JP2005312996A - 軟骨細胞株 - Google Patents

Abstract

【課題】 関節炎のヒト細胞モデルを提供すること。
【解決手段】カルシウムを鉱化することを特徴とする、単離された関節軟骨細胞；カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞株を生成するための方法であって、以下の工程：ａ）不死化剤を用いて少なくとも１つの成熟ヒト関節軟骨細胞を不死化する工程；およびｂ）該不死化細胞を、ヒト関節軟骨細胞の集団を生成するために培養する工程を包含する、方法；関節炎を処置するために設計された治療薬剤を同定するための方法であって、以下の工程：ａ）カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞を含有する、単離された軟骨細胞、または少なくとも１つの軟骨細胞株を少なくとも１つの試験薬剤に曝す工程；ｂ）該試験薬剤に対する応答の性質を観察する工程；およびｃ）関節炎を処置するために有用な応答を示す任意の薬剤を同定する工程を包含する、方法が開示される。
【選択図】 なし

Description

本発明は、関節炎の状態を研究するために使用される軟骨細胞および軟骨細胞株に関する。しかし、特にそれに限定されない。

さらに本発明は、例えば、股関節および関節のような骨格組織の置換に使用するための、新規生体材料の開発において特に有用であり得る軟骨細胞に関する。

関節炎は、関節の炎症およびそれによる軟骨組織の炎症により特徴付けられる。軟骨は、細胞、および特に軟骨細胞により細胞外スペース内に分泌される物質からなる。細胞から分泌される最も顕著な２つの物質は、コラーゲンとムコ多糖である。ムコ多糖は、二糖類の繰り返しとして存在する炭水化物鎖を含有する大きな分子量の糖分子である。２つの糖のうちの１つは、常にアミノ糖であり、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンのいずれかである。ほとんどの場合、ムコ多糖はタンパク質と結合し、従って、プロテオグリカンを形成する。

コラーゲンは繊維状の構造である。一方、ムコ多糖は外観上は不定形で、極度の粘性であり、従って、一定の重量に対して大きな容積を占有し得る。多くの場合、コラーゲンおよびプロテオグリカンは互いに相互作用し、多様な細胞外構造を形成する。これらの構造は、自己組織化と考えられる；これらの重合、相互作用、または方向付けをもたらす酵素または他の物質は明らかではない。例えば、軟骨内に見出される代表的なコラーゲンプロテオグリカンは、それに対して結合し、一定の長さの間隔で連結タンパク質を有する数マイクロメートルのヒアルロン酸の中心フィラメントからなり得る。長い核タンパク質は、連結タンパク質と結合し、一定間隔での核タンパク質からの分岐は、例えばコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸のようなムコ多糖である。従って、細胞外マトリックス物質は、自分自身を組織化して軟骨を形成する。

骨形成は、肥大性軟骨細胞の領域における石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により特徴づけられる。脈管の侵入はインビボでの鉱化作用（ｍｉｎｅｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）に重要であるが、石灰化の開始は、血管新生と無関係であることは明らかである。なぜなら、肥大性軟骨細胞は、外因性のリン酸塩が存在しない場合、インビボにおいて自発的にそれらのマトリックスを鉱化し（ｍｉｎｅｒａｌｉｓｅ）得るからである。しかし、成人の関節軟骨は、石灰化が特徴的な到着点（ｔｉｄｅ−ｍａｒｋ）を形成する肋軟骨を有する連結部での場合を除いて、通常は石灰化しない。従って、興味深いことに、軟骨石灰症（ピロリン酸カルシウムによる関節軟骨の鉱化作用の病理学的な石灰化）は、関節の異なる領域または他の軟骨において起こり、年齢とともに有病率を増大し、そして変形性関節症に関連し得ることは注目すべきことである。

