JP2005137253A - ポリイオン会合体およびポリイオン会合体からなる生体物質キャリアー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 カチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックと、ポリ(エチルオキサゾリン)ブロックとを有するブロック共重合体、およびアニオン性の生体物質とからなり、前記ブロック共重合体中のカチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックとアニオン性の生体物質とがイオン結合したポリイオン会合体、および該会合体からなる生体物質キャリアー。生体物質を体内の分解酵素から守り、遺伝子を標的細胞まで安全に運ぶことができる。
【選択図】 なし
Description
上記ブロック共重合体の有するカチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックは、エチレンイミンおよびそのエチレンイミンの水素がアルキル基に置換された単位から構成されたカチオン形態のものであり、親水性を有するブロックである。すなわち、主鎖窒素が二級アミン、三級アミンのプロトン化された形態、あるいは四級アンモニウム形態のものが挙げられる。なかでも、アニオン性の生体物質、特に核酸(DNA、RNA)と良好なイオン結合力を有し、かつ水素結合を形成できる二級アミン類のポリエチレンイミンを使用することがより好ましい。
で表されるポリ(エチルオキサゾリン)ブロックとを有し、前記式(i)で表されるポリ(エチレンイミン)ブロックがカチオン化されてなるブロック共重合体は、特に生体物質キャリアー用途に好適に使用することができる。
(式(1)中、Xは1価以上の重合開始化合物残基、Aはカチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロック、Bは非イオン性のポリ(エチルオキサゾリン)ブロック、nはXの価数の範囲内で、少なくとも1の整数である。)
(式(2)中、Xは一価以上の重合開始化合物残基、Yは一価以上の末端化合物残基、Aはポリ(エチレンイミン)ブロック、Bはポリ(エチルオキサゾリン)ブロック、nはXの価数の範囲内で少なくとも1の整数、mはYの価数の範囲内で少なくとも1の整数である。)
本発明において使用するブロック共重合体を合成する方法としては、その前駆共重合体である、ポリ(N−ホルミルエチレンイミン)ブロックまたはポリ(メチルオキサゾリン)ブロックと、ポリ(エチルオキサゾリン)ブロックとから構成されるブロック共重合体(以下、該ブロック共重合体を前駆共重合体と略記する。)のポリ(N−ホルミルエチレンイミン)ブロックまたはポリ(メチルオキサゾリン)ブロックを優先的に加水分解することにより得られる。
アニオン性の生体物質としては、上記したカチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックとイオン結合して水不溶性となる物質であればよい。このような生体物質としては、その構造中にアニオン性基を有するDNA、蛋白質、細胞、あるいはウイルスなどが挙げられる。
本発明のコロイド状粒子は、上記ブロック共重合体と、上記生体物質とを水に溶解した水溶液を攪拌または振動させるか、あるいは上記ブロック共重合体の水溶液と上記生体物質の水溶液とを攪拌または振動下で混合させることにより、容易に得ることができる。水溶液中で、共重合体中のカチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックと、生体物質中のアニオン性基とがイオン結合し、該イオン結合部分が水不溶性となる。使用する共重合体、あるいは生体物質は、各々単一種類のみを使用しても、構造の異なる複数種類を使用してもよい。
特に断らない限り、「%」は「質量%」を表す。
東ソー株式会社製高速液体クロマトグラフィー「HLC−8000」(RI検出器、TSKge12000x1+3000Hxl+5000Hxl+guardcolumnHx1−H、溶媒ジメチルホルムアミド、流速1.0ml/分、温度40℃)を使用して測定した。
日機装株式会社製UPA粒度分析計「Microtrac 9203」(レーザー光波長780nm、反射角180o、温度25℃)を使用して、動的光散乱(DLS)法による粒径および粒径分布を測定した。
