JP4120580B2 - Method for selectively recovering N-terminal fragments of proteins - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質のアミノ酸配列の決定の分野において利用できる、タンパク質のＮ末端の回収方法に関する。 The present invention relates to a method for recovering the N-terminus of a protein, which can be used in the field of determining the amino acid sequence of a protein.
タンパク質のアミノ酸配列の決定方法としては、プロテインシーケンサーを用いる方法が挙げられる。プロテインシーケンサーでは、Ｎ末端を標識したタンパク質をエドマン法によってＮ末端から順に１つずつアミノ酸を切り出し、切り出したアミノ酸をより安定な化合物に変換した後、得られた最終生成物をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いてＵＶで検出し、保持時間から順次アミノ酸を決定する。しかし、プロテインシーケンサーには例えば以下のような問題がある。第１に、エドマン法では修飾されたＮ末端で反応が起きないため、直接的にシーケンスできないことである。タンパク質を予め断片化処理することにより間接的にシーケンスすることは可能であるが、この場合は、タンパク質の内部配列は決定できてもＮ末端からの配列を決定することはできない。第２に、エドマン分解の過程で、最終生成物の安定性の低さ等に起因する副反応が、ＨＰＬＣでの解析を困難にすることである。第３に、最終生成物のＵＶの吸光係数が小さく検出感度が低いことである。 Examples of a method for determining the amino acid sequence of a protein include a method using a protein sequencer. In the protein sequencer, the N-terminal labeled protein is cleaved one by one from the N-terminal in order by the Edman method, the cleaved amino acid is converted into a more stable compound, and the resulting final product is analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography). The amino acids are sequentially determined from the retention time. However, protein sequencers have the following problems, for example. First, the Edman method cannot be directly sequenced because no reaction occurs at the modified N-terminus. Although it is possible to indirectly sequence the protein by fragmenting in advance, in this case, the internal sequence of the protein can be determined, but the sequence from the N-terminus cannot be determined. Secondly, in the process of Edman degradation, side reactions caused by the low stability of the final product make analysis by HPLC difficult. Third, the UV absorption coefficient of the final product is small and the detection sensitivity is low.
近年、質量分析装置の感度及び精度が大きく向上し、ペプチドのタンパク質への帰属や部分アミノ酸配列の決定が、質量分析で得られるデータだけから高能率かつ高い信頼性で可能になった。これに伴い、質量分析を用いる方法がタンパク質の解析法として一般化している。このような方法においては、タンパク質を酵素消化などによりペプチドフラグメントに分解し、得られたペプチドフラグメント群の質量値を測定し、得られたデータをデータベースと照合させ、タンパク質の同定を行う。例えば、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法（例えば、Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, and Watanabe C, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90, p. 5011-5105、及び、James P, Quadroni M, Carafoli E, and Gonnet G, Biochemical Biophysical Research Communications, 1993, 195, p. 58-64参照）や、ペプチドのアミノ酸配列情報を直接得るためのＭＳ／ＭＳによる解析（例えば、Hunt DF, Yates JR, Shabanowitz J, Winston S, Hauer CH, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America1986, 83, p. 6233-6237参照）が行われている。しかし、これらの方法では、タンパク質のＮ末端ペプチドフラグメントを他のペプチドフラグメントと区別することはできない。このため、タンパク質の内部配列は決定できてもＮ末端からの配列を決定することはできない。 In recent years, the sensitivity and accuracy of mass spectrometers have greatly improved, and it has become possible to assign peptides to proteins and determine partial amino acid sequences with high efficiency and high reliability only from data obtained by mass spectrometry. Along with this, a method using mass spectrometry has been generalized as a protein analysis method. In such a method, a protein is decomposed into peptide fragments by enzymatic digestion or the like, the mass value of the obtained peptide fragment group is measured, the obtained data is collated with a database, and the protein is identified. For example, the peptide mass finger printing (PMF) method (eg, Henzel WJ, Billeci ™, Stults JT, Wong SC, Grimley C, and Watanabe C, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90, p. 5011-5105 and James P, Quadroni M, Carafoli E, and Gonnet G, Biochemical Biophysical Research Communications, 1993, 195, p. 58-64) and MS for directly obtaining amino acid sequence information of peptides / MS analysis (for example, see Hunt DF, Yates JR, Shabanowitz J, Winston S, Hauer CH, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 1986, 83, p. 6233-6237) . However, these methods do not distinguish N-terminal peptide fragments of proteins from other peptide fragments. For this reason, even if the internal sequence of the protein can be determined, the sequence from the N-terminus cannot be determined.
本発明の目的は、質量分析を用いたタンパク質のＮ末端からの配列決定を行うために、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、そのＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収する方法を提供することにある。 It is an object of the present invention to selectively sequence N-terminal peptide fragments regardless of whether the N-terminus of the protein to be analyzed has been modified in order to perform sequencing from the N-terminus of the protein using mass spectrometry. It is to provide a method of recovering.
本発明者らは、鋭意検討した結果、解析すべきタンパク質のリジン残基等の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、得られたグアニジノ化タンパク質を断片化し、解析すべきタンパク質のＮ末端に由来するＮ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとを、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用して分離を行うことによって上記本目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have guanidino-ized side chain amino groups such as lysine residues of the protein to be analyzed, fragmented the obtained guanidinized protein, and N derived from the N-terminus of the protein to be analyzed. It was found that the above object was achieved by separating terminal peptide fragments and other peptide fragments using the difference in reactivity or affinity with respect to the support, and the present invention was completed. It was.
本発明は以下の発明を含む。 The present invention includes the following inventions.
下記＜１＞は、Ｎ末端が修飾されたタンパク質とＮ末端が修飾されていないタンパク質とからなる解析すべきタンパク質に対して、まず保護工程としてグアニジノ化工程（１）を行い、次に修飾工程と断片化工程（２）とを行い、最後に分離工程（３）を行う形態を示す。断片化工程（２）においては、支持体として、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有するものを用いる。 In the following <1>, a guanidinolation step (1) is first performed as a protection step on a protein to be analyzed consisting of a protein with an N-terminal modified and a protein with no N-terminal modification , and then the modification step And a fragmentation step (2), and finally a separation step (3) is shown. In the fragmentation step (2), a support having a molecule or a part of a molecule that can form a covalent bond by chemical reaction with an amino group is used.
＜１＞ Ｎ末端が修飾されたタンパク質とＮ末端が修飾されていないタンパク質とからなる解析すべきタンパク質の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質を得るグアニジノ化工程（１）と、
前記グアニジノ化されたタンパク質中の非修飾Ｎ末端を修飾する修飾工程と、
前記修飾工程に付されたグアニジノ化タンパク質を断片化し、前記解析すべきタンパク質のＮ末端に由来するＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る断片化工程（２）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記支持体として、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有するものを用いて、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、アミノ基を介して前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
<1> A side chain amino group of an amino acid residue having a side chain amino group of a protein to be analyzed consisting of a protein with an N-terminal modified and a protein with no N-terminal modified , and the side chain A guanidinolation step (1) for obtaining a guanidinoylated protein in which an amino group is converted to a guanidino group ;
A modification step of modifying an unmodified N-terminus in the guanidinoylated protein;
The guanidinoylated protein subjected to the modification step is fragmented, and an N-terminal peptide fragment (a) derived from the N-terminus of the protein to be analyzed, and one or more kinds other than the N-terminal peptide fragment (a) A fragmentation step (2) to obtain another peptide fragment (b);
A separation step (3) for selectively eluting the N-terminal peptide fragment (a) from the N-terminal peptide fragment (a) and the other peptide fragment (b) by utilizing a difference in reactivity with a support; In the separation step (3),
As the support, a molecule or a part of the molecule that can form a covalent bond by chemical reaction with an amino group is used, and the other peptide fragment (b) is transferred via the amino group to the support. how is bound, the Ru eluted N-terminal peptide fragment (a), selectively recovering the N-terminal fragment of the protein.
上記タンパク質は、オリゴペプチド、ポリペプチド等のペプチドを含む意味で用いる。 The protein is used in the sense that it includes peptides such as oligopeptides and polypeptides.
＜２＞ 前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂である、＜１＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
本発明においてＤＩＴＣポリマー樹脂とは、ＤＩＴＣが樹脂に複数固定化されているものである。 <2> wherein the support is, p- phenylene Ru isothiocyanate (DITC) polymeric resins der, for selectively recovering N-terminal fragment of the protein according to <1>.
In the present invention, the DITC polymer resin is a resin in which a plurality of DITCs are fixed to the resin.
本発明によれば、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、そのＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収する方法が提供される。この方法を用いると、質量分析を用いたタンパク質のＮ末端からの配列決定を行うことができる。 According to the present invention, there is provided a method for selectively recovering the N-terminal peptide fragment regardless of whether the N-terminus of the protein to be analyzed is modified. Using this method, sequencing from the N-terminus of the protein using mass spectrometry can be performed.
タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法は、保護工程と、断片化工程と、分離工程とを含む。本方法においては、まず保護工程（１）を行い、次に断片化工程（２）を行い、最後に分離工程（３）を行う形態と、工程（１）及び（２）を入れ代えた形態、つまり、まず断片化工程（２´）を行い、次に保護工程（１´）を行い、最後に分離工程（３）を行う形態との両方が含まれる。 A method for selectively recovering an N-terminal fragment of a protein includes a protection step, a fragmentation step, and a separation step. In this method , the protection step (1) is first performed, then the fragmentation step (2) is performed, and the separation step (3) is finally performed, and the steps (1) and (2) are interchanged. That is, it includes both the form in which the fragmentation step (2 ′) is first performed, the protection step (1 ′) is then performed, and the separation step (3) is finally performed.
保護工程（１）においては、解析すべきタンパク質の側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、適切に保護されたタンパク質を得る。断片化工程（２）においては、（１）で得られた保護されたタンパク質を分解し、解析すべきタンパク質のＮ末端に由来するＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る。 In the protection step (1), the side chain amino group of the amino acid residue having the side chain amino group of the protein to be analyzed is protected to obtain an appropriately protected protein. In the fragmentation step (2), the protected protein obtained in (1) is decomposed, and an N-terminal peptide fragment (a) derived from the N-terminus of the protein to be analyzed and other peptide fragments (b) Get.
一方、断片化工程（２´）においては、解析すべきタンパク質を断片化し、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）とその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とを得る。保護工程（１´）においては、工程（２´）で得られたペプチドフラグメント（ａ´）及び（ｂ´）の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る。
さらに、分離工程（３）においては、工程（２）又は工程（１´）で得られたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、いずれか一方を支持体に結合させ、いずれか他方を溶出させることにより分離する。
On the other hand, in the fragmentation step (2 ′), the protein to be analyzed is fragmented to obtain an N-terminal peptide fragment (a ′) and other peptide fragments (b ′). In the protection step (1 ′), the side chain amino group of the amino acid residue having a side chain amino group in the peptide fragments (a ′) and (b ′) obtained in step (2 ′) is protected, and N The terminal peptide fragment (a) and the other peptide fragment (b) are obtained.
Further, in the separation step (3), the N-terminal peptide fragment (a) obtained in the step (2) or step (1 ′) and the other peptide fragment (b) are reacted with a difference in reactivity to the support or Using the difference in affinity, separation is performed by binding either one to the support and eluting the other.
前記保護工程においては、後述のようにグアニジノ基を導入するグアニジノ化工程を行う。以下、本発明を詳細に説明する。 Contact Itewa before Symbol protection step, the guanidino step of introducing a guanidino group as described below. Hereinafter , the present invention will be described in detail.
まず第１に、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されている場合について説明する。解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されている場合、まずグアニジノ化工程（１Ａ）を行い、次に断片化工程（２Ａ）を行い、最後に分離工程（３Ａ）を行う。また、工程（１Ａ）と工程（２Ａ）とは入れ代わっても良い。つまり、まず断片化工程（２Ａ´）を行い、次にグアニジノ化工程（１Ａ´）を行い、最後に分離工程（３Ａ）を行っても良い。 First, the case where the N-terminus of the protein to be analyzed is modified will be described. When the N-terminus of the protein to be analyzed is modified, first the guanidinolation step (1A) is performed, then the fragmentation step (2A) is performed, and finally the separation step (3A) is performed. Further, the step (1A) and the step (2A) may be interchanged. That is, the fragmentation step (2A ′) may be performed first, then the guanidinolation step (1A ′) may be performed, and finally the separation step (3A) may be performed.
ここで、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法を表す流れ図を図１に示す。以下、図１に従って各工程を詳細に説明する。 Here, a flow chart showing a method for selectively recovering an N-terminal fragment of a protein is shown in FIG. Hereafter, each process is demonstrated in detail according to FIG.
［グアニジノ化工程（１Ａ）］
まず、解析すべきタンパク質の側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護する。側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基としては、ε−アミノ基を有するリジン残基やδーアミノ基を有するオルニチン残基等が挙げられる。これら側鎖アミノ基は一般的に、グアニジノ化反応によって保護される。グアニジノ化反応は、例えばリジン残基をホモアルギニン残基へ、オルニチン残基をアルギニン残基へ変換する。
[Guanidino-forming step (1A)]
First, the side chain amino group of the amino acid residue having the side chain amino group of the protein to be analyzed is protected. Examples of amino acid residues having a side chain amino group include lysine residues having an ε-amino group and ornithine residues having a δ-amino group. These side chain amino groups are generally protected by a guanidination reaction. In the guanidinolation reaction, for example, a lysine residue is converted into a homoarginine residue, and an ornithine residue is converted into an arginine residue.
側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基としてリジンのみを含むタンパク質のモデルを例に挙げ、本工程を次の式１に示す。式中、Ｒ１は、解析すべきタンパク質のＮ末端が有する修飾基を表し、ａ〜ｌは、側鎖アミノ基を有しないアミノ酸残基を表す。
A protein model containing only lysine as an amino acid residue having a side chain amino group is taken as an example, and this process is shown in the following
グアニジノ化反応は式１に示すように、側鎖アミノ基（−ＮＨ２）を、グアニジノ基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）に変換する。グアニジル化試薬としては、Ｏ−メチルイソウレア、Ｓ−メチルイソウレア、１−グアニルー３，５−ジメチルピラゾール等を用いるとよい。実際には、例えば、アンモニア水等の塩基性溶液に解析すべきタンパク質及びグアニジル化試薬を混合して反応を行う。このようにして、側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質が得られる。
As shown in
［断片化工程（２Ａ）］
得られたグアニジノ化タンパク質は断片化される。化学的断片化や酵素による消化等を行うと良い。化学的断片化を行う場合、ＢｒＣＮ等を用いると良い。
酵素による消化を行う場合、酵素としてエンドプロテアーゼを用いることができる。本発明においては、解析すべきタンパク質に応じて、質量分析装置で分析が容易な長さのＮ末端ペプチドフラグメントを生成する酵素を選択することが可能である。例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ等が用いられる。この酵素消化は、通常の方法を用いて行う。
[Fragmentation step (2A)]
The resulting guanidinoylated protein is fragmented. Chemical fragmentation or enzymatic digestion is recommended. When chemical fragmentation is performed, BrCN or the like may be used.
When digesting with an enzyme, an endoprotease can be used as the enzyme. In the present invention, it is possible to select an enzyme that generates an N-terminal peptide fragment of a length that can be easily analyzed by a mass spectrometer, depending on the protein to be analyzed. For example, trypsin, chymotrypsin, Glu-C and the like are used. This enzymatic digestion is performed using a conventional method.
本工程は、例えば次の式２で表される。 This step is expressed by, for example, the following formula 2.
式２は、ｅ残基のＣ末端とｈ残基のＣ末端を分解するエンドプロテアーゼを用いた例として示している。断片化によって、グアニジノ化タンパク質は、解析すべきタンパク質の修飾Ｎ末端に由来する目的のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、その他のペプチドフラグメント（ｂ）とに分解される。式２が示すように、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）は、ペプチド結合の加水分解によって生じた無置換のアミノ基を有している。 Equation 2 shows an example using an endoprotease that degrades the C-terminus of the e residue and the C-terminus of the h residue. By fragmentation, the guanidinoylated protein is broken down into the desired N-terminal peptide fragment (a) derived from the modified N-terminus of the protein to be analyzed and the other peptide fragments (b). As shown in Formula 2, the other peptide fragment (b) has an unsubstituted amino group generated by hydrolysis of a peptide bond.
［断片化工程（２Ａ´）］
本工程は、上記断片化工程（２Ａ）と同様の方法で行うことができる。つまり、化学的断片化又は酵素消化によって、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）とその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とが得られる。
[Fragmentation step (2A ')]
This step can be performed by the same method as the fragmentation step (2A). That is, an N-terminal peptide fragment (a ′) and other peptide fragments (b ′) are obtained by chemical fragmentation or enzymatic digestion.
［グアニジノ化工程（１Ａ´）］
上記断片化工程（２Ａ´）によって得られた各ペプチドフラグメント（ａ´）及び（ｂ´）は、前記グアニジノ化工程（１Ａ）と同様の方法によって側鎖アミノ基がグアニジノ化保護される。このとき、グアニジノ化反応は、側鎖アミノ基だけに選択的に起こり、ペプチドフラグメント（ａ´）及び（ｂ´）の無置換アミノ基では起こらない。このようにして、側鎖アミノ基が適切に保護されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ）が得られる。なお本工程では、前記断片化工程（２Ａ´）において酵素Ｌｙｓ−Ｃを用いた場合以外は、前記グアニジノ化工程（１Ａ）及び断片化工程（２Ａ）によって得られたペプチドフラグメントと理論上同じものが得られる。本明細書では、グアニジノ化及び断片化によって生成したペプチドフラグメントをまとめて、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ）として記載する。
[Guanidino-forming step (1A ′)]
In each of the peptide fragments (a ′) and (b ′) obtained by the fragmentation step (2A ′), the side chain amino group is protected by guanidinolation in the same manner as in the guanidinolation step (1A). At this time, the guanidinolation reaction occurs selectively only in the side chain amino group, and does not occur in the unsubstituted amino group of the peptide fragments (a ′) and (b ′). In this way, an N-terminal peptide fragment (a) and other peptide fragments (b) with appropriately protected side chain amino groups are obtained. In this step, the peptide fragments obtained by the guanidinolation step (1A) and the fragmentation step (2A) are theoretically the same except that the enzyme Lys-C is used in the fragmentation step (2A ′). Is obtained. In the present specification, peptide fragments generated by guanidinolation and fragmentation are collectively described as an N-terminal peptide fragment (a) and other peptide fragments (b).
