JP2005192452A - Kit for protein unwinding - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活操作・工程に使用される試薬・物質・材料に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために、不活性なタンパク質、あるいは、ある種の原因で立体構造が変化し、失活したタンパク質をリフォールディングさせ、該タンパク質固有の、本来機能を賦活・再生させる操作・工程において用いられる試薬・物質・材料、いわゆる試剤キット、及び該キットを利用した不活性タンパク質の活性化、すなわち、活性タンパク質の製造・生産に関するものである。本発明は、従来、例えば、生化学品、医薬品製造の技術分野において、大腸菌等の遺伝子発現系を利用して生産した高次構造未形成タンパク質を、リフォールディングさせることが種々検討されているが、それらの多くは、実用上解決すべき種々の問題点を有していることを踏まえ、鎖長の長短を問わず、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性の高い、しかも、繰り返し使用可能な低コストで高効率のリフォールディングキットを開発し、提供することを可能にしたものであり、該タンパク質の本来の機能・活性を賦活させることが可能な新しいキット、並びに、それを用いる新しい機能賦活方法を提供するものとして有用である。 従来、大腸菌等の発現系で得られるタンパク質は、一般には、立体構造が無秩序であり、該タンパク質の持つ本来の機能・物性を持たず、活性を示さないという問題があったが、本発明のキットは、上記タンパク質に代表される不活性タンパク質の機能・活性を賦活させ、所定の機能・活性を有するタンパク質へと再生させる、革新的なタンパク質製造・生産技術を提供するものである。 The present invention relates to reagents / substances / materials used in the function activation operation / process of an inactive protein. More specifically, since a higher-order structure is not formed, an inactive protein or a certain kind Reagents, substances, and materials used in operations / processes that cause the conformation of the protein to change, refold the inactivated protein, and activate and regenerate the intrinsic function of the protein, so-called reagent kits, and the kits It relates to the activation of the inactive protein utilized, that is, the production and production of the active protein. The present invention has been variously studied for refolding higher-order unstructured proteins produced by using gene expression systems such as Escherichia coli in the technical fields of biochemicals and pharmaceutical production, for example. In view of the fact that many of them have various problems to be solved practically, regardless of the length of the chain length, they can be applied to various high-order structure unformed and denatured / inactivated proteins. It is possible to develop and provide a low-cost, high-efficiency refolding kit that is highly general, universal, and can be used repeatedly, and activates the original functions and activities of the protein. It is useful as a new kit that can be used, and a new function activation method using the same. Conventionally, proteins obtained by expression systems such as Escherichia coli generally have a problem that the three-dimensional structure is disordered, the protein does not have the original functions and properties, and does not exhibit activity. The kit provides an innovative protein production / production technology that activates the function / activity of an inactive protein typified by the above-mentioned protein and regenerates it into a protein having a predetermined function / activity.
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。 It is not a gene that actually acts and works in vivo, but a protein made from them. Therefore, elucidation and analysis of protein functions and structures are extremely important, for example, directly related to disease treatment and drug discovery. For this reason, various proteins are synthesized and produced by various methods, their structures are examined, and action mechanisms and roles in the living body are elucidated. Now, it is well known that the functions of proteins are determined not only by the sequence and chain length of the amino acids constituting them, but also by the ordered three-dimensional structure (higher order structure) taken by them.
タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。 Protein synthesis is generally performed using expression systems such as Escherichia coli, insect cells, and mammalian cells. In the synthesis by insect cells and mammalian cells, the resulting protein is often soluble, with a higher order structure controlled, an ordered three-dimensional structure. However, these methods have a drawback that the operation of separation and purification is very complicated, and it takes time to obtain the target protein, resulting in an increase in cost and an extremely small amount of protein to be obtained. In contrast, protein synthesis by E. coli is easy to operate, requires less time to obtain the target protein, and does not cost much. For this reason, at present, a method using E. coli into which a gene code responsible for the synthesis of a target protein is incorporated has become the mainstream of protein synthesis, and a production process is being established.
ところが、ヒト等の高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわち、アミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序が無く、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわち、アミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆる封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。 However, when the proteins of higher organisms such as humans are synthesized in the E. coli expression system, the amino acid binding order and number, that is, the amino acid chain length, can be obtained as designed, but the three-dimensional structure is not ordered. Thus, a protein whose higher-order structure is not controlled, that is, an insoluble protein called an inclusion body in which amino acid chains are entangled is obtained. As a matter of course, the inclusion body of this insoluble protein does not have the desired function and performance and does not exhibit activity. For this reason, in the production process using E. coli, it is necessary to unravel the inclusion body, prepare a higher-order structure, and convert it into a soluble protein having an ordered three-dimensional structure, that is, refolding (rewinding) the inclusion body.
この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。 This type of refolding is an extremely important technique that can be applied not only to the production of proteins by E. coli, but also to the regeneration of proteins that have been inactivated due to certain causes such as thermal history. Therefore, this refolding has been extensively studied and various methods have been proposed, but most of them have a low refolding rate and a certain limited protein (especially a specific protein having a low molecular weight). In many cases, this refolding is general, universal, and has a high refolding rate applicable to various proteins. It is not an efficient and economical method.
最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（Hampton Research社製 FoldItキット）である。一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを単に希釈して行くことで界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせる（Hampton Research社製 FoldItキット）ものである。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のSodium N-lauroyl sarcosinate溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のTriton X-100で希釈し巻き戻す（非特許文献１）方法等、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。 The most commonly used refolding operation from the oldest is dialysis and dilution. In the former, the protein is dissolved in an aqueous solution containing a surfactant or denaturant and dialyzed against a buffer solution that does not contain a surfactant or denaturant to reduce the concentration of the surfactant or denaturant. Refolding (Hampton Research FoldIt kit). On the other hand, in the latter case, after dissolving the protein in an aqueous solution containing a surfactant or denaturant, the concentration of the surfactant or denaturant is lowered and refolded by simply diluting the protein (FoldIt by Hampton Research). Kit). These are common, but in addition, the glutathione S-transferase fusion protein is dissolved in a solution of the surfactant Sodium N-lauroyl sarcosinate, diluted with 1-2% Triton X-100 and unwound (Non-patent) There is also a method of refolding using a diluent such as literature 1).
透析と希釈の両方に対し、Hampton Research社から使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ligand binding domains from glutamate and kainate receptors、Lysozyme、 Carbonic anhydrase B等の極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められている(非特許文献２)に過ぎず、試行錯誤法の域にとどまっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、それを他のタンパク質に適用するとほとんどうまくいかないのが通例である。 Disposable kits are commercially available from Hampton Research for both dialysis and dilution, and these procedures allow refolding with limited proteins such as Ligand binding domains from glutamate and kainate receptors, Lysozyme, Carbonic anhydrase B, etc. It is not an exaggeration to say that it is only allowed to occur (Non-Patent Document 2) and remains in the field of trial and error. Therefore, even if it happens to be successful, it usually does not work well when applied to other proteins.
