JP2005269921A

JP2005269921A - 細胞や組織等の試料の恒温振とうによる培養方法とその装置

Info

Publication number: JP2005269921A
Application number: JP2004084422A
Authority: JP
Inventors: Toshiharu Nishimura; 敏晴西村; Satoshi Tomita; 悟志富田
Original assignee: Taitec Corp
Current assignee: Taitec Corp
Priority date: 2004-03-23
Filing date: 2004-03-23
Publication date: 2005-10-06

Abstract

【課題】本発明の解決しようとする課題は、故障のない簡易な設備と必要最小限のガスにより安定したガス環境をつくり、このガス環境下において細胞や組織等を振とう培養することができるようにすることである。
【解決手段】本発明は培養すべき細胞や組織等を培地中に注入した１乃至複数個の三角フラスコ等の容器３を恒温振とう機１の振とう台２上に載上し、該各容器に振とう機の外部に設ける供給ユニット４より一定割合のガスを混和した大気を分岐管５の供給管路５ａを用いて直接供給し、且つ該容器３より排出すべき大気を該分岐管５の併行管路５ｂを用いて外部に放出するようにして、該振とう台２上の三角フラスコ等の容器３内のみをガス環境にして細胞や組織等の試料を恒温振とう培養するようにしたことを特徴とする動物系細胞試料の恒温振とうによる培養方法とその装置にある。
【選択図】図２

Description

本発明は細胞や組織等，詳しくは哺乳類や鳥類等の動物系のほか、植物系の培養細胞および組織を含む試料の恒温振とうによる培養方法とその装置に関するものである。

従来、哺乳類などの動物系の細胞は大腸菌等の微生物と違って温度変化等の外乱はもとより機械的ストレスに弱いと考えられており、その培養は倍着性の細胞を用いた静置培養が一般的手法となっている。また細胞はｐＨ（ペーハー；水素イオン濃度指数）の変化にも弱いので、動物由来の細胞を培養するときは、細胞自らが排出する老廃物による培地の酸性化をできるだけ緩やかにするために、炭酸ガス（ＣＯ₂）と相互作用して緩衝作用を発揮する成分を含む培地を作製し、炭酸ガス恒温庫（ＣＯ₂インキュベーター）の庫内を５〜１０％程度の炭酸ガスの混入した炭酸ガス気相として、この炭酸ガス緩衝系の環境下で開放形の培養容器（浅皿形など）を用いて静置培養を行っている（例えば特許文献１参照）。

一方、前述の炭酸ガス緩衝作用や細胞の呼吸代謝という観点から見れば、培養液を振とう撹拌する方が気液界面でのガス交換（通気；エアレーション）を促進することができるために細胞の生育にとって都合の良いことは確かである。加えて静置培養では培養液中の栄養成分や特定の処理（例えば遺伝子導入）のために培養液に添加する試薬または老廃物の分布に偏りが生ずるほか、接触による増殖阻止（容器の底に接着して増殖する細胞は、隣接する細胞と接すると増殖を停止する）等の要因が増殖や遺伝子導入等の効率を妨げているのではないかという見地から、動物系の細胞の培養も、特に浮遊性の細胞を用いて振とう撹拌する方がより培養に効果的であるという再認識が近年高まってきていて、ＣＯ₂インキュベーター内に通常の振とう機（シェーカー）を入れ、開放形の培養容器（浅皿形など）内の培地中に注入した細胞を振とう機の振とう台上に載せ入れて恒温振とう培養することが行われはじめている。ちなみに振とう機による振とう撹拌において細胞に与える機械的なストレスが問題になるという場合には、振とう速度の調節によってごく緩やかな撹拌とすることで対処することができるけれども、既存のプロペラ撹拌式タンク培養槽（ファーメンター）においては、機械的ストレスという以前に物理的な剪断力によって細胞を損傷してしまうおそれが大きいこととなる。
特開平５−２５２９４４号公報

しかしながら、ＣＯ₂インキュベーターの庫内を所定のＣＯ₂濃度にて維持することは、実際に必要とする炭酸ガスの量に較べてはるかに大量の炭酸ガスを必要として無駄が多く、ＣＯ₂インキュベーターの扉の開閉の都度にＣＯ₂濃度が減少するため、設定環境を迅速に調整し直すことが必要となる。またシェーカー等の機器を別途庫内に入れるときは、それらの機器の作動熱が庫内温度を上昇させて庫内の恒温を妨げる要因となって外乱に弱い細胞の培養に支障を生ずることになる。加えて、従来の静置培養法は、シャーレ等の浅皿形の容器に培地を５〜１０ｍｍ程度の高さまで注加して（容器の深さは２ｃｍ程度であり、そもそも大量の培地は注加できないほか、あまり培地量が多いと接着細胞を用いた静置培養では細胞の呼吸に悪影響を生じかねないため）、接着性の細胞を容器底に張り付かせて静置培養するという手法上、容器当たりの培養液量を必然的に少なくせざるを得ず、さらに用いる容器が蒸発を促進する開放形であることから、培養中の細胞試料を乾燥させないためにＣＯ₂インキュベーターの庫内に水張り等の手段による湿度の確保を必要とし、よってＣＯ₂インキュベーターの庫内は炭酸ガス環境と相俟って弱酸性の高湿度環境になってしまうこととなる。このような環境下にあってはシェーカー等の精密機器は故障する可能性が高い上、しかも密閉された庫内に入れてしまうために庫外から運転を自由にコントロールすることができないなどの課題も生じている。