従って、変形性関節症に関連するメカニズムの理解は、関節軟骨の石灰化に関連するメカニズムの理解を含むはずである。しかし、この研究のための細胞モデルは存在しない。逆に、存在する細胞モデルは、増殖プレート軟骨細胞（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、すなわち骨組織を生成するためにカルシウムを鉱化する軟骨細胞を利用する。ヒヨコの細胞モデルを用いることにより、ヒヨコ増殖プレート軟骨細胞層がアスコルビン酸塩またはβ−グリセロリン酸の存在下で鉱化することを示し得る（１）。アスコルビン酸塩の効果は、アルカリフホスファターゼおよびＸ型コラーゲンの合成の増大に関係するが、これらは、ともに石灰化を起こすために不可欠であるかどうかは明らかではない。β−グリセロリン酸は、おそらく、核形成のための外因性のリン酸の豊富な供給源を提供することにより、これらの２つの分子の調節を独立に行う。他の研究者らは、アルカリホスファターゼおよびＸ型コラーゲンの合成、ならびにアスコルビン酸塩を有する培養物における石灰化が生じるウサギ増殖プレート軟骨細胞のためのペレット培養系を開発した（２）。別の研究（３）は、アスコルビン酸塩の効果が、種特異的であり得、このことは、ヒト疾患の過程が研究され得る場合、ヒト軟骨細胞モデル系のための必要性を強調することを示唆する。

今日までのところ、インビトロで、関節軟骨細胞によるマトリックスの石灰化を示す研究はない。研究者たちは、ウサギの関節軟骨細胞および増殖プレート軟骨細胞を比較し、そして高密度培養において増殖プレート軟骨細胞は、アルカリホスファターゼを生成し、細胞層内にカルシウムを組み込むが、一方、関節軟骨細胞はそのようなことを行わないことを見出した（４）。しかし、２つの研究は、ヒヨコ（５）またはヒト（６）の関節軟骨細胞が、長期間の培養中に、Ｘ型コラーゲンおよびアルカリフォスファターゼを発現し得ることを明らかにした。しかし、いずれの研究においても、細胞層マトリックスの石灰化は明らかではない。

他の研究者らは、ヒト軟骨細胞株が、ＳＶ４０オンコジーンを用いた未熟な一次軟骨細胞のトランスフェクションによりどのように生成され得るかを、国際特許出願ＷＯ９４０９１１８（最も密接な先行技術）に記載する。軟骨細胞は、関節軟骨細胞に特異的な成分であるＩＩ型コラーゲンを発現する。しかし、これらの細胞株を用いたマトリックスの石灰化との関係はない。

従って、石灰化のインビトロモデルの存在は、動物の増殖プレート軟骨細胞の長期間の培養に基づく。現在、ヒトの軟骨細胞石灰化のモデルはない。

本発明者らは、驚くべきことに、成熟した関節軟骨細胞および不死化された関節軟骨細胞株が、急速に石灰化する細胞外マトリックスを提供することを見出した。用語「成熟した」により、本発明者らは、例えば変形性関節症が進行したような年齢の個体のような老齢の個体、５０歳を越えた、そしてより好ましくは６５歳を越えた個体由来の軟骨細胞を意味する。しかし、これには限定されない。あるいは、機能的に同等の年齢のインビトロで増殖させた軟骨細胞である。

従って、本発明者らの発見は、関節軟骨の石灰化に関係したメカニズムの研究、およびこの石灰化の調節のための貴重な機会を表す。本発明者らは、この関節軟骨細胞株が、学術的および商業的な両方の値価を有すると予想する。軟骨細胞株は、骨関節炎の病状に関係し得る石灰化のより大きな理解を容易にするだけではなく、このような症状を処置するための治療薬の開発に貴重な道具として用いられる。

本発明者らは、本発明者らの発見を説明し得ないが、以下のように推定する。発達の期間中、一般に、軟骨細胞は２つの系統の１つを行う。第１の系統は、骨の生成に関係し、従って分化した軟骨細胞はカルシウムを鉱化する。２つ目は、軟骨組織の生成に関係し、従って分化した軟骨細胞はカルシウムを鉱化しない。系統の決定においてはいくらかの柔軟性があり得る。そして例えば、このことは老化に伴うＤＮＡの脱メチル化に関連し得る。

従って、関節軟骨細胞が老化するに従って、カルシウム鉱化作用を妨げる制御メカニズムは効果的に作用せず、そして驚くべきことに、関節軟骨系統の軟骨細胞は、実際にカルシウムを鉱化する。

