JP2005124572A - 高遊離アミノ酸含有ダイズ - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、遊離アミノ酸含有食品への加工が容易である、子実中の総遊離アミノ酸含量が高いダイズおよびその作出方法に関する。
【解決手段】 β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失すること、もしくはβ-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうちグリシニンサブユニットであるA3B4のみを有することを特徴とするダイズを提供することにより、一般栽培種のダイズに比べて子実中の総遊離アミノ酸含量が高いダイズが提供される。
【選択図】 なし
【解決手段】 β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失すること、もしくはβ-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうちグリシニンサブユニットであるA3B4のみを有することを特徴とするダイズを提供することにより、一般栽培種のダイズに比べて子実中の総遊離アミノ酸含量が高いダイズが提供される。
【選択図】 なし
Description
本発明は、従来の栽培ダイズより、子実中に遊離アミノ酸を高濃度に含有するダイズ、およびその作出方法に関する。
マメ科植物であるダイズの子実中には、多量の貯蔵蛋白質が蓄積されることは良く知られており、この子実中に含まれるアミノ酸のほとんどは結合型アミノ酸、即ち、貯蔵蛋白質または酵素蛋白質等の成分として保存されている。従って、ダイズ子実中にはアミノ酸が遊離した状態では多く存在していないため、公知の酵素法、化学的処理方法などで蛋白質を加水分解しない限り子実中から高濃度の遊離アミノ酸を得ることはできない。
一方、ダイズ子実中には主要な貯蔵蛋白質としてβ-コングリシニンとグリシニンとがあり、全蛋白質の約70%を占めている。従って、ダイズ蛋白質の性質の大部分はこの両成分の性質が反映されたものであり、ダイズ貯蔵蛋白質の特性を改良するには、β-コングリシニンならびにグリシニン含量を変化させることが有効である。その目的のために両蛋白質のサブユニットを遺伝的に欠失もしくは低減したダイズが作出され、例えば、β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニットのうち、α、α’を遺伝的に欠失させ、βサブユニットを低減させることにより、補完的にグリシニン含量が高まり、その結果、ダイズ蛋白質の栄養価値を制限している含硫アミノ酸（シスチン、メチオニン）を高めることができるという知見が得られている（例えばOgawa et al.1989）。
一方、グリシニンを構成する5つのサブユニットであるA1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3およびA3B4についても、それらを合成するGy1、Gy2、Gy3、Gy4、Gy5の遺伝子の構造や発現機序について明らかにされている（例えばNielsen et al. 1988）。さらに、サブユニットの欠失変異ダイズであるA1aB2、A2B1a、A1bB1b（Group Ｉ）同時欠失型、A5A4B3（Group IIa）欠失型、A3B4（Group IIb）欠失型の系統が作出され、それぞれの欠失型がそれぞれ劣性遺伝子により支配されていることがわかっている（例えばYagasaki et al.1996）。これによって、これらを親とした交雑によりグリシニンの複数のサブユニットを遺伝的に欠失したダイズが作出できるようになり、グリシニン含量と加工適性、特に豆腐加工適性との関係について検討がなされるようになった（Yagasaki et al. 2000）。
このように、これまでのダイズ子実の蛋白質ならびにアミノ酸に関する研究はその研究対象がもっぱら貯蔵蛋白質そのものであり、ダイズ子実中の遊離アミノ酸に関する研究例はほとんどなく、貯蔵蛋白質欠失ダイズを利用してダイズ子実中の遊離アミノ酸を高めようとする考えは全くなかった。
しかし、近年、栄養生理学、食品学等の観点から、例えば疲労回復および/または脂肪燃焼効率化などのためには遊離アミノ酸を摂取することが好ましいとされ、さまざまな遊離アミノ酸を含有する機能性食品あるいはサプリメントが開発されてきている。
ダイズは、人類の非常に有用な食用作物として、非常に多くの国々、地域で栽培されている植物であり、その子実は、油分および蛋白質含量も高い植物性食品として、多種多様な加工食品にも利用されている。
特に、近年、各種遊離アミノ酸の摂取がヒトの健康によい影響を及ぼすという事実がかなり知られるところとなり、疲労回復、体内での脂肪燃焼効果などを利用したスポーツサプリメントやダイエットサプリメントが広く販売されるようになっている。本発明のダイズにおいて特異的に多いアルギニンについては、その摂取が悪性腫瘍細胞の破壊を助けたり（例えば、Park et al. 1991）、ヒトの免疫機能の向上（例えばKirk et al. 1993）、成長ホルモンの分泌の増進（例えばKreider et al. 1993）に役立つことが報告されており、グルタミンについても、筋力増強（例えば、Rennie 1996）、免疫機能の向上（例えばNewsholme and Calder 1997）等が報告されており、遊離アミノ酸の様々な健康機能性について科学的な検証がなされている。
Ogawa,T.他、1989. Jpn. J. Breed. 39:137-147
Yagasaki, K.他、2000. Breed. Sc. 50:101-107
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植松芳彦 他、1999．育種学研究１(別１)：１５４
そこで、子実中の総遊離アミノ酸含量が高いダイズが作出できれば、この子実を原料に用いることにより、総遊離アミノ酸含量の高い機能性ダイズ加工食品を得ることができる。
本発明は、ダイズ子実中の主要貯蔵蛋白質の生合成能力を遺伝的に抑止することによって、初期産物として生産されるアミノ酸を遊離状態のままで高濃度に子実中に蓄積するダイズ、およびその作出方法を提供することを目的とするものである。また、該方法により、種々の健康機能性を有する遊離アミノ酸を含有する機能性加工食品の原料としての遊離アミノ酸含量の高いダイズを提供する。
本発明者等は上記課題を解決するため、鋭意研究する中で、貯蔵蛋白質のうち、α、α’およびβサブユニットを全て欠失するβ-コングリシニン欠失ツルマメQT2（これは、独立行政法人、産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６）に受託番号FERM BP-8376として、2003年5月8日に寄託されている）を世界で初めて発見するに至った（Hajika et al. 1996）。さらに研究を進める中で、β-コングリシニン欠失ツルマメQT2とβ-コングリシニンを有する栽培ダイズとを交雑し、そのF1、F2個体群の分離比を算出することによって、このβ-コングリシニン欠失が一因子の優性遺伝子に支配されていることを見出し、この遺伝子をScgと命名した（Hajika et al.1998）。
