JP2005124996A - 生体材料 - Google Patents

Abstract

【課題】 組織形成を促進させ、かつ結合組織の過形成による狭窄を抑制することを特徴とする、新規な生体材料を提供する。
【解決手段】 羊膜又は羊膜細胞と多孔性支持体とからなる、生体材料。
【選択図】 なし

Description

本発明は、羊膜又は羊膜細胞と多孔性支持体とからなる、生体材料に関する。

悪性腫瘍、気管切開後狭窄などにより気管管状切除が必要な状況において、一定以上の長さの気管欠損修復には補綴のための生体材料が必要となるが、逸脱、感染、狭窄などの問題により、長期の臨床使用が可能な人工気管は未だ開発されていない。

また、人工血管は胸腹部や下肢、頸部、腋窩領域における動脈再建において多くの人命を救ってきた実績があり、内径１０ｍｍ以上の大口径人工血管や内径６〜８ｍｍ前後の中口径人工血管の臨床成績に関しては、ほぼ満足できる状況にある。しかしながら、内径６ｍｍ未満の小口径人工血管においては狭窄の問題により、未だ臨床に耐えうるものは開発されていない。

例えば、金属やガラス、シリコーン製の単なるチューブが気道確保の為に検討されたが、チューブ内面での自己組織形成不足や外面における周囲組織との一体化不足による感染や逸脱、吻合部での肉芽過形成による狭窄などの欠点があり、長期の臨床使用は不可能であった。

より最近では、これら問題点の改善を目的として、多孔性のコラーゲン素材を用いた人工気管や多孔性ポリウレタンと非多孔性のリング状ポリウレタンから構成される人工気管が開発されている（特許文献１〜３、非特許文献１）。

しかし、自己気管から人工気管内面に進展する線毛上皮細胞など内面組織の形成不良、これに伴う人工気管中央部での結合組織の過形成による狭窄など、未だ解決すべき問題点が残っている。
特開昭６１−６８０３８号公報 実開平６−１７７１５号公報 国際公開第０１／０２４７３１号パンフレット エッチ・エッチ・シャウベッカー（H.H.Schauwecker）著、「ビーグル犬における分節的気管交換のための等弾力性ポリウレタン人工気管（Isoelastic polyurethane prosthesis for segmental trachea replacement in beagle dogs.）」、Artif Organs.、第１３巻、第３号、第２１６〜２１８頁、１９８９年

本発明が解決しようとする課題は、組織形成を促進させ、かつ結合組織の過形成による狭窄を抑制することを特徴とする、新規な生体材料を提供することである。

本発明は、羊膜又は羊膜細胞と多孔性支持体とからなる、生体材料に関する。

上記多孔性支持体は、補強体によって補強されていることが好ましい。補強体は、輪状又はらせん状であることができる。

上記多孔性支持体の材質は、好ましくは、セグメント化ポリウレタンであり、より好ましくは、脂肪族系セグメント化ポリウレタンである。

本発明に用いる羊膜又は羊膜細胞は、ヒトに由来する羊膜又は羊膜細胞であることが好ましい。

本発明の生体材料は、好ましくは、人工気管又は人工血管として用いることができる。

また、本発明は、羊膜又は羊膜細胞を上記多孔性支持体と接触させることを含む、上記生体材料の製造方法にも関する。

本発明による生体材料は、周囲組織や毛細血管の生体材料壁への侵入を促し、これに伴い生体材料と周囲組織との一体化を促進することができる。また、本発明の生体材料は、結合組織の過形成による狭窄や閉塞を抑制することができる。さらに、本発明の生体材料は、生体組織から生体材料への線毛上皮細胞や血管内皮細胞の進展を促進し、感染防止や痰の排泄機能や血流の保持または改善に寄与することができる。

本発明で用いられる支持体は、周囲組織や毛細血管の進入を可能とする多くの孔を有することが必要であり、その空孔率は、６５〜８５％であり、平均孔径は、１０〜１００μｍであり、好ましくは、空孔率は、７１〜８２％であり、平均孔径は、２０〜６０μｍである。

また、上記の多孔性支持体は、例えば、首の運動に追従することができる程度の可撓性を有し、かつ、屈曲時に内腔のつぶれや閉塞がなく、気体や液体の流動性を保持することができる構造である必要があり、柔軟な多孔性支持体を硬質の輪状又はらせん状の補強体で補強する事が好ましい。

多孔性支持体を構成する材料は、Ｄ７９０（ＡＳＴＭ）試験法による曲げ応力が５〜６５０ＭＰａであり、支持体の内径／外径比率が０．６５〜０．９５であり、好ましくは、７〜７０ＭＰａ、０．７０〜０．９０である。

多孔性支持体の材質としては、柔軟かつ組織適合性に優れ、羊膜との結合や羊膜細胞の培養ができるものであれば良いが、セグメント化ポリウレタンが好ましく、脂肪族系セグメント化ポリウレタンがより好ましい。