［分離工程（３Ａ）］
断片化工程（２Ａ）又はグアニジノ化工程（１Ａ´）で得られた、修飾Ｎ末端を有する目的のペプチドフラグメント（ａ）とアミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）とは、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、その他のペプチドフラグメント（ｂ）を支持体に結合させ、回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させることによって分離する。
[Separation step (3A)]
The target peptide fragment (a) having a modified N-terminus obtained in the fragmentation step (2A) or the guanidinolation step (1A ′) and the other peptide fragment (b) having an amino group are reacted with the support. Using the difference in sex or affinity, other peptide fragments (b) are bound to the support and separated by eluting the N-terminal peptide fragment (a) to be recovered.
支持体に対する反応性の差を利用してＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のフラグメント（ｂ）とを分離する場合、支持体には、その他のフラグメント（ｂ）が有するアミノ基と化学反応することにより共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有しているものを用いると良い。例えば、前記分子を樹脂等の担体に固定化させたもの、前記分子又は分子の一部を有する単量体の重合体等を担体に固定化させたもの、前記重合体そのもの等を支持体として用いることができる。固定化させる担体の材質及び形状は、当業者が適宜定めることができる。また、前記重合体の形状も、当業者が適宜定めることができる。 When the N-terminal peptide fragment (a) and the other fragment (b) are separated using the difference in reactivity to the support, the support chemically reacts with the amino group of the other fragment (b). It is preferable to use a molecule or a part of the molecule that can form a covalent bond. For example, those in which the molecule is immobilized on a carrier such as a resin, those in which a polymer of a monomer having a molecule or a part of the molecule is immobilized on a carrier, the polymer itself or the like as a support. Can be used. A person skilled in the art can appropriately determine the material and shape of the carrier to be immobilized. Moreover, those skilled in the art can appropriately determine the shape of the polymer.
支持体の具体例としては、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂等が挙げられる。これら支持体は、ＤＩＴＣ等が何らかの樹脂に複数固定化されたものである。 Specific examples of the support, p- phenylenediisothiocyanate (DITC) polymer resins, and the like. In these supports, a plurality of DITCs and the like are fixed to some kind of resin.
支持体としてＤＩＴＣを樹脂に固定化させたＤＩＴＣポリマー樹脂を用いた例を挙げ、本工程を式３に表す。 An example of using a DITC polymer resin in which DITC is fixed to a resin as a support is given, and this process is represented by Formula 3.
式３が示すように、アミノ基を有する前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）が支持体のＤＩＴＣと化学反応により共有結合を形成し、一方、修飾Ｎ末端を有する目的のペプチドフラグメント（ａ）はアミノ基を有しないために支持体のＤＩＴＣと反応することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。 As shown in Formula 3, the other peptide fragment (b) having an amino group forms a covalent bond by chemical reaction with the DITC of the support, while the target peptide fragment (a) having a modified N-terminus is an amino acid. Since it has no group, it elutes without reacting with DITC of the support. In this way, only peptide fragments derived from the N-terminus of the protein can be selectively recovered.
前述のように、本工程の支持体は、無置換のアミノ基を結合させる。そのためこれら支持体は、前記その他のペプチドフラグメント等が有するα−アミノ基以外にも側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基が保護されていない場合は、その側鎖アミノ基も結合し得る。そのような場合にはＮ末端ペプチドフラグメントも結合されてしまうため好ましくない。このような理由で、前述のようにグアニジノ化等の保護が予め行われる。 As described above, the support in this step binds an unsubstituted amino group. Therefore, if the side chain amino group of the amino acid residue having a side chain amino group is not protected in addition to the α-amino group of the other peptide fragments etc., these supports also bind the side chain amino group. Can do. In such a case, the N-terminal peptide fragment is also bound, which is not preferable. For this reason, protection such as guanidinolation is performed in advance as described above.
支持体に対する親和性の差を利用してＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のフラグメント（ｂ）とを分離する場合は、前記断片化工程（２Ａ）の後、前記分離工程（３Ａ）の前に、その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に親和性物質をカップリングさせる。本明細書において親和性物質とは、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合することによって複合体を形成することができる物質をいう。この場合、支持体には前記特定の分子からなるリガンド、又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものを用いる。 When the N-terminal peptide fragment (a) and other fragments (b) are separated using the difference in affinity for the support, after the fragmentation step (2A) and before the separation step (3A) In addition, an affinity substance is coupled to the N-terminus of the other peptide fragment (b). As used herein, an affinity substance refers to a substance that can form a complex by specifically binding to a specific molecule or a specific part of a molecule. In this case, a support in which a ligand composed of the specific molecule or a ligand having a specific part of the molecule is immobilized is used.
前記親和性物質と前記リガンドとの組み合わせとして、抗原物質とそれに対応する抗体との組み合わせが挙げられる。ここで抗原物質とは、抗体と結合能を持つ物質であり、ハプテン等の低分子化合物も含む。具体的な組み合わせとしては、抗原としてニトロフェノール誘導体、ラクトシド、フェニルアゾ誘導体及びそれらの錯体、抗体としてそれら抗原を用いて産生する抗体等が挙げられる。 Examples of the combination of the affinity substance and the ligand include a combination of an antigen substance and a corresponding antibody. Here, the antigen substance is a substance having an ability to bind to an antibody, and includes a low molecular compound such as a hapten. Specific combinations include nitrophenol derivatives, lactosides, phenylazo derivatives and their complexes as antigens, and antibodies produced using these antigens as antibodies.
また、前記親和性物質と前記リガンドとの組み合わせとして、ビオチン誘導体とアビジンとの組み合わせを用いることも好ましい。 It is also preferable to use a combination of a biotin derivative and avidin as the combination of the affinity substance and the ligand.
親和性物質のカップリングは、例えば、抗原物質のカルボキシル基とペプチドフラグメントのアミノ基とを結合させるときは、水溶性カルボジイミド等を架橋剤に用いて行う。抗原物質のアミノ基とペプチドフラグメントのアミノ基とを結合させるときは、グルタルアルデヒドを架橋剤に用いて行う。また、ビオチン誘導体とペプチドフラグメントのアミノ基とを結合させるときは、ビオチン活性エステルをペプチドフラグメントに反応させて行う。 For example, when the carboxyl group of the antigen substance and the amino group of the peptide fragment are bound to each other, the affinity substance is coupled using a water-soluble carbodiimide or the like as a crosslinking agent. When the amino group of the antigen substance is bound to the amino group of the peptide fragment, glutaraldehyde is used as a cross-linking agent. Further, when the biotin derivative is bound to the amino group of the peptide fragment, the biotin active ester is reacted with the peptide fragment.
本工程の一例を式４に示す。式中、△は親和性物質を表す。 An example of this process is shown in Formula 4. In the formula, Δ represents an affinity substance.
式４が示すように、この時、カップリングによる親和性物質の修飾を受けたその他のペプチドフラグメント（ｂ）は支持体に固定化されたリガンドに結合し、抗原抗体複合体やビオチン−アビジン複合体を形成する。その結果、修飾Ｎ末端を有する回収すべきペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。 As shown in Formula 4, at this time, the other peptide fragment (b) subjected to the modification of the affinity substance by coupling binds to the ligand immobilized on the support, and the antigen-antibody complex or biotin-avidin complex Form the body. As a result, the peptide fragment (a) to be recovered having a modified N-terminus elutes without binding. In this way, only peptide fragments derived from the N-terminus of the protein can be selectively recovered.
第２に、本発明の、Ｎ末端が修飾されたタンパク質とＮ末端が修飾されていないタンパク質とからなる解析すべきタンパク質について以下に説明する。図１に示すように、まずグアニジノ化工程（１Ｂ）を行い、次に、解析すべきタンパク質中のＮ末端が修飾されていないタンパク質の非修飾Ｎ末端を修飾する。その後は、Ｎ末端の修飾形態により、断片化工程（２Ｂ）及び分離工程（３Ｂ）、又は断片化工程（２Ｃ）及び分離工程（３Ｃ）を行う。式５は、グアニジノ化工程（１Ｂ）から断片化工程（２Ｂ）又は（２Ｃ）までを一例として示す。式中、Ｒ２は、非修飾Ｎ末端の修飾基を表す。 Secondly, the protein to be analyzed according to the present invention consisting of a protein having an N-terminal modified and a protein having no N-terminal modified will be described below. As shown in FIG. 1, or not a performed guanidino step (1B), then modifying the unmodified N-terminal of the protein N-terminus of the protein to be analyzed is not modified. Thereafter, the fragmentation step (2B) and the separation step (3B), or the fragmentation step (2C) and the separation step (3C) are performed depending on the modified form of the N-terminal. Formula 5 shows from the guanidinolation step (1B) to the fragmentation step (2B) or (2C) as an example. In the formula, R 2 represents an unmodified N-terminal modifying group.