リフォールディングに吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３）。しかし、この方法では、リフォールディングは必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では満足できる結果が得られないのが通常である。構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である、分子シャペロンGroELを固定したカラムに、８Mの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２M含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こることも報告されている（非特許文献４）。しかし、これらは、Cyclophilin A等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャぺロンを用いる場合は、それがある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。 The use of an adsorption separation column for refolding has also been tried. When a protein denatured with urea / guanidine hydrochloride and thioredoxin are subjected to gel filtration, the protein is unwound during gel filtration (Non-patent Document 3). However, refolding is not always sufficient with this method, and other proteins usually do not give satisfactory results. When a protein that has been solubilized with 8M urea is adsorbed to a column immobilized with molecular chaperone GroEL, which is a type of protein that promotes unwinding of a protein with a broken structure, and eluted with a solution containing 2M each of potassium chloride and urea. It has also been reported that elution of the eluted protein occurs (Non-patent Document 4). However, these are only found in very limited proteins such as Cyclophilin A. In particular, when a molecular chaperone is used, since it is a certain type of template, the fact that it does not conform to the shape of the template is completely useless.
また、リフォールディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、GroEL、DsbA（大腸菌のdisulfide oxidereductase）及びPPI（human proline cis-trans isomerase）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質（Scorpion toxin Cn5）を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こる（非特許文献５）ことも報告されている。しかしながら、これについては、Scorpion toxin Cn5等の特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑でコスト高となるという問題もある。 In addition, a protein (Scorpion toxin Cn5) denatured with guanidine hydrochloride on a resin simultaneously fixed with three proteins, GroEL, DsbA (Escherichia coli disulfide oxide reductase) and PPI (human proline cis-trans isomerase), which are thought to be involved in promoting refolding. It is also reported that when protein is mixed, this protein rewinding occurs on the resin (Non-patent Document 5). However, in addition to the disadvantage that can be applied only to specific proteins such as Scorpion toxin Cn5, there is also a problem that the preparation of a resin in which three types of proteins are immobilized is complicated and expensive.
カラム上の固定物質として、巻き戻しタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したHis6-タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６）。本法の適用がこのタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑でコスト高となることは同じである。 In some cases, a metal chelate is used in place of the unwinding protein as an immobilizing substance on the column. When a His6-tag fusion protein dissolved and modified with an aqueous solution containing guanidine hydrochloride and urea is adsorbed on a resin to which nickel chelate is fixed and washed with a buffer solution not containing a denaturant, the fusion protein unwinds (non-patented). Reference 6). The application of this method is limited to this protein, and the resin preparation is complicated and expensive.
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質が巻き戻るとの報告（非特許文献７〜９）もある。しかし、この方法は、carbonic anhydrase B 等で成功しているに過ぎない。しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。 When β-cyclodextrin or cycloamylose is used as an artificial chaperone and a protein denatured with a surfactant is mixed into this chaperone solution, the surfactant is taken up by the artificial chaperone and the protein is unwound in this process. There are also reports (Non-Patent Documents 7 to 9). However, this method is only successful with carbonic anhydrase B and the like. Moreover, it is not a method that can be repeated, but is expensive.
このように、従来、種々のリフォールディングの方法や、リフォールディング機能を有する物質・材料が報告され、更には、それらから構成されるリフォールディングキットが市販されているが、これらの方法・物質材料並びにキットには、上記のような問題があるのが実情であり、そのために、当技術分野においては、鎖長の長短を問わず、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性の高い、しかも、繰り返し使用可能な低コストの高効率のリフォールディング物質材料並びに方法、すなわち、経済的で高性能なリフォールディング技術、並びにそれを基とするリフォールディングキットを開発することが急務の課題となっていた。 Thus, various refolding methods and substances / materials having a refolding function have been reported in the past, and further, refolding kits composed of these have been commercially available. In addition, the kit has the problems as described above. Therefore, in this technical field, it is applied to various high-order structure unformed and denatured / inactivated proteins regardless of the chain length. Possible, general, universal and low-cost, high-efficiency refolding materials and methods that are reusable, ie, economical and high-performance refolding technology, and refolding based on it Developing the kit was an urgent issue.
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上述の課題を解決することが可能な、新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を進めると共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等のバイオポリマーの、ゼオライト等の金属酸化物上への吸着状況を詳細に調べ（Chem. Eur. J. Vol. 7 (2001) 1555-1560）、タンパク質の分離精製材料並びに方法を鋭意研究している過程で、ＢＥＡ構造のゼオライト、すなわち、ゼオライトベータが変性タンパク質の巻き戻し機能を有することを見出し、ゼオライトベータからなるリフォールディング剤を開発すると同時に、それを必須構成成分とするタンパク質リフォールディングキットを開発するに至った。更に、該リフォールディング剤が、大腸菌等の発現系で生産した高次構造未形成タンパク質あるいは熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質等、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質等の巻き戻しにも適用できることを認め、本発明、すなわち、一般性、普遍性の高いタンパク質のリフォールディング技術並びにリフォールディングキットを完成するに到った。本発明は、新規リフォールディングキットを提供することを目的とするものである。 Under such circumstances, the present inventors proceeded with intensive research and development with the goal of developing a new refolding technology capable of solving the above-mentioned problems in view of the above-described conventional technology. , DNA, RNA, protein, and other biopolymers adsorbed on metal oxides such as zeolites (Chem. Eur. J. Vol. 7 (2001) 1555-1560) In the course of earnestly researching the method, it has been found that a zeolite having a BEA structure, that is, zeolite beta, has a function of unwinding denatured protein, and at the same time developing a refolding agent comprising zeolite beta, To develop a protein refolding kit. Furthermore, the refolding agent includes various proteins including large proteins with a molecular weight exceeding 100,000, such as non-conformation proteins produced in an expression system such as Escherichia coli or proteins deactivated due to a certain cause such as heat history. The present invention, that is, a protein refolding technique and a refolding kit with high generality and universality, has been completed. The object of the present invention is to provide a novel refolding kit.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）高次構造が無秩序なため、不活性であるタンパク質の高次構造を整え、活性にする、タンパク質の機能賦活（リフォールディング）操作・工程で用いる試剤キットであって、ＢＥＡ構造のゼオライト（ゼオライトベータ）からなるリフォールディング剤を構成要件として含むことを特徴とするタンパク質リフォールディングキット。
