JP2005254168A - セルロース系有機物を含む処理対象物の嫌気性処理方法および装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】 簡易且つ安価に、セルロース系有機物を含む処理対象物におけるセルロース分解能を高め、維持することができる嫌気性処理方法および装置を提供する。
【手段】 本発明は、セルロース系有機物を含む処理対象物のセルロース分解細菌による生物分解を行うための嫌気性処理方法であって、メタン発酵系のような嫌気性処理がなされる処理対象物の少なくとも一部を分取する工程、該分取物にセルロース分解細菌の菌数が増加する培養環境を与える工程、および該培養処理物の少なくとも一部を前記処理対象物に導入する工程を含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
【手段】 本発明は、セルロース系有機物を含む処理対象物のセルロース分解細菌による生物分解を行うための嫌気性処理方法であって、メタン発酵系のような嫌気性処理がなされる処理対象物の少なくとも一部を分取する工程、該分取物にセルロース分解細菌の菌数が増加する培養環境を与える工程、および該培養処理物の少なくとも一部を前記処理対象物に導入する工程を含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
Description
本発明は、セルロース系有機物を含む廃棄物又は排水等の処理対象物を高効率で浄化処理するための嫌気性処理方法および装置に関し、特に、メタン生成細菌と共にセルロース分解細菌が存在する廃棄物又は排水等からのバイオガスによるエネルギー回収効率を向上させ得るメタン発酵法およびそのための装置に関する。
微生物の生物分解を利用した各種有機廃棄物の処理・減容化方法は、下記のような有用性を有する。すなわち、生ごみ、紙ごみ、し尿・浄化槽汚泥は、我々が日常生活を営む過程で大量に発生する代表的な有機性廃棄物であるが、水分を多く含むため、従来の焼却処分では大量の化石燃料を消費すると共に、多量の二酸化炭素・NOx・SOx等を生成し、またダイオキシン等の有害物質の発生源ともなっている。また、焼却灰を含めた廃棄物の埋め立て処分地の確保も困難になりつつある。一方、平成12年4月の容器包装紙リサイクル法完全施行により、これまで廃棄されていた包装紙、紙容器などの再商品化が義務づけられたが、同法の施行前から古紙の再商品率は56％程度であり（古紙リサイクル推進検討会、「今後の古紙リサイクル向上に向けて」平成12年）、今後更に再商品化に不向きな古紙の利用の場が求められている。従って、それらの問題を解決するには生物学的な処理が有用である。
特に下水余剰汚泥や畜産廃棄物の有用な生物学的処理・減容化方法として、メタン発酵技術が知られている。この技術では、嫌気的な環境条件下で複数の嫌気性細菌群の連係プレーにより、有機物をエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。またメタン発酵は、焼却・埋め立て処理されてきた有機性廃棄物の処理およびエネルギー回収技術としても有効である。
しかしながら、下水汚泥、生ゴミ、古紙・パルプ系の廃棄物は、生物分解を受け難い固形性有機物であるセルロースを多く含有し、そのような環境下でのメタン発酵においては、セルロースの加水分解・酸生成反応が律速となっているため、30から40日程度の長い処理時間を必要とし、しかもその有機物分解率（セルロースのメタンへの転換率）が易分解性の廃水などと比較してかなり低い（非特許文献１）。すなわち、セルロース系の有機性廃棄物・排水のメタン発酵を中心とした高効率な処理技術を確立するためには、セルロース分解細菌をそのメタン発酵処理系内で安定的に維持および制御することが重要であると考えられる。
環境試料から単離した分解微生物を用いた分解プロセスを開発する試みは古くから行われてきた。しかしながら、活性汚泥やメタン発酵のように複雑な微生物混合系においては、単離微生物を培養して添加しても、添加微生物が複合微生物系に定着することは極めて困難であることが知られている。例えば、Mladenovska Z.は糞尿のメタン発酵において、そこに含まれるセルロース等の繊維分の分解を促進させるためにセルロース分解細菌の投与を行った。しかしながら、系外から投与した分解細菌のメタン発酵系内での定着には成功しておらず、セルロース分解能を高めることができなかった（非特許文献２）。
これに対し、本発明者等は、メタン発酵処理系等の環境浄化に有用な環境試料において重要な役割を果たすセルロース分解細菌を見出すため、セルロースを炭素源に用いた高温メタン発酵汚泥の集積培養実験を行い、その細菌相の解析と基質代謝特性の調査を行った結果、Clostridiumに属し、セルロースに対し高い分解能を有する嫌気性微生物Clostridium sp. JC3（以下単に「JC3菌」又は「セルロース分解細菌」とも記述する）がメタン発酵細菌群集内で優占化することを突き止めた（未公開特許文献１）。そして、難分解性の固形性有機物であるセルロースに対し高い分解能を有するJC3菌を含む一群の菌株群の増殖が促進される培養条件をも見出した。
