JP2014187886A - METHOD FOR PRODUCING 1,3-βGALACTOSYL-N-ACETYLHEXOSAMINE PHOSPHORYLASE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、1,3-βガラクトシル-N-アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（GLNBP）高生産能を示すビフィドバクテリウム属菌、該菌を用いたGLNBPの製造方法、及び該菌のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a Bifidobacterium genus exhibiting a high production ability of 1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase (GLNBP), a method for producing GLNBP using the bacterium, and a screening method for the bacterium.
1,3-βガラクトシル−N−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（EC 2.4.1.211；別名1,3-βガラクトシル-N-アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ、又はガラクト-N-ビオース／ラクト-N-ビオースIホスホリラーゼ）（以下、GLNBPと略称することがある）は、ラクトNビオース（別名ガラクトピラノシルβ1,3N-アセチルグルコサミン）をガラクトース-1-リン酸とN-アセチルグルコサミンに加リン酸分解する活性及びその逆反応触媒活性を有する、ビフィドバクテリウム属菌の菌体内酵素として知られている（例えば、特許文献１）。GLNBPの存在はビフィドバクテリウム属菌の間で広く見出されている（非特許文献１）。GLNBPは、食品用素材や医薬品用素材として利用することができる種々のラクトNビオース誘導体、例えばラクト-N-ビオースI（以下、LNBと略称することがある）やガラクト-N-ビオース（以下、GNBと略称することがある）等の製造に用いられている（例えば、特許文献２）。 1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase (EC 2.4.1.211; also known as 1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase, or galacto-N-biose / lacto-N-biose I phosphorylase) GLNBP (sometimes abbreviated as GLNBP) is an activity of phosphorolytic decomposition of lacto N-biose (also known as galactopyranosyl β1,3N-acetylglucosamine) into galactose-1-phosphate and N-acetylglucosamine and its reverse reaction catalyst It is known as an intracellular enzyme of Bifidobacterium having an activity (for example, Patent Document 1). The presence of GLNBP is widely found among Bifidobacterium (Non-Patent Document 1). GLNBP is a variety of lacto N biose derivatives that can be used as food materials and pharmaceutical materials, such as lacto-N-biose I (hereinafter sometimes abbreviated as LNB) and galacto-N-biose (hereinafter, (It may be abbreviated as GNB) and the like (for example, Patent Document 2).
多くのビフィドバクテリウム属菌では、GLNBP活性（生産）の誘導にLNB等の高価な糖を炭素源として必要とする（非特許文献１）。そのため、ビフィドバクテリウム属菌からGLNBPを安価に調製することは難しい。一方、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）は、比較的安価な糖であるグルコースを炭素源とした培地でもGLNBPを生産するが、その培養液当たりの活性は低く、効率的にGLNBPを生産させることはできない。 Many Bifidobacterium spp. Require expensive sugars such as LNB as a carbon source for induction of GLNBP activity (production) (Non-patent Document 1). Therefore, it is difficult to prepare GLNBP from Bifidobacterium at low cost. Bifidobacterium bifidum, on the other hand, produces GLNBP even in a medium using glucose, which is a relatively inexpensive sugar, as a carbon source, but its activity per culture is low and it produces GLNBP efficiently. I can't let you.
本発明は、GLNBP高生産能を示すビフィドバクテリウム属菌を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a genus Bifidobacterium exhibiting a high productivity of GLNBP.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、スクロースを炭素源としてGLNBP高生産能を示すビフィドバクテリウム属菌が高頻度に出現することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that Bifidobacterium spp. Exhibiting high GLNBP high productivity using sucrose as a carbon source appears frequently, and completed the present invention. It came to do.
すなわち、本発明は以下を包含する。 That is, the present invention includes the following.
[１] スクロースを炭素源として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブエスピー・ロンガムJCM1217株と比較して10倍以上高い1,3-βガラクトシル-N-アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（GLNBP）生産能を示す、GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌。 [1] Using sucrose as a carbon source, it exhibits 1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase (GLNBP) -producing ability that is 10 times higher than Bifidobacterium longum, subsp. Longum JCM1217 strain, GLNBP highly productive Bifidobacterium.
一実施形態では、上記ビフィドバクテリウム属菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガムであり、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブエスピー・ロンガムであってもよい。 In one embodiment, the Bifidobacterium spp. Is Bifidobacterium longum, for example, Bifidobacterium longum subsp. Longum.
上記GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブエスピー・ロンガムGLN-1株（受託番号NITE P-1540）、GLN-15株（受託番号NITE P-1541）若しくはGLN-16株（受託番号NITE P-1542）又はそれらの変異株が挙げられる。 As the above-mentioned GLNBP highly productive Bifidobacterium, Bifidobacterium longum, subsp. Longum GLN-1 strain (Accession number NITE P-1540), GLN-15 strain (Accession number NITE P-1541) Alternatively, GLN-16 strain (Accession No. NITE P-1542) or a mutant thereof can be mentioned.
[２] 上記[１]のGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌を、スクロースを炭素源として含む培地において培養し、生産されたGLNBPを回収することを含む、GLNBPの製造方法。 [2] A method for producing GLNBP, comprising culturing the GLNBP highly productive Bifidobacterium of [1] above in a medium containing sucrose as a carbon source, and collecting the produced GLNBP.
[３] スクロースを炭素源として含む培地において、GLNBP遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌を培養し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブエスピー・ロンガムJCM1217株と比較して10倍以上高いGLNBP生産能を示す菌を選抜することを含む、GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌をスクリーニングする方法。 [3] Bifidobacterium with GLNBP gene is cultured in a medium containing sucrose as a carbon source, and GLNBP production capacity is 10 times higher than Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 A method for screening a GLNBP highly productive Bifidobacterium genus, comprising selecting a bacterium exhibiting the above.
一実施形態では、前記培養前に、GLNBP遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌に変異を導入することをさらに含んでよい。 In one embodiment, the method may further include introducing a mutation into a Bifidobacterium having a GLNBP gene before the culture.
