JP2005192498A - 検査装置、検査方法及び合成装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 dNTPと、蛍光標識されたプライマーとを用いてDNAサンプルに対してPCR法を行い、PCR法により得られた生成物をゲル8の陰極4よりに注入する。そして、陽極5−陰極4間に電圧を印加することにより、生成物を陽極に向けて電気泳動させる。そして、ゲル8の蛍光強度分布を観察する。
【選択図】図1
Description
蛍光標識を有するプライマーに、重りを有するdNTPを結合して得られる生成物が取り込まれるための媒体が入った槽と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動手段と、
を備えることを特徴とする。
蛍光標識を有するプライマーに、重りを有するdNTPを結合して得られる生成物を媒体に入れる注入工程と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動工程と、
を含むことを特徴とする。
蛍光標識を有するプライマーにdNTPを結合して得られる生成物が取り込まれるための媒体が入った槽と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動手段と、
を備えることを特徴とする。
蛍光標識を有するプライマーと相補的な塩基配列のDNAに、前記プライマーがアニールしてdNTPと結合することによって増幅された生成物を媒体に入れる注入工程と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動工程と、
を備えることを特徴とする。
蛍光標識を有するプライマーを相補的な塩基配列のDNAと結合してから重りを有するdNTPを入れて前記蛍光標識を有するプライマーに前記dNTPを結合するための合成用の槽を有することを特徴とする。
本発明によれば、プライマーに結合された重りの重さに応じてプライマーの移動速度を変えるような生成物を合成することができる。
以下、本発明を適用した第1の実施の形態における”検査装置、検査方法及び合成装置”について説明する。
DNAサンプル中に特定の塩基配列が存在するか否かを判定検査すること。
図1は、判定判定に用いる検査装置1の平面図であり、図2は、図1のII−II面に沿った断面図である。
この検査装置1は、矩形状を呈した固体撮像デバイス2と、固体撮像デバイス2の受光面の外周縁に沿って取り付けられた矩形枠状の浴槽3と、浴槽3の4辺のうち1つの框の内壁面に形成された陽極5と、陽極5が形成された框の対側となる框の内壁面に形成された陰極4と、固体撮像デバイス2の受光面に対向した紫外線源7と、固体撮像デバイス2の受光面に成膜された紫外線遮蔽膜10と、を具備する。固体撮像デバイス2は、フォトダイオード、フォトトランジスタ、ダブルゲート型フォトトランジスタといった光電変換素子をマトリクス状に配列したものである。固体撮像デバイス2としては、CCD型固体撮像デバイス、CMOS型固体撮像デバイス、MOS型固体撮像デバイス等がある。浴槽3内には、電気泳動媒体であるゲル8を入れておく。ゲル8に電界を加える電界形成手段は陽極5と陰極4とからなり、陽極5と陰極4との間においてゲル8に電界が形成され、これにより陽極5及び陰極4はゲル8中にプライマーを泳動させる泳動手段として機能する。紫外線源7は、下方の固体撮像デバイス2に向かって紫外線(励起光)を出射する光源である。紫外線遮蔽膜10は、アナターゼ型又はルチル型の酸化チタンからなる膜である。紫外線遮蔽膜10は、紫外線を吸収するとともに蛍光(主に可視光波長領域)を透過する性質を有する。
工程(1):塩基配列が既知であるとともに蛍光標識されたプライマーを準備する。プライマーは、未知の塩基配列を有した一本鎖のDNAサンプルに相補的な可能性のある一本鎖DNAであり、PCR増幅されて実質的に同一種の塩基配列の分子が多数存在している。
なお、工程(4)において得られた一本鎖DNAサンプル(図3、図4の場合には、一本鎖DNAサンプル91)、工程(1)において準備したプライマー(図3、図4の場合には、プライマー93)、及び、酵素試薬をゲル8の陰極4寄りに注入し、ゲル8中でPCR法により増幅しても良い。つまり、工程(5)の処理をゲル8中で行っても良い。
詳細には、一本鎖DNAサンプルと相補的なプライマーがある場合には、相補的でないために伸長していないプライマーが相補的であるために伸長したプライマーよりも同じ時間で長い距離泳動するため(図5を参照。)、蛍光強度のピークが二箇所で検出される。このように、陰極4から陽極5にかけて二箇所で蛍光強度のピークが検出された場合には、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的であり、特定の塩基配列(プライマーと相補的な塩基配列)がDNAサンプルに存在することがわかる。例えば、図5の場合には、蛍光強度のピークは伸長したプライマー93(図5では、左側)の位置と、伸長していないプライマー93(図5では、右側)の位置に検出され、プライマー93と相補的な塩基配列が一本鎖DNAサンプル91に存在することがわかる。