さらに本発明者等は、難分解性の固形性有機物であるJC3菌等の発見に続いて、このJC3菌の菌学的性質とその系統学的側面に着目し、この種の細菌が安定的に保持している16S rRNA遺伝子（その全配列はアセッション番号AB093546としてデータベースに登録済みである）等を標的とすることによって、環境試料中の優占化セルロース分解細菌の菌数を効率的、定量的且つ／又は特異的に測定できる菌数測定法、およびそのためのオリゴヌクレオチドプライマー等を見出した（未公開特許文献２）。
上記の発明では、JC3菌を含む一群の菌株群の増殖が促進される培養条件を利用すると共に、培養した菌体を含む微生物培養液又はその乾燥菌体を、発酵槽（酸発酵槽、メタン発酵槽など）に所望の濃度（例えば、発酵槽内の最終濃度で106〜1011 cells/mL程度）で添加することにより、処理対象物におけるセルロース分解能を高めることが可能となった。
De Baere L., Anaerobic digestion of solid waste: state-of-the-art, Water Sci. Technol. 2000;41(3):283-90
Mladenovska Z., Bioaugmentation of a mesophilic biogas reactor by anaerobic xylanolytic-and cellulolytic bacteria. Anaerobic Digestion. 2001;183-188
未公開特許文献１
特願2003-279233号公報
未公開特許文献２
特願2003-56088号公報
特願2003-279233号公報
未公開特許文献２
特願2003-56088号公報
しかしながら、セルロース分解能を高めるために培養菌体を添加する場合、その添加量は、処理対象物に含まれるセルロースの量や投入する発酵槽の運転状況などに応じて適切に設定する必要がある。また、添加する菌体はできる限り安価に製造する必要もある。また特に、大量の有機性廃棄物・排水を処理する嫌気性処理装置においては、嫌気性処理槽の環境全体をセルロース分解細菌の培養環境になるよう厳密制御するか、あるいは増殖基質を添加するのではコスト面から見て実用性が低い。
そこで、本発明の目的は、より簡易且つ安価に、セルロース系有機物を含む処理対象物におけるセルロース分解能を高め、維持することができる嫌気性処理方法および装置を提供することにある。
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、嫌気性処理槽内から有機性廃棄物・排水の一部あるいはメタン発酵汚泥等の処理対象物を分取して、これをセルロース分解細菌の菌数を所望値まで増加させた後に、その嫌気性処理槽（メタン発酵槽またはその前段階に設けられた酸発酵槽）に導入することにより、当該処理対象物に含まれるセルロースを迅速に、且つ安価に分解できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、セルロース系有機物を含む処理対象物の生物分解を行うための嫌気性処理方法であって、セルロース分解細菌による嫌気性処理がなされる処理対象物の少なくとも一部を分取する工程、該分取物に前記セルロース分解細菌の菌数が増加する培養環境を与える工程、および該培養処理物の少なくとも一部を前記処理対象物に導入する工程を含むことを特徴とする嫌気性処理方法を提供する。
本法は、前記嫌気性処理がメタン発酵系による処理に適用することができる。また、前記嫌気性処理の前段階で酸発酵系による処理を行い、該酸発酵系に前記培養処理物の少なくとも一部を導入する工程を含むとしてもよい。
本法において、前記分取物に与えられる培養条件は、45〜65 ℃の温度、好ましくは50〜60 ℃の温度、および5.3〜8.0のpH、好ましくは6.5〜7.5のpHを維持することを含む。
また本法には、前記処理対象物及び／又は分取物における下記（１）〜（４）の性質を有するセルロース分解細菌の菌数を測定する工程を更に含む嫌気性処理方法も含まれる：
（１）クロストリジウム属に属する；
（２）45〜65 ℃の温度領域で至適生育温度を有する；
（３）セルロースの分解能を有する；且つ
（４）配列番号１の塩基配列に対して少なくとも90 ％の相同性を持つ16S rDNAを有し、且つ／又は配列番号２の塩基配列に対して少なくとも80 ％の相同性を持つcbhA（cellobiohydrolase A）遺伝子を有する。
また本法には、前記処理対象物及び／又は分取物における下記（１）〜（４）の性質を有するセルロース分解細菌の菌数を測定する工程を更に含む嫌気性処理方法も含まれる：
（１）クロストリジウム属に属する；
（２）45〜65 ℃の温度領域で至適生育温度を有する；
（３）セルロースの分解能を有する；且つ
（４）配列番号１の塩基配列に対して少なくとも90 ％の相同性を持つ16S rDNAを有し、且つ／又は配列番号２の塩基配列に対して少なくとも80 ％の相同性を持つcbhA（cellobiohydrolase A）遺伝子を有する。
上記の態様においては、前記菌数を測定する工程が、前記セルロース分解細菌のcbhA遺伝子を標的として、下記（Ａ）〜（Ｂ）のいずれか一組の塩基配列からなるプライマー対を使用して定量的PCR法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、該測定値に基づいて菌数を求めることを含むとすることができる：