従って、本発明者らの発見は、これまでの予想に反して、関節炎のヒト細胞モデルを提供し得ることを示唆する。成熟または不死化した、いずれかの関節軟骨細胞、そして理想的にはそれに関係する細胞株を用いる細胞モデルを提供し得る。

本発明は、特許請求の範囲の記載のほか、以下の１から２９に規定され得る発明を提供する。
１．カルシウムを鉱化することを特徴とする、関節軟骨細胞。
２．複数の上記軟骨細胞がペレット形態に配列される、項１に記載の関節軟骨細胞。
３．上記軟骨細胞は、成熟しているか、または成熟した個体および好ましくは関節炎を患うかもしくは関節炎の素因を有する個体に由来する、項１または２に記載の関節軟骨細胞。
４．上記軟骨細胞が胎児起源である、項１または２に記載の関節軟骨細胞。
５．上記軟骨細胞が細胞株として提供される、項１から４のいずれかに記載の関節軟骨細胞。
６．上記細胞株がヒト起源である、項５に記載の関節軟骨細胞。
７．上記軟骨細胞がオンコジーンを含有する、項１から６のいずれかに記載の関節軟骨細胞。
８．上記オンコジーンが温度感受性である、項７に記載の関節軟骨細胞。
９．上記オンコジーンがＳＶ４０Ｔ抗原である、項８に記載の関節軟骨細胞。
１０．カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞株を生成するための方法であって、以下の工程：
ａ）不死化剤を用いて少なくとも１つの成熟ヒト関節軟骨細胞を不死化する工程；および
ｂ）上記不死化細胞を、ヒト関節軟骨細胞の集団を生成するために培養する工程
を包含する、方法。
１１．上記不死化剤がオンコジーンである、項１０に記載の方法。
１２．上記オンコジーンが温度感受性である、項１１に記載の方法。
１３．上記オンコジーンがＳＶ４０Ｔ抗原である、項１２に記載の方法。
１４．上記方法が、上記不死化細胞を、上記オンコジーンの非許容温度で培養する工程をさらに包含する、項１２または１３に記載の方法。
１５．関節炎を処置するために設計された治療薬剤を同定するための、カルシウムを鉱化する少なくとも１つの関節軟骨細胞の使用。
１６．関節炎を処置するために設計された治療薬剤を開発するための方法であって、以下の工程：
ａ）カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞を含有する、軟骨細胞、または少なくとも１つの軟骨細胞株を少なくとも１つの試験薬剤に曝す工程；および
ｂ）上記試験薬剤に対する応答の性質を観察する工程；
を包含する、方法。
１７．上記観察が、上記軟骨細胞または上記軟骨細胞株と関連したカルシウムの鉱化作用の量の評価を包含する、項１６に記載の方法。
１８．ヒト肥大性軟骨細胞株。
１９．上記細胞株が胎児の起源である、項１８に記載の細胞株。
２０．上記細胞株がオンコジーンを含有する、項１８または１９に記載の細胞株。
２１．上記オンコジーンが温度感受性である、項２０に記載の細胞株。
２２．上記オンコジーンがＳＶ４０Ｔ抗原である、項２０または２１に記載の細胞株。
２３．ヒト肥大性軟骨細胞株を生成するための方法であって、以下の工程：
ａ）不死化剤を用いて、少なくとも１つのヒト胎児軟骨細胞を不死化する工程、および
ｂ）上記不死化細胞を、ヒト胎児由来軟骨細胞の集団を生成するために培養する工程
を包含する、方法。
２４．上記不死化剤がオンコジーンである、項２３に記載の方法。
２５．上記オンコジーンが温度感受性である、項２４に記載の方法。
２６．上記オンコジーンがＳＶ４０Ｔ抗原である、項２４または２５に記載の方法。
２７．上記方法が、上記不死化細胞を上記オンコジーンの非許容温度で培養する工程をさらに包含する、項２５または２６に記載の方法。
２８．結合マトリックス組織を提供する際の使用のために、肥大性軟骨細胞、または少なくとも１つの肥大性軟骨細胞株の使用。
２９．損傷組織の修復および／または置換に使用するための結合マトリックス組織を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）肥大性軟骨細胞株を提供する工程；
ｂ）上記細胞株を、マトリックス増殖を促進する条件下で培養する工程；およびｃ）上記細胞、および／または上記マトリックス組織、および／またはその選択された部分を回収する工程
を包含する、方法。
３０．関節炎の処置のために設計された治療薬剤の同定に使用するための、肥大性軟骨細胞または少なくとも１つの肥大性軟骨細胞株。