さらに、β-コングリシニン欠失ツルマメと栽培ダイズとの戻し交雑を進め、開花、成熟および生育状況等の農業特性が栽培ダイズに劣らないβ-コングリシニン欠失ダイズである九系305を作出した（Takahashi et al. 2000）。
本発明者等は、一方、グリシニンの主要サブユニットであるA1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3およびA3B4全てを遺伝的に欠失するダイズ（Yagasakai et al. 1996）に、栽培ダイズ（エンレイ）を交雑し、農業特性を一部改良したグリシニン欠失ダイズであるEnB1（これは、独立行政法人、産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６）に受託番号FERM BP-8377として、2003年5月8日に寄託されている）を作出した。
さらに、本発明者等はβ-コングリシニン欠失ダイズとグリシニン欠失ダイズとの交雑により貯蔵蛋白質の約70%を占めるβ-コングリシニンとグリシニンを遺伝的に欠失したダイズが作出できることを世界で初めて見出した（植松ら1999）。
β-コングリシニン欠失ダイズとグリシニン欠失ダイズとの交雑後代からβ-コングリシニンおよびグリシニンを同時に遺伝的に欠失したダイズを選抜し、これらの子実中の総遊離アミノ酸含量が特に増加していることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の態様：
１．子実中の総遊離アミノ酸含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカおよびタチユタカ、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、ならびにグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中の該含量に比べて高いダイズ；
２．子実中の総遊離アミノ酸含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカおよびタチユタカ、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、ならびにグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中の該含量に比べて少なくとも2倍以上高いことを特徴とする、上記１記載のダイズ；
３．子実中の総遊離アミノ酸含量が、子実乾物重1g当たり8mg以上であることを特徴とする、上記１記載のダイズ；
４．子実中に含まれる各遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンからなる群より選択される少なくとも1種の遊離アミノ酸の含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、およびグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中に含まれるその含量に比べて高いことを特徴とする、上記１記載のダイズ；
５．子実中に含まれる各遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジンおよびグルタミンの全ての遊離アミノ酸の含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、およびグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中のそれぞれの含量に比べて高いことを特徴とする、上記４記載のダイズ；
６．β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうち、少なくともβ-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットを遺伝的に欠失する、上記１記載のダイズ；
７．β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失している、上記６記載のダイズ；
８．β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニット全てを欠失しているダイズとを交雑させるか、または上記サブユニット全てを欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含み、ここで交雑する両ダイズの少なくとも一方はグリニシンのA3B4サブユニットを有するものとする、上記６記載のダイズを作出する方法；
９．β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3およびA3B4サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニットを全て欠失しているダイズとを交雑させるか、または上記サブユニットを全て欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含む、上記７記載のダイズを作出する方法；
１０．β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305と、グリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1とを交雑するステップを含む、上記８または９記載の方法；
１１．交雑ステップの後、β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうちグリシニンサブユニットA3B4のみを有する系統、またはβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを欠失した系統を選抜するステップをさらに含む、上記８〜１０のいずれかに記載の方法；
１２.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料として用いて製造される、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された場合に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、遊離アミノ酸含有ダイズ食品材料；
１３.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて製造される、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された場合に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、機能性食品；
