JP2007053999A - Anti-gtf antibody and its production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、う蝕の原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）が産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体、及び当該抗体の遺伝子工学的製造方法に関する。 The present invention relates to an antibody against glycosyltransferase produced by Streptococcus mutans, which is a causative agent of caries, and a method for producing the antibody by genetic engineering.
う蝕と歯周病は、現代人の最も典型的な口腔疾患である。これらの疾患を予防する手段としては、免疫を利用するものが考えられ、それには能動免疫及び受動免疫の2つが挙げられる。このうち能動免疫は、受動免疫に比べて確かに効果的ではあるものの、全く予想不可能な副作用を有するおそれがある。従って、医学領域とは異なり、ワクチンを用いることについての社会的コンセンサスが依然として得られていない歯学領域の現状においては、受動免疫システムの研究の方が重要視されている。 Caries and periodontal disease are the most typical oral diseases of modern people. As means for preventing these diseases, those utilizing immunity are conceivable, and two of them are active immunity and passive immunity. Of these, active immunity is certainly more effective than passive immunity, but may have unpredictable side effects. Therefore, unlike the medical field, in the current state of the dentistry field where a social consensus about the use of a vaccine has not yet been obtained, the study of the passive immune system is regarded as more important.
このような受動免疫システムの1つとして、歯周病の原因と考えられているポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のベジクルに由来する赤血球凝集活性作用を、ベジクルに対する抗体分子を用いて抑制し、歯周病を治療する試みがなされている。具体的には、ポルフィロモナス・ジンジバリスのベジクル画分をマウスに免疫し、マウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合することにより、ベジクル由来の赤血球凝集活性を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを確立する。そして、このハイブリドーマから上記モノクローナル抗体のH鎖（重鎖）及びL鎖（軽鎖）の可変領域をコードする遺伝子を得、当該遺伝子を、グラム陽性細菌であるバシラス・ブレビス（Bacillus brevis）に導入して、可変領域のH鎖及びL鎖からなる抗体分子を発現させ、この抗体分子により歯周病を治療する試みがなされている（非特許文献１参照）。 One such passive immune system is to suppress the hemagglutination activity derived from Porphyromonas gingivalis vesicles, which are thought to be the cause of periodontal disease, by using antibody molecules against vesicles. Attempts have been made to treat periodontal disease. Specifically, a monoclonal antibody that suppresses vesicle-derived hemagglutination activity by immunizing mice with the vesicle fraction of Porphyromonas gingivalis, removing the spleen from the mouse, and fusing spleen cells with myeloma cells Is established. Then, a gene encoding the variable region of the H chain (heavy chain) and L chain (light chain) of the monoclonal antibody is obtained from this hybridoma, and the gene is introduced into Bacillus brevis, a Gram-positive bacterium. An attempt has been made to express an antibody molecule consisting of the H chain and L chain of the variable region and treat periodontal disease with this antibody molecule (see Non-Patent Document 1).
ところで、う蝕の原因と考えられているものとしては、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼ（以下「GTF」）がある。この酵素はショ糖を基質として分解し、フルクトースと、う蝕の直接的原因となるグルカンとを生成する酵素である。GTFには2種類あり、それぞれ、水不溶性のグルカン又は水可溶性のグルカンを生成する。従来、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するGTF活性を受動免疫システムにより抑制し、う蝕を治療する試みがなされている。具体的には、ストレプトコッカス・ミュータンスPS14株より水不溶性のGTFを得、これをマウスに免疫し、摘出した脾臓とミエローマ細胞とを融合させて、当該GTF活性を抑制するモノクローナル抗体を産生する陽性ハイブリドーマP136を確立する。そして、このハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体をう蝕の治療に用いる試みがなされている（非特許文献２参照）。 By the way, what is considered to be a cause of caries is a glycosyltransferase (hereinafter referred to as “GTF”) produced by Streptococcus mutans. This enzyme is an enzyme that decomposes sucrose as a substrate to produce fructose and glucan that directly causes caries. There are two types of GTF, each producing water-insoluble glucan or water-soluble glucan. Conventionally, attempts have been made to treat caries by suppressing GTF activity produced by Streptococcus mutans by a passive immune system. Specifically, a water-insoluble GTF is obtained from Streptococcus mutans PS14 strain, immunized with a mouse, and the extracted spleen and myeloma cells are fused to produce a monoclonal antibody that suppresses the GTF activity. Establish hybridoma P136. An attempt has been made to use a monoclonal antibody obtained from this hybridoma for the treatment of caries (see Non-Patent Document 2).
また、大腸菌において、ストレプトコッカス・ミュータンス由来の水不溶性GTFの活性を抑制するモノクローナル抗体のH鎖及びL鎖の可変領域をコードする遺伝子を発現させて、得られた抗体分子をう蝕の治療に用いる試みも提案されている（非特許文献２参照）。しかしながら、この場合、発現した抗体分子の大部分は、不溶性の包括体として大腸菌内に存在することとなるため、効率的に十分量の抗体分子を得ることは困難である。
本発明が解決しようとする課題は、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するGTFに対する新規な抗体を提供すること、及び、当該抗体を効率よく大量に製造し得る遺伝子工学的製造方法を提供することにある。 The problem to be solved by the present invention is to provide a novel antibody against GTF produced by Streptococcus mutans, and to provide a genetic engineering production method capable of efficiently producing the antibody in large quantities. .
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するGTFに対する新規な抗体を構築することに成功し、また当該抗体を効率的かつ大量に製造し得る方法を見出して、本発明を完成した。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, the inventors have succeeded in constructing a novel antibody against GTF produced by Streptococcus mutans, and found a method capable of producing the antibody efficiently and in large quantities, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は以下のとおりである。 That is, the present invention is as follows.
(1) 以下の(a)又は(b)のタンパク質。 (1) The following protein (a) or (b):
(a) 配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）が産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体活性を有するタンパク質
(2) 上記(1)に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4
(b) against a glycosyltransferase comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and produced by Streptococcus mutans Protein with antibody activity
(2) A gene encoding the protein according to (1) above.
(3) 以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子。 (3) A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(a) 配列番号1若しくは3に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号1若しくは3に示される塩基配列を含むDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体活性を有するタンパク質をコードするDNA
(4) 上記(3)に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
(a) DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3
(b) a glycosyltransferase that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and produced by Streptococcus mutans DNA encoding a protein having antibody activity against
(4) A recombinant vector comprising the gene according to (3) above.
当該組み換えベクターとしては、例えば、バシラス・ブレビスにおいて機能し得る複製起点、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列を含むものを挙げることができる。この場合、上記複製起点としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプラスミド（例えばpUB110）の複製起点が挙げられ、上記プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列としては、例えば、それぞれ、バシラス・サブチリス由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列が挙げられる。 Examples of the recombinant vector include those containing a replication origin, a promoter sequence, an SD sequence and a signal sequence that can function in Bacillus brevis. In this case, examples of the replication origin include a replication origin of a plasmid derived from Staphylococcus aureus (eg, pUB110). Examples of the promoter sequence, SD sequence, and signal sequence are derived from Bacillus subtilis, respectively. Promoter sequence, SD sequence and signal sequence of the α-amylase gene.
(5) 上記(4)に記載の組み換えベクターを含む形質転換体。 (5) A transformant comprising the recombinant vector according to (4) above.
当該形質転換体において、宿主としては、例えば、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）を用いることができる。 In the transformant, for example, Bacillus brevis can be used as the host.
(6) 上記(2)又は(3)に記載の遺伝子をバシラス・ブレビスにおいて発現可能なように組み込んだ発現ベクターにより、バシラス・ブレビスを形質転換して該形質転換体を培養し、得られる培養物からグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体を採取することを特徴とする、前記抗体の製造方法。 (6) Using an expression vector in which the gene described in (2) or (3) above is incorporated so that it can be expressed in Bacillus brevis, transforming Bacillus brevis to culture the transformant, resulting culture A method for producing an antibody, comprising collecting an antibody against glycosyltransferase from a product.
本発明によれば、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するGTFに対する新規な抗体（抗GTF抗体）を提供することができ、この新規抗体は、GTF活性、特にシュクラーゼ活性を強力に抑制することができ、極めて有用なものである。本発明また、当該抗GTF抗体をコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することができる。さらには、当該抗体を高効率かつ大量に製造することのできる遺伝子工学的製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a novel antibody (anti-GTF antibody) against GTF produced by Streptococcus mutans, and this novel antibody can strongly suppress GTF activity, particularly sucrose activity, It is extremely useful. The present invention can also provide a gene encoding the anti-GTF antibody, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the recombinant vector. Furthermore, it is possible to provide a genetic engineering production method capable of producing the antibody in high efficiency and in large quantities.
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
１．抗GTF抗体として機能し得るタンパク質
本発明のタンパク質は、以下の(a)又は(b)のタンパク質であり、詳しくは抗GTF抗体として機能し得るタンパク質である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, the scope of the present invention is not limited to these descriptions, and modifications other than the following exemplifications can be made as appropriate without departing from the spirit of the present invention.
1. Protein capable of functioning as anti-GTF antibody The protein of the present invention is the following protein (a) or (b), specifically a protein capable of functioning as an anti-GTF antibody.
(a) 配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体活性を有するタンパク質
本発明のタンパク質（抗GTF抗体）は、そのH鎖（重鎖）及びL鎖（軽鎖）の可変領域（Fv）が、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するGTFのうちショ糖を基質として水不溶性のグルカンを生成するGTF（以下「GTF-I」）（GenBank accession number：M17361）に対するモノクローナル抗体（Kazuo Fukushima et. al., Infect. Immun., 61, 323-328, 1993）であることが好ましい。
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4
(b) It has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and has antibody activity against a glycosyltransferase produced by Streptococcus mutans Protein The protein of the present invention (anti-GTF antibody) has a variable region (Fv) of H chain (heavy chain) and L chain (light chain), for example, sucrose as a substrate of GTF produced by Streptococcus mutans. Monoclonal antibody (Kazuo Fukushima et. Al., Infect. Immun., 61, 323-328, 1993) against GTF that produces water-insoluble glucan (hereinafter “GTF-I”) (GenBank accession number: M17361) It is preferable.
また当該抗GTF抗体は、H鎖及びL鎖の可変領域が互いにリンカーペプチドにより連結された分子構造を有するものである。当該リンカーペプチドとしては、H鎖及びL鎖の可変領域が一緒になって（協働して）抗原結合機能を有効に発揮する構造をとり得るペプチドであればよく、限定はされないが、例えば、H鎖及びL鎖の可変領域が二本鎖構造を取りやすいようにフレキシブルな構造のリンカーペプチドであることが好ましい。フレキシブルな構造のリンカーペプチドとしては、例えば、構成アミノ酸としてグリシン及びセリン等のアミノ酸残基を多く含むものが好ましい。 The anti-GTF antibody has a molecular structure in which the variable regions of the H chain and the L chain are linked to each other by a linker peptide. The linker peptide is not particularly limited as long as it is a peptide that can take a structure in which the variable regions of the H chain and the L chain are combined (cooperate) together to effectively exert the antigen-binding function. A linker peptide having a flexible structure is preferable so that the variable regions of the H chain and the L chain can easily have a double-stranded structure. As the linker peptide having a flexible structure, for example, those containing many amino acid residues such as glycine and serine as constituent amino acids are preferable.