（Ａ）配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは
（Ｂ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
（Ａ）配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは
（Ｂ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
また、前記菌数を測定する工程が、前記セルロース分解細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、下記（Ｃ）〜（Ｅ）のいずれか一組の塩基配列からなるプライマー対を使用して定量的PCR法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、該測定値に基づいて菌数を求めることを含むとしてもよい：
（Ｃ）配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；
（Ｄ）配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは
（Ｅ）配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
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（Ｄ）配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは
（Ｅ）配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。
さらに、前記菌数を測定する工程が、前記セルロース分解細菌の核酸を標的として、配列番号１０〜１２のいずれかの塩基配列又はそれらと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにより構成される標識プローブを使用してハイブリダイゼーションを行い、それによりハイブリッドを形成した標記プローブから得られるシグナルに基づいて菌数を求めることを含むとすることもできる。
また、本発明は、セルロース分解細菌によりセルロース系有機物を含む処理対象物の生物分解が行われる嫌気性処理槽、該嫌気性処理槽を経由する処理対象物の少なくとも一部を分取して他の槽に導入する手段、前記分取物が導入され、該分取物に前記セルロース分解細菌の菌数が増加する培養環境を与えるセルロース分解細菌増殖槽、および該セルロース分解細菌増殖槽内の培養処理物の少なくとも一部を前記嫌気性処理槽に導入する手段を有することを特徴とする嫌気性処理装置を提供する。
本発明は、前記嫌気性処理槽がメタン発酵槽である嫌気性処理装置に適用することができる。また、前記嫌気性処理槽の前段階に酸発酵槽を設け、該酸発酵槽に前記培養処理物の少なくとも一部を導入する手段を有するとしてもよい。
本発明により、微生物の生物分解を利用する嫌気性処理において、セルロース分解細菌を効率的に増殖し、維持することができる。特に、セルロース系有機物の分解を含むメタン発酵系の嫌気性処理において、セルロースを迅速且つ安価に分解し、メタンガスとして効率的に回収することができる。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
（１）本発明の嫌気性処理方法
本発明の嫌気性処理方法は、セルロース系有機物の生物分解が行われる嫌気性処理槽を経由する処理対象物の少なくとも一部を分取し、この分取物をセルロース分解細菌増殖槽に導入し、ここでセルロース分解細菌の増殖が促進される培養環境を与え、その培養処理物の少なくとも一部を嫌気性処理槽内に再び戻す工程を有する。
（１）本発明の嫌気性処理方法
本発明の嫌気性処理方法は、セルロース系有機物の生物分解が行われる嫌気性処理槽を経由する処理対象物の少なくとも一部を分取し、この分取物をセルロース分解細菌増殖槽に導入し、ここでセルロース分解細菌の増殖が促進される培養環境を与え、その培養処理物の少なくとも一部を嫌気性処理槽内に再び戻す工程を有する。
本明細書において使用される「嫌気性処理方法」という用語は、嫌気的な環境条件下でセルロース系有機物に対する微生物の分解活性を利用して処理対象物を浄化処理するためのプロセスを意味し、これには、本発明に関するセルロース分解細菌と共に他の多様な分解微生物が働く複雑な生物処理系が含まれる。
本発明を適用し得る処理対象物には、セルロース系有機物を含むあらゆる廃棄物や排水、例えば、生ごみ、紙ごみ、し尿・浄化槽汚泥等が含まれる。特に好適なものは、セルロース分解細菌とメタン生成細菌との連係プレーによりセルロース系有機物をエネルギーとしてのメタンガスにまで転換できるメタン発酵系の処理対象物、特に、下水汚泥、生ゴミ、又は古紙・パルプ系の廃棄物である。
セルロース分解細菌の増殖法
上述の通り本発明では、嫌気性処理される処理対象物の少なくとも一部をセルロース分解細菌増殖槽に移して、所定の培養処理を行うことを特徴とする。すなわち、本明細書において使用される「培養処理」という用語は、分取した処理対象物に、セルロース分解細菌の菌数が増加するような培養環境を与えることを意味する。
