JP2005148054A - Label amidating method of living body molecule and method for analyzing living body molecule - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ライフサイエンス基礎研究分野に関し、より詳しくは、タンパク質・ペプチド、糖鎖等の生体分子の質量分析における解析感度を向上するための技術に関する。 The present invention relates to a life science basic research field, and more particularly to a technique for improving analysis sensitivity in mass spectrometry of biomolecules such as proteins / peptides and sugar chains.
従来から、タンデム質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳ解析手法によって、タンパク質・ペプチドの構造解析が行われている。例えば、特開平１０−９０２２６号公報において、質量分析におけるタンパク質・ペプチドのフラグメントイオンの発生を容易にする方法として、ペプチドのＮ末端やＣ末端に電荷を有するアミノ酸で化学修飾を行う方法が記載されている。 Conventionally, structural analysis of proteins and peptides has been performed by an MS / MS analysis method using a tandem mass spectrometer. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-90226 describes a method of chemically modifying amino acids having a charge at the N-terminus or C-terminus of a peptide as a method for facilitating the generation of protein / peptide fragment ions in mass spectrometry. ing.
また、糖鎖構造解析の分野においても、タンデム質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳ解析が主流になりつつある。例えば、Rapid Communication in Mass Spectrometry, vol. 10, 1027-1032(1996)において、MALDI-TOF-MS装置によるシアル酸の付加糖鎖の測定において、シアル酸のカルボキシル基をメチルエステル化することによって、シアル酸の脱離を抑制する方法が報告されている。 Also in the field of sugar chain structure analysis, MS / MS analysis using a tandem mass spectrometer is becoming mainstream. For example, in Rapid Communication in Mass Spectrometry, vol. 10, 1027-1032 (1996), in the measurement of the added sugar chain of sialic acid with a MALDI-TOF-MS apparatus, by methyl esterifying the carboxyl group of sialic acid, A method for suppressing the elimination of sialic acid has been reported.
タンパク質・ペプチドのＭＳ／ＭＳ解析では、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基の部位において開裂が優先的に起こるため、他のアミノ酸残基の部位で開裂したフラグメントイオンが得にくい。従って、全体としてフラグメントイオンの検出率が悪く、解析が困難になる問題がある。 In the MS / MS analysis of proteins and peptides, since cleavage occurs preferentially at the aspartic acid residue and glutamic acid residue sites, it is difficult to obtain fragment ions cleaved at other amino acid residue sites. Therefore, there is a problem that the detection rate of fragment ions is poor as a whole, and analysis becomes difficult.
また、シアル酸含有糖鎖のＭＡＬＤＩをイオン源とする質量分析測定においては、ＩＳＤ（in source decay）やＰＳＤ（post source decay）でシアル酸の脱離が容易に起こるため、分子量関連イオンの絶対量が減少する。さらに、シアル酸含有糖鎖のＭＳ／ＭＳ解析では、シアル酸の脱離が優先的に起こり、解析に十分な他のフラグメントイオンを得ることが難しい。 In mass spectrometry using MALDI of sialic acid-containing sugar chains as an ion source, sialic acid is easily eliminated by ISD (in source decay) or PSD (post source decay). The amount decreases. Furthermore, in MS / MS analysis of sialic acid-containing sugar chains, sialic acid is eliminated preferentially, and it is difficult to obtain other fragment ions sufficient for analysis.
本発明の目的は、質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供することにある。また本発明の目的は、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for improving the analysis sensitivity of biomolecules in mass spectrometry. Another object of the present invention is to provide a method for quickly and easily analyzing a biomolecule using a method for improving analysis sensitivity in mass spectrometry.
本発明には、以下の発明が含まれる。
下記（１）〜（７）の発明は、標識アミド化法に向けられる。
（１）生体分子が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、前記生体分子の標識アミド化体を得る、標識アミド化法。
The present invention includes the following inventions.
The following inventions (1) to (7) are directed to a labeled amidation method.
(1) A labeled amidation method for obtaining a labeled amidated product of the biomolecule by allowing an amidating reagent labeled with a nitrogen atom isotope 15 N to act on a carboxyl group of the biomolecule.
（２）前記生体分子がタンパク質又はペプチドである、（１）に記載の標識アミド化法。
すなわち、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、標識アミド化タンパク質又は標識アミド化ペプチドを得る、タンパク質又はペプチドの標識アミド化法。
（３）前記カルボキシル基が、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基が有するカルボキシル基である、（１）又は（２）に記載の標識アミド化法。
（４）前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれる、（３）に記載の標識アミド化法。
(2) The labeled amidation method according to (1), wherein the biomolecule is a protein or a peptide.
That is, a labeled amidation method for a protein or peptide, wherein a labeled amidated protein or labeled amidated peptide is obtained by allowing an amidation reagent labeled with a nitrogen atom isotope 15 N to act on the carboxyl group of the protein or peptide .
(3) The labeled amidation method according to (1) or (2), wherein the carboxyl group is a carboxyl group of an acidic amino acid residue of a protein or peptide.
(4) The labeled amidation method according to (3), wherein the acidic amino acid is selected from glutamic acid and aspartic acid.
（５）前記生体分子が糖鎖である、（１）に記載の標識アミド化法。
すなわち、糖鎖が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより標識糖鎖を得る、糖鎖の標識アミド化法。
（６）前記カルボキシル基が、糖鎖の酸性糖残基が有するカルボキシル基である、（
１）又は（５）に記載の標識アミド化法。
（７）前記酸性糖がシアル酸又はムラミン酸である、（６）に記載の標識アミド化法。
(5) The labeled amidation method according to (1), wherein the biomolecule is a sugar chain.
That is, a labeled amidation method for a sugar chain, wherein a labeled sugar chain is obtained by allowing an amidation reagent labeled with a nitrogen atom isotope 15 N to act on a carboxyl group of the sugar chain.
(6) The carboxyl group is a carboxyl group possessed by an acidic sugar residue of a sugar chain.
The labeled amidation method according to 1) or (5).
(7) The labeled amidation method according to (6), wherein the acidic sugar is sialic acid or muramic acid.
（８）前記アミド化試薬が塩化［15Ｎ］アンモニウムである、（１）〜（７）のいずれかに記載の標識アミド化法。 (8) The labeled amidation method according to any one of (1) to (7), wherein the amidation reagent is [ 15 N] ammonium chloride.