（２）キットが、上記ゼオライトベータからなるリフォールディング剤、タンパク質変性剤及びｐＨ調整剤を基本構成成分とし、更に、タンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成防止剤、界面活性剤及びリフォールディング因子のうちの１種又は２種以上を含む組み合わせから構成されることを特徴とする上記（１）に記載のリフォールディングキット。
（３）ゼオライトベータの骨格構造が、ケイ素、酸素及びそれ以外の１種又は２種以上の元素を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のリフォールディングキット。
（４）ゼオライトベータの骨格構造が、ケイ素と酸素、又はケイ素とアルミニウムと酸素のみからなることを特徴とする上記（１）から（３）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
（５）ゼオライトベータが、アンモニウム類を含むことを特徴とする上記（１）から（４）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
（６）アンモニウム類が、アンモニウムイオン、有機アミン及び／又は酸アミドであることを特徴とする上記（５）に記載のリフォールディングキット。
（７）有機アミンが、テトラアルキルアンモニウムであることを特徴とする上記（６）に記載のリフォールディングキット。
（８）キット中のタンパク質変性剤が、塩酸グアニジンであることを特徴とする上記（２）から（７）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
（９）キット中のｐＨ調整剤が、トリスアミノメタン三塩酸塩（TrisHCl）及び／又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（HEPES）であることを特徴とする上記（２）から（８）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
（１０）キット中のタンパク質Ｓ−Ｓ架橋形成防止剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン又はチオフェノールであることを特徴とする上記（２）から（９）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
（１１）キット中の、界面活性剤及びリフォールディング因子が、ポリエチレングリコール、Ficol170、Ficol1400、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Dextran T-500、Tween20、Tween40、Tween60、NP-40、SB3-14、SB12、CTAB及びTritonX-100のうちの１種又は２種以上から選ばれることを特徴とする上記（２）から（１０）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
（１２）キットが、HEPES、ハロゲン化アルカリ、２−メルカプトエタノール、リフォールディング因子及び界面活性剤から構成される溶液（リフォールディングバッファー）、上記リフォールディング剤、塩酸グアニジン、TrisHCl及び２−メルカプトエタノールからなるキットであるか、又は、該リフォールディングバッファー、該リフォールディング剤、塩酸グアニジン、TrisHCl、２−メルカプトエタノール及びハロゲン化アルカリからなるキットであることを特徴とする上記（１）から（７）のいずれかに記載のリフォールディングキット。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A reagent kit used in a protein functional activation (refolding) operation / process for preparing and activating a higher-order structure of an inactive protein due to disordered higher-order structure, and having a BEA structure zeolite A protein refolding kit comprising a refolding agent comprising (zeolite beta) as a constituent element.
(2) The kit comprises a refolding agent, a protein denaturant and a pH adjuster comprising the zeolite beta as basic constituents, and further includes a protein SS cross-linking inhibitor, a surfactant, and a refolding factor. It is comprised from the combination containing a seed | species or 2 or more types, The refolding kit as described in said (1) characterized by the above-mentioned.
(3) The refolding kit according to (1) or (2) above, wherein the framework structure of zeolite beta contains silicon, oxygen, and one or more other elements.
(4) The refolding kit according to any one of (1) to (3) above, wherein the framework structure of zeolite beta is composed only of silicon and oxygen, or silicon, aluminum and oxygen.
(5) The refolding kit according to any one of (1) to (4), wherein the zeolite beta contains ammoniums.
(6) The refolding kit according to (5), wherein the ammonium is an ammonium ion, an organic amine and / or an acid amide.
(7) The refolding kit according to (6) above, wherein the organic amine is tetraalkylammonium.
(8) The refolding kit according to any one of (2) to (7) above, wherein the protein denaturant in the kit is guanidine hydrochloride.
(9) The above characterized in that the pH adjuster in the kit is trisaminomethane trihydrochloride (TrisHCl) and / or 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ( The refolding kit according to any one of 2) to (8).
(10) The protein SS crosslinking inhibitor in the kit is 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, cystine or thiophenol, according to any one of (2) to (9) above Refolding kit.
(11) The surfactant and refolding factor in the kit are polyethylene glycol, Ficol170, Ficol1400, polyphosphate, sodium dodecyl sulfate (SDS), sucrose, glucose, glycerol, inositol, cyclodextrin, amylose, Dextran T-500 Any one of (2) to (10) above, which is selected from one or more of Tween20, Tween40, Tween60, NP-40, SB3-14, SB12, CTAB and TritonX-100 The refolding kit described in 1.
(12) A kit comprising a solution (refolding buffer) comprising HEPES, alkali halide, 2-mercaptoethanol, refolding factor and surfactant, the above refolding agent, guanidine hydrochloride, TrisHCl and 2-mercaptoethanol Or a kit comprising the refolding buffer, the refolding agent, guanidine hydrochloride, TrisHCl, 2-mercaptoethanol, and an alkali halide as described in (1) to (7) above. The refolding kit according to any one of the above.
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の不活性タンパク質の機能賦活を行う試剤群、すなわち、リフォールディングキットの対象となるタンパク質は、高次構造が整っていない不活性なタンパク質全てであるが、一般には、大腸菌等の発現系で得られる立体構造が無秩序なタンパク質、いわゆるインクルージョンボディ、あるいは熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質である。本発明のキットは、該タンパク質の、該キット中のゼオライトベータからなるリフォールディング剤への吸着・脱離過程で、該タンパク質の立体構造をリフォールディングし、該タンパク質本来の機能の賦活・付与を行うが、該リフォールディング剤の本能力は、必ずしもそれに限定されるものではなく、通常、次のような操作で発揮される。換言すれば、次のような操作で不活性タンパク質の機能賦活が行われる。すなわち、この操作は、まず、該タンパク質を、変性剤や界面活性剤等を含む溶液に分散溶解し、この後、該リフォールディング剤を含む溶液との混合や、該リフォールディング剤充填カラムへの注入により、該タンパク質を該リフォールディング剤に吸着させ、次いで、該リフォールディング剤から該タンパク質を脱着させる手順で行われる。
Next, the present invention will be described in more detail.
A group of reagents for activating the function of the inactive protein of the present invention, that is, the proteins to be subjected to the refolding kit are all inactive proteins having no higher-order structure, but generally an expression system such as Escherichia coli Proteins with three-dimensional structures obtained in (1) are inactivated due to a certain cause such as so-called inclusion bodies or thermal history. The kit of the present invention refolds the three-dimensional structure of the protein in the process of adsorption / desorption of the protein to the refolding agent comprising zeolite beta in the kit, and activates / provides the original function of the protein. However, this ability of the refolding agent is not necessarily limited thereto, and is usually exhibited by the following operation. In other words, the function activation of the inactive protein is performed by the following operation. That is, in this operation, first, the protein is dispersed and dissolved in a solution containing a denaturing agent, a surfactant, etc., and then mixed with a solution containing the refolding agent, or is applied to the column packed with the refolding agent. The procedure is performed by adsorbing the protein to the refolding agent by injection, and then desorbing the protein from the refolding agent.