<星型ブロック共重合体の前駆体(1−1)の合成>
内部をアルゴンガスで置換した反応容器に、四官能性のカチオン開環リビング重合開始剤であり、星型のブロック前駆体の核(1)となるテトラ(4−クロロメチルフェニル)ポルフィリン0.022g(0.027mmol)、ヨウ化ナトリウム0.12g、およびN,N−ジメチルアセトアミド6mlを加え、室温で3時間攪拌した。この溶液に、2-エチル-2-オキサゾリン0.99g(10mmol)を加え、100℃に昇温し24時間撹拌した。
得られた重合体のメタノール溶液を、ジエチルエーテル中に注いで再沈殿させ、吸引濾過後、濾過物を真空乾燥し、星型のブロック前駆体(1−1)2.4gを得た。収率は95%であった。
1H−NMR(δTMS=0,CDCl3)測定からメチルオキサゾリンブロックにおける側鎖メチル基のシグナル(CH3:1.97ppm)と、エチルオキサゾリンブロックにおける側鎖エチル由来のシグナル(CH3:1.14ppm,CH2:2.41ppm)および両ブロックの主鎖エチレンシグナル(CH2CH2:3.45ppm)を確認した。また、星型ポリマー中心に位置するポルフィリン骨格のピロール環のプロトンは8.82ppmに現れた。1H−NMR測定による積分比から、メチルオキサゾリンブロックと、エチルオキサゾリンブロックのモル組成比は71:29であることがわかった。
上記でのブロック前駆体(1−1)0.5gを、15mLのクロロホルム中に溶解させた後、それに5mol/lの塩酸水溶液0.8mlを加えた。この混合液を撹拌してW/O型エマルジョンを得た。該エマルジョンを60℃に加熱し、48時間攪拌した。反応液にアセトン50mlを加えて重合体を沈殿させた後、吸引濾過し、アセトンで洗浄した。得られた重合体を乾燥し、エチレンイミンブロックと、エチルオキサゾリンブロックとからなる分子鎖を有する水溶性ブロック共重合体(1−2)0.45gを得た。
<比較用星型ポリエチレンイミンの合成>
内部をアルゴンガスで置換した反応容器に、四官能性のカチオン開環リビング重合開始剤であり、星型のブロック前駆体の核(1)となるテトラ(4−クロロメチルフェニル)ポルフィリン0.022g(0.027mmol)、ヨウ化ナトリウム0.12g、およびN,N−ジメチルアセトアミド6mlを加え、室温で3時間攪拌した。この溶液に、2−メチル−2−オキサゾリン1.53g(18mmol)を加え、100℃に昇温し24時間撹拌した。反応混合液の温度を室温に下げ、メタノール10mlを加えた後、反応混合液を減圧濃縮した。この濃縮液をジエチルエーテル50ml中に注いで、重合体を沈殿させた。得られた重合体を再び5mLのメタノールに溶解させた後、50mLのジエチルエーテル中再沈殿させ、吸引濾過後、濾過物を真空乾燥し、星型のポリメチルオキサゾリン1.47gを得た。収率は95%であった。
分子量測定および1H−NMR測定した結果、その質量平均分子量が19800、その分子量分布が1.5であった。
1H−NMR(δTMS=0,CDCl3)測定からエチルオキサゾリンブロックにおける側鎖メチル基のシグナル(CH3:1.97ppm)と主鎖エチレンシグナル(CH2CH2:3.45ppm)を確認した。
<星型の水溶性ブロック共重合体(1−2)とDNAとのポリイオン会合体>
合成例1で得た星型の水溶性ブロック共重合体(2−1)0.015gを1mlの蒸留水に溶解し、この溶液を、サケの精子から抽出したDNAの水溶液4ml(濃度2.2mg/ml)中に滴下し、1時間攪拌した。該分散液について、動的光散乱法によって、星型の水溶性ブロック共重合体(2−1)とDNAとのポリイオン会合体の粒子形成を確認したところ、平均粒径が146nmとなる単分散状態のナノ粒子が観測された。さらに、この分散液に、0.2gの食塩を加え、塩濃度を0.69mol/lに調製し、再び会合粒子の粒径を確認したところ、平均中心粒径は172nmであった。DNAを含むナノ粒子は、これほどの高濃度の食塩中でも全く凝集することなく、これを半年間放置した後にも粒径変化は起こらず、きわめて高い安定性を保持した。この安定性の高さは、星型の水溶性ブロック共重合体(1−2)のエチルオキサゾリンブロックがイオン会合コアを取り囲む水溶性コロナ層を形成したことを強く示唆する。この中性のコロナ層が塩の静電気的な遮蔽効果を弱める働きをしたと推測できる。