上述の通り本発明では、嫌気性処理される処理対象物の少なくとも一部をセルロース分解細菌増殖槽に移して、所定の培養処理を行うことを特徴とする。すなわち、本明細書において使用される「培養処理」という用語は、分取した処理対象物に、セルロース分解細菌の菌数が増加するような培養環境を与えることを意味する。
分取物に与えるべき培養環境は、概してpHを7付近に維持し且つ高温に保つことである。より具体的には、JC3菌に代表されるセルロース分解細菌の培養温度は、高温度域、即ち45〜65℃に維持するのが好ましく、特に50〜60 ℃になるように制御することがより好ましい。またpHは5.3〜8.0の範囲に維持するのが好ましく、6.5〜7.5付近になるように制御することがより好ましい。このような培養環境を維持することにより、中温性細菌の増殖は抑制され、高温性細菌であるJC3菌のような所望の菌株が優占化する。
セルロース細菌増殖槽内においてセルロース分解細菌に必要な増殖基質は、そこに分取される処理対象物（有機性廃棄物・排水あるいはメタン発酵槽内汚泥など）に含まれているので、逐次導入される処理対象物で供給される。但し、セルロース細菌増殖槽内に増殖基質であるセルロースおよびその中間代謝基質であるセロビオース、グルコースなど、あるいはセルロース含有率の高い廃棄物などを添加することにより、JC3菌のような菌株を優先的に増殖させることもできる。したがって、必要であれば上記の温度およびpHの制御に加え、上記の増殖基質を添加するとしてもよい。
上記セルロース細菌増殖槽内の培養処理物（例えば、槽の内液）は、セルロース分解細菌の菌数が所望の値に達した後、嫌気性処理の工程に再び導入される。その導入法は、嫌気性処理槽へ直接導入する方法でもよいし、嫌気性処理槽の前段階にある他の処理槽や配管、例えば、酸発酵槽に導入する間接的な方法でもよい。
セルロース分解細菌数の検出、設定およびモニタリング
本発明の嫌気性処理方法において、セルロース分解細菌増殖槽、嫌気性処理槽および／又は酸発酵槽内におけるセルロース分解細菌の菌数は、JC3菌のような菌株が安定的に保持している特定遺伝子を標的とすることによって、効率的、定量的且つ／又は特異的に測定できる菌数測定法、例えば、前記特定遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドプライマー等を用いた定量的PCR法やハイブリダイゼーションアッセイなどにより定量することができる。したがって、本発明では、各槽内のセルロース分解細菌の菌数は上記のような検出法を用いて迅速に把握し、セルロース分解細菌の菌数を制御することに役立てることができる。
本発明の嫌気性処理方法において、セルロース分解細菌増殖槽、嫌気性処理槽および／又は酸発酵槽内におけるセルロース分解細菌の菌数は、JC3菌のような菌株が安定的に保持している特定遺伝子を標的とすることによって、効率的、定量的且つ／又は特異的に測定できる菌数測定法、例えば、前記特定遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドプライマー等を用いた定量的PCR法やハイブリダイゼーションアッセイなどにより定量することができる。したがって、本発明では、各槽内のセルロース分解細菌の菌数は上記のような検出法を用いて迅速に把握し、セルロース分解細菌の菌数を制御することに役立てることができる。
ここで菌数を測定する工程では、好ましくは下記（１）〜（４）の性質を有するセルロース分解細菌を検出して、その菌数を計測することを含む。
（１）クロストリジウム属に属する；
（２）45〜65 ℃の温度領域で至適生育温度を有する；
（３）セルロースの分解能を有する；且つ
（４）配列番号１の塩基配列に対して少なくとも90 ％の相同性を持つ16S rDNAを有し、且つ／又は配列番号２の塩基配列に対して少なくとも80 ％の相同性を持つセロビオヒドロラーゼA（cbhA）遺伝子を有する。
（１）クロストリジウム属に属する；
（２）45〜65 ℃の温度領域で至適生育温度を有する；
（３）セルロースの分解能を有する；且つ
（４）配列番号１の塩基配列に対して少なくとも90 ％の相同性を持つ16S rDNAを有し、且つ／又は配列番号２の塩基配列に対して少なくとも80 ％の相同性を持つセロビオヒドロラーゼA（cbhA）遺伝子を有する。
ここで、上記（４）の系統学的側面によると、菌数を測定するためのPCR法において、前記セルロース分解細菌のcbhA遺伝子を標的とするプライマー対、例えば、（Ａ）配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは（Ｂ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を使用することができる。
また、セルロース分解細菌の16S rRNA遺伝子を標的とする場合、例えば、（Ｃ）配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；（Ｄ）配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは（Ｅ）配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列からなるプライマー対を使用することができる。
