JP2005261317A - Dimethylarginine dimethylaminohydrolase, its gene, recombinant dna and method for producing dimethylarginine dimethylaminohydrolase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子、組み換え体DNA及びジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法に関する。 The present invention relates to dimethylarginine dimethylaminohydrolase, its gene, recombinant DNA, and a method for producing dimethylarginine dimethylaminohydrolase.
非対称ジメチルアルギニン(以下、ADMAと略称する。)は、ヒト生体内において、NO合成酵素の内因性阻害剤として知られており、生体内でのNOの生成量をコントロールするもののひとつである可能性が示唆されている(非特許文献1参照)。NOの役割としては、血管収縮弛緩コントロール、マクロファージより産生されたNOによる生体防御、神経伝達物質としての利用などが現在知られている。 Asymmetric dimethylarginine (hereinafter abbreviated as ADMA) is known as an endogenous inhibitor of NO synthase in the human body, and may be one of the controls for the amount of NO produced in the body. Has been suggested (see Non-Patent Document 1). As the role of NO, vasoconstriction / relaxation control, biological defense by NO produced from macrophages, utilization as a neurotransmitter, etc. are currently known.
近年、NOと関連する疾患についての研究が進み、動脈硬化、高血圧、妊娠中毒症等においてADMAとの関連性が知られるようになった(非特許文献2及び非特許文献3参照)。すなわち、ADMA量を測定することにより、上記動脈硬化等の疾患の診断が可能であることが示唆されている。 In recent years, research on diseases related to NO has progressed, and the relationship with ADMA has been known in arteriosclerosis, hypertension, pregnancy toxemia and the like (see Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). That is, it has been suggested that the above-mentioned diseases such as arteriosclerosis can be diagnosed by measuring the amount of ADMA.
現在ADMAは、HPLCを用いる方法(非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8及び非特許文献9参照)あるいはELISA(特許文献1参照)により測定されている。更にジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ(以下、DDAHと略称する。)を用いた酵素的測定法も開示されている(特許文献2参照)。 Currently, ADMA is measured by a method using HPLC (see Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6, Non-Patent Document 7, Non-Patent Document 8, and Non-Patent Document 9) or ELISA (see Patent Document 1). Has been. Furthermore, an enzymatic measurement method using dimethylarginine dimethylaminohydrolase (hereinafter abbreviated as DDAH) is also disclosed (see Patent Document 2).
この測定法は、生体中ADMAをDDAHによりシトルリンに変換し、シトルリン量を測定する方法である。DDAHは、小川等により初めてラットより単離されており(非特許文献10参照)、ヒト由来遺伝子(非特許文献11及び非特許文献12参照)、ラット由来遺伝子(非特許文献13参照)等が知られている。しかしながら、生体組織からDDAHを大量に抽出精製することは困難であり、これまでに知られている組み換え型sDDAHは、ヒスチジンタグ、GSTタグ等を付加しなければ大腸菌で発現できず、発現量もわずかであることが報告されている。 This measurement method is a method in which ADMA in a living body is converted to citrulline by DDAH and the amount of citrulline is measured. DDAH has been isolated from rats for the first time by Ogawa et al. (See Non-Patent Document 10), human-derived genes (see Non-Patent Documents 11 and 12), rat-derived genes (see Non-Patent Document 13), etc. Are known. However, it is difficult to extract and purify DDAH from living tissues in large quantities. Recombinant sDDAH known so far cannot be expressed in E. coli without adding a histidine tag, GST tag, etc. Slightly reported.
微生物由来遺伝子については、組み換え型DDAHについて報告がされている(非特許文献14及び非特許文献15参照)。 As for microorganism-derived genes, recombinant DDAH has been reported (see Non-Patent Document 14 and Non-Patent Document 15).
しかし、微生物培養物から天然型酵素を精製した例は報告されていない。組み換え型DDAHは、ヒスチジンタグを付加した形で大腸菌で発現することが報告されている。しかし、詳細な酵素的性質は明らかになっていない。また、ADMAに対する比活性が報告されている微生物由来酵素の中で一番強いと思われるPseudomonas aeruginosa由来酵素はわずかではあるがアルギニンデイミナーゼ活性を有することから高感度ADMA測定キットに用いる場合、充分とはいえない。 However, no example of purifying a natural enzyme from a microbial culture has been reported. Recombinant DDAH has been reported to be expressed in E. coli with a histidine tag added. However, detailed enzymatic properties are not clear. In addition, Pseudomonas aeruginosa-derived enzyme, which seems to be the strongest among the microorganism-derived enzymes that have reported specific activity against ADMA, has a small amount of arginine deiminase activity, so it is sufficient when used in a highly sensitive ADMA measurement kit. That's not true.
更に、タグを付加したDDAHを精製するには、タグをトラップする専用の樹脂を用いることが有用であり、精製後、タグを専用のプロテアーゼで処理してやる必要がある場合が多い。 Furthermore, in order to purify DDAH to which a tag is added, it is useful to use a dedicated resin for trapping the tag, and it is often necessary to treat the tag with a dedicated protease after purification.
このように、従来知られているDDAHは、発現量が少ないこと、あるいは、専用の樹脂もしくはプロテアーゼを用いるという点から、大量精製には向かず、測定キットの調製上極めて困難な点があった。 As described above, DDAH known in the art is not suitable for mass purification because it has a low expression level or uses a dedicated resin or protease, and has a very difficult point in preparing a measurement kit. .
本発明が解決しようとする課題は、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子、組み換え体DNA及びジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法を提供することにある。 The problem to be solved by the present invention is to provide dimethylarginine dimethylaminohydrolase, its gene, recombinant DNA and a method for producing dimethylarginine dimethylaminohydrolase.
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、機能未知で、Sinorhizobium meliloti由来の遺伝子配列が、新規なジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていること、また、このジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子にタグを付加することなく、極めて効率よく該遺伝子を発現させることができること等を見出し、本発明を完成した。 Therefore, as a result of intensive studies for solving the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have unknown functions, and the gene sequence derived from Sinorhizobium meliloti encodes a protein having a novel dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity. Further, the present inventors have found that the dimethylarginine dimethylaminohydrolase gene can be expressed very efficiently without adding a tag, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
(1)以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
(a)作用:非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
(b)基質特異性:アルギニンには作用しない。
(2)以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
(a)作用:非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
(b)基質特異性:アルギニンには作用しない。
(c)至適pH:7.0〜10.0
(3)以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
(a)作用:非対称ジメチルアルギニンに作用し、シトルリン及びジメチルアミンを生成する反応を触媒する。
(b)基質特異性:アルギニンには作用しない。
(c)至適pH:7.0〜10.0
(d)安定pH範囲:pH4.0〜10.0
(e)作用適温の範囲:30〜40℃
(f)熱安定性:40℃、10分の熱処理で70%以上の活性が残存する。
(g)分子量:約31,000(SDS−PAGE)
(4)以下の(a)、(b)又は(c)のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
(5) 以下の(a)、(b)又は(c)のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼをコードするジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
(6) 項目(5)記載の遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。
(7)項目(6)記載の組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
(8)項目(7)記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼを採取することを特徴とするジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法。
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) Dimethylarginine dimethylaminohydrolase having the following physicochemical properties:
(A) Action: Acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces dimethylamine and citrulline.