本発明により、スクロースを炭素源としてGLNBP高生産能を示すビフィドバクテリウム属菌が提供される。 According to the present invention, a Bifidobacterium genus having high GLNBP production ability using sucrose as a carbon source is provided.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌
本発明は、GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌に関する。本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌は、特にスクロースを炭素源とした場合に、従来のビフィドバクテリウム属菌と比較してGLNBPを高生産することができる。本発明において、炭素源とは、1以上の炭素原子を含む化合物であって、本発明のビフィドバクテリウム属菌が吸収し生体構成炭素として利用する（資化する）化合物をいう。
1. GLNBP highly productive Bifidobacterium genus The present invention relates to a GLNBP highly productive Bifidobacterium genus. The GLNBP highly-productive Bifidobacterium genus according to the present invention can produce GLNBP at a higher level than conventional Bifidobacterium, particularly when sucrose is used as a carbon source. In the present invention, a carbon source refers to a compound containing one or more carbon atoms, which is absorbed (utilized) by the Bifidobacterium of the present invention and used as bioconstitutive carbon.
本発明において、ビフィドバクテリウム属菌とは、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する細菌をいう。本発明において、ビフィドバクテリウム属菌は、1,3-βガラクトシル-N-アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ遺伝子（GLNBP遺伝子）を有する。GLNBP遺伝子は、ビフィドバクテリウム属菌が生来有している内在性のものであることが好ましい。 In the present invention, the genus Bifidobacterium refers to a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium. In the present invention, the genus Bifidobacterium has a 1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase gene (GLNBP gene). The GLNBP gene is preferably an endogenous gene inherent in Bifidobacterium.
本発明において、ビフィドバクテリウム属菌が有するGLNBP遺伝子は、配列番号１に示すBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株のGLNBP遺伝子の塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、例えば97％以上又は98％以上の塩基配列同一性を有し、かつGLNBP活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってよい。あるいは、本発明において、ビフィドバクテリウム属菌が有するGLNBP遺伝子は、配列番号２に示すBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株のGLNBPタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は配列番号２に示すアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、例えば97％以上又は98％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつGLNBP活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってよい。 In the present invention, the GLNBP gene possessed by the genus Bifidobacterium is 70% or more, preferably the base sequence of the GLNBP gene of Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may be a gene encoding a protein having a base sequence identity of 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, such as 97% or more or 98% or more, and having GLNBP activity. Alternatively, in the present invention, the GLNBP gene possessed by Bifidobacterium belongs to the gene encoding the amino acid sequence of the GLNBP protein of Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 strain shown in SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 It may be a gene encoding a protein having amino acid sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, such as 97% or more or 98% or more, and having GLNBP activity.
本発明におけるビフィドバクテリウム属菌は、天然源から分離した野生型ビフィドバクテリウム属菌であってよく、その変異型ビフィドバクテリウム属菌であってもよい。変異型ビフィドバクテリウム属菌は、自然突然変異又は人為的突然変異により、遺伝的な変異が生じた菌であってよい。人為的突然変異の導入は当業者に周知のいかなる方法で行ってもよく、例えば、X線照射及びUV照射等の物理的方法、並びに5-ブロモウラシル若しくは2-アミノプリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシアミン、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホン酸（EMS）等の突然変異剤を使用する化学的方法を用いてよい。 The Bifidobacterium in the present invention may be a wild-type Bifidobacterium isolated from a natural source, or a mutant Bifidobacterium. The mutant Bifidobacterium genus may be a bacterium in which a genetic variation has occurred due to natural mutation or artificial mutation. Artificial mutations may be introduced by any method known to those skilled in the art, for example, physical methods such as X-ray irradiation and UV irradiation, and base analogs such as 5-bromouracil or 2-aminopurine, Chemical methods using mutagens such as nitrous acid, hydroxyamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS) may be used.
本発明におけるビフィドバクテリウム属菌は、スクロースを炭素源として増殖できる（スクロース資化性である）ことが好ましく、そのような菌としては、限定するものではないが、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブエスピー・ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブエスピー・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブエスピー・アニマリス（Bifidobacterium animalis subsp. animalis）等が挙げられる（非特許文献１）。一実施形態では、ビフィドバクテリウム属菌は、Bifidobacterium longumであり、例えば、Bifidobacterium longum subsp. longumであってもよい。ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）はGLNBP遺伝子を有するが、スクロースを炭素源として増殖することができないため、本発明には適さない。 The Bifidobacterium in the present invention is preferably capable of growing using sucrose as a carbon source (sucrose assimilating), and such bacteria are not limited, but include Bifidobacterium longum. Subsp. Longum (Bifidobacterium longum subsp. Longum), Bifidobacterium longum subsp. Infantis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium Examples include Bifidobacterium pseudolongum and Bifidobacterium animalis subsp. Animalis (Non-Patent Document 1). In one embodiment, the Bifidobacterium is Bifidobacterium longum, for example, Bifidobacterium longum subsp. Longum. Although Bifidobacterium bifidum has a GLNBP gene, it cannot be grown using sucrose as a carbon source and is not suitable for the present invention.
本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌は、スクロースを炭素源として、Bifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株と比較して高いGLNBP生産能を示す。上記JCM1217株は、スクロースを炭素源とした場合にGLNBP生産能が低い従来のビフィドバクテリウム属菌の代表例である。 The GLNBP highly productive Bifidobacterium genus according to the present invention exhibits higher GLNBP production ability compared to Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 strain using sucrose as a carbon source. The JCM1217 strain is a representative example of a conventional Bifidobacterium genus having a low GLNBP production ability when sucrose is used as a carbon source.
本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌の、スクロースを炭素源とした場合のGLNBP生産能は、上記JCM1217株と比較して、10倍以上、15倍以上、20倍以上、22倍以上、24倍以上、25倍以上又は26倍以上高いことが好ましい。 The GLNBP high productivity Bifidobacterium genus according to the present invention, when sucrose is used as a carbon source, the GLNBP production ability is 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 22 It is preferably at least twice, 24 times, 25 times or 26 times higher.