また上記のPCR法と共にあるいは別個の手段として、前記セルロース分解細菌の核酸を標的とするハイブリダイゼーションアッセイを行って菌数を求めることもできる。例えば、前記16S rRNA遺伝子を標的とする場合、配列番号１０〜１２のいずれかの塩基配列又はそれらと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた標識プローブを使用することができる。
上記いずれの検出法においても、試料の調製法、PCR条件、ハイブリダイズ条件等の諸条件は、当業者に良く知られている常套手段および公知の条件に基づいて選択することができる。なお、本明細書において「特定遺伝子を標的とする検出」に言及する場合、これには、その遺伝子（DNA）のプローブを用いた検出のほか、DNAの転写物であるRNAからcDNAを逆転写し、これを鋳型とするPCRなど、当該遺伝子の存在を知るためのあらゆる検出法が含まれる。例えば、rRNA遺伝子を標的とする場合、上述のように、染色体上のrDNAを標的としたPCRを行ってもよいし、細胞内に発現しているrRNAにハイブリダイズするプローブを使用してもよいし、rRNAをcDNAに逆転写後、rDNAを増幅するためのプライマーを使用してPCRを行ってもよい。
菌数のモニタリングおよび制御に関し、例えば、セルロース分解菌増殖槽内のセルロース分解菌の菌数は、それが導入される槽（嫌気性処理槽又は酸発酵槽）内に所望される菌体の最終濃度に基づいて設定することができる。すなわち、嫌気性処理槽又は酸発酵槽における菌数を上記検出法によりモニタリングすれば、セルロース分解菌増殖槽内で達成すべきセルロース分解菌数およびその導入率を逆算的に設定することができる。概して、嫌気性処理槽又は酸発酵槽内において望ましいセルロース分解細菌の菌数は、最終濃度で106〜1011 cells/mL程度、より好ましくは109〜1011cells/mL程度である。このようにセルロース分解菌の菌数を把握し、培養環境を制御することにより、その結果、嫌気性処理槽又は酸発酵槽内のセルロース分解細菌の菌数を所望の範囲に維持し、その系のセルロースの分解活性を好ましく高く維持することができる。
（２）本発明の嫌気性処理装置
図１は本発明の嫌気性処理装置の第１の構成例を示す。この嫌気性処理装置は、嫌気性処理槽としてのメタン発酵槽１、pH調整液貯留槽３が設けられたセルロース分解細菌増殖槽２、メタン発酵槽１を経由する処理対象物（例えば、生ゴミの原水）の一部を分取してセルロース分解細菌増殖槽に送るための配管６、およびセルロース分解細菌増殖槽内の培養処理物の少なくとも一部（例えば、槽内液）をメタン発酵槽に戻すための配管７を含んで構成されている。処理対象物からの分取は、図１（ａ）のようにメタン発酵槽からの流出配管４からでもよいし、図１（ｂ）のようにメタン発酵槽への流入配管４からでもよい。
図１は本発明の嫌気性処理装置の第１の構成例を示す。この嫌気性処理装置は、嫌気性処理槽としてのメタン発酵槽１、pH調整液貯留槽３が設けられたセルロース分解細菌増殖槽２、メタン発酵槽１を経由する処理対象物（例えば、生ゴミの原水）の一部を分取してセルロース分解細菌増殖槽に送るための配管６、およびセルロース分解細菌増殖槽内の培養処理物の少なくとも一部（例えば、槽内液）をメタン発酵槽に戻すための配管７を含んで構成されている。処理対象物からの分取は、図１（ａ）のようにメタン発酵槽からの流出配管４からでもよいし、図１（ｂ）のようにメタン発酵槽への流入配管４からでもよい。
セルロース分解細菌増殖槽内は、pH調整液貯留槽からのpH調整液の流入および図示しない温度制御手段によって適切な培養環境に制御されている。既述の通り、温度を高温度域、即ち45〜65 ℃に維持するのが好ましく、50〜60 ℃になるように制御することがより好ましく、pHは5.3〜8.0の範囲に維持するのが好ましく、6.5〜7.5付近になるように制御することがより好ましい。
上記構成の装置において、セルロース分解細菌増殖槽内でセルロース分解細菌が増殖するように処理された培養物は、メタン発酵槽内に直接フィードバックされ、その結果、メタン発酵槽内のセルロース分解細菌の菌数が所望範囲に維持される。
図２は嫌気性処理装置の第２の構成例を示す。この嫌気性処理装置は、図１の構成に加えて、メタン発酵槽１の前に接続された酸発酵槽８を有し、セルロース分解細菌増殖槽２からの培養処理物を酸発酵槽に送るように配管７が設けられている。このように増殖させたセルロース分解細菌の導入は、メタン発酵槽１ではなく酸発酵槽８へ行ってもよい。
図３は嫌気性処理装置の第３の構成例を示す。この嫌気性処理装置は、図１の構成に加えて、メタン発酵槽１の前に接続された前処理装置１０、およびセルロース分解細菌増殖槽２に接続された培養基質貯留槽９を有する。
培養基質貯留槽９は、セルロース分解細菌の増殖基質であるセルロースやその中間代謝基質であるセロビオース、グルコースなど、あるいはセルロース含有率の高い廃棄物などをセルロース分解細菌増殖槽２に添加する場合に設けられる。さらにセルロース含有率の高い廃棄物などを培養基質として利用する場合は、必要に応じて破砕機などの前処理装置１０を設けることができる。また、生ごみや紙ごみ等の搬入される施設においては、紙ごみを分別してセルロース分解細菌の培養基質として用いることもできる。