(B) Substrate specificity: Does not act on arginine.
(2) Dimethylarginine dimethylaminohydrolase having the following physicochemical properties:
(A) Action: Acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces dimethylamine and citrulline.
(B) Substrate specificity: Does not act on arginine.
(C) Optimum pH: 7.0 to 10.0
(3) Dimethylarginine dimethylaminohydrolase having the following physicochemical properties:
(A) Action: Acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces citrulline and dimethylamine.
(B) Substrate specificity: Does not act on arginine.
(C) Optimum pH: 7.0 to 10.0
(D) Stable pH range: pH 4.0-10.0
(E) Temperature range suitable for action: 30 to 40 ° C
(F) Thermal stability: 70% or more activity remains after heat treatment at 40 ° C. for 10 minutes.
(G) Molecular weight: about 31,000 (SDS-PAGE)
(4) The following dimethylarginine dimethylaminohydrolase (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A protein having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity (c) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity (5) A dimethylarginine dimethylaminohydrolase gene encoding the dimethylarginine dimethylaminohydrolase of (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A protein having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity (c) a protein having an amino acid sequence of 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity (6) Item ( 5) Recombinant DNA characterized by inserting the gene described in vector DNA.
(7) A transformant or transductant containing the recombinant DNA according to item (6).
(8) A method for producing dimethylarginine dimethylaminohydrolase, comprising culturing the transformant or transductant according to item (7) in a medium and collecting dimethylarginine dimethylaminohydrolase from the culture.
本発明によれば、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子、組み換え体DNA及びジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法が提供され、診断用酵素として測定用キットに容易に利用されると共に、このジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子にタグを付加することなく安価に、かつ、大量に供給されるため産業上極めて有用である。 According to the present invention, a method for producing dimethylarginine dimethylaminohydrolase, its gene, recombinant DNA, and dimethylarginine dimethylaminohydrolase is provided, which can be easily used as a diagnostic enzyme in a measurement kit. The aminohydrolase gene is extremely useful industrially because it is supplied at low cost and in large quantities without adding a tag.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明のDDAHとは、非対称ジメチルアルギニンに作用し、シトルリン及びジメチルアミンを生成する反応を触媒する酵素であり、アルギニンには作用しない酵素である。この作用を有する酵素であれば、如何なる酵素でも本発明DDAHに含まれる。 The DDAH of the present invention is an enzyme that acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces citrulline and dimethylamine, and does not act on arginine. Any enzyme having this action is included in the DDAH of the present invention.
ジメチルアルギニン + H2O → ジメチルアミン+シトルリン Dimethylarginine + H 2 O → Dimethylamine + citrulline
また、DDAHの一形態として、例えば、上記反応を触媒する作用を有するアルギニンには作用しないDDAH、上記反応を触媒する作用を有し、かつpH7.0〜10.0で作用するDDAH、上記反応を触媒する作用を有し、かつpH7.0〜10.0で作用し、アルギニンに作用しないDDAH等が挙げられる。
更には、上記反応を触媒する作用を有すると同時に、以下の(a)〜(e)に記載の理化学的性質を夫々もしくはそれらを適宜併せて有するDDAH等も本発明DDAHとして挙げられる。
(a)至適pH:pH7.0〜10.0
例えば、緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.0〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0〜8.5)、200mM グリシン緩衝液(pH8.0〜11.0)を用い、夫々のpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行ない、至適pHを求める。例えば、至適pHとしてpH7.0〜10.0、好ましくはpH9.0〜10.0の理化学的性質を有する本発明DDAH等が挙げられる。
(b)作用適温の範囲:30〜40℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行ない作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として20〜50℃、好ましくは30〜40℃の理化学的性質を有する本発明DDAH等が挙げられる。
(c)熱安定性:40℃、10分間の熱処理で70%以上の活性が残存する。
例えば、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)を用いて、40℃で10分間処理した後、本酵素の残存活性を測定する。例えば、上記処理条件下で、50%以上、好ましくは70%以上活性が残存している本発明DDAH等が挙げられる。
(d)安定pHの範囲:pH4.0〜10.0
例えば、緩衝液として、200mM 酢酸緩衝液(pH3.0〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜8.5)、200mM グリシン緩衝液(pH8.0〜12.0)を用い、夫々のpHにおいて30℃で10分間処理した後、本発明DDAHの残存活性を測定する。例えば、安定pH範囲として、pH4.0〜10.0、好ましくはpH8.0〜10.0の理化学的性質を有する本発明DDAH等が挙げられる。
(e)分子量:約31,000(SDS−PAGE)
例えば、マルチゲル4/20(第一化学薬品社製)を用いるSDS−PAGE法により分子量を求める。例えば、分子量として25,000〜60,000、好ましくは、30,000〜40,000(SDS−PAGE)の分子量を有する本発明DDAH等が挙げられる。
Further, as one form of DDAH, for example, DDAH that does not act on arginine that has the action of catalyzing the above reaction, DDAH that has the action of catalyzing the above reaction and acts at pH 7.0 to 10.0, and the above reaction And DDAH, which has an action of catalyzing NO, and acts at pH 7.0 to 10.0 and does not act on arginine.
Furthermore, DDAH etc. which have the effect | action which catalyzes the said reaction, and also have the physicochemical property as described in the following (a)-(e) or combined those suitably are also mentioned as this invention DDAH.
(A) Optimal pH: pH 7.0 to 10.0
For example, 200 mM acetate buffer (pH 4.0 to 6.0), 200 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0 to 8.5), and 200 mM glycine buffer (pH 8.0 to 11.0) are used as buffers. At each pH, an enzyme reaction is performed at a temperature of 37 ° C. to obtain an optimum pH. For example, the DDAH of the present invention having physicochemical properties of pH 7.0 to 10.0, preferably pH 9.0 to 10.0 as the optimum pH.
