JP2005341883A - Lacto-n-biose phosphorylase gene, recombinant vector comprising the gene and transformant comprising the vector - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体に関する。 The present invention relates to a lacto N-biose phosphorylase gene, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the vector.
ラクトＮビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）は、ラクトＮビオース（ガラクトピラノシルβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン）をガラクトース−１−リン酸とＮ−アセチルグルコサミンに加リン酸分解する酵素であり、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）の菌体内にその活性が報告されている（非特許文献１）。本酵素はまたその逆反応を触媒することから、本酵素を用いることにより、食品用素材，医薬品用素材などとして有用と期待される種々のラクトＮビオース誘導体を合成することが可能である。このように、ラクトＮビオースホスホリラーゼは産業上極めて重要な酵素である。 Lactose N biose phosphorylase (EC 2.4.1.211) is an enzyme that phosphorylates lacto N biose (galactopyranosyl β1,3N-acetylglucosamine) into galactose-1-phosphate and N-acetylglucosamine. The activity of Bifidobacterium bifidum has been reported (Non-patent Document 1). Since this enzyme also catalyzes the reverse reaction, it is possible to synthesize various lacto N-biose derivatives that are expected to be useful as food materials, pharmaceutical materials, and the like. Thus, lacto N biose phosphorylase is an extremely important enzyme in the industry.
しかしながら、従来、ラクトＮビオースホスホリラーゼはビフィドバクテリウム・ビフィダム菌体から抽出したものが粗酵素あるいは部分精製酵素として利用されているにすぎず（非特許文献２）、該酵素を安定的に生産して工業的利用の向上を図ることは行われていなかった。 However, conventionally, lacto-N-biose phosphorylase extracted from Bifidobacterium bifidum cells has only been used as a crude enzyme or a partially purified enzyme (Non-patent Document 2), and the enzyme is stably used. Production and industrial use have not been improved.
ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子が提供されれば、それを用いることによりラクトＮビオースホスホリラーゼの安定的で効率的な生産が可能になると期待される。 If a lacto N biose phosphorylase gene is provided, it is expected that stable and efficient production of lacto N biose phosphorylase will be possible by using it.
そこで本発明は、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a lacto N bioose phosphorylase gene, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the vector.
本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
The present invention includes the following inventions.
(1) A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(B) DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having lacto N-biose phosphorylase activity
(C) Hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to all or part of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and lacto N-biose phosphorylase DNA encoding a protein having activity
（２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
(2) A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
(B) a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having lacto N-biose phosphorylase activity
(C) Hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to all or part of DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and lacto N biose phosphorylase DNA encoding a protein having activity
（３）上記（１）又は（２）に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（４）上記（３）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(3) A recombinant vector containing the gene according to (1) or (2) above.
(4) A transformant comprising the recombinant vector according to (3) above.
本発明によれば、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体が提供される。 According to the present invention, a lacto N-biose phosphorylase gene, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the vector are provided.
本発明は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有する。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号２０の第２８６〜２５３８番のＤＮＡ塩基配列が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１９の第２０〜２２７２番のＤＮＡ塩基配列が挙げられる。 The present invention relates to a gene comprising DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 has lacto N bioose phosphorylase activity. Examples of the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include the DNA base sequences of Nos. 286 to 2538 of SEQ ID NO: 20. Examples of the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include the 20th to 2272th DNA base sequences of SEQ ID NO: 19.
本発明に係る遺伝子はまた、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってよい。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、天然に生じたものであってもよく、部位特異的変異導入方法等を行った結果として生じたものであってもよい。 The gene according to the present invention is also a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and having a lacto N-biose phosphorylase activity It may be a gene consisting of DNA encoding. Amino acid deletion, substitution, or addition may occur naturally or may occur as a result of performing a site-directed mutagenesis method or the like.