従って、本発明者らは、成熟した成体組織、あるいは不死化した、より若いヒト組織のいずれかより由来する、カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞株を生成し得ることを明白に立証した。従って、本発明者らの細胞株は、これらの組織によるカルシウムの鉱化に影響する薬剤の同定に用途を有する。本発明者らはまた、上記のように使用するため、および多数の適用に用いられる、生体物質の開発に使用するため、しかし特に関節置換に用いられる物質の開発に使用するためのヒト肥大性軟骨細胞株を提供し得ることも立証した。

従って、本発明の第１の局面によれば、カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞が提供される。

好ましくは、ペレットの形態で配列された多数の軟骨細胞を提供する。

好ましくは、前記の軟骨細胞（単数および複数）は、成熟個体から、および理想的には、関節炎を患っているかまたはその素因を有するそのような個体に由来する。あるいは、前記の軟骨細胞（単数および複数）は、胎児起源、そして好ましくはヒト胎児起源である。さらに好ましくは、前記軟骨細胞（単数および複数）は、本明細書中に定義されるように成熟している。

さらに好ましくは、このような軟骨細胞の細胞株を提供する。

本発明の好ましい実施態様においては、前記細胞株がヒト起源であり、そして理想的には、オンコジーン、および理想的には、許容性の第１の温度で、活性なオンコジーン産物を発現し、そして非許容性の第２の温度で、活性なオンコジーン産物の発現を妨げる温度感受性オンコジーンを含有する。本発明者らは、このようなオンコジーン産物の使用が、非許容温度でＩＩ型コラーゲン（完全に分化された表現型のマーカー）の発現の増大を示す細胞株を提供することを見い出した。

理想的には、オンコジーンは、不死化するオンコジーンＳＶ４０−Ｔの温度感受性変異体である。

本発明者らは、この段階において、関節軟骨細胞によるカルシウム鉱化作用が骨関節炎の直接の原因であるかどうか、あるいは関節軟骨細胞によるカルシウム鉱化作用が、変形性関節症に起因するまだ同定されていない状態またはマーカーの指標であるかどうかを確定しない。どちらの場合においても、本発明者らの細胞株は、さらなる研究のための適切な細胞モデルを現す。

前記のように、本発明者らは、この段階において、関節軟骨細胞または肥大性軟骨細胞によるカルシウム鉱化作用を導くメカニズムの本質をさらに確信し得ない。他の研究者らは、年齢に関連する遺伝子の再活性化の存在を示唆した（７）。従って、本発明書らが上記に推測したように、脱分化のプロセスは変形性関節症を引き起こし得る。生涯にわたって典型的に不活性な遺伝子が老化に伴って発現し、そしてその遺伝子は従って成熟した関節軟骨細胞の異常な表現型の原因となり得る。

上記の推測は、啓発の目的だけのために提供される。これは、適用が上記の推測のいずれかに限定されるべきでないことを意図する。むしろ、推測は、理解の目的のために提供される。

明らかな利点が、関節炎状態を模倣するインビトロの細胞モデルの使用から誘導され得る。しかし、さらに本発明者らは、Ｘ型コラーゲン（肥大性軟骨細胞のマーカー）を発現する胎児組織由来の軟骨細胞株を生成する。このような軟骨細胞は、カルシウムを鉱化することが知られており、そして従って、これらの細胞の表現型が一旦決定されると、鉱化作用の存在は驚くほどではない。しかし、関節炎の状態の前兆である石灰化プロセスの理解において明らかに有利であるにもかかわらず、これまで誰もヒト肥大性軟骨細胞株を作製していないことは注目される。さらに誰も、骨格の修復および／または置換研究および／または手術において使用するための結合マトリックス組織（ｊｏｉｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｔｉｓｓｕｅ）の研究および／または生成のために、このような細胞株を作製することを考えなかった。従って、本発明者らはまた、本明細書中で、ヒト肥大性軟骨細胞株の生成に関する知識およびそれに関連する方法を示す。