〔実施例１〕
セルロース分解細菌増殖実験は、有効容積2 Lのラボスケールの嫌気性培養槽を用いて行った。し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っている高温メタン発酵槽、下水汚泥の処理を行っている中温メタン発酵槽および下水の処理を行っている無加温メタン発酵槽より採取した汚泥1.2 Lに、表１の無機培地1.2 Lとセルロースパウダー43.2 gを加え、60日間、半連続培養を行った。経時的にメタンガスの生成量をモニタリングし、投入セルロースの85 %以上がメタンガスへと転換された時点で、セルロースを含む表１の培地を発酵槽内滞留時間が25日となる様に半連続投入した。培養温度は55 ℃に、pHは7.0に設定した。
セルロース分解細菌増殖実験は、有効容積2 Lのラボスケールの嫌気性培養槽を用いて行った。し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っている高温メタン発酵槽、下水汚泥の処理を行っている中温メタン発酵槽および下水の処理を行っている無加温メタン発酵槽より採取した汚泥1.2 Lに、表１の無機培地1.2 Lとセルロースパウダー43.2 gを加え、60日間、半連続培養を行った。経時的にメタンガスの生成量をモニタリングし、投入セルロースの85 %以上がメタンガスへと転換された時点で、セルロースを含む表１の培地を発酵槽内滞留時間が25日となる様に半連続投入した。培養温度は55 ℃に、pHは7.0に設定した。
試料中のJC3菌の存在を特異的に検出するために、JC3菌cbhA遺伝子（配列番号２の塩基配列）に特異的なプライマーとして配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（cbhA14F）と、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（cbhA14R）を競合PCR用プライマーとして設計し、これらを使用して、配列番号２の塩基配列中の塩基番号719〜870に相当する151塩基の核酸断片を増幅して定量した。
上記の各培養槽より採取した汚泥からDNAを抽出し、抽出したDNAを鋳型として競合PCRを行った。競合PCR用のコンペティターの作製には、宝酒造株式会社製のDNA Competitor作製キット（Code No.RR017）を用い、上記PCRプライマーを用いた場合に「191塩基」のコンペティターDNAが増幅されるように設計した。コンペティター溶液は、104コピー/反応、105コピー/反応、106コピー/反応、107 コピー/反応、108コピー/反応、109コピー/反応でそれぞれ添加した。
上記競合PCRの条件は、94℃ 10分を1サイクル；94℃ 1分、55℃ 1分、および72℃ 1分を35サイクル；そして72℃ 10分を1サイクルとした。
し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っている高温メタン発酵槽から採取した汚泥の場合、実験開始時にはJC3菌およびJC3菌と実質的に相同な菌株の菌数は7.3×106 cells/mL程度存在していたが、セルロースを基質として60日間培養後は、2.8×1010 cells/mL程度まで増加した。また、下水汚泥の処理を行っている中温メタン発酵槽および下水の処理を行っている無加温メタン発酵槽より採取した汚泥の場合は、実験開始時にはJC3菌およびJC3菌と実質的に相同な菌株の菌数は検出限界（104 cells/mL）以下であったが、セルロースを基質として50日間培養後は、それぞれ3.5×1010 cells/mLおよび4.7×1010 cells/mL程度まで増加した。
し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っている高温メタン発酵槽から採取した汚泥の場合、実験開始時にはJC3菌およびJC3菌と実質的に相同な菌株の菌数は7.3×106 cells/mL程度存在していたが、セルロースを基質として60日間培養後は、2.8×1010 cells/mL程度まで増加した。また、下水汚泥の処理を行っている中温メタン発酵槽および下水の処理を行っている無加温メタン発酵槽より採取した汚泥の場合は、実験開始時にはJC3菌およびJC3菌と実質的に相同な菌株の菌数は検出限界（104 cells/mL）以下であったが、セルロースを基質として50日間培養後は、それぞれ3.5×1010 cells/mLおよび4.7×1010 cells/mL程度まで増加した。
このときのセルロース負荷（セルロース分解活性）は、し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っている高温メタン発酵槽から採取した汚泥の場合には0.007 gCOD/gVSS/dから0.36 gCOD/gVSS/dまで、下水汚泥の処理を行っている中温メタン発酵槽から採取した汚泥の場合には0.005 gCOD/gVSS/dから0.558 gCOD/gVSS/dまで、また下水の処理を行っている無加温メタン発酵槽より採取した汚泥の場合には0.003 gCOD/gVSS/dから0.407 gCOD/gVSS/dまで増加した。
