JP2005172825A - ポリマーの分子量を決定する装置 - Google Patents

Abstract

【課題】ポリマーの分子量を決定する装置
【解決手段】本発明は、被分析物エレクトロスプレーから発生した電荷減少気相被分析物を使用し、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）と連結した、ポリマーを含む分子および巨大分子の直接質量分析のための装置および方法に関する。本発明に従い分析されるポリマーを含む分子および巨大分子には、１キロダルトン（ｋＤ）から５００，０００ｋＤの間の重量平均分子量を有する水溶性および水不溶性ポリマー双方が含まれる。
【選択図】なし

Description

本発明は、分子および巨大分子の分子量を決定するための装置および直接方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリマーエレクトロスプレーから発生した電荷の減少したポリマーイオンを使用して、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）と連結させたポリマーの直接的質量分析を目的とする。

ポリマーの分子量分布の決定は、ポリマーの特性評価の重要な側面である。ポリマーの分子量分布（ＭＷＤ）を決定する慣用方法は、ＭＷＤが正確に決定されているある種のスタンダードポリマーと対応させるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）の使用である。しかしながら、多くのポリマーについての分子量分布は、ＧＰＣを使用しては測定することができない。ＧＰＣを使用したＭＷＤの測定が成功するためには、ＧＰＣカラム充填物質に適合し、カラムとの吸着相互作用を避ける溶媒にポリマーを溶解させなければならない。質量分析法（ＭＳ）は、ポリマーのＭＷＤを決定する他の方法である。しかしながら、質量分析検出が多岐にわたる分子を同定するための有効な手段を提供する一方で、高分子量化合物を分析するためのその使用は、与えられた被分析物（ａｎａｌｙｔｅ）による気相イオンを生成させることに関する問題により、現在は妨げられている。特に、重要な生体化合物および工業用ポリマーの混合物の組成物を測定するための質量分光分析の利用は、蒸発およびイオン化プロセスの過程での低い試料揮発性および不可避のフラグメンテーションに関する実験的困難により、厳しく制限されている。これらの制限の結果として、生体巨大分子およびポリマーを含有する試料の質量分析による定量分析の可能性は、大部分未解決のままである。加えて、ポリマーイオンは、ある範囲の荷電状態（ｚ）を有して生成される場合がある。この範囲を伴ってＭＷＤの広いポリマーを分析する場合、イオンがそれらのｍ／ｚ比に従って分離されるので、結果的に深刻なスペクトルの重複となる。かかる重複は、いったん平均分子量が約１０，０００ダルトンを超えると、ポリマーの正確なＭＷＤの決定をしばしば不可能にする。

質量分光分析のための現在利用可能なシステムおよび方法に関連する典型的な制限は、米国特許第６，６４９，９０７Ｂ２号に記載されている事項であり、この文献はペプチド、ヌクレオチド、糖タンパク質、タンパク質、ＤＮＡおよび脂質をはじめとする生体化合物の質量分光分析に使用するための電荷減少イオン化イオン源について開示しており、それらの測定された質量範囲は１８０００ａｍｕまでである。残念ながら、水溶性ポリマーの混合物である、それぞれ２，０００ダルトンおよび１０，０００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の混合物についての質量分析を遂行する試みは、その質量分解能が、多重荷電およびコロナ放電イオン化源の結果として、いかに劣ったものであるか（ピークブロード化）を示している。また、生体分子については、スペクトル重複問題は実際には存在せず、その質量が質量分析器の範囲を超えるがｍ／ｚは多重荷電によりその範囲を超えない粒子については、多重荷電は妨害であることよりむしろ、しばしば優位に使用される。水溶性ポリマーに加えて、工業的に重要かつ商業的に入手可能な多くのポリマーは水溶性ではなく、かかるポリマーのエレクトロスプレーを調製するための実際的かつ有効な方法を有し、および安定なポリマーエレクトロスプレーを生成する際に有効なエレクトロスプレー発生器を飛行時間型質量分析器（ＴＯＦ−ＭＳ）と連結して、かかるポリマーの質量分析を直接遂行する装置を有することが望ましい。その方法についての一つの利点は、測定されたポリマーデータの分子量軸が絶対的であることである。それ故、１〜１００ナノメートル（ｎｍ）の範囲のポリマー粒径について、ポリマーの分子量分布を高分解能で測定する直接法を提供することが望ましい。また、各エレクトロスプレー液滴においてクラスター化されている１以上のポリマー分子を含むエレクトロスプレーポリマークラスター（ユニマー ｎ＝１、ダイマー ｎ＝２、ヘキサマー ｎ＝６およびより高位のクラスター）を生じさせることが望ましい。かかる装置および方法は、それらの分子量が数千ダルトン（１〜３ｎｍのポリマー粒径に相当）から数億ダルトン（１５〜１００ｎｍのポリマー粒径に相当）の範囲にわたる工業用ポリマー；ＧＰＣを含む従来の方法および従来のエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用しては分析することができない分子量分布を有するポリマーの先例の無い直接質量分析を提供する。