例えば、本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属は、スクロースを炭素源とした場合、例えば後述の実施例に記載するように0.5％又は1％スクロースを炭素源とした培地（例えば1％スクロースを炭素源とした培地1）で培養した場合、培養液あたり30ユニット/L以上、40ユニット/L以上、50ユニット/L以上、60ユニット/L以上又は70ユニット/L以上の量のGLNBPを生産できることが好ましい。本発明において、終濃度10 mM LNB、10 mMリン酸を含む50 mM MOPS緩衝液（pH7.0）の反応液において30℃で1分間に1μモルのLNBを加リン酸分解するGLNBP酵素量（酵素活性）を1ユニットと定義する。 For example, the GLNBP highly productive Bifidobacterium genus according to the present invention, when sucrose is used as a carbon source, for example, a medium containing 0.5% or 1% sucrose as a carbon source (for example, 1 When cultivated in a medium 1) containing% sucrose as a carbon source, the amount of the culture medium is 30 units / L or more, 40 units / L or more, 50 units / L or more, 60 units / L or more, or 70 units / L or more. It is preferable that GLNBP can be produced. In the present invention, the amount of GLNBP enzyme that phosphorylates 1 μmol of LNB per minute at 30 ° C. in a reaction solution of 50 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 10 mM LNB and 10 mM phosphoric acid at a final concentration ( Enzyme activity) is defined as 1 unit.
本発明において、スクロースを炭素源とした場合のGLNBP生産能は、炭素源として1％スクロースを含む培地において培養した後の菌体中のGLNBP活性を指標として評価する。GLNBP生産能を評価するための培養に使用される培地は、評価対象であるビフィドバクテリウム属菌及び比較対象であるBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株がその培地で増殖可能である限り、ビフィドバクテリウム属菌の培養に通常使用される培地であってよく、一般に、炭素源、窒素源、無機塩類等を含む合成培地であることが多い。ここでは、炭素源としては1％スクロースを用いる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、魚肉エキス、肉エキス、普通ブイヨン等を用いてよく、無機塩類としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸アンモニウム等を用いてよい。培地は、これらの成分の他に、微量栄養素（例えばビタミン、アミノ酸、核酸成分）、生育因子、還元剤（例えばアスコルビン酸ナトリウム、システイン塩酸塩）、Tween 80等の他の成分を必要に応じて含んでもよい。培地は、液体培地が好ましい。好適な液体培地の組成の例は、後述の表１に示す通りである。 In the present invention, the GLNBP producing ability when sucrose is used as a carbon source is evaluated using the GLNBP activity in the cells after culturing in a medium containing 1% sucrose as a carbon source as an index. The medium used for culturing to evaluate GLNBP production ability is bifidobacterial as long as the target Bifidobacterium sp. And the target Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 can grow on that medium. It may be a medium usually used for culturing bacteria, and is generally a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like in many cases. Here, 1% sucrose is used as the carbon source. As the nitrogen source, peptone, yeast extract, fish extract, meat extract, ordinary bouillon, etc. may be used, and inorganic salts include sodium phosphate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, calcium carbonate, ammonium sulfate. Etc. may be used. In addition to these components, the medium contains other components such as micronutrients (eg vitamins, amino acids, nucleic acid components), growth factors, reducing agents (eg sodium ascorbate, cysteine hydrochloride), Tween 80, etc. May be included. The medium is preferably a liquid medium. Examples of suitable liquid medium compositions are as shown in Table 1 below.
培養条件は、評価対象であるビフィドバクテリウム属菌によって異なるが、ビフィドバクテリウム属菌の培養に通常使用する条件とすることができる。例えば、培養方法は、嫌気条件下での静置培養又は撹拌培養であってよく、培養温度は、好ましくは25℃〜45℃、より好ましくは30℃〜40℃であってよい。培養時間は、典型的には、12時間〜48時間、好ましくは24時間〜32時間であってよい。 The culture conditions vary depending on the Bifidobacterium to be evaluated, but can be the conditions normally used for culturing the Bifidobacterium. For example, the culture method may be stationary culture or agitation culture under anaerobic conditions, and the culture temperature may be preferably 25 ° C to 45 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C. The incubation time is typically 12 hours to 48 hours, preferably 24 hours to 32 hours.
培養後の菌体は、遠心分離又は濾過等の周知の方法によって回収し、得られた菌体から、超音波破砕機等により細胞を破砕することによって又はタンパク質抽出試薬によって細胞抽出液を得て、それを酵素抽出液としてGLNBP活性の測定を行う。 The cultured cells are collected by a well-known method such as centrifugation or filtration, and a cell extract is obtained from the obtained cells by crushing the cells with an ultrasonic crusher or using a protein extraction reagent. GLNBP activity is measured using the enzyme extract as an enzyme extract.