該リフォールディング剤に吸着前のタンパク質の分散溶媒としては、一般には、それが大腸菌等の発現系で生産されること、タンパク質は、通常、水溶液中で使われることが多く、失活した場合でも水溶液中にあることが多いことから、好ましくは、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該タンパク質と反応を起こさないもの、及び該タンパク質の立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールやポリエーテル類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 As a protein dispersion solvent before adsorption to the refolding agent, it is generally produced in an expression system such as Escherichia coli, and the protein is usually used in an aqueous solution. Water is preferably used because it is often in an aqueous solution. However, the present invention is not necessarily limited to this, and there is basically no problem as long as it does not cause a reaction with the protein and does not change the three-dimensional structure of the protein into an unintentional form. In some cases, these solvents can be used alone or mixed with water. Typical examples of this type of solvent include, but are not limited to, monohydric and polyhydric alcohols and polyethers.
該タンパク質の吸脱着は、一般には、インクルージョンボディ等の縺れ絡んだタンパク質鎖長を、解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、及び／又は、タンパク質鎖長中に不本意に生成したＳ−Ｓ結合（架橋）を切断するために、ある種の還元剤の存在下で行われる。したがって、本発明のキットは、ゼオライトベータからなるリフォールディング剤の他、変性剤やｐＨ調整剤を含み、更には、これらの他に、リフォールディング剤からのタンパク質の脱着促進と、リフォールディング後の再インクルージョンボディ化を防ぐためのリフォールディング因子及び／又は界面活性剤、Ｓ−Ｓ架橋形成防止（阻害）剤から、構成されている。 The protein adsorption / desorption generally involves denaturing agents, surfactants, pH adjusters, refolding factors, etc., in order to easily unwind and unwind the entangled protein chain length of the inclusion body, etc. And / or in the presence of certain reducing agents in order to cleave S—S bonds (crosslinks) that are inadvertently generated in the protein chain length. Therefore, the kit of the present invention contains a denaturing agent and a pH adjusting agent in addition to the refolding agent composed of zeolite beta, and in addition to these, protein desorption promotion from the refolding agent and after refolding It is composed of a refolding factor and / or a surfactant for preventing re-inclusion body formation, and an SS crosslinking formation inhibitor (inhibition).
本発明のキット中の、この種の変性剤やｐＨ調整剤の典型例としては、例えば、それぞれ、塩酸グアニジンや、トリスアミノメタン塩酸塩（TrisHCl）及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ：HEPES）等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、同様な作用を持つものはいずれも使用可能である。 Typical examples of this type of denaturing agent and pH adjusting agent in the kit of the present invention include, for example, guanidine hydrochloride, trisaminomethane hydrochloride (TrisHCl) and 4- (2-hydroxyethyl) -1- Examples include piperazine ethanesulfonic acid (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid: HEPES). However, these are not limited to these, and any of those having the same action can be used.
また、本発明のキット中の、リフォールディング因子や界面活性剤の典型例としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG20K、PEG800、PEG200、PEG3350）、Ficol170、Ficol1400、ポリ燐酸、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、シクロデキストリン、アミロース、Dextran T-500、Tween20、Tween40、Tween60、NP-40、SB3-14、SB12、CTAB及びTritonX-100等を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、同様な作用を持つものはいずれも使用可能である。 In addition, as typical examples of the refolding factor and the surfactant in the kit of the present invention, for example, polyethylene glycol (PEG20K, PEG800, PEG200, PEG3350), Ficol170, Ficol1400, polyphosphoric acid, sodium dodecyl sulfate (SDS), Examples include, but are not limited to, sucrose, glucose, glycerol, inositol, cyclodextrin, amylose, Dextran T-500, Tween20, Tween40, Tween60, NP-40, SB3-14, SB12, CTAB and TritonX-100. Anything that has a similar action can be used.
不本意に生成したS-S架橋を切断し、本来の構造に戻す還元剤としては、安価で入手し易いことから、通常は、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンあるいはチオフェノールが用いられるが、これらに限定されるものではなく、同様な作用を行うものは全て使用可能である。 As a reducing agent that cleaves the unintentionally generated SS bridge and returns it to its original structure, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, cystine, or thiophenol is usually used because it is inexpensive and readily available. However, the present invention is not limited to these, and anything that performs the same action can be used.
当然のことながら、タンパク質鎖長が解きほぐれやすい場合や、不本意にＳ−Ｓ架橋が生成しない場合は、変性剤や界面活性剤、及び／又は防止剤を必ずしも使う必要がないので、これらの存在は常に必須とは限らず、状況に応じ適宜選択してキットとして用いられる。また、キットを構成する成分の量は、それを用いるときの状況に応じ適宜決められることになるが、本発明のキットは、通常は、ゼオライトベータからなるリフォールディング剤、塩酸グアニジン（変性剤）及びTrisHClとHEPES（ｐＨ調整剤）を有し、更に、２−メルカプトエタノールと前記リフォールディング因子や界面活性剤の１種あるいは２種以上より構成されのが好ましい。 As a matter of course, when the protein chain length is easily unraveled or when the S—S crosslinking is not generated unintentionally, it is not always necessary to use a denaturant, a surfactant, and / or an inhibitor. Presence is not always essential, and can be appropriately selected according to the situation and used as a kit. The amount of the components constituting the kit is appropriately determined according to the situation when it is used, but the kit of the present invention is usually a refolding agent composed of zeolite beta, guanidine hydrochloride (modifier). And TrisHCl and HEPES (pH adjuster), and further preferably composed of 2-mercaptoethanol and one or more of the above-mentioned refolding factors and surfactants.
一般に、本キットを用いてのリフォールディング操作・工程中のタンパク質の脱着過程では、通常、該キット中の試剤（リフォールディング因子や界面活性剤）による置換吸着が用いられるが、基本的には、該タンパク質の脱着後の機能賦活を阻まない操作であればいかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。 In general, in the protein desorption process during the refolding operation / process using this kit, substitution adsorption by the reagent (refolding factor or surfactant) in the kit is usually used. Any operation is applicable as long as it does not hinder the function activation after desorption of the protein, and is not particularly limited. Therefore, pH change, temperature change, etc. can be used, and these and substitution adsorption can be used together.
ところで、置換吸着の際、該タンパク質の脱着を促す物質として、従来から、カラムクロマトグラフィーの溶離では、ハロゲン化アルカリ等の塩が頻繁に用いられており、これらの併用で顕著な効果が得られる場合も多い。また、本発明のキット構成試剤を用いる時に、キット構成試剤間の反応等、特に問題や支障が起きない場合は、キット構成試剤の幾つかをあらかじめ合わせておき、一つの試剤としておくこともできる。例を挙げれば、HEPES、ハロゲン化アルカリ（例えば、塩化ナトリウム）、２−メルカプトエタノール、リフォールディング因子（例えば、ポリエチレングリコールのPEG20K、 PEG800、PEG200、PEG3350のうちの１種や、Ficol170あるいはβ−シクロデキストリン）及び界面活性剤（例えば、Tween20、 Tween40、Tween60、NP-40あるいはTritonX-100）からなる溶液をリフォールディングバッファーとして一纏めにし、本発明のキット構成試剤の一つにすることも可能である。これは、リフォールディング操作・工程でしばしば大きな利便となる。 By the way, as a substance that promotes desorption of the protein during substitution adsorption, conventionally, salts such as alkali halides have been frequently used in column chromatography elution, and the combined use of these salts provides a remarkable effect. There are many cases. In addition, when using the kit component reagent of the present invention, if there is no problem or trouble, such as a reaction between the kit component reagents, some of the kit component reagents may be combined in advance and used as one reagent. . Examples include HEPES, alkali halides (eg, sodium chloride), 2-mercaptoethanol, refolding factors (eg, polyethylene glycol PEG20K, PEG800, PEG200, PEG3350, Ficol170 or β-cyclo Dextrin) and a surfactant (for example, Tween20, Tween40, Tween60, NP-40 or TritonX-100) can be combined into a refolding buffer to form one of the kit components of the present invention. . This is often a great convenience in refolding operations / processes.