米国特許第６，６４９，９０７Ｂ２号明細書

従って、本発明は、慣用の質量分光分析器の質量範囲を超える分子量を有する巨大分子の直接質量分析のための装置を提供する。本発明者らは、高誘電率を有する溶媒を使用して水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマー双方の電荷減少エレクトロスプレーを発生させることによりポリマーの直接質量分析のための装置および方法を見出した。エレクトロスプレー中に形成されるポリマーイオンは、それらの長さ、即ちそれらの質量に比例したレベルの電荷を運搬する。生じたポリマーイオンの電荷の数は、放射性源またはコロナ放電源を使用して単一体（ｕｎｉｔｙ）に接近する値まで減少される。発生したポリマーエレクトロスプレーは、直接質量分析するため飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）に供給される。本発明者らは、また、ポリマーの１からｎ分子までを含む各エレクトロスプレー液滴中のポリマーイオンのクラスターがエレクトロスプレー液滴中のポリマー濃度を変えることにより発生することを見出した。

本発明は、分子および巨大分子の直接質量分析のための装置であって：分子および巨大分子を含む被分析物のエレクトロスプレーを生成するためのエレクトロスプレー発生器を含み、そのエレクトロスプレー発生器は、気相被分析物イオンの電荷減少のためのイオン化源を含み、被分析物の直接質量分析のための飛行時間型質量分析計と連結している直接質量分析のための装置を提供する。

本発明は、また、分子および巨大分子の分子量分布を決定する直接法であって、（ａ）分子および巨大分子を含む被分析物のエレクトロスプレーを発生させる工程；ならびに
（ｂ）被分析物の電荷が減少したエレクトロスプレーを飛行時間型質量分析計に導くことにより被分析物の質量比を測定する工程
を含む直接法を提供する。

本明細書において、１ダルトンは、炭素の最も豊富な同位元素である、１２の原子質量を有する（^１２Ｃ）の１／１２に等しい原子質量単位（１ダルトン＝１原子質量単位（ａｍｕ））である。本発明に従い分析されるポリマーには、１キロダルトン（ｋＤ）から５００，０００ｋＤの間の重量平均分子量を有する水溶性および水不溶性ポリマー双方が含まれる。本明細書において、用語「水溶性」は、ポリマーに適用される場合、ポリマーが水１００グラムあたり少なくとも１グラム、好ましくは水１００グラムあたり少なくとも１０グラム、より好ましくは水１００グラムあたり少なくとも約５０グラムの溶解度を有することを意味する。用語「水不溶性」は、ポリマーに適用される場合、水１００グラムあたり１グラム未満の低いまたは非常に低い水溶解度を有するポリマーを意味する。用語、巨大分子は、１０，０００ダルトンより大きい分子量を有するポリマーを含む大きな分子を意味する。

本明細書において、用語「クラスターイオン」は、１（ユニマー）からｎ（たとえば、ｎ＝６はヘキサマーを意味する）分子の基本対照ポリマー質量スタンダードを含む基本対照ポリマー質量スタンダードから発生する一連の内部依存性質量を意味する。クラスターイオンの数は、液滴中のポリマー濃度に伴い変化する。クラスターイオンを発生させる利点は、それが質量範囲を因数ｎ（ｍ）によって拡張することである。たとえば、５０ｋＤポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニマーは、１２ｋＤ ＰＥＧ テトラマー（すなわち４×１２ｋＤ＝４８ｋＤ、ｎ＝４）と等価の測定された移動度、質量および密度を有する。

本発明に従い、水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマーのエレクトロスプレーは、エレクトロスプレー器（米国特許第５，８７３，５２３号）およびエレクトロスプレー液滴発生器（米国特許出願公開第２００３／０１３６６８０ Ａ１号）として参照されるエレクトロスプレー源（ＥＳ）を使用して生成される。任意の慣用のまたは商業的に入手可能なエレクトロスプレー源または発生器が本発明に従い有用に使用される。本発明において使用されるエレクトロスプレー器は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．、第６８巻、１８９５〜１９０４頁（１９９６年）におけるＫａｕｆｍａｎらにより記載された装置に設計的に類似のものである。同様のエレクトロスプレー液滴発生器は、ＴＳＩモデル３４８０エレクトロスプレーエアロゾル発生器（ＴＳＩ Ｉｎｃ．、米国、ミネソタ州、セントポール）として商業的に入手可能である。代替的なエレクトロスプレー器は、米国特許第５，８７３，５２３号に記載されている。

ＥＳは、被分析物としての水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマーを含む導電性溶液から、均一なナノメートルサイズのエレクトロスプレー（また、液滴およびエアロゾルとも称される）を生成する。用語「エレクトロスプレー」は、よく限定された粒度分布を有する液滴（およびエアロゾル）を意味し、これはキャピラリーから特定の距離（センチメートル、ｃｍ〜ミリメートル、ｍｍ）離れて位置する基準電極に対して数キロボルト（ｋＶ）の電位を維持しながら、キャピラリーを通して充分に導電性の液体を供給することによって発生する。用語エアロゾルは、液滴形態で空気中に懸濁された、被分析物のディスパーションおよびサスペンションを含む、ナノメートル（ｎｍ）サイズの溶液を意味する。本発明のエレクトロスプレーは、大きな印加電位の下でＥＳから溶媒液滴とし生成され、溶媒液滴は、溶解したポリマーを含有するよく限定された粒度分布を有する。用語被分析物は、溶液を生じる溶媒中に溶解された固体被分析物（ポリマー）を意味する。用語、溶解ポリマーおよびポリマー溶液は、ポリマーの懸濁液および分散液、典型的にはポリマーの微細懸濁液および分散液を包含するものとして本文中において理解される。被分析物の微細懸濁液および分散液のエレクトロスプレーは、溶媒または液体キャリヤーを使用して生成される。懸濁液および分散液は、溶媒または液体キャリヤー中の被分析物の均質なまたは不均質な混合物を含む。