GLNBP活性は、当業者に公知の方法によって測定することができ、例えばXiao et al.（非特許文献１）に記載された方法、Nihiraらの方法（T. Nihira, et al., Anal. Biochem., (2007) 371(2), p.259-261）等を利用することができる。本発明では、α-D-ガラクトース1-リン酸の比色定量法であるNihiraらの方法を利用してGLNBP活性を測定することができる。測定方法の詳細については後述の実施例を参照することができる。Nihiraらの方法によるGLNBP活性の測定方法は、簡単に説明すると、反応容器（例えば96穴マイクロプレートウェル）中、ラクト-N-ビオースI（LNB）、リン酸、UDP-グルコース、グルコース1,6-ビスリン酸、チオNAD、MgCl2、ホスホグルコムターゼ、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、UDP-グルコース-ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを含む緩衝液（典型例では、終濃度10 mM LNB、10 mM リン酸、0.25 mM UDP-グルコース、0.025 mMグルコース1,6-ビスリン酸、0.25 mMチオNAD、2.5 mM MgCl2、5 U/mL ホスホグルコムターゼ、5 U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、0.2 U/mL UDP-グルコース-ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを含む50 mM MOPS緩衝液（pH7.0））に、酵素GLNBP（本発明では上記スクロースを炭素源として含む培地における培養後の菌体からの酵素抽出液）を適量加えて反応液（例えば200 μL）を調製し、30℃にて所定の時間インキュベートして酵素反応を行い、マイクロプレートリーダー等で波長400 nmの吸光度を連続的に測定し、その増加速度を求めることにより活性を測定する方法である。この測定方法により、スクロースを炭素源として含む培地における培養後の目的のビフィドバクテリウム属菌の菌体中のGLNBPの酵素活性を測定し、同一培養条件における培養後のBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株の酵素の活性と比較し、GLNBP高生産能を確認することができる。 The GLNBP activity can be measured by a method known to those skilled in the art. For example, the method described in Xiao et al. (Non-patent Document 1), the method of Nihira et al. (T. Nihira, et al., Anal. Biochem ., (2007) 371 (2), p.259-261) can be used. In the present invention, GLNBP activity can be measured using the method of Nihira et al., Which is a colorimetric method for determining α-D-galactose 1-phosphate. The details of the measurement method can be referred to the examples described later. The measurement method of GLNBP activity by Nihira et al.'S method is briefly explained. In a reaction vessel (for example, 96-well microplate well), lacto-N-biose I (LNB), phosphate, UDP-glucose, glucose 1,6 - bisphosphate, thio NAD, MgCl 2, phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, UDP-glucose - buffer comprising hexose monophosphate uridylyltransferase (in a typical example, a final concentration of 10 mM LNB, 10 mM Phosphate, 0.25 mM UDP-glucose, 0.025 mM glucose 1,6-bisphosphate, 0.25 mM thio NAD, 2.5 mM MgCl 2 , 5 U / mL phosphoglucomutase, 5 U / mL glucose 6-phosphate dehydrogenase, 0.2 U / mL UDP-glucose-hexose monophosphate uridylyltransferase containing 50 mM MOPS buffer (pH 7.0), enzyme GLNBP (in the present invention, the above sucrose as a carbon source in a medium containing a culture medium Prepare a reaction solution (for example, 200 μL) by adding an appropriate amount of enzyme extract from the body, incubate at 30 ° C for a specified time, perform the enzyme reaction, and continuously measure the absorbance at a wavelength of 400 nm using a microplate reader or the like. In this method, the activity is measured by determining the rate of increase. By this measurement method, the enzyme activity of GLNBP in the cells of the desired Bifidobacterium after culture in a medium containing sucrose as a carbon source was measured, and Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 after culture under the same culture conditions. Compared with the enzyme activity of the strain, it is possible to confirm the high productivity of GLNBP.
GLNBP生産能についての比較対象であるBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（RIKEN BRC）微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）（RIKEN BRC-JCM; 〒305-0074 茨城県つくば市高野台3-1-1）のJCMカタログから入手することができる。 Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217, which is the target for comparison of GLNBP production capacity, is the Japan Collection of Microorganisms (RIKEN BRC-JCM; RIKEN BRC-JCM; 305-0074) It can be obtained from the JCM catalog of 3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture.
本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌の例として、Bifidobacterium longum subsp. longum GLN-1株、GLN-15株及びGLN-16株並びにそれらの変異株が挙げられる。Bifidobacterium longum subsp. longum GLN-1株、GLN-15株及びGLN-16株は、本発明においてBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株に変異を導入して作製され、2013年2月13日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、それぞれ受託番号NITE P-1540、NITE P-1541及びNITE P-1542として寄託されている。本発明において、Bifidobacterium longum subsp. longum GLN-1株、GLN-15株又はGLN-16株の「変異株」とは、該GLN-1株、GLN-15株又はGLN-16株の細菌細胞を継代培養等により増殖させ維持した菌株であって、自然突然変異又は人為的突然変異により、遺伝的な変異が生じた菌株をいう。本発明に係る変異株も、親株である上記GLN-1株、GLN-15株又はGLN-16株と同様に、スクロースを炭素源とした場合にGLNBP高生産能を示す。 Examples of the GLNBP high-producing Bifidobacterium genus according to the present invention include Bifidobacterium longum subsp. Longum GLN-1, GLN-15 and GLN-16 strains, and mutants thereof. Bifidobacterium longum subsp. Longum GLN-1, GLN-15 and GLN-16 strains were produced by introducing mutations into Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 strain in the present invention. It has been deposited as the NITE P-1540, NITE P-1541, and NITE P-1542, respectively, with the Patent Microorganism Deposit Center (2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture). In the present invention, the “mutant strain” of Bifidobacterium longum subsp. Longum GLN-1, GLN-15 or GLN-16 strain refers to bacterial cells of the GLN-1, GLN-15 or GLN-16 strain. A strain which has been grown and maintained by subculture or the like and has undergone a genetic variation due to natural mutation or artificial mutation. The mutant strain according to the present invention also exhibits a high productivity of GLNBP when sucrose is used as a carbon source in the same manner as the parent strain GLN-1, GLN-15 or GLN-16.
本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌は、スクロースを炭素源とした場合のGLNBPの生産能が、スクロース以外の糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フラクトース、ラクトース及びLNB）を炭素源とした場合のGLNBPの生産能より高いことが好ましい。 The GLNBP high-productivity Bifidobacterium according to the present invention has a GLNBP production ability when sucrose is used as a carbon source. It is preferable that it is higher than the productivity of GLNBP.
2. GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌を利用したGLNBPの製造方法
本発明はまた、上記のような本発明に係るビフィドバクテリウム属菌を利用したGLNBPの製造方法に関する。該方法は、上記のような本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌を、スクロースを炭素源として含む培地において培養し、生産されたGLNBP（好ましくは菌体中に生産されたGLNBP）を回収することを含む。
2. Method for producing GLNBP using GLNBP highly productive Bifidobacterium genus The present invention also relates to a method for producing GLNBP using Bifidobacterium genus according to the present invention as described above. The method comprises culturing the GLNBP high-producing Bifidobacterium according to the present invention as described above in a medium containing sucrose as a carbon source, and producing GLNBP (preferably GLNBP produced in the microbial cell). ).