更に言えば、該タンパク質の該キット中のリフォールディング剤への吸着、あるいはそれからの脱着を促すために、上記操作と併用して種々の付加的操作を行うこともできる。このような操作の典型例には、例えば、超音波やマイクロ波の照射や、磁場や電場の印加がある。以上述べてきた、本発明のキットを用いての手順・操作により、該リフォールディング剤の持つタンパク質巻き戻し能が高度に発揮されることになり、大腸菌等の発現系を用いて生産した高次構造未形成タンパク質、並びに、ある種の原因で失活したタンパク質にリフォールディングが起き、それらのタンパク質が本来持つはずの機能が速やかに賦活される。 Furthermore, in order to promote adsorption of the protein to the refolding agent in the kit or desorption from the refolding agent, various additional operations can be performed in combination with the above operation. Typical examples of such operations include irradiation of ultrasonic waves and microwaves, and application of magnetic fields and electric fields. By the procedure and operation using the kit of the present invention described above, the protein unwinding ability of the refolding agent will be demonstrated to a high degree, and the higher order produced using an expression system such as Escherichia coli. Refolding occurs in unstructured proteins as well as proteins that have been deactivated for some reason, and the functions that these proteins originally have are quickly activated.
以上述べてきた、不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を発揮するリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータとしては、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ（例えば、商品名ＨＳＺ−９３０ＮＨＡ、東ソー社製）、文献等に従い自前で合成・調製したゼオライトベータ（Zeolites, Vol. 11 (1991) 202.参照）、それらを、焼成して得られるゼオライトベータ、該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム含有骨格置換ゼオライトベータ等が挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には、全て該機能・能力を有しており、該リフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。 As a typical example of the zeolite having the BEA structure, so-called zeolite beta, which constitutes the refolding agent that exhibits the activity activating function of the inactive protein and the ability to unwind the denatured protein as described above, typical examples of the zeolite beta are: (For example, trade name HSZ-930NHA, manufactured by Tosoh Corporation), zeolite beta synthesized and prepared in accordance with literatures etc. (see Zeolites, Vol. 11 (1991) 202.), zeolite beta obtained by calcining them, Zeolite beta having ammonium and ammonium such as various aliphatic and / or aromatic ammonium in the space of the zeolite, and framework-substituted zeolite beta in which a part of the framework silicon forming the zeolite is changed to another metal , The ammonium-containing framework-substituted zeolite beta and the like, As long as it has an Olite beta framework structure, it basically has all of these functions and abilities, and the zeolite beta constituting the refolding agent is not necessarily limited to those listed here. is not.
ところで、該リフォールディング剤の該機能・能力は、不活性並びに変性タンパク質の該リフォールディング剤への接触、すなわち、吸着・脱離で発揮され、この際には、リフォールディング剤表面と対象タンパク質との間の親和性が重要となる上に、また、該タンパク質の吸着・脱離は、その分散溶媒、分散溶媒中の変性剤や界面活性剤並びにリフォールディング因子、更には、分散溶媒のｐＨ等で影響される場合も多いので、対象とするタンパク質及びそれを含む溶液の成分状況等に応じて、該リフォールディング剤のリフォールディング能は、該リフォールディング剤を構成する前述の種々のゼオライトベータで、しばしば異なる。しかしながら、総じて、アンモニウム類を含むゼオライトベータより構成されるリフォールディング剤は、それを含まないものより高いリフォールディング能を示すので、該リフォールディング剤としては、アンモニウム類を含むゼオライトベータ及びアンモニウム類を含む骨格置換ゼオライトベータからなるリフォールディング剤を用いる方が好ましいことがしばしばである。 By the way, the function / capability of the refolding agent is exhibited by inactivation and contact of the denatured protein with the refolding agent, that is, adsorption / desorption. In this case, the surface of the refolding agent, the target protein, In addition, the adsorption / desorption of the protein is caused by the dispersion solvent, the denaturing agent and surfactant in the dispersion solvent, the refolding factor, the pH of the dispersion solvent, etc. In many cases, the refolding ability of the refolding agent depends on the various zeolite betas constituting the refolding agent, depending on the target protein and the component status of the solution containing the protein. Often different. However, as a whole, refolding agents composed of zeolite beta containing ammoniums show higher refolding ability than those not containing them, so that the refolding agents include zeolite beta containing ammoniums and ammoniums. It is often preferred to use a refolding agent consisting of a framework-substituted zeolite beta.
該リフォールディング剤を構成するゼオライトベータに含有されるべきアンモニウム類としては、該ゼオライトの有する空間中に留まり易いアンモニウム類、例えば、アンモニウムイオン、アルキル基がメチル、エチル、プロピル及びブチル等のモノ、ジ、トリ及びテトラアルキルアンモニウムイオン、更には、５員環、６員環及び７員環の脂肪族アミン及び芳香族アミンのアンモニウムイオン、より詳しくは、ピペリジュムイオン、アルキルピペリジュムイオン、ピリジニウムイオン、アルキルピリジウムイオン、アニリンイオン、Ｎ−アルキルアニリンイオン等を挙げることができ、また、酸アミドとしての、例えば、フォルムアミド、アセトアミド及びこれらのＮ―アルキル置換体を挙げることができるが、基本的には、ゼオライトベータの有する細孔中に入ることが可能なアンモニウム類であればいずれでもよく、ここに例示したアンモニウム類に限定されるものではない。 Examples of ammoniums to be contained in the zeolite beta constituting the refolding agent include ammoniums that are likely to remain in the space of the zeolite, such as ammonium ions, monovalent alkyl groups such as methyl, ethyl, propyl, and butyl, Di-, tri- and tetraalkylammonium ions, and further ammonium ions of 5-membered, 6-membered and 7-membered aliphatic amines and aromatic amines, more specifically piperidium ions, alkyl piperidium ions, pyridinium ions , Alkylpyridinium ions, aniline ions, N-alkylaniline ions, and the like, and as acid amides, for example, formamide, acetamide, and N-alkyl substituted products thereof may be mentioned. In particular, the zeolite base May be any ammonium compound which can enter into the pores with the data, it is not limited to the exemplified ammoniums here.