硬質な輪状又はらせん状の補強体を構成する材料の曲げ応力は、９０ＭＰａ以上であればその効果を発揮することができるが、６００ＭＰａ以上であることが好ましい。

上記補強体は、多孔性、非多孔性いずれの構造も本発明の生体材料に適用することができる。

上記補強体の材質としては、硬質な樹脂、ステンレス、チタニウムなどの金属、ヒドロキシアパタイト、セラミックなどを挙げることができるが、セグメント化ポリウレタン、ポリプロピレンが好ましい。

また、多孔性支持体および補強体に用いることができる材料は、上記材質に限定されるものではない。

本発明における羊膜や羊膜細胞を用いた多孔性支持体は、移植箇所に適応した任意の形状であることができ、円筒形のみならず、気管分岐や血管分岐に相当するＹ字型や、気管や血管の部分切除用のシート状であってもよい。

本発明における羊膜や羊膜細胞を用いた多孔性支持体は、円筒形の形状であるときは、その内径は、好ましくは、１〜６ｍｍであり、さらに好ましくは、１〜４ｍｍであり、最も好ましくは１〜２ｍｍである。

多孔性支持体は、原材料および、炭酸カルシウムや塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機粒子を混合した粘調な溶液を、押出し成型やディピング成型、プレス成型など一般的な加工方法により所定の形に成型し乾燥した後、水洗による無機粒子の溶解除去により多孔性支持体を得ることができる。

これら多孔性支持体に用いることが出来る原材料としては、例えばTHERMEDICS社製のTecoflexやUpjohn社のPellethane等のセグメント化ポリウレタンを用いることができる。

本発明に用いられる羊膜細胞は、分娩時に排泄される羊膜組織から単離することができる。羊膜から羊膜細胞を単離する際には、組織から細胞を分離させる一般的な方法を用いることができ、例えば、コラゲナーゼ・トリプシン・ヒアルロニダーゼなどを用いて細胞を分散させることができる。

また採取される細胞のうち羊膜上皮細胞を用いることが、自家気管の線毛上皮細胞や自家血管の血管内皮細胞の進展促進、周囲組織や毛細血管の浸入促進、結合組織の過形成抑制の効果の点より好ましい。

また、羊膜それ自体も好ましく用いることが可能である。

多孔性支持体内腔での培養に用いる培地は、成長因子などを添加した無血清培地又は１０％ＦＢＳ含有基礎培地が好ましい。培養は、５％炭酸ガス培養器内で静置培養することができるが、内腔面全体への均一な培養を行なうには、５〜１０分に１回の割合で培養容器を回転させる回転培養が好ましい。

また、人工気管と自己気管、人工血管と自己血管の吻合部外側や、人工気管や人工血管の中央部外側を羊膜で被覆して移植することも可能である。

また本発明の多孔性支持体内腔で羊膜細胞を培養した生体材料は、人工血管としても使用可能である。

多孔性円筒体の作製；
ポリウレタン樹脂（THERMEDICS社、ＥＧ−８５Ａ、ショアー硬度７７Ａ）１００部をテトラヒドロフランに溶解させ適度な粘調性溶液を調製した後、平均粒径３０μｍの塩化ナトリウム８００部を加えた。このポリウレタン溶液に直径２ｍｍのガラス棒を浸漬後、ゆっくりと引上げ室温で約３０分間風乾させた。この操作を数回繰返し所定の外径とした後１２時間以上室温で乾燥させた。その後、水中へ浸漬させ、塩化ナトリウムおよび残留溶媒を除去し、引き続き７０℃の温水中に６時間以上浸漬させた。この間、水および温水を適宜交換した。

ガラス棒から成型物を脱型し４５℃で乾燥させ、内径２ｍｍ、外径４ｍｍのポリウレタン多孔性円筒体を得た。

羊膜上皮細胞の調製および培養；
インフォームドコンセントおよび倫理委員会承認のもと、分娩により得られた羊膜を氷冷したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で洗浄し、血液・胎便などの付着物を除去した。剪刀を用いて小細片化後、羊膜を１００ｍｍ径の培養シャーレにとり、ＤＮアーゼおよびヒアルロニダーゼを加えたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）溶液を加え、鋏を用いて細切した。

これに０．２５％トリプシンを含むＤＭＥＭを、全量が１００ｍＬ程度になるように添加し、バイオシェーカーを用いて、３７℃、１３０回転／分で３０分間攪拌後、尺角ガーゼでろ過し羊膜上皮細胞を得た。

尺角ガーゼに残った羊膜細片を試薬瓶にいれ、再び０．２５％トリプシンを含むＤＭＥＭを全量で１００ｍＬ程度になるように添加し、同様に攪拌後ろ過を行った。

ろ過した細胞浮遊液を５０ｍＬの遠沈管に入れ、３００ｇ、１０分間の遠沈後、上清液を吸引除去した。沈殿した細胞に適量の培地を加え分散させ、その一部を採取してトリパンブルーによる染色後、細胞生存率・細胞数の計測を行い、残りの部分を３７℃、５％炭酸ガス培養器で培養した。