本発明において、ビフィドバクテリウム属菌を用いたGLNBPの製造のための培養に使用される培地は、本発明に係るビフィドバクテリウム属菌がその培地で増殖可能である限り、ビフィドバクテリウム属菌の培養に通常使用される培地であってよい。ビフィドバクテリウム属菌の培養に通常使用される培地は、一般に、炭素源、窒素源、無機塩類等を含む合成培地であることが多い。本発明において、炭素源としてはスクロースを用いる。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、魚肉エキス、肉エキス、普通ブイヨン等を用いてよい。無機塩類としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸アンモニウム等を用いてよい。培地は、これらの成分の他に、微量栄養素（例えばビタミン、アミノ酸、核酸成分）、生育因子、還元剤（例えばアスコルビン酸ナトリウム、システイン塩酸塩）、Tween 80等の他の成分を必要に応じて含んでもよい。 In the present invention, the medium used for the culture for the production of GLNBP using Bifidobacterium is not limited as long as the Bifidobacterium according to the present invention can grow on the medium. It may be a medium usually used for culturing a genus Bacillus. In general, the medium usually used for culturing Bifidobacterium is generally a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like. In the present invention, sucrose is used as the carbon source. As the nitrogen source, peptone, yeast extract, fish extract, meat extract, ordinary bouillon and the like may be used. As inorganic salts, sodium phosphate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, calcium carbonate, ammonium sulfate and the like may be used. In addition to these components, the medium contains other components such as micronutrients (eg vitamins, amino acids, nucleic acid components), growth factors, reducing agents (eg sodium ascorbate, cysteine hydrochloride), Tween 80, etc. May be included.
培地のスクロース濃度は特に限定しないが、好ましくは0.05％〜10％、より好ましくは0.1％〜2％である。 The concentration of sucrose in the medium is not particularly limited, but is preferably 0.05% to 10%, more preferably 0.1% to 2%.
培地は、寒天やゼラチンを加えて固化した固体培地、低濃度の寒天を加えた半流動培地、培地成分のみを含む液体培地を用いることができるが、液体培地が好ましい。 The medium may be a solid medium solidified by adding agar or gelatin, a semi-fluid medium added with a low concentration of agar, or a liquid medium containing only medium components, but a liquid medium is preferred.
好適な液体培地の組成の例は、以下の通りである（濃度は全て重量％である；明細書中において同じ）。 An example of a suitable liquid medium composition is as follows (all concentrations are in weight percent; the same throughout the specification):
培養条件は、用いるビフィドバクテリウム属菌によって異なるが、ビフィドバクテリウム属菌の培養に通常使用する条件とすることができる。例えば、培養方法は、嫌気条件下での静置培養又は撹拌培養とし得る。培養温度は、好ましくは25℃〜45℃、より好ましくは30℃〜40℃であってよい。培養時間は、典型的には、12時間〜48時間、好ましくは24時間〜32時間であってよい。 The culture conditions vary depending on the genus Bifidobacterium, but can be those normally used for culturing Bifidobacterium. For example, the culture method can be stationary culture or agitation culture under anaerobic conditions. The culture temperature may be preferably 25 ° C to 45 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C. The incubation time is typically 12 hours to 48 hours, preferably 24 hours to 32 hours.
培養後の菌体は、遠心分離又は濾過等の周知の方法によって回収することができる。得られた菌体から、超音波破砕機等により細胞を破砕することによって又はタンパク質抽出試薬によって細胞抽出液を得て、それを酵素抽出液として回収してもよい。また、その酵素抽出液を、当業者に周知のタンパク質分離精製回収法、例えば、クロマトグラフィー（カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等）、電気泳動法、限外濾過等に供することよって目的とするGLNBPを分離又は精製し、回収してもよい。 The cultured cells can be collected by a known method such as centrifugation or filtration. From the obtained microbial cells, a cell extract may be obtained by crushing cells with an ultrasonic crusher or the like or using a protein extraction reagent and recovering it as an enzyme extract. In addition, the enzyme extract can be purified from protein separation and purification methods well known to those skilled in the art, such as chromatography (column chromatography, high performance liquid chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, etc. The target GLNBP may be separated or purified and recovered by subjecting it to a method such as chromatography), electrophoresis, ultrafiltration or the like.
本発明のGLNBPの製造方法によれば、GLNBPを効率よく製造することができ、高活性なGLNBP酵素液を容易に調製することができる。 According to the method for producing GLNBP of the present invention, GLNBP can be produced efficiently, and a highly active GLNBP enzyme solution can be easily prepared.
3. GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌をスクリーニングする方法
本発明はまた、GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌をスクリーニングする方法に関する。具体的には、本方法は、スクロースを炭素源として含む培地において、GLNBP遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌を培養し、Bifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株と比較して高いGLNBP生産能を示す菌を選抜することを含む。
3. Method for screening GLNBP highly productive Bifidobacterium genus The present invention also relates to a method for screening GLNBP highly productive Bifidobacterium genus. Specifically, this method cultivates a genus Bifidobacterium having a GLNBP gene in a medium containing sucrose as a carbon source, and exhibits a higher GLNBP producing ability than Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 strain. Including selecting.
本方法において、上記JCM1217株は、上記「1. GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌」に記載した通りに入手することができる。GLNBP生産能は、上記「1. GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌」に記載した通りに、すなわち、1％スクロースを炭素源として含む培地で培養し、菌体から得られた酵素抽出液において、例えばNihiraらの方法（T. Nihira, et al., Anal. Biochem., (2007) 371(2), p.259-261）等を利用して菌体中のGLNBP活性を指標として評価することができる。 In this method, the JCM1217 strain can be obtained as described in “1. GLNBP highly productive Bifidobacterium”. The ability to produce GLNBP is the same as described in “1. GLNBP high productivity Bifidobacterium”, that is, the enzyme extract obtained by culturing in a medium containing 1% sucrose as a carbon source and obtained from the cells. , For example, using the method of Nihira et al. (T. Nihira, et al., Anal. Biochem., (2007) 371 (2), p.259-261) etc. to evaluate GLNBP activity in bacterial cells as an index can do.