本発明のタンパク質のうち、上記(a)のタンパク質（配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列を含む2種のタンパク質）は、いずれも、配列番号6に示される所定のアミノ酸配列を有するリンカーペプチド部分を有しており、当該リンカーペプチド部分よりN末端側部分がH鎖の可変領域、C末端側部分がL鎖の可変領域という構造を有する、一本鎖可変領域の抗体分子（single chain Fv：scFv）である。 Among the proteins of the present invention, the above-mentioned protein (a) (two kinds of proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4) is a linker peptide having a predetermined amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 Single-chain variable region antibody molecule (single chain Fv) having a structure in which the N-terminal portion is an H chain variable region and the C-terminal portion is an L chain variable region from the linker peptide portion. : ScFv).
また上記(a)のタンパク質は、限定はされないが、配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。 The protein (a) is not limited, but may be a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4.
ここで、上記(a)のタンパク質のうち、配列番号2に示されるアミノ酸配列と、配列番号4に示されるアミノ酸配列とを比較すると、配列番号4に示されるアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の第159番目のチロシン残基（Tyr；Y）がシステイン残基（Cys；C）に置き換わったものである。通常、抗GTF抗体としての上記scFvは、それを構成するアミノ酸配列中に４個のCys残基（H鎖及びL鎖の可変領域にそれぞれ２個ずつ）を有するものであり、その２個ずつが互いに結合して２組のS-S結合を形成することにより抗体としての安定性が高められると考えられている。この点、配列番号2に示されるアミノ酸配列は、L鎖の可変領域を構成するアミノ酸配列においてCys残基を１個しか有しないが（すなわちCys残基は合計３個；第24番目,98番目,228番目のアミノ酸残基）、配列番号4に示されるアミノ酸配列は、合計４個のCys残基（第24番目,98番目,159番目,228番目のアミノ酸残基）を有するため、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む抗GTF抗体タンパク質は、より安定性に優れ、高い抗体活性を有する点で好ましい。 Here, when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is compared with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 among the proteins of the above (a), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is shown in SEQ ID NO: 2. The 159th tyrosine residue (Tyr; Y) in the amino acid sequence is replaced with a cysteine residue (Cys; C). Usually, the above scFv as an anti-GTF antibody has four Cys residues (two each in the variable region of the H chain and L chain) in the amino acid sequence constituting the anti-GTF antibody. Are bound to each other to form two sets of SS bonds, and thus the stability as an antibody is considered to be enhanced. In this regard, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has only one Cys residue in the amino acid sequence constituting the variable region of the L chain (that is, a total of three Cys residues; 24th and 98th positions) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has a total of 4 Cys residues (the 24th, 98th, 159th, and 228th amino acid residues). The anti-GTF antibody protein containing the amino acid sequence shown in 4 is preferable in that it is more stable and has high antibody activity.
上記(b)のタンパク質は、上記(a)のタンパク質を構成し得るアミノ酸配列（配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列）において１個又は数個（例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度）のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（変異型アミノ酸配列）を含み、かつ抗GTF活性を有するタンパク質であればよく、限定はされない。また、これらの変異型タンパク質には、欠失、置換及び付加が適宜組み合わされたアミノ酸配列のものも含まれる。但し、配列番号2に示されるアミノ酸配列の変異型の場合は、当該アミノ酸配列（配列番号2）の第24番目、98番目及び228番目のアミノ酸残基を変異させたものではないことが好ましい。また、配列番号4に示されるアミノ酸配列の変異型の場合は、当該アミノ酸配列（配列番号4）の第24番目、98番目、159番目及び228番目のアミノ酸残基を変異させたものではないことが好ましい。 The protein (b) is one or several (for example, about 1 to 10, preferably 1) in the amino acid sequence (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4) that can constitute the protein (a). Any protein may be used as long as it has an amino acid sequence (mutated amino acid sequence) in which about 5 to 5 amino acids are deleted, substituted and / or added, and has anti-GTF activity. These mutant proteins also include those with amino acid sequences in which deletions, substitutions and additions are appropriately combined. However, in the case of a mutant form of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it is preferable that the 24th, 98th and 228th amino acid residues of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) are not mutated. In the case of a variant of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid residues at positions 24, 98, 159 and 228 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) are not mutated. Is preferred.
このように、上記(a)のタンパク質を構成し得るアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92等に記載の部位特異的変位誘発法に従って調製することができる。また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。 Thus, a polynucleotide encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or added in the amino acid sequence that can constitute the protein of (a) above is Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, etc. Can be prepared according to the following site-specific displacement induction method. In order to introduce mutations into polynucleotides, mutation introduction kits using site-directed mutagenesis, such as the QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), using known techniques such as the Kunkel method and the Gapped duplex method. ), GeneTailor ™ Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
なお、上記(b)のタンパク質は、上記(a)のタンパク質と同様に抗GTF抗体活性（GTFに対する結合活性）を有することが重要であるため、例えば、H鎖とL鎖を連結し適度なフレキシビリティを有している必要のあるリンカーペプチド部分のアミノ酸配列は、上記(a)のタンパク質における当該リンカーペプチド部分のアミノ酸配列（配列番号6）から変異置換されていないものが特に好ましい。 In addition, since it is important that the protein of (b) has anti-GTF antibody activity (binding activity to GTF) in the same manner as the protein of (a) above, for example, an appropriate amount is obtained by linking H chain and L chain. The amino acid sequence of the linker peptide portion that needs to have flexibility is particularly preferably one that is not mutated from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the linker peptide portion in the protein (a).
また上記(b)のタンパク質は、限定はされないが、配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。 The protein of (b) is not limited, but may be a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Good.
本発明のタンパク質の抗GTF抗体活性については、例えば、後述する実施例に記載のアッセイ法により測定することができる。
２．抗GTF抗体遺伝子
上述した本発明のタンパク質（抗GTF抗体）をコードする遺伝子としては、限定はされないが、以下の(a)又は(b)のDNAを含む遺伝子が挙げられる。
The anti-GTF antibody activity of the protein of the present invention can be measured, for example, by the assay method described in Examples described later.
2. Anti-GTF antibody gene The gene encoding the above-described protein of the present invention (anti-GTF antibody) is not limited, but includes a gene containing the following DNA (a) or (b).
なお、以下の(a)及び(b)のDNAは、いずれも本発明のタンパク質の構造遺伝子であるが、これらDNAを含む遺伝子とは、これらDNAのみからなるものであってもよいし、これらDNAを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター配列、SD配列、シグナル配列、Kozak配列、ターミネーター等）を含むものであってもよく、限定はされない。 The following DNAs (a) and (b) are all structural genes of the protein of the present invention, but the gene containing these DNAs may be composed only of these DNAs, or these It may contain DNA, and may contain other known base sequences (transcription promoter sequence, SD sequence, signal sequence, Kozak sequence, terminator, etc.) necessary for gene expression.
(a) 配列番号1若しくは3に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号1若しくは3に示される塩基配列を含むDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体活性を有するタンパク質をコードするDNA
ここで、配列番号1及び3に示される塩基配列を含むDNAを、本明細書においては、それぞれ順に「A4-13」及び「A4-13YC」と称する。
(a) DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3
(b) a glycosyltransferase that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and produced by Streptococcus mutans DNA encoding a protein having antibody activity against
Here, DNAs containing the base sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 3 are referred to as “A4-13” and “A4-13YC” in this specification, respectively.
上記(a)のDNAは、抗体分子のH鎖の可変領域をコードするDNA及びL鎖の可変領域をコードするDNAが、リンカーペプチドをコードするDNAを介して連結された塩基配列を有している。詳しくは、上記(a)の2種のDNA（配列番号1又は3に示される2種の塩基配列）は、いずれも、配列番号5に示される所定の塩基配列（リンカーペプチドをコードするDNA配列）を含んでおり、当該塩基配列より5'側部分がH鎖の可変領域をコードするDNA配列、当該塩基配列より3'側部分がL鎖の可変領域をコードするDNA配列であって、一本鎖可変領域の抗体分子（single chain Fv：scFv）をコードする遺伝子である。 The DNA of (a) above has a base sequence in which DNA encoding the variable region of the H chain of an antibody molecule and DNA encoding the variable region of the L chain are linked via DNA encoding a linker peptide. Yes. Specifically, each of the two types of DNAs (a) (two types of base sequences shown in SEQ ID NO: 1 or 3) is a predetermined base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (DNA sequence encoding a linker peptide) A DNA sequence in which the 5 ′ portion from the base sequence encodes a variable region of the H chain, and a DNA sequence in which the 3 ′ side portion from the base sequence encodes the variable region of the L chain, It is a gene encoding an antibody molecule (single chain Fv: scFv) of this variable chain region.