本発明の第２の局面によれば、ヒト肥大性軟骨細胞株が提供される。

本発明のなおさらに好ましい実施態様において、前記細胞株がヒト胎児起源であり、そして理想的にはオンコジーン、および理想的には、許容性の第１の温度で、活性なオンコジーン産物を発現し、そして非許容性の第２の温度で、活性なオンコジーン産物の発現を阻害する温度感受性オンコジーンを含有する。本発明者らは、このようなオンコジーン産物の使用が、非許容温度においてＸ型コラーゲン（肥大性軟骨細胞のマーカー）の発現を示す細胞株を提供することを見い出した。従って、カルシウムを鉱化するヒト胎児組織より誘導される代替細胞株を提供し得る。

本発明のなおさらなる局面によれば、関節軟骨細胞株を生成するための方法が提供される。その方法は以下の工程を包含する：
ａ）不死化剤を用いて、少なくとも１つの成熟関節軟骨細胞を不死化する工程；および
ｂ）ヒト関節軟骨細胞の集団を生成するために、前記不死化細胞を培養する工程。

好ましくは、不死化剤はオンコジーンであり、そしてなおさらに好ましくは、非許容温度で軟骨細胞の表現型特徴の増強した発現をもたらす温度感受性オンコジーンである。

本発明の好ましい実施態様において、不死化は、日常的なトランスフェクション技術を用いて達成され、そして好ましくは不死化剤は、例えばオンコジーン、そしてなおより好ましくは不死化するオンコジーンＳＶ４０−Ｔの温度感受性変異体のような、不死化遺伝子である。

理想的には、前記の方法は、前記不死化した細胞をオンコジーンの非許容温度で培養する工程をさらに包含する。

本発明のなおさらなる局面によれば、肥大性軟骨細胞株を生成するための方法が提供される。その方法は以下の工程を包含する：
ａ）不死化剤を用いて、少なくとも１つのヒト胎児軟骨細胞を不死化する工程；および
ｂ）ヒト胎児由来の軟骨細胞の集団を生成するために、前記不死化細胞を培養する工程。

好ましくは不死化剤は、オンコジーンであり、そしてなおさらに好ましくは非許容温度で軟骨細胞の表現型特徴の増強した発現をもたらす温度感受性オンコジーンである。

本発明の好ましい実施態様において、不死化は、日常的なトランスフェクション技術により達成され、そして好ましくは、不死化剤は、例えばオンコジーンのような、そしてなおさらに好ましくは不死化さするオンコジーンＳＶ４０−Ｔの温度感受性変異体のような不死化する遺伝子である。なおさらに好ましくは、前記トランスフェクションは、レトロウイルスの温度感受性オンコジーンの形質導入を用いて行う。

理想的には前記方法は、オンコジーンの非許容温度で前記不死化細胞を培養する工程をさらに包含する。

本発明のなおさらなる局面によれば、関節炎を処置するために設計された治療薬剤の開発に使用するための本発明による軟骨細胞、または少なくとも１つの軟骨細胞株が提供される。

本発明のなおさらなる局面によれば、関節炎を処置するために設計された治療薬剤を開発するための方法が提供され、以下の工程を包含する：
ａ）軟骨細胞または少なくとも１つの軟骨細胞株を、本発明に従って、少なくとも１つの試験薬剤に曝す工程；および
ｂ）前記試験薬剤に対する応答の性質を観察する工程。

本発明の好ましい方法において、前記観察は、前記軟骨細胞または前記軟骨細胞株に関係するカルシウム鉱化作用の評価を包含する。

本発明の別の局面によれば、結合マトリックス組織の供給において使用するための肥大性軟骨細胞または少なくとも１つの肥大性軟骨細胞株が提供される。

本発明の別の局面によれば、損傷組織を修復および／または置換するために使用される結合マトリックス組織を生成する方法が提供され、以下の工程を包含する：
ａ）肥大性軟骨細胞株を生成する工程；
ｂ）前記細胞株を、マトリックス増殖を促進する条件下で培養する工程；およびｃ）前記細胞および／または前記マトリックス組織、および／またはその選択される一部を回収する工程。