１４.請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて製造される豆乳であって、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された豆乳に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、豆乳；
１５.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて、総遊離アミノ酸含量が増加している機能性食品を製造する方法；ならびに
１６.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された豆乳に比べて総遊離アミノ酸含量が増加している豆乳を製造する方法；
に関する。
１．子実中の総遊離アミノ酸含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカおよびタチユタカ、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、ならびにグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中の該含量に比べて高いダイズ；
２．子実中の総遊離アミノ酸含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカおよびタチユタカ、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、ならびにグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中の該含量に比べて少なくとも2倍以上高いことを特徴とする、上記１記載のダイズ；
３．子実中の総遊離アミノ酸含量が、子実乾物重1g当たり8mg以上であることを特徴とする、上記１記載のダイズ；
４．子実中に含まれる各遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンからなる群より選択される少なくとも1種の遊離アミノ酸の含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、およびグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中に含まれるその含量に比べて高いことを特徴とする、上記１記載のダイズ；
５．子実中に含まれる各遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジンおよびグルタミンの全ての遊離アミノ酸の含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、およびグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中のそれぞれの含量に比べて高いことを特徴とする、上記４記載のダイズ；
６．β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうち、少なくともβ-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットを遺伝的に欠失する、上記１記載のダイズ；
７．β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失している、上記６記載のダイズ；
８．β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニット全てを欠失しているダイズとを交雑させるか、または上記サブユニット全てを欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含み、ここで交雑する両ダイズの少なくとも一方はグリニシンのA3B4サブユニットを有するものとする、上記６記載のダイズを作出する方法；
９．β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3およびA3B4サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニットを全て欠失しているダイズとを交雑させるか、または上記サブユニットを全て欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含む、上記７記載のダイズを作出する方法；
１０．β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305と、グリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1とを交雑するステップを含む、上記８または９記載の方法；
１１．交雑ステップの後、β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうちグリシニンサブユニットA3B4のみを有する系統、またはβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを欠失した系統を選抜するステップをさらに含む、上記８〜１０のいずれかに記載の方法；
１２.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料として用いて製造される、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された場合に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、遊離アミノ酸含有ダイズ食品材料；
１３.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて製造される、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された場合に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、機能性食品；
１４.請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて製造される豆乳であって、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された豆乳に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、豆乳；
１５.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて、総遊離アミノ酸含量が増加している機能性食品を製造する方法；ならびに