ここで、配列番号1に示される塩基配列と、配列番号3に示される塩基配列とを比較すると、配列番号3に示される塩基配列は、配列番号1に示される塩基配列の第476番目の「a」が「g」に置き換わったものである。この置換により、第475〜477番目の塩基からなるコドンに対応するアミノ酸がチロシン残基（Tyr；Y）からシステイン残基（Cys；C）に置換される。 Here, comparing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the 476th “ “a” is replaced with “g”. By this substitution, the amino acid corresponding to the codon consisting of the 475th to 477th bases is replaced from the tyrosine residue (Tyr; Y) to the cysteine residue (Cys; C).
scFvをコードする上記(a)のDNAは、例えば、以下のような方法で得ることができる。すなわち、まず、GTF-Iをマウスに免疫し、脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させることにより、GTF-Iを認識するモノクローナル抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを得る（Kazuo Fukushima et. al., Infect. Immun., 61, 323-328, 1993）。次いで、GTF-I活性を抑制するscFvをコードする遺伝子は、市販のキットマウスscFvモジュール／組み換えファージ抗体システム（ファルマシアバイオテック社製）等の手順に従い調製することができる。上記ハイブリドーマから得たmRNAよりcDNAを作製し、さらにPCR及びアッセンブルPCR等によりscFvをコードするDNA断片を増幅する。PCRに用いるDNAポリメラーゼは、限定されないが、正確性の高いDNAポリメラーゼであることが好ましく、例えば、Pwo DNAポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、Pfu DNAポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナPfx DNAポリメラーゼ（インビトロジェン）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。PCRの反応条件は、PCRの種類、用いるDNAポリメラーゼの最適温度、合成するDNAの長さや種類等によって異なるが、90〜98℃で5〜30秒（熱変性）、50〜65℃で5〜30秒（アニーリング）、65〜80℃で30〜1200秒（伸長）のセットを1サイクルとして20〜200サイクル行うようにすることが好ましい。その後、PCR増幅断片をアガロース電気泳動等により精製してプライマー等を除く。精製後の断片を前記キットに付属のプラスミドベクターに導入して、scFvをコードする遺伝子を含むプラスミドを構築する。その結果、このプラスミド中にscFvをコードするDNAを得ることができる。この方法では、Yasuko Shibata et. al., Infect. Immun., 66, 2207-2212, 1998に記載の方法が参照される。 The above-mentioned DNA (a) encoding scFv can be obtained, for example, by the following method. That is, first, a mouse is immunized with GTF-I, a spleen is removed, and then fused with myeloma cells to obtain a positive hybridoma that secretes a monoclonal antibody that recognizes GTF-I (Kazuo Fukushima et. Al., Infect Immun., 61, 323-328, 1993). Next, a gene encoding scFv that suppresses GTF-I activity can be prepared according to a procedure such as a commercially available kit mouse scFv module / recombinant phage antibody system (Pharmacia Biotech). CDNA is prepared from mRNA obtained from the hybridoma, and a DNA fragment encoding scFv is amplified by PCR, assembly PCR, or the like. Although the DNA polymerase used for PCR is not limited, it is preferably a highly accurate DNA polymerase. For example, Pwo DNA polymerase (Roche Diagnostics), Pfu DNA polymerase (Promega), Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) ), KOD DNA polymerase (Toyobo) and the like are preferable. PCR reaction conditions vary depending on the type of PCR, the optimal temperature of the DNA polymerase to be used, the length and type of DNA to be synthesized, etc., but 5 to 30 seconds (thermal denaturation) at 90 to 98 ° C, and 5 to 50 to 50 to 65 ° C. It is preferable to carry out 20 to 200 cycles by setting 30 seconds (annealing) and 65 to 80 ° C. for 30 to 1200 seconds (extension) as one cycle. Thereafter, the PCR amplified fragment is purified by agarose electrophoresis or the like to remove primers and the like. The purified fragment is introduced into the plasmid vector attached to the kit to construct a plasmid containing the gene encoding scFv. As a result, DNA encoding scFv can be obtained in this plasmid. In this method, reference is made to the method described in Yasuko Shibata et. Al., Infect. Immun., 66, 2207-2212, 1998.
なお、配列番号1又は3に示される塩基配列を含むDNAは、それぞれ順に、前述した配列番号2又は4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAである。 The DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 is a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 described above, respectively.
また上記(a)のDNAは、限定はされないが、配列番号1又は3に示される塩基配列からなるDNAであってもよい。 Further, the DNA of the above (a) is not limited, but may be DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3.
上記(b)のDNAは、上記(a)のDNA若しくはそれと相補的な塩基配列からなるDNA、又はこれらの断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、およびサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラリーやゲノムライブラリーから得ることもできる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を適宜参照することができる。 The DNA of (b) is a known hybridization such as colony hybridization, plaque hybridization, and Southern blot using the DNA of (a) or a DNA comprising a complementary base sequence, or a fragment thereof as a probe. It can also be obtained from a cDNA library or a genomic library by performing a hybridization method. A library prepared by a known method may be used, or a commercially available cDNA library or genomic library may be used, and is not limited. For detailed procedures of the hybridization method, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) and the like can be referred to as appropriate.
ハイブリダイゼーション法の実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が15〜330mM、温度が25〜65℃、好ましくは塩濃度が15〜150mM、温度が45〜55℃の条件を意味する。具体的には、例えば、80mMで50℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記(b)のDNAを得るための条件を適宜設定することができる。 “Stringent conditions” in carrying out the hybridization method are conditions at the time of washing after hybridization, and the salt concentration of the buffer is 15 to 330 mM, the temperature is 25 to 65 ° C., preferably the salt concentration is 15 to It means the condition of 150 mM and temperature 45-55 ° C. Specifically, for example, conditions such as 50 mM at 80 mM can be mentioned. Furthermore, in addition to the conditions such as salt concentration and temperature, various conditions such as the probe concentration, probe length, and reaction time are taken into consideration, and the conditions for obtaining the DNA of (b) above are appropriately set. Can do.
ハイブリダイズするDNAとしては、上記(a)のDNAの塩基配列に対して少なくとも40％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは60％、さらに好ましくは90％以上である。 The hybridizing DNA is preferably a base sequence having at least 40% homology to the DNA base sequence of (a) above, more preferably 60%, and even more preferably 90% or more. .
なお、上記(b)のDNAは、抗GTF抗体活性を有するタンパク質をコードするDNAであることが重要であるため、翻訳後のアミノ酸配列を考慮したときに、例えば、リンカーペプチド部分のアミノ酸配列が配列番号6に示すアミノ酸配列から変異（欠失、置換及び／又は付加）されないような、塩基配列を有するものが特に好ましい。 In addition, since it is important that the DNA of the above (b) is a DNA encoding a protein having anti-GTF antibody activity, when the translated amino acid sequence is taken into account, for example, the amino acid sequence of the linker peptide portion is Those having a nucleotide sequence that are not mutated (deleted, substituted and / or added) from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 are particularly preferred.
また上記(b)のDNAは、限定はされないが、「配列番号1又は3に示される塩基配列からなるDNA」に対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。ストリンジェントな条件は、前記と同様である。当該「ハイブリダイズするDNA」は、抗GTF抗体活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明に含まれる。 The DNA of (b) is not limited, but is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a complementary base sequence to the “DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3”. It may be. The stringent conditions are the same as described above. The “hybridizing DNA” is included in the present invention as long as it encodes a protein having anti-GTF antibody activity.
本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、アミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされず、転写後、大腸菌や酵母等の微生物や植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すDNAを含むものであってもよいし、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すDNAを含むものであってもよいが、当該タンパク質の発現系（宿主細胞）を適宜考慮したものとするのが好ましい。
３．組み換えベクター
本発明のタンパク質（抗GTF抗体）を発現させるためには、前述した本発明のタンパク質をコードする遺伝子がベクターに組み込まれて構築された組み換えベクターが用いられる。ベクターは、必要に応じ、当該遺伝子の上流に転写プロモーター配列、SD配列（宿主が原核細胞の場合）、シグナル配列、Kozak配列（宿主が真核細胞の場合）を、下流にはターミネーターを、例えばPCR等により付加しておくこともできる。上記転写プロモーター配列などの、タンパク質の発現に必要な各要素は、当該遺伝子に含まれていてもよいし、発現ベクターにもともと含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。発現ベクターに当該遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用する。発現ベクターとしては、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保持し得るものであれば、限定はされず、各種発現系（宿主細胞）に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
As the gene encoding the protein of the present invention, the codon corresponding to the amino acid is not particularly limited, and after transcription, a codon generally used in microorganisms such as Escherichia coli and yeast, plants, etc. (preferably the frequency of use) High codon) or a DNA showing a codon generally used in mammals such as humans (preferably a frequently used codon). However, it is preferable to appropriately consider the expression system (host cell) of the protein.
3. Recombinant Vector In order to express the protein of the present invention (anti-GTF antibody), a recombinant vector constructed by incorporating the above-described gene encoding the protein of the present invention into a vector is used. If necessary, the vector may have a transcription promoter sequence, an SD sequence (when the host is a prokaryotic cell), a signal sequence, a Kozak sequence (when the host is a eukaryotic cell) upstream, and a terminator downstream, for example, It can also be added by PCR or the like. Each element necessary for protein expression, such as the above transcription promoter sequence, may be included in the gene, or may be used when originally included in the expression vector, and is not limited. In order to insert the gene into the expression vector, a method using a restriction enzyme, a method using topoisomerase, or the like is used. The expression vector is not limited as long as it can hold the gene encoding the protein of the present invention, and a vector suitable for various expression systems (host cells) can be appropriately selected and used.
このような組換えベクター構築は、周知の方法を用いて行うことができ、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等に記載された方法を適宜参照することができる。 Such a recombinant vector can be constructed using a known method, for example, appropriately refer to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). can do.
本発明の組換えベクターとしては、例えば、バシラス・サブチリスを宿主として形質転換する場合に好適である以下のものを挙げることができる。すなわち、本発明の組換えベクターは、本発明のタンパク質（抗GTF抗体）をコードする遺伝子のほかに、バシラス・ブレビスにおいて機能し得る複製起点（複製領域）、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列を含むものが好ましい。この場合、バシラス・ブレビスにおいて機能し得る複製起点としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプラスミド（例えばpUB110など）の複製起点が好ましく挙げられ、また、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列としては、例えば、バシラス・サブチリス由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列が好ましく挙げられる。
４．形質転換体
本発明のタンパク質（抗GTF抗体）の発現は、宿主となる細胞に前述した本発明の組み換えベクターを導入して形質転換体を得、これを培養等することにより行うことができる。
Examples of the recombinant vector of the present invention include the following suitable for transformation using Bacillus subtilis as a host. That is, the recombinant vector of the present invention comprises, in addition to the gene encoding the protein of the present invention (anti-GTF antibody), a replication origin (replication region) that can function in Bacillus brevis, a promoter sequence, an SD sequence, and a signal sequence. The inclusion is preferred. In this case, the replication origin that can function in Bacillus brevis is preferably, for example, the replication origin of a plasmid derived from Staphylococcus aureus (eg, pUB110), and the promoter sequence, SD sequence, and signal sequence are For example, a promoter sequence, an SD sequence and a signal sequence of an α-amylase gene derived from Bacillus subtilis are preferable.
4). Transformant The protein of the present invention (anti-GTF antibody) can be expressed by introducing the above-described recombinant vector of the present invention into a host cell, obtaining a transformant, and culturing it.
宿主細胞としては、上記組換えベクターの導入後、本発明のタンパク質を発現し得るものであればよく、限定はされないが、例えば、バシラス属（バシラス・ブレビス、バシラス・サブチリス(枯草菌)等）、酵母、カビ及び大腸菌等の公知の各種微生物細胞、ヒト、マウス及び昆虫等の各種動物細胞、並びに各種植物細胞等が挙げられる。なかでも、バシラス属（特にバシラス・ブレビス）を用いることが好ましい。 The host cell is not particularly limited as long as it can express the protein of the present invention after the introduction of the above recombinant vector. For example, the genus Bacillus (Bacillus brevis, Bacillus subtilis, etc.) And various known microbial cells such as yeast, mold and Escherichia coli, various animal cells such as human, mouse and insect, and various plant cells. Among these, it is preferable to use a Bacillus genus (particularly Bacillus brevis).