下記（９）〜（１２）の発明は、生体分子の解析方法に向けられる。
（９）生体分子が有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られた生体分子のアミド化体を質量分析法によって解析する、生体分子の解析方法。
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべき生体分子を標識アミド化し、その後、得られた生体分子の標識アミド化体を質量分析法によって解析する、生体分子の解析方法。
The following inventions (9) to (12) are directed to a biomolecule analysis method.
(9) A biomolecule analysis method in which a carboxyl group of a biomolecule is amidated, and then an amidated product of the obtained biomolecule is analyzed by mass spectrometry.
(10) The biomolecule to be analyzed by the labeled amidation method according to any one of (1) to (8) is labeled amidated, and then the labeled amidated product of the obtained biomolecule is analyzed by mass spectrometry. , Biomolecule analysis method.
（１１）前記生体分子が、タンパク質又はペプチドである、（９）又は（１０）に記載の生体分子の解析方法。
すなわち、前記（９）の生体分子の解析方法においては、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られたアミド化タンパク質又はアミド化ペプチドを質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
前記（１０）の生体分子の解析方法においては、（２）〜（４）及び（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべきタンパク質又はペプチドを標識アミド化し、その後、得られた標識タンパク質又は標識ペプチドを質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
(11) The biomolecule analysis method according to (9) or (10), wherein the biomolecule is a protein or a peptide.
That is, in the biomolecule analysis method of (9) above, the protein or peptide is amidated by amidating the carboxyl group of the protein or peptide, and then analyzing the obtained amidated protein or amidated peptide by mass spectrometry. analysis method.
In the biomolecule analysis method according to (10) above, the protein or peptide to be analyzed by the labeled amidation method according to any one of (2) to (4) and (8) is labeled and then obtained. A method for analyzing a protein or peptide, wherein the labeled protein or peptide is analyzed by mass spectrometry.
（１２）前記生体分子が糖鎖である、（９）又は（１０）に記載の生体分子の解析方法。
すなわち、前記（９）の生体分子の解析方法においては、糖鎖が有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られたアミド化糖鎖を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
前記（１０）の生体分子の解析方法においては、（５）〜（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべき糖鎖を標識アミド化し、その後、得られた標識糖鎖を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
(12) The biomolecule analysis method according to (9) or (10), wherein the biomolecule is a sugar chain.
That is, in the biomolecule analysis method of (9) above, a sugar chain analysis method in which a carboxyl group of a sugar chain is amidated, and then the obtained amidated sugar chain is analyzed by mass spectrometry.
In the biomolecule analysis method according to (10), the sugar chain to be analyzed by the labeled amidation method according to any one of (5) to (8) is labeled amidated, and then the obtained labeled sugar chain is used. A method for analyzing sugar chains, which is analyzed by mass spectrometry.
下記（１３）〜（１６）の発明は、標識アミド化体に向けられる。
（１３）カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、生体分子の標識アミド化体。
（１４）前記生体分子が、質量分析により解析すべき生体分子である、（１３）に記載の標識アミド化体。
The inventions (13) to (16) below are directed to labeled amidated products.
(13) A labeled amidated form of a biomolecule in which a carboxyl group is 15 N-labeled amidated.
(14) The labeled amidated product according to (13), wherein the biomolecule is a biomolecule to be analyzed by mass spectrometry.
（１５）前記生体分子が、タンパク質又はペプチドである、（１３）又は（１４）に記載の標識アミド化体。
すなわち、前記（１３）の標識アミド化体においては、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、タンパク質又はペプチドの標識アミド化体。
前記（１４）の標識アミド化体においては、前記タンパク質又はペプチドが、質量分析により解析すべきタンパク質又はペプチドである、標識アミド化体。
(15) The labeled amidated product according to (13) or (14), wherein the biomolecule is a protein or a peptide.
That is, in the labeled amidated product of (13) above, a labeled amidated protein or peptide in which the carboxyl group is 15 N-labeled amidated.
In the labeled amidated product of (14) above, the labeled amidated product, wherein the protein or peptide is a protein or peptide to be analyzed by mass spectrometry.
（１６）前記生体分子が糖鎖である、（１３）又は（１４）に記載の標識アミド化体。
すなわち、前記（１３）の標識アミド化体においては、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、糖鎖の標識アミド化体。
前記（１４）の標識アミド化体においては、前記糖鎖が、質量分析により解析すべき糖鎖である、糖鎖の標識アミド化体。
(16) The labeled amidated product according to (13) or (14), wherein the biomolecule is a sugar chain.
That is, in the labeled amidated product of (13), a labeled amidated product of a sugar chain in which a carboxyl group is 15 N-labeled amidated.
In the labeled amidated product of (14), a labeled amidated product of a sugar chain, wherein the sugar chain is a sugar chain to be analyzed by mass spectrometry.
本発明によると、アミド化法を用いることにより、質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供することができる。又本発明によると、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供することができる。 According to the present invention, by using an amidation method, a method for improving the analysis sensitivity of a biomolecule in mass spectrometry can be provided. In addition, according to the present invention, it is possible to provide a method for quickly and easily analyzing a biomolecule using a method for improving analysis sensitivity in mass spectrometry.
以下の記述は、標識アミド化法に関する。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を15Ｎ標識アミド化して15Ｎ標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換する方法である。生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。なお本明細書において、「生体分子」とは生体高分子を含む意味で用いる。
The following description relates to a labeled amidation method.
The present invention is a method for converting a carboxyl group (—COOH group) of a biomolecule into a 15 N-labeled carbamoyl group (—CO 15 NH 2 group) by 15 N-labeled amidation. Examples of biomolecules include proteins / peptides and sugar chains. In the present specification, “biomolecule” is used to include biopolymers.