１６.上記１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された豆乳に比べて総遊離アミノ酸含量が増加している豆乳を製造する方法；
に関する。
本発明により、子実中の総遊離アミノ酸含量が従来のダイズ品種もしくは系統より高いダイズ系統が作出された。該ダイズは、農業的利用に適した農業特性を有している。さらに、本発明で作出されたダイズは総遊離アミノ酸含量が従来の一般的栽培ダイズの３〜５倍以上であり、遊離のアルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンの含量が高い。このため、ヒトが従来の栽培ダイズの代わりに本発明で得られるダイズを摂取することによって、より多くの遊離アミノ酸を直接体内へ効率良く吸収できるようになる。
すなわち、本発明で得られるダイズは従来の栽培ダイズにはない遊離アミノ酸含量の高い機能性食品の食品素材として、有用性が非常に高い。
本明細書中の総遊離アミノ酸含量とは、各ダイズの子実中に検出される、蛋白質中に組込まれず遊離した状態にある各アミノ酸の総和を指す。各遊離アミノ酸の量の定量方法は当技術分野で公知であるが、例えば粉砕した子実からエタノール等の溶媒で抽出した遊離アミノ酸抽出液をアミノ酸分析に供し、天然に存在する20種全てのアミノ酸についてそれぞれ定量して、その総和を算出するとよい。
本発明のダイズは、冬から春（1998年12月〜1999年3月）の加温ガラス室内（平均気温25℃に調整、自然日長）でのポット栽培（培養土と腐植土を2：1に混合した培地）、夏から秋（2000年7月から10月）の一般圃場（黒ボク火山灰土壌、平均気温24.3℃、平均最高気温29.3℃、平均最低気温19.7℃、降水量453.0mm）、再度、夏から秋（2001年7月〜2001年10月）の一般圃場（黒ボク火山灰土壌、平均気温24.1℃、平均最高気温29.2℃、平均最低気温19.4℃、降水量682.5mm）での栽培など異なる環境条件下であっても、同様にして栽培されたダイズ主要貯蔵蛋白質であるβ-コングリシニンおよびグリシニンのいずれのサブユニットも欠失していないフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3を遺伝的に欠失するエンレイなどのダイズ、β-コングリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失する九系305などのダイズ、ならびにグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するEnB1などのダイズからなる群より選択されるいずれかに比べて、その子実中に含まれる総遊離アミノ酸含量が高いこと、好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上、最も好ましくは4倍以上高いことを特徴とする。通常の圃場での栽培では、上記栽培ダイズの子実中の総遊離アミノ酸総含量は、その種および/または栽培条件によって異なるが、通常子実1ｇあたり１〜３mgの範囲内であることが多いが、本発明のダイズのアミノ酸総含量は、子実1ｇあたり5mg以上、好ましくは8mg以上、さらに好ましくは9mg以上、最も好ましくは10mg以上であり、最も好ましい場合は30mg以上である。
さらに、各アミノ酸別の含量に注目した場合、本発明のダイズは、遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンが、同様の条件下で栽培した栽培ダイズに比べて増加している。栽培ダイズにおいても、その品種もしくは系統によって各遊離アミノ酸の含量は異なるが、例えば、同様の条件下で栽培したフクユタカ、タチユタカ、エンレイ、九系305およびEnB1からなる群より選択される任意のものに比べて、本発明のダイズでは、アスパラギンおよびヒスチジンでは2倍以上、グルタミンでは５倍以上、ならびにアルギニンでは８倍以上である。
本発明の１つの態様は、β-コングリシニンおよびグリシニンを構成するサブユニットのうち、グリシニンのA3B4サブユニットのみを有するダイズであり、かかるダイズは、β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを遺伝的に欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有する全てのサブユニットを遺伝的に欠失するダイズとを交雑させるか、または上記サブユニット全てを遺伝的に欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含む方法により作出することができる。ここで、交雑する両ダイズの少なくとも一方はグリシニンのA3B4サブユニットを有していてもよい。すなわち、β-コングリシニンの全サブユニットおよびグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットのいずれもが、交雑する両方のダイズのうち少なくとも一方において遺伝的に欠失されており、かつ、グリシニンのA3B4サブユニットは交雑する両方のダイズのうち少なくとも一方において発現可能である場合、両ダイズを交雑させることによって、β-コングリシニンおよびグリシニンの構成サブユニットのうち、グリシニンのA3B4サブユニットのみを有するダイズが作出される。
また、本発明のダイズは、β-コングリシニンおよびグリシニンを構成するサブユニットの全てを遺伝的に欠失するダイズでもよい。かかるダイズは、β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3およびA3B4サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを遺伝的に欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニットの全てを遺伝的に欠失するダイズとを交雑させるか、または上記サブユニットの全てを遺伝的に欠失するダイズとこれらの全てもしくは一部のサブユニットを有するダイズとを交雑させることよって作出することができる。例えば、β-コングリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失する九系305と、グリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するEnB1との交雑、あるいはβ-コングリシニンならびにグリシニンの全サブユニットを有するフクユタカとβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失したダイズを交雑させることによって得ることができる。
ダイズの交雑は、当技術分野で周知の方法で実施することができる。