形質転換の方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターの組み合わせを考慮し、適宜選択し実施することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法等が好ましく挙げられる。 The transformation method is not limited and can be appropriately selected and implemented in consideration of the combination of the host and the expression vector. For example, electroporation method, lipofection method, heat shock method, PEG method, calcium phosphate method, The DEAE dextran method is preferred.
得られる形質転換体においては、実際に用いた宿主と、組み換えベクターに含まれる抗GTF抗体の遺伝子のコドン型に対応する宿主とが、一致していてもよいし異なっていてもよく、限定はされない。 In the resulting transformant, the host actually used and the host corresponding to the codon type of the gene of the anti-GTF antibody contained in the recombinant vector may be the same or different. Not.
得られる形質転換体の培養方法、及びその培養物から抗体を採取（回収）する方法は、限定はされず、宿主細胞の種類等に応じ、公知の各種培養方法、回収方法等を適宜採用できる。 The method for culturing the obtained transformant and the method for collecting (collecting) the antibody from the culture are not limited, and various known culturing methods, collecting methods, etc. can be appropriately employed depending on the type of the host cell. .
形質転換体の培養後は、得られた培養物から目的とする抗GTF抗体を得ることができる。本発明においては、「培養物」とは、培養上清、培養細胞(菌体)、又は細胞(菌体)の破砕物のいずれをも意味するものとし、限定はされない。目的とする抗GTF抗体は当該培養物中に蓄積される。 After culturing the transformant, the desired anti-GTF antibody can be obtained from the obtained culture. In the present invention, the “culture” means any of culture supernatant, cultured cells (bacteria), or disrupted cells (bacteria), and is not limited. The target anti-GTF antibody is accumulated in the culture.
培養後、目的の抗GTF抗体が宿主細胞外に生産される（分泌される）場合（例えばバシラス・ブレビスを宿主とする形質転換体を培養した場合）は、必要に応じて、遠心分離処理等により細胞を除去した後、培養液を目的の抗GTF抗体溶液として得ることができる。一方、目的の抗GTF抗体が宿主細胞内に生産される場合は、ホモジナイザー処理や超音波処理等により宿主細胞を破砕する、あるいは、溶菌により宿主細胞を破砕することができる。溶菌により宿主細胞を破砕する場合は、Lysozyme処理、凍結融解処理、低張液処理等を施すことができる。破砕後の液を遠心分離した後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した目的の抗GTF抗体溶液として得ることができる。 If the desired anti-GTF antibody is produced (secreted) outside the host cell after culturing (for example, when a transformant using Bacillus brevis as the host is cultured), if necessary, centrifugation treatment, etc. After removing the cells, the culture solution can be obtained as a target anti-GTF antibody solution. On the other hand, when the target anti-GTF antibody is produced in the host cell, the host cell can be disrupted by homogenizer treatment, ultrasonic treatment, or the like, or the host cell can be disrupted by lysis. When disrupting host cells by lysis, Lysozyme treatment, freeze-thaw treatment, hypotonic solution treatment, and the like can be performed. The supernatant after centrifuging the disrupted solution is a cell extract soluble fraction and can be obtained as a crude purified target anti-GTF antibody solution.
その後、得られた抗GTF抗体溶液から、硫安沈澱による抽出等により目的の抗GTF抗体を採取し、必要に応じて、更に塩析、透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）等の公知のタンパク質精製法を用いて単離精製することによって、目的とする抗GTF抗体を高純度で得ることができる。なお、目的の抗GTF抗体の収率は、SDS-PAGE等の公知のタンパク質検出方法により確認することができる。
５．抗GTF抗体の製造方法
本発明の製造方法は、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼ（GTF）に対する抗体（抗GTF抗体）をコードする遺伝子を、バシラス・ブレビスにおいて発現可能なように組み込んだ発現ベクターにより、バシラス・ブレビスを形質転換して該形質転換体を培養し、得られる培養物から抗GTF抗体を採取することを特徴とするものであり、前記遺伝子として、前述した本発明の遺伝子を用いるものである。
Thereafter, the target anti-GTF antibody is collected from the obtained anti-GTF antibody solution by extraction with ammonium sulfate precipitation, and further salted out, dialyzed, various chromatographies (gel filtration, ion exchange chromatography, high-speed chromatography) as necessary. The target anti-GTF antibody can be obtained with high purity by isolation and purification using a known protein purification method such as liquid chromatography, affinity chromatography and the like. The yield of the target anti-GTF antibody can be confirmed by a known protein detection method such as SDS-PAGE.
5. Production method of anti-GTF antibody The production method of the present invention is an expression in which a gene encoding an antibody (anti-GTF antibody) against glycosyltransferase (GTF) produced by Streptococcus mutans is incorporated so that it can be expressed in Bacillus brevis. Bacillus brevis is transformed with a vector, the transformant is cultured, and an anti-GTF antibody is collected from the obtained culture. The gene of the present invention described above is used as the gene. It is what is used.
上記抗GTF抗体についての詳細については、前述した「１．抗GTF抗体として機能し得るタンパク質」における抗GTF抗体の説明が同様に適用できる。 For details of the anti-GTF antibody, the description of the anti-GTF antibody in “1. Protein that can function as an anti-GTF antibody” described above can be similarly applied.
本発明の製造方法においては、抗GTF抗体をコードする遺伝子として、本発明の遺伝子を用いることが重要であるが、当該遺伝子の説明、及び当該遺伝子を得る方法の説明については、前述した「２．抗GTF抗体遺伝子」における記載が同様に適用できる。本発明の製造方法に用い得る遺伝子としては、前述した「２．抗GTF抗体遺伝子」における“(a)及び(b)のDNA”を含む遺伝子が特に好ましい。 In the production method of the present invention, it is important to use the gene of the present invention as a gene encoding an anti-GTF antibody. For the explanation of the gene and the method for obtaining the gene, refer to “2” described above. The description in “.anti-GTF antibody gene” can be similarly applied. As a gene that can be used in the production method of the present invention, a gene containing “DNA of (a) and (b)” in “2. Anti-GTF antibody gene” described above is particularly preferable.
本発明の製造方法においては、上述した抗GTF抗体をコードする遺伝子を、所定の宿主（バシラス・ブレビス）で発現可能なように組み込んだ発現ベクターを構築して用いる。具体的には、当該遺伝子が、所定の宿主（バシラス・ブレビス）において機能し得る複製起点（複製領域）、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列とともに、発現可能なように配置されてなる発現ベクターが好ましい。 In the production method of the present invention, an expression vector in which the above-described gene encoding the anti-GTF antibody is incorporated so as to be expressed in a predetermined host (Bacillus brevis) is constructed and used. Specifically, an expression vector in which the gene is arranged so that it can be expressed together with a replication origin (replication region), a promoter sequence, an SD sequence, and a signal sequence that can function in a predetermined host (Bacillus brevis). preferable.
バシラス・ブレビスにおいて機能し得る複製起点としては、限定はされないが、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプラスミド（例えばpUB110など）の複製起点（T. McKenzie et. al., Plasmid, 15, 93-103, 1986）、グラム陽性菌由来のプラスミド（例えばpC194又はpLS5等）の複製起点（pC194：S. Horinouchi et. al., J. Bacteriol., 150, 815-825, 1982； pLS5：S. A. Lacks et. al., J. Mol. Biol., 192, 753-765, 1986）等が挙げられる。 The origin of replication that can function in Bacillus brevis is not limited. For example, the origin of replication of a plasmid derived from Staphylococcus aureus (eg, pUB110) (T. McKenzie et. Al., Plasmid, 15, 93- 103, 1986), origin of replication of a plasmid derived from a Gram-positive bacterium (such as pC194 or pLS5) (pC194: S. Horinouchi et. Al., J. Bacteriol., 150, 815-825, 1982; pLS5: SA Lacks et al., J. Mol. Biol., 192, 753-765, 1986).
また、バシラス・ブレビスにおいて機能し得るプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列としては、限定はされないが、例えば、バシラス・サブチリス由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列（Yamazaki, H. et. al., J. Bacteriol., 156, 327-337, 1983）、アルカリン・バシラス（Alkaline Bacillus）由来のアミラーゼ遺伝子又はプロテアーゼ遺伝子のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列（Akira Tsukamoto et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 25-31, 1988）、バシラス・ブレビス由来の主要菌体外タンパク質遺伝子のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列（鵜高重三, 日本農芸化学会誌, 第61巻, 669, 1987）等が挙げられる。 The promoter sequence, SD sequence, and signal sequence that can function in Bacillus brevis are not limited. For example, the promoter sequence, SD sequence, and signal sequence of the α-amylase gene derived from Bacillus subtilis (Yamazaki, H. et. al., J. Bacteriol., 156, 327-337, 1983), Alkaline Bacillus amylase gene or protease gene promoter sequence, SD sequence and signal sequence (Akira Tsukamoto et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151, 25-31, 1988), promoter sequence, SD sequence and signal sequence of major extracellular protein genes derived from Bacillus brevis (Shigezo Tsujitaka, Journal of Japanese Agricultural Chemistry Society, No. 61, 669, 1987).
以上の各領域（複製起点、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列）は、通常、上流側（5'末端側）から複製起点、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列の順に配置され、シグナル配列の下流側（3'末端側）にリーディングフレーム（読み取り枠）を揃えて、前述した抗GTF抗体をコードする遺伝子が配置される。 The above regions (replication origin, promoter sequence, SD sequence and signal sequence) are usually arranged in the order of the replication origin, promoter sequence, SD sequence and signal sequence from the upstream side (5 ′ end side), and downstream of the signal sequence. The gene encoding the above-described anti-GTF antibody is arranged with the reading frame (reading frame) aligned on the side (3 ′ end side).
このような発現ベクターの構築は、周知の方法、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等に記載された方法を適宜参照して行うことができるが、以下に具体的に説明する。 Such an expression vector can be constructed by appropriately referring to a known method, for example, a method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). This will be specifically described below.
バシラス・ブレビスを形質転換する場合に用い得る発現ベクターとしては、具体的には、例えば、図４のDに示す発現ベクターpYS28等が好ましく挙げられる。pYS28は、複製起点としてpUB110 rep-MO断片を有し、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列としてバシラス・サブチリス由来のα-アミラーゼ遺伝子（amyE）のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列を有し、当該シグナル配列の3'末端側に抗GTF抗体をコードする遺伝子A4-13（配列番号1）が配置されたものである。また、発現ベクターpYS28におけるA4-13の代わりにA4-13YC（配列番号3）を保持する発現ベクターpYS28YCも、バシラス・ブレビスを形質転換する場合に用い得る発現ベクターとして好ましく挙げられる。 Specific examples of the expression vector that can be used for transforming Bacillus brevis include, for example, the expression vector pYS28 shown in FIG. 4D. pYS28 has a pUB110 rep-MO fragment as an origin of replication, and has a promoter sequence, SD sequence and signal sequence derived from Bacillus subtilis-derived α-amylase gene (amyE) promoter sequence, SD sequence and signal sequence, A gene A4-13 (SEQ ID NO: 1) encoding an anti-GTF antibody is arranged on the 3 ′ end side of the signal sequence. An expression vector pYS28YC that retains A4-13YC (SEQ ID NO: 3) instead of A4-13 in the expression vector pYS28 is also preferred as an expression vector that can be used when transforming Bacillus brevis.
