によって第2細胞宿主の感染前に、逆転写酵素の前記阻害化合物を場合により異なる濃度で、第2細胞宿主に付加すること又は付加しないことからなり、かつ逆転写酵素の阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0054】
本発明の分析法の第3の特殊な実施態様によれば、ステップ(b)のPCRによる増幅は、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われ、かつステップ(c)のベクターは、インテグラーゼをコードする遺伝子の全部又は部分から欠失したレトロウイルスベクターである。
【0055】
好適には、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ(b)の増幅は、配列:INT B+ − 5’GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3’(配列識別番号9)及びINT B− 5’TTTTGGTGTTATTAATGCT3’(配列識別番号10)、又は少なくとも1つの突然変異を有するインテグラーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列を含む、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有するプライマー対により行われ、プライマー対:INT V+ 5’CACCCTAACTGACACAACAA3’(配列識別番号11)及びINT V− 5’AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3’(配列識別番号12)、又は少なくとも1つの突然変異を有するインテグラーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列による第2の増幅ステップが続く。
【0056】
非常に好ましくは、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ(b)の増幅は、3950から5410までの残渣に及ぶ1460塩基対のDNA断片を得るために、プライマー対:
INT B+ −5’GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3’(配列識別番号9)及び
INT B− 5’TTTTGGTGTTATTAATGCT3’(配列識別番号10)により行われ、プライマー対:
INT V+ 5’CACCCTAACTGACACAACAA3’(配列識別番号11)及び
INT V− 5’AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3’(配列識別番号12)による第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のベクターは、4228から5093までの残渣に及ぶHIV−1のインテグラーゼをコードするpol読み取り枠全領域、及び6343位から7611位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターである。
【0057】
本発明は、HIVウイルスのインテグラーゼ阻害化合物感受性を決定する分析法であって、ステップ(e)の間、ステップ(f)の前に、インテグラーゼの前記阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつインテグラーゼの阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0058】
本発明の分析法の第4の特殊な実施態様によれば、ステップ(b)のPCRによる増幅は、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われ、かつステップ(c)のベクターは、外被タンパク質をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したHIVウイルスのゲノムから構成されるレトロウイルスベクターである。
【0059】
好ましくは、ステップ(c)のベクターは、Rev応答要素(RRE)を構成するHIV−1ゲノム領域の、7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターである。
【0060】
好適には、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、配列:FIN−A:5’TCAAATATTACAGGGCTGCT3’(配列識別番号13)及びFIN−B:5’TAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号14)か、配列FuA:5’AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3’(配列識別番号23)及びFuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーにより行われ、配列:FIN−C:5’CTATTAACAAGAGATGGTGG3’(配列識別番号15)及びFIN−D:5’TCCACCTTCTTCTTCGATT3’(配列識別番号16)か、次の2つの配列:FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)及びFuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物と組み合わせて使用される、配列:FuC:5’ATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3’(配列識別番号25)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーにより行われる第2の増幅ステップが続く。
【0061】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、7553から8517までの残渣に及ぶ965塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
FIN−A:5’TCAAATATTACAGGGCTGCT3’(配列識別番号13)及び
FIN−B:5’TAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号14)により行われ、プライマー対:
FIN−C:5’CTATTAACAAGAGATGGTGG3’(配列識別番号15)及び
FIN−D:5’TCCACCTTCTTCTTCGATT3’(配列識別番号16)により行われる第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のベクターは、7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含む。
【0062】
非常に好ましくは、本発明による分析法は、亜型が何であれHIVウイルスの、かつ特には亜型A、B、C、D及びE)のウイルスの外被領域の配列の増幅を可能にし、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅のために使用しては、7635から8440までの残渣に及ぶ805塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
FuA:5’AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3’(配列識別番号23)及び
FuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)により行われ、プライマー:
FuC:5’ATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3’(配列識別番号25)及び次のプライマー:
FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)
FuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物により行われる第2の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは(10%:90%)から(90%:10%)、かつ非常に好ましくは(60%:40%)から(40%:60%)の比率で行われ、かつステップ(c)のベクターは、7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含む。
【0063】
好適には、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、配列:NEU−A:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3’(配列識別番号17)及びFIN−B:5’TAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号14)、又はFuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーにより行われ、配列:NEU−C:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3’(配列識別番号18)及びFIN−D:5’TCCACCTTCTTCTTCGATT3’(配列識別番号16)、又は次の配列:FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)及びFuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有するプライマー対による第2の増幅ステップが続く。
【0064】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、6197〜6222の残渣から6197〜6222までの残渣まで及ぶ2106から2320の塩基対のDNA断片を得るために、1対のプライマー:
NEU−A:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3’(配列識別番号17)及び