得られた交雑後代からβ-コングリシニンおよびグリシニンを構成するサブユニットのうちの少なくとも1つのサブユニット、A3B4サブユニット以外の全てのサブユニット、または全てのサブユニットを遺伝的に欠失したダイズを選抜するとよい。この選抜のためのサブユニットを欠失するか否かの判定は、当業者であれば容易に行うことができる。例えば、交雑後代から得た子実の子葉部分を削り取り、Kitamuraら(1984)の方法にしたがってSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判定することができる。
得られた交雑後代からβ-コングリシニンおよびグリシニンを構成するサブユニットのうちの少なくとも1つのサブユニット、A3B4サブユニット以外の全てのサブユニット、または全てのサブユニットを遺伝的に欠失したダイズを選抜するとよい。この選抜のためのサブユニットを欠失するか否かの判定は、当業者であれば容易に行うことができる。例えば、交雑後代から得た子実の子葉部分を削り取り、Kitamuraら(1984)の方法にしたがってSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判定することができる。
そして、β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットを欠失するダイズ系統を遺伝的に固定することができる。β-コングリシニンおよびグリシニンを構成する全てのサブユニットを遺伝的に欠失するダイズ系統（以後、QF2と呼ぶ）あるいはβ-コングリシニンのサブユニットの全てを遺伝的に欠失し、グリシニンのサブユニットのうちグループI（A1aB2、A2B1a、A1bB1b）ならびにIIa（A5A4B3）を遺伝的に欠失するダイズ系統（以後、QF3と呼ぶ）を選抜して固定することもできる。これらの方法は当業者には公知である。
したがって、本発明は、本発明のダイズを作出するこれらの方法も包含する。
したがって、本発明は、本発明のダイズを作出するこれらの方法も包含する。
このような方法で作出される本発明のダイズは農業特性が一般の栽培ダイズと比べて劣ることなく、野外の一般栽培において正常な栄養生長を行い、正常な子実を生産でき、栽培植物として事実上問題ない。
本発明のダイズとの比較対象として、β-コングリシニンの全サブユニットのみを遺伝的に欠失するダイズの総遊離アミノ酸含量を測定したところ、栽培ダイズあるいはβ-コングリシニンおよびグリシニンのいずれのサブユニットも欠失していないダイズに比べ遊離アミノ酸の増加は認められず、これに対して、グリシニンの全サブユニットのみを遺伝的に欠失するダイズの総遊離アミノ酸含量を栽培ダイズと比較したところ、一部の遊離アミノ酸についてその含量が増加しているが、QF2およびQF3ダイズに比べるとその増加量は明らかに低い。β-コングリシニンの全サブユニットの遺伝的欠失に加えグリシニンのサブユニットを一部、遺伝的に欠失させることも子実の遊離アミノ酸含量の増加に効果的であるが、その増加の程度は、QF2、QF3には及ばない。さらに、β-コングリシニンのほとんどを遺伝的に欠失したダイズ、即ち、α、α’を遺伝的に欠失し、βサブユニット生成量が低減したβ-コングリシニン不完全欠失ダイズとグリシニン欠失ダイズの交雑後代から得られるβ-コングリシニン不完全欠失・グリシニン欠失ダイズでも子実中の総遊離アミノ酸含量はグリシニン欠失ダイズと同程度であった。したがって、本発明のβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットのうち、少なくともβ-コングリシニンのサブユニットの全てとグリシニンのサブユニットのうちグループI（A1aB2、A2B1a、A1bB1b）およびIIa（A5A4B3）とを遺伝的に欠失するダイズ、すなわち、β-コングリシニンとグリシニンとのサブユニットのうちグリシニンのグループIIb（A3B4）のみを有するダイズ、またはβ-コングリシニンとグリシニンとの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズの総遊離アミノ酸含量が、他の種に比べて特に高いという点で、食用作物として有利である。
さらに、本発明は、本発明のダイズの子実を原料とする加工食品も包含する。かかる加工食品は、豆乳(調製豆乳、豆乳飲料を含む)、豆腐等を含むあらゆるダイズ加工食品を含む。これらは、原料とするダイズ子実の総遊離アミノ酸含量が高いために、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造される加工食品に比べて、総遊離アミノ酸含量が高く、特に、遊離のアルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミン含量が高い。例えば、本発明のダイズの子実を原料とする豆乳の場合、総遊離アミノ酸含量が通常の栽培ダイズに比べ５倍以上であり得、その中でもアルギニンが栽培ダイズに比べ１８倍以上多く含まれ得、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、ヒスチジンで栽培ダイズを原料とした豆乳に比べ多く含まれ得る。したがって、本発明のダイズを用いることにより、遊離アミノ酸を添加するなどの処理をすることなく、総遊離アミノ酸含量の高いダイズ加工食品が得られる。また、このようにして得られた豆乳、または該豆乳から分画して得られる遊離アミノ酸含有画分を、加工食品原料に添加することにより、高遊離アミノ酸含有加工食品(すなわち、機能性食品)を得ることができる。したがって、本発明のダイズ子実を原料として得られる、総遊離アミノ酸含量の高い、高遊離アミノ酸含有ダイズ食品材料もまた本発明の範囲に包含される。すなわち、該ダイズ子実の遊離アミノ酸成分を含む画分を抽出することにより得られる、豆乳またはその他の遊離アミノ酸成分を含む画分は、加工食品中の遊離アミノ酸含量を増大させる目的で、加工食品中に添加することができる。
このことにより、本発明の加工食品は、アミノ酸の吸収効率がよく、栄養的に優れた機能性食品である。
このことにより、本発明の加工食品は、アミノ酸の吸収効率がよく、栄養的に優れた機能性食品である。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施例１