(B) Suitable temperature range: 30-40 ° C
For example, using a reaction solution having the same composition as the reaction solution in the activity measurement method described later, the activity of the enzyme is measured at various temperatures to determine the optimum temperature range of action. For example, the DDAH of the present invention having a physicochemical property of 20 to 50 ° C., preferably 30 to 40 ° C., as the temperature range of action.
(C) Thermal stability: 70% or more activity remains after heat treatment at 40 ° C. for 10 minutes.
For example, after treatment with 40 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) at 40 ° C. for 10 minutes, the residual activity of the enzyme is measured. For example, the DDAH of the present invention in which the activity remains at 50% or more, preferably 70% or more under the above treatment conditions.
(D) Stable pH range: pH 4.0-10.0
For example, 200 mM acetate buffer (pH 3.0 to 6.0), 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5 to 8.5), and 200 mM glycine buffer (pH 8.0 to 12.0) are used as buffers. Used, after treatment at 30 ° C. for 10 minutes at each pH, the residual activity of the DDAH of the present invention is measured. Examples of the stable pH range include the present invention DDAH having physicochemical properties of pH 4.0 to 10.0, preferably pH 8.0 to 10.0.
(E) Molecular weight: about 31,000 (SDS-PAGE)
For example, the molecular weight is determined by the SDS-PAGE method using Multigel 4/20 (Daiichi Chemicals Co., Ltd.). For example, the DDAH of the present invention having a molecular weight of 25,000 to 60,000, preferably 30,000 to 40,000 (SDS-PAGE).
本発明DDAHの酵素活性の測定方法としては、トリチウムラベルしたADMAを用いる方法、あるいは、酵素の反応により生成するシトルリンを測定する方法が主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、シトルリンを測定する方法について示す。以下、本発明DDAHの活性測定には、ことわりのない限り、ADMAを基質として用いる。なお、酵素力価は、ADMAを基質として測定したとき、1分間に1μmolのシトルリンを生成する酵素量を1Uと定義する。 Examples of the method for measuring the enzyme activity of the DDAH of the present invention include a method using tritium-labeled ADMA or a method for measuring citrulline produced by the enzyme reaction. Hereinafter, as an example, a method for measuring citrulline will be described. Hereinafter, ADMA is used as a substrate for the measurement of the activity of the DDAH of the present invention unless otherwise specified. The enzyme titer is defined as 1 U for the amount of enzyme that produces 1 μmol of citrulline per minute when measured using ADMA as a substrate.
A.試薬の調製
(1)試薬1:発色液A
500mgのアンチピリン、278mgの硫酸鉄を50%硫酸に溶解し、100mlに定容する。
(2)試薬2:発色液B
800mgのジアセチルモノオキシムを5%酢酸に溶解し、100mlに定容する。
(3)試薬3:基質溶液(10mM;終濃度 1mM)
非対称ジメチルアルギニン25mgをイオン交換水に溶解して9.1mlに定容する。対称ジメチルアルギニン又はL−アルギニンを基質として用いるときは夫々、25mg、16mgをイオン交換水に溶解して、9.1mlに定容した溶液を用いる。
(4)試薬4:200mMリン酸カリウムバッファー(pH8.0)
(5)試薬5:混合発色液
使用直前に試薬1及び試薬2を等量混合する。
A. Preparation of reagents (1) Reagent 1: Color developing solution A
500 mg of antipyrine, 278 mg of iron sulfate are dissolved in 50% sulfuric acid and made up to a volume of 100 ml.
(2) Reagent 2: Color developing solution B
Dissolve 800 mg of diacetyl monooxime in 5% acetic acid and make up to 100 ml.
(3) Reagent 3: Substrate solution (10 mM; final concentration 1 mM)
Dissolve 25 mg of asymmetric dimethylarginine in ion-exchanged water to a constant volume of 9.1 ml. When symmetric dimethylarginine or L-arginine is used as a substrate, 25 mg and 16 mg are dissolved in ion-exchanged water and a solution having a constant volume of 9.1 ml is used.
(4) Reagent 4: 200 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0)
(5) Reagent 5: Mixed color developer Reagents 1 and 2 are mixed in equal amounts immediately before use.
B.測定法
0.25mlの試薬4及び0.2mlの酵素液を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後0.05mlの試薬3を加えて充分混合した後、37℃で20分間インキュベートする。0.25mlの試薬5を添加し、よく攪拌した後、85℃で40分反応させる。放冷後、分光光度計で466nmにおける吸光度を測定する。なお、対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これを予め作製しておいたシトルリンを試薬3の代わりに、又酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、37℃、1分間当たりに生成されるシトルリンのマイクロモルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。アルギニンに作用するか否かを測定するときは、非対称ジメチルアルギニンの代わりにL−アルギニンを基質として用いた試薬3(基質溶液)を用いることにより、上記と同様の操作で測定することができる。
B. Measurement method Mix 0.25 ml of reagent 4 and 0.2 ml of enzyme solution, and preheat at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 0.05 ml of
このように本発明DDAH等は、非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する、前式に示した反応を触媒するDDAHであり、例えば、前記作用を有し、前述した種々の理化学的性質を夫々もしくは適宜組み合わせて、併せ持つ本発明DDAH等も挙げることができる。そしてこれらの本発明DDAHは、生体材料あるいは試料中の非対称ジメチルアルギニンに効率よく作用するため、非対称ジメチルアルギニン測定用酵素として有効に用いられる。更に、タグを付加することなく組み換え体で充分に生産でき、アルギニンに作用しない本発明酵素は、臨床診断用酵素として利用する上で、特に好ましい本発明DDAHとして挙げられる。 Thus, the DDAH of the present invention is a DDAH that acts on asymmetric dimethylarginine to produce dimethylamine and citrulline and catalyzes the reaction shown in the previous formula. The DDAH of the present invention, which has a combination of specific properties or appropriate combinations, can also be mentioned. Since these DDAHs of the present invention efficiently act on asymmetric dimethylarginine in biomaterials or samples, they are effectively used as an enzyme for measuring asymmetric dimethylarginine. Furthermore, the enzyme of the present invention that can be sufficiently produced as a recombinant without adding a tag and does not act on arginine is particularly preferred as the present invention DDAH when used as a clinical diagnostic enzyme.