FIN−B:5’TAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号14)により行われ、プライマー対:
NEU−C:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3’(配列識別番号18)及び
FIN−D:5’TCCACCTTCTTCTTCGATT3’(配列識別番号16)による第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のベクターは、6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含む。
【0065】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、6322から8440までの残渣に及ぶ2118塩基対のDNA断片を得るために、1対のプライマー:
NEU−A:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3’(配列識別番号17)及び
FuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)により行われ、プライマー:
NEU−C:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3’(配列識別番号18)及び次のプライマー
FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)及び
FuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物による第2の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは(10%:90%)から(90%:10%)、かつ非常に好ましくは(60%:40%)から(40%:60%)の比率で行われ、かつステップ(c)のベクターは、6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含む。
【0066】
好適には、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、配列:E00:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3’(配列識別番号19)及びES8B:5’CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3’(配列識別番号20)を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも1つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーにより行われ、配列:E20:5’GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3’(配列識別番号21)及びE115:5’AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3’(配列識別番号22)、を含むか、又は少なくとも1つの突然変異を有するプロテアーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない1つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、10から50のオリゴヌクレオチドの大きさを有する1対のプライマーによる第2の増幅ステップが続く。
【0067】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、6426から7364までの残渣に及ぶ938塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
E00:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3’(配列識別番号19)及び
ES8B:5’CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3’(配列識別番号20)により行われ、プライマー対:
E20:5’GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3’(配列識別番号21)及び
E115:5’AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3’(配列識別番号22)による第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のベクターは、6617から7250までに及ぶHIV−1外被のV1ループからV3ループにわたるドメインをコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のNheI制限部位を含む。
【0068】
本発明は、HIVウイルスの、HIV−1のgp41タンパク質を標的とする融合阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号15配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号13、配列識別番号14か、プライマー対、配列識別番号18、配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号17配列識別番号18によりステップ(b)の増幅を行うこと、ステップ(e)で得られる細胞宿主の培養の間、ステップ(f)の前に、前記融合阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつHIV−1のgp41を標的とする融合阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0069】
本発明は、HIVウイルスの、標的細胞中への前記HIVウイルスの侵入阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号18及び配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号17及び配列識別番号18によりステップ(b)の増幅を行うこと、ステップ(f)の感染前に、ステップ(e)で得られる細胞宿主に、前記侵入阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつ侵入阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0070】
本発明は、HIVウイルスの抗体阻害作用感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号18、配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号17配列識別番号18によりステップ(b)の増幅を行うこと、培養ステップ(e)の間に、前記抗体を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつ抗体有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0071】
本発明は、細胞レセプターに関してHIVウイルスの向性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号18、配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号17配列識別番号18によりステップ(b)の増幅を行うこと、2つの別の細胞宿主に対してステップ(e)で得られるウイルス粒子によりステップ(f)の感染を行うことからなり、かつ2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0072】
好適には、本発明の分析法によるステップ(f)の感染に使用する細胞宿主は、CCR5レセプター又はCXCR4レセプターを発現する細胞宿主から選択される。
【0073】
本発明は、HIVウイルスの、HIV−1のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号18、配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号17配列識別番号18によりステップ(b)の増幅を行うこと、培養ステップ(e)の間に、HIV−1のコレセプターを標的とする前記阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、ステップ(f)の感染は、2つの別の細胞宿主に対して行われ、かつ2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0074】
本発明は、細胞レセプターに関してHIVウイルスの向性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号21及び配列識別番号22による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号19及び配列識別番号20によりステップ(b)の増幅を行うこと、ステップ(e)で得られるウイルス粒子により2つの別の細胞宿主をステップ(f)で感染させることからなり、かつ2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で含む分析法にも同様に関する。
【0075】
本発明は、HIVウイルスの、HIV−1のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号21及び配列識別番号22による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号19及び配列識別番号20によりステップ(b)の増幅を行うこと、ステップ(d)の培養の間に、HIV−1のコレセプターを標的とする前記阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、2つの別の細胞宿主に対してステップ(e)で得られるウイルス粒子により、ステップ(f)の感染を行うこと、及び2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現をステップ(g)で比較することからなる分析法にも同様に関する。