まず、高遊離アミノ酸ダイズであるβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズの作出方法について検証する。β-コングリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失した九系305とグリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失したEnB1を1997年12月から1998年3月の期間、加温ガラス室内（熊本県西合志町 最低気温22℃、最高気温32℃に調整、播種後１ヶ月間は毎日、蛍光灯照明を午後4時〜午後９時、翌朝3時〜8時の２回行い、18時間日長とする。以後、自然日長とする。）のポット土耕栽培（黒ボク火山灰土壌）にて約40〜50日間養成後、交雑し、F1子実を得る（全生育日数 約95日）。次にF1子実を1998年7月に一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）に播種し、発芽したF1個体が成熟する1998年10月中旬まで養成し（平均気温24.9℃、平均最高気温30.4℃、平均最低気温20.3℃、総降水量301.5mm）、F2子実を得る。得られたF2子実は子葉部分（約10mg）を削り取り、β-コングリシニンおよびグリシニンの各サブユニットグループの有無をKitamura et al.の方法（1984）に準じSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判定する。これによって、β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失するF2子実を選抜する。さらに、β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失したF2子実を加温ガラス室内（広島県福山市 平均気温25℃に調整、自然日長）のポット（培養土と腐植土を2：1に混合して充填）に1998年12月に播種し、発芽したF2個体を養成後、F3子実を1999年3月に得る。各個体から得られるF3子実のうち、約30粒をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析し、全ての子実がβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するF3系統を選抜する。即ち、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットの欠失性を遺伝的に固定している系統(QF2F3-1、QF2F3-2、QF2F3-3)を選抜する。これら３つの系統のうち、２つの系統（QF2F3-1、QF2F3-2）子実を粉砕しその約500mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。なお、比較のため、β-コングリシニンならびにグリシニンを構成するサブユニットを全て有する栽培ダイズ（タチユタカ）、交雑親に用いたβ−コングリシニン欠失ダイズ（九系305）ならびにグリシニン欠失ダイズ（EnB1）をF2個体と同じ条件で栽培し、それらの子実を得る。これらの比較対照は、その子実を粉砕して、それぞれ約500mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。
まず、高遊離アミノ酸ダイズであるβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズの作出方法について検証する。β-コングリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失した九系305とグリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失したEnB1を1997年12月から1998年3月の期間、加温ガラス室内（熊本県西合志町 最低気温22℃、最高気温32℃に調整、播種後１ヶ月間は毎日、蛍光灯照明を午後4時〜午後９時、翌朝3時〜8時の２回行い、18時間日長とする。以後、自然日長とする。）のポット土耕栽培（黒ボク火山灰土壌）にて約40〜50日間養成後、交雑し、F1子実を得る（全生育日数 約95日）。次にF1子実を1998年7月に一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）に播種し、発芽したF1個体が成熟する1998年10月中旬まで養成し（平均気温24.9℃、平均最高気温30.4℃、平均最低気温20.3℃、総降水量301.5mm）、F2子実を得る。得られたF2子実は子葉部分（約10mg）を削り取り、β-コングリシニンおよびグリシニンの各サブユニットグループの有無をKitamura et al.の方法（1984）に準じSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判定する。これによって、β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失するF2子実を選抜する。さらに、β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失したF2子実を加温ガラス室内（広島県福山市 平均気温25℃に調整、自然日長）のポット（培養土と腐植土を2：1に混合して充填）に1998年12月に播種し、発芽したF2個体を養成後、F3子実を1999年3月に得る。各個体から得られるF3子実のうち、約30粒をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析し、全ての子実がβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するF3系統を選抜する。即ち、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットの欠失性を遺伝的に固定している系統(QF2F3-1、QF2F3-2、QF2F3-3)を選抜する。これら３つの系統のうち、２つの系統（QF2F3-1、QF2F3-2）子実を粉砕しその約500mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。なお、比較のため、β-コングリシニンならびにグリシニンを構成するサブユニットを全て有する栽培ダイズ（タチユタカ）、交雑親に用いたβ−コングリシニン欠失ダイズ（九系305）ならびにグリシニン欠失ダイズ（EnB1）をF2個体と同じ条件で栽培し、それらの子実を得る。これらの比較対照は、その子実を粉砕して、それぞれ約500mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。
遊離アミノ酸の定量のために、上記の精秤した粉砕子実に試料とする粉砕子実重量10mgあたり200μlの75%エタノールを、試験内で混ぜ合わせる。常温にて2分間振とう後、5,000gで5分間遠心分離し、その上清みを遊離アミノ酸抽出液として得る。さらに沈殿させた子実残渣に試料とする粉砕子実重量10mgあたり200μlの75%エタノールを加え、同様に再度、遊離アミノ酸抽出液を得る。この2回の抽出液を合わせた後、その20分の１容量をとり、15,000gで10分間遠心し残渣を取り除き、蒸留水で5倍に希釈する。希釈液は再度6,000gで50分間遠心し、得られた上清のうち1mlを用いてPico Tagアミノ酸分析装置により20種類のアミノ酸含量を測定し、その総和を総遊離アミノ酸含量として算出する。結果を表1に示す。
表１から明らかなようにβ-コングリシニン欠失ダイズ（九系305）ならびにグリシニン欠失ダイズ（EnB1）の総遊離アミノ酸含量は栽培ダイズ（タチユタカ）より高いが、その差は小さく、最も多いグリシニン欠失ダイズ（EnB1）が栽培ダイズ（タチユタカ）の1.16倍程度であった。