本方法では、上記JCM1217株と比較して、10倍以上、15倍以上、20倍以上、22倍以上、24倍以上、25倍以上又は26倍以上高いGLNBP生産能を示す菌を選抜することが好ましい。例えば、本方法では、培養液あたり30ユニット/L以上、40ユニット/L以上、50ユニット/L以上、60ユニット/L以上又は70ユニット/L以上のGLNBP活性を示す菌を選抜し得る。 In this method, select a bacterium that exhibits GLNBP production ability that is 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 22 times or more, 24 times or more, 25 times or more or 26 times or more higher than the JCM1217 strain Is preferred. For example, in this method, bacteria exhibiting GLNBP activity of 30 units / L or more, 40 units / L or more, 50 units / L or more, 60 units / L or more, or 70 units / L or more per culture medium can be selected.
本方法では、そのような高いGLNBP生産能を示す菌を選抜するために、1％以外のスクロース濃度（例えば0.05〜10％スクロース、具体的には0.5％スクロース）を示す培地を用いてGLNBP生産能が他のビフィドバクテリウム属菌よりも高い菌を予め選抜してもよい。 In this method, GLNBP production is performed using a medium having a sucrose concentration other than 1% (for example, 0.05 to 10% sucrose, specifically 0.5% sucrose) in order to select bacteria exhibiting such high GLNBP production ability. Bacteria having a higher ability than other Bifidobacterium species may be selected in advance.
本方法の一実施形態では、前記培養前に、GLNBP遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌に変異を導入することをさらに含んでもよい。変異の導入は当業者に周知のいかなる方法で行ってもよく、例えば、X線照射及びUV照射等の物理的方法、並びに5-ブロモウラシル若しくは2-アミノプリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシアミン、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホン酸（EMS）等の突然変異剤を使用する化学的方法を用いてよい。これらの方法によって、GLNBP遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌のゲノムにランダム変異が導入されることが好ましい。 In one embodiment of this method, the method may further comprise introducing a mutation into a Bifidobacterium having a GLNBP gene before the culture. Mutation can be introduced by any method known to those skilled in the art, for example, physical methods such as X-ray irradiation and UV irradiation, and base analogs such as 5-bromouracil or 2-aminopurine, nitrous acid, Chemical methods using mutagens such as hydroxyamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonic acid (EMS) may be used. It is preferable that a random mutation is introduced into the genome of the genus Bifidobacterium having the GLNBP gene by these methods.
本方法により、GLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌（変異株）を取得できる。 By this method, a GLNBP highly productive Bifidobacterium genus (mutant strain) can be obtained.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
（培地）
以下の実施例において培地1の組成は次のとおりである。
(Culture medium)
In the following examples, the composition of the culture medium 1 is as follows.
以下の実施例では、グルコース、スクロース等を炭素源としてさらに添加した培地1を使用した。 In the following Examples, Medium 1 further added with glucose, sucrose, etc. as a carbon source was used.
［実施例１］
（グルコースを炭素源とする培地を用いたGLNBP高生産株のスクリーニング）
独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（RIKEN BRC）微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms; JCM）より入手したBifidobacterium longum subsp. longum JCM1217株を、5 mLの1％グルコースを炭素源とした培地1に植菌し、37℃で24時間嫌気条件にて静置培養した。嫌気条件は、アネロパック−ケンキ（三菱ガス化学株式会社）を使用して作製した（以降の嫌気条件でも同様とした）。得られた培養液を適宜希釈し、1％グルコースを炭素源とした培地1のプレート（寒天1.5％を含む）にプレーティングした。生残率0.1〜1％の条件でUV殺菌灯照射し（15W 殺菌灯（日立 GL-15）を用いて距離50cmで45秒間）、突然変異を導入した。このプレートを37℃で嫌気培養し、コロニー群を得た。
[Example 1]
(Screening of GLNBP high-producing strains using a medium containing glucose as a carbon source)
The Bifidobacterium longum subsp. Longum JCM1217 strain obtained from the RIKEN BRC (Japan Collection of Microorganisms; JCM) was added to the medium 1 using 5 mL of 1% glucose as the carbon source. Inoculated and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours under anaerobic conditions. Anaerobic conditions were prepared using Aneropack-Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) (the same applies to the subsequent anaerobic conditions). The obtained culture broth was appropriately diluted and plated on a medium 1 plate (containing 1.5% agar) containing 1% glucose as a carbon source. A UV germicidal lamp was irradiated at a survival rate of 0.1 to 1% (45 seconds at a distance of 50 cm using a 15 W germicidal lamp (Hitachi GL-15)) to introduce a mutation. This plate was anaerobically cultured at 37 ° C. to obtain a colony group.
続いて、このコロニー群からランダムに選択した8000コロニーについて、得られた各コロニーを、V底96穴マイクロプレートを用い、200 μLの1％グルコースを炭素源とした培地1にそれぞれ植菌し、37℃で24時間嫌気条件にて静置培養した。培養液をマイクロプレート上で遠心分離し上清を除去した後、菌体に、N−アセチルムラミデイス（生化学工業）を終濃度0.2 mg/mLとなるように添加したタンパク質抽出試薬BugBuster（登録商標）Master Mix（Novagen社）を200 μL加えて25℃にて2時間振とうすることにより、酵素（1,3-βガラクトシル-N-アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ）を抽出した。 Subsequently, for each of 8000 colonies randomly selected from this colony group, each obtained colony was inoculated into medium 1 using 200 μL of 1% glucose as a carbon source using a V-bottom 96-well microplate, Static culture was performed under anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours. After removing the supernatant by centrifuging the culture on a microplate, N-acetylmuramidis (Seikagaku Corporation) was added to the cells to a final concentration of 0.2 mg / mL. The enzyme (1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase) was extracted by adding 200 μL (trademark) Master Mix (Novagen) and shaking at 25 ° C. for 2 hours.