以下、本発明の標識アミド化法の一例として、タンパク質又はペプチドを標識アミド化する方法について説明する。この例においては、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基のカルボキシル基を標識アミド化する。上記酸性アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。すなわち本発明によって例えばアスパラギン酸はアスパラギンに、グルタミン酸はグルタミンに変換される。なお本発明においては、標識アミド化すべきタンパク質又はペプチドが無置換のＣ末端を有している場合、Ｃ末端カルボキシル基も標識アミド化される。 Hereinafter, as an example of the labeling amidation method of the present invention, a method for labeling amidation of a protein or peptide will be described. In this example, the carboxyl group of an acidic amino acid residue of a protein or peptide is labeled and amidated. The acidic amino acid may be any of α-amino acid, β-amino acid, γ-amino acid, and δ-amino acid. Examples of the α-amino acid include aspartic acid and glutamic acid. That is, according to the present invention, for example, aspartic acid is converted to asparagine and glutamic acid is converted to glutamine. In the present invention, when the protein or peptide to be labeled amidated has an unsubstituted C-terminus, the C-terminal carboxyl group is also labeled amidated.
標識アミド化の試薬としては、アミド化試薬として用いることができる化合物の、窒素同位体15Ｎによる標識体を特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化［15Ｎ］アンモニウム等を用いることができる。標識アミド化の方法としては、標識アミド化試薬を用いることの他は特に限定することなく、公知のアミド化法を用いることができる。例えば、タンパク質又はペプチドを必要に応じて変性剤で処理し、標識アミド化剤と縮合剤とを用いて標識アミド化を行うことができる。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、シアナミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド等を用いることができる。 As a labeled amidation reagent, a labeled form of a compound that can be used as an amidation reagent with nitrogen isotope 15 N can be used without any particular limitation. For example, [ 15 N] ammonium chloride can be used. As a method of labeled amidation, a known amidation method can be used without particular limitation, except that a labeled amidation reagent is used. For example, protein or peptide can be treated with a denaturing agent as necessary, and labeled amidation can be performed using a labeled amidating agent and a condensing agent. As the condensing agent, carbodiimide such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC), N, N′-diisopropylcarbodiimide, cyanamide, N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or the like is used. Can do.
本発明においては、カルボジイミドを縮合剤として用いるカルボジイミド法を用いることが好ましい。このとき、標識アミド化試薬として塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いることが好ましい。また、カルボジイミドとしては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いることが好ましい。カルボジイミド法を用いる場合、例えば以下のように標識アミド化を行うことができる。タンパク質を、塩酸グアニジンを存在させた塩化［15Ｎ］アンモニウム水溶液に溶解し、塩酸グアニジンを存在させたカルボジイミドを加えて反応させる。塩化［15Ｎ］アンモニウムの量としては、タンパク質６００ｐｍｏｌに対して５００ｍＭ〜１Ｍ程度のものを５０μｌ用いるとよい。カルボジイミドの量としては、塩化［15Ｎ］アンモニウムの０．０８〜０．２倍当量程度を用いることができる。またこの反応は、４〜３０℃で１〜１２時間程度の条件下で行うことができる。 In the present invention, it is preferable to use a carbodiimide method using carbodiimide as a condensing agent. At this time, it is preferable to use [ 15 N] ammonium chloride as a labeled amidation reagent. As carbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) is preferably used. When using the carbodiimide method, for example, labeled amidation can be performed as follows. The protein is dissolved in an aqueous solution of [ 15 N] ammonium chloride in the presence of guanidine hydrochloride, and reacted with carbodiimide in the presence of guanidine hydrochloride. As the amount of [ 15 N] ammonium chloride, 50 μl of about 500 mM to 1 M may be used for 600 pmol of protein. As the amount of carbodiimide, about 0.08 to 0.2 times equivalent of [ 15 N] ammonium chloride can be used. Moreover, this reaction can be performed on 4-30 degreeC on the conditions for about 1 to 12 hours.
以上のようにして、タンパク質又はペプチドのカルボキシル基を標識アミド化することができる。本発明の標識アミド化は、タンパク質・ペプチドを質量分析によって解析する場合に特に有用である。 As described above, the carboxyl group of the protein or peptide can be labeled and amidated. The labeled amidation of the present invention is particularly useful when a protein / peptide is analyzed by mass spectrometry.
以下、本発明の標識アミド化法の他の一例として、糖鎖を標識アミド化する方法について説明する。この例においては、糖鎖の酸性糖残基のカルボキシル基を標識アミド化する。上記酸性糖としては、シアル酸、ムラミン酸等が挙げられる。本発明の標識アミド化法は、特にシアル酸において有用である。ここでシアル酸は、ノイラミン酸のＮ−アシル体及びその誘導体であり、具体的にはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸等が挙げられる。 Hereinafter, as another example of the labeled amidation method of the present invention, a method for labeling and amidating a sugar chain will be described. In this example, the carboxyl group of the acidic sugar residue of the sugar chain is labeled and amidated. Examples of the acidic sugar include sialic acid and muramic acid. The labeled amidation method of the present invention is particularly useful for sialic acid. Here, sialic acid is an N-acyl derivative of neuraminic acid and derivatives thereof, and specific examples include N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid.
標識アミド化の試薬としては、アミド化試薬として用いることができる化合物の、窒素同位体15Ｎによる標識体を特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化［15Ｎ］アンモニウム等を用いることができる。標識アミド化の方法としては、標識アミド化試薬を用いることの他は特に限定することなく、公知のアミド化法を用いることができる。例えば、糖鎖を標識アミド化剤と縮合剤とを用いて標識アミド化を行うことができる。縮合剤としては、上述のタンパク質・ペプチドの標識アミド化法におけるものを用いることもできるが、好ましくは４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）が用いられる。例えば、標識アミド化剤に塩化［15Ｎ］アンモニウムを用い、縮合剤にＤＭＴ−ＭＭを用いる場合、塩化［15Ｎ］アンモニウムは糖鎖の５万〜５０万倍当量程度、ＤＭＴ−ＭＭは塩化［15Ｎ］アンモニウムの０．１〜０．５倍当量程度を用いることができる。またこの反応は、３０〜６０℃で５〜４８時間程度の条件下で行うことができる。 As a labeled amidation reagent, a labeled form of a compound that can be used as an amidation reagent with nitrogen isotope 15 N can be used without any particular limitation. For example, [ 15 N] ammonium chloride can be used. As a method of labeled amidation, a known amidation method can be used without particular limitation, except that a labeled amidation reagent is used. For example, labeled amidation can be performed on a sugar chain using a labeled amidating agent and a condensing agent. As the condensing agent, those in the above-described labeling amidation method of protein / peptide can be used, but 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4- is preferred. Methylmorpholinium chloride n-hydrate (DMT-MM) is used. For example, when [ 15 N] ammonium chloride is used as the labeling amidating agent and DMT-MM is used as the condensing agent, [ 15 N] ammonium chloride is about 50,000 to 500,000 times equivalent to the sugar chain, and DMT-MM is chlorinated. About 15 to 0.5 equivalents of [ 15 N] ammonium can be used. This reaction can be carried out at 30 to 60 ° C. for about 5 to 48 hours.