【0076】
本発明は、HIVウイルスの感染力又は複製能力を決定する分析法であって、ステップ(a)から(f)を応用して得られるウイルス粒子により感染した第2細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、患者の生体試料と、かつステップ(a)から(f)を応用して得られる参照ウイルス粒子により感染した同じ第2細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、参照ウイルスを含む試料と、ステップ(g)で比較することからなる分析法にも同様に関する。
【0077】
好適には、参照ウイルスから生じた参照ウイルス粒子は、治療の先行する段階又はその前に、ステップ(a)から(f)を同じ患者の生体試料に応用することにより得られるウイルス粒子である。
【0078】
本発明は、HIVウイルスの毒性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号15配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号13、配列識別番号14か、プライマー対、配列識別番号18、配列識別番号16による第2の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号17配列識別番号18によりステップ(b)の増幅を行うこと、及び第2細胞宿主に対して生成した細胞変性効果をステップ(f)の感染の際に測定することからなる分析法にも同様に関する。
【0079】
好適には、第2細胞宿主に対してステップ(f)の感染の際に生成した細胞変性効果は、融合細胞誘導、アポトーシス誘導、又は流動血球計算による測定のような細胞毒性技術により測定される。
【0080】
本発明は、HIVウイルスのヒドロキシ尿素感受性を決定する分析法であって、培養ステップ(e)の間か、第2細胞宿主かに、ヒドロキシ尿素を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、及びヒドロキシ尿素有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ(g)で行うことからなる分析法にも同様に関する。
【0081】
好ましくは、本発明の方法による培養ステップ(e)の所要時間は、12から72時間であり、非常に好ましくは、24から48時間である。
【0082】
本発明は、患者の生体試料中に存在するHIVウイルスの表現型特性の分析法を実施するためのキットであって:
i)少なくとも1つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む1対のプライマー、
ii)外被タンパク質をコードする遺伝子、及び(i)で定義したプライマーにより増幅されたセグメントを除き、ウイルス複製に必要なHIVウイルスのゲノム部分を含むベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第2ベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とするキットも同様に目的とする。
【0083】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号1及び配列識別番号2
−配列識別番号3及び配列識別番号4のプライマー対、
ii)1505から2565までの残渣に及ぶHIV−1のプロテアーゼをコードするpol読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子を有する偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0084】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号5及び配列識別番号7
−配列識別番号6及び配列識別番号8のプライマー対、
ii)2618から2872までの残渣に及ぶHIV−1の逆転写酵素をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0085】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号9及び配列識別番号10
−配列識別番号11及び配列識別番号12のプライマー対、
ii)4228から5093までの残渣に及ぶHIV−1のインテグラーゼをコードするpol読み取り枠全領域、及び6343位から7611位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0086】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号13及び配列識別番号14
−配列識別番号15及び配列識別番号16のプライマー対、
ii)7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0087】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号17及び配列識別番号14
−配列識別番号18及び配列識別番号16のプライマー対、
ii)6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0088】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号19及び配列識別番号20
−配列識別番号21及び配列識別番号22のプライマー対、
ii)6617から7250までに及ぶHIV−1外被のV1ループからV3ループにわたるドメインをコードする領域から欠失し、かつ唯一のNheI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0089】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号23及び配列識別番号24
−配列識別番号27を有する配列識別番号25及び配列識別番号26のプライマー対、
ii)7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0090】
好適には、本発明によるキットは:
i)配列:
−配列識別番号17及び配列識別番号24
−配列識別番号18及び配列識別番号26及び配列識別番号27のプライマー対、
ii)6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【0091】
本発明のその他の利点及び特性は、これに続き、かつ次の図面を参照する実施例において図示する。
【0092】
図1は、pSRTプラスミドを概略的に示す。pNL4−3xcenvの逆転写酵素をコードする領域は、BalI−SnaBIによる消化によって欠失する。結果として生じるpSRTの線形化は、Nru Iの使用によって達成される。
【0093】
図2は、逆転写酵素阻害物質による処理前及び後に、2人の患者対AZT及び3TCに関して得られた用量応答効果の曲線を図示する。
【0094】
処理の詳細、時間に関する試料採取、及び遺伝子型は、図の見出しにある。
【0095】
曲線は、材料及び方法の段落で、追って記載する技術によりzidovuidine(AZT、パネルA及びC)又はlamivudine(3TC、パネルB及びD)によって処理されたP4細胞の組み換えウイルスによる感染阻害を示す。患者1に関して、試料は、処理後0(◆)、9(●)及び18(□)ヶ月で、かつ患者2に関して、処理後0(◆)及び27(●)ヶ月でテストされた。
【0096】
図3は、本発明の方法の特殊な実施の最初のステップ(a及びb)の図式である。図式は、本発明の方法のRT PCRによって患者の血漿から抽出された逆転写酵素配列の抽出(a)及び増幅(b)ステップ、及びステップ(d)で後に使用されるpRVA/RTプラスミドの構成図式を図示する。
【0097】
図4は、本発明の方法の特殊な実施のステップ(c)から(g)の図式である。この図式は、ステップ(b)で増幅された核酸配列の全部又は部分に対応する1つの核酸セグメントも、外被タンパク質をコードする核酸配列断片も含まない、HIVウイルスのゲノムから構成されるp43xcsnΔenv RT第1プラスミド、及び外被タンパク質をコードする配列を含むpVSV−G第2プラスミドの、ステップ(b)の増幅された核酸のHeLa/293T細胞中の同時トランスフェクションステップ(d);ウイルス粒子を生成することを可能にする培養ステップ(e)、逆転写酵素の様々な阻害物質の連続希釈の存在下又は不存在下で予め保温された、P4細胞中でステップ(e)で得られるウイルス粒子のトランスフェクションステップ(f)、及びCPRG基質によるベータ−ガラクトシダーゼ検出及び/又は定量化ステップ(g)を図示し、前記P4指示細胞は、組み換えウイルスによって発現される活性化配列tatによって専ら活性化可能なベータ−ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝子の発現系を含む。
【0098】
図5は、患者(P1、P2及びP3)の血漿中に存在するウイルス及び参照ウイルス原型(NL43及びDIM耐性クローン)に関してT20融合阻害物質の存在下で得られる表現型分析の結果を図示する。
【0099】
図6は、様々な資料から抽出されたウイルスL1、L2及びL3の複製能力の測定結果を図示する。
【0100】
I−材料及び方法
I.1−重合連鎖反応(PCR)による増幅
RNAは、Roche Amplicor(登録商標)キット(Roche Diagnostics,38242 Meylan Cedex, France)により患者の血漿から分離され、かつ対象となる遺伝子は、逆転写酵素及び次のPCR反応によって分離される。
【0101】