発現ベクターpYS28は、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス由来のpUB110の複製起点pUB110 rep-MO、カナマイシン耐性遺伝子Kmr及び大腸菌で複製するための複製起点p15Aを有するドナープラスミドpHD17K（図４のB）と、バシラス・サブチリス由来のamyEのプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列、抗GTF抗体をコードする遺伝子A4-13、エリスロマイシン耐性遺伝子Emr並びに大腸菌で複製するための複製起点p15Aを有するクローニングプラスミドpYS24（図４のA）とを用いて、後述するヘテロダイマー法（Teruaki Shiroza et. al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(2), 380-395, 2001）により構築することができる。 The expression vector pYS28 is, for example, a donor plasmid pHD17K (B in FIG. 4) having a replication origin pUB110 rep-MO derived from Staphylococcus aureus pUB110 rep-MO, a kanamycin resistance gene Km r and a replication origin p15A for replication in E. coli. A cloning plasmid pYS24 having a promoter sequence of amyE derived from Bacillus subtilis, an SD sequence and a signal sequence, a gene A4-13 encoding an anti-GTF antibody, an erythromycin resistance gene Em r and an origin of replication p15A for replication in E. coli (FIG. 4) and the heterodimer method described below (Teruaki Shiroza et. Al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (2), 380-395, 2001).
クローニングプラスミドpYS24は、図２に示すように、上記抗体分子scFvをコードする遺伝子A4-13を有するプラスミドpCANTAB-A4-13（図２のB）から構築することができる。具体的には、クローニングプラスミドであるpHD10E（図２のA）のマルチクローニングサイト（MCS）を制限酵素BamHI及びPstIで切断し、これに、バシラス・サブチリス由来のα-アミラーゼ遺伝子の5'側領域のBam HI−Pst I断片（1.3kb；図２のC）（プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列を含む）を導入する。次いで、抗体分子scFvをコードする遺伝子A4-13をpCANTAB-A4-13よりHind III−Eco RI断片として回収し、これをクローン化して、PCRの鋳型となるプラスミドpYS22（図２のD）を得る。次いで、抗体分子scFvをコードする遺伝子A4-13とα-アミラーゼ遺伝子のシグナル配列とが、正しいリーディングフレームで連結するようにプライマーを設計してPCRを実施することにより、目的とするクローニングプラスミドpYS24（図２のE）を得ることができる。 As shown in FIG. 2, the cloning plasmid pYS24 can be constructed from the plasmid pCANTAB-A4-13 (B in FIG. 2) having the gene A4-13 encoding the antibody molecule scFv. Specifically, the multicloning site (MCS) of the cloning plasmid pHD10E (A in FIG. 2) was cleaved with restriction enzymes BamHI and PstI, and then the 5 ′ region of the α-amylase gene derived from Bacillus subtilis. A Bam HI-Pst I fragment (1.3 kb; C in FIG. 2) (including promoter sequence, SD sequence and signal sequence) is introduced. Next, the gene A4-13 encoding the antibody molecule scFv is recovered as a Hind III-Eco RI fragment from pCANTAB-A4-13 and cloned to obtain a plasmid pYS22 (D in FIG. 2) that serves as a PCR template. . Subsequently, a primer was designed so that the gene A4-13 encoding the antibody molecule scFv and the signal sequence of the α-amylase gene were ligated in the correct reading frame, and PCR was performed, whereby the desired cloning plasmid pYS24 ( E) of FIG. 2 can be obtained.
ドナープラスミドpHD17Kは、図１のAに示した方法により構築することができる。具体的には、プラスミドpResKmNot10Asc（図１のA1）のMCSを制限酵素Bgl II及びBam HIで切断し、pUB110の複製起点であるpUB110 rep（図１のA2）を導入する。得られるプラスミドを、更に制限酵素Bam HI及びBcl Iで切断し、その後、pUB110の複製起点のマイナスオリジン領域（MO断片；図１のA3）を導入し、ドナープラスミドpHD17K（3.6kb；図１のA5）を構築することができる。 The donor plasmid pHD17K can be constructed by the method shown in FIG. Specifically, MCS of plasmid pResKmNot10Asc (A1 in FIG. 1) is cleaved with restriction enzymes Bgl II and Bam HI, and pUB110 rep (A2 in FIG. 1), which is the replication origin of pUB110, is introduced. The resulting plasmid was further cleaved with restriction enzymes Bam HI and Bcl I, and then the minus origin region (MO fragment; A3 in FIG. 1) of pUB110 was introduced, and the donor plasmid pHD17K (3.6 kb; FIG. 1) was introduced. A5) can be constructed.
なお、クローニングプラスミドpYS24を構築する際に原型プラスミドとして用いたクローニングプラスミドであるpHD10Eは、図１のBに示した方法により構築することができる。具体的には、プラスミドpResKmNot10Asc（図１のA1）を制限酵素Bgl II及びBcl Iで切断し、リガーゼ反応を行うことによりMCS構造だけを取り除いたプラスミドpResKmNotAsc（図１のB1）を得る。このプラスミドに両端がNot IサイトとなったMCSを導入し、中間体であるプラスミドpResKmNot10NotAsc（図１のB2）を得る。この中間体及びもう1つのプラスミドであるpResEmPvu10（図１のB3）の両者を、制限酵素Bam HI及びBst BIで切断し、目的とするクローニングプラスミドpHD10E（1.6kb；図１のB4）を構築することができる。 The cloning plasmid pHD10E used as a prototype plasmid when constructing the cloning plasmid pYS24 can be constructed by the method shown in FIG. 1B. Specifically, plasmid pResKmNot10Asc (A1 in FIG. 1) is cleaved with restriction enzymes Bgl II and Bcl I, and ligase reaction is performed to obtain plasmid pResKmNotAsc (B1 in FIG. 1) from which only the MCS structure has been removed. MCS in which both ends are Not I sites is introduced into this plasmid to obtain an intermediate plasmid pResKmNot10NotAsc (B2 in FIG. 1). Both this intermediate and another plasmid, pResEmPvu10 (B3 in FIG. 1), are digested with restriction enzymes Bam HI and Bst BI to construct the desired cloning plasmid pHD10E (1.6 kb; B4 in FIG. 1). be able to.
ここで、前述したヘテロダイマー法について詳述する。当該方法は、所望のプラスミドDNAを構築する際に用い得る遺伝子組換え法の一つであり、その概略は次の通りである。まず、ドナープラスミド及びクローニングプラスミドを共通の制限酵素で切断した後、直鎖としたDNA断片を脱リン酸化することなく、再びリガーゼ反応に付す。このリガーゼ反応では、殆どの断片は単純に再び環状化されるだけであり、元のドナープラスミド及びクローニングプラスミドを再生する。しかしながら、わずかの分子は互いに結合して二量体（ダイマー）を形成する。そこで、このリガーゼ反応溶液を、組換え能が抑制された大腸菌（例えばJM109株等）に導入すると、同一の複製起点（例えばp15A等）を持つ異なったプラスミドは同じ大腸菌内には互いに共存できないというプラスミドの和合性・不和合性の性質から、複数のプラスミドが同一の大腸菌内に存在することはできず、一種のプラスミドが他のプラスミドを排除することとなる。その結果、形質転換後の大腸菌は、ドナープラスミドに由来する薬剤耐性のみを有するか、クローニングプラスミドに由来する薬剤耐性のみを有するか、あるいは、ドナープラスミド及びクローニングプラスミドに由来する両方の薬剤耐性を有するものとなる。そこで、形質転換体を、両薬剤を含む寒天培地上で選抜することにより、ヘテロダイマープラスミドを保持する大腸菌のみが選択的に得られることになる。次に、構築されたヘテロダイマープラスミドを他の制限酵素で切断し、再環状化し、大腸菌に形質転換して、エリスロマイシンのみを含有する寒天培地で形質転換体を選抜することにより、目的とする発現ベクターを構築することができる。以上に説明したテロダイマー法により、本発明の製造方法において用い得る発現ベクター、すなわち、抗GTF抗体をコードする遺伝子をバシラス・ブレビスにおいて発現可能なように組み込んだ発現ベクターを構築することができる。 Here, the heterodimer method described above will be described in detail. This method is one of gene recombination methods that can be used when constructing a desired plasmid DNA, and the outline thereof is as follows. First, the donor plasmid and the cloning plasmid are cleaved with a common restriction enzyme, and then the linear DNA fragment is subjected to ligase reaction again without dephosphorylation. In this ligase reaction, most fragments are simply recircularized, regenerating the original donor and cloning plasmids. However, a few molecules bind to each other to form a dimer (dimer). Therefore, when this ligase reaction solution is introduced into Escherichia coli with suppressed recombination ability (for example, JM109 strain), different plasmids having the same replication origin (for example, p15A) cannot coexist in the same E. coli. Due to the compatibility and incompatibility of plasmids, multiple plasmids cannot exist in the same E. coli, and one plasmid excludes the other plasmids. As a result, E. coli after transformation has only drug resistance derived from the donor plasmid, only drug resistance derived from the cloning plasmid, or both drug resistance derived from the donor plasmid and the cloning plasmid. It will be a thing. Therefore, by selecting the transformant on an agar medium containing both drugs, only E. coli carrying the heterodimeric plasmid can be selectively obtained. Next, the constructed heterodimeric plasmid is cleaved with other restriction enzymes, recircularized, transformed into E. coli, and the transformant is selected on an agar medium containing only erythromycin, thereby expressing the desired expression. A vector can be constructed. By the telodimer method described above, an expression vector that can be used in the production method of the present invention, that is, an expression vector in which a gene encoding an anti-GTF antibody is incorporated so as to be expressed in Bacillus brevis can be constructed.
なお、上述した発現ベクターpYS28及びpYS28YCは、いずれも大腸菌（Escherichia coli JM109）に組み込まれ、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に、以下の通り寄託されている。 The above-described expression vectors pYS28 and pYS28YC are both incorporated into Escherichia coli JM109, and the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-15-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref. No. 6) is deposited as follows.