星型の水溶性ブロック共重合体(1−2)とDNAとのポリイオン会合体には、核酸のリン酸基が取り込まれるが、それのNMRシグナルを測定した。星型の水溶性ブロック共重合体(1−2)19mgと鮭の精子から抽出されたDNA9mgを0.6mLの重水中に溶解させ、ポリイオン会合体のコロイド液を調製した。このコロイド分散液中の燐原子のシグナルは0.35ppmで現れた。これはDNA単独の場合、燐原子シグナルが−160ppmに現れることと大きく異なった。即ち、水溶性ブロック共重合体(1−2)とDNAとのポリイオン会合体はエチレンイミンのカチオンとDNA中のリン酸基のアニオンとのイオン結合により形成されたことを示唆する。
<星型の水溶性ポリ(エチレンイミン)とDNAとのポリイオン会合体>
合成例2で得た星型ポリ(エチレンイミン)0.015gを1mlの蒸留水に溶解し、この溶液を、サケの精子から抽出したDNAの水溶液4ml(濃度2.2mg/ml)中に滴下し、1時間攪拌した。該分散液について、動的光散乱法によって、星型ポリエチレンイミンとDNAとのポリイオン会合体の粒子形成を確認したところ、平均粒径が68nmであった。この分散液に、0.2gの食塩を加え、塩濃度を0.69mol/lに調製したところ、系内では凝集による沈殿が生じた。この沈殿は加熱または超音波処理でも解くことができなかった。これは実施例1でのポリイオン会合体が食塩存在下でも安定性を保つ結果と対照的であり、本発明でのポリ(エチレンイミン)とポリ(エチルオキサゾリン)から構成されたブロック共重合体がDNAのキャリアーとしての有効性を示唆することと考えられる。
Claims (11)
- カチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックと、ポリ(エチルオキサゾリン)ブロックとを有するブロック共重合体、およびアニオン性の生体物質とからなり、前記ブロック共重合体中のカチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックとアニオン性の生体物質とがイオン結合したポリイオン会合体。
- 前記ブロック共重合体が下記一般式(1)
X−(A−B)n、またはX−(B−A)n (1)
(式(1)中、Xは一価以上の重合開始化合物残基、Aはポリ(エチレンイミン)ブロック、Bはポリ(エチルオキサゾリン)ブロック、nはXの価数の範囲内で少なくとも1の整数である。)で表され、かつ質量平均分子量が1000〜100000の範囲である請求項1に記載のポリイオン会合体。 - 前記ブロック共重合体が下記一般式(2)
[X−(A−B)n]m−Y、または[X−(B−A)n]m−Y (2)
(式(2)中、Xは一価以上の重合開始化合物残基、Yは一価以上の末端化合物残基、Aはポリ(エチレンイミン)ブロック、Bはポリ(エチルオキサゾリン)ブロック、nはXの価数の範囲内で少なくとも1の整数、mはYの価数の範囲内で少なくとも1の整数である。)で表され、かつ質量平均分子量が3000〜100000の範囲である請求項1に記載のポリイオン会合体。 - 前記カチオン性のポリ(エチレンイミン)ブロックと前記ポリ(エチルオキサゾリン)ブロックとの比率が、各々のポリマーを形成する構造単位のモル比(エチレンイミン単位)/(エチルオキサゾリン単位)で5/1〜1/5の範囲である請求項1〜3のいずれかに記載のポリイオン会合体。
- 前記Xが1〜12価の重合開始化合物残基である請求項2〜5のいずれかに記載のポリイオン会合体。
- 前記Yが1〜12価の末端化合物残基である請求項3〜5のいずれかに記載のポリイオン会合体。
- 前記Xが、ベンゼン骨格、ポルフィリン骨格、フタロシアニン骨格、またはピレン骨格のいずれかの骨格を有する重合開始化合物の残基である請求項2〜7のいずれかに記載のポリイオン会合体。
- 前記生体物質が核酸である請求項1〜8のいずれかに記載のポリイオン会合体。
- コロイド粒子状である請求項1〜9のいずれかに記載のポリイオン会合体。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のポリイオン会合体からなる生体物質キャリアー。
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