逆転写酵素(RT)をコードする領域の増幅は、外部プライマーMJ3(5’ AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3’)(添付の配列識別番号5)及びRT−EXT(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(添付の配列識別番号6)、並びに内部プライマーA35(5’ TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3’)(添付の配列識別番号7)及びRT−IN(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(添付の配列識別番号8)により、50℃(30分)及び94℃(2分)での最初のサイクル、その後に続く94℃(30秒)、55℃(30秒)及び68℃(90秒)での40サイクル、並びに10分間、98℃でび最終伸長ステップによって行われる。このことは、プロテアーゼのコード領域のコドン93を超えて、かつポリメラーゼ(pol)のコード領域のコドン503を超えて及ぶ1530pb生成物を増幅する。
【0102】
PCRによってこのようにして得られる生成物は、QuiaAmp(登録商標)カラムで純化され、かつアガロースゲル電気泳動によって、大きさ、純度及びおおよその濃度に関して分析される。
【0103】
I.2−遺伝子型特定
逆転写酵素のコード領域のヌクレオチド配列は、未加工PCR生成物のジデオキシヌクレオチド鎖末端の自動配列決定によって決定される。
【0104】
I.3−プラスミド
分析法で使用するHIV−1の分子クローンは、pNL4−3から誘導される。
【0105】
逆転写酵素の欠失したプラスミドは、3872位の唯一のSnaBI制限部位及び3892位のNru Iを有するために突然変異したpNL4−3xcΔenvの変更によって構成される。
【0106】
酵素Ba I及びSnaB Iは、逆転写酵素をコードする領域(2618から2872位)を取り出すために使用され、かつ結果として生じるpSRTプラスミドの線形化は、Nru I酵素によって行われる。トランスフェクトされた細胞中のVSV−G外被の糖タンパク質発現は、CMVプロモーターの制御下でvsv−gコード配列を含むpVSVプラスミドによって確実に行われる。
【0107】
I.4−細胞培養
HeLa、293T及びP4細胞は、ウシ胎児血清(SVF)10%、ペニシリン50UI/ml及びストレプトマイシン50μg/mlが加えられたDMEM媒質中で培養される。P4細胞は、ベータ−ガラクトシダーゼの発現がHIVのトランス活性化するTatタンパク質によって厳密に誘導可能である、Hela−CD4、LTR−LacZ細胞であり、従って唯一の複製サイクルに基づくHIV−1ウイルスの感染力又は複製能力の正確な定量化を可能にする(Charneau,P.,Mirambeau,G.,Roux,P.,Paulous,S.,Buc,H.及びClavel,F.(1994)「HIV−1逆転写酵素。ゲノム中心の終結ステップ」J Mol Biol 241(5),651−62)。P4細胞は、ジェネテシン500μg/mlの存在下で培養される。
【0108】
II.−HIVウイルスの逆転写酵素阻害物質(RTI)感受性の決定
HIVウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性決定は、次のように行われる:293T細胞は、NruIによって線形化されるpSRTプラスミド7.5μg、pVSV−Gプラスミド0.1μg、並びにHIVの逆転写酵素のPCR反応から生じる生成物0.5及び1μgによってトランスフェクトされる。トランスフェクションの沈殿物は、18時間の保温後に細胞から取り出され、かつ新鮮な増殖培地が、加えられる。24時間の培養後、上澄みは、遠心分離(500g、15分)によって浄化され、かつ4時間、三重のウェル中で、逆転写酵素阻害物質の連続希釈により予め保温されたP4指示細胞上に移される。使用される阻害物質の濃度範囲は、化合物に応じて異なる。マーカー遺伝子の活性化により生成される信号は、逆転写酵素阻害物質感受性の分析のように、48時間CPRGによって発達し、かつ指数IC50は、半有効方程式を使用して計算された。
【0109】
III−HIVウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性を決定する分析法の最適化
逆転写酵素のコドン24(塩基2618)から逆転写酵素のコドン432(塩基3872)にわたるpolをコードする領域中の欠失を有するpSRTプラスミドは、今日知られている耐性現象に関連する全ての突然変異を含む。PCRから生じる逆転写酵素生成物の相同的配列は、pSRT中の欠失から上流の88塩基対及び下流の186塩基に及ぶ。逆転写酵素阻害物質感受性を決定するためのトランスフェクションは、HeLa細胞よりも、高いトランスフェクトされる能力を有する293T細胞系統により行われる。このことは、細胞がP4細胞移動前に遠心分離によってウイルスを含む上澄みから除去されるので、問題とならない。
【0110】
移動条件は、チェッカーボードテストにより最適化される。プラスミド/PCRから生じた生成物の比率の変化は、生成された逆転写酵素若しくはP24の量又はCPRGによる反応速度を著しく変更しない。環状プラスミド、pVSV−Gが、293T細胞に対して非常に有毒であるように見えるので、その量はトランスフェクション混合物中で3μgから0.1μgに減少され、高いp24収率が導かれた(9.8ng/mlと比較して>20ng/ml)。
【0111】
逆転写酵素を含むウイルスの早期複製段階が、このタイプの決定においてP4指示細胞中で生じるので、逆転写酵素阻害物質の連続希釈により処理されるのは、これらの細胞である。
【0112】
使用される阻害物質の濃度範囲は、各化合物の細胞毒性に応じて、かつ耐性分離株の感受性に関して比率IC50/IC90に応じて選択される(表1)。例えば、P4細胞のabacavirに関する指数IC50が約250μMである一方、天然ウイルス株のこの化合物に関する指数IC50が約3μMであるので、耐性検出は、毒性により制限される。200μMに始まる4つの連続希釈の範囲が、abacavirに関して使用され、耐性の60倍までの検出を可能にした。
【0113】
他方では、P4細胞のAZTの毒性が高い(>300μM)一方、指数IC50が著しく低いので、(100倍までの)高い耐性レベルの検出を可能にするように、より広い希釈範囲が使用された(5μMからの1/10連続希釈)。
【0114】
耐性ウイルスに関する指数IC90の検出は、大部分の逆転写酵素阻害物質で、化合物の毒性レベルを要求し得るので、RVA逆転写酵素に関して、指数IC50が、指数IC90よりも使用される。
【0115】
表1は、NL4−3参照ウイルスの逆転写酵素阻害物質(RTI)感受性を表す。
【0116】
【表1】
【0117】
a−逆転写酵素阻害物質に関して反復した20回のテストの幾何平均及び標準偏差。
b−一定の薬剤の濃度範囲を使用して測定し得る、テストしたウイルス及びNL43の間の指数IC50及びIC90の最大近似差。
【0118】
HIVウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性を決定する分析法は、1.78(abacavir)から2.7(D4T及びAZT)の、20回のテストに関する幾何平均の標準偏差を生じさせる。テストした逆転写酵素阻害物質(RTI)(AZT、3TC、D4T、DDI、abacavir、efavirenz及びnevirapine)の中央標準偏差は、2.2である。患者の試料の自動的な結果解釈を簡単にするように、任意の耐性指数(IR)の値、IR=5が、NL43に対して著しく減少したと考えられるRTIへの感受性減少の最小限として定義された。
【0119】
NL43が、臨床分離株との比較に適した参照ウイルスであるか決定するために、平凡な処理によって患者から取られた試料パネルが、逆転写酵素阻害物質感受性に関して3つのRVA複製に対し、テストされた。
【0120】
テストした22のウイルスに関して見出だされた中央IC50は、(stavudineに関して)0.92、及び(lamivudine)1.22付近の中央IRを有するNL43ウイルスに関して見出されたそれよりも、僅かに大きい傾向がある。IRは、大部分のテストした試料の阻害物質全体に対して、定義された限度の5より小さいが、IR範囲は、特に非ヌクレオシド阻害物質に関して広いように見える。特にnevirapineの耐性指数の11.0は、あるウイルスに関して得られたが、しかるに、このウイルスは、NNRTI耐性において以前に関与していた逆転写酵素のコドン98(Sに対するA)に対する突然変異を有した。
【0121】
IV−再現性
組み換えウイルス(RVA)の逆転写酵素阻害物質(RTI)感受性の決定法の再現性は、RNA製剤及び別々のPCR反応を使用して、広範囲の感受性特徴を代表するように選択される5つの試料に関する一連のテストによって、試料毎に4から8回のテストで評価された。
【0122】
HIVウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性を決定するテスト間偏差は、幾つかの場合において、反復決定に関して見出された最大IR及び最小IRの間に5を超える差が存在することを示す(表2)が、しかしながら幾何平均の標準偏差は、(R4、AZT)を除く全ての場合において=2.2に維持される。試料の3つにおいて、反復テストの際に得られたIRが、ウイルスが適度に耐性を有し得る化合物に関して<5から>5まで変化する(IRは12以下)。
【0123】
表2は、RTI感受性の再現性を表す。
【0124】
【表2】
【0125】
(a)逆転写酵素阻害物質耐性に関連するとして既に公知であるアミノ酸置換のみを示す。
(b)耐性指数は、試料中のIC50の、比較決定されたNL43のそれに対する比率である。
(c)幾何平均。
(d)幾何平均の標準偏差。
(e)最低耐性指数で除した、テストで得られる最高耐性指数。
(f)ウイルスを耐性を有するとして分類する、耐性指数>4を生じるテスト数/行われたテスト総数。
(g)全てのテストで、検出可能な範囲を超えるIC50は、>で示す。これらの場合、標準偏差及び最小/最大は、適用されない(na)。
【0126】
これらの逆転写酵素阻害物質に関して得られた表現型結果は、試料の遺伝子型特徴との一致を示している。
【0127】
テストした全化合物に対して高い耐久度を示す試料R2は、減少したNNRTI感受性を誘導することで知られる突然変異(181C、190A)、及び184V突然変異に関連した3TC耐性、RTIヌクレオチド耐性を与える複数化合物耐性の複合体の突然変異(62V、75I、77L、116Y及び151M)を含み、複数の突然変異を含む。
【0128】