本発明のＥＳは、液体を噴出するための出口を有するキャピラリーを含み、前記液体は高電圧電力供給によって高電位に荷電される。キャピラリーの典型的な例は、シリカキャピラリーである。代替的なキャピラリーは、導電性材料から製造される。基準電極はキャピラリーから特定の距離（ｃｍ）を離れて位置する。気体源が使用され、キャピラリー出口の領域において、直ちに気体領域を確立する。典型的な気体源としては、たとえば、空気および二酸化炭素が挙げられる。キャピラリー出口およびＥＳ中の電極との間の電位差は、双方とも高度に均一な粒径の液滴を含有するエレクトロスプレーを確立するのに充分なものである。

ポリマー被分析物を含む液滴は層流ガスフローにより運搬され、そこで迅速に脱溶媒和し、乾燥して、中性および荷電されたポリマー粒子を形成する。これはイオン化源（たとえば、アルファ放射放射線源）に曝露され、液滴が蒸発するにつれて単一体に接近する値まで粒子の電荷を減少させる。アルファ線放射源（たとえば、典型的には５ミリキュリーの^２１０Ｐｏ）への曝露レベルは、金属箔でその活性領域を覆うことで制御される。それは、ポリマー被分析物が多重荷電種に関連したピークを表わさないように調節される。液滴には、乾燥ポリマー粒子が電荷減少する前に蒸発するのに充分な時間が与えられる。

ポリマー粒子は、最初にエレクトロスプレーされた液滴が運搬した同一の電荷量を運搬する。アルファ−放射源電荷減少プロセスは、荷電されたポリマー粒子の良く特徴付けられた確かな流れを生み出す。本明細書において、良く特徴付けられたとは、単一的に荷電されたポリマー粒子の画分は粒径に依存するが、粒径と単一電荷を運搬するポリマー粒子の画分との間の関係が充分確立されていることを意味する。代替法は、荷電されたポリマー粒子の流入流れが単一電荷を超えない電荷を有する粒子でもって出て行くことを確実にするように使用され、たとえばアルファ放射線源と同一の電荷状態減少を有する第二次電子を生じさせる交流コロナを含む。

本方法の一態様によれば、エレクトロスプレーは、かなり低いポリマー被分析物濃度を使用する必要なしに、被分析物として一つだけのポリマー分子を含むような粒度分布を有して発生する。水溶性ポリマー（たとえば、ＰＥＧ）の場合において、水が溶媒として使用され、これは少量の１以上の電解質（たとえば、１０ｍＭの酢酸アンモニウム）を同時に含む。水不溶性ポリマー（たとえば、ポリスチレン、ＰＳ）の場合において、高誘電率を有する溶媒（たとえば、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、ＮＭＰ）が使用され、これは少量の１以上の電解質（たとえば、１０ｍＭのトリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）を同時に含む。与えられた液滴径およびポリマー分子量については、液滴あたり一ポリマー鎖を提供するのに対応するポリマー濃度が計算される。たとえば、５０ｎｍの初期液滴径を有する１００ｋＤのＰＥＧは、２５３８ｐｐｍの濃度において単一ＰＥＧ鎖を提供する。１００ｎｍ、５００ｎｍ、２μｍおよび１０μｍの初期液滴径を有する同一ポリマーは、それぞれ３１７ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、０．０４ｐｐｍおよび０．０００３ｐｐｍの濃度において単一のＰＥＧ鎖を提供する。従ってシグナルを最大化するために、液滴径は最小にされ、エレクトロスプレー化は挟い粒度分布を有する液滴を発生する。液滴中のポリマー濃度を増加することによって、複数ポリマー分子（鎖）を提供し、同一乾燥ポリマー粒子における、クラスターイオンと称する、分子のクラスターが提供される。クラスターイオンの数、ｎ、が使用されて、より高い分子量ｍの単一分子（鎖）ポリマーについて合理的な概算がなされ、それにより因数ｎ（ｍ）により分子量範囲が拡張される。たとえば、１２０ｋＤのＰＥＧのヘキサマーは、単一鎖（分子）７２０ｋＤのＰＥＧ（６×１２０ｋＤ＝７２０ｋＤ）と等価である。

ＥＳ装置は、質量分析器に電荷減少ポリマー粒子を送り、ポリマーエレクトロスプレーから発生した気相ポリマーイオンの荷電に対するその質量比（ｍ／ｚ）を決定する。例示的な態様に従えば、質量分析器は、１０，０００ダルトンより大きい分子質量を有する化合物についてのｍ／ｚ比率の正確な測定を提供するために適した検出システムを装備した飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）である。１キロダルトン（ｋＤ）から５００，０００ｋＤの間の重量平均分子量を有するポリマーを含む分子および巨大分子の質量分析には、該装置を直接使用し、当該使用では、慣用のＥＳＩ−ＭＳおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）の場合のような固有の制限に苦しむことはなく、すなわち、多数の異なる電荷状態のそれぞれの複数質量からのスペクトルの密集に苦しむことはない。後者の二つの装置は、工業用ポリマーの質量分布を決定するには不満足であったが、一方で本発明の装置は工業用ポリマーの質量分布を含む正確な、直接質量分析を提供する。

本発明は、また、
（ａ）分子および巨大分子を含む被分析物のエレクトロスプレーを発生させる工程；および
（ｂ）被分析物の電荷減少したエレクトロスプレーを飛行時間型質量分析計に導くことにより被分析物の質量比を測定する工程
を含む分子および巨大分子の分子量分布を決定する直接法を提供する。