酵素活性は、Nihiraらの方法（T. Nihira, et al., Anal. Biochem., (2007) 371(2), p.259-261）に従って30℃において測定した。具体的には、96穴マイクロプレートウェル中で終濃度10 mM LNB、10 mMリン酸、0.25 mM UDP-グルコース、0.025 mM グルコース1,6-ビスリン酸、0.25 mMチオNAD、2.5 mM MgCl2、5 U/mL ホスホグルコムターゼ、5 U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、0.2 U/mL UDP-グルコース-ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを含む50 mM MOPS緩衝液（pH7.0）にGLNBP酵素抽出液を適量加えて、200 μLの反応液を調製し、マイクロプレートリーダー中で30℃にて反応を行い、波長400 nmの吸光度を連続的に測定した。得られた測定値から以下の式に従って酵素活性添加量（ユニット）を算出し、それに基づき培養液あたりのGLNBP酵素活性（ユニット/L）を算出した。 Enzyme activity was measured at 30 ° C according to the method of Nihira et al. (T. Nihira, et al., Anal. Biochem., (2007) 371 (2), p.259-261). Specifically, final concentrations of 10 mM LNB, 10 mM phosphate, 0.25 mM UDP-glucose, 0.025 mM glucose 1,6-bisphosphate, 0.25 mM thio NAD, 2.5 mM MgCl 2 , 5 in a 96-well microplate well GLNBP enzyme extraction in 50 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing U / mL phosphoglucomutase, 5 U / mL glucose 6-phosphate dehydrogenase, 0.2 U / mL UDP-glucose-hexose monophosphate uridylyltransferase An appropriate amount of the solution was added to prepare a 200 μL reaction solution, which was reacted at 30 ° C. in a microplate reader, and the absorbance at a wavelength of 400 nm was continuously measured. The enzyme activity addition amount (unit) was calculated from the obtained measured value according to the following formula, and the GLNBP enzyme activity (unit / L) per culture solution was calculated based on the calculated amount.
算出された活性値に基づき、変異導入前のJCM1217株と比べて高い活性を示した変異株を選抜した（一次スクリーニング）。この一次スクリーニングで得られた変異株を5 mLの1％グルコースを炭素源とした培地1に植菌し37℃で24時間嫌気条件にて静置培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体について上記の方法に従ってGLNBP活性を測定し、活性（酵素生産性）の再現性の良い3株を選抜した（二次スクリーニング）。変異導入前のJCM1217株（親株）のGLNBP活性（酵素生産性）が0.5ユニット/Lであったのと比較して、得られた3つの変異株のGLNBP活性はいずれも2ユニット/L以上であった。 Based on the calculated activity value, a mutant strain showing higher activity than the JCM1217 strain before the mutation introduction was selected (primary screening). The mutant obtained in this primary screening was inoculated into medium 1 using 5 mL of 1% glucose as a carbon source, and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours under anaerobic conditions. The bacterial cells obtained by centrifuging the culture solution were measured for GLNBP activity according to the above method, and three strains with good reproducibility of activity (enzyme productivity) were selected (secondary screening). Compared to the GLNBP activity (enzyme productivity) of the JCM1217 strain (parent strain) before mutagenesis was 0.5 units / L, the GLNBP activities of all three mutant strains were 2 units / L or more. there were.
次に、得られた各変異株を、5 mLの1％スクロースを炭素源とした培地1に植菌し、37℃で24時間嫌気条件にて静置培養した。遠心分離して得られた菌体について、上記の方法に従ってGLNBP活性を測定した結果、1株のみ顕著に高い62ユニット/Lの活性を示した。この株をGLN-1株と命名した。他の2株の活性は10ユニット/L以下であった。同様に測定したJCM1217株の活性は2.5ユニット/Lであり、1％スクロース条件下ではGLN-1株はJCM1217株と比べて20倍以上高い酵素生産性を示した。 Next, each of the obtained mutants was inoculated into Medium 1 using 5 mL of 1% sucrose as a carbon source, and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours under anaerobic conditions. As a result of measuring the GLNBP activity of the cells obtained by centrifugation according to the above method, only one strain showed a remarkably high activity of 62 units / L. This strain was named GLN-1 strain. The activity of the other two strains was 10 units / L or less. The activity of the JCM1217 strain measured in the same manner was 2.5 units / L, and the GLN-1 strain showed an enzyme productivity 20 times higher than that of the JCM1217 strain under 1% sucrose conditions.
このように、グルコースを炭素源とする培地を用いたスクリーニングによって、8000コロニーから、GLNBP高生産能を示す変異株が1株得られた（取得率0.0125％）。 Thus, one mutant strain showing high GLNBP production ability was obtained from 8000 colonies by screening using a medium containing glucose as a carbon source (acquisition rate: 0.0125%).
［実施例２］
（種々の糖を炭素源とする培養時のGLNBP活性の比較）
変異導入前のJCM1217株（親株）と実施例１で得られた変異株（GLN-1株）を、種々の糖（0.5％）を炭素源とした培地1（5 mL）に植菌し、37℃で24時間嫌気条件にて静置培養した。遠心分離して得られた菌体について、実施例１に記載の方法に従ってGLNBP活性を測定した。
[Example 2]
(Comparison of GLNBP activity during culture using various sugars as carbon source)
Inoculate the JCM1217 strain (parent strain) before mutagenesis and the mutant strain (GLN-1 strain) obtained in Example 1 in Medium 1 (5 mL) using various sugars (0.5%) as a carbon source, Static culture was performed under anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours. About the microbial cell obtained by centrifugation, GLNBP activity was measured in accordance with the method described in Example 1.