本発明は、以下の実施例を参照してのみ、例として記載される。

（関節軟骨細胞の不死化）
参考文献１３は、一次培養のためのヒト関節軟骨細胞を調製する一般的な方法を提供するが、任意の公開されている方法で十分である。簡単には、患者の生検からの成熟したヒトの脛骨顆および大腿顆の切片由来の軟骨細胞を酵素的に消化し（１４）、そして抗生物質およびＬ−グルタミン、ならびに１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＥａｇｌｅ最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ Ｌｔｄ． ＵＫ）が入った組織培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ Ｌｔｄ． ＵＫ）中に置いた。培養を、５％ ＣＯ_２の加湿雰囲気中で、３７℃に保ち、そして培地を一定の間隔で交換した。次いで、付着性細胞集団を、レトロウイルス形質導入を用いて、シミアンウイルス４０由来のラージ腫瘍（Ｔ）抗原の温度感受性変異体をトランスフェクトした。この配列（ＬＴＲプロモーターのような、その発現を駆動するために適切なプロモーターへの結合と一緒に）のトランスフェクションの任意の標準的な方法（例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ沈澱法、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクション）で十分であるが、レトロウイルス形質導入を、使用の簡便性のために選択した。

（ヒト胎児組織の不死化）
胎児の肋骨または大腿骨組織を、妊娠第７週〜第９週で採取し、そして抗生物質およびＬ−グルタミンならびに１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＥａｇｌｅ最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃｏ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ＵＫ）を入れた組織培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ＵＫ）中に置いた。培養細胞を、５％ ＣＯ_２の加湿雰囲気中で３７℃に保ち、そして一定の間隔（２〜３日）で培地を交換した。切除した組織の初代培養では普通であるように、サンプル中の細胞は、組織本体から移動し、フラスコ表面に付着し、そして潜在的には、組織培養皿の表面全体を覆うように複製する。初代培養の初期期間の例えば２週間後、細胞集団を、レトロウイルス形質導入を用いて、シミアンウイルス４０由来ラージ腫瘍（Ｔ）抗原の温度感受性変異体でトランスフェクトした。

（均質な細胞集団を産生するための不死化細胞の培養）
簡単にいえば、この構築物およびジェネティシン、Ｇ４１８に対する耐性マーカーを含有する両栄養性にパッケージされたレトロウイルス粒子（Ｍ Ｏ’Ｈａｒｅ博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｒｏｙａｌ Ｍａｒｓｄｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｌｉｎｃｏｌｎ’ｓ Ｉｎｎ， Ｓｕｔｔｏｎ， Ｓｕｒｒｅｙ）により好意的に贈与された、あるいはＳＶ４０オンコジーンの温度感受性変異体を発現する本質的に同じ構築物は、Ｐｈｉｌ Ｇａｉｌｌｉｍｏｒｅ教授， ＣＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＵＫにより好意的に贈与された）を、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とともに、０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように培地に加えた。ウイルスの力価を、０．０００２％の低形質導入効率を与えるように調整して、フラスコあたり平均２０個の不死化細胞コロニーを生成させ、各コロニーは単一の細胞に由来した。ウイルス添加の２時間後、培養培地を新鮮な培地で置き換えた。培養物を、３３℃（活性型のＳＶ４０−Ｔオンコジーン産物の許容温度）で維持した。形質導入の５日後、ジェネティシン（０．４ｍｇ／ｍｌ）をさらに１０日間培地に加え、レトロウイルスベクターを組み込まなかった細胞を根絶させた。

（上記細胞の分化）
形質導入後の１４〜２０日の間に、複製した細胞の独立したコロニーが確認され得た。コロニーを、他の複製コロニーから十分離れていることを基準として選択した。各コロニー中の細胞は１００〜１０００細胞に達した。これらを、リングクローニングによりつつき、そして７５ｃｍ^２のフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ， ＵＫ Ｌｔｄ）中でほぼコンフルエンスになるまで拡大した。これは、単一細胞からの約２２回分裂物に等しかった。その後、アリコートに分けたストックを凍結した。サンプルをまた、細胞の特徴付けのために、およびそれらが関節軟骨細胞特異的マーカーを発現する能力を有することを決定するために使用した。発現は、オンコジーンの非許容温度（３９℃）に細胞を曝すことによりもたらされた。クローンは、単一細胞拡大の日常的な方法により得られた。