本発明は、恒温振とう機の振とう台上に載上する１乃至複数個の三角フラスコ等の容器内に一定割合のＣＯ₂ガスなどを混入した大気を供給し、三角フラスコ等の容器内のみを所定のガス環境下にして細胞試料を恒温振とう培養するようにして、かかる課題を解決するようにしたのである。

本発明は以上のようにして、恒温振とう機の振とう台上に載上する三角フラスコ等の容器内に直接ガス混入の大気を供給して容器内のみをガス環境下にして細胞や組織等の試料を恒温振とう培養するようにしたので、従来のＣＯ₂インキュベーターなどが庫内全体をガス環境下に置くのと較べて、ガス使用量を格段に減らすことができるという効果を生ずる。よって大気へのＣＯ₂排出量も減少させることとなって環境保護も考慮したものとなっている。

三角フラスコ等の容器内のみを所望のガス環境とするので、従来方法における庫扉の開閉などによるガス環境の不安定を解消することができ、恒温振とう機の庫内環境を悪化させることもないので故障の発生を誘発することなしに振とう培養を行うことができるという効果を生ずる。

動物系の細胞試料などは容器内を浮遊振とうすることでエアレーションが良くなり、静置培養においてさけることができなかった栄養成分や老廃物の分布の偏りがなくなることによって、実験の結果、静置培養に比して増殖効率が約１０倍、細胞が産生した有用物質の量（濃度）もおよそ１０倍になるという優れた効果を生ずることとなった。

本発明は培養すべき細胞試料を培地中に注入した１乃至複数個の三角フラスコ等の容器を恒温振とう機の振とう台上に載上し、該各容器に振とう機の外部に設ける供給ユニットより一定割合のガスを混和した大気を分岐管等を用いて直接供給し、且つ該容器より排出すべき大気を該分岐管の併行管路を用いて外部に放出するようにして、該振とう台上のフラスコ等の容器内のみをガス環境にして細胞試料を恒温振とう培養するのである。

以下図面に基づいて、ＣＯ₂ガス環境を望む動物系細胞の培養例について実施例を説明する。

恒温振とう機１の振とう台２上に、培養すべき動物系の細胞試料を培地中に浮遊するように注入してなる培養液収容の１乃至複数個のフラスコ等の容器３を載上し、振とう機１の外部に設置するガスボンベ４ａとＣＯ₂濃度コントローラー４ｂとからなる供給ユニット４にて大気に５％程度のＣＯ₂を混入したガス混合大気を調整し、これを分岐管５の供給管路５ａを経て各容器３に直接供給し、各容器３内の排気を分岐管５に並設する排出用の併設管路５ｂにて外部に排出するようにしたのである。１ａは恒温振とう機１の透明な開閉扉である。

ＣＯ₂濃度コントローラー４ｂは図３に示すように、ガスボンベ４ａと接続する取入口４ｃ，電磁バルブ４ｄ，大気の取入口４ｅ，ガス濃度を検知するセンサー４ｆを備えたコントロールチャンバー４ｇと送出用のポンプ４ｈ，流量調節器４ｉおよび給出口４ｊより構成されている。６はノズル７ａ，７ｂ付のシリコン栓であり、８は各管路に設けた除菌と蒸発防止用を兼ねたフィルター、８ａは開閉栓である。各フィルターは汚損が早いのでこまめに新しいものに交換し、分岐管もエタノール洗浄を主体にして雑菌の付着を防止するようにする。濃度コントローラー４ｂの内部のコントロールチャンバーも４ｆ等も固定ネジを外してアルコール洗浄をするようにする。

三角フラスコ等の容器３内に所定の培地を注入し、細胞試料を浮遊するように入れて恒温振とう機１の振とう台２上に載せ、前運転により分岐管５などの各管路内よりゴミ等を捕集し清浄にしてから各容器３にシリコン栓６を嵌めてノズル７ａ，７ｂを供給および排出管路５ａ，５ｂに接続して供給ユニット４より所定割合のＣＯ₂ガスを混和した大気を直接各容器３内に供給し且つ排気して容器３内のみを所定のガス環境下にして恒温振とう培養を開始するのである。