以上のようにして、糖鎖を標識アミド化することができる。本発明の標識アミド化は、糖鎖を質量分析によって解析する場合に特に有用である。 As described above, the sugar chain can be labeled and amidated. The labeled amidation of the present invention is particularly useful when a sugar chain is analyzed by mass spectrometry.
以下の記述は、標識アミド化体に関する。
本発明は、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、生体分子のアミド化体である。このアミド化体は、上記の標識アミド化法において記載したように、生体分子を標識アミド化することによって得ることができる。生体分子としては、タンパク質、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。解析したい生体分子の標識アミド化体である場合は、質量分析によって解析する場合に特に有用に用いられる。
The following description relates to labeled amidated products.
The present invention is an amidated form of a biomolecule having a 15 N-labeled amidated carboxyl group. This amidated product can be obtained by labeling and amidating a biomolecule as described in the labeling amidation method above. Biomolecules include proteins, peptides, sugar chains and the like. The labeled amidated form of a biomolecule to be analyzed is particularly useful when analyzed by mass spectrometry.
以下の記述は、生体分子の解析方法に関する。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）をアミド化してカルバモイル基（−ＣＯＮＨ2基）に変換する処理を行うことにより生体分子の解析を行う方法である。解析すべき生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。
The following description relates to a method for analyzing biomolecules.
The present invention is a method for analyzing a biomolecule by performing a process of amidating a carboxyl group (—COOH group) of a biomolecule into a carbamoyl group (—CONH 2 group). Examples of biomolecules to be analyzed include proteins / peptides and sugar chains.
以下、本発明の生体分子の解析方法の一例として、タンパク質又はペプチドを解析する方法について説明する。この例においては、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化する。上記酸性アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。すなわち本発明によって例えばアスパラギン酸はアスパラギンに、グルタミン酸はグルタミンに変換される。なお本発明においては、アミド化すべきタンパク質又はペプチドが無置換のＣ末端を有している場合、Ｃ末端カルボキシル基もアミド化される。 Hereinafter, as an example of the biomolecule analysis method of the present invention, a method for analyzing a protein or peptide will be described. In this example, the carboxyl group of the acidic amino acid residue of the protein or peptide is amidated. The acidic amino acid may be any of α-amino acid, β-amino acid, γ-amino acid, and δ-amino acid. Examples of the α-amino acid include aspartic acid and glutamic acid. That is, according to the present invention, for example, aspartic acid is converted to asparagine and glutamic acid is converted to glutamine. In the present invention, when the protein or peptide to be amidated has an unsubstituted C-terminus, the C-terminal carboxyl group is also amidated.
本発明のタンパク質・ペプチドの解析法においては、解析すべきタンパク質又はペプチドのカルボキシル基をアミド化し、得られたアミド化タンパク質又はアミド化ペプチドを質量分析によって解析する。アミド化タンパク質又はアミド化ペプチドは、質量分析に供する前に、必要に応じて遠心分離、還元−カルボキシメチル化、断片化、脱塩等の処理を行うと良い。これらの処理は、公知の方法を利用して行うことができる。 In the protein / peptide analysis method of the present invention, the carboxyl group of the protein or peptide to be analyzed is amidated, and the obtained amidated protein or amidated peptide is analyzed by mass spectrometry. The amidated protein or amidated peptide may be subjected to treatment such as centrifugation, reduction-carboxymethylation, fragmentation, desalting, etc., as necessary, before being subjected to mass spectrometry. These processes can be performed using a known method.
本発明の解析方法においては、アミド化は、カルボキシル基を非標識カルバモイル基（−ＣＯ14ＮＨ2基）に変換することと、標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換することとの両方を含む。非標識アミド化法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。また標識アミド化法としては、上述したタンパク質又はペプチドの標識アミド化法を用いることができる。 In the analysis method of the present invention, amidation includes conversion of a carboxyl group into an unlabeled carbamoyl group (—CO 14 NH 2 group) and conversion into a labeled carbamoyl group (—CO 15 NH 2 group). Includes both. As the unlabeled amidation method, a known method can be used without any particular limitation. As the labeled amidation method, the above-described labeled amidation method of protein or peptide can be used.
本発明の解析方法においてアミド化を行うことは、以下の点で好ましい。すなわち、優先的な開裂が起こりやすいアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基等の酸性アミノ酸残基の部位がアミド化によって無くなるため、他のアミノ酸残基の部位においても開裂が起こりやすくなり、多種類のフラグメントイオンを検出することができる。従って、より多くの配列情報を得ることができる。 Performing amidation in the analysis method of the present invention is preferable in the following points. That is, acidic amino acid residues such as aspartic acid residues and glutamic acid residues that are likely to undergo preferential cleavage are eliminated by amidation, so that cleavage is likely to occur at other amino acid residue sites as well. Fragment ions can be detected. Therefore, more sequence information can be obtained.
本発明の解析方法においては、以下の理由で、標識アミド化を行うことが特に好ましい。すなわち、標識アミド化によって−ＣＯＯＨ基を−ＣＯ15ＮＨ2基に変換することで、解析すべきタンパク質・ペプチドと標識アミド化タンパク質・ペプチドとの質量差がカルボキシル基１個あたり０．０１３０１９３８と極微小に抑えられる。すなわち、標識アミド化前後でタンパク質・ペプチドの質量がほとんど変わらない。このため、質量分析によって得られる質量データは、標識アミド化前のもとの解析すべきタンパク質・ペプチドの質量をほぼ反映しており、質量分析データからもとのタンパク質・ペプチドの解析をより容易に行うことができる。従って、ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）解析やＭＳ／ＭＳイオンサーチ（ＭＩＳ）解析において、データベースとの照合が容易であり、迅速にかつ容易にタンパク質・ペプチドの同定を行うことができる。 In the analysis method of the present invention, labeled amidation is particularly preferred for the following reasons. That is, by converting a —COOH group to a —CO 15 NH 2 group by labeled amidation, the mass difference between the protein / peptide to be analyzed and the labeled amidated protein / peptide is as small as 0.01301938 per carboxyl group. Can be kept small. That is, the mass of the protein / peptide hardly changes before and after the labeling amidation. For this reason, the mass data obtained by mass spectrometry almost reflects the mass of the protein / peptide to be analyzed before labeling amidation, making it easier to analyze the original protein / peptide from the mass spectrometry data. Can be done. Therefore, in peptide mass fingerprint (PMF) analysis and MS / MS ion search (MIS) analysis, collation with a database is easy, and protein / peptide identification can be performed quickly and easily.