別の例示的な態様に従えば、代替の質量分析器としては、これらに限定されないが、たとえば、微分型電気移動度測定器（ＤＭＡ）、四重極型質量分析計、タンデム質量分析計、イオントラップおよびそれらの質量分析器の組み合わせが挙げられる。

ＤＭＡ態様に従えば、ＥＳ装置は電荷減少ポリマー粒子を微分型電気移動度測定器（ＤＭＡ）に送り、そこで荷電ポリマー粒子の粒径が測定される。イオン電気移動度は、イオンの物理的特性であり、それが電場に付される場合にイオンが獲得する速度に相関する。電気移動度Ｚは、数学的関係式Ｚ＝Ｖ／Ｅから定義され、式中Ｖは終端速度およびＥは電場である。粒子直径は、次の項を代入することによりＺ＝ｎｅＣ_ｃ／３πηｄの関係より決定される、式中ｎは粒子についての電荷の数（ｎ＝１）であり、ｅ＝１．６×１０^−１９クーロン／電荷、Ｃ_ｃは粒子サイズ依存性滑り補正係数、ηは気体粘度およびｄは粒子直径である。粒子直径は既知のパラメーターの関数として、粒子直径についての直接の関係を提供する関係式：ｄ＝［ｎｅＣ_ｃ／３πη］［Ｅ／Ｖ］から導かれる。Ｅを変えることにより、荷電ポリマー粒子の異なる粒子直径が得られる。本発明は高分解能ＤＭＡを使用してポリマーイオン電気移動度を測定し、測定されたポリマーイオン移動度をポリマー質量に関係付ける正確な検量方法を開発する方法を提供する。

ＤＭＡは、流れ場と電場を組み合わせて、時間ではなく空間においてイオンを分離する。本発明において使用されるＤＭＡは、Ｔ．Ｅｉｃｈｌｅｒにより、Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、ドイツ（１９９７年５月）に提出された「イオンおよびナノ粒子についての微分型電気移動度測定器：高レイノルズ数における層流」と題された論文において記載され、その改良である大型層流化入り口を有する小型ウイーン型ＤＭＡが、Ｈｅｒｒｍａｎｎ等によりミシシッピー州セントルイスにおいてＡＡＡＲの年次総会、２０００年、１０月６〜１０日において記載された。実際には、典型的なＤＭＡは、２ｎｍより小さな粒子の粒度分布を測定することができない。しかしながら、それらはＭｗ＞１０ｋＤを有するポリマーを測定する本発明において容易に使用される。高分解能ＤＭＡは、１ｎｍ未満の粒子の粒度分布を測定できるよう設計および製作された。米国特許出願第２００３／０１１６７０８Ａ１号に記載された該高分解能ＤＭＡにおいて、層流は異例に高く、層流を維持している間の分析部分における平均速度および円筒状電極間隔（０．５センチメートル）から計算して、１０，０００〜３０，０００以上のレイノルズ数（Ｒｅ）に相当する。用語「レイノルズ数」は、流体の密度、流体の速度および固有の長さの積全てを、流体の粘性係数で割ったものに等しい無次元の数である。小さなＭｗを有する有機分子についてのイオン移動度を測定するのに、該高Ｒｅ数が要求されるのに対し、１ｋＤより大きいＭｗを有するポリマーについてのイオン移動度を正確に測定するには該高Ｒｅ数が必要とされない。一利点は、ポリマー質量を正確に決定するための方法が、層流を維持しながら２０００未満（Ｒｅ＜２０００）のレイノルズ数においてＤＭＡを作動することを要求するということである。

電荷減少ポリマーイオンは、ＤＭＡを通して注入され、ＤＭＡはそれらの直径および移動度に従い荷電ポリマーイオンを分離する。移動度で選択されたポリマー粒子を感知する検出器は、約１秒の応答時間および約１０^−１６アンペアのノイズレベルを有するＬａｚｃａｎｏ Ｉｎｃ．から商業的に供給される電位計である。最大ピーク高さにおける全幅（ＦＷＨＭ）が２．７％より優れた移動度分解能を有するＤＭＡが、典型的である。分解能は、ＤＭＡを改変することにより１．８％ＦＷＨＭまで改良することができる。

ポリマーの測定された移動度分布は、下記の方法でそれぞれのポリマー質量に相関する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマーのエレクトロスプレーは、それらが単一または複数ポリマー鎖から構成されているか否かにかかわらずガラスまたは結晶状態に相当する嵩密度を有する球状ポリマー粒子を生成する。該ポリマー粒子は、球状であり、気体平均自由行程よりずっと小さいので、移動度Ｚおよび質量ｍはお互い相関し得る。何故ならｍおよびＺ双方は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６巻、４５９〜４７５頁（１９９５年）においてＨ．ＴａｍｍｅｔによりおよびＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第１７巻、３２８〜３３９頁（１９９８年）においてｄｅ ｌａ Ｍｏｒａらに従い粒子直径ｄと関連するからである。：

式中、ρは球状粒子の密度であり、ｑはその電荷であり、ｐは圧力であり、Ｔは温度であり、ｍ_ｇは懸濁化気体の分子質量であり、ｋはボルツマン定数、ｄ_ｇは気体粒子衝突の有効直径であり、およびαは相当する適応係数である。