（分化した関節軟骨細胞株の機能的特徴を示すための実験）
関節軟骨細胞の特異的マーカーは、ＩＩ型コラーゲン（８）を発現する能力である。従って、本発明者らの発明の細胞を、ＩＩ型コラーゲンの発現を示すために調査した。不死化ヒト軟骨細胞を、６週間のペレット培養（９、１０）後、オンコジーンの非許容温度である３９℃に曝した。図１は、３３℃の許容温度または３９℃の非許容温度のいずれかでインキュベートした６つのペレットの平均を示す。エラーバーは標準偏差を現す。図１は、３９℃の非許容温度でのＩＩ型コラーゲンの発現のアップレギュレーションを明らかに示す。このデータは、本発明者らの細胞株が、分化した機能的関節軟骨細胞を含むことを示す。

（細胞外石灰化）
図２Ａ〜Ｃおよび図３Ａ〜Ｃは、細胞外石灰化が本発明に従って細胞を用いて達成されることを示す。特に図２Ａ〜Ｃは、組織マトリックス中の石灰化を同定するための標準的な組織学的手順（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色、１１）を示す。影の領域は（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ陽性染色）は、これらの関節軟骨細胞により生成された石灰化マトリックスを表し、これは培養物中の軟骨細胞の染色されやすさまたは染色されにくさにより分けられている。図３Ａ〜Ｃは、肥大性軟骨細胞の期待される特徴のインビトロの発現を示唆する、これらの細胞において免疫細胞化学的に局在化されたＸ型コラーゲン（１２）の表示を含む。このデータは、本発明の細胞が、肥大性軟骨細胞に関係する特徴を示すために脱分化し得たことを示唆する傾向がある。

（ヒト関節軟骨細胞株の長命）
本発明の方法を用いて、驚くべきことに、本発明者らは、本発明者らのヒト関節軟骨細胞株が、うまく分化して関節軟骨細胞の特徴を備える機能的細胞を生成することを見い出した。細胞は生存し続け、そして２年間にわたって６０回を越える分裂を経て、様々なクローン由来の１０^１８個の細胞を生成する。細胞株は生存し続け、そしてさらにこの株の細胞は、分化細胞の組織型に特有の機能的な特徴を示し続ける。さらに本発明者らは、驚くべきことにカルシウムを鉱化する分化細胞を含む不死化ヒト関節軟骨細胞株を生成し得た。

（分化した肥大性の胎児由来軟骨細胞株の機能的特徴を示すための実験）
肥大性軟骨細胞の特異的マーカーは、Ｘ型コラーゲンを発現する能力である。従って本発明者らの発明の細胞を、Ｘ型コラーゲンの発現を示すために調査した。本発明者らの全ての胎児由来軟骨細胞は、この細胞マーカーを発現し、そしてさらに試験を行い、そしてこれらの細胞においては、Ｉ型コラーゲンを発現しなかったと結論した。これは、これらの細胞が骨始原細胞起源でなかったことを明らかに示す。

図４は、妊娠第７週〜第９週で長さが約６００μｍのヒト胎児に由来する大腿骨を示す。大腿骨を、どの初代細胞培養の場合もそうであるように、複製する細胞集団を外殖および拡大させるために、上記の培養培地中で１４日間培養した。しかし、この例では、細胞回収を助けるために酵素を用いての前処理は必要ではない。１４日間の細胞の拡大を、レトロウイルスの温度感受性オンコジーンの形質導入の前に行った。