［グアニジノ化工程（１Ｂ）］
側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基は、グアニジノ化工程（１Ａ）と同様の方法によって保護する。グアニジノ化工程（１Ｂ）において用いるグアニジル化試薬としては、例えばＯ−メチルイソウレアが挙げられる。この工程により、側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質が得られる。
[Guanidino-forming step (1B)]
The side chain amino group of the amino acid residue having a side chain amino group is protected by the same method as in the guanidinolation step (1A). Examples of the guanidylation reagent used in the guanidinolation step (1B) include O-methylisourea. By this step, a guanidinoylated protein having a side chain amino group converted to a guanidino group is obtained.
［Ｎ末端修飾］
断片化の前に、得られたグアニジノ化タンパク質の非修飾Ｎ末端を修飾する。このように修飾することによって、Ｎ末端のアミノ基は後述のタンパク質の断片化によって生じる無置換のアミノ基と区別される。
[N-terminal modification]
Prior to fragmentation, the unmodified N-terminus of the resulting guanidinoylated protein is modified. By modifying in this way, the N-terminal amino group is distinguished from the unsubstituted amino group generated by fragmentation of the protein described later.
具体的に非修飾Ｎ末端を修飾する物質としては、前記した親和性物質を用いることができる。例えば抗原物質やビオチン誘導体を用いると良い。ただし、抗原物質としては、後述の断片化工程（２Ｂ）において使用する酵素等に加水分解される構造を有しないハプテン等を用いることが好ましい。これらの親和性物質をグアニジノ化タンパク質にカップリングさせることにより、Ｎ末端が親和性物質で修飾されたグアニジノ化タンパク質が得られる。（断片化工程（２Ｂ）へ進む。） Specifically, the affinity substance described above can be used as the substance that modifies the unmodified N-terminus. For example, an antigen substance or a biotin derivative may be used. However, as an antigen substance, it is preferable to use a hapten or the like that does not have a structure that is hydrolyzed by an enzyme or the like used in the fragmentation step (2B) described later. By coupling these affinity substances to a guanidinoylated protein, a guanidinoylated protein whose N-terminal is modified with an affinity substance is obtained. (Proceed to the fragmentation step (2B).)
また、非修飾Ｎ末端を親和性物質以外の適当な化合物を用いて修飾しても良い。このような化合物としては、フェニルイソチオシアネート、フルオレセインイソチオシアネート等が挙げられる。この場合、グアニジノ化タンパク質の非修飾Ｎ末端に前記化合物を付加することにより、非修飾Ｎ末端にフェニルチオカルバミル基、フルオレセインチオカルバミル基等が導入される。これにより、Ｎ末端が適当な置換基で修飾されたグアニジノ化タンパク質が得られる。（断片化工程（２Ｃ）へ進む。） Further, the unmodified N-terminus may be modified with an appropriate compound other than the affinity substance. Examples of such compounds include phenyl isothiocyanate and fluorescein isothiocyanate. In this case, a phenylthiocarbamyl group, a fluorescein thiocarbamyl group, etc. are introduce | transduced into an unmodified N terminal by adding the said compound to the unmodified N terminal of a guanidinoylated protein. As a result, a guanidinoylated protein having an N-terminal modified with an appropriate substituent can be obtained. (Proceed to the fragmentation step (2C).)
以下、これら２つの修飾形態を有するそれぞれのグアニジノ化タンパク質の断片化及び分離について説明する。 Hereinafter, fragmentation and separation of each guanidinoylated protein having these two modified forms will be described.
［断片化工程（２Ｂ）］
まず、Ｎ末端が親和性物質で修飾されたグアニジノ化タンパク質の場合について説明する。
親和性物質によって非修飾Ｎ末端の修飾を受けたグアニジノ化タンパク質は、断片化工程（２Ａ）と同様にして、親和性物質で修飾されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、無置換アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）とに分解される。
[Fragmentation step (2B)]
First, the case of a guanidinoylated protein whose N-terminus is modified with an affinity substance will be described.
In the same manner as in the fragmentation step (2A), the guanidinoylated protein that has been subjected to unmodified N-terminal modification with an affinity substance has an N-terminal peptide fragment (a) modified with an affinity substance and an unsubstituted amino group. It is decomposed into other peptide fragments (b).
［分離工程（２Ｂ）］
断片化された各ペプチドフラグメント（ａ）及び（ｂ）は、支持体との反応性の差又は親和性の差によって分離される。
[Separation step (2B)]
Each fragmented peptide fragment (a) and (b) is separated by the difference in reactivity or affinity with the support.
支持体との反応性の差を利用する場合は、分離工程（３Ａ）で述べたように、ＤＩＴＣポリマー樹脂等、アミノ基と化学反応することにより共有結合を形成することができるものを支持体として用いることができる。従って、前記式３で示したように、アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）が共有結合によって支持体に結合し、親和性物質が導入された回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。 When utilizing the difference in reactivity with the support, as described in the separation step (3A), a support that can form a covalent bond by chemically reacting with an amino group, such as a DITC polymer resin, is used. Can be used as Therefore, as shown in Formula 3, the other peptide fragment (b) having an amino group is covalently bonded to the support, and the N-terminal peptide fragment (a) to be recovered into which the affinity substance has been introduced is Elute without binding. In this way, only peptide fragments derived from the N-terminus of the protein can be selectively recovered.
支持体との親和性の差を利用する場合は、分離工程（３Ａ）で述べたように、親和性物質と複合体を形成することができるリガンドを担体に固定化した支持体を用いることができる。例えば、前記Ｎ末端修飾を抗原物質によって行った場合はリガンドとして抗体を選択し、ビオチン誘導体によって行った場合はリガンドとしてアビジンを選択する。このようなリガンドを固定化させた支持体を用いる例を式６に示す。 When utilizing the difference in affinity with the support, as described in the separation step (3A), it is necessary to use a support in which a ligand capable of forming a complex with the affinity substance is immobilized on a carrier. it can. For example, when the N-terminal modification is performed with an antigen substance, an antibody is selected as a ligand, and when it is performed with a biotin derivative, avidin is selected as a ligand. An example using a support on which such a ligand is immobilized is shown in Formula 6.
まず、親和性物質が導入された回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）が特異的に支持体に固定化されたリガンドに結合し、無置換アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）は結合することなく溶出する。次に、回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）が結合した支持体を良く洗浄し、抗原と抗体との間の結合力を弱めることによって、目的のＮ末端ペプチドフラグメントを溶出させる。これを回収することにより、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。 First, the N-terminal peptide fragment (a) to be recovered, into which the affinity substance has been introduced, specifically binds to the ligand immobilized on the support, and the other peptide fragment (b) having an unsubstituted amino group binds. Elute without Next, the support to which the N-terminal peptide fragment (a) to be recovered is bound is thoroughly washed, and the target N-terminal peptide fragment is eluted by weakening the binding force between the antigen and the antibody. By collecting this, only peptide fragments derived from the N-terminus of the protein can be selectively recovered.
抗原物質と抗体との間の結合力を弱めるためには、例えば、ｐＨを酸性側に変化させたり、塩濃度を上げたりする処理等を行う。
また、ビオチンとアビジンとの結合を弱めるためには、過酸化水素による酸化、塩酸グアニジン処理、アセトニトリル等の有機溶媒の温度を上げる等を行う。
In order to weaken the binding force between the antigenic substance and the antibody, for example, a treatment such as changing the pH to the acidic side or increasing the salt concentration is performed.
In order to weaken the bond between biotin and avidin, oxidation with hydrogen peroxide, treatment with guanidine hydrochloride, raising the temperature of an organic solvent such as acetonitrile, and the like are performed.
［断片化工程（２Ｃ）］
次に、Ｎ末端が親和性物質以外の適当な置換基で修飾されたグアニジノ化タンパク質の場合について説明する。
[Fragmentation step (2C)]
Next, the case of a guanidinoylated protein in which the N-terminus is modified with an appropriate substituent other than the affinity substance will be described.
非修飾Ｎ末端に親和性物質以外の適当な化合物による修飾を受けたグアニジノ化タンパク質は、断片化工程（２Ａ）と同様にして、前記修飾を受けた回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）とに分解される。 The guanidinoylated protein that has been modified with an appropriate compound other than an affinity substance at the non-modified N-terminus is the same as in the fragmentation step (2A), and the modified N-terminal peptide fragment to be recovered (a) and To be decomposed into other peptide fragments (b) having an amino group.
［分離工程（２Ｃ）］
断片化された各ペプチドフラグメント（ａ）及び（ｂ）は、支持体との反応性の差又は親和性の差によって分離される。
[Separation step (2C)]
Each fragmented peptide fragment (a) and (b) is separated by the difference in reactivity or affinity with the support.