本発明に係る遺伝子はまた、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。同様に、本発明に係る遺伝子はまた、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらにハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃での条件である場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」に含めることができる。 The gene according to the present invention also hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to all or part of DNA encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and It may be a gene consisting of DNA encoding a protein having lacto N-biose phosphorylase activity. Similarly, the gene according to the present invention also hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to all or part of DNA encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a gene consisting of DNA encoding a protein having lacto N-biose phosphorylase activity. Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a DNA having a high homology (a homology of 90% or more, preferably 95% or more) with a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid represented by SEQ ID NO: 1. Examples include conditions for hybridizing to DNA consisting of a base sequence complementary to DNA encoding a protein consisting of the sequence. More specifically, the sodium salt concentration is 15 to 750 mM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, the temperature is 25 to 70 ° C., preferably 50 to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C., This refers to conditions at a formamide concentration of 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%. Further, the filter washing conditions after hybridization are such that the sodium salt concentration is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably 55 to 70 ° C., more preferably 60. The conditions at ˜65 ° C. can also be included in the “stringent conditions” in the present invention.
ここで、「一部の配列」とは、所定の遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡがラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものを指す。また「一部の配列」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。 Here, the “partial sequence” refers to a base sequence of DNA containing a part of the base sequence of a predetermined gene, and the DNA encodes a protein having lacto N bioose phosphorylase activity. The “partial sequence” is a sequence having a length sufficient for hybridization under stringent conditions, for example, at least 10 bases, preferably at least 50 bases, more preferably at least 200 bases. Is an array.
ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性は、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中３０℃において、１０ｍＭ αガラクトース−１−リン酸及び１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミンから生じるリン酸の遊離量を測定することにより評価した。 The lacto N bioose phosphorylase activity was evaluated by measuring the amount of phosphate released from 10 mM α-galactose-1-phosphate and 10 mM N-acetylglucosamine in 30 mM at 50 ° C. MOPS buffer (pH 7.0). .
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、例えばビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４（理化学研究所微生物系統保存施設より入手可能）から、実施例に示す手法で得ることができる。ビフィドバクテリウム・ビフィダム由来のラクトＮビオースホスホリラーゼをクローニングするためには、ラクトＮビオースホスホリラーゼを完全精製された状態で入手することが不可欠である。しかしながら従来、部分精製の方法および部分精製酵素の利用が報告されているのみであり（非特許文献１，２）、完全精製は安定性の面から困難である旨が報告されていた（非特許文献１）。本発明者らは、疎水クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを効果的に配置することにより困難な完全精製に初めて成功した。そして、こうして得られた完全精製酵素を用いることにより本発明を完成するに至った。更にまた本遺伝子のクローニングを行うに際して、全アミノ酸配列情報を得ることが困難であり通常のＰＣＲ法では遺伝子全長を取得することが難しい。本発明者らは、鋭意研究の結果、ＤＮＡの内部配列を増幅してからその配列を元に実施例に詳述する特殊なＰＣＲ法を行うことによりタンパク質コード領域全長を取得することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The gene consisting of DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be obtained from, for example, Bifidobacterium bifidum JCM 1254 (available from RIKEN Microbial System Storage Facility) by the method shown in the Examples. Can be obtained. In order to clone the lacto N-biose phosphorylase derived from Bifidobacterium bifidum, it is essential to obtain the lacto-N biose phosphorylase in a completely purified state. However, conventionally, only a method of partial purification and use of a partially purified enzyme have been reported (Non-Patent Documents 1 and 2), and it has been reported that complete purification is difficult in terms of stability (Non-patent). Reference 1). The present inventors have succeeded for the first time in difficult complete purification by effectively arranging hydrophobic chromatography and ion exchange chromatography. The present invention has been completed by using the completely purified enzyme thus obtained. Furthermore, when cloning this gene, it is difficult to obtain information on all amino acid sequences, and it is difficult to obtain the full length of the gene by a normal PCR method. As a result of intensive studies, the present inventors have found that the full-length protein coding region can be obtained by amplifying the internal sequence of DNA and then performing a special PCR method detailed in the examples based on that sequence. The headline and the present invention were completed.