該リフォールディング剤を構成するゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般にはケイ素と酸素、あるいはケイ素とアルミニウムと酸素であるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ、及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性タンパク質の活性賦活機能を行うリフォ−ルディング剤となり得る。該ゼオライトベータの骨格ケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的にゼオライトベータの構造を破壊しないものであればいずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性並びに変性タンパク質のリフォールディング剤となり得ることは同様である。 The elements that form the framework of zeolite beta constituting the refolding agent are generally silicon and oxygen, or silicon, aluminum, and oxygen, but zeolite beta in which a part of silicon or aluminum is substituted with other elements, and Substituted zeolite beta containing the ammoniums in the pores can also serve as a refolding agent that performs the activity activation function of the inactive protein. Typical examples of the zeolite beta that can be replaced with the framework silicon include aluminum, boron, phosphorus, gallium, tin, titanium, iron, cobalt, copper, nickel, zinc, chromium, vanadium, and the like. It is not limited to these, and any one that basically does not destroy the structure of zeolite beta may be used. Further, regarding the substitution amount, any substitution amount may be used as long as it does not destroy the structure of zeolite beta, and the substitution zeolite beta can be a refolding agent for inert and denatured proteins. is there.
本発明のキットの必須成分である、リフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、いずれも熱安定性、化学安定性に優れており、しかも、安価であるうえ、繰り返し使用が可能である。本発明のキット並びにそれを用いる不活性並びに変性タンパク質の機能賦活方法は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとって極めて有用であり、その技術的、経済効果は計り知れないものがある。 Zeolite beta constituting the refolding agent, which is an essential component of the kit of the present invention, is excellent in thermal stability and chemical stability, is inexpensive, and can be used repeatedly. The kit of the present invention and the method for activating the function of inactive and denatured proteins using the kit are extremely useful for, for example, biochemical production and pharmaceutical production, and their technical and economic effects are immeasurable.
本発明は、不活性タンパク質の機能を賦活する操作・工程に用いる試剤キット、並びにその使用方法に係わるものであり、本発明によって、１）タンパク質の種類を問わず広範な不活性タンパク質に対して、それらの本来の機能を賦活させる万能的試剤群、すなわち、キットを選定できる、２）このキットを用いて、前記タンパク質、例えば、大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいは、ある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質を処理することにより、それらのタンパク質の本来の機能・活性をリフォールディングにより賦活させることができる、３）本キットは、インクルージョンボディのタンパク質にも効力を有し、これを用いるインクルージョンボディの効率的なリフォールディング方法として有用である、４）本キットを用いることによる不活性タンパク質の機能賦活方法は、タンパク質を構成するアミノ酸の鎖長・配列を問わず種々の変性タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的方法として提供される、５）本キットの必須成分であるリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、すなわち、ゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し使用可能である、６）本キットを用いる不活性タンパク質の機能賦活方法は、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質のリフォールディングに適用できる、７）例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本キットによる不活性タンパク質の機能賦活とを組み合わせることにより、高次構造が制御されて該タンパク質固有の本来機能が備わったタンパク質を生産する、新規の活性タンパク質製造プロセスを提案・確立することができる、という格別の効果が奏される。 The present invention relates to a reagent kit used in an operation / process for activating the function of an inactive protein, and a method for using the kit. According to the present invention, 1) a wide range of inactive proteins regardless of the type of protein. A versatile reagent group that activates their original functions, that is, a kit can be selected. 2) With this kit, the higher-order structure produced in the expression system of the protein, for example, E. coli is not formed. Therefore, by treating an inactive protein or a protein deactivated due to a change in the three-dimensional structure due to a certain cause, the original function / activity of the protein can be activated by refolding. ) This kit is also effective for inclusion body proteins. 4) The function activation method of an inactive protein by using this kit is applicable to various denatured proteins regardless of the chain length and sequence of amino acids constituting the protein. 5) ZEA zeolite that constitutes the refolding agent that is an essential component of the kit, ie, zeolite beta, is provided as an efficient and efficient refolding method. In addition, the function activation method of the inactive protein using this kit, which can be used repeatedly, can be applied to the refolding of various conformationally disordered proteins including large proteins with a molecular weight exceeding 100,000. 7) For example, Protein synthesis process by E. coli expression system and inactive protein by this kit In combination with the functional activation of the protein, it is possible to propose and establish a novel active protein production process in which a higher-order structure is controlled to produce a protein with inherent functions inherent to the protein. Played.
次に、実施例及び比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等によって何ら制約を受けるものではない。 Next, the present invention will be specifically described based on examples and comparative examples. However, the present invention is not limited by the following examples.
（実施例及び比較例）
以下、本実施例では、大腸菌発現系生産タンパク質及び変性タンパク質の機能賦活を例に説明するが、本発明の適用は、実施例に示されたタンパク質に限定・制限されるものではない。
(Examples and Comparative Examples)
Hereinafter, in this example, functional activation of E. coli expression system production protein and denatured protein will be described as an example. However, application of the present invention is not limited to or limited to the proteins shown in the examples.
１）試料等の調製
（ａ）リフォールディング剤
本発明のリフォールディング剤（機能賦活剤）として、後記する表1及び表２に示した、市販ゼオライトベータ、合成ゼオライトベータ、それらを焼成したゼオライトベータ、各種アンモニウム類含有ゼオライトベータ、骨格置換ゼオライトベータ及び各種アンモニウム類含有骨格置換ゼオライトベータを使用した。比較品として、表３の比較例に列挙した物質を用いた。これらの物質は、ベータ構造を有するゼオライトではない。例えば、比較例１９、２０のゼオライトは、合成時間が充分ではなく、ＢＥＡ構造が未形成のシリカ及びシリカ・アルミナで、大半は非晶質構造である。
1) Preparation of Samples, etc. (a) Refolding Agent As the refolding agent (functional activator) of the present invention, commercial zeolite beta, synthetic zeolite beta, and zeolite beta obtained by calcining them as shown in Table 1 and Table 2 described later Various ammonium-containing zeolite beta, framework-substituted zeolite beta, and various ammonium-containing framework-substituted zeolite beta were used. As comparative products, the substances listed in Comparative Examples in Table 3 were used. These materials are not zeolites with a beta structure. For example, the zeolites of Comparative Examples 19 and 20 have insufficient synthesis time, silica and silica-alumina with an unformed BEA structure, and most have an amorphous structure.
（ｂ）変性タンパク質溶液
活性賦活対象タンパク質として、表１ないし表３のタンパク質及び同表の備考欄に示した内容のＲＰ７０（黄色ショウジョウバエ由来）、Ｐ５３（ヒト由来）等を使用した。
（ｃ）リフォールディングバッファー
一般には、リフォールディングバッファーとして、50mM HEPES pH7.5／0.5M NaCl／ 20ｍM ２−メルカプトエタノール／2.5(w/v)％ ポリエチレングリコール 20000（リフォールディング因子）／1(v/v)％ Tween20（界面活性剤）の組成の液を用いた。表４ないし表６に、用いたリフォールディングバッファーの詳細を示す。
(B) Denatured protein solution As the protein to be activated, RP70 (derived from yellow Drosophila) and P53 (derived from human) having the contents shown in the remarks column of Tables 1 to 3 and the like were used.