支持体との反応性の差を利用する場合は、分離工程（３Ａ）及び分離工程（３Ｂ）で述べたように、ＤＩＴＣポリマー樹脂等、アミノ基と化学反応することにより共有結合を形成することができるものを支持体として用いることができる。従って、前記式３で示したように、アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）が共有結合によって支持体に結合させ、親和性物質が導入されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。 When utilizing the difference in reactivity with the support, as described in the separation step (3A) and separation step (3B), form a covalent bond by chemically reacting with an amino group such as DITC polymer resin. What can be used can be used as a support. Therefore, as shown in Formula 3, the other peptide fragment (b) having an amino group is bound to the support by a covalent bond, and the N-terminal peptide fragment (a) into which the affinity substance is introduced is bound. Elutes completely. In this way, only peptide fragments derived from the N-terminus of the protein can be selectively recovered.
支持体に対する親和性の差を利用してＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のフラグメント（ｂ）とを分離する場合は、前記断片化工程（２Ｃ）の後、前記分離工程（３Ｃ）の前に、その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に親和性物質をカップリングさせる。この場合、分離工程（３Ａ）で述べたように、支持体には前記親和性物質と特異的に結合することによって複合体を形成することができるリガンドを固定化したものを用いる。前記親和性物質と前記リガンドとの組み合わせも、前述と同様に、抗原物質とそれに対応する抗体との組み合わせ、及びビオチン誘導体とアビジンとの組み合わせが挙げられる。前記式４に示すように、カップリングによる親和性物質の修飾を受けたその他のペプチドフラグメント（ｂ）は、支持体に固定化されたリガンドと結合することにより抗原抗体複合体やビオチン−アビジン複合体を形成する。その結果、Ｎ末端を有する回収すべきペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。 When the N-terminal peptide fragment (a) and other fragments (b) are separated using the difference in affinity for the support, after the fragmentation step (2C) and before the separation step (3C) In addition, an affinity substance is coupled to the N-terminus of the other peptide fragment (b). In this case, as described in the separation step (3A), a support on which a ligand capable of forming a complex by specifically binding to the affinity substance is used as the support. Examples of the combination of the affinity substance and the ligand include a combination of an antigen substance and a corresponding antibody, and a combination of a biotin derivative and avidin, as described above. As shown in the above formula 4, the other peptide fragment (b) subjected to modification of the affinity substance by coupling is bound to the ligand immobilized on the support, whereby the antigen-antibody complex or the biotin-avidin complex Form the body. As a result, the peptide fragment (a) having an N-terminus to be recovered is eluted without binding. In this way, only peptide fragments derived from the N-terminus of the protein can be selectively recovered.
以上のようにして、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、タンパク質のＮ末端に由来するフラグメント（ａ）だけを選択的に回収する。回収されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）はＭＳ／ＭＳ等により解析することができる。 As described above, regardless of whether or not the N-terminus of the protein to be analyzed is modified, only the fragment (a) derived from the N-terminus of the protein is selectively recovered. The recovered N-terminal peptide fragment (a) can be analyzed by MS / MS or the like.
一方、その他のペプチドフラグメント（ｂ）は以下のように回収及び解析することができる。つまり、式６のような場合は、その他のペプチドフラグメント（ｂ）が先に溶出するため、支持体の洗浄液を回収する。また、式４のように、その他のペプチドフラグメント（ｂ）が抗原抗体複合体やビオチン−アビジン複合体等として支持体に結合している場合は、支持体との結合を前述の方法によって弱めて回収する。回収されたその他のペプチドフラグメント（ｂ）の混合物は、ＰＭＦ分析やＭＳ／ＭＳ等によって解析することができる。
このようにして、タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列を決定することができる。
On the other hand, other peptide fragments (b) can be recovered and analyzed as follows. That is, in the case of Formula 6, since the other peptide fragment (b) elutes first, the washing solution for the support is recovered. In addition, when the other peptide fragment (b) is bound to the support as an antigen-antibody complex or a biotin-avidin complex as shown in Formula 4, the bond with the support is weakened by the method described above. to recover. The collected mixture of other peptide fragments (b) can be analyzed by PMF analysis, MS / MS, or the like.
In this way, the amino acid sequence from the N-terminus of the protein can be determined.
以下、特に断りのない限り、「％」は重量％を表す。また、図２〜４のＨＰＬＣクロマトグラムにおいては、横軸に時間（分;min）、縦軸にピーク強度を示し、図５〜１０のＭＡＬＤＩスペクトルにおいては、横軸に 質量／電荷 (Mass/Charge)、縦軸にイオンピークの強度(% Int.)を示す。 Below, unless otherwise specified, "%" represents% by weight. In the HPLC chromatograms of FIGS. 2 to 4, the horizontal axis represents time (minute; min), and the vertical axis represents peak intensity. In the MALDI spectra of FIGS. 5 to 10, the horizontal axis represents mass / charge (Mass / charge). Charge), and the vertical axis represents ion peak intensity (% Int.).
［実験例１］
本実験例においては、グアニジノ化工程（１Ａ）−断片化工程（２Ａ）−分離工程（３Ａ）の工程により、Ｎ末端ペプチドフラグメントの回収を行った。
本実験例においてはサンプルとしてニューロテンシンを用いた。ニューロテンシンは、ヒト（Human）、ウシ（Bovine）、イヌ（Canine）等から得ることができるペプチドであるが、本実験例では（株）ペプチド研究所製の合成ニューロテンシン（Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu（配列表の配列番号１））を用いた。このペプチドは、Ｎ末端にピログルタミン酸残基（Pyr）を有する。
[ Experiment 1]
In this experimental example , the N-terminal peptide fragment was recovered by the steps of guanidinolation step (1A) -fragmentation step (2A) -separation step (3A).
In this experimental example , neurotensin was used as a sample. Neurotensin is a peptide that can be obtained from human, bovine, canine, etc., but in this experimental example , synthetic neurotensin (Pyr-Leu-Tyr) manufactured by Peptide Institute, Inc. -Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)) was used. This peptide has a pyroglutamic acid residue (Pyr) at the N-terminus.
（グアニジノ化工程（１Ａ））
0.67mMのニューロテンシン30μlと、9Ｎのアンモニア水33μｌと、6ＭのＯ−メチルイソウレア9μlとを混合し、65℃で30分間反応させ、グアニジノ化を行った。図２にグアニジノ化後のニューロテンシンの逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（2 nmol）を示す。図２において、溶出時間約30分のメインピークがグアニジノ化ニューロテンシンであり、直前のマイナーピークが未反応のニューロテンシンであることがＭＡＬＤＩによって確認された。
(Guanidino-forming step (1A))
30 μl of 0.67 mM neurotensin, 33 μl of 9N ammonia water, and 9 μl of 6M O-methylisourea were mixed and reacted at 65 ° C. for 30 minutes to perform guanidinolation. FIG. 2 shows a reverse phase HPLC chromatogram (2 nmol) of neurotensin after guanidinolation. In FIG. 2, it was confirmed by MALDI that the main peak with an elution time of about 30 minutes was guanidinoylated neurotensin and the immediately preceding minor peak was unreacted neurotensin.
（断片化工程（２Ａ））
前記メインピークの分画を回収し、さらに逆相ＨＰＬＣで精製し、乾固した。得られた試料に50mMの炭酸水素アンモニウムと5mMの塩化カルシウム水溶液に溶解したトリプシン溶液（0.1μg/μl）30μlとを加え、37℃で一晩放置し、消化を行った。消化後の試料の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを図３に、ＭＡＬＤＩスペクトルを図５に示す。図３で確認された２つのピークは、図５においてPyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg（配列表の配列番号；1072（m/z）（このペプチドは、Ｎ末端にピログルタミン酸残基（Pyr）を有する。）と、Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu（配列表の配列番号３；661（m/z））とに相当する[M+H]+の分子イオンピークとして検出された。
(Fragmentation step (2A))
The main peak fraction was collected and further purified by reverse phase HPLC and dried. To the obtained sample, 50 mM ammonium bicarbonate and 30 μl of a trypsin solution (0.1 μg / μl) dissolved in 5 mM calcium chloride aqueous solution were added, and the mixture was allowed to stand overnight at 37 ° C. for digestion. The reverse phase HPLC chromatogram of the digested sample is shown in FIG. 3, and the MALDI spectrum is shown in FIG. Two peaks confirmed in FIG. 3 are Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg (SEQ ID NO: 1072 (m / z) in FIG. 5). [M + H] + molecular ion corresponding to pyroglutamic acid residue (Pyr)) and Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 3; 661 (m / z) in Sequence Listing) Detected as a peak.