結果を表３に示す。JCM1217株は、LNBを炭素源とした場合でのみやや高い活性を示し（21.9ユニット/L）、スクロースを炭素源とした場合では活性は低かった（6.0ユニット/L）。一方、GLN-1株は、スクロースを炭素源とする培地で培養した場合のみ非常に高い活性を示した（72.5ユニット/L）。 The results are shown in Table 3. The JCM1217 strain showed slightly higher activity only when LNB was used as the carbon source (21.9 units / L), and the activity was lower when sucrose was used as the carbon source (6.0 units / L). On the other hand, the GLN-1 strain showed very high activity only when cultured in a medium containing sucrose as a carbon source (72.5 units / L).
［実施例３］
（ラージスケールでのGLNBPの製造）
実施例１で得られたGLN-1株を、1 Lの1％スクロースを炭素源とした培地1に植菌し、37℃で32時間嫌気条件にて撹拌培養した。遠心分離して得られた菌体について、実施例１に記載の方法に従ってGLNBP活性を測定した結果、ラージスケールでも67ユニット/Lの非常に高い酵素生産性を示すことがわかった。
[Example 3]
(Manufacturing GLNBP on large scale)
The GLN-1 strain obtained in Example 1 was inoculated into Medium 1 using 1 L of 1% sucrose as a carbon source, and stirred and cultured at 37 ° C. for 32 hours under anaerobic conditions. As a result of measuring the GLNBP activity of the cells obtained by centrifugation according to the method described in Example 1, it was found that a very high enzyme productivity of 67 units / L was exhibited even on a large scale.
［実施例４］
（スクロースを炭素源とする培地を用いたGLNBP高生産株のスクリーニング）
変異株のスクリーニング用液体培地においてグルコースをスクロースに変更したこと以外は実施例１と同様のスクリーニングを行った。その結果、4000コロニーから変異導入前のJCM1217株と比べて高い活性を示す変異株を2株得ることに成功し（取得率0.05％）、それぞれGLN-15株及びGLN-16株と命名した。GLN-15株及びGLN-16株を、5 mLの1％スクロースを炭素源とした培地1に植菌し37℃で24時間嫌気条件にて静置培養し、遠心分離して得られた菌体について実施例１に記載の方法に従ってGLNBP活性を測定した。その結果、GLN-15株及びGLN-16株は、それぞれ65ユニット/L及び53ユニット/LのGLNBP活性（酵素生産性）を示した。同条件でのJCM1217株の活性は2.5ユニット/Lであり（実施例１）、GLN-15株及びGLN-16株は共に、JCM1217株と比べて20倍以上高い酵素生産性を示した。
[Example 4]
(Screening of GLNBP high-producing strains using sucrose as a carbon source)
Screening was performed in the same manner as in Example 1 except that glucose was changed to sucrose in the mutant strain screening liquid medium. As a result, we succeeded in obtaining two mutant strains having higher activity than the JCM1217 strain before mutagenesis from 4000 colonies (acquisition rate 0.05%), and named them GLN-15 strain and GLN-16 strain, respectively. Bacteria obtained by inoculating the GLN-15 and GLN-16 strains in medium 1 containing 5 mL of 1% sucrose as a carbon source, standing at 37 ° C for 24 hours under anaerobic conditions, and centrifugation The body was measured for GLNBP activity according to the method described in Example 1. As a result, GLN-15 strain and GLN-16 strain showed GLNBP activity (enzyme productivity) of 65 units / L and 53 units / L, respectively. The activity of the JCM1217 strain under the same conditions was 2.5 units / L (Example 1), and both the GLN-15 strain and the GLN-16 strain showed enzyme productivity 20 times or more higher than that of the JCM1217 strain.
したがって、スクロースを炭素源とする培地を用いたスクリーニング法により、グルコースを炭素源とする培地を用いたスクリーニング法（実施例１）と比較して4倍の効率で、GLNBP高生産能を示す変異株を得ることに成功した。 Therefore, the screening method using a medium containing sucrose as a carbon source is a mutation that exhibits high GLNBP high productivity with four times the efficiency of the screening method using a medium containing glucose as a carbon source (Example 1). Succeeded in obtaining the stock.
本発明に係るGLNBP高生産性ビフィドバクテリウム属菌を利用して、比較的安価にかつ効率よくGLNBPを製造することができ、製造されたGLNBPはLNB等のラクト-N-ビオース誘導体の製造に有用である。本発明により製造されたGLNBPは、好ましくは遺伝子組換え酵素ではなく、かつ病原性のないビフィドバクテリウム属菌に由来し、食品用素材としてのラクト-N-ビオース誘導体の製造にも用いることができる。 Using the GLNBP highly productive Bifidobacterium according to the present invention, GLNBP can be produced relatively inexpensively and efficiently, and the produced GLNBP is a production of a lacto-N-biose derivative such as LNB Useful for. The GLNBP produced according to the present invention is preferably not a gene recombination enzyme and is derived from a non-pathogenic Bifidobacterium genus and used for the production of a lacto-N-biose derivative as a food material. Can do.
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| JP2013063482A JP6222647B2 (en) | 2013-03-26 | 2013-03-26 | Method for producing 1,3-β galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase |
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|---|---|---|---|---|
| WO2020040257A1 (en) * | 2018-08-24 | 2020-02-27 | 国立大学法人京都大学 | METHOD FOR SYNTHESIZING ENZYME FOR β-GLYCOSIDE OF LACTO-N-BIOSE I OR GALACTO-N-BIOSE USING MODIFIED PHOSPHORYLASE |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005341883A (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-15 | National Food Research Institute | Lacto-n-biose phosphorylase gene, recombinant vector comprising the gene and transformant comprising the vector |
| JP2008154495A (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-10 | National Agriculture & Food Research Organization | Method for producing lacto-n-biose i and galacto-n-biose |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2020040257A1 (en) * | 2018-08-24 | 2020-02-27 | 国立大学法人京都大学 | METHOD FOR SYNTHESIZING ENZYME FOR β-GLYCOSIDE OF LACTO-N-BIOSE I OR GALACTO-N-BIOSE USING MODIFIED PHOSPHORYLASE |
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