(C) Refolding buffer
In general, 50 mM HEPES pH 7.5 / 0.5 M NaCl / 20 mM 2-mercaptoethanol / 2.5 (w / v)% polyethylene glycol 20000 (refolding factor) / 1 (v / v)% Tween20 (interface) as a refolding buffer A liquid having a composition of (active agent) was used. Tables 4 to 6 show details of the refolding buffer used.
２）リフォールディング操作
1.5mlのエッペンドルフチューブに100mgの機能賦活剤を入れ、0.5mlの6M塩酸グアニジン・20mMトリスアミノメタン三塩酸塩（TrisHCl）pH7.5・0.5M NaCl・20mM ２−メルカプトエタノールを加えて懸濁した。これに、6M塩酸グアニジン・20mM ２−メルカプトエタノールを加え、氷上で１時間放置し、変性したタンパク質溶液（濃度は0.5〜1.0mg/ml）を0.5ml加えた。この混合液を、該タンパク質の機能賦活剤上への吸着を確実にするために、低温室に置かれたROTARY CUTURE RCC-100（IWAKI GLASS社製）で、１時間攪拌した。
2) Refolding operation
In a 1.5 ml Eppendorf tube, 100 mg of a functional activator was added, and 0.5 ml of 6 M guanidine hydrochloride / 20 mM trisaminomethane trihydrochloride (TrisHCl) pH 7.5 / 0.5 M NaCl / 20 mM 2-mercaptoethanol was added and suspended. . To this, 6M guanidine hydrochloride · 20mM 2-mercaptoethanol was added, left on ice for 1 hour, and 0.5ml of denatured protein solution (concentration 0.5-1.0mg / ml) was added. In order to ensure the adsorption of the protein onto the functional activator, the mixed solution was stirred for 1 hour with ROTARY CUTURE RCC-100 (manufactured by IWAKI GLASS) placed in a low temperature chamber.
その後、10000×gで５秒間遠心して、機能賦活剤を沈殿させ、上澄みを除去した。次に、この沈殿した機能賦活剤からタンパク質変性剤を完全に除去するために、これを1mlの20mM TrisHCl pH7.5・20mM ２−メルカプトエタノールで４回洗った後、10000×gで５秒間遠心し、更に、生じた上澄みを捨てた。残った機能賦活剤に、1mlのリフォールディングバッファー（50mM HEPES pH7.5、0.5M NaCl、20mM ２−メルカプトエタノール、リフォールディング因子及び非イオン系界面活性剤から構成）を加え、懸濁した。 Thereafter, the functional activator was precipitated by centrifuging at 10,000 × g for 5 seconds, and the supernatant was removed. Next, in order to completely remove the protein denaturant from the precipitated functional activator, this was washed 4 times with 1 ml of 20 mM TrisHCl pH 7.5 / 20 mM 2-mercaptoethanol, and then centrifuged at 10,000 × g for 5 seconds. In addition, the resulting supernatant was discarded. To the remaining functional activator, 1 ml of refolding buffer (composed of 50 mM HEPES pH 7.5, 0.5 M NaCl, 20 mM 2-mercaptoethanol, refolding factor and nonionic surfactant) was added and suspended.
機能賦活剤上に吸着した該タンパク質を脱着・溶離させるために、この懸濁液を再び低温下のROTARY CUTURE RCC-100（IWAKI GLASS社製）で攪拌した。その後、10000×gで５秒間遠心して、機能賦活剤を沈殿させ、該タンパク質を含む上澄みを新しいエッペンドルフチューブに移し、活性測定（アッセイ）に用いた。
なお、活性測定には、用いたタンパク質の働きに応じた方法を採用した。具体的には、４種の測定、すなわち、ゲルシフトアッセイ、ポリメラーゼアッセイ、リゾチーム活性測定及びトポイソメラーゼI活性測定で行った。
In order to desorb and elute the protein adsorbed on the functional activator, this suspension was again stirred with ROTARY CUTURE RCC-100 (manufactured by IWAKI GLASS) at low temperature. Thereafter, the functional activator was precipitated by centrifuging at 10,000 × g for 5 seconds, and the supernatant containing the protein was transferred to a new Eppendorf tube and used for activity measurement (assay).
In addition, the method according to the function of the used protein was employ | adopted for activity measurement. Specifically, four types of measurements were performed: gel shift assay, polymerase assay, lysozyme activity measurement, and topoisomerase I activity measurement.
３）活性測定操作
（ａ）ゲルシフトアッセイ
1pmolの放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドDNAとリフォールディングしたタンパク質を、組成25mM HEPES pH7.4・50mM KCl・20% glycerol・0.1% NP-40・1mM DTT・1mg/ml bovine serum albuminの溶液中で、氷上30分インキュベートし、4.5%のポリアクリルアミノゲルで0.5×TBEのバッファーを使い、4℃で電気泳動した。
タンパク質にDNA結合性がある（すなわち、活性がある）場合、DNAにタンパク質が結合し、これにより電気泳動が遅くなりバンドがシフトするので、これにより活性（すなわち、リフォールディング率）を判定した。
3) Activity measurement procedure (a) Gel shift assay
1 pmol radioisotope-labeled oligonucleotide DNA and refolded protein in a solution of 25 mM HEPES pH 7.4, 50 mM KCl, 20% glycerol, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mg / ml bovine serum albumin And incubated on ice for 30 minutes and electrophoresed on a 4.5% polyacrylaminogel at 4 ° C. using 0.5 × TBE buffer.
If the protein has DNA binding (i.e., activity), the protein binds to DNA, which slows electrophoresis and shifts the band, thereby determining activity (i.e., refolding rate).
（ｂ）ポリメラーゼアッセイ
鋳型DNAとして、poly(dA)oligo(dT)12-18あるいはDNase I-activate calf thymus DNAを使用し、反応液には、組成（終濃度）50nmM TrisHCl pH7.5・1mM DTT・15% glycerol・5mM MgCl2・0.5μM dTTP (cold)（チミジル酸三リン酸）・[3H]-dTTP (5mCi/ml: 100-500cpm/pmol)のものを用いた。先ず、この反応液の濃度が２倍のもの10μlに、タンパク質（酵素）サンプル溶液を加え、懸濁した後、37℃で１時間インキュベートした後、氷上に置き反応を停止させた。
(B) Polymerase assay Poly (dA) oligo (dT) 12-18 or DNase I-activate calf thymus DNA is used as the template DNA, and the composition (final concentration) is 50 nm TrisHCl pH 7.5 · 1 mM DTT. 15% glycerol, 5 mM MgCl 2 , 0.5 μM dTTP (cold) (thymidylic acid triphosphate), [ 3 H] -dTTP (5 mCi / ml: 100-500 cpm / pmol) were used. First, a protein (enzyme) sample solution was added to 10 μl of a double concentration of this reaction solution, suspended, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then placed on ice to stop the reaction.