以上の結果のように、本発明の方法により、各種のメタン発酵汚泥についてJC3菌のようなセルロース分解細菌を増殖させることができ、それによりセルロース分解活性を高めることができた。
〔実施例２〕
メタン発酵汚泥の馴致
生ごみを原料としたメタン発酵汚泥を種汚泥として、トイレットペーパーを添加した生ごみ原水を供給して汚泥の馴致を行った。実験に用いた生ごみのおおよその組成を表２に示す。
メタン発酵汚泥の馴致
生ごみを原料としたメタン発酵汚泥を種汚泥として、トイレットペーパーを添加した生ごみ原水を供給して汚泥の馴致を行った。実験に用いた生ごみのおおよその組成を表２に示す。
生ごみ原水の調製は、生ごみ：水＝１：２で混合し、ブレンダーで破砕処理した。トイレットペーパー添加生ごみ原水は、この生ごみ原水1 Lあたり13.7 g（セルロース当量10 g）の乾燥トイレットペーパーを加え、更に破砕処理した。これらの原水を有効容積30 Lの完全混合型反応槽に、1日1回投入した。発酵槽の温度は55 ℃に制御した。原水は4℃で保存した。
培養開始当初はメタン発酵槽の滞留時間（HRT）が約60日になるように原水を投入し、メタンガスの発生量、有機物分解率が安定した状態で段階的に負荷を上げ、約3ヶ月の馴致により、HRT 23日で安定したメタンガス発生が認められるようになった。
セルロース高含有原料のメタン発酵実験
上記馴致汚泥を種汚泥として、セルロース分解細菌増殖槽（有効容積1.0 L）、完全混合型メタン発酵槽（有効容積30 L）からなる連続実験装置で、生ごみ：水＝１：4.5にトイレットペーパー25.75 ｇを添加した原水を供給した。原水の性状を表３に示す。
上記馴致汚泥を種汚泥として、セルロース分解細菌増殖槽（有効容積1.0 L）、完全混合型メタン発酵槽（有効容積30 L）からなる連続実験装置で、生ごみ：水＝１：4.5にトイレットペーパー25.75 ｇを添加した原水を供給した。原水の性状を表３に示す。
セルロース分解細菌増殖槽およびメタン発酵槽の温度は55℃に制御した。メタン発酵槽から汚泥を5日に1回120 ml分取して、セルロース分解細菌増殖槽へ導入し、同時にセルロース分解細菌増殖槽から同量の培養液をメタン発酵槽へ導入した。セルロース分解細菌増殖槽にはセルロースパウダー懸濁液（セルロース濃度120 g/L）を3日に1回 30 ml添加した。セルロース分解細菌増殖槽のpHは7.0に制御した。セルロースパウダー懸濁液の添加量は、メタン発酵槽汚泥中のJC3菌およびJC3菌と実質的に相同な菌株の菌数を、実施例１と同様にして配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（cbhA14F）と、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（cbhA14R）をプライマーとして用いた競合PCRにより定量して、その1,000倍の菌数になるようにセルロース分解細菌増殖槽のセルロース負荷を計算して、決定した。
セルロース分解細菌増殖槽を設けない完全混合型メタン発酵槽（有効容積30 L）において、上記馴致汚泥を種汚泥として、同一の原水を供給した実験を対照とした。実験装置の概略構成を図４に示す。同図において符号１はメタン発酵槽、２はセルロース分解菌増殖槽、３はpH調整液貯留槽、４は原水流入配管、５はメタン発酵槽流出液配管、６は分取液配管、７は増殖槽流出液配管、９は増殖基質貯留槽、１１は原水貯留槽、１２は送液ポンプ、１３は電磁バルブ、１４はpHセンサーを示す。
培養開始当初はメタン発酵槽の滞留時間（HRT）が約60日になるように原水を投入し、メタンガスの発生量、有機物分解率が安定した状態で段階的に負荷を上げた。
セルロース分解細菌増殖槽を設けた場合、実験開始5日目にHRTを40日に、50日目にHRTを25日に、さらに80日目にHRTを14日に上げることができ、その後も順調にメタンガスの生成が認められた。メタンガス生成が安定した期間では、投入したセルロース分の90 ％以上がメタンガスに転換された。一方、対照系の場合、5日目にHRTを40日に、90日目にHRTを25日に上げたが、メタンガス発生が次第に不安定になったため、115日目に運転を停止した。
セルロース分解細菌増殖槽を設けた場合、実験開始5日目にHRTを40日に、50日目にHRTを25日に、さらに80日目にHRTを14日に上げることができ、その後も順調にメタンガスの生成が認められた。メタンガス生成が安定した期間では、投入したセルロース分の90 ％以上がメタンガスに転換された。一方、対照系の場合、5日目にHRTを40日に、90日目にHRTを25日に上げたが、メタンガス発生が次第に不安定になったため、115日目に運転を停止した。
各実験期間における平均的なセルロース分解細菌数を表４に示す。
この結果から、セルロース分解細菌増殖槽でセルロース分解細菌が増殖されて定期的にメタン発酵槽に供給されることにより、セルロース含有率が極めて高い廃棄物から効率的にメタンガスが生成されることがわかった。
１ メタン発酵槽（嫌気性処理槽）
２ セルロース分解細菌増殖槽
３ pH調整液貯留槽
４ 原水の配管
５ メタン発酵槽流出液の配管
６ 分取液の配管（処理対象物の少なくとも一部を分取して他の槽に導入する手段）
７ セルロース分解細菌増殖槽からの流出液の配管（培養処理物の少なくとも一部を嫌気性処理槽に導入する手段）