用語αは弾性衝突については０および完全非弾性衝突については１である。空気中の小粒子の多様な測定は、α＝０．９１である場合の式（２）に一致し、これはＳ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒによる「Ｄｕｓｔ，Ｓｍｏｋｅ ａｎｄ Ｈａｚｅ」、Ｊ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第２版、２０００年において報告されており、ｄ_ｇが０．５３ｎｍであるとも報告されている。式（１）および（２）から結果的に、ｍ^１／３およびＺ^−１／２の量は双方ともｄに関して線形的であり、それぞれがそれぞれに対しプロットされたとき直線の関係を生じる：

式中、定数ＡおよびＢは上記により与えられた情報から推定されるだけでなく、キャリブレーションから得られる。より大きなポリマー粒子（ｄ＞１０ｎｍ）についての一般的な手順としては、関係Ｚ（ｄ）を逆数にして、移動度直径ｄ（Ｚ）に関して、測定された移動度を表す。これはｄ（Ｚ）対ｍ^１／３のプロットが、対象である工業的ポリマーについての質量の全範囲内で直線となるよう、メガダルトン範囲を含むよう代数的になされる。

移動度Ｚおよび移動度の逆数１／Ｚは、下記のＭｉｌｌｉｋａｎ関係式から決定することができる。式中Ｋｎｕｄｓｅｎ数Ｋｎはキャリヤーガスの平均自由行程の２倍と粒子直径ｄとの間の比率である：

式中、μは気体の速度係数であり、およびρ_ｇは気体密度である。これはＺの関数としてのｄを生じ、それによりＺ^−１／２の代わりにｄを使用することが可能になり、式（５）に示されるようにｄおよびｍ^１／３との間に直線関係を生じさせる。

従って、本発明は、
（ａ）ポリマーおよび１以上の対照ポリマーをエレクトロスプレーする工程；
（ｂ）高分解能微分型電気移動度測定器を使用してポリマーおよび１以上の対照ポリマーについてのイオン移動度の分布を測定する工程；および
（ｃ）相当する測定されたポリマーイオン移動度からポリマー質量を計算することにより１以上の対照ポリマーと比較してそのポリマーの分子量を得る工程
を含むポリマーの分子量分布を決定する方法を提供する。

水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマーについて高分解能質量（分子量）分布決定のための電荷減少エレクトロスプレー移動度分析の有効性が、本発明の方法を使用して実証された。水溶性ポリマーの代表例はＰＥＧである。一例において、与えられた液滴中に唯一のＰＥＧ分子（鎖）を含有する希釈ポリマー濃度および与えられた液滴中にＰＥＧ分子のクラスターが存在する増加したポリマー濃度におけるエレクトロスプレーから、１２．６ｋＤのＰＥＧ試料についてのイオン移動度スペクトルが測定された。低ポリマー濃度において、単一鎖ＰＥＧ分子（ユニマー、ｎ＝１）に相当する移動度ピークが観察された。クラスターイオンでは漸次的な外観が見られ、ユニマーからデカマー（ｎ＝１０）の移動度のピークが、ポリマー濃度が１×１０^−６から１×１０^−６Ｍに増加する間に観察された。この例から、プローブされるポリマー質量の範囲は、単一ポリマー試料およびクラスター形成物を使用して、因数１０によって単一の１２６ｋＤのＰＥＧ鎖に等しい値まで拡張される。更に、１２０ｋＤのＰＥＧ試料のエレクトロスプレー移動度分析は、本発明の方法を使用するユニマーからヘキサマーまでに相当する移動度ピークから、７２０ｋＤにまで拡張させることができる。本方法においてなされる仮定の一つは、（特にクラスターの場合において）乾燥ポリマー粒子は球状であり、それらの密度は直径、即ち、分子量とは無関係であるとすることである。その仮定の正当性は、ＰＥＧポリマーの二組の実験結果、つまり直線関係がポリマーイオン移動度の逆数の平方根対ポリマー質量（分子量）の立方根との間で得られたという実験結果を使用して実証された。本方法の一つの利点は、上記した様に一連の質量は内部的に依存しており、一貫性がありおよび直線をなすことである。移動度対ＭＷの関係を使用して、１．００１の多分散性が５％ＦＷＨＭのイオン移動度ピークを与えることが算出される。従って、慣用のＤＭＡの分解能は、合成、半合成および自然発生ポリマーを含む多分散性ポリマーの分子量分布を測定する場合に観察し得るピークのブロード化をほとんどまたは全く与えない。二つの例は、ポリマーについてのエレクトロスプレー移動度分析クラスターデータが、２桁の規模範囲を超えるポリマーの高分解分子量分布をもって正確に決定する能力を提供し、分解能はＧＰＣよりかなり優れており、典型的にＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルに見られる範囲を超える範囲を有していることを示している。

水不溶性ポリマーのエレクトロスプレー移動度分析は、本発明の方法を使用して同様の方法で遂行される。代表的な水不溶性ポリマーは、ポリスチレン（ＰＳ）である。一例において、与えられた液滴中で唯一のＰＳ分子（鎖）を含有する希釈ポリマー濃度および与えられた液滴中にＰＳ分子のクラスターが存在する増加したポリマー濃度におけるエレクトロスプレーから、１７０ｋＤのＰＳ試料についてのイオン移動度スペクトルが測定された。ユニマー（ｎ＝１）のイオン移動度ピークは、２×１０^−６Ｍにおいて観察された。クラスターイオンでは漸次的な外観が見られ、ユニマーからトリマー（ｎ＝３）までの移動度ピークが、ポリマー濃度が１．７×１０^−５Ｍまで増加する間に観察され、分子量範囲は５１０ｋＤまで拡張される。