β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失したQF2F3-1、QF2F3-2の子実中総遊離アミノ酸含量はそれぞれ、25.5、22.6mg/g、であり、栽培ダイズ（タチユタカ）の5倍以上であった。上記の実施例により、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失する高遊離アミノ酸ダイズを作出する方法を検証できた。
実施例２
次に、実施例１において実施した九系305（β-コングリシニン欠失ダイズ）とEnB1（グリシニン欠失ダイズ）との交配組合せから作出可能な全ての系統、すなわち、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が異なる16種類系統を作出し、これらの系統のなかにβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの全てを遺伝的に欠失させて得られることのできる高遊離アミノ酸ダイズ（QF2）と同等のダイズが得られるかを検証した。即ち、実施例１で得られたF2集団からβ-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失するF2子実（QF2F2-1、QF2F2-2、QF2F2-3）を選抜した残りのF2子実集団を1999年12月に、加温ガラス室（熊本県西合志町 最低気温22℃、最高気温32℃に調整、播種後１ヶ月間は毎日、蛍光灯照明を午後4時〜午後９時、翌朝3時〜8時の２回行い、18時間日長とする。以後、自然日長とする。）にて養成し、2000年3月にそのF3子実を得た。得られたF3子実についてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、表２に示した16種類のβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が異なるダイズ、即ち、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットを全てを有するダイズF3子実、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットを部分的に遺伝的に欠失するダイズF3子実、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニット全てを遺伝的に欠失するダイズF3子実をそれぞれ約10から20粒を得る。得られた16種類のダイズF3子実は、2000年7月から10月の期間（平均気温24.3℃、平均最高気温29.3℃、平均最低気温19.7℃、降水量453.0mm）、野外の一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）において栽培する。各F3個体から得られるF4子実約15粒についてβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が親のF3個体と同じで、且つ固定しているF4子実のみを生産したF3個体を選抜することによって、表２に示すようなβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が異なる16種類のF4系統を得た。それら16種類のF4系統の子実は粉砕され、それぞれ約500mgを精秤して、実施例１で示した同様の方法により遊離アミノ酸含量を分析し、その総量を算出する。その結果を表２に示す。
次に、実施例１において実施した九系305（β-コングリシニン欠失ダイズ）とEnB1（グリシニン欠失ダイズ）との交配組合せから作出可能な全ての系統、すなわち、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が異なる16種類系統を作出し、これらの系統のなかにβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの全てを遺伝的に欠失させて得られることのできる高遊離アミノ酸ダイズ（QF2）と同等のダイズが得られるかを検証した。即ち、実施例１で得られたF2集団からβ-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失するF2子実（QF2F2-1、QF2F2-2、QF2F2-3）を選抜した残りのF2子実集団を1999年12月に、加温ガラス室（熊本県西合志町 最低気温22℃、最高気温32℃に調整、播種後１ヶ月間は毎日、蛍光灯照明を午後4時〜午後９時、翌朝3時〜8時の２回行い、18時間日長とする。以後、自然日長とする。）にて養成し、2000年3月にそのF3子実を得た。得られたF3子実についてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、表２に示した16種類のβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が異なるダイズ、即ち、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットを全てを有するダイズF3子実、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットを部分的に遺伝的に欠失するダイズF3子実、β-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニット全てを遺伝的に欠失するダイズF3子実をそれぞれ約10から20粒を得る。得られた16種類のダイズF3子実は、2000年7月から10月の期間（平均気温24.3℃、平均最高気温29.3℃、平均最低気温19.7℃、降水量453.0mm）、野外の一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）において栽培する。各F3個体から得られるF4子実約15粒についてβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が親のF3個体と同じで、且つ固定しているF4子実のみを生産したF3個体を選抜することによって、表２に示すようなβ-コングリシニンならびにグリシニンのサブユニットの組成が異なる16種類のF4系統を得た。それら16種類のF4系統の子実は粉砕され、それぞれ約500mgを精秤して、実施例１で示した同様の方法により遊離アミノ酸含量を分析し、その総量を算出する。その結果を表２に示す。