試料R3は、184V突然変異によって改めて変調された、高い3TC耐性レベルを示し、AZTに関して著しいIRの偏差があり、それはおそらく184Vによる、215Fによって誘導される耐性除去の不確実な性質を反映している。
【0129】
試料R4において、かかる除去は、208Y突然変異を含む複数の突然変異の存在によって阻まれる。
【0130】
試料R5は、103Nと組み合わせて、efavirenz及びnevirapineに対して観察される高い耐性レベルの原因である、100I突然変異の効果のために、41L突然変異及び215Y突然変異にもかかわらず、AZTで著しく保たれる。
【0131】
V−HIVウイルスの融合阻害物質感受性を決定する分析法の検証
プライマー:FuC:5’ATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3’(配列識別番号25)及び次のプライマー:FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)、FuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物によって行われる第2の増幅が続く、プライマー対FuA:5’AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3’(配列識別番号23)及びFuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)を、ステップ(b)の増幅のために使用して得られる組み換えは、非常に有効である。
【0132】
実際、満足のゆくウイルス生成物を得るためには、組み換えステップで使用されるPCR生成物10〜50ngで一般的に十分である。融合表現型特性を分析するためのこの方法において、p24の50〜400ng/mlに対応するウイルス生成物は、トランスフェクション後に得られる。標的細胞の感染に関して、p24の0.5〜5ng/ウェル(96ウェルプレート)が使用される。標的細胞の感染後に得られる光学密度の増加は、感染がこれらの条件で行われるならば、線形である。
【0133】
HIVウイルスの融合阻害物質感受性に関する分析法を検証するために、2つの融合阻害物質が使用された:すなわち(DP178又はT20と呼ばれる)HIVのgp41中の遠位ヘリックス配列から誘導されるペプチド、及びベツリン酸誘導体(RPR103611)である。各阻害物質に、2つの参照ウイルス:すなわち1次血漿ウイルスT5A1及び生体外培養に適したウイルス(LAI)に対し(他の著者によって以前に特定された)耐性を有する1つ以上のウイルスの感受性減少が行われた。全てのウイルスは、組み換えにより生成された。
【0134】
結果
V.1−DP178又はT20阻害物質
(Rimsky L.T.ら、J.Virol.1998,vol 72,pages 986−993に記載された)高い耐性を有するNL−DIMウイルス、及び(部分的に耐性を有する)NL4.3ウイルスに関するIC50の増加は、この阻害物質に対して測定された。
【0135】
高い耐性を有するDIMウイルスは、T5A1に対して80倍の、かつLAIに対して100倍を超えるIC50値の増加を示す。
【0136】
部分的に耐性を有するNL4.3ウイルスは、T5A1に対して10倍の、かつLAIに対して12.5倍のIC50の増加を特徴とする。
【0137】
V.1.1−血漿HIVのT20融合阻害物質感受性の決定
ウイルスRNAは、HIV陽性患者の血漿から抽出される。
【0138】
プライマー対ED3_E01−でPCRによる第1の増幅を行う。
【0139】
6322から8522の残渣に及ぶ2200塩基対のDNA断片を得るために、プライマー対E10_FuBでPCRによる第2の増幅を行う。
【0140】
−第2の増幅後に得られる核酸、
−6480から8263までの残渣に及ぶHIV外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、により第1細胞宿主のトランスフェクションを行う。
【0141】
ウイルス粒子を生成することを可能にする条件において第1細胞宿主を培養する。
【0142】
T20融合阻害物質の増加用量の存在下で、(ウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む)第2細胞宿主の、前のステップで生成したウイルス粒子による感染を行う。
【0143】
生体試料中に存在するHIVウイルスの、T20融合阻害物質感受性のレベルを明らかにするために、発現されたマーカーの定量化を行う。
【0144】
患者(P1、P2及びP3)の血漿中に存在するウイルス及び参照ウイルス原型(NL43及びDIM耐性クローン)に関する上記の表現型分析の結果は、添付の図5に図示され、かつ指数IC50は、以下の表3に示す。
【0145】
【表3】
【0146】
V.2−RPR103611阻害物質
この阻害物質に対し耐性を有するウイルスLAI−L91H(Labrosse B.ら、J Virol.2000 vol 74 pages 2142−2150)のIC50の増加が測定された。
【0147】
LAI−L91Hウイルスに関して、LAI及びT5A1に対するIC50の増加は、100倍を超える。
【0148】
VI−HIVウイルスの中和能力を決定する分析法の最適化
プライマー:NEU−C:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3’(配列識別番号18)及びプライマーFuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)及びFuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物による第2の増幅が続く、1対のプライマーNEU−A:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3’(配列識別番号17)及びFuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)を、ステップ(b)の増幅のために使用して得られる組み換えは、同様に非常に有効である。
【0149】
実際、ウイルス生成物の制御の際に、満足のゆくウイルス生成物を得るためには、組み換えステップで使用されるPCR生成物10〜50ngで一般的に十分であることが判明した。
【0150】
トランスフェクション後のp24の50〜400ng/mlに対応するウイルス生成物が、得られる。標的細胞の感染に関して、p24の0.5〜5ng/ウェル(96ウェルプレート)が使用される。標的細胞の感染後に得られる光学密度の増加は、感染がこれらの条件で行われるならば、線形である。
【0151】
VII−ウイルス感染力の測定(又は複製能力テスト)
プライマー対FITA及びPROA−でPCRによる第1の増幅を行う。
【0152】
1237から2725の残渣に及ぶ1488塩基対のDNA断片を得るために、プライマー対FITB及びPROB−でPCRによる第2の増幅を行う。
【0153】
−第2の増幅後に得られる核酸、
−Gagの1部分及びプロテアーゼ全体をコードする領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、により第1細胞宿主のトランスフェクションを行う。
【0154】
ウイルス粒子を生成することを可能にする条件において第1細胞宿主の培養を行う。
【0155】
p24抗原の量を決めるElisaテストによりこの培養上澄み中の組み換えウイルス粒子の量を測定する。
【0156】
ウイルス上澄みの漸増希釈によって(ウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む)第2細胞宿主の、前のステップで生成したウイルス粒子による感染を行う。
【0157】
組み換えウイルスの感染力レベルを明らかにするために、発現されたマーカーの定量化を行う。
【0158】
測定値からの回帰線を設定し、かつこの線の勾配を固定して、組み換えウイルスの複製能力を計算する。
【0159】
実験用参照ウイルスの複製能力に対する、又は処理の設定前かつ耐性の発達前に、同じ患者に由来するウイルス配列を保有する組み換えウイルスに関して、ウイルス複製能力を表す。得られた結果は、添付の図6に図示する。
【0160】
ウイルスL1、L2及びL3は、同じ患者において3回の異なる時期に得られたプロテアーゼ配列を保有する組み換えウイルスに対応する。ウイルスL1は、処理前に得られたプロテアーゼ配列を有する。各点は、3つのウイルスの各々の希釈によりP4指示細胞の感染後に測定された光学密度に対応する。各ウイルスの一連の測定のために、回帰線を引く。線の勾配を計算する。L2の勾配とL1の勾配の比率によってL2の複製能力を、かつL3の勾配とL1の勾配の比率によってL3の複製能力を表す。ここで参照ウイルスは、治療前のウイルスL1である。治療前のウイルスが無い時は、pNL4−3のような実験用参照ウイルスに関する患者のウイルスの複製能力を表すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
pSRTプラスミドを概略的に示す。
【図2】
逆転写酵素阻害物質による処理前及び後に、2人の患者対AZT及び3TCに関して得られた用量応答効果の曲線を図示する。
【図3】
本発明の方法の特殊な実施の最初のステップ(a及びb)の図式である。
【図4】
本発明の方法の特殊な実施のステップ(c)から(g)の図式である。
【図5】
患者(P1、P2及びP3)の血漿中に存在するウイルス及び参照ウイルス原型(NL43及びDIM耐性クローン)に関してT20融合阻害物質の存在下で得られる表現型分析の結果を図示する。
【図6】
様々な資料から抽出されたウイルスL1、L2及びL3の複製能力の測定結果を図示する。
Claims (43)
- ウイルス感染に影響を及ぼす可能性のあるウイルスのゲノムの1つ又は幾つかの突然変異から生じる、患者の生体試料中に存在するHIVウイルスの表現型特性の分析法であって:
a)前記生体試料中に含まれる核酸の抽出、
b)各々が少なくとも1つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む1対のプライマーを有する、ステップ(a)の核酸セグメントのPCRによる少なくとも1つの増幅、