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＪＣＭ １２１７株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手可能）から、実施例に示す手法で得ることができる。本遺伝子を得るためには、まず、タンパク質コード領域の外側のＤＮＡ配列に対するプライマーを作成しＰＣＲにて増幅できる条件を検討した後に、得られた増幅断片の配列をもとにプライマーを設計し全長配列のクローニングを行うという二段階のＰＣＲを行うことを特徴とする方法を用いる必要があった。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、データベース上に開示されているビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５株由来の機能未知遺伝子ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と９７％程度の相同性を示すのであるが、本発明に係る遺伝子の入手にもまた酵素の完全精製が必須であったこと及び上記のように二段階の特殊なＰＣＲ増幅を行う必要があることに鑑みれば、機能未知遺伝子ＢＬ１６４１が開示されているという事実にかかわらず、本発明に係る遺伝子を入手することは決して容易なことではない。 A gene comprising a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was carried out from, for example, Bifidobacterium longum JCM 1217 strain (available from RIKEN Microbial System Storage Facility) It can be obtained by the method shown in the example. To obtain this gene, first create a primer for the DNA sequence outside the protein coding region and study the conditions for amplification by PCR, then design the primer based on the sequence of the obtained amplified fragment, It was necessary to use a method characterized by performing a two-step PCR of cloning a sequence. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 shows about 97% homology with the amino acid sequence encoded by the function-unknown gene BL1641 derived from Bifidobacterium longum NCC2705 strain disclosed in the database. However, in view of the fact that the complete purification of the enzyme is also essential for obtaining the gene according to the present invention and that it is necessary to perform two-step special PCR amplification as described above, the function unknown gene BL1641 is disclosed. Regardless of the fact that it has been obtained, it is not easy to obtain the gene according to the present invention.
本発明はまた、本発明の遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また、該ベクター自体が単独では複製され得ないものであっても、宿主の染色体に挿入されることによって、複製可能となるものであればよい。 The present invention also relates to a recombinant vector containing the gene of the present invention. The vector for inserting the gene of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and examples thereof include plasmids, shuttle vectors, helper plasmids and the like. In addition, even if the vector itself cannot be replicated alone, it can be any one that can be replicated by being inserted into the host chromosome.
プラスミドとしては特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ系プラスミド、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹｅｐ１３等のＹｅｐ系、Ｙｃｐ５０等のＹｃｐ系等）が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、特に限定されないが、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらにはレトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることができる。 The plasmid is not particularly limited, but a plasmid derived from E. coli (for example, pET plasmid, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), a plasmid derived from Bacillus subtilis (for example, pUB110, pTP5, etc.), yeast Plasmids derived from the origin (for example, Yep systems such as Yep13, Ycp systems such as Ycp50, etc.), and phage DNAs are not particularly limited, but λ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, etc.) Is mentioned. Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
本発明はまた、これらの組換えベクターを含む形質転換体に関する。かかる形質転換体は、前記組換えベクターを用いて宿主を形質転換することにより得ることができる。前記形質転換は、例えばプロトプラスト法、塩化ルビジウム法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等の常法により行われる。宿主としては、ラクトＮビオースホスホリラーゼの発現に適する宿主であればよく、微生物が好ましく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。 The present invention also relates to a transformant containing these recombinant vectors. Such a transformant can be obtained by transforming a host using the recombinant vector. The transformation is performed by a conventional method such as a protoplast method, a rubidium chloride method, a calcium chloride method, an electroporation method, or a competent cell method. The host may be any host that is suitable for the expression of lacto N bioose phosphorylase, and is preferably a microorganism. ) Yeast belonging to the genus, yeast belonging to the genus Candida such as Candida maltosa, animal cells such as COS cells, CHO cells, mouse L cells, rat GH3, human FL cells, insects such as SF9 cells Examples include cells.
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by these.