本発明DDAH等は、微生物、動物、植物等起源の酵素を探索して、自然界より取得することができる。例えば、本発明DDAHを生産する能力を有する微生物を探索する場合、非対称ジメチルアルギニン等の酵素生産誘導物質を加えた培地で微生物を培養し、得られた微生物菌体を破砕し、非対称ジメチルアルギニンを基質として用い、DDAH活性を調べることにより本発明DDAH生産能を有する微生物を取得できる。ここで用いる微生物は、土壌から新たに分離してもよく、更には、微生物保存機関等より入手した微生物を用いることもできる。更に、現在までに知られているDDAH遺伝子配列により相同性検索を行ない、機能未知の遺伝子配列情報を入手し、クローニングしてもよい。 The DDAH of the present invention can be obtained from nature by searching for enzymes originating from microorganisms, animals, plants and the like. For example, when searching for a microorganism having the ability to produce the DDAH of the present invention, the microorganism is cultured in a medium to which an enzyme production inducer such as asymmetric dimethylarginine is added, the resulting microbial cell is disrupted, and the asymmetric dimethylarginine is obtained. The microorganism having the ability to produce the DDAH of the present invention can be obtained by examining the DDAH activity as a substrate. The microorganism used here may be newly separated from the soil, and further, a microorganism obtained from a microorganism storage organization or the like may be used. Furthermore, homology search may be performed using DDAH gene sequences known so far, and information on gene sequences with unknown functions may be obtained and cloned.
更に、本発明DDAHとして、遺伝子工学的技術あるいは変異処理等の方法により、天然型の本発明DDAHを改変して得られる本発明DDAHも挙げられる。 Further, the DDAH of the present invention also includes the DDAH of the present invention obtained by modifying the natural DDAH of the present invention by genetic engineering techniques or methods such as mutation treatment.
改変する方法としては、例えば、上記DDAHを生産する生物に、紫外線、X線、放射線等を照射したり、もしくはエチルメタンサルフォネート、N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の変異誘発剤を接触させることにより、改変された本発明DDAHを生産する微生物を得、得られた微生物から本発明DDAHを得る方法等が挙げられる。一般的には、遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするDDAH等をコードする遺伝子を改変することにより、本発明DDAHを得ることもできる。 Examples of the modification method include irradiating the organism producing DDAH with ultraviolet rays, X-rays, radiation, etc., or ethyl methanesulfonate, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, Examples include a method of obtaining a modified microorganism of the present invention DDAH by contacting a mutagen such as nitric acid, and obtaining the present invention DDAH from the obtained microorganism. In general, the DDAH of the present invention can be obtained by modifying a gene encoding DDAH or the like having different properties by using genetic engineering techniques.
更に、本発明DDAHとして、例えば、(a)、(b)又は(c)等の本発明DDAH等が挙げられる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むDDAH。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むDDAH。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むDDAH。
Furthermore, as this invention DDAH, this invention DDAH etc., such as (a), (b) or (c), are mentioned, for example.
(A) DDAH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(B) DDAH containing an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(C) DDAH containing an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
ここで、「1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された」とは、例えば、1〜20個、好ましくは1〜10個、更に好ましくは1〜5個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたことを意味する。 Here, “from 1 to several amino acids are deleted, substituted and / or added” means, for example, an arbitrary number of 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5. Is deleted, substituted and / or added.
また、「80%以上の相同性を示す」とは、配列番号1又は3で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であれば特に制限がなく、例えば80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上である。 “Showing 80% or more homology” is not particularly limited as long as the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 is 80% or more, for example, 80% or more, preferably 90%. % Or more, most preferably 95% or more.
上記本発明DDAHとして、例えば、シノリゾビウム メリロッティ ATCC51124 (Sinorhizobium meliloti ATCC51124)の染色体DNA由来の天然型DDAH遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られるDDAHが挙げられる。更に、自然界より取得された種々起源のDDAH等からも得られる。 Examples of the DDAH of the present invention include DDAH obtained by cloning a natural DDAH gene derived from chromosomal DNA of Sinorhizobium meliloti ATCC 51124, introducing it into an appropriate vector host system, and expressing it. . Further, it can be obtained from various sources of DDAH obtained from the natural world.
次に、本発明遺伝子の取得法について説明する。
本発明遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、現在までに知られているDDAH遺伝子配列を公開されているデータベースを用いて相同性検索を行ない、相同性の高いホモログをピックアップしてくる。得られたホモログ遺伝子情報より構造遺伝子を増幅できるようプライマーを設計する。前述した本発明DDAHホモログを有する微生物菌体あるいは種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出する。上記構造遺伝子を増幅できるプライマーを用いて、染色体DNA又はmRNAを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)あるいは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により、目的の遺伝子DNAを増幅させ本発明遺伝子DNAを得ることができる。例えば、シノリゾビウム メリロティ ATCC51124 (Sinorhizobium meliloti ATCC51124)の本発明遺伝子を以下のようにして得ることができる。
Next, a method for obtaining the gene of the present invention will be described.
In order to obtain the gene of the present invention, a commonly used gene cloning method is used. For example, a homology search is performed using a publicly available database of DDAH gene sequences known so far, and homologs with high homology are picked up. Primers are designed so that structural genes can be amplified from the obtained homologous gene information. Chromosomal DNA or mRNA is extracted from the microbial cells having the DDAH homolog of the present invention or various cells by a conventional method, for example, the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Using the primer capable of amplifying the above structural gene, the gene DNA of the present invention is amplified by polymerase chain reaction (PCR method) or reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using chromosomal DNA or mRNA as a template. Can be obtained. For example, the gene of the present invention of Sinorhizobium meliloti ATCC 51124 can be obtained as follows.