一方、非標識アミド化を行った場合は、解析すべきタンパク質・ペプチドと非標識アミド化タンパク質・ペプチドとでカルボキシル基１個あたり約１の質量差が生じる。ＰＭＦ解析やＭＩＳ解析においては、非標識アミド化による質量変化が質量誤差として支障となることもある。 On the other hand, when unlabeled amidation is performed, a mass difference of about 1 per carboxyl group occurs between the protein / peptide to be analyzed and the unlabeled amidated protein / peptide. In PMF analysis and MIS analysis, mass change due to unlabeled amidation may interfere with mass error.
以下、本発明の生体分子の解析方法の他の一例として、糖鎖を解析する方法について説明する。この例においては、糖鎖が有する酸性糖残基のカルボキシル基をアミド化する。上記酸性糖としては、シアル酸、ムラミン酸等が挙げられる。得られたアミド化糖鎖は、質量分析によって解析する。 Hereinafter, a method for analyzing a sugar chain will be described as another example of the biomolecule analysis method of the present invention. In this example, the carboxyl group of the acidic sugar residue of the sugar chain is amidated. Examples of the acidic sugar include sialic acid and muramic acid. The obtained amidated sugar chain is analyzed by mass spectrometry.
本発明の解析方法においては、アミド化は、カルボキシル基を非標識カルバモイル基（−ＣＯ14ＮＨ2基）に変換することと、標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換することとの両方を含む。非標識アミド化法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。また標識アミド化法としては、上述した糖鎖の標識アミド化法を用いることができる。 In the analysis method of the present invention, amidation includes conversion of a carboxyl group into an unlabeled carbamoyl group (—CO 14 NH 2 group) and conversion into a labeled carbamoyl group (—CO 15 NH 2 group). Includes both. As the unlabeled amidation method, a known method can be used without any particular limitation. As the labeled amidation method, the above-described labeled amidation method of a sugar chain can be used.
本発明の解析方法においてアミド化を行うことは、以下の点で好ましい。例えばシアル酸含有糖鎖の場合、優先的な脱離が起こりやすいシアル酸の部位がアミド化によって無くなる。このため、ISDやPSDにおいてシアル酸の脱離が抑制される分、分子量関連イオンの絶対量が増加し、感度が向上する。またMS/MS解析においては、シアル酸の脱離が抑制され、他の部位由来のフラグメントイオンが検出される。このことを利用し、シアル酸付加イオンをプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルと、シアル酸脱離イオンをプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルとから、より詳細な糖鎖構造解析を行うことが可能となる。 Performing amidation in the analysis method of the present invention is preferable in the following points. For example, in the case of a sialic acid-containing sugar chain, the site of sialic acid that tends to undergo preferential elimination is eliminated by amidation. For this reason, the absolute amount of molecular weight-related ions is increased and sensitivity is improved as much as the elimination of sialic acid is suppressed in ISD and PSD. In MS / MS analysis, the elimination of sialic acid is suppressed and fragment ions derived from other sites are detected. Using this, it is possible to perform more detailed glycan structure analysis from MS / MS spectra using sialic acid addition ions as precursor ions and MS / MS spectra using sialic acid elimination ions as precursor ions. It becomes.
本発明の解析方法においては、以下の理由で、標識アミド化を行うことが特に好ましい。すなわち、標識アミド化によって−ＣＯＯＨ基を−ＣＯ15ＮＨ2基に変換することで、解析すべき糖鎖と標識アミド化糖鎖との質量差がカルボキシル基１個あたり０．０１３０１９３８と極微小に抑えられる。すなわち、標識アミド化前後で糖鎖の質量がほとんど変わらない。このため、質量分析によって得られる質量データは、標識アミド化前のもとの解析すべき糖鎖の質量をほぼ反映しており、質量分析データからもとの糖鎖の解析をより容易に行うことができる。従って、糖鎖のデータベース解析において、質量変化を考慮する手間を省くことが可能となり、迅速にかつ容易に糖鎖の同定を行うことができる。 In the analysis method of the present invention, labeled amidation is particularly preferred for the following reasons. That is, by converting a —COOH group to a —CO 15 NH 2 group by labeled amidation, the mass difference between the sugar chain to be analyzed and the labeled amidated sugar chain is as small as 0.01301938 per carboxyl group. It can be suppressed. That is, the mass of the sugar chain hardly changes before and after the labeling amidation. For this reason, the mass data obtained by mass spectrometry almost reflects the mass of the sugar chain to be analyzed before labeling amidation, and the analysis of the original sugar chain can be performed more easily from the mass spectrometry data. be able to. Therefore, in the sugar chain database analysis, it is possible to save the trouble of considering the mass change, and the sugar chain can be identified quickly and easily.
一方、非標識アミド化を行った場合は、解析すべき糖鎖と非標識アミド化糖鎖とでカルボキシル基１個あたり約１の質量差が生じる。糖鎖のデータベース解析においては、非標識アミド化による質量変化が質量誤差として支障となることもある。 On the other hand, when unlabeled amidation is performed, a mass difference of about 1 per carboxyl group occurs between the sugar chain to be analyzed and the unlabeled amidated sugar chain. In sugar chain database analysis, mass changes due to unlabeled amidation may interfere with mass errors.
［実施例１］
ミオグロビンに対し、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。
[Example 1]
Each of myoglobin was tested using mass spectrometry to confirm that amidation was performed using [ 14 N] ammonium chloride and [ 15 N] ammonium chloride.