分子量が未知の任意のポリマーは、１以上の対照ポリマーを使用してエレクトロスプレー移動度分析により決定される。対照ポリマーは、ＧＰＣまたはＭＳ等の任意の慣用技術を使用してその分子量が正確に決定されているポリマーである。ＰＥＧスタンダードは、本発明の方法を使用する水溶性ポリマーについての対照ポリマーとして有用である。ＰＳスタンダードは、本発明の方法を使用する水不溶性ポリマーについての対照ポリマーとして有用である。任意の好適な水溶性ポリマーまたは水不溶性ポリマーを、その分子量が正確に決定されていることを条件として、対照として使用することができる。エレクトロスプレー移動度分析におけるクラスターの一つの利点は、クラスターイオンが、一連の内部対照をも提供することである。分子量が未知のポリマーについての移動度分布は、１以上の対照ポリマーのイオン移動度分布と比較して本発明の方法を使用して決定される。

ポリマー質量に対してポリマーの移動度分布をキャリブレーションする方法は
（ａ）異なる分子質量を有する１以上の対照ポリマーを得る工程；
（ｂ）微分型電気移動度測定器を使用して各対照ポリマーについてのイオン移動度を測定する工程；
（ｃ）測定された移動度分布から対照ポリマーイオンの粒子直径を算出する工程；および（ｄ）ポリマー粒子直径ｄ（Ｚ）またはポリマー粒子移動度（Ｚ^−１／２）対ポリマー質量（ｍ）^１／３の、確定されている質量範囲にわたるプロットを得る工程
を含む。

本発明は、また、対応するポリマー質量を有するポリマーのイオン移動度をキャリブレーションし、ポリマー質量範囲を拡張する方法であって
（ａ）挟い分子量分布を有する対照ポリマーを得る工程；
（ｂ）一連のｎ個のクラスターイオンを対照ポリマーから発生させ、さらに微分型電気移動度測定器を使用して各クラスターイオンについてのイオン移動度を測定する工程；
（ｃ）測定された移動度分布から対照ポリマーおよび対応するクラスターイオンの粒子直径を算出する工程；および
（ｄ）ポリマー粒子直径ｄ（Ｚ）またはポリマー粒子移動度（Ｚ^−１／２）対ポリマー質量（ｍ）^１／３の拡張された質量範囲にわたるプロットを得る工程
を含む方法を提供する。この方法の一利点は、その一連の対照質量は上記したように内部的に依存し、一貫性がありおよび直線をなすことである。

上記したように、水溶性ポリマーおよび水不溶性ポリマー双方の質量分析は、本発明の方法を使用して遂行される。水溶性ポリマーは、水と好適な塩を含む緩衝溶液からエレクトロスプレーされ、必要とされる液滴を生成する。好適な水溶性ポリマーの例としては、これらに限定されないが、たとえばポリアルキレンオキシド、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリアクリル酸およびその塩、ポリメタクリル酸およびその塩、ポリイタコン酸およびその塩、ポリクロトン酸およびその塩、ポリマレイン酸およびその塩、スチレンスルホン酸およびその塩、スチレンスルホン酸の誘導体およびその塩、ポリアミンおよびそのアンモニウム塩、ポリアミノアクリレートおよびそのアンモニウム塩が挙げられる。他の好適な水溶性ポリマーとしては、全ての高分子電解質、たとえば、ポリ（メタ）アクリル酸コポリマーおよびその塩、無水マレイン酸コポリマー、多糖類およびその塩、多糖類誘導体およびその塩、ポリエチレンイミンおよびその塩、ポリアミドアミンおよびその塩、イオネン（ｉｏｎｅｎｅｓ）およびその塩、カチオン性アクリル酸エステルのホモ−およびコポリマー、ゼラチンおよび核酸が挙げられる。全ての水溶性ポリマーの分子量分布を、本方法の方法を使用して決定することができると考えられる。

水不溶性ポリマーの質量分析は、高誘電率を有する溶媒中のポリマーのエレクトロスプレーから決定される。用語「誘電率」は、溶媒を含む液体媒体の極性を意味し、式Ｆ＝ＱＱ’／εｒ^２におけるεにより定義され、ここでＦは媒体において距離ｒで分離される二つの電荷ＱおよびＱ’間の引力である。高誘電性溶媒は、ポリマーを溶解し／分散する働きをし、必要とされる導電性を有し、および本発明の方法を使用する質量分析のための汚染されていないポリマーイオンを生じさせるために不純物を含まない。全ての水不溶性ポリマーの分子量分布を、それらがイオン化のために充分高い誘電率を有する１以上の好適な溶媒中に溶解され、懸濁されまたは分散され得ることを条件に、本発明の方法を使用して決定することができると考えられる。

高誘電率を有する溶媒の好適な例としては、これらに限定されないが、誘電率ε＞２．０を有する溶媒が挙げられる。好適な例としては、たとえば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ニトロメタン、ニトロエタン、ニトロベンゼン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、アセトアミド、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、アリルアルコール、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、５−メチル−２−ピロリジノン、２−メチル−１−ブタノール、無水酢酸、アミルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノン、グリコールニトリル、シアン化水素（低温において超臨界または凝縮相である）、二酸化硫黄（低温において超臨界または凝縮相である）、シアン化水素酸、イソブチロニトリル、イソブチルアルコール、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルシクロヘキサノン、Ｎ−メチルピリジンおよびリン酸トリブチルが挙げられる。