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株（理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市広沢２番１号）より入手）を減酸素条件下において栄養培地にて培養したのち、培養物から菌体を分離した。次いで該菌体（培養液４Ｌ分）を１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で定法により破砕した後、遠心分離を行い菌体破砕液を得た。該菌体破砕液に硫酸アンモニウムを３０％飽和濃度に達するまで加え、生じた沈殿を遠心分離にて除去した。該遠心上清を、３０％飽和濃度硫酸アンモニウムを含んだ１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ （東ソー）カラムに通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中３０％飽和〜０％の硫酸アンモニウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、硫酸アンモニウムを終濃度６０％飽和になるよう加え、遠心分離により沈殿を回収した。該沈殿を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解した後、同緩衝液により平衡化されたＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー）カラムに通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１５０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、硫酸アンモニウムを終濃度６０％飽和になるよう加え、遠心分離により沈殿を回収した。該沈殿を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解した後、同緩衝液により平衡化されたＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１５０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析することにより、精製されたラクトＮビオースホスホリラーゼを得た。得られた酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一のバンドを示し高度に精製されていた。 Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain (obtained from RIKEN Microbial System Preservation Facility (2-1 Hirosawa, Wako City, Saitama Prefecture)) was cultured in nutrient medium under hypoxic conditions, and then the cells from the culture Separated. Next, the cells (4 L of culture solution) were crushed by a conventional method in 10 mL of 10 mM MOPS buffer (pH 7.0), and then centrifuged to obtain a cell lysate. Ammonium sulfate was added to the cell disruption solution until reaching a 30% saturation concentration, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The centrifugation supernatant was passed through a Butyl-Toyopearl 650M (Tosoh) column equilibrated with 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 30% saturated ammonium sulfate, and adsorbed from the column. The enzyme was eluted with a gradient from 30% saturated to 0% ammonium sulfate in buffer (pH 7.0). After the fractions showing lacto N bioose phosphorylase activity were collected, ammonium sulfate was added to a final concentration of 60% saturation, and the precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was redissolved in 10 mM MOPS buffer (pH 7.0), passed through a DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh) column equilibrated with the same buffer, adsorbed, and then 10 mM MOPS buffer was adsorbed from the column. The enzyme was eluted with a concentration gradient of 150-300 mM sodium chloride in the solution (pH 7.0). After the fractions showing lacto N bioose phosphorylase activity were collected, ammonium sulfate was added to a final concentration of 60% saturation, and the precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was redissolved in 10 mM MOPS buffer (pH 7.0), passed through a MonoQ column (Amersham) equilibrated with the same buffer, adsorbed, and then 10 mM MOPS buffer ( The enzyme was eluted with a gradient of 150-300 mM sodium chloride in pH 7.0). The fractions showing lacto N bioose phosphorylase activity were collected and dialyzed against 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) to obtain purified lacto N biose phosphorylase. The resulting enzyme showed a single band on SDS-PAGE and was highly purified.
この精製ラクトＮビオースホスホリラーゼについて、プロテインシーケンサー（PerkinElmer社製）により、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。決定した配列を配列番号３に示す。さらに、このラクトＮビオースホスホリラーゼをＶ８プロテアーゼ（Merck社製）で分解してペプチドフラグメントを調製し、２種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を配列番号４及び５に示す。 With respect to this purified lactose N-biose phosphorylase, the N-terminal amino acid sequence was determined by a protein sequencer (PerkinElmer). The determined sequence is shown in SEQ ID NO: 3. Furthermore, this lacto N biose phosphorylase was digested with V8 protease (Merck) to prepare peptide fragments, and the amino acid sequences of the two types of peptide fragments were determined. The determined amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 4 and 5.
解読されたアミノ酸配列について相同検索を行ったところ、ＢＬ１６４１としてＧＥＮＥＳ Ｄａｔａｂａｓｅに登録されているビフィドバクテリウム・ロンガム由来の機能未知遺伝子産物と高い相同性（相同性８１％）を示した。そこでこのＢＬ１６４１のゲノム情報を基に、隣接するタンパク質コード領域及びタンパク質コード領域内部を増幅するために２つのフォーワードプライマー（配列番号６及び７）及び２つのリバースプライマー（配列番号８及び９）を作成した。 When the homologous search was performed on the decoded amino acid sequence, it showed a high homology (81% homology) with a function-unknown gene product derived from Bifidobacterium longum registered in GENES Database as BL1641. Therefore, based on the genomic information of BL1641, two forward primers (SEQ ID NOs: 6 and 7) and two reverse primers (SEQ ID NOs: 8 and 9) are used to amplify the adjacent protein coding region and the protein coding region. Created.