Escherichia coli JM109/pYS28：
受託番号 FERM P-20361（寄託日：2005年1月14日）
Escherichia coli JM109/pYS28YC：
受託番号 FERM P-20362（寄託日：2005年1月14日）
本発明の製造方法において、抗GTF抗体生産のための宿主として用い得るバシラス・ブレビスの種類は、限定はされず、例えば、バシラス・ブレビスHPD31（FERM BP-1087）、バシラス・ブレビス47（FERM P-722）及びバシラス・ブレビスH102（FERM BP-1087）等が挙げられるが、中でも、バシラス・ブレビスHPD31が好ましい。
Escherichia coli JM109 / pYS28:
Accession number FERM P-20361 (Deposit date: January 14, 2005)
Escherichia coli JM109 / pYS28YC:
Accession number FERM P-20362 (Deposit date: January 14, 2005)
In the production method of the present invention, the type of Bacillus brevis that can be used as a host for the production of anti-GTF antibody is not limited. For example, Bacillus brevis HPD31 (FERM BP-1087), Bacillus brevis 47 (FERM P -722) and Bacillus brevis H102 (FERM BP-1087), among others, Bacillus brevis HPD31 is preferable.
バシラス・ブレビスを宿主とする形質転換法としては、公知のいずれの方法を採用してもよく、例えば、高橋らの方法（J. Bacteriol., vol.156, 1130, 1983）、高木らの方法（Agric. Biol. Chem., vol.53, 3099, 1989）、鵜高らの方法（Methods in Enzymol., vol.217, 23, 1993）等が挙げられる。また、得られる形質転換体の培養方法についても、公知のいずれの方法を採用してもよく、例えば、宿主にバシラス・ブレビスHPD31を用いた場合は、THB培地で30℃程度で数日間培養を行うことができる。 As a transformation method using Bacillus brevis as a host, any known method may be employed, for example, the method of Takahashi et al. (J. Bacteriol., Vol.156, 1130, 1983), the method of Takagi et al. (Agric. Biol. Chem., Vol. 53, 3099, 1989), the method of Takataka et al. (Methods in Enzymol., Vol. 217, 23, 1993) and the like. In addition, any known method may be employed as a method for culturing the obtained transformant. For example, when Bacillus brevis HPD31 is used as a host, the transformant is cultured in THB medium at about 30 ° C. for several days. It can be carried out.
本発明の製造方法においては、形質転換体の培養後に得られた培養物から、目的とする抗GTF抗体を得ることができる。ここで、当該抗体の採取方法、単離精製方法、収率の確認方法等については、前述した「４．形質転換体」における説明が同様に適用できる。 In the production method of the present invention, the target anti-GTF antibody can be obtained from the culture obtained after culturing the transformant. Here, the description in “4. Transformant” described above can be similarly applied to the antibody collection method, the isolation purification method, the yield confirmation method, and the like.
以上に説明したように、所定の宿主（バシラス・ブレビス）及び発現ベクターを用いて得られる形質転換体を培養して、培養物から抗GTF抗体を採取することにより、目的とする抗GTF抗体分子を大量に且つ高効率で製造することができる。また、得られる抗GTF抗体は、GTF活性を強力に抑制し得るものである。GTFは、通常、ショ糖を基質として分解しグルコースとフルクトースにした後、グルコースを重合させてグルカンを生成させるが、当該抗GTF抗体は、ショ糖をグルコースとフルクトースとに分解するシュクラーゼ活性を特に強力に抑制することができるものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
As described above, a target anti-GTF antibody molecule is obtained by culturing a transformant obtained using a predetermined host (Bacillus brevis) and an expression vector, and collecting the anti-GTF antibody from the culture. Can be manufactured in large quantities and with high efficiency. Moreover, the obtained anti-GTF antibody can strongly suppress GTF activity. GTF usually degrades sucrose as a substrate to glucose and fructose, then polymerizes glucose to produce glucan, but the anti-GTF antibody particularly has a sucrose activity that degrades sucrose into glucose and fructose. It can be strongly suppressed.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
抗GTF抗体(scFv)をコードする遺伝子（DNA断片）の調製
下記文献「Kazuo Fukushima et al., Infect. Immun., vol.61, p.323-328, 1993」（以下、文献A）に記載の方法に従い、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のGTF-I活性を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
Preparation of gene (DNA fragment) encoding anti-GTF antibody (scFv) Described in the following document "Kazuo Fukushima et al., Infect. Immun., Vol.61, p.323-328, 1993" (hereinafter referred to as Document A) According to the above method, a hybridoma producing a monoclonal antibody that suppresses GTF-I activity derived from Streptococcus mutans was obtained.
まず、ストレプトコッカス・ミュータンスPS14株（文献A参照）より、精製GTF-Iタンパク質を得、これを実験動物であるマウスに免疫し、脾臓を摘出後、ミエローマ細胞と融合させることにより不死化細胞株を作製した。次に、ELISA及び限界希釈法等により、抗原として用いたGTF-Iタンパク質を認識するモノクローナル抗体を分泌する株をスクリーニンク゛し、陽性ハイブリドーマP126を得た（文献A参照）。本ハイブリドーマからは、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のGTF-I活性を抑制するモノクローナル抗体が分泌生産される。 First, purified GTF-I protein is obtained from Streptococcus mutans PS14 strain (see Reference A), immunized with experimental mice, spleen removed, and then immortalized by fusion with myeloma cells Was made. Next, a strain that secretes a monoclonal antibody that recognizes the GTF-I protein used as an antigen was screened by ELISA, limiting dilution, or the like, to obtain a positive hybridoma P126 (see Document A). From this hybridoma, a monoclonal antibody that suppresses GTF-I activity derived from Streptococcus mutans is secreted and produced.
続いて、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のGTF-I活性を抑制するscFvをコードする遺伝子の調製を、市販のキット（アマシャム社製）の手順に従い試みた。具体的には、まず、本ハイブリドーマから、酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法により全mRNAを抽出し、これを逆転写反応のテンプレートとして用いた。プライム化ファーストストランド反応混合物を用いて、ファーストストランドcDNAを合成した。モノクローナル抗体のH鎖（重鎖）及びL鎖（軽鎖）のそれぞれの可変領域をコードするcDNAを、上記キットに添付のプライマー一式を使用して、PCRにより増幅した。 Subsequently, preparation of a gene encoding scFv that suppresses GTF-I activity derived from Streptococcus mutans was attempted according to the procedure of a commercially available kit (manufactured by Amersham). Specifically, first, total mRNA was extracted from this hybridoma by the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, and this was used as a template for the reverse transcription reaction. First-strand cDNA was synthesized using the primed first-strand reaction mixture. CDNAs encoding the variable regions of the H chain (heavy chain) and L chain (light chain) of the monoclonal antibody were amplified by PCR using a set of primers attached to the kit.
PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製して、プライマーを除いた。精製されたDNAの塩基配列を公知の塩基配列決定法（ジデオキシ法）により決定した結果、上記モノクローナル抗体のH鎖の可変領域は、配列番号１に示す塩基配列の第1番目〜第363番目の塩基からなるものであり、L鎖の可変領域は、配列番号１に示す塩基配列の第409番目〜第798番目の塩基からなるものであった。 PCR amplification products were purified by agarose gel electrophoresis to remove the primers. As a result of determining the base sequence of the purified DNA by a known base sequence determination method (dideoxy method), the variable region of the H chain of the monoclonal antibody is the first to the 363rd base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It consisted of bases, and the variable region of the L chain consisted of the 409th to 798th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
H鎖及びL鎖の可変領域をコードするcDNAを、配列番号５に示すリンカーペプチドをコードするDNAリンカーフラグメントを用いて、アッセンブルPCRを行い、正しい読み取り枠になるよう連結して、上記scFvをコードするDNA断片を調製した。 The cDNA encoding the variable regions of the H chain and the L chain is assembled using the DNA linker fragment encoding the linker peptide shown in SEQ ID NO: 5 and ligated into the correct reading frame to encode the scFv. DNA fragments to be prepared were prepared.
調製したDNA断片を、上記キットに付属のpCANTABベクターに導入して、上記scFvをコードするDNAを含む「pCANTAB-A4-13」を構築した（図２のB参照）。 The prepared DNA fragment was introduced into the pCANTAB vector attached to the kit to construct “pCANTAB-A4-13” containing the scFv-encoding DNA (see B in FIG. 2).
なお、pCANTAB-A4-13によりコードされる上記scFvタンパク質は、ファージM13のコートタンパク質のリーダー配列と融合した形となっている。また、pCANTAB-A4-13は、ペプチドtag（E-tag）をコードする遺伝子を含んでおり、これを利用して、scFvタンパク質の同定を抗E-tag抗体によるウエスタンブロットにより行うことができる。 The scFv protein encoded by pCANTAB-A4-13 is fused to the leader sequence of the coat protein of phage M13. Moreover, pCANTAB-A4-13 contains a gene encoding a peptide tag (E-tag), and by using this gene, scFv protein can be identified by Western blot using an anti-E-tag antibody.
抗GTF抗体(scFv)の発現ベクターpYS28のヘテロダイマー法による構築
１．ドナープラスミドpFD17Kの構築（図１のA参照）
ヘテロダイマー法のためのプラスミドの構築を行った。ドナープラスミドpFD17Kを構築するために、原型となるプラスミドpResKmNot10Asc（図１のA1参照）のマルチクローニングサイト（MCS）をBgl II及びBam HIで切断し、pUB110の複製領域pUB110 rep（図１のA2参照）を導入した。得られたプラスミドを、更にBam HI及びBcl Iで切断後、pUB110のマイナスオリジン領域（MO断片；図１のA3参照）を導入し、ドナープラスミドpFD17K（3.6kb；図１のA5参照）を構築した。
1. Construction of anti-GTF antibody (scFv) expression vector pYS28 by heterodimer method Construction of donor plasmid pFD17K (see A in Fig. 1)
Plasmid construction for the heterodimer method was performed. To construct the donor plasmid pFD17K, the multicloning site (MCS) of the original plasmid pResKmNot10Asc (see A1 in FIG. 1) was cleaved with Bgl II and Bam HI, and the replication region pUB110 rep of pUB110 (see A2 in FIG. 1). ) Was introduced. The obtained plasmid was further cleaved with Bam HI and Bcl I, and the minus origin region (MO fragment; see A3 in FIG. 1) of pUB110 was introduced to construct donor plasmid pFD17K (3.6 kb; see A5 in FIG. 1). did.