その後の工程(7)では、生成物が陽極に向かって泳動する。ここで伸長したプライマーは伸長していないプライマーよりも陽極4により近づく。そのため、伸長したプライマーがある場合には(プライマーの塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに含まれている場合には)、伸長したプライマーの泳動後の位置と、伸長していないプライマーの泳動後の位置との両方で蛍光強度のピークが存するが、伸長したプライマーがない場合には(プライマーの塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに含まれていない場合には)、伸長していないプライマーの泳動後の位置のみでしか蛍光強度のピークが存しない。従って、二箇所で蛍光強度のピークがある場合には、伸長したプライマーの塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに含まれていると判定することができる。一方、一箇所でしか蛍光強度のピークがない場合には、プライマーの塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに含まれていないと判定することができる。
第2の実施の形態における”検査装置、検査方法及び合成装置”について説明する。なお第1の実施の形態と実質的に同様な部分は説明を省略する。第1の実施の形態ではDNAサンプルに対して過剰な量の一種類の塩基配列のプライマーを準備したが、第2の実施の形態ではDNAサンプルに対して過剰な量の塩基配列の互いに異なる複数種のプライマーを準備する。更に、プライマーに、重りとなる所定の重さの不活性分子を結合させるが、結合する重りの重さ(分子量)は塩基配列ごとに異なるようにし、多くとも一種類のプライマーには重りを結合しなくても良い。ここで、重りの重さはプライマーの分子量よりも十分に重くする。また塩基配列がそれぞれ異なる各種プライマーの数は、DNAサンプルの数より過少になる。
即ち、塩基配列の種類ごとに結合されている重りの重さが異なるため、複数種のプライマーに着目すると、結合する重りの重さが重くなるにつれてプライマーの泳動度も低くなるので、塩基配列の種類ごとにプライマーの泳動を観察することができる。その上、或る一種類の塩基配列のプライマーに着目して或る時間だけ泳動させると、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的である場合には、伸長していないプライマーが伸長したプライマーよりも同じ時間で長い距離泳動するため、蛍光強度のピークが二箇所で検出されるが、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的でない場合には、どのプライマーも同じ距離だけ泳動するため、陰極4から陽極5にかけて一箇所で蛍光強度のピークが検出される。このように、或る一種類の塩基配列のプライマーに着目して或る時間だけ泳動させて、蛍光強度のピークが二箇所で検出された場合には、その塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに存在すると判定することができる。一方、或る一種類の塩基配列のプライマーに着目して或る時間だけ泳動させても、蛍光強度のピークが二箇所で検出されない場合には、その塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに存在しないと判定することができる。
また、複数種の塩基配列それぞれについて相補的な配列がDNAサンプルに存在するか否かを同一工程で判定することができる。
第3の実施の形態における”検査装置、検査方法及び合成装置”について説明する。なお第1又は第2の実施の形態と実質的に同様な部分は説明を省略する。
詳細には、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的である場合には、伸長していないプライマーが伸長したプライマーよりも同じ時間で長い距離泳動するため(図12を参照。)、蛍光強度のピークが二箇所で検出される。このように、磁石206の反対側から磁石206にかけて二箇所で蛍光強度のピークが検出された場合には、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的であり、DNAサンプルに特定の塩基配列(プライマーと相補的な塩基配列)が存在することがわかる。
また、ゲル208に電界を発生させていないので、ゲル208が発熱しない。そのため、発熱による蛍光標識のプライマーからの遊離等の現象を防ぎ、安定して判定することができる。
第4の実施の形態における”検査装置、検査方法及び合成装置”について説明する。第3の実施の形態では一種類の塩基配列のプライマーを準備したが、第4の実施の形態では塩基配列の互いに異なる複数種のプライマーを準備する。なお第1又は第2又は第3の実施の形態と実質的に同様な部分は説明を省略する。更に、プライマーに重りを結合させるが、結合する重りの重さは塩基配列ごとに異なるようにし、多くとも一種類のプライマーには重りを結合しなくても良い。ここで、重りの重さ(分子量)はプライマーの分子量よりも十分に重くする。勿論、各種のプライマーには、磁気微粒子及び蛍光標識を付す。