培養は、６０ｍｍ径の培養シャーレ４枚を用い、細胞密度が７５〜９０％の周密度（confluent）になった時点で一日一枚ずつ０．２５％トリプシン含有ＰＢＳを用いて上皮細胞を剥離、遠沈、計測し、１×１０^４個／μＬの細胞浮遊液を作製し、ピペットを用いて約２ｃｍに切断した上記のウレタン多孔性円筒体内腔に注入した。

内腔全面での培養を行なうため、この浮遊液の注入を、多孔性円筒体を周方向で９０度ずつ回転させながら計４回行い、その後１４日間培養した。

ラット移植試験；
内腔一面が羊膜上皮細胞で被覆されていることを確認後、Ｆ３４４ラットより摘出し二分した各々約０．５ｃｍの気管を多孔性円筒体の両端に端々吻合し、他のＦ３４４ラット皮下に移植し、２８日間の培養を行なった。

コントロールとして羊膜上皮細胞で被覆していない多孔性円筒体に同様にラット摘出気管を端々吻合したものを用い比較検討した。

その結果、ヒト羊膜上皮細胞で被覆したウレタン多孔性円筒体はコントロールと比較して、気管側の気道上皮線毛細胞の多孔性円筒体への移行、および多孔性円筒体への結合組織の移行ともに良好であり、かつ内腔狭窄は軽度であった。

気道上皮の移行距離は、コントロールの約５ｍｍに対し、羊膜上皮細胞で被覆したものでは約１０ｍｍ、内腔狭窄率はコントロールの約５０％に対し、羊膜上皮細胞で被覆したものでは約１０％で、羊膜上皮細胞による被覆の効果が確認された。

本発明によれば、羊膜上皮細胞で被覆したウレタン多孔性円筒体を用いる事により人工気管内面における自己組織形成（気道線毛上皮細胞の進展）や外面における周囲組織との一体化（多孔性円筒体への結合組織の移行）、接合部での肉芽過形成による狭窄などを著しく改善できる。

多孔性円筒体の作製；
実施例１と同様のポリウレタン樹脂、塩化ナトリウム溶液および直径2ｍｍのガラス棒を用い、同様の方法で外径２．６ｍｍの浸漬成型物を得た後、ジョンソン・エンド・ジョンソン社製のETHICONポリプロピレン縫合糸（PROLENE 6-0）を、らせん状の補強体として前記成型物に平均ピッチ３．６ｍｍで巻き、前記のポリウレタン樹脂、塩化ナトリウム溶液に再度浸漬させ、補強体を多孔性円筒体内に埋蔵させた。
実施例１と同様の水および温水を用いた塩化ナトリウムおよび残留溶媒の除去および乾燥により、内径２ｍｍ、外径３ｍｍのらせん状補強体付き多孔性円筒体を得た。

羊膜上皮細胞の調製および培養；
実施例１と同様に羊膜細胞を調製し、約２．０ｃｍの前記のらせん状補強体付き多孔性円筒体内腔で培養した。

家兎移植試験；
１４週例（体重約３ｋｇ）の雄家兎への移植試験を行なった。人工換気、全身麻酔下に１.５〜２.０ｃｍの頸動脈切除を行い、前記のらせん状補強体付き多孔性円筒体を端々吻合後した。コントロールとしては、羊膜上皮細胞で被覆していない同様の円筒体による評価を行った。

移植後２週間の時点で、本人工血管を含めた血管を摘出しホルマリン固定、ＨＥ染色による組織学的な評価を行った。

評価の結果を下表に示す。

本発明によれば、羊膜上皮細胞で被覆したウレタン多孔性円筒体を用いる事により人工血管内面における自己組織形成（血管内皮細胞の進展）や外面における周囲組織との一体化（多孔性円筒体への結合組織の移行）、接合部での肉芽過形成による狭窄などを著しく改善できる。

本発明の人工気管は、周囲組織や毛細血管の人工気管壁への侵入、人工気管と周囲組織との一体化、自己気管からの線毛上皮細胞の進展を促す事により、結合組織の過形成による狭窄や閉塞を抑制し、かつ感染防止や痰の排泄機能の保持または改善を行なう事が出来る。これにより、悪性腫瘍や気管切開後狭窄など一定以上の長さの気管欠損修復が必要な症例に対し、長期使用が可能な人工気管を提供する事ができる。

輪状補強体付き多孔性円筒体を用いた人工気管の断面図である。

Claims (9)

1. 羊膜又は羊膜細胞と多孔性支持体とからなる、生体材料。
2. 上記多孔性支持体が、円筒形である、請求項１に記載の生体材料。
3. 上記多孔性支持体が、輪状又はらせん状の補強体によって補強されている、請求項２に記載の生体材料。
4. 上記多孔性支持体の材質が、セグメント化ポリウレタンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体材料。
5. 上記セグメント化ポリウレタンが脂肪族系のセグメント化ポリウレタンである請求項４に記載の生体材料。
6. 羊膜又は羊膜細胞が、ヒトに由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体材料。
7. 生体材料の形状が、円筒形であり、その内径が、１〜６ｍｍである、請求項１〜６のいずれか1項に記載の生体材料。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体材料からなる、人工気管又は人工血管。
9. 羊膜又は羊膜細胞を上記多孔性支持体と接触させることを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体材料の製造方法。