非標識アミド化については、以下のように行った。
ミオグロビン６００pmolを、５Ｍ 塩酸グアニジン／１Ｍ 14ＮＨ4Ｃｌ ５０μlに溶解した。この溶液に、５Ｍ 塩酸グアニジン／０．４Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を１５μl添加して反応液を調製し、得られた反応液を室温で２時間インキュベーションした。マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社製）に反応液を加え、さらに０．００１Ｍ ＨＣｌを３３５μl加え、１４０００rpm、４℃で７０分遠心した。さらに０．００１Ｍ ＨＣｌを４００μl加え、１４０００rpm、４℃で７０分遠心した。その後、５０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3を加え、溶液の全量が１００μlになるように調製した。これに１ＭＤＤＴを１μl添加し、５６℃で１時間インキュベーションした。さらに１Ｍヨードアセトアミドを５．５μl添加し、室温で４５分インキュベーションした。その後、１００ｍＭ ＣａＣｌ2を５μl加えた。Sequencing Grade Modified Trypsin（プロメガ社製）を６pmol添加し、３７℃で１６時間インキュベーションした。０．１重量％ＴＦＡを１０μl添加し、ZipTip μ-C18（ミリポア社製）を用いて脱塩精製を行うことにより、ミオグロビンのトリプシン消化断片を得た。
The unlabeled amidation was performed as follows.
600 pmol of myoglobin was dissolved in 50 μl of 5M guanidine hydrochloride / 1M 14 NH 4 Cl. To this solution, 15 μl of 5M guanidine hydrochloride / 0.4M1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) was added to prepare a reaction solution, and the resulting reaction solution was incubated at room temperature for 2 hours. . The reaction solution was added to Microcon YM-10 (manufactured by Millipore), and 335 μl of 0.001M HCl was further added, followed by centrifugation at 14000 rpm and 4 ° C. for 70 minutes. Further, 400 μl of 0.001M HCl was added and centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 70 minutes. Thereafter, 50 mM NH 4 HCO 3 was added to prepare a total solution volume of 100 μl. 1 μl of 1MDDT was added thereto and incubated at 56 ° C. for 1 hour. Further, 5.5 μl of 1M iodoacetamide was added and incubated at room temperature for 45 minutes. Thereafter, 5 μl of 100 mM CaCl 2 was added. 6 pmol of Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega) was added and incubated at 37 ° C. for 16 hours. 10 μl of 0.1 wt% TFA was added, and desalting purification was performed using ZipTip μ-C18 (Millipore) to obtain a trypsin-digested fragment of myoglobin.
標識アミド化については、14ＮＨ4Ｃｌの代わりに15ＮＨ4Ｃｌを用いた以外は、上記非標識アミド化と同様に行うことにより、ミオグロビンの消化断片を得た。 The labeled amidation was carried out in the same manner as the unlabeled amidation except that 15 NH 4 Cl was used in place of 14 NH 4 Cl to obtain a digested fragment of myoglobin.
別途用意したアミド化されていないミオグロビンのトリプシン消化断片と、上記非標識及び標識アミド化によって得られたトリプシン消化断片とについて、それぞれAXIMA-QIT（島津製作所製）によって質量分析を行った結果を図１の（a）及び（b）に示す。すなわち図１の（a）及び（b）は、ＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ（配列番号１）の配列を有するミオグロビントリプシン消化断片(m/z=1606）（以下、単にペプチドと表記する。）の、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）ものと、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったものと、標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったものとのスペクトルを比較して表している。なお、図１中のスペクトルはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にフラグメントイオンの相対強度（%Int.）を表す。 Figure 2 shows the results of mass spectrometry using AXIMA-QIT (manufactured by Shimadzu Corporation) for the trypsin digestion fragment of myoglobin that was prepared separately and the trypsin digestion fragment obtained by the above unlabeled and labeled amidation, respectively. 1 (a) and (b). That is, (a) and (b) in FIG. 1 show an amidation reaction of a myoglobin trypsin digested fragment (m / z = 1606) (hereinafter simply referred to as a peptide) having the sequence of VEADIAGHGQEVLIR (SEQ ID NO: 1). compared was not performed and the (non-amidation) ones, and having been subjected to the unlabeled amidation reaction (amidation (14 N)), the spectrum of which was labeled amidation reaction (amidation (15 N)) It expresses. In each spectrum in FIG. 1, the horizontal axis represents mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity (% Int.) Of fragment ions.
図１において、（a）の下段は、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の下段のピーク（m/z=1606.85）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。（a）の中段は、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の中段のピーク（m/z=1603.91）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。（a）の上段は、標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の上段のピーク（m/z=1606.89）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。 In FIG. 1, the lower part of (a) is an MS / MS spectrum of a peptide that was not subjected to an amidation reaction (non-amidation). In this spectrum, the lower peak (m / z = 1606.85) in (b) was measured as a precursor ion (Precursor ion). The middle row of (a) is an MS / MS spectrum of a peptide that has undergone an unlabeled amidation reaction (amidation ( 14 N)). In this spectrum, the middle peak (m / z = 1603.91) of (b) was measured as a precursor ion (Precursor ion). The upper part of (a) is an MS / MS spectrum of a peptide subjected to a labeled amidation reaction (amidation ( 15 N)). In this spectrum, the upper peak (m / z = 1606.89) of (b) was measured as a precursor ion (Precursor ion).
ペプチドの非標識アミド化が行われれば、非標識アミド化ペプチドにおいては、アミド化反応を行わなかったペプチドよりも、反応によって変換されたカルボキシル基１個あたり質量数が約１Ｄａ小さくなる。図１によると、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいてペプチド中の同じ部位で切断されて生成したフラグメントイオン同士の質量数を比較した場合、非標識アミド化反応を行ったペプチドから生成したフラグメントイオンの方が、アミド化反応を行わなかったペプチドから生成したフラグメントイオンよりも、上記非標識アミド化反応によって変換されたカルボキシル基の数だけ小さい。以上のことから、非標識アミド化反応によってペプチドの非標識アミド化が行われたことが示された。 If unlabeled amidation of a peptide is performed, the mass number per carboxyl group converted by the reaction in the unlabeled amidated peptide is smaller by about 1 Da than in the peptide that has not undergone the amidation reaction. According to FIG. 1, when comparing the mass numbers of fragment ions generated by cleaving at the same site in a peptide in the MS / MS spectrum, the fragment ion generated from the peptide subjected to the unlabeled amidation reaction, The number of carboxyl groups converted by the above-mentioned unlabeled amidation reaction is smaller than the fragment ion generated from the peptide not subjected to the amidation reaction. From the above, it was shown that the unlabeled amidation of the peptide was performed by the unlabeled amidation reaction.