三角フラスコ等の容器３に接続したガス供給ユニット４は、大気の取入口４ｅにおいてもエアフィルター８等によって外界と隔絶され、それ自体が恒温振とう培養機庫内から独立した閉鎖状態となっているので、容器３内のみを所望のガス環境とすることができる。要所にエアフィルター８を配置した密閉接続によって培養液の蒸発もほとんどなく、湿度の確保も不要であるため、従来のＣＯ₂インキュベーターにおける扉開閉によるガス環境の不安定さや湿気による雑菌混入（コンタミネ−ション）の懸念を解消することができ、培養環境を悪化させることがないので細胞への外的影響の心配もないこととなる。加えて恒温振とう機１の庫内は弱酸や高湿度への耐性を特別に考慮しなくとも機器の故障を誘発するおそれが全くないので、機器としての汎用性や機能の拡張性において優れたものとなっている。
また実験によって、本発明における振とう撹拌による機械的ストレスが細胞への致死的な損傷とはならないことが確認された。一方、植物系の細胞の培養においては、光合成のためのＣＯ₂ガスを本発明により最適な濃度で供給することによって効率化が期待できるものとなる。

以下、本発明により行った細胞培養の実験例について詳細に説明する。
用いた培養細胞は、ＣＨＯ細胞を無血清培地で培養し選定して得た浮遊系の細胞で、遺伝子導入により抗体を産生するようにしたものである。この培養細胞を、５００ml三角フラスコに市販のＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（米国・ＪＲＨバイオサイエンス社製）２００mlを入れた中に注下して、ＣＯ₂濃度を５％に調整した大気を三角フラスコ１本あたり約１６.７ml/minで供給しながら３７℃、１００r/minの条件で振とう培養を行った。
計１２日間培養し、３、５、７、９、１２日目に生細胞数および産生される抗体量を測定した。
細胞数はトリハロンブルー染色による計測法、抗体量測定はＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）法による。なお、同様に調製した培養液を振とうせずに静置したものも用意し、振とうした場合との比較も行った。
結果、本発明による培養は静置培養に較べて生細胞数、つまり増殖効率が約１０倍（表１）、産生された抗体量も約１０倍（表２）という優れた結果を得ることができるものであった。
これは、細胞試料は容器３内を浮遊振とうすることで細胞試料にとって重要なエアレーションが効率化し、栄養成分との接触機会が増大し、また静置培養において懸念される栄養成分や老廃物の分布の偏りといった負の要素が軽減したことによるものと考えられる。
なお本実験は、広島大学大学院生物圏科学研究科分子生命開発学講座免疫生物学研究室の松田治男教授、古澤修一助教授、長浜広貴大学院生により行われたものである。

本発明は、供給するガスの種類を選択することによって、ＣＯ₂環境を要する動物系細胞の振とう培養のほか、酸素ガスや窒素ガス、その他のガス環境を望む細胞や組織，微生物などの振とう培養にも応用することができるものである。

装置の１実施例を示す斜視図同、説明図濃度コントローラーの説明図

符号の説明

１は恒温振とう機
１ａは開閉扉
２は振とう台
３は三角フラスコ等の容器
４は供給ユニット
４ａはガスボンベ
４ｂはＣＯ₂濃度コントローラー
４ｃは取入口
４ｄは電磁バルブ
４ｅは大気の取入口
４ｆはガス濃度のセンサー
４ｇはコントロールチャンバー
４ｈはポンプ
４ｉは流量調節器
４ｊは給出口
５は分岐管
５ａは供給管路
５ｂは併設管路
６はシリコン栓
７ａ，７ｂはノズル
８はフィルター
８ａは開閉栓

Claims

培養すべき細胞や組織等の試料を培地中に浮遊するように注入した１乃至複数個の三角フラスコ等の容器を恒温振とう機の振とう台上に載上し、該各容器に振とう機の外部に設ける供給ユニットより一定割合のガスを混和した大気を分岐管等を用いて直接供給し、且つ該容器より排出すべき大気を該分岐管の併行管路を用いて外部に放出するようにして、該振とう台上の三角フラスコ等の容器内のみをガス環境にして細胞や組織等の試料を恒温振とう培養するようにしたことを特徴とする細胞や組織等の試料の恒温振とうによる培養方法。
細胞や組織等の試料を培地中に浮遊するように注入する１乃至複数個の三角フラスコ等の容器と、該容器を載上する振とう台を有す恒温振とう機と、一定割合のガスを混和した大気を該各容器に供給する供給ユニットと、供給用の分岐管に排気用の併行管路を設けたことを特徴とする細胞や組織等の試料の恒温振とうによる培養装置。