なお、原型となるpResKmNot10Ascは、下記文献「Teruaki Shiroza et al., Infect. Immun., vol.61, p.3745-3755, 1993」（以下、文献B）に記載された、Kmr903、p15Aori 及びMCSを結合し、更に市販のAsc Iリンカーを導入することにより構築した。
２．クローニングプラスミドpHD10Eの構築（図１のB参照）
次に、一般的なクローニングプラスミドを構築するため、原型となるプラスミドpResKmNot10Asc（図１のA1参照）をBgl II及びBcl Iで切断し、そのままリガーゼ反応を行うことによりMCS構造だけを取り除いたプラスミドpResKmNotAsc（図１のB1参照）を得た。このプラスミドに、両端がNot IサイトとなったMCSを導入し、中間体であるプラスミドpResKmNot10NotAsc（図１のB2参照）を得た。この中間体プラスミド、及びもう一つの原型プラスミドであるpResEmPvu10（図１のB3参照）の両者を、Bam HI及びBst BIで切断し、それぞれ、より大断片及び小断片を電気泳動により精製し、リガーゼ反応後、大腸菌に導入して形質転換した。その結果、一般的なクローニングプラスミドであるpHD10E（1.6kb；図１のB4参照）を得た。
The original pResKmNot10Asc is described in the following document “Teruaki Shiroza et al., Infect. Immun., Vol.61, p.3745-3755, 1993” (hereinafter referred to as document B), Km r 903, p15Aori. And MCS were combined, and a commercially available Asc I linker was further introduced.
2. Construction of cloning plasmid pHD10E (see B in Fig. 1)
Next, in order to construct a general cloning plasmid, the original plasmid pResKmNot10Asc (see A1 in FIG. 1) was cleaved with Bgl II and Bcl I, and the ligase reaction was carried out as it was to remove only the MCS structure. (See B1 in FIG. 1). MCS with both ends turned into Not I sites was introduced into this plasmid to obtain an intermediate plasmid pResKmNot10NotAsc (see B2 in FIG. 1). Both this intermediate plasmid and another prototype plasmid, pResEmPvu10 (see B3 in FIG. 1), were digested with Bam HI and Bst BI, and larger fragments and small fragments were purified by electrophoresis, respectively, and ligase was obtained. After the reaction, it was introduced into E. coli and transformed. As a result, a general cloning plasmid pHD10E (1.6 kb; see B4 in FIG. 1) was obtained.
なお、中間体であるプラスミドpResKmNot10NotAscは、上記した原型となるプラスミドpResKmNot10Ascに、市販のAsc Iリンカーを導入することにより構築した。また、プラスミドpResEmPvu10は、文献Bに記載された、Emr、p15Aori 及びMCSを結合することにより構築した。
３．プラスミドpYS24の構築（図２のE参照）
(1) プラスミドpYS22の構築（図２のD参照）
クローニングプラスミドpHD10E（図２のA参照）を、Bam HI及びPst Iで切断し、これに、電気泳動により精製した枯草菌α-アミラーゼ遺伝子の5'側領域のプロモーター配列、SD配列及びシグナル配列を含むBam Hi−Pst I断片（1.3kb；図２のC参照）を導入した。次いで、scFVタンパク質をコードする遺伝子（DNA断片）A4-13を、実施例１で構築したpCANTAB-A4-13（図２のB参照）のHind III−Eco RI断片（2.0kb）として電気泳動による精製後に回収し、その後数段の操作により、この断片をクローン化し、下記の(2)で行うPCRのテンプレートとなるプラスミドpYS22（図２のD参照）を構築した。
The intermediate plasmid pResKmNot10NotAsc was constructed by introducing a commercially available Asc I linker into the original plasmid pResKmNot10Asc. The plasmid pResEmPvu10 was constructed by linking Em r , p15Aori and MCS described in Reference B.
3. Construction of plasmid pYS24 (see E in Fig. 2)
(1) Construction of plasmid pYS22 (see D in Fig. 2)
Cloning plasmid pHD10E (see A in FIG. 2) was digested with Bam HI and Pst I, and the promoter sequence, SD sequence and signal sequence of the 5 ′ region of Bacillus subtilis α-amylase gene purified by electrophoresis were added thereto. A Bam Hi-Pst I fragment (1.3 kb; see FIG. 2C) was introduced. Next, the gene (DNA fragment) A4-13 encoding the scFV protein was electrophoresed as a Hind III-Eco RI fragment (2.0 kb) of pCANTAB-A4-13 (see FIG. 2B) constructed in Example 1. After the purification, the fragment was cloned by several steps, and a plasmid pYS22 (see D in FIG. 2) serving as a template for PCR performed in (2) below was constructed.
(2) α-アミラーゼ遺伝子のシグナル配列と抗GTF抗体(scFv)をコードする遺伝子とのリーディングフレームを合わせた融合（in-frame融合）
枯草菌α-アミラーゼのシグナルペプチドの長さは33アミノ酸残基と考えられており（図３のA参照）、一方、pCANTAB-A4-13によりコードされるscFvタンパク質は、ファージM13のコートタンパク質のリーダー配列と融合した形となっている（図３のB参照）。
(2) Fusion of the α-amylase gene signal sequence and the anti-GTF antibody (scFv) -encoding gene combined with the reading frame (in-frame fusion)
The length of the signal peptide of Bacillus subtilis α-amylase is considered to be 33 amino acid residues (see A in FIG. 3), while the scFv protein encoded by pCANTAB-A4-13 is a coat protein of phage M13. It is in a fused form with the leader sequence (see B in FIG. 3).
そこで、枯草菌α-アミラーゼ遺伝子（amyE）の分泌をつかさどるシグナル配列と、scFvタンパク質の構造遺伝子（A4-13）の塩基配列とを、リーディングフレーム（読み取り枠）を合わせた状態で融合させるために、まず以下の２つのプライマーをデザインし、プラスミドpYS22（図２のD参照）を鋳型として、PCRを行った。各プライマーは、図３のA, B中の点線で示した配列に結合し得るものである。 Therefore, in order to fuse the signal sequence that controls the secretion of the Bacillus subtilis α-amylase gene (amyE) and the base sequence of the structural gene (A4-13) of the scFv protein together with the reading frame (reading frame) combined. First, the following two primers were designed, and PCR was performed using plasmid pYS22 (see D in FIG. 2) as a template. Each primer can bind to the sequence indicated by the dotted line in A and B of FIG.
amyEのシグナル配列に対するプライマー（プライマー１）：
5'-GGCACTCGCAGCCGCCGGTCC-3' （配列番号７）
A4-13構造遺伝子配列に対するプライマー（プライマー２）：
5'-ATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG-3' （配列番号８）
上記PCRは、市販のPCRキットを用い、以下の反応液組成で、パーキンエルマー9600を使用して行った。PCRの反応条件は、(i) 初期変性（94℃，3分）、(ii)「変性（94℃，1分）→アニーリング（55℃，2分）→伸長（72℃，3分）」を１サイクルとして計30サイクル、(iii) 反応終了時の伸長（72℃，10分）とした。
PCR 反応組成液
鋳型DNA： 2μL
DNAポリメラーゼ： 2unit
プライマー１： 10μL
プライマー２： 10μL
dNTP(2.5mM)： 2μL
10×バッファー： 10μL
滅菌水： 適量(約64μL)
合計： 100μL
なお、プライマー１の5'側末端には、コードされるアミノ酸に影響を与えない、TをCとしたミスマッチを一ヶ所導入した。その結果、PCR産物のリガーゼ反応後のものを大腸菌に導入した形質転換体から得られるプラスミドには、新たにNco Iサイトが導入される（図３のC参照）。このプライマー設計の工夫により、効率よく形質転換体をスクリーニングし、pYS24（4.4kb；図２のE参照）を得ることができた。得られたプラスミドpYS24について、公知の塩基配列決定法（ジデオキシ法）により塩基配列を確認した結果、設計通り、両遺伝子が正しくin-frame融合されており、プロモーター配列、SD配列及びシグナル配列が正しく機能し得るように導入されていることが確認された。
４．ヘテロダイマー法による発現ベクターpYS28の構築（図４のD参照）
ヘテロダイマー法により、シャトルベクターであるプラスミドpYS28を構築した。まず、少量のクローニングプラスミドpYS24（図４のA参照）、及びドナープラスミドpHD17K（図４のB参照）をエッペンドルフチューブに混ぜ入れ、8塩基認識制限酵素であるNot Iで切断（図４のA, Bの太い矢印部分）し、リガーゼ反応後、大腸菌JM109に導入して形質転換した。得られた形質転換体を、エリスロマイシン及びカナマイシンの両薬剤を含む寒天培地上でスクリーニングし、ヘテロダイマープラスミド（キメラプラスミド）pYS26（7.9kb；図４のC参照）を保持する形質転換体、及びこの形質転換体から抽出したpYS26を得た。
Primer for amyE signal sequence (Primer 1):
5'-GGCACTCGCAGCCGCCGGTCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
Primer for A4-13 structural gene sequence (Primer 2):
5'-ATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG-3 '(SEQ ID NO: 8)
The above PCR was performed using a commercially available PCR kit and the following reaction solution composition using Perkin Elmer 9600. PCR reaction conditions are (i) initial denaturation (94 ° C, 3 minutes), (ii) "denaturation (94 ° C, 1 minute) → annealing (55 ° C, 2 minutes) → extension (72 ° C, 3 minutes)" Was defined as 30 cycles, and (iii) elongation at the end of the reaction (72 ° C., 10 minutes).
PCR reaction composition
Template DNA: 2μL
DNA polymerase: 2unit
Primer 1: 10 μL
Primer 2: 10 μL
dNTP (2.5mM): 2μL
10 x buffer: 10 μL
Sterile water: appropriate amount (about 64μL)
Total: 100μL
In addition, at the 5 ′ end of primer 1, one mismatch with T as C that does not affect the encoded amino acid was introduced. As a result, a new Nco I site is introduced into the plasmid obtained from the transformant obtained by introducing the PCR product after ligase reaction into E. coli (see C in FIG. 3). By designing the primer, it was possible to efficiently screen for transformants and obtain pYS24 (4.4 kb; see E in FIG. 2). As a result of confirming the nucleotide sequence of the obtained plasmid pYS24 by a known nucleotide sequencing method (dideoxy method), both genes were correctly in-frame fused as designed, and the promoter sequence, SD sequence and signal sequence were correct. It was confirmed that it was introduced to function.
4). Construction of expression vector pYS28 by heterodimer method (see D in Fig. 4)
Plasmid pYS28, a shuttle vector, was constructed by the heterodimer method. First, a small amount of cloning plasmid pYS24 (see A in FIG. 4) and donor plasmid pHD17K (see B in FIG. 4) are mixed in an Eppendorf tube and cleaved with Not I, an 8-base recognition restriction enzyme (A, FIG. 4). B, the thick arrow part), and after ligase reaction, it was introduced into E. coli JM109 for transformation. The obtained transformant was screened on an agar medium containing both erythromycin and kanamycin, and a transformant carrying a heterodimeric plasmid (chimeric plasmid) pYS26 (7.9 kb; see FIG. 4C), and this PYS26 extracted from the transformant was obtained.