さらに、非標識アミド化によって、ペプチドにおけるアスパラギン酸及びグルタミン酸部位での優先的な開裂が抑制されたため、非標識アミド化反応を行わなかったペプチドには検出されなかった他のフラグメントイオンが検出された。また、内部配列断片（Internal fragment）のフラグメントイオンも新たに検出された。このように、ペプチドの非標識アミド化を行うことによってフラグメントイオンの検出率が向上したことが示された。 In addition, unlabeled amidation suppressed preferential cleavage at the aspartate and glutamate sites in the peptide, thus detecting other fragment ions that were not detected in the peptide that did not undergo the unlabeled amidation reaction. . Moreover, a fragment ion of an internal fragment was also newly detected. Thus, it was shown that the detection rate of fragment ions was improved by performing unlabeled amidation of the peptide.
また、標識アミド化反応を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルにおいては、アミド化反応を行わなかったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるものとほぼ同じ質量数を有するフラグメントイオンが検出された。さらに、標識アミド化反応を行わなかったペプチドには検出されなかった他のフラグメントイオンが検出された。また、内部配列断片（Internal fragment）のフラグメントイオンも新たに検出された。このことと、上述の非標識アミド化による結果とから、標識アミド化反応によってもペプチドの標識アミド化が行われたことが示された。従って、ペプチドの標識アミド化を行うことによっても、ペプチドにおけるアスパラギン酸及びグルタミン酸部位での優先的な開裂が抑制され、その結果、フラグメントイオンの検出率が向上したことが示された。 Further, in the MS / MS spectrum of the peptide subjected to the labeled amidation reaction, fragment ions having almost the same mass number as those in the MS / MS spectrum of the peptide not subjected to the amidation reaction were detected. Furthermore, other fragment ions that were not detected in the peptide that did not undergo the labeled amidation reaction were detected. Moreover, a fragment ion of an internal fragment was also newly detected. From this and the result of the above-mentioned unlabeled amidation, it was shown that the labeled amidation of the peptide was also performed by the labeled amidation reaction. Therefore, it was shown that preferential cleavage at the aspartic acid and glutamic acid sites in the peptide was also suppressed by performing labeled amidation of the peptide, and as a result, the detection rate of fragment ions was improved.
上述のことから、ペプチドのアミド化によって質量分析における解析の感度が上昇したことが示された。 From the above, it was shown that the sensitivity of analysis in mass spectrometry was increased by peptide amidation.
［実施例２］
シアル酸含有糖鎖であるシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオース（Sialyllacto-N-Fucopentaose；ＳＬＮＦＰ、Exact Mass:1144.40）に対し、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。なお、ＳＬＮＦＰは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuNAc）、ガラクトース（Galactose）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、グルコース（Glucose）、及びフコース（Fucose）を構成糖とする糖鎖である。ＳＬＮＦＰの構造は、後述の図２中に記載した。
[Example 2]
Sialyllacto-N-Fucopentaose (SLNFP, Exact Mass: 1144.40), which is a sialic acid-containing sugar chain, is amidated using [ 14 N] ammonium chloride and [ 15 N] ammonium chloride. Each experiment was conducted to confirm that this was done by mass spectrometry. SLNFP is a sugar chain composed of N-acetylneuraminic acid (NeuNAc), galactose, N-acetylglucosamine (GlcNAc), glucose (Glucose), and fucose. The structure of SLNFP is shown in FIG.
非標識アミド化については、以下のように行った。
１nmol/μl Sialyllacto-N-Fucopentaose IV（ＳＬＮＦＰ）水溶液１μlを、５０μlの１M 14ＮＨ４Ｃｌ水溶液に添加し、１５μlの１M ４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）水溶液を加え（pH４．２）、３７℃で２４時間インキュベーションした。
直径１cm×高さ５．５cmのリアクションベッセル（島津製作所製）にSephadex G-10（アマシャムバイオサイエンス製）を２．３ml充填し、大気圧下で、生成物のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。２６〜２８drop目（１drop≒４０μl）を回収し、遠心乾燥を行った。
乾燥した回収物を５μlのＨ２Ｏに溶解し、１μlを非標識アミド化ＳＬＮＦＰの質量分析測定用試料とした。
The unlabeled amidation was performed as follows.
1 μl of 1 nmol / μl Sialyllacto-N-Fucopentaose IV (SLNFP) aqueous solution is added to 50 μl of 1M 14 NH 4 Cl aqueous solution, and 15 μl of 1M 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2- Yl) -4-methylmorpholinium chloride chloride (DMT-MM) aqueous solution was added (pH 4.2), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 24 hours.
A reaction vessel having a diameter of 1 cm and a height of 5.5 cm (manufactured by Shimadzu Corporation) was filled with 2.3 ml of Sephadex G-10 (manufactured by Amersham Biosciences), and the product was subjected to gel filtration chromatography under atmospheric pressure. The 26th to 28th drops (1 drop≈40 μl) were collected and subjected to centrifugal drying.
The dried recovered product was dissolved in 5 μl of H 2 O, and 1 μl was used as a sample for mass spectrometry measurement of unlabeled amidated SLNFP.
標識アミド化については、14ＮＨ4Ｃｌの代わりに15ＮＨ4Ｃｌを用いた以外は、上記非標識アミド化と同様に行うことにより、標識アミド化ＳＬＮＦＰの質量分析測定用試料を得た。 The labeled amidation was carried out in the same manner as the unlabeled amidation except that 15 NH 4 Cl was used instead of 14 NH 4 Cl to obtain a sample for mass spectrometric measurement of labeled amidated SLNFP.