（分離工程（３Ａ））
上記消化された試料3.3μlと、100mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）32.7μlと、12.5％トリメチルアミン水溶液4μlと、アセトニトリル4μlとを混合し、ＤＩＴＣポリマー樹脂カラム（CTFF-1 COLUMN(P/N292-02400)、（株）島津製作所製）に注入し、60℃で１時間反応させた。反応後、0.1%トリフルオロ酢酸、２−プロパノール及びアセトニトリルの（4：3：3 v/v/v）混合液300μlで樹脂を洗浄し、洗浄液を回収した。回収した洗浄液を乾固した後、0.1%トリフルオロ酢酸水溶液に再溶解し、逆相ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩにより分析を行った。
(Separation step (3A))
3.3 μl of the digested sample, 32.7 μl of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 4 μl of 12.5% trimethylamine aqueous solution, and 4 μl of acetonitrile were mixed, and a DITC polymer resin column (CTFF-1 COLUMN (P / N292-02400), manufactured by Shimadzu Corporation, and reacted at 60 ° C. for 1 hour. After the reaction, the resin was washed with 300 μl of a (4: 3: 3 v / v / v) mixed solution of 0.1% trifluoroacetic acid, 2-propanol and acetonitrile, and the washing solution was collected. The collected washings were dried and then redissolved in a 0.1% aqueous trifluoroacetic acid solution and analyzed by reverse phase HPLC and MALDI.
図４に逆相ＨＰＬＣクロマトグラム、図６にＭＡＬＤＩスペクトルを示す。図４より、前記図３で得られた２つのピークのうち、溶出時間約22分のピークだけが得られた。このピークは、図６の結果からPyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg（配列表の配列番号２；1072（m/z））に相当する[M+H]+の分子イオンピークとして検出されたため、ニューロテンシンのＮ末端フラグメントのみが選択的に回収されたことが確認された。 FIG. 4 shows a reverse phase HPLC chromatogram, and FIG. 6 shows a MALDI spectrum. From FIG. 4, only the peak with an elution time of about 22 minutes was obtained from the two peaks obtained in FIG. This peak is a molecule of [M + H] + corresponding to Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg (SEQ ID NO: 2; 1072 (m / z)) in the result of FIG. Since it was detected as an ion peak, it was confirmed that only the N-terminal fragment of neurotensin was selectively recovered.
［実験例２］
本実験例においては、グアニジノ化工程（１Ｂ）−Ｎ末端修飾工程−断片化工程（２Ｂ）−分離工程（３Ｂ）の工程により、Ｎ末端ペプチドフラグメントの回収を行った。
本実験例においてはサンプルとしてリゾチームLysozyme（EC 3.2.1.17、ニワトリ卵白由来：SIGMA社製）を用いた。Lysozymeを100pmol/μlの濃度になるよう蒸留水に溶解した。溶解されたLysozyme10μlを、直径8mmの円形にカットしたPVDF（ポリビニリデンジフルオリド）膜（日本ジェネティクス社製 ）に滴下し乾燥し、サンプルがアプライされたPVDF膜を得た。
[ Experiment 2]
In this experimental example , the N-terminal peptide fragment was recovered by the steps of guanidinolation step (1B) -N-terminal modification step-fragmentation step (2B) -separation step (3B).
In this experimental example , lysozyme Lysozyme (EC 3.2.1.17, derived from chicken egg white: manufactured by SIGMA) was used as a sample. Lysozyme was dissolved in distilled water to a concentration of 100 pmol / μl. 10 μl of the dissolved Lysozyme was dropped onto a PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (manufactured by Nippon Genetics) cut into a circle having a diameter of 8 mm and dried to obtain a PVDF membrane to which the sample was applied.
（還元−アルキル化）
サンプルをアプライしたPVDF膜を1.5mlのチューブに入れ、10mM ジチオスレイトールを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlを加え、56℃で1時間反応させた。反応終了後、上記チューブから加えられた上記混合液を除き、55mM ヨードアセトアミドを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlをチューブに加え、室温で45分間反応させた。反応終了後、PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
(Reduction-alkylation)
Place the PVDF membrane with sample applied into a 1.5 ml tube, add 1 ml of a (8: 2 v / v) mixture of 100 mM NH 4 HCO 3 aqueous solution containing 10 mM dithiothreitol and acetonitrile, and at 56 ° C. for 1 hour. Reacted. After completion of the reaction, the mixed solution added from the tube was removed, and 1 ml of a (8: 2 v / v) mixed solution of 100 mM NH 4 HCO 3 aqueous solution containing 55 mM iodoacetamide and acetonitrile was added to the tube at room temperature. The reaction was allowed to proceed for 45 minutes. After completion of the reaction, the PVDF membrane was taken out from the tube, placed in a beaker containing 100 ml of distilled water, and stirred for 10 minutes to wash the PVDF membrane. After washing, the PVDF membrane was dried.
（グアニジノ化工程（１Ｂ））
上記還元−アルキル化処理して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlのチューブに入れ、0.85M ヘミ硫酸O−メチルイソウレアを含む７N アンモニア水と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液 1 mlを加え、60℃で30分間反応させた。PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
(Guanidino-forming step (1B))
The PVDF membrane obtained by the above reduction-alkylation treatment was put in a separately prepared 1.5 ml tube, and 7N ammonia water containing 0.85M hemisulfate O-methylisourea and acetonitrile (8: 2 v / v) 1 ml of the mixture was added and reacted at 60 ° C. for 30 minutes. The PVDF membrane was taken out from the tube, placed in a beaker containing 100 ml of distilled water, and stirred for 10 minutes to wash the PVDF membrane. After washing, the PVDF membrane was dried.
（Ｎ末端修飾工程）
１）ビオチニルシステイン酸の合成
スルホスクシンイミドビオチン3.4mgを20μlの蒸留水に溶解したもの、システイン酸1.1mgを15μlの蒸留水に溶解したもの、及び1.65μlのトリエチルアミンを混合し、60℃で30分間反応させた。反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、目的のビオチニルシステイン酸をMALDI-TOF MSで確認した。得られたビオチニルシステイン酸の構造式（I）を以下に示す。
(N-terminal modification step)
1) Synthesis of biotinylcysteic acid 3.4 mg of sulfosuccinimide biotin dissolved in 20 μl of distilled water, 1.1 mg of cysteic acid dissolved in 15 μl of distilled water, and 1.65 μl of triethylamine were mixed at 60 ° C. for 30 minutes. Reacted. The reaction product was purified by reverse phase HPLC, and the desired biotinylcysteic acid was confirmed by MALDI-TOF MS. The structural formula (I) of the obtained biotinyl cysteic acid is shown below.
２）Ｎ末端へのカップリング
上記グアニジノ化処理して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlのチューブに入れ、2mM ビオチニルシステイン酸（I）、2mM EDC（１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、及び5mM Sulfo-NHS（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を含む0.1M MES（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）緩衝液と、アセトニトリルとの（8:2 v/v）混合液900μlを加え、65℃で１時間反応させた。反応終了後、PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
2) Coupling to N-terminal The PVDF membrane obtained by the above guanidinolation treatment was placed in a separately prepared 1.5 ml tube, and 2 mM biotinylcysteic acid (I), 2 mM EDC (1-ethyl-3- (3- (Dimethylaminopropyl) carbodiimide) and 0.1 M MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer containing 5 mM Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) with acetonitrile (8: 2 v / v ) 900 μl of the mixture was added and reacted at 65 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the PVDF membrane was taken out from the tube, placed in a beaker containing 100 ml of distilled water, and stirred for 10 minutes to wash the PVDF membrane. After washing, the PVDF membrane was dried.
（断片化工程（２Ｂ））
上記修飾して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlの消化用チューブに入れ、20μgのトリプシンを含む100ｍM NH4HCO3及び5mM CaCl2の混合溶液と、アセトニトリルとの（8:2 v/v）混合液100μlを加え、36℃で一晩消化を行った。
(Fragmentation step (2B))
The PVDF membrane obtained by the above modification was put into a separately prepared 1.5 ml digestion tube, and a mixed solution of 100 mM NH 4 HCO 3 and 5 mM CaCl 2 containing 20 μg trypsin and acetonitrile (8: 2 v / v) 100 μl of the mixture was added and digested overnight at 36 ° C.
（PVDF膜からの消化ペプチドの抽出）
上記消化終了後、消化用チューブから液部分を取り出して、別途用意した1.5 mlの回収用チューブに回収した。消化用チューブ内に残ったPVDF膜に0.1%TFA（トリフルオロ酢酸）とアセトニトリルとの（4:6 v/v）混合液150μlを加え、60℃で1時間放置した後、攪拌することによりPVDF膜からの消化ペプチドの抽出を行った。得られた抽出溶液を、上記回収用チューブに回収した。消化ペプチドの抽出及び抽出溶液の回収の一連の操作をさらに２回繰り返した。回収液は遠心乾燥を行ない乾固した。得られた乾燥消化ペプチドは、下記分離工程（３Ｂ）の ２）N末端フラグメントの回収 において使用した。
(Extraction of digested peptide from PVDF membrane)
After completion of the digestion, the liquid part was taken out from the digestion tube and recovered in a separately prepared 1.5 ml recovery tube. To the PVDF membrane remaining in the digestion tube, 150 μl of a 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) and acetonitrile (4: 6 v / v) mixture (150 μl) was added and left at 60 ° C. for 1 hour, followed by stirring. Digested peptides were extracted from the membrane. The obtained extraction solution was recovered in the recovery tube. A series of operations of extracting the digested peptide and recovering the extracted solution was repeated twice more. The collected liquid was dried by centrifugal drying. The obtained dry digested peptide was used in 2) N-terminal fragment recovery in the following separation step (3B).