先ず、上記微生物等を培養し、得られた菌体を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢等を用いて物理的に磨砕することにより、細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から、市販のDNA抽出キット等を用いて、通常の方法により染色体DNAを抽出する。本発明DDAHホモログの遺伝子配列から構造遺伝子を増幅できるPCRに用いるプライマーを合成する。これらのプライマーと上記の得られた染色体DNAを鋳型として、PCRを行ない、本発明DDAHをコードするDNA断片を得る。増幅されたDNAは、通常の方法に準じてクローニングできる。この増幅されたDNAを適当なベクターに挿入して組み換え体DNAを得る。クローニングには、例えば、TA Cloning Kit (Invitrogen 社)等の市販のキットあるいはベクターとしては、pUC119(寶酒造社製)、pBR322(寶酒造社製)、pMAL−C2(NEW England Labs 社製)、pBluescript I I SK+(Stratagene社製)、pKK223-3(アマシャム・バイオテク社)等のプラスミドベクターDNAあるいはλENBL3(Stratagene社製)、λDASH I I (フナコシ社製)等のバクテリオファージベクターDNA等を用いることができる。 First, after culturing the above-mentioned microorganisms, the obtained cells are frozen in liquid nitrogen, and then physically ground using a mortar or the like to obtain a fine powdery cell piece. Chromosomal DNA is extracted from the piece by a usual method using a commercially available DNA extraction kit or the like. Primers used in PCR capable of amplifying a structural gene from the gene sequence of the DDAH homolog of the present invention are synthesized. PCR is performed using these primers and the obtained chromosomal DNA as a template to obtain a DNA fragment encoding the DDAH of the present invention. Amplified DNA can be cloned according to a conventional method. The amplified DNA is inserted into an appropriate vector to obtain recombinant DNA. For cloning, for example, commercially available kits or vectors such as TA Cloning Kit (Invitrogen) include pUC119 (manufactured by Sakai Shuzo), pBR322 (manufactured by Sakai Shuzo), pMAL-C2 (manufactured by NEW England Labs), pBluescript II. Plasmid vector DNA such as SK + (Stratagene), pKK223-3 (Amersham Biotech), or bacteriophage vector DNA such as λENBL3 (Stratagene), λDASH II (Funakoshi) can be used.
このようにして得られた組み換え体DNAを用いて、例えば、大腸菌K12、好ましくは大腸菌JM109、DH5α(共に東洋紡社製)、XL1−Blue〔フナコシ(株)製〕等を形質転換又は形質導入し、組み換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体を得ることができる。形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法(Methods in Enzymology,68,326-331,1979)により行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法 (Methods in Enzymology,68,299-309,1979)により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌のほか、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞等使用できる。 Using the recombinant DNA thus obtained, for example, E. coli K12, preferably E. coli JM109, DH5α (both manufactured by Toyobo Co., Ltd.), XL1-Blue [manufactured by Funakoshi Co., Ltd.], etc. are transformed or transduced. A transformant or transductant containing recombinant DNA can be obtained. Transformation can be performed, for example, by the method of D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326-331, 1979). Transduction can be performed, for example, by the method of B. Hohn (Methods in Enzymology, 68, 299-309, 1979). As host cells, in addition to E. coli, other bacteria, yeasts, filamentous fungi, actinomycetes and other microorganisms or animal cells can be used as appropriate.
上記増幅されたDNAの全塩基配列は、例えば、LI-COR MODEL 4200L シークエンサー(LI-COR社製)、370A DNAシークエンス・システム(パーキンエルマー社製)等を用いて、解析することができる。得られた本発明遺伝子の解析により、翻訳されるポリペプチド、すなわち、本発明DDAHのアミノ酸配列が確認される。 The entire base sequence of the amplified DNA can be analyzed using, for example, a LI-COR MODEL 4200L sequencer (manufactured by LI-COR), a 370A DNA sequence system (manufactured by PerkinElmer), or the like. Analysis of the obtained gene of the present invention confirms the translated polypeptide, that is, the amino acid sequence of the present DDAH.
本発明遺伝子の一例として、配列番号2で表される塩基配列からなるDNAを含む遺伝子等が挙げられる。配列番号2で表される塩基配列からなるDNAを含むプラスミドpT7sDDAHは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−19735として寄託されている。 An example of the gene of the present invention includes a gene containing DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Plasmid pT7sDDAH containing DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been deposited as FERM P-19735 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST).
更に、上記本発明遺伝子を改変することにより、種々の改変された本発明DDAHを得ることができる。 Further, various modified DDAHs of the present invention can be obtained by modifying the gene of the present invention.
上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができ、例えば、前記の組み換え体DNAに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤を接触させる方法、又はPCR法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組み換え体DNAを選択的に開裂し、次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組み換え体DNAを脱塩カラム、QIAGEN(キアゲン社製)等を用いて精製し、種々の組み換え体DNAを得ることができる。 As a method for modifying the gene, any known method can be used, for example, a method in which the recombinant DNA is contacted with a chemical mutagen such as hydroxyamine or nitrous acid, or a random method using a PCR method. A point mutation method such as conversion to a site, a site-directed mutagenesis method that is a well-known technique for generating a site-specific substitution or deletion mutation using a commercially available kit, and selectively cleaving this recombinant DNA Then, a method of removing or adding selected oligonucleotides and linking them, that is, an oligonucleotide mutagenesis method and the like can be mentioned. Next, the recombinant DNA after the treatment can be purified using a desalting column, QIAGEN (Qiagen) or the like, and various recombinant DNAs can be obtained.
これらの改変により、例えば、配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長又はそのうちの15塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつDDAH活性を有するタンパク質をコードするDNAあるいは配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長又はそのうちの15塩基以上の部分と80%以上の相同性を示し、かつDDAH活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる本発明遺伝子が得られる。 By these modifications, for example, it hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the full length of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a portion of 15 or more bases thereof, and A DNA encoding a protein having DDAH activity or a full-length DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a portion having 15 bases or more of which has a homology of 80% or more and encodes a protein having DDAH activity The gene of the present invention comprising the DNA to be obtained is obtained.
更に、本発明遺伝子を改変することにより、例えば、配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつDDAH活性を有するタンパク質あるいは配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつDDAH活性を有するタンパク質等の本発明DDAHがえられる。 Furthermore, by modifying the gene of the present invention, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and / or added, and has DDAH activity. The DDAH of the present invention, such as a protein having a DDAH activity, comprising a protein having the amino acid sequence having 80% or more homology with the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the like.
次に、本発明DDAH等の製造法について述べる。
本発明DDAH遺伝子を含む形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物より本発明DDAH等を、通常用いられている種々の蛋白質分離方法を用いて、回収することにより製造することができる。一例として、本発明DDAH遺伝子を含む形質転換体又は形質導入体を用いる以下の方法が、具体的な製造方法として採用できる。先ず、本発明DDAHを生産する形質転換体又は形質導入体(以下「組み換え菌」と総称する)を培養する。この場合、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。又、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等1種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第2鉄、硫酸第2鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、更に、必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。酵素生産誘導基質として、プロモーターに適した誘導基質、例えば、IPTG等を適宜添加するのも生産量を向上させるのに有効である。
Next, a method for producing the DDAH etc. of the present invention will be described.