次いで、得られたpYS26を、別の8塩基認識制限酵素であるAsc Iで切断し、再度リガーゼ反応後、大腸菌JM109に導入して形質転換した。得られた形質転換体を、エリスロマイシンを含む寒天培地上でスクリーニングすることにより、プロモーター配列、SD配列、シグナル配列及びscFVをコードする遺伝子を、scFVが発現可能なように含む、キメラなシャトルプラスミドpYS28（5.9kb；図４のD参照）を保持する形質転換体、及びこの形質転換体から抽出したpYS28を得た。なお、カナマイシンを含む寒天培地上でスクリーニングすると、カナマイシン耐性遺伝子を有する小さなプラスミドが得られる。 Next, the obtained pYS26 was cleaved with Asc I, which is another 8-base recognition restriction enzyme, and after ligase reaction again, it was introduced into E. coli JM109 and transformed. By screening the obtained transformant on an agar medium containing erythromycin, a chimeric shuttle plasmid pYS28 containing a promoter sequence, an SD sequence, a signal sequence and a gene encoding scFV so that scFV can be expressed. (5.9 kb; see D in FIG. 4) and pYS28 extracted from this transformant were obtained. In addition, when screening on an agar medium containing kanamycin, a small plasmid having a kanamycin resistance gene is obtained.
抗GTF抗体(scFv)の産生及びその精製
まず、実施例２で得られたキメラなシャトルプラスミドpYS28を、バシラス・ブレビスHPD31株に導入して形質転換することにより、エリスロマイシン耐性の形質転換体を得た。この形質転換体は、50mg/Lのエリスロマイシンを含む、Todd Hewitt Broth（THB；Difco社製）培地にて培養した。
Production and purification of anti-GTF antibody (scFv) First, the chimeric shuttle plasmid pYS28 obtained in Example 2 was introduced into Bacillus brevis strain HPD31 and transformed to obtain a transformant resistant to erythromycin. It was. This transformant was cultured in a Todd Hewitt Broth (THB; manufactured by Difco) medium containing 50 mg / L erythromycin.
なお、以下の全ての精製操作は、4℃の温度条件下で行った。また、scFvタンパク質の同定は、抗E-tag抗体によるウエスタンブロットで行った。 All the following purification operations were performed under a temperature condition of 4 ° C. The scFv protein was identified by Western blot using an anti-E-tag antibody.
上記バシラス・ブレビス形質転換体を、2リットルのTHB培地に接種し、30℃で3日間、激しく攪拌を行いながら培養し、その後、遠心分離処理により菌体を除いた。 The Bacillus brevis transformant was inoculated into 2 liters of THB medium, cultured at 30 ° C. with vigorous stirring for 3 days, and then the cells were removed by centrifugation.
得られた上澄に対し、等量の冷エタノールを加え、生じた不溶性物質を遠心分離処理により得た。この不溶性物質を、200ｍLのバッファーA（10mM Tris-HCl、pH8.0、6M尿素）に懸濁し、5リットルの10mM Tris-HCl（pH8.0）に対して透析を行った。 An equal amount of cold ethanol was added to the resulting supernatant, and the resulting insoluble material was obtained by centrifugation. This insoluble material was suspended in 200 mL of buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6 M urea), and dialyzed against 5 liters of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0).
透析終了後、予めバッファーAにて平衡化しておいたブチルトヨバールによる疎水クロマト（0.5×10cm）に付した。吸着タンパク質は、30％から0％の飽和硫安グラジエントにより溶出し、抗E-tag抗体による陽性画分を集めた。このカラム操作を繰り返すことにより、他のタンパク質が混在しない画分を得、これを10mM Tris-HCl（pH8.0）に対して透析を行い、精製scFvの標品を得た。結果として、バシラス・ブレビス形質転換体のTHB培養液2リットルから、約1mgの精製scFv標品を得た。 After completion of dialysis, the sample was subjected to hydrophobic chromatography (0.5 × 10 cm) using butyltoyobar that had been equilibrated with buffer A in advance. The adsorbed protein was eluted with a 30% to 0% saturated ammonium sulfate gradient, and the positive fractions from the anti-E-tag antibody were collected. By repeating this column operation, a fraction free of other proteins was obtained, and this was dialyzed against 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to obtain a purified scFv sample. As a result, about 1 mg of purified scFv preparation was obtained from 2 liters of THB culture of Bacillus brevis transformants.
精製scFv標品のSDS-PAGE（図５のA参照）及びウエスタンブロット（図５のB参照）により、他のタンパク質の混在の無いことが確認された（図５のA及びBそれぞれのレーン3参照）。 SDS-PAGE (see FIG. 5A) and Western blot (see FIG. 5B) of the purified scFv preparation confirmed that no other proteins were present (lane 3 in each of A and B in FIG. 5). reference).
抗GTF抗体(scFv)の性質
実施例3で得られた精製抗GTF抗体(scFv)を用いて、GTF-I活性の抑制活性を、定性的アッセイ法により測定した。
１．アッセイ法に用いるGTF-Iの調製（抗原調製）
GTF-Iの精製は、Kuwahara等の方法（Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 1290-1295, 2001）に準じ、以下のように行った。全ての精製操作は4℃の温度条件下で行った。GTF-Iを精製するための菌株は、S. mutans GS5株由来gtfB遺伝子が導入されたS. anginosus形質転換体KSB8株を使用した（Infect. Immun., 60, 2815-2822, 1993 参照）。本菌株を100mLのTHB培地に接種、37℃で20時間、嫌気培養を行った。遠心分離処理により菌体を取り除き、得られた上澄に対し等量の-80℃冷エタノールを加え、一夜置いた。生じた不溶性物質を遠心分離処理により回収し、これをバッファーA（10mM Tris-HCl、pH8.0）に溶解し、同一バッファーで24時間透析を行った。不溶物を遠心分離処理により取り除き、上澄に最終濃度が0.2％となるようにTriton X-100を加え、予め0.2％ Triton X-100を含むバッファーAで平衡化したDEAE-Bio-Gelカラム（1×50cm）に付した。カラムを十分に洗浄後、吸着タンパクを食塩の濃度勾配（0から0.5M）を含むバッファーAにより溶出した。SDS-PAGEによる活性染色等よりGTF-I活性を有するフラクションを得、同一樹脂による再クロマト（0.5×25cm）をTriton X-100無しで行うことにより、精製GTF-I標品を得た。
２．定性的アッセイ法の詳細
0.1ユニットの精製GTF-Iを含む100mMリン酸バッファー（pH6.0）溶液に、各量の精製scFv（2μg、4μg、8μg、16μg）を添加して、容量を300μLとし、37℃で1時間置いた。これに、最終濃度が50mMとなるようにショ糖を加え、最終容量を500μLとして、37℃で一夜置き、生成した不溶性グルカンを観察した。
Properties of anti-GTF antibody (scFv) Using the purified anti-GTF antibody (scFv) obtained in Example 3, the inhibitory activity of GTF-I activity was measured by a qualitative assay.
1. Preparation of GTF-I used for assay method (antigen preparation)
Purification of GTF-I was performed as follows according to the method of Kuwahara et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 1290-1295, 2001). All purification operations were performed at a temperature of 4 ° C. As a strain for purifying GTF-I, the S. anginosus transformant KSB8 strain into which the gtfB gene derived from S. mutans GS5 strain was used (see Infect. Immun., 60, 2815-2822, 1993). This strain was inoculated into 100 mL of THB medium and anaerobically cultured at 37 ° C. for 20 hours. The cells were removed by centrifugation, and an equal amount of cold ethanol at −80 ° C. was added to the resulting supernatant and left overnight. The resulting insoluble material was recovered by centrifugation, dissolved in buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0), and dialyzed against the same buffer for 24 hours. Insoluble material was removed by centrifugation, Triton X-100 was added to the supernatant to a final concentration of 0.2%, and a DEAE-Bio-Gel column equilibrated in advance with buffer A containing 0.2% Triton X-100 ( 1 × 50 cm). After thoroughly washing the column, the adsorbed protein was eluted with buffer A containing a salt concentration gradient (0 to 0.5 M). A fraction having GTF-I activity was obtained by activity staining by SDS-PAGE, and rechromatography (0.5 × 25 cm) with the same resin was performed without Triton X-100 to obtain a purified GTF-I standard.
2. Qualitative assay details
Each volume of purified scFv (2 μg, 4 μg, 8 μg, 16 μg) was added to a 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) solution containing 0.1 unit of purified GTF-I to a volume of 300 μL for 1 hour at 37 ° C. placed. To this, sucrose was added to a final concentration of 50 mM, the final volume was 500 μL, and the mixture was allowed to stand overnight at 37 ° C., and the produced insoluble glucan was observed.
なお、精製GTF-Iを含まず、精製scFvを添加しないものをコントロールとした。
３．アッセイの結果
上記アッセイ法により、精製scFv標品を用いてGTF-I活性の抑制活性を測定した結果を、図６に示した。
A control without purified GTF-I and without the addition of purified scFv was used as a control.
3. Results of Assay FIG. 6 shows the results of measuring the inhibitory activity of GTF-I activity using the purified scFv sample by the above assay method.
図６では、より左側のサンプルほど精製scFvの添加量が多くなっており、この添加量が多いほど不溶性グルカンによる白い濁りが少なくなった。従って、精製scFvはGTF-I活性を有効に抑制することが分かった。なお、一番右側のサンプルはコントロールであり、上段と下段の写真は同じサンプルを角度を変えて撮ったものを示している。 In FIG. 6, the amount of purified scFv added to the sample on the left side increased, and white turbidity due to insoluble glucan decreased as the amount added increased. Therefore, it was found that purified scFv effectively suppresses GTF-I activity. The rightmost sample is the control, and the upper and lower photographs show the same sample taken at different angles.
配列番号１：抗GTF抗体
配列番号２：抗GTF抗体
配列番号３：抗GTF抗体
配列番号４：抗GTF抗体
配列番号５：リンカーペプチド
配列番号６：リンカーペプチド
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
SEQ ID NO: 1: anti-GTF antibody SEQ ID NO: 2: anti-GTF antibody SEQ ID NO: 3: anti-GTF antibody SEQ ID NO: 4: anti-GTF antibody SEQ ID NO: 5: linker peptide SEQ ID NO: 6: linker peptide SEQ ID NO: 7: primer SEQ ID NO: 8: primer
Claims (10)
(a) 配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体活性を有するタンパク質 The following protein (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4
(b) It has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and has antibody activity against a glycosyltransferase produced by Streptococcus mutans protein
(a) 配列番号1若しくは3に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号1若しくは3に示される塩基配列を含むDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグリコシルトランスフェラーゼに対する抗体活性を有するタンパク質をコードするDNA A gene comprising the following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3
(b) a glycosyltransferase that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and produced by Streptococcus mutans DNA encoding a protein having antibody activity against
4. An antibody against glycosyltransferase from a culture obtained by transforming Bacillus brevis by culturing the transformant with an expression vector into which the gene according to claim 2 or 3 is incorporated so that it can be expressed in Bacillus brevis. Collecting the antibody.
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