別途用意したアミド化されていないＳＬＮＦＰと、上記非標識及び標識アミド化によって得られたＳＬＮＦＰとについて、それぞれによって質量分析を行った結果を図２及び図３に示す。図２には、ＳＬＮＦＰの構造も示す。図２のＡは、AXIMA-CFR（島津製作所製）によるMSスペクトルである。図２のＢは、Ａにおける分子量関連イオンのＮａ＋付加体のピーク（［Ｍ＋Ｎａ］＋）の拡大スペクトルである。図３は、AXIMA-QIT（島津製作所製）による、［Ｍ＋Ｎａ］＋をプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルである。また、図２及び図３のスペクトルにおいて、上段スペクトルは、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのもの、中段スペクトルは、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのもの、下段スペクトルは、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのものである。なお、これらのスペクトルはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にフラグメントイオンの相対強度を表す。 FIG. 2 and FIG. 3 show the results of mass spectrometry of separately prepared non-amidated SLNFP and SLNFP obtained by the above unlabeled and labeled amidation, respectively. FIG. 2 also shows the structure of SLNFP. A in FIG. 2 is an MS spectrum by AXIMA-CFR (manufactured by Shimadzu Corporation). FIG. 2B is an expanded spectrum of the Na + adduct peak ([M + Na] + ) of the molecular weight related ion in A. FIG. 3 is an MS / MS spectrum using [M + Na] + as a precursor ion by AXIMA-QIT (manufactured by Shimadzu Corporation). 2 and 3, the upper spectrum is that of SLNFP that has undergone a labeled amidation reaction with 15 NH 4 Cl, and the middle spectrum is that of SLNFP that has undergone an unlabeled amidation reaction with 14 NH 4 Cl. The lower spectrum is that of SLNFP in which no amidation reaction was performed. In these spectra, the horizontal axis represents mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of fragment ions.
糖鎖の非標識アミド化が行われれば、非標識アミド化糖鎖においては、アミド化反応を行わなかった糖鎖よりも、反応によって変換されたカルボキシル基１個あたり質量数が約１Ｄａ小さくなる。図２のＡ及びＢによると、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1166.59）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.48）よりも１Ｄａ小さくなっている。これは、ＳＬＮＦＰが有する１個のＮ−アセチルノイラミン酸のカルボキシル基がカルバモイル基に変換されたことに相当する。このことから、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応によって糖鎖の非標識アミド化が行われたことが示された。 If unlabeled amidation of a sugar chain is performed, the mass number per carboxyl group converted by the reaction in the unlabeled amidated sugar chain is smaller by about 1 Da than in the sugar chain that has not been subjected to the amidation reaction. . According to A and B of FIG. 2, the molecular weight related ion peak (m / z = 1166.59) added with Na + in the spectrum (middle stage) of SLNFP subjected to unlabeled amidation reaction with 14 NH 4 Cl is shown as amidation reaction. It is 1 Da smaller than the molecular weight-related ion peak (m / z = 1167.48) added with Na + in the spectrum of SLNFP (lower part) that was not used. This corresponds to the conversion of the carboxyl group of one N-acetylneuraminic acid in SLNFP into a carbamoyl group. This showed that unlabeled amidation of the sugar chain was performed by unlabeled amidation reaction with 14 NH 4 Cl.
さらに図２のＡ及びＢによると、非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）のシアル酸脱離ピーク（m/z=876.34）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）のシアル酸脱離ピーク（m/z=876.42）よりもイオン強度が小さくなっている。このことから、ISDやPSDによりシアル酸の脱離が抑制されたことが示された。 Further, according to A and B of FIG. 2, the sialic acid elimination peak (m / z = 876.34) of the spectrum (middle stage) of SLNFP subjected to unlabeled amidation reaction is the spectrum of SLNFP not subjected to amidation reaction (m / z = 876.34). The ionic strength is smaller than the sialic acid elimination peak (m / z = 876.42) in the lower part. From this, it was shown that the elimination of sialic acid was suppressed by ISD and PSD.
さらに、MS/MSの結果である図３によると、非標識アミド化されたＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）においては、アミド化されなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）に比べてのシアル酸脱離ピーク（m/z=876付近）のイオン強度が小さくなるとともに他のフラグメントイオンが新たに検出されている。これは、非標識アミド化によって質量分析における糖鎖のシアル酸の脱離が抑制されたために他のフラグメントイオンの検出率が向上したことを示す。この結果、糖鎖の構造決定が容易になった。 Furthermore, according to FIG. 3 which is the result of MS / MS, in the spectrum of unlabeled amidated SLNFP (middle panel), the sialic acid elimination peak (lower panel) compared to the spectrum of non-amidated SLNFP (lower panel) While the ion intensity at around m / z = 876) decreases, other fragment ions are newly detected. This indicates that the detection rate of other fragment ions was improved because the elimination of sialic acid from the sugar chain in mass spectrometry was suppressed by unlabeled amidation. As a result, the sugar chain structure can be easily determined.
そして、図２のＡによると、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（上段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.44）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.48）とほぼ同じ質量数を有するものであった。さらに、MS/MSの結果である図３によると、標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（上段）においては、非標識アミド化を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）におけるように、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）に比べてシアル酸脱離ピークのイオン強度が小さくなるとともに他のフラグメントイオンの検出率が向上した。このことから、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応によって糖鎖の標識アミド化が行われたことが示された。さらに、非標識アミド化と標識アミド化とにおいて、同位体によって質量差の異なるピークが検出されること以外は、糖鎖の開裂パターンやイオンの検出率への同位体による影響はないことが確認された。 According to A in FIG. 2, the molecular weight related ion peak (m / z = 1167.44) added with Na + in the spectrum of SLNFP (upper stage) subjected to labeled amidation reaction with 15 NH 4 Cl (m / z = 1167.44) In the spectrum of SLNFP that was not carried out (lower part), the molecular weight-related ion peak (m / z = 1167.48) added with Na + had almost the same mass number. Furthermore, according to FIG. 3 which is the result of MS / MS, in the spectrum of SLNFP subjected to the labeled amidation reaction (upper part), the amidation reaction as in the spectrum of SLNFP subjected to unlabeled amidation (middle part). The ionic strength of the sialic acid desorption peak was reduced and the detection rate of other fragment ions was improved as compared to the spectrum of SLNFP (lower part) in which no ion was performed. From this, it was shown that the labeled amidation of the sugar chain was performed by the labeled amidation reaction with 15 NH 4 Cl. Furthermore, it is confirmed that there is no influence of the isotope on the sugar chain cleavage pattern and ion detection rate, except that peaks with different mass differences are detected by isotopes in unlabeled amidation and labeled amidation. It was done.
上述のことから、糖鎖のアミド化によって質量分析における解析の感度が上昇したことが示された。 From the above, it was shown that the sensitivity of analysis in mass spectrometry was increased by amidation of sugar chains.
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