その後、正方形に切ったDE81紙に反応液を滴下し、乾燥させた後、ビーカーの中に移して、未反応dTTPを溶解除去するために洗浄した。洗浄は、先ず、5%リン酸水素二ナトリウム水溶液で３回行い、次いで、蒸留水で３回、更に、エタノールで２回行い、その後、乾燥した。このようにして得た乾燥DE81紙を、シンチレーターが入ったバイアルに入れ、シンチレーションカウンターで放射活性（cpm）を測定した。酵素サンプルの活性が強いほど、それで合成されるDNAに、放射性同位体で標識したdTTPがより多く取り込まれ、放射性が高くなるので、これによりタンパク質の活性を判定した。 Thereafter, the reaction solution was dropped onto DE81 paper cut into a square, dried, then transferred into a beaker, and washed to dissolve and remove unreacted dTTP. Washing was first performed 3 times with 5% aqueous solution of disodium hydrogenphosphate, then 3 times with distilled water, 2 times with ethanol, and then dried. The dry DE81 paper thus obtained was placed in a vial containing a scintillator, and the radioactivity (cpm) was measured with a scintillation counter. The stronger the activity of the enzyme sample, the more dTTP labeled with a radioisotope is incorporated into the DNA synthesized with it, and the radioactivity becomes higher. Thus, the activity of the protein was determined.
（ｃ）リゾチームの活性測定
基質に細菌M. lysodeikticusを選び、これを50mMリン酸バッファーで懸濁し、0.16mg/ml濃度の基質溶液を調製した。この基質溶液480μlに20μlのタンパク質（酵素リゾチーム）溶液を加え、室温で30分間インキュベートした。その後、波長450nmの吸光度を測定した。
リゾチームは、細菌の細胞壁を分解する能力があるので、その能力、すなわち、活性が高いほど吸光度は減少する。リゾチーム活性1 unitは、１分間当たりに450nmの吸光度が0.001減少することと定義した。
(C) Activity measurement of lysozyme Bacteria M. lysodeikticus was selected as the substrate, and this was suspended in 50 mM phosphate buffer to prepare a substrate solution having a concentration of 0.16 mg / ml. 20 μl of protein (enzyme lysozyme) solution was added to 480 μl of this substrate solution and incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured.
Since lysozyme has the ability to break down bacterial cell walls, the higher its ability, ie activity, the lower the absorbance. One unit of lysozyme activity was defined as a 0.001 decrease in absorbance at 450 nm per minute.
（ｄ）トポイソメラーゼI活性測定
0.5μgのsupercoiled pBR322と、トポイソメラーゼ（Topoisomerase）Iタンパク質を反応バッファー（10mM TrisHCl, pH7.5, 150mM NaCl, 5mM β-mercaptoethanol, 0.5mM EDTA）に懸濁し、37℃で30分インキュベーションした後、0.1%SDSを添加し反応を停止した。次に、これに0.5μg/ml proeinase Kを添加し、37℃で30分インキュベーションし、液中のタンパク質トポイソメラーゼIを分解した。この後、この液を、1%(w/v)アガロースで電気泳動し、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドでＤＮＡ染色し、UVトランスイルミネーターで上方にシフトしたＤＮＡのバンドを確認することによって、トポイソメラーゼＩ活性測定を行った。
(D) Topoisomerase I activity measurement
0.5 μg of supercoiled pBR322 and topoisomerase I protein were suspended in a reaction buffer (10 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 0.5 mM EDTA), incubated at 37 ° C. for 30 minutes, 0.1 % SDS was added to stop the reaction. Next, 0.5 μg / ml proeinase K was added thereto, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to decompose protein topoisomerase I in the solution. Thereafter, this solution was electrophoresed with 1% (w / v) agarose, stained with 0.5 μg / ml ethidium bromide, and the DNA band shifted upward was confirmed with a UV transilluminator. Topoisomerase I activity was measured.
上記手順・操作で得られた本実施例の結果である、活性（リフォールディング率）、タンパク質回収率を、表１及び表２に、比較例の結果を、表３に纏めた。実施例に示されるように、リフォールディングにより、ＤＮＡ結合活性等のタンパク質本来の活性が得られることが分かった。本発明のゼオライトベータは、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用できる、一般性、普遍性の高い、リフォールディング剤として有用であり、その適用は、実施例に示されたタンパク質に限定されるものではなく、任意のタンパク質に適用し得るものである。 Tables 1 and 2 show the activity (refolding rate) and protein recovery rate, and Table 3 shows the results of the comparative example, which are the results of this example obtained by the above procedures and operations. As shown in the Examples, it was found that the original activity of the protein such as DNA binding activity can be obtained by refolding. The zeolite beta of the present invention is useful as a general and universal refolding agent that can be applied to various unstructured and denatured / inactivated proteins, and its application is shown in the Examples. The present invention is not limited to proteins, and can be applied to any protein.
以上詳述したように、本発明は、不活性タンパク質の機能賦活剤並びに機能賦活方法に係わるものであり、本発明によって、大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために、不活性なタンパク質、あるいは、ある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質の本来の機能・活性をリフォールディングにより賦活させることができる。この方法は、インクルージョンボディを効率よくリフォールディングする方法として有用である。種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い、効率的なリフォールディングキットと、その使用方法を提供できる。本発明のキットの、必須成分であるリフォールディング剤を構成するゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し使用が可能である。このリフォールディングキットは、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質のリフオールディングに効力を有する。したがって、更なる展開、例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと、本発明のキット並びにその使用法とを組み合わせることにより、高次構造の制御された該タンパク質固有の本来機能が備わったタンパク質を生産する、新規の活性タンパク質製造プロセス・システムを構築することができる。 As described above in detail, the present invention relates to a functional activator of inactive protein and a functional activation method, and because the higher-order structure produced in an expression system such as Escherichia coli is not formed by the present invention. The original function / activity of an inactive protein or a protein that has been inactivated due to a change in the three-dimensional structure due to a certain cause can be activated by refolding. This method is useful as a method for efficiently refolding an inclusion body. An efficient refolding kit that can be applied to various proteins, has generality, universality, and has a high refolding rate, and a method of using the same can be provided. The zeolite beta constituting the refolding agent, which is an essential component of the kit of the present invention, is low in cost and can be used repeatedly. This refolding kit is effective for refolding various conformationally disordered proteins including large proteins having a molecular weight exceeding 100,000. Therefore, by combining further development, for example, a protein synthesis process by the expression system of E. coli, and the kit of the present invention and its use, a protein having inherent functions inherent to the protein with a higher-order structure controlled can be obtained. A new active protein production process system to be produced can be constructed.
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