A transformant or transductant containing the DDAH gene of the present invention is cultured in a medium, and the present DDAH or the like is recovered from the culture by using various commonly used protein separation methods. it can. As an example, the following method using a transformant or transductant containing the DDAH gene of the present invention can be adopted as a specific production method. First, transformants or transductants (hereinafter collectively referred to as “recombinant bacteria”) that produce the DDAH of the present invention are cultured. In this case, the culture may be performed by a solid culture method, but it is more preferable to employ a liquid culture method for culture. Examples of the culture medium for cultivating the microorganism include one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat straw leachate, potassium dihydrogen phosphate, dihydrogen phosphate. One or more inorganic salts such as potassium, magnesium sulfate, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate are added, and further, saccharide raw materials, vitamins and the like are appropriately added as necessary. As an enzyme production induction substrate, it is also effective to improve the production amount to appropriately add an induction substrate suitable for a promoter, for example, IPTG.
なお、培地の初発pHは、例えば、7.0〜9.0に調製するのが適当である。また培養は、例えば、25〜42℃、好ましくは30℃前後で1〜5日間、通気攪拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明DDAHを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。 The initial pH of the medium is suitably adjusted to 7.0 to 9.0, for example. Cultivation is preferably performed, for example, at 25 to 42 ° C., preferably around 30 ° C. for 1 to 5 days, by aeration / agitation deep culture, shaking culture, stationary culture, or the like. In order to collect the DDAH of the present invention from the culture after completion of the culture, a normal enzyme collecting means can be used.
次いで、培養液から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明DDAHを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンX−100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から本発明DDAHを採取するのが好ましい。 Next, the cells are separated from the culture solution by, for example, operations such as filtration and centrifugation, and washed. The DDAH of the present invention is preferably collected from the cells. In this case, the bacterial cells can be used as they are, but the cell wall using a cell wall lytic enzyme such as lysozyme, a method of destroying the bacterial cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, French press, dynomill, etc. It is preferable to collect the DDAH of the present invention from the microbial cells by a method for dissolving the microbial cells, a method for extracting an enzyme from the microbial cells using a surfactant such as Triton X-100, and the like.
このようにして得られた粗酵素液から本発明DDAHを精製、単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。このようにして、本発明DDAHを、SDS−PAGE上でほぼ単一のバンドを示すまでに単離することができる。又、上記精製方法を適宜組み合わせて、用途に応じた精製度合の異なる酵素標品を調整することもできる。 In order to purify and isolate the DDAH of the present invention from the crude enzyme solution thus obtained, a conventional method for enzyme purification can be used. For example, an ammonium sulfate salting-out method, an organic solvent precipitation method, an ion exchange chromatography method, a gel filtration chromatography method, a hydrophobic chromatography method, an adsorption chromatography method, an electrophoresis method and the like are preferably combined appropriately. In this way, the DDAH of the present invention can be isolated by showing an almost single band on SDS-PAGE. In addition, enzyme preparations with different degrees of purification can be prepared by appropriately combining the above purification methods.
このようにして得られた本発明DDAHは、例えば、米国特許第6358699号明細書記載のジメチルアルギニン測定等に有効に用いられる。先ず、非対称ジメチルアルギニンを含むサンプルに本発明DDAHを作用させ、シトルリンを遊離させる。遊離したシトルリン量を上記活性測定法に従って測定する。 The DDAH of the present invention thus obtained is effectively used for measuring dimethylarginine described in US Pat. No. 6,358,699, for example. First, DDAH of the present invention is allowed to act on a sample containing asymmetric dimethylarginine to liberate citrulline. The amount of citrulline liberated is measured according to the above activity measurement method.
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
(データベース検索)
ラット由来DDAHアミノ酸配列を用いてBLASTデータベース検索を行なった。その結果、ラット由来、ヒト由来の他に、昆虫由来あるいは微生物由来ホモログの存在が明らかになった。
(Database search)
BLAST database search was performed using rat-derived DDAH amino acid sequences. As a result, the existence of insect-derived or microbial-derived homologs in addition to rats and humans was revealed.
Sinorhizobium meliloti ATCC51124は、ゲノム解析されており、全ゲノムDNA情報が明らかにされている。該遺伝子は、活性の知られている哺乳類由来あるいは微生物由来のアミノ酸配列とは28〜38%の相同性にしか過ぎず、該遺伝子のコードする酵素の機能あるいは性質については、これまで調べられていなかった。 Sinorhizobium meliloti ATCC51124 has been genome-analyzed, and the entire genome DNA information has been clarified. This gene has only 28-38% homology with known mammalian or microbial amino acid sequences, and the function or property of the enzyme encoded by the gene has been investigated so far. There wasn't.
[本発明遺伝子(Sinorhizobium meliloti)のクローニング及び形質転換体による発現]
(1)プライマーの合成及びDNAの調製
アミノ酸配列相同性検索より判明したSinorhizobium meliloti由来遺伝子配列に基づいて構造遺伝子を増幅できるDNAプライマーをシグマジェネシス社の受託合成により作製した。Sinorhizobium melilotiは、ATCCより菌株を購入し、ATCC指定の方法で復元した後、0.2LのTY培地に接種し、30℃、120r.p.m.で1日間回転振とう培養した。この培養液より、12,000r.p.m.で10分間遠心分離することで菌体を回収した。得られた菌体は、5mlのTEバッファーで懸濁し、等量のTE飽和フェノールを添加した後、緩やかに振とうすることにより溶菌させた。12000r.p.m.で2分遠心後、上清を取りだし、更に、TE飽和フェノールで除蛋白処理を行なった。最後に、エタノール沈殿法によりDNAを回収し、1.20mgのDNAを得た。
[Cloning of the gene of the present invention (Sinorhizobium meliloti) and expression by transformants]
(1) Primer synthesis and DNA preparation A DNA primer capable of amplifying a structural gene based on a gene sequence derived from Sinorhizobium meliloti, which was found from amino acid sequence homology search, was prepared by contract synthesis of Sigma Genesis. Sinorhizobium meliloti was purchased from ATCC, and after reconstitution with the method specified by ATCC, 0.2 L of TY medium was inoculated and cultured at 30 ° C. and 120 rpm for 1 day. From this culture, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The obtained cells were suspended in 5 ml of TE buffer, added with an equal amount of TE saturated phenol, and then lysed by gentle shaking. After centrifugation at 12000 rpm for 2 minutes, the supernatant was taken out and further subjected to protein removal treatment with TE saturated phenol. Finally, DNA was recovered by ethanol precipitation to obtain 1.20 mg of DNA.