c)ステップ(b)で増幅されたセグメントを除いて、かつ場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を除いて、ウイルス複製に必要なHIVウイルスのゲノムの部分を含むベクターの調製、
d)相同的組み換えによってキメラウイルスを得るために:
−ステップ(b)で得られる核酸、
−ステップ(c)で調製されるベクター、
−外被遺伝子がステップ(c)で調製されるベクターから欠失するならば、場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第2ベクター、による第1細胞宿主のトランスフェクション、
e)単一の複製サイクル中にウイルス粒子を生成することを可能にする条件における前記第1細胞宿主の培養、
f)HIVウイルス、又はHIV偽型ウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染の後に活性化可能なマーカー遺伝子を場合により含む少なくとも1つの第2細胞宿主の、ステップ(e)で得られるウイルス粒子による感染、
g)生体試料中に存在するHIVウイルスの少なくとも1つの特性を明らかにするための、ステップ(f)で発現されたマーカーの検出及び/又は定量化を含むことを特徴とする分析法。 - ステップ(b)のPCRによる増幅は、gag、pol、プロテアーゼ、逆転写酵素、RNA分解酵素H、インテグラーゼ、vif、vpr、tat、rev、vpu、env、nef、シス活性配列、LTR、二量化配列、スプライシング調整配列、又はRev応答要素(RRE)から選択されるウイルスのゲノム領域の全部又は部分を含む核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われることを特徴とする請求項1に記載の分析法。
- ステップ(b)のPCRによる増幅は、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのgagタンパク質の1部分をコードする核酸配列及びプロテアーゼをコードする核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われること、及びステップ(c)のベクターは、プロテアーゼをコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したHIVウイルスのゲノムから構成されることを特徴とする請求項1又は2のいずれかに記載の分析法。
- プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有するステップ(b)の増幅は、1237から2725までの残渣に及ぶ1488塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
Fit A−:(5’ TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3’)(配列識別番号1)及び
Pro A−:(5’ GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3’ 3’)(配列識別番号2)により行われ、1対のプライマー:
Fit B:(5’ AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3’)(配列識別番号3)及び
Pro B−:(5’ GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3’)(配列識別番号4)による第2の増幅が続くこと、及びステップ(c)のベクターは、1505から2565までの残渣に及ぶHIV−1のプロテアーゼをコードするpol読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項1から3に記載の分析法。 - ステップ(b)のPCRによる増幅は、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われ、かつステップ(c)のトランスフェクションは、逆転写酵素をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したHIVウイルスのゲノムから構成される第1ベクターによって行われることを特徴とする請求項1又は2に記載の分析法。
- ステップ(b)の増幅は、プロテアーゼをコードする領域のコドン93を超えて、かつポリメラーゼ(POL)をコードする領域のコドン503を超えて及ぶ1530塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
MJ3(5’ AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3’)(配列識別番号5)及び
RT−EXT(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(配列識別番号6)により行われ、1対のプライマー:
A35(5’ TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3’)(配列識別番号7)及び
RT−IN(5’ TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3’)(配列識別番号8)による第2の増幅ステップが続くこと、及びステップ(c)のベクターは、2618から2872までの残渣に及ぶHIV−1の逆転写酵素をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項1、2又は5に記載の分析法。 - ステップ(b)の増幅が、gagタンパク質、又はプロテアーゼ若しくは逆転写酵素をコードする核酸配列中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのgagタンパク質の1部分、プロテアーゼ及び逆転写酵素の1部分をコードする核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われることを特徴とする請求項1又は2に記載の分析法。
- ステップ(b)の増幅は、1237から4062の残渣に及ぶ2825塩基対のDNAセグメントを得るために、プライマー対:
gag+1(5’ AGGGGCAAATGGTACATCA 3’)(配列識別番号31)及び
RT−EX(配列識別番号6)により行われ、1対のプライマー:
Fit B+(配列識別番号1)及び
RT−IN(配列識別番号8)による第2の増幅ステップが続くこと、及びステップ(c)のトランスフェクションは、gag遺伝子の1部分、及び1507から3870までの残渣に及ぶHIV−1のプロテアーゼ及び逆転写酵素の1部分をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、外被領域中で欠失し、かつ唯一のNruI制限部位を含むレトロウイルスベクターによって行われることを特徴とする請求項1、2又は7に記載の分析法。 - ステップ(e)で得たウイルス粒子によって第2細胞宿主の感染前に、逆転写酵素の阻害化合物を場合により異なる濃度で、第2細胞宿主に付加すること又は付加しないこと、及びステップ(g)は、逆転写酵素の阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスの、逆転写酵素阻害化合物感受性を決定することからなる請求項1、2、5又は6に記載の分析法。
- ステップ(b)のPCRによる増幅は、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われ、かつステップ(c)のベクターは、インテグラーゼをコードする遺伝子の全部又は部分から欠失したレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項1又は2に記載の分析法。
- ステップ(b)の増幅は、3950から5410までの残渣に及ぶ1460塩基対のDNA断片を得るために、プライマー対:
INT B+ −5’GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3’(配列識別番号9)及び
INT B− 5’TTTTGGTGTTATTAATGCT3’(配列識別番号10)により行われ、プライマー対:
INT V+ 5’CACCCTAACTGACACAACAA3’(配列識別番号11)及び
INT V− 5’AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3’(配列識別番号12)による第2の増幅ステップが続くこと、及びステップ(c)のベクターは、4228から5093までの残渣に及ぶHIV−1のインテグラーゼをコードするpol読み取り枠全領域、及び6343位から7611位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項1、2又は10に記載の分析法。 - ステップ(e)の間、ステップ(f)の前に、インテグラーゼの阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、及びステップ(g)は、インテグラーゼの阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスのインテグラーゼ阻害化合物感受性を決定することからなる請求項1、2、10又は11に記載の分析法。
- ステップ(b)のPCRによる増幅は、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む1対のプライマーにより行われること、及びステップ(c)のベクターは、外被タンパク質をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したHIVウイルスのゲノムから構成されるレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項1又は2に記載の分析法。
- ステップ(c)のベクターは、Rev応答要素(RRE)を構成するHIV−1ゲノム領域の、7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項1、2又は13に記載の分析法。
- ステップ(b)の増幅は、7553から8517までの残渣に及ぶ965塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