これらのプライマーを組み合わせて使用し、InstaGene Matrix（Bio-Rad社製）を用いて調製したビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株及びビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、それぞれＰＣＲ反応により増幅させた。 Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain and Bifidobacterium longum JCM 1217 strain (RIKEN microbial strain storage facility) prepared using InstaGene Matrix (Bio-Rad) using these primers in combination Obtained from the genomic DNA as a template, and each was amplified by PCR reaction.
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７に記載したフォーワードプライマーと、配列番号８に記載したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７４℃３分を２７サイクル）を行ない、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１８４８ｂｐの明瞭なバンドが確認された。このバンドをクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１８で示すＤＮＡ塩基配列（１７８８ｂｐ）が含まれていることが決定された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列の一部分と相同であることが確認された（相同性９３％）。すなわち、配列番号１８で示すＤＮＡ塩基配列がタンパク質コード領域の一部分であると推定された。 Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain genomic DNA was used as a template, PCR reaction using the forward primer set forth in SEQ ID NO: 7 and the reverse primer set forth in SEQ ID NO: 8 (PCR condition: KOD Dash (as polymerase) (Toyobo) was used for 27 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 3 minutes. When the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, a clear band of 1848 bp was confirmed. When this band was cloned and analyzed with a DNA sequencer, it was determined that the DNA base sequence (1788 bp) represented by SEQ ID NO: 18 was contained. When this DNA base sequence was translated into amino acids, it was confirmed to be homologous with a part of the amino acid sequence encoded by BL1641 (homology 93%). That is, it was estimated that the DNA base sequence represented by SEQ ID NO: 18 was a part of the protein coding region.
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株由来遺伝子の完全長のタンパク質コード領域を取得するために、解析されたＤＮＡ塩基配列（配列番号１８）の情報をもとにＰＣＲ増幅を更に行った。 In order to obtain the full-length protein coding region of the gene derived from Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain, PCR amplification was further performed based on the information of the analyzed DNA base sequence (SEQ ID NO: 18).
完全長のタンパク質コード領域を含むＤＮＡの５’末端側上流を増幅することを目的として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６に示すフォーワードプライマーと配列番号１０に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７４℃３分を２７サイクル）を行ない、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１９４９ｂｐの明瞭なバンドが確認された。更にまた、完全長のタンパク質コード領域を含むＤＮＡの３’末端側下流を増幅することを目的として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、解析されたＤＮＡ塩基配列（配列番号１８）をもとに作製したプライマー（配列番号１１〜１３）を用いてサーマルアシンメトリックインターレイストＰＣＲ法（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社、１９９７年、８３頁）を行った（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡） ＰＣＲ１回目 ９４℃１分、６５℃１分、６８℃３分を５サイクル、９４℃１分、２５℃３分、６８℃３分を１サイクル、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒４９℃１分、６８℃３分を１５サイクル： ＰＣＲ２回目 ９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒４９℃１分、６８℃３分を１５サイクル）。反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１０００ｂｐの明瞭なバンドが確認された。 For the purpose of amplifying the 5′-terminal upstream of DNA containing the full-length protein coding region, the forward primer shown in SEQ ID NO: 6 and the SEQ ID NO: 6 were used with the genomic DNA of Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain as a template. PCR reaction using the reverse primer shown in Fig. 10 (PCR conditions: KOD Dash (Toyobo) as polymerase, 27 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 74 ° C for 3 minutes), and the reaction product was agarose. When subjected to gel electrophoresis, a clear band of 1949 bp was confirmed. Furthermore, for the purpose of amplifying the 3 ′ downstream side of the DNA containing the full-length protein coding region, the analyzed DNA base sequence (sequence) using the genomic DNA of Bifidobacterium bifidum JCM 1254 as a template. No. 18) using a primer (SEQ ID NO: 11 to 13) prepared based on thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR, “Plant PCR Experiment Protocol”, Isao Shimamoto, Takuji Sasaki, Shujunsha (1997, page 83) (PCR conditions: polymerase KOD plus (Toyobo) PCR 1st 94 ° C 1 minute, 65 ° C 1 minute, 68 ° C 3 minutes, 5 cycles, 94 ° C 1 minute, 25 ° C 3 minutes, 68 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 63 ° C for 1 minute, 68 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 63 ° C for 1 minute, 68 ° C for 3 minutes, 94 ° C 30 seconds 49 ° C 1 minute, 68 ° C 3 minutes 15 cycles: 2nd PCR 94 ° C 30 seconds, 63 ° C 1 minute, 68 ° C 3 minutes, 94 ° C 30 seconds, 63 ° C 1 minute, 68 ° C 3 minutes, 94 15 cycles of 30 seconds at 49 ° C for 1 minute and 68 ° C for 3 minutes) When the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, a clear band of about 1000 bp was confirmed.