(2)PCR
反応液を以下の組成で調製し、変性を94℃、30秒間、アニールを62℃、30秒間、伸長反応を72℃、2分間で30サイクルの反応条件でPCRを行なった。
(反応液組成)
10μMプライマー(配列番号3) 0.6μl
10μMプライマー(配列番号4) 0.6μl
10×PCRバッファー 2μl
dNTP 2μl
1mM塩化マグネシウム 0.8μl
Taqポリメラーゼ 0.4U
H2O 最終容量20μlになるよう加える。
PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約0.8kbの位置に目的の断片と思われるバンドが確認されたので、そのバンドをRecoChip(宝酒造社製)で精製抽出した。
(2) PCR
A reaction solution was prepared with the following composition, and PCR was performed under the conditions of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 62 ° C. for 30 seconds, extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes and 30 cycles.
(Reaction solution composition)
0.6 μl of 10 μM primer (SEQ ID NO: 3)
0.6 μl of 10 μM primer (SEQ ID NO: 4)
2x 10x PCR buffer
dNTP 2 μl
1 mM magnesium chloride 0.8 μl
Taq polymerase 0.4U
Add to a final volume of 20 μl of H 2 O.
After completion of PCR, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, a band considered to be the target fragment was confirmed at about 0.8 kb, and the band was purified and extracted with RecoChip (Takara Shuzo).
(3)精製DNA断片の解析
精製したDNA断片を370A DNAシークエンシス・システム(パーキンエルマー社製)を用いて塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列は、データベースのDNA配列と同じであった。一方プラスミドpT7−Blue(ノバジェン社製)を制限酵素EcoRVで消化後、上記精製抽出したDNA断片とライゲーション反応を行ない、大腸菌JM109を形質転換した。得られたプラスミドpT7sDDAHは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−19735として寄託されている。
(3) Analysis of purified DNA fragment When the purified DNA fragment was subjected to nucleotide sequence determination and analysis using a 370A DNA sequencing system (manufactured by PerkinElmer), the determined nucleotide sequence was determined from the DNA sequence in the database. It was the same. On the other hand, plasmid pT7-Blue (manufactured by Novagen) was digested with restriction enzyme EcoRV, and then ligated with the purified and extracted DNA fragment to transform E. coli JM109. The obtained plasmid pT7sDDAH has been deposited as FERM P-19735 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
(4)活性の確認
大腸菌JM109(pT7sDDAH)菌体を、50μg/mlのアンピシリンを含むTY培地(1% バクトトリプトン、0.5% バクトイースト・エクストラクト、0.5% NaCl、pH7.0)10mlにて28℃でクレット100まで振とう培養した後、IPTGを終濃度1mMとなるよう添加し、更に、3時間培養した。この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて20秒間、4回処理した。これをエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、12,000r.p.m.で10分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、前述した酵素活性測定法によりDDAH活性を測定したところ、JM109(pT7sDDAH)は、0.23U/mlとDDAH活性を有していた。
(4) Confirmation of activity Escherichia coli JM109 (pT7sDDAH) cells were treated with TY medium (1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0) containing 50 μg / ml ampicillin. ) After shaking culture at 10 ml at 28 ° C. to
(5)Sinorhizobium meliloti由来本発明DDAHの製造
JM109(pT7sDDAH)を50μg/mlのアンピシリンを含むTY培地(1% バクトトリプトン、0.5% バクトイースト・エクストラクト、0.5% NaCl、pH7.0)10mlに接種し、30℃で1日間振とう培養した。これを種培養として、0.5L三角フラスコに入れた上記培地0.1Lに1mlずつ接種し、28℃でクレット100まで振とう培養した後、IPTGを終濃度1mMとなる如く添加し、更に、3時間培養した。この培養液より、遠心分離(12000r.p.m.、10分間)により菌体を回収した。得られた菌体を−80℃で凍結保存した。
(5) Manufacture of DDAH of the present invention derived from Sinorhizobium meliloti JM109 (pT7sDDAH) containing 50 μg / ml ampicillin in TY medium (1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7. 0) 10 ml was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. As a seed culture, inoculate 1 ml each of 0.1 L of the above medium in a 0.5 L Erlenmeyer flask, shake culture at 28 ° C. to
凍結菌体(300ml分)をバッファーA(50mM リン酸バッファー、5% グリセロール、pH8.0)15mlに懸濁し、氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて20秒間、4回処理した。破砕液を12,000r.p.m.で、10分間遠心し、上清を予めバッファーAで平衡化したQセファロースFF(アマシャムバイオテク社製)カラム(2.5cm×15cm)にかけた。150mlのバッファーAで洗浄後、バッファーAからバッファーB(0.7M 塩化ナトリウム、50mM リン酸バッファー、5% グリセロール、pH8.0)のリニアグラジェントで溶出させた。活性画分は、約0.3M塩化ナトリウムで溶出した。 Frozen cells (300 ml) are suspended in 15 ml of buffer A (50 mM phosphate buffer, 5% glycerol, pH 8.0), and cooled on ice, using an ultrasonic crusher (Ultrasonicgenerator, manufactured by Nissei) for 20 seconds. Processed 4 times. The disrupted solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was applied to a Q Sepharose FF (Amersham Biotech) column (2.5 cm × 15 cm) previously equilibrated with buffer A. After washing with 150 ml of buffer A, elution was performed with a linear gradient of buffer A to buffer B (0.7 M sodium chloride, 50 mM phosphate buffer, 5% glycerol, pH 8.0). The active fraction was eluted with about 0.3M sodium chloride.
溶出された活性画分をセントリプレップ10(アミコン社製)で濃縮、透析し、もう一度QセファロースFFにかけた。溶出は、バッファーA〜バッファーBのリニアグラジェントで行なった。活性画分を約0.3M塩化ナトリウムで溶出した。 The eluted active fraction was concentrated and dialyzed with Centriprep 10 (Amicon), and again subjected to Q Sepharose FF. Elution was performed with a linear gradient of buffer A to buffer B. The active fraction was eluted with about 0.3M sodium chloride.
得られた活性画分をSDS−PAGEで分析したところ、ほぼ単一なバンドが得られた(分子量約31,000)。得られた活性画分を以下の理化学的性質を決定するのに用いた。 When the obtained active fraction was analyzed by SDS-PAGE, an almost single band was obtained (molecular weight about 31,000). The obtained active fraction was used to determine the following physicochemical properties.