FIN−A:5’TCAAATATTACAGGGCTGCT3’(配列識別番号13)及び
FIN−B:5’TAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号14)により行われ、プライマー対:
FIN−C:5’CTATTAACAAGAGATGGTGG3’(配列識別番号15)及び
FIN−D:5’TCCACCTTCTTCTTCGATT3’(配列識別番号16)により行われる第2の増幅ステップが続くこと、及びステップ(c)のベクターは、7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含むことを特徴とする請求項1、2、13又は14に記載の分析法。 - 外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、7635から8440までの残渣に及ぶ805塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
FuA:5’AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3’(配列識別番号23)及び
FuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)により行われ、プライマー:
FuC:5’ATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3’(配列識別番号25)及び次のプライマー:
FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)
FuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物により行われる第2の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは(10%:90%)から(90%:10%)、かつ非常に好ましくは(60%:40%)から(40%:60%)の比率で行われ、かつステップ(c)のベクターは、7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含むことを特徴とする請求項1、2、13又は14に記載の分析法。 - ステップ(b)の増幅は、6197〜6222の残渣から6197〜6222までの残渣まで及ぶ2106から2320の塩基対のDNA断片を得るために、1対のプライマー:
NEU−A:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3’(配列識別番号17)及び
FIN−B:5’TAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号14)により行われ、プライマー対:
NEU−C:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3’(配列識別番号18)及び
FIN−D:5’TCCACCTTCTTCTTCGATT3’(配列識別番号16)による第2の増幅ステップが続くこと、及びステップ(c)のベクターは、6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMlul制限部位を含むことを特徴とする請求項1、2、13又は14に記載の分析法。 - 外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、6322から8440までの残渣に及ぶ2118塩基対のDNA断片を得るために、1対のプライマー:
NEU−A:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3’(配列識別番号17)及び
FuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)により行われ、プライマー:
NEU−C:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3’(配列識別番号18)及びプライマー
FuD1:5’TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号26)及び
FuD2:5’TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3’(配列識別番号27)の混合物による第2の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは(10%:90%)から(90%:10%)、かつ非常に好ましくは(60%:40%)から(40%:60%)の比率で行われ、かつステップ(c)のベクターは、6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含むことを特徴とする請求項1、2、13又は14に記載の分析法。 - 外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む1対のプライマーによるステップ(b)の増幅は、6322から8522までの残渣に及ぶ2200塩基対のDNA断片を得るために、プライマー対:
ED3:5’TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG3’(配列識別番号28)及び
E01:5’TCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTAAAAA3’(配列識別番号29)により行われ、プライマー:
E10:5’GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGT3’(配列識別番号30)及び
FuB:5’GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3’(配列識別番号24)による第2の増幅ステップが続き、かつステップ(c)のベクターは、6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のMull制限部位を含むことを特徴とする請求項1、2、13又は14に記載の分析法。 - ステップ(b)の増幅は、6426から7364までの残渣に及ぶ938塩基対のDNAセグメントを得るために、1対のプライマー:
E00:5’TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3’(配列識別番号19)及び
ES8B:5’CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3’(配列識別番号20)により行われ、プライマー対:
E20:5’GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3’(配列識別番号21)及び
E115:5’AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3’(配列識別番号22)による第2の増幅ステップが続くこと、及びステップ(c)のベクターは、6617から7250までに及ぶHIV−1外被のV1ループからV3ループにわたるドメインをコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のNheI制限部位を含むことを特徴とする請求項1、2、13又は14に記載の分析法。 - ステップ(e)で得られる細胞宿主の培養の間、ステップ(f)の前に、HIV−1のgp41タンパク質を標的とする融合阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、及びステップ(g)は、HIV−1のgp41を標的とする融合阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスの、HIV−1のgp41タンパク質を標的とする融合阻害化合物感受性を決定することからなる請求項1、2、13から20に記載の分析法。
- ステップ(f)の感染前に、ステップ(e)で得られる細胞宿主に、標的細胞中へのHIVウイルス侵入阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、及びステップ(g)は、侵入阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスの、標的細胞中への前記HIVウイルス侵入阻害化合物感受性を決定することからなる請求項1、2、13、14又は16に記載の分析法。
- 一方では抗体無しで、かつ他方では抗体有りで、場合により異なる濃度で行われ、前記抗体は、ステップ(e)で存在すること、及びステップ(g)は、抗体有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスの抗体阻害作用感受性を決定することからなる請求項1、2、13、14又は17に記載の分析法。
- ステップ(e)で得られるウイルス粒子によるステップ(f)の感染は、2つの別の細胞宿主に対して行われ、かつステップ(g)は、2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とする細胞レセプターに関するHIVウイルスの向性を決定することからなる請求項1、2、13、14又は17に記載の分析法。
- ステップ(f)で感染した2つの細胞宿主の一方は、CCR5レセプターを発現し、かつ他方はCXCR4レセプターを発現することを特徴とする請求項24に記載の分析法。
- 培養ステップ(e)の間に、HIV−1のコレセプターを標的とする阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、ステップ(f)の感染は、2つの別の細胞宿主に対して行われること、及びステップ(g)は、2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスの、HIV−1のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を決定することからなる請求項1、2、13、14又は17に記載の分析法。