こうして得られた２つのバンドをそれぞれクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析してＤＮＡ塩基配列をそれぞれ解読した。解読結果から、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株ゲノムＤＮＡ中には、配列番号２０で示すＤＮＡ塩基配列が存在することが確認された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、配列番号２０の第２８６番〜第２５３８番がコードするアミノ酸配列が、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と相同であることが確認された（相同性９０％）。すなわち、配列番号２０の第２８６番〜第２５３８番がタンパク質コード領域であると推定された。 The two bands thus obtained were each cloned and analyzed with a DNA sequencer to decode the DNA base sequence. From the decoding result, it was confirmed that the DNA base sequence represented by SEQ ID NO: 20 exists in the Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain genomic DNA. When this DNA base sequence was translated into amino acids, it was confirmed that the amino acid sequence encoded by Nos. 286 to 2538 of SEQ ID NO: 20 was homologous to the amino acid sequence encoded by BL1641 (homology 90%). . That is, it was estimated that the 286th to 2538th of SEQ ID NO: 20 was the protein coding region.
また、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６に記載したフォーワードプライマーと、配列番号９に記載したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行ない（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９８℃１０秒、６０℃１０秒、７４℃２分を２７サイクル）、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、２６００ｂｐの明瞭なバンドが確認された。このバンドをＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１９で示すＤＮＡ塩基配列（２３３５ｂｐ）が含まれていることが決定された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、配列番号１９の第２０番〜第２２７２番（２２５３ｂｐ）がコードするアミノ酸配列が、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と相同であることが確認された（相同性９７％）。すなわち、配列番号１９の第２０番〜第２２７２番がタンパク質コード領域であると推定された。 In addition, PCR amplification was performed using the genomic DNA of Bifidobacterium longum JCM 1217 strain as a template and using the forward primer set forth in SEQ ID NO: 6 and the reverse primer set forth in SEQ ID NO: 9 (PCR condition: polymerase As the reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis using a KOD Dash (Toyobo Co., Ltd., 27 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 74 ° C. for 2 minutes), a clear band of 2600 bp was confirmed. When this band was analyzed by a DNA sequencer, it was determined that the DNA base sequence (2335 bp) represented by SEQ ID NO: 19 was contained. When this DNA base sequence was translated into amino acids, it was confirmed that the amino acid sequence encoded by No. 20 to No. 2272 (2253 bp) of SEQ ID NO: 19 was homologous to the amino acid sequence encoded by BL1641 (homology 97%). That is, it was estimated that SEQ ID NO: 19 from No. 20 to No. 2272 were protein coding regions.
次に、これらのタンパク質コード領域がラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子であることを確認するために、大腸菌による遺伝子の発現系を構築した。 Next, in order to confirm that these protein coding regions are lacto N biose phosphorylase genes, a gene expression system using E. coli was constructed.