（分離工程（３Ｂ））
１）アビジン樹脂の調製
アビジン樹脂SoftLinkTM SoftLease Avidin Resin（Promega社製）30μlを1.5 mlのチューブにとり、0.1M リン酸緩衝液（Phosphate buffer）500μlを添加し攪拌した後、遠心分離により樹脂を沈殿させ、上澄を除いた。リン酸緩衝液の添加、攪拌、遠心分離及び上澄除去の一連の操作を３回繰り返し、アビジン樹脂を平衡化した。チューブ内の得られたアビジン樹脂に、5mMのビオチニルシステイン酸（I）を含む0.1M リン酸緩衝液100μlを加え、30分間攪拌し、アビジン樹脂へのビオチニルシステイン酸の吸着を行った。吸着終了後、上澄を除いた。得られた樹脂に、10% 酢酸水溶液 500μlを添加し攪拌し、アビジン樹脂からビオチニルシステイン酸の抽出を行なった。その後、樹脂を沈殿させて上澄を除いた。酢酸水溶液の添加から上澄除去までの一連の操作をさらに２回行った。このような処理を行うことによって、ビオチニルシステイン酸による修飾基を有するＮ末端ペプチドフラグメントのアビジン樹脂への非特異的吸着を防いだ。得られたアビジン樹脂は、0.1M リン酸緩衝液 を用いて上記と同様に平衡化を行った後、調製されたアビジン樹脂とした。
(Separation process (3B))
1) Preparation of avidin resin Take 30 μl of avidin resin SoftLink TM SoftLease Avidin Resin (Promega) in a 1.5 ml tube, add 500 μl of 0.1 M phosphate buffer (Phosphate buffer), stir, and then precipitate the resin by centrifugation. The supernatant was removed. A series of operations of adding phosphate buffer, stirring, centrifuging and removing the supernatant was repeated three times to equilibrate the avidin resin. To the obtained avidin resin in the tube, 100 μl of 0.1M phosphate buffer containing 5 mM biotinylcysteic acid (I) was added and stirred for 30 minutes to adsorb biotinylcysteic acid to the avidin resin. After completion of the adsorption, the supernatant was removed. To the obtained resin, 500 μl of a 10% aqueous acetic acid solution was added and stirred, and biotinylcysteic acid was extracted from the avidin resin. Thereafter, the resin was precipitated and the supernatant was removed. A series of operations from addition of aqueous acetic acid to removal of supernatant was further performed twice. By performing such treatment, non-specific adsorption of the N-terminal peptide fragment having a modification group by biotinyl cysteic acid to the avidin resin was prevented. The obtained avidin resin was equilibrated in the same manner as described above using a 0.1 M phosphate buffer, and then prepared as an avidin resin.
２）N末端フラグメントの回収
上記乾燥消化ペプチドを0.1mM リン酸緩衝液 100μlに再溶解した。溶解した消化ペプチドのうち２μlをZipTipTMC18（MILLIPORE社製）で脱塩を行い、MALDIで分析した。このとき得られたスペクトルを図７に示す。1025.70 (m/z)に検出されているピークが、Ｎ末端ペプチドフラグメント（Bio-cys-Hor-Val-Phe-Gly-Arg：配列番号４：理論値1025.47 (m/z)）に相当する。このＮ末端ペプチドフラグメントは、ビオチニルシステイン酸による修飾基（Bio-cys）とグアニジノ化されたLys残基（Hor）とを有する。Ｎ末端ペプチドフラグメントとともに、その他のトリプシン消化ペプチドに相当するピークも多数検出されている。
2) Recovery of N-terminal fragment The dry digested peptide was redissolved in 100 μl of 0.1 mM phosphate buffer. 2 μl of the dissolved digested peptide was desalted with ZipTip ™ C18 (MILLIPORE) and analyzed by MALDI. The spectrum obtained at this time is shown in FIG. The peak detected at 1025.70 (m / z) corresponds to the N-terminal peptide fragment (Bio-cys-Hor-Val-Phe-Gly-Arg: SEQ ID NO: 4: Theoretical value 1025.47 (m / z)). This N-terminal peptide fragment has a biotinyl cysteic acid modification group (Bio-cys) and a guanidinized Lys residue (Hor). A number of peaks corresponding to other trypsin-digested peptides have been detected along with the N-terminal peptide fragment.
一方、溶解した消化ペプチドのうち10μlを上記調製されたアビジン樹脂へアプライした。室温で１時間攪拌し、N-フラグメント（ビオチニルシステイン酸による修飾基を有する）のアビジン樹脂への吸着を行った。吸着終了後、アビジン樹脂を500μlの0.1mM リン酸緩衝液で３回洗浄し、N末端フラグメント以外のペプチドをアビジン樹脂から除去した。10％ 酢酸水溶液 150μlを2回、0.1% TFAとアセトニトリルとの(1:1 v/v)混合液150μlを1回流し、吸着されたN末端フラグメントの溶出を行った。溶出されたN末端フラグメントを、遠心乾燥機で乾固した。乾固したN末端フラグメントは、0.1% TFA水溶液10μlに再溶解し、ZipTipTMC18で脱塩を行った後、MALDIで分析を行った。このとき得られたスペクトルを図８に示す。図８においては、図７で検出されたＮ末端ペプチドフラグメントに相当する、1025.59(m/z)のピークが特異的に検出され、N末端フラグメンントが選択的に回収されたことが確認された。 On the other hand, 10 μl of the dissolved digested peptide was applied to the avidin resin prepared above. The mixture was stirred at room temperature for 1 hour, and an N-fragment (having a modification group by biotinyl cysteic acid) was adsorbed to an avidin resin. After completion of adsorption, the avidin resin was washed with 500 μl of 0.1 mM phosphate buffer three times to remove peptides other than the N-terminal fragment from the avidin resin. The adsorbed N-terminal fragment was eluted by flowing 150 μl of 10% aqueous acetic acid twice and 150 μl of a 0.1% TFA / acetonitrile (1: 1 v / v) mixture once. The eluted N-terminal fragment was dried with a centrifugal dryer. The dried N-terminal fragment was redissolved in 10 μl of 0.1% TFA aqueous solution, desalted with ZipTip ™ C18, and analyzed by MALDI. The spectrum obtained at this time is shown in FIG. In FIG. 8, the peak at 1025.59 (m / z) corresponding to the N-terminal peptide fragment detected in FIG. 7 was specifically detected, and it was confirmed that the N-terminal fragment was selectively recovered. .
［実験例３］
本実験例においては、断片化工程（２Ａ´）−グアニジノ化工程（１Ａ´）−分離工程（３Ａ）の工程により、Ｎ末端フラグメントの回収を行った。
本実験例においてはサンプルとしてオブアルブミンovalbumin（SIGMA社製）を用いた。ovalbuminを100pmol/μlの濃度になるよう蒸留水に溶解した。溶解されたovalbumin 10μlを、直径8mmの円形にカットしたPVDF膜（日本ジェネティクス社製 ）に滴下し乾燥し、サンプルがアプライされたPVDF膜を得た。
[ Experiment 3]
In this experimental example , the N-terminal fragment was recovered by the steps of fragmentation step (2A ′)-guanidinolation step (1A ′)-separation step (3A).
In this experimental example , ovalbumin ovalbumin (manufactured by SIGMA) was used as a sample. ovalbumin was dissolved in distilled water to a concentration of 100 pmol / μl. 10 μl of dissolved ovalbumin was dropped onto a PVDF membrane (manufactured by Nippon Genetics) cut into a circle having a diameter of 8 mm and dried to obtain a PVDF membrane to which the sample was applied.
（還元−アルキル化）
サンプルをアプライしたPVDF膜を1.5 mlのチューブに入れ、10mM ジチオスレイトールを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlを加え、56℃で1時間反応させた。反応終了後、上記チューブから加えられた上記混合液を除き、55mM ヨードアセトアミドを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlをチューブに加え、室温で45分間反応させた。反応終了後、PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
(Reduction-alkylation)
Place the PVDF membrane with sample applied in a 1.5 ml tube, add 1 ml of a (8: 2 v / v) mixture of 100 mM NH 4 HCO 3 aqueous solution containing 10 mM dithiothreitol and acetonitrile, and then at 56 ° C. for 1 hour. Reacted. After completion of the reaction, the mixed solution added from the tube was removed, and 1 ml of a (8: 2 v / v) mixed solution of 100 mM NH 4 HCO 3 aqueous solution containing 55 mM iodoacetamide and acetonitrile was added to the tube at room temperature. The reaction was allowed to proceed for 45 minutes. After completion of the reaction, the PVDF membrane was taken out from the tube, placed in a beaker containing 100 ml of distilled water, and stirred for 10 minutes to wash the PVDF membrane. After washing, the PVDF membrane was dried.