- ステップ(e)で得られるウイルス粒子によるステップ(f)の感染は、2つの別の細胞宿主に対して行われ、かつステップ(g)は、2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とする細胞レセプターに関してHIVウイルスの向性を分析することからなる請求項1、2、13、14又は20に記載の分析法。
- ステップ(d)の培養の間に、HIV−1のコレセプターを標的とする阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、ステップ(e)で得られるウイルス粒子によるステップ(f)の感染は、2つの別の細胞宿主に対して行われること、及びステップ(g)は、2つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスの、HIV−1のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を分析することからなる請求項1、2、13、14又は20に記載の分析法。
- ステップ(g)は、ステップ(a)から(f)を応用して得られるウイルス粒子により感染した第2細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、患者の生体試料と、かつステップ(a)から(f)を応用して得られる参照ウイルス粒子により感染した同じ第2細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、参照ウイルスを含む試料と比較すること含むことを特徴とするHIVウイルスの感染力又は複製能力を決定することからなる請求項1から20のいずれかに記載の分析法。
- 参照ウイルスから生じた参照ウイルス粒子は、治療の先行する段階又はその前に、ステップ(a)から(f)を同じ患者の生体試料に応用することにより得られるウイルス粒子であることを特徴とする請求項29に記載の分析法。
- 培養ステップ(e)の間か、第2細胞宿主かに、ステップ(f)での該第2細胞宿主の感染前に、ヒドロキシ尿素を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、及びステップ(g)は、ヒドロキシ尿素有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするHIVウイルスのヒドロキシ尿素感受性を決定することからなる請求項1から20に記載の分析法。
- 培養ステップ(e)は、12時間から72時間、好ましくは、24時間から48時間にわたる期間で行われることを特徴とする請求項1から31のいずれかに記載の分析法。
- i)少なくとも1つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む1対のプライマー、
ii)外被タンパク質をコードする遺伝子、及び(i)で定義したプライマーにより増幅されたセグメントを除き、ウイルス複製に必要なHIVウイルスのゲノム部分を含むベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第2ベクター、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項1から32のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。 - i)配列:
−配列識別番号1及び配列識別番号2
−配列識別番号3及び配列識別番号4のプライマー対、
ii)1505から2565までの残渣に及ぶHIV−1のプロテアーゼをコードするpol読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子を有する偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号5及び配列識別番号7
−配列識別番号6及び配列識別番号8のプライマー対、
ii)2618から2872までの残渣に及ぶHIV−1の逆転写酵素をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号9及び配列識別番号10
−配列識別番号11及び配列識別番号12のプライマー対、
ii)4228から5093までの残渣に及ぶHIV−1のインテグラーゼをコードするpol読み取り枠全領域、及び6343位から7611位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号13及び配列識別番号14
−配列識別番号15及び配列識別番号16のプライマー対、
ii)7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号23及び配列識別番号24
−配列識別番号27を有する配列識別番号25及び配列識別番号26のプライマー対、
ii)7745から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被のgp41サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号17及び配列識別番号14
−配列識別番号18及び配列識別番号16のプライマー対、
ii)6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号17及び配列識別番号24
−配列識別番号18及び配列識別番号26及び配列識別番号27のプライマー対、
ii)6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
−配列識別番号19及び配列識別番号20
−配列識別番号21及び配列識別番号22のプライマー対、
ii)6617から7250までに及ぶHIV−1外被のV1ループからV3ループにわたるドメインをコードする領域から欠失し、かつ唯一のNheI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
(配列識別番号5)及び(配列識別番号6)、
(配列識別番号7)及び(配列識別番号8)のプライマー対、
ii)2618から2872までの残渣に及ぶHIV−1の逆転写酵素をコードするpol読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のMluI制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。 - i)配列:
(配列識別番号28)及び(配列識別番号29)及び
(配列識別番号30)及び(配列識別番号24)のプライマー対、
ii)6480から8263までの残渣に及ぶHIV−1外被の大部分のgp120サブユニット及びgp41の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のMull制限部位を含むレトロウイルスベクター、
iii)外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
iv)HIVウイルスに感染した可能性がある第1細胞宿主、
v)HIVウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第2細胞宿主、
vi)PCRによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
vii)発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。
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WO2008047227A2 (en) * | 2006-10-20 | 2008-04-24 | Eurofins Viralliance Inc. | Method of assaying hiv-1 tropism for ccr5 and/or cxcr4 co-receptor and/or susceptibility to entry inhibitors |
EP1914309A1 (en) * | 2006-10-20 | 2008-04-23 | Eurofins Viralliance Inc. | Method of assaying HIV-1 tropism for CCR5 and/or CXCR4 co-receptor and/or susceptibility to entry inhibitors |
US20100173282A1 (en) | 2007-05-25 | 2010-07-08 | Tibotec Pharmaceuticals Ltd. | Mutational profile in hiv-1 gag cleavage site correlated with phenotypic drug resistance |
WO2014145408A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Johns Hopkins University | Clinical methods for determining hiv-1 receptor tropism and cellular reservoirs of hiv-1 replication |
WO2020150499A1 (en) * | 2019-01-16 | 2020-07-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods to tag and isolate cells infected with the human immunodeficiency virus |
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US5837464A (en) * | 1996-01-29 | 1998-11-17 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
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US6103462A (en) * | 1998-05-29 | 2000-08-15 | Institut Pasteur | Rapid single-cycle assay for human immunodeficiency virus type-1 drug resistance |
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