(Sinorhizobium meliloti由来本発明DDAHの理化学的性質)
実施例2により得られた本発明DDAHの理化学的性質は、下記の通りであった。
(a)作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質として非対称ジメチルアルギニン(ADMA)、対称ジメチルアルギニン(SDMA)、L−アルギニンを用いて、本発明sDDAHの活性を測定した。本発明DDAHは、SDMA,L−アルギニンには作用しなかった。
(Physicochemical properties of the present invention DDAH derived from Sinorhizobium meliloti)
The physicochemical properties of the DDAH of the present invention obtained in Example 2 were as follows.
(A) Action and substrate specificity The activity of the sDDAH of the present invention was measured by using the enzyme activity measurement method described above, using asymmetric dimethylarginine (ADMA), symmetric dimethylarginine (SDMA), and L-arginine as substrates. The DDAH of the present invention did not act on SDMA, L-arginine.
(b)至適pH
緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.0〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0〜8.5)、200mM グリシン緩衝液(pH8.0〜11.0)を用い、夫々のpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行なった。結果を図1に示した。
本発明sDDAHは、pH9.0〜10.0において最も高い活性を示した。また、pH7.0〜10.0でもpH9.0付近における活性値の50%以上を示したことから、本発明DDAHの至適pHは、pH7.0〜10.0であり、最も好ましい至適pHは、pH9.0〜10.0であると判断した。
(B) Optimal pH
200 mM acetate buffer (pH 4.0 to 6.0), 200 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0 to 8.5), and 200 mM glycine buffer (pH 8.0 to 11.0) were used as buffers. The enzyme reaction was carried out at a temperature of 37 ° C. The results are shown in FIG.
The sDDAH of the present invention showed the highest activity at pH 9.0-10.0. In addition, since the activity value in the vicinity of pH 9.0 was 50% or more even at pH 7.0 to 10.0, the optimum pH of the DDAH of the present invention is pH 7.0 to 10.0, and the most preferable optimum. The pH was judged to be pH 9.0-10.0.
(c)至適温度の範囲
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図2に示した。最も高い活性を示した温度である、37℃付近での活性に対して60%以上の活性を示す温度範囲は、30〜40℃であった。
以上から、本発明DDAHの至適温度の範囲は、30〜40℃であると判断した。
(C) Optimum temperature range The activity of the enzyme was measured at various temperatures using a reaction solution having the same composition as the reaction solution in the activity measurement method described above. The results are shown in FIG. The temperature range showing 60% or more of the activity in the vicinity of 37 ° C., which is the temperature showing the highest activity, was 30 to 40 ° C.
From the above, the optimum temperature range of the DDAH of the present invention was determined to be 30 to 40 ° C.
(d)熱安定性
200mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)を用いて、各温度で10分間処理した時の熱安定性の結果は、図3に示す通りであり、本発明DDAHは、40℃付近まで安定であった。
(D) Thermal stability The results of thermal stability when treated with 200 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) at each temperature for 10 minutes are as shown in FIG. It was stable up to around 40 ° C.
(e)安定pH範囲
緩衝液として、200mM 酢酸緩衝液(pH3.0〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜8.5)、200mM グリシン緩衝液(pH8.0〜12.0)を用い、夫々のpHにおいて30℃で10分間処理した後、本発明DDAHの残存活性を測定した。結果を図4に示した。最も高い残存活性を示したpHである。pH10.0付近での活性に対して50%以上の活性を示すpH範囲は、pH4.0〜10.0であった。
以上から、本発明DDAHの安定pH範囲は、pH4.0〜10.0であると判断した。
(E) Stable pH Range As a buffer solution, 200 mM acetate buffer (pH 3.0 to 6.0), 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5 to 8.5), 200 mM glycine buffer (pH 8.0 to 12) 0.0), the residual activity of the DDAH of the present invention was measured after treatment at 30 ° C. for 10 minutes at each pH. The results are shown in FIG. The pH showing the highest residual activity. The pH range showing an activity of 50% or more with respect to the activity around pH 10.0 was pH 4.0 to 10.0.
As mentioned above, it was judged that the stable pH range of this invention DDAH is pH 4.0-10.0.
(f)分子量
マルチゲル4/20(第一化学薬品社製)を用いるSDS−PAGE法により分子量を求めた結果、本発明DDAHの分子量は、約31,000であった。
(F) Molecular weight As a result of obtaining the molecular weight by SDS-PAGE method using Multigel 4/20 (manufactured by Daiichi Chemicals Co., Ltd.), the molecular weight of the DDAH of the present invention was about 31,000.
Claims (8)
(a)作用:非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
(b)基質特異性:アルギニンには作用しない。 Dimethylarginine dimethylaminohydrolase having the following physicochemical properties:
(A) Action: Acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces dimethylamine and citrulline.
(B) Substrate specificity: Does not act on arginine.
(a)作用:非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
(b)基質特異性:アルギニンには作用しない。
(c)至適pH:7.0〜10.0 Dimethylarginine dimethylaminohydrolase having the following physicochemical properties:
(A) Action: Acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces dimethylamine and citrulline.
(B) Substrate specificity: Does not act on arginine.
(C) Optimum pH: 7.0 to 10.0
(a)作用:非対称ジメチルアルギニンに作用し、シトルリン及びジメチルアミンを生成する反応を触媒する。
(b)基質特異性:アルギニンには作用しない。
(c)至適pH:7.0〜10.0
(d)安定pH範囲:pH4.0〜10.0
(e)作用適温の範囲:30〜40℃
(f)熱安定性:40℃、10分の熱処理で70%以上の活性が残存する。
(g)分子量:約31,000(SDS−PAGE) Dimethylarginine dimethylaminohydrolase having the following physicochemical properties:
(A) Action: Acts on asymmetric dimethylarginine to catalyze a reaction that produces citrulline and dimethylamine.
(B) Substrate specificity: Does not act on arginine.
(C) Optimum pH: 7.0 to 10.0
(D) Stable pH range: pH 4.0-10.0
(E) Temperature range suitable for action: 30 to 40 ° C
(F) Thermal stability: 70% or more activity remains after heat treatment at 40 ° C. for 10 minutes.
(G) Molecular weight: about 31,000 (SDS-PAGE)
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質 The following (a), (b) or (c) dimethylarginine dimethylaminohydrolase.
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A protein having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity (c) A protein having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質 A dimethylarginine dimethylaminohydrolase gene encoding the dimethylarginine dimethylaminohydrolase of the following (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A protein having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity (c) A protein having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity
A method for producing dimethylarginine dimethylaminohydrolase, comprising culturing the transformant or transductant according to claim 7 in a medium and collecting dimethylarginine dimethylaminohydrolase from the culture.
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