タンパク質コード領域の５’末端配列及び３’末端配列をもとにプライマー（配列番号１４〜１７）を作成した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株については配列番号１４のフォーワードプライマー及び配列番号１５のリバースプライマーを用い、また、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株については配列番号１６のフォーワードプライマー及び配列番号１７のリバースプライマーを用い、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてタンパク質コード領域の全長をＰＣＲにより増幅した（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９６℃１５秒、６０℃１５秒、７４℃２分を２７サイクル）。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ２８ａ（Novagen社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌ＢＬ２１株（Novagen社製）を形質転換した。形質転換はジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いる電気穿孔法により行った。 Primers (SEQ ID NOs: 14 to 17) were prepared based on the 5 'end sequence and 3' end sequence of the protein coding region. For Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain, the forward primer of SEQ ID NO: 14 and reverse primer of SEQ ID NO: 15 are used, and for Bifidobacterium longum JCM 1217 strain, the forward primer and sequence of SEQ ID NO: 16 are used. Using the reverse primer of No. 17, the entire length of the protein coding region was amplified by PCR using each genomic DNA as a template (PCR conditions: using KOD Dash (Toyobo) as a polymerase, 96 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, 74 2 cycles of 2 minutes at 27 ° C.). The PCR product was digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and then ligated to a similarly treated commercially available gene expression plasmid pET28a (Novagen) using a DNA ligation kit (Takara Shuzo). Furthermore, according to the method described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition" 1.74 Vo1. 1 (1989) using these plasmids. BL21 strain (Novagen) was transformed. Transformation was performed by electroporation using Gene Pulser (manufactured by BioRad).
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子を発現させ、組換えタンパク質の生産を行った。これらの組換えタンパク質がラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有していたことからクローニングされた遺伝子がいずれもラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが確認された。なお、ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性はαガラクトース１リン酸とＮアセチルグルコサミンからのリン酸遊離、及びラクトＮビオースの加リン酸分解によるガラクトース１リン酸とＮアセチルグルコサミンの生成により確認した。 Using the transformant obtained as described above, the gene was expressed according to a conventional method to produce a recombinant protein. Since these recombinant proteins had lacto N biose phosphorylase activity, it was confirmed that all the cloned genes were lacto N biose phosphorylase genes. In addition, the lacto N-biose phosphorylase activity was confirmed by the release of phosphate from α-galactose monophosphate and N-acetylglucosamine and the production of galactose-monophosphate and N-acetylglucosamine by phosphorolysis of lacto N-biose.
また、活性型ラクトＮビオースホスホリラーゼの分子量を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて評価したところ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株由来ラクトＮビオースホスホリラーゼ及びビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株由来ラクトＮビオースホスホリラーゼのいずれについても約８５,０００ダルトンであり、遺伝子でコードされるタンパク質の分子量８４,２５０及び８４,３２７とそれぞれ良く一致していた。 In addition, the molecular weight of the activated lacto N biose phosphorylase was evaluated using SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The strain-derived lacto N-biose phosphorylase was about 85,000 daltons, which was in good agreement with the molecular weights 84,250 and 84,327 of the protein encoded by the gene.
以上の通り、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子が見出された。すなわち、ラクトＮビオースホスホリラーゼの構造遺伝子は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株では配列番号２０の塩基配列中の２８６番目以降２５３８番目までの間に、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株では配列番号１９の塩基配列中の２０番目以降２２７２番目までの間にそれぞれ存在することが確認された。 As described above, the lacto N bioose phosphorylase gene was found. That is, the structural gene of lacto N-biose phosphorylase is between 286 and 2538 in the base sequence of SEQ ID NO: 20 in Bifidobacterium bifidum JCM 1254 strain, and in Bifidobacterium longum JCM 1217 strain. It was confirmed to exist between the 20th and 2272th positions in the base sequence of SEQ ID NO: 19, respectively.
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
Sequence number 6: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 7: synthetic DNA
Sequence number 8: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 9: synthetic DNA
SEQ ID NO: 10: synthetic DNA
SEQ ID NO: 11: synthetic DNA
SEQ ID NO: 12: synthetic DNA
SEQ ID NO: 13: synthetic DNA
SEQ ID NO: 14: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 15: synthetic DNA
SEQ ID NO: 16: synthetic DNA
Sequence number 17: Synthetic DNA
Claims (4)
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(B) DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having lacto N-biose phosphorylase activity
(C) Hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to all or part of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and lacto N-biose phosphorylase DNA encoding a protein having activity
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ A gene comprising the following DNA (a), (b) or (c):
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
(B) a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having lacto N-biose phosphorylase activity
(C) Hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to all or part of DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and lacto N biose phosphorylase DNA encoding a protein having activity
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