即ち、塩基配列の種類ごとに結合されている重りの重さが異なるため、複数種のプライマーに着目すると、結合する重りの重さが重くなるにつれてプライマーの泳動度も低くなるので、塩基配列の種類ごとにプライマーの泳動を観察することができる。その上、或る一種類の塩基配列のプライマーに着目して或る時間だけ泳動させると、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的である場合には、伸長していないプライマーが伸長したプライマーよりも同じ時間で長い距離泳動するため、蛍光強度のピークが二箇所で検出されるが、一本鎖DNAサンプルがプライマーと相補的でない場合には、どのプライマーも同じ距離だけ泳動するため、磁石206の反対側から磁石206にかけてにかけて一箇所で蛍光強度のピークが検出される。このように、或る一種類の塩基配列のプライマーに着目して或る時間だけ泳動させて、蛍光強度のピークが二箇所で検出された場合には、その塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに存在すると判定することができる。一方、或る一種類の塩基配列のプライマーに着目して或る時間だけ泳動させても、蛍光強度のピークが二箇所で検出されない場合には、その塩基配列と相補的な塩基配列がDNAサンプルに存在しないと判定することができる。
なお、第3実施の形態及び第4実施の形態において、磁石206は浴槽203の一方の面に形成されたが、浴槽203の対向する両壁側のどちらか一方がゲル208にN極の磁界を発生させる磁石で、他方がゲル208にS極の磁界を発生させる磁石であってもよい。
4 … 陰極(泳動手段、電界形成手段)
5 … 陽極(泳動手段、電界形成手段)
7,207 … 紫外線源(光源)
8,208 … ゲル(媒体)
206 … 磁石(泳動手段、磁界形成手段)
Claims (15)
- 蛍光標識を有するプライマーに、重りを有するdNTPを結合して得られる生成物が取り込まれるための媒体が入った槽と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動手段と、
を備えることを特徴とする検査装置。 - 前記泳動手段は、前記媒体に電界を加える電界形成手段であることを特徴とする請求項1に記載の検査装置。
- 前記泳動手段は、前記媒体に磁界を加える磁界形成手段であることを特徴とする請求項1記載の検査装置。
- 前記媒体内の前記蛍光標識が蛍光を発するような励起光を出射する光源を有することを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれか一項に記載の検査装置。
- 前記蛍光標識の蛍光を判別する判別手段を有することを特徴とする請求項4に記載の検査装置。
- 前記生成物は、前記プライマーが前記プライマーと相補的な塩基配列のDNAにアニールして前記dNTPと結合することによって増幅してなるものを有することを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の検査装置。
- 蛍光標識を有するプライマーにdNTPを結合して得られる生成物が取り込まれるための媒体が入った槽と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動手段と、
を備えることを特徴とする検査装置。 - 蛍光標識を有するプライマーに、重りを有するdNTPを結合して得られる生成物を媒体に入れる注入工程と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動工程と、
を含むことを特徴とする検査方法。 - 前記泳動工程は、前記媒体に電界を加える電界形成工程であることを特徴とする請求項8に記載の検査方法。
- 前記泳動工程は、前記媒体に磁界を加える磁界形成工程であることを特徴とする請求項8に記載の検査方法。
- 前記媒体内の前記蛍光標識が蛍光を発するような励起光を出射する励起光出射工程を含むことを特徴とする請求項8〜請求項10のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記蛍光標識の蛍光を判別する判別工程を含むことを特徴とする請求項11に記載の検査方法。
- 前記プライマーと相補的な塩基配列のDNAに前記プライマーがアニールして前記dNTPと結合することによって増幅する増幅工程を含むことを特徴とする請求項8〜請求項12のいずれか一項に記載の検査方法。
- 蛍光標識を有するプライマーと相補的な塩基配列のDNAに、前記プライマーがアニールしてdNTPと結合することによって増幅された生成物を媒体に入れる注入工程と、
前記媒体中のプライマーを泳動させる泳動工程と、
を備えることを特徴とする検査方法。 - 蛍光標識を有するプライマーを相補的な塩基配列のDNAと結合してから重りを有するdNTPを入れて前記蛍光標識を有するプライマーに前記dNTPを結合するための合成用の槽を有することを特徴とする合成装置。
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JP2016510991A (ja) * | 2013-03-11 | 2016-04-14 | エリテックグループ・ベスローテン・フェンノートシャップElitechgroup B.V. | 正確な鎖置換型等温増幅のための方法 |
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