（細胞外石灰化）
不死化した胎児由来の肥大性軟骨細胞もまた、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３に応答し、そしてアルカリホスファターゼ活性を高レベルで発現した（肥大性軟骨細胞様表現型の２つのさらなるマーカー）。細胞を、添加したβ−グリセロリン酸の非存在下、オンコジーンの非許容温度である３９℃で１０〜１４日間単層培養中に置いた場合、培養物は鉱化する。これは、温度感受性オンコジーンを用いたレトロウイルスの形質導入後の胎児大腿骨からクローン化された３つの軟骨細胞株が示すように、図５で明らかに見られ得る。それぞれの細胞株は、基底レベルのアルカリホスファターゼ活性およびいくらかのＸ型コラーゲン発現を有する。この細胞を１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の存在下、オンコジーンの非許容温度でプレートし、そしてインキュベートする場合（上段）、それぞれのクローンは、上記のようにＶｏｎ Ｋｏｓｓａ染色の標準的な組織学的手順により例示されるように、カルシウムを活発に鉱化する。１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の非存在下、オンコジーンの非許容温度でプレートされ、そしてインキュベートされる細胞（下段）は、カルシウムを活発には鉱化しない。

最後に、図６は、再度Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色を用いて、ヒト胎児細胞より誘導された軟骨細胞株の活発に鉱化する単層培養物を示す。影の部分は、発達し、そして培養皿の表面に付着する培養細胞を覆う鉱化されたマトリックスを表す。

従って、本発明者らは、成熟した成体組織、あるいは不死化した、より若いヒト組織のいずれかより由来する、カルシウムを鉱化する関節軟骨細胞株を生成し得ることを明白に立証した。従って、本発明者らの細胞株は、これらの組織によるカルシウムの鉱化に影響する薬剤の同定に用途を有する。本発明者らはまた、上記のように使用するため、および多数の適用に用いられる、生体物質の開発に使用するため、しかし特に関節置換に用いられる物質の開発に使用するためのヒト肥大性軟骨細胞株を提供し得ることも立証した。

図１は、ヒト関節軟骨細胞中におけるＩＩ型コラーゲン発現のアップレギュレーションを示す。 図２Ａは、組織マトリックス中の石灰化を同定するための標準的な組織学的手法（Ｖｏｎ Ｋａｓｓａ染色、１１）を用いてこれらの細胞により達成される細胞外石灰化を示す。 図２Ｂは、組織マトリックス中の石灰化を同定するための標準的な組織学的手法（Ｖｏｎ Ｋａｓｓａ染色、１１）を用いてこれらの細胞により達成される細胞外石灰化を示す。 図２Ｃは、組織マトリックス中の石灰化を同定するための標準的な組織学的手法（Ｖｏｎ Ｋａｓｓａ染色、１１）を用いてこれらの細胞により達成される細胞外石灰化を示す。 図３Ａは、これらの細胞内の免疫細胞化学的に局在化されたＸ型コラーゲン（１２）を示す。これは、肥大性軟骨細胞の予想される特徴的なインビトロ発現を示唆する。 図３Ｂは、これらの細胞内の免疫細胞化学的に局在化されたＸ型コラーゲン（１２）を示す。これは、肥大性軟骨細胞の予想される特徴的なインビトロ発現を示唆する。 図３Ｃは、これらの細胞内の免疫細胞化学的に局在化されたＸ型コラーゲン（１２）を示す。これは、肥大性軟骨細胞の予想される特徴的なインビトロ発現を示唆する。 図４は、１４日間培養された、ヒト胎児から誘導された大腿骨を示す。 図５は、１．２５（ＯＨ）２Ｄ３の存在下（上段）、または１．２５（ＯＨ）２Ｄ３の非存在下のいずれかで培養した胎児大腿骨由来の３つの軟骨細胞株クローンを示す。 図６は、ヒト胎児細胞より誘導された軟骨細胞株の活発に鉱化する単層培養を示す。

Claims (3)

1. 損傷組織の修復および／または置換に使用するための結合マトリックスを生成する方法であって、以下の工程：
   ａ）軟骨細胞株を提供する工程；
   ｂ）前記細胞株を、マトリックス増殖を促進する条件下で培養する工程；およびｃ）
   前記細胞、および／または前記マトリックス、および／またはその選択された部分を回収する工程
   を包含する、方法。
2. 前記損傷組織が骨である、請求項１に記載の方法。
3. 損傷組織の修復および／または置換のための方法であって、結合マトリックスを投与する工程を包含する、方法。

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