（断片化工程（２Ａ´））
上記得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlの消化用チューブに入れ、20μgのトリプシンを含む100mM NH4HCO3及び5mM CaCl2の混合溶液と、アセトニトリルとの（8:2 v/v）混合液100μlを加え、36℃で一晩消化を行った。
(Fragmentation process (2A '))
The obtained PVDF membrane was put into a separately prepared 1.5 ml digestion tube, and a mixed solution of 100 mM NH 4 HCO 3 and 5 mM CaCl 2 containing 20 μg trypsin and acetonitrile (8: 2 v / v) 100 μl of the mixture was added and digested overnight at 36 ° C.
（PVDF膜からの消化ペプチドの抽出）
上記消化終了後、消化用チューブから液部分を取り出して、別途用意した1.5 mlの回収用チューブに回収した。消化用チューブ内に残ったPVDF膜に0.1%TFA（トリフルオロ酢酸）とアセトニトリルとの（4:6 v/v）混合液150μlを加え、60℃で1時間放置した後、攪拌することによりPVDF膜からの消化ペプチドの抽出を行った。得られた抽出溶液を、上記回収用チューブに回収した。消化ペプチドの抽出及び抽出溶液の回収の一連の操作をさらに２回繰り返した。回収液は遠心乾燥を行ない乾固した。
(Extraction of digested peptide from PVDF membrane)
After completion of the digestion, the liquid part was taken out from the digestion tube and recovered in a separately prepared 1.5 ml recovery tube. To the PVDF membrane remaining in the digestion tube, 150 μl of a 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) and acetonitrile (4: 6 v / v) mixture (150 μl) was added and left at 60 ° C. for 1 hour, followed by stirring. Digested peptides were extracted from the membrane. The obtained extraction solution was recovered in the recovery tube. A series of operations of extracting the digested peptide and recovering the extracted solution was repeated twice more. The collected liquid was dried by centrifugal drying.
（グアニジノ化工程（１Ａ´））
上記得られた乾燥消化ペプチドを、別途用意したグアニジノ化用1.5 mlチューブに入れ、0.85M ヘミ硫酸O−メチルイソウレアを含む7N アンモニア水7μlを加え、60℃で30分間反応させた。10％TFA水溶液10μlをさらにチューブに加えて反応を停止し、遠心乾燥機により得られた反応液を乾固した。得られた乾燥ペプチドは、以下の分離工程（３Ａ）に供された。
(Guanidino-forming step (1A ′))
The obtained dry digested peptide was put into a separately prepared 1.5 ml tube for guanidinolysis, 7 μl of 7N aqueous ammonia containing 0.85 M hemisulfate O-methylisourea was added, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 30 minutes. 10 μl of 10% TFA aqueous solution was further added to the tube to stop the reaction, and the reaction solution obtained by a centrifugal dryer was dried. The obtained dried peptide was subjected to the following separation step (3A).
（分離工程（３Ａ））
ＤＩＴＣガラスDITC-Glass（Isothiocyanate glass: SIGMA社製）3mgを500μlのチューブにとった。別途、上記消化及びグアニジノ化によって得られた乾燥ペプチドを7μl蒸留水に溶解した。溶解したペプチドのうち一部はMALDIで分析を行った。このとき得られたスペクトルを図９に示す。1849.81（m/z）に検出されているピークが、N末端ペプチドフラグメント（Ac-Gly-Ser-Ile-Gly-Ala-Ala-Ser-Met-Glu-Phe-Cys(Cam)-Phe-Asp-Val-Phe-Hor：配列番号５：理論値1849.83（m/z））である。このＮ末端ペプチドフラグメントは、アセチル化されたＮ末端のGly残基（Ac-Gly）及びカルバモイルメチル化されたシステイン残基（Cys(Cam)）を有する。Ｎ末端ペプチドフラグメントとともに、多数のその他のペプチドフラグメントのピークも検出されている。
(Separation step (3A))
3 mg of DITC glass DITC-Glass (Isothiocyanate glass: manufactured by SIGMA) was placed in a 500 μl tube. Separately, the dried peptide obtained by digestion and guanidinolysis was dissolved in 7 μl distilled water. Some of the dissolved peptides were analyzed by MALDI. The spectrum obtained at this time is shown in FIG. The peak detected at 1849.81 (m / z) is the N-terminal peptide fragment (Ac-Gly-Ser-Ile-Gly-Ala-Ala-Ser-Met-Glu-Phe-Cys (Cam) -Phe-Asp- Val-Phe-Hor: SEQ ID NO: 5: theoretical value 1849.83 (m / z)). This N-terminal peptide fragment has an acetylated N-terminal Gly residue (Ac-Gly) and a carbamoylmethylated cysteine residue (Cys (Cam)). A number of other peptide fragment peaks have also been detected along with the N-terminal peptide fragment.
前記溶解したペプチドの残りに12%トリメチルアミン水溶液7μlを加え、上記DITC-Glassにアプライした。60℃で2時間放置し、その後1時間浸とうして反応させた。反応終了後、0.1%TFA水溶液とアセトニトリルとイソプロパノールとの混合液（42:18:40 v/v/v）100μlを添加して攪拌し、DITC-Glassを沈殿させて上澄を回収用チューブに回収した。混合液の添加から上澄の回収までの一連の操作をさらに２回行い、回収用チューブ内の回収液を遠心乾燥により乾固した。得られた乾燥ペプチドを0.1％TFA水溶液10μlに再溶解し、ZipTipTMC18で脱塩を行った後、MALDIで分析を行った。このとき得られたスペクトルを図１０に示す。図１０においては、図９で検出されたＮ末端ペプチドフラグメントに相当する、1850.04(m/z)のピークが特異的に検出され、N末端フラグメントが選択的に回収されたことが確認された。 7 μl of 12% trimethylamine aqueous solution was added to the remaining dissolved peptide and applied to the DITC-Glass. The reaction was allowed to stand at 60 ° C. for 2 hours and then immersed for 1 hour to react. After the reaction is complete, add 100 μl of a 0.1% TFA aqueous solution, acetonitrile and isopropanol (42:18:40 v / v / v) and stir to precipitate DITC-Glass and place the supernatant in a collection tube. It was collected. The series of operations from the addition of the mixed solution to the collection of the supernatant was further performed twice, and the collected solution in the collection tube was dried by centrifugal drying. The obtained dried peptide was redissolved in 10 μl of 0.1% TFA aqueous solution, desalted with ZipTip ™ C18, and analyzed by MALDI. The spectrum obtained at this time is shown in FIG. In FIG. 10, a peak of 1850.04 (m / z) corresponding to the N-terminal peptide fragment detected in FIG. 9 was specifically detected, and it was confirmed that the N-terminal fragment was selectively recovered.
配列番号４は、Ｎ末端のアミノ酸残基においてビオチニルシステイン酸を用いたペプチド結合が形成され、かつ、グアニジノ化されている。配列番号５は、Ｎ末端のアミノ酸残基においてアセチル化され、Ｎ末端から１１番目のアミノ酸残基においてカルバモイルメチル化され、かつ、Ｎ末端から１６番目のアミノ酸残基においてグアニジノ化されている。 In SEQ ID NO: 4, a peptide bond using biotinyl cysteic acid is formed at the N-terminal amino acid residue and guanidinoylated. SEQ ID NO: 5 is acetylated at the N-terminal amino acid residue, carbamoylmethylated at the 11th amino acid residue from the N-terminus, and guanidinolated at the 16th amino acid residue from the N-terminus.
Claims (2)
前記グアニジノ化された解析すべきタンパク質中の非修飾Ｎ末端を修飾する修飾工程と、
前記修飾工程後のグアニジノ化された解析すべきタンパク質を断片化し、前記解析すべきタンパク質のＮ末端に由来するＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る断片化工程（２）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記支持体として、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有するものを用いて、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、アミノ基を介して前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。 Of the protein to be analyzed for protein and N-terminal N-terminus is modified consists of a protein that is not modified, the side chain amino group of amino acid residues having side-chain amino groups and guanidino reduction, said side chain amino groups guanidino step of obtaining a guanidino protein that has been converted into a guanidino group (1),
A modification step of modifying the unmodified N-terminus in the guanidinized protein to be analyzed;
The modified fragment guanidino reduction are proteins to be analyzed were after step, the N-terminal peptide fragment you from the N-terminus of the protein to be the analysis (a), the N-terminal peptide fragment (a) except for one Or a fragmentation step (2) to obtain a plurality of other peptide fragments (b);
A separation step (3) for selectively eluting the N-terminal peptide fragment (a) from the N-terminal peptide fragment (a) and the other peptide fragment (b) by utilizing a difference in reactivity with a support; In the separation step (3),
As the support, a molecule or a part of the molecule that can form a covalent bond by chemical reaction with an amino group is used, and the other peptide fragment (b) is transferred via the amino group to the support. how is bound, the Ru eluted N-terminal peptide fragment (a), selectively recovering the N-terminal fragment of the protein.
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