広範囲の水不溶性の工業用ポリマーの質量（分子量）分析は、本発明の方法を使用して決定される。好適なポリマーの例として、これらに限定されないが、ビニルポリマー、たとえばポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルピリジン、ポリビニルアミン、ポリビニルアミド、ポリビニルエーテル；縮合ポリマー、たとえばポリエステルおよびポリウレタン；ポリエチレン性不飽和ポリマー、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリメタアクリレートコポリマー、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリアルキル（メタ）アクリレートコポリマー、ポリヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリルコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミドおよびポリ（メタ）アクリルアミドコポリマー；ポリウレタンおよびポリエステルが挙げられる。他の好適な例の水不溶性ポリマーには、掲げられたポリマーの架橋ポリマーが含まれる。

本発明に有用な水不溶性アクリルポリマーは、溶液、サスペンションおよびエマルション重合を含む慣用の重合技術により調製される。たとえば、ラテックスポリマー粒子のディスパーションは、米国特許第４，４２７，８３６号；第４，４６９，８２５号；第４，５９４，３６３号；第４，６７７，００３号；第４，９２０，１６０号；および第４，９７０，２４１号に開示されたものを含むプロセスに従って調製される。ラテックスポリマー粒子は、また、たとえば欧州特許公開番号第ＥＰ０２６７７２６号；ＥＰ０３３１４２１号；ＥＰ０９１５１０８号および米国特許第４，９１０，２２９号；第５，１５７，０８４号；第５，６６３，２１３号および第６，３８４，１０４号に開示された重合技術によっても調製することができる。

本明細書において、用語「（メタ）アクリル」は、対応するアクリルまたはメタクリル酸および誘導体のいずれかを意味し；同様に用語「アルキル（メタ）アクリレート」は、対応するアクリレートまたはメタクリレートエステルのいずれかを意味する。

移動度測定によるポリマーの質量分析は、いくつかの重要な利点を提供する。それは、ＧＰＣを使用しては決定され得ないまたは慣用のＭＳ装置を使用しては直接決定され得ないポリマーの質量（分子量）分析を可能にする。当該質量分析は、迅速規模で遂行される。ポリマーイオンの移動度は、第一原理からポリマー粒径および形状まで相関させることができる。

本発明に従い分析されるポリマーは、１キロダルトン（ｋＤ）から５００，０００ｋＤの間の重量平均分子量を有する水溶性および水不溶性ポリマー双方を含む。

本方法は、また、多種類の工業的ポリマーの分子量決定に一般的に適用可能である。本発明の一態様によれば、移動度対質量の関係は分析される各ポリマーについて決定される。別の態様に従い、移動度対質量の関係は、使用される一つのポリマーについて得られる関係を他のポリマーに変換することにより決定される。実験データは、単一鎖粒子の密度はバルクポリマーの密度と同様であることを示しており、嵩密度は測定されるか推定される。

本発明のいくつかの態様は、次の実施例により詳細に記載される。

実施例１ 水溶性ポリマーの質量分析
１０ミリモラー（ｍＭ）酢酸アンモニウムバッファー中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の水溶液が、エレクトロスプレーされた。バッファーは、１０ｍＭ酢酸アンモニウムと共に５０／５０（ｖ／ｖ）水メタノール溶液を含んでいた。二酸化炭素は、エレクトロスプレー用の気体として使用された。商業的に入手可能なＰＥＧ試料が、入手された（ポリマーラボラトリーズ、米国、マサチューセッツ州、アムハースト０１００３）。分子量は、製造者によってＧＰＣおよび光散乱測定を使用して独立に決定され、表１に掲げられている。

形成されるポリマーイオンの移動度分布は、高分解能ＤＭＡを使用して空気中で測定され、対応するマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（ＭＳ）データと比較された。移動度スペクトルは、各ＰＥＧ試料について得られた。結果は、本発明の方法を使用してもたらされたいかなるピークの広域化も、最も狭い入手可能なＰＥＧ試料についての算出されたＭＷＤに深刻な影響を及ぼさないことを確認した。ポリマーイオンの移動度とその質量との間の関係は、狭いＭＷＤを有するＰＥＧ質量スタンダードと比較して決定された。ＰＥＧ試料は、液滴あたり１を超えないポリマー鎖を生じさせるに充分な低濃度（表１）においてエレクトロスプレーされた。ＰＥＧスタンダードから入手され得る情報を最大化するために、より濃縮された溶液が、またエレクトロスプレーされ、ＤＭＡにより分析された。１ＰＥＧ分子から６分子（ヘキサマー）までを含むクラスターイオンの漸次的な出現が１×１０^−６〜１×１０^−４モル／リットル（Ｍ）まで濃度を増加するにつれて観察された。クラスター化プロセスは、因数ｎ（ｍ）により入手可能な質量スタンダードの有効数を拡張するという利点を有する。

ポリマーイオン移動度およびポリマー質量との間の信頼性ある関係は、商業的に入手可能なＰＥＧスタンダードを使用して得られた。その結果により、ＰＥＧ粒子はそれらが単一または複数のポリマー鎖から構成されるか否かとは無関係に、ガラスまたは結晶状態に相当する嵩密度を伴って球状をしていることが確認された。形成される粒子についての一定の形状および密度は、測定された移動度から質量を正確に決定するのに有用である、何故ならＺは断面積の関数であり、それは形状および容積に依存し、言い換えれば密度に依存するからである。