８ 酸発酵槽
９ 増殖基質貯留槽
１０ 破砕機（前処理装置）
２ セルロース分解細菌増殖槽
３ pH調整液貯留槽
４ 原水の配管
５ メタン発酵槽流出液の配管
６ 分取液の配管（処理対象物の少なくとも一部を分取して他の槽に導入する手段）
７ セルロース分解細菌増殖槽からの流出液の配管（培養処理物の少なくとも一部を嫌気性処理槽に導入する手段）
８ 酸発酵槽
９ 増殖基質貯留槽
１０ 破砕機（前処理装置）
Claims (12)
- セルロース系有機物を含む処理対象物の生物分解を行うための嫌気性処理方法であって、セルロース分解細菌による嫌気性処理がなされる処理対象物の少なくとも一部を分取する工程、該分取物に前記セルロース分解細菌の菌数が増加する培養環境を与える工程、および該培養処理物の少なくとも一部を前記処理対象物に導入する工程を含むことを特徴とする嫌気性処理方法。
- 前記嫌気性処理がメタン発酵系による処理を含む、請求項１に記載の嫌気性処理方法。
- 前記嫌気性処理の前段階で酸発酵系による処理を行い、該酸発酵系に前記培養処理物の少なくとも一部を導入する工程を含む、請求項１又は２に記載の嫌気性処理方法。
- 前記分取物に与えられる培養条件が、45〜65 ℃の温度および5.3〜8.0のpHを維持することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の嫌気性処理方法。
- 前記分取物に与えられる培養条件が、50〜60 ℃の温度および6.5〜7.5のpHを維持することを含む、請求項４に記載の嫌気性処理方法。
- 前記処理対象物及び／又は分取物における下記（１）〜（４）の性質を有するセルロース分解細菌の菌数を測定する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の嫌気性処理方法：
（１）クロストリジウム属に属する；
（２）45〜65 ℃の温度領域で至適生育温度を有する；
（３）セルロースの分解能を有する；且つ
（４）配列番号１の塩基配列に対して少なくとも90 ％の相同性を持つ16S rDNAを有し、且つ／又は配列番号２の塩基配列に対して少なくとも80 ％の相同性を持つcbhA（cellobiohydrolase A）遺伝子を有する。 - 前記菌数を測定する工程が、前記セルロース分解細菌のcbhA遺伝子を標的として、下記（Ａ）〜（Ｂ）のいずれか一組の塩基配列からなるプライマー対を使用して定量的PCR法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、該測定値に基づいて菌数を求めることを含む、請求項６に記載の嫌気性処理方法。
（Ａ）配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは
（Ｂ）配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。 - 前記菌数を測定する工程が、前記セルロース分解細菌の16S rRNA遺伝子を標的として、下記（Ｃ）〜（Ｅ）のいずれか一組の塩基配列からなるプライマー対を使用して定量的PCR法を行い、それにより増幅された核酸の量を測定し、該測定値に基づいて菌数を求めることを含む、請求項６又は７に記載の嫌気性処理方法：
（Ｃ）配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；
（Ｄ）配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列；あるいは
（Ｅ）配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列と、配列番号１４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列。 - 前記菌数を測定する工程が、前記セルロース分解細菌の核酸を標的として、配列番号１０〜１２のいずれかの塩基配列又はそれらと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにより構成される標識プローブを使用してハイブリダイゼーションを行い、それによりハイブリッドを形成した標記プローブから得られるシグナルに基づいて菌数を求めることを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の嫌気性処理方法。
- セルロース分解細菌によりセルロース系有機物を含む処理対象物の生物分解が行われる嫌気性処理槽、該嫌気性処理槽を経由する処理対象物の少なくとも一部を分取して他の槽に導入する手段、前記分取物が導入され、該分取物に前記セルロース分解細菌の菌数が増加する培養環境を与えるセルロース分解細菌増殖槽、および該セルロース分解細菌増殖槽内の培養処理物の少なくとも一部を前記嫌気性処理槽に導入する手段を有することを特徴とする嫌気性処理装置。
- 前記嫌気性処理槽がメタン発酵槽である、請求項１０に記載の嫌気性処理装置。
- 前記嫌気性処理槽の前段階に酸発酵槽を設け、該酸発酵槽に前記培養処理物の少なくとも一部を導入する手段を有する、請求項１０又は１１に記載の嫌気性処理装置。
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