ＰＥＧの嵩密度についての報告された値は、２９８ＫにおいてＭｗ＝３，４００ｇ／モルにおいて１．２０４ｇ／ｃｍ^３であり、およびＭｗ＝６，０００ｇ／モルにおいて１．２１ｇ／ｃｍ^３である。式（１）〜（５）を使用して、ｄ（Ｚ）対ｍ^１／３の直線プロットがＰＥＧスタンダードについて得られた。式（５）を使用してデータを適合させ、ｄ_ｇ＝０．４５３ｎｍおよびＢ_Ｍ＝０．１３６４ｎｍ（ｇ／モル）^１／^３を得る。線Ｂ_Ｍの勾配から、１．２５ｇ／ｃｍ^３の粒子密度は、ＰＥＧの嵩密度と一致して得られる。

実施例２
水不溶性ポリマーの質量分析
狭い質量分布および９ｋＤ＜Ｍｎ＜１７０ｋＤの範囲の平均分子量を有するポリスチレンポリマーは、５容積％のトリフルオロ酢酸でシードされたＮＭＰ中のそれらの溶液からエレクトロスプレーされた。ポリスチレン質量スタンダードは、商業的に得られ、表２において要約されている。

形成されるポリマーイオンの移動度分布は、高分解能ＤＭＡを使用して空気中で測定された。移動度スペクトルは、各ポリスチレン試料について得られた。１×１０^−４モル／リットルに近似の濃度において使用されるポリスチレン質量スタンダードは、１から６（ヘキサマー）までのポリスチレン分子を含有する粒子の形成に関連するいくつかのよく限定された移動度ピークを生む。

ポリマーイオン移動度およびポリマー質量との間の信頼性ある関係は、商業的に入手可能なポリスチレンスタンダードを使用して得られた。その結果により、ポリスチレン粒子はそれらが単一または複数のポリマー鎖から構成されるか否かとは無関係にガラスまたは結晶状態に相当する嵩密度を伴って球状をしていることが確認された。４ポリスチレン質量スタンダード（Ｍｎ（ｋＤ）９．２、４５、６８および１７０）の使用は、９ｋＤ〜１７０ｋＤの（Ｚ^−１／２）対ｍ^１／３の直線関係を確立する１５の質量対移動度データを与える。球状ポリマー粒子は、エレクトロスプレーおよびポリスチレンの測定された嵩密度に一致する移動度分析から確認された。式（１）〜（５）を使用して、（Ｚ^−１／２）対ｍ^１／３の直線プロットがＰＥＧスタンダードについて得られた。式（５）を使用してデーターを適合させ、線Ｂ_Ｍの勾配から、１．０６７ｇ／ｃｍ^３の粒子密度がＰＳの嵩密度と一致して得られる。ＰＳの嵩密度は、１．０４０〜１．０８０ｇ／ｃｍ^３の範囲である。最高分子量ＰＳ試料は、６％以内で一貫性があった。

Claims (10)

1. 分子および巨大分子の直接質量分析のための装置であって、分子および巨大分子を含む被分析物のエレクトロスプレーを生成するためのエレクトロスプレー発生器を含み、該エレクトロスプレー発生器は、気相被分析物イオンの電荷減少のためのイオン化源を含み、被分析物の直接質量分析のための飛行時間型質量分析計と連結している、直接質量分析のための装置。
2. 該被分析物の分子量が１キロダルトン（ｋＤ）から５００，０００ｋＤの間である請求項１に記載の装置。
3. 該被分析物が水溶性または水不溶性ポリマーである請求項１に記載の装置。
4. 該水不溶性ポリマーが少なくとも２．０の誘電率を有する溶媒または液体キャリヤーを使用してエレクトロスプレーされる請求項３に記載の装置。
5. 該溶媒または液体キャリヤーが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ニトロメタン、ニトロエタン、ニトロベンゼン、メタノール、エタノール、プロパノール、１−ブタノール、アセトアミド、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、アリルアルコール、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、５−メチル−２−ピロリジノン、２−メチル−１−ブタノール、無水酢酸、アミルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノン、グリコールニトリル、シアン化水素、シアン化水素酸、イソブチロニトリル、イソブチルアルコール、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルシクロヘキサノン、Ｎ−メチルピリジンおよびリン酸トリブチルからなる群から選択される請求項４に記載の装置。
6. 分子および巨大分子の分子量を直接決定する方法であって、
   （ａ）分子および巨大分子を含む被分析物のエレクトロスプレーを発生させる工程；および
   （ｂ）被分析物の電荷減少したエレクトロスプレーを飛行時間型質量分析計に導くことにより被分析物の質量比を測定する工程
   を含む方法。
7. 該被分析物の分子量が１キロダルトン（ｋＤ）から５００，０００ｋＤの間である請求項６に記載の方法。
8. 該被分析物が水溶性または水不溶性ポリマーである請求項６に記載の方法。
9. 該水不溶性ポリマーが少なくとも２．０の誘電率を有する溶媒または液体キャリヤーを使用してエレクトロスプレーされる請求項８に記載の方法。
10. 該溶媒または液体キャリヤーが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ニトロメタン、ニトロエタン、ニトロベンゼン、メタノール、エタノール、プロパノール、１−ブタノール、アセトアミド、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、アリルアルコール、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、５−メチル−２−ピロリジノン、２−メチル−１−ブタノール、無水酢酸、アミルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノン、グリコールニトリル、シアン化水素、シアン化水素酸、イソブチロニトリル、イソブチルアルコール、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルシクロヘキサノン、Ｎ−メチルピリジンおよびリン酸トリブチルからなる群から選択される請求項９に記載の方法。