表２からわかるように、β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを有するF4系統（No.1）の子実中の総遊離アミノ酸含量は、低レベルであった。また、ダイズ子実中のβ-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットいずれかを遺伝的に欠失させることがダイズ子実中の遊離アミノ酸含量を一定量増加させる効果のあることがわかる。さらに、β-コングリシニンのサブユニットの遺伝的欠失に加えグリシニンのいずれかのサブユニットを遺伝的に欠失させることがより効果的であり、特にβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失したF4系統（No.16）だけでなく、β-コングリシニンのサブユニットの遺伝的欠失に加えグリシニンのグループI（A1aB2、A2B1a、A1bB1b）ならびにIIa（A5A4B3）を遺伝的に欠失するF4系統（No.12）が高遊離アミノ酸ダイズの特徴を有することが明らかとなった。遊離アミノ酸のうち、特に増加が顕著であった遊離アミノ酸はアルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンであった。
上記の実施例により、実施例１で検証したβ-コングリシニンならびにグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失したダイズが高遊離アミノ酸ダイズであることが再度検証され、さらに、β-コングリシニンのサブユニットの全てを遺伝的に欠失させ、グリシニンのサブユニットのうちグループI（A1aB2、A2B1a、A1bB1b）ならびにIIa（A5A4B3）を遺伝的に欠失するダイズ、すなわちグリシニンのサブユニットIIb（A3B4）のみを有するダイズが高遊離アミノ酸ダイズであることが新たに判明した。
実施例３
次に高遊離アミノ酸ダイズが遺伝的に安定して高い遊離アミノ酸を子実に含有することを証明するために、以下の実験を行った。即ち、実施例１で得られたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失した３つのQF2F3系統（QF2F3-1、QF2F3-2、QF2F3-3）を、β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットを全て有する栽培ダイズ（フクユタカ、タチユタカ）、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを遺伝的に欠失する栽培ダイズ（エンレイ）、交雑親に用いたβ-コングリシニン欠失ダイズ（九系305）ならびにグリシニン欠失ダイズ（EnB1）とともに野外の一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）に1999年から2001年までの3年間栽培し（1999年：平均気温23.8℃、平均最高気温28.7℃、平均最低気温19.5℃、降水量811.5mm、2000年：平均気温24.3℃、平均最高気温29.3℃、平均最低気温19.7℃、降水量453.0mm、2001年：平均気温24.1℃、平均最高気温29.2℃、平均最低気温19.4℃、降水量682.5mm）、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットの欠失系統の世代を進めることによって農業特性の遺伝的固定を図った。これによって、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失したF6系統（QF2F6-1、QF2F6-2、QF2F6-3）の子実ならびに比較対照の品種・系統（フクユタカ、タチユタカ、エンレイ、九系305、En-B1）の子実を得る。
次に高遊離アミノ酸ダイズが遺伝的に安定して高い遊離アミノ酸を子実に含有することを証明するために、以下の実験を行った。即ち、実施例１で得られたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失した３つのQF2F3系統（QF2F3-1、QF2F3-2、QF2F3-3）を、β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットを全て有する栽培ダイズ（フクユタカ、タチユタカ）、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを遺伝的に欠失する栽培ダイズ（エンレイ）、交雑親に用いたβ-コングリシニン欠失ダイズ（九系305）ならびにグリシニン欠失ダイズ（EnB1）とともに野外の一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）に1999年から2001年までの3年間栽培し（1999年：平均気温23.8℃、平均最高気温28.7℃、平均最低気温19.5℃、降水量811.5mm、2000年：平均気温24.3℃、平均最高気温29.3℃、平均最低気温19.7℃、降水量453.0mm、2001年：平均気温24.1℃、平均最高気温29.2℃、平均最低気温19.4℃、降水量682.5mm）、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットの欠失系統の世代を進めることによって農業特性の遺伝的固定を図った。これによって、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失したF6系統（QF2F6-1、QF2F6-2、QF2F6-3）の子実ならびに比較対照の品種・系統（フクユタカ、タチユタカ、エンレイ、九系305、En-B1）の子実を得る。
それぞれのダイズの粉砕子実を用いた以外は上記実施例１と同様にして得られる遊離アミノ酸抽出液のアミノ酸含量を測定し、総遊離アミノ酸含量を算出する。結果を表３に示す。
表３から明らかなように栽培ダイズ（フクユタカ、タチユタカ、エンレイ）の総遊離アミノ酸含量は1.38〜2.44mg/gの範囲内でさまざまであるが、最も総遊離アミノ酸含量が高いエンレイ（グリシニンサブユニットA5A4B3を欠失）では、特にアスパラギン、ヒスチジンの含量が高い。これに対して、交雑親である九系305とEnB1ではそれぞれ1.53、2.17mg/gと総含量では栽培ダイズと大差がないが、EnB1のアルギニン含量は栽培ダイズより高い。
一般圃場で栽培したダイズQF2F6-1、QF2F6-2、QF2F6-3の総遊離アミノ酸含量は8.02〜10.78mg/gで、ガラス室内で栽培して得られたQF2F3子実（表１）の半分以下となったが、同じ条件で栽培された栽培ダイズ（フクユタカ、タチユタカ、エンレイ）、交雑親（九系305、EnB1）より明らかに高い。特に増加が顕著であった遊離アミノ酸はアルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンであり、実施例２で検証した高遊離アミノ酸ダイズにおいて認められたアミノ酸の増加と一致している。
以上要するに、β-コングリシニンならびにグリシニンの主要サブユニットを欠失させたF3子実（実施例１参照）、F6子実（実施例３）ともに栽培ダイズの少なくとも２倍または約３〜５倍以上の遊離アミノ酸を含有しており、高遊離アミノ酸という特性が遺伝的に安定して維持されることが明らかとなり、β-コングリシニン欠失性とグリシニンの各サブユニットの欠失性を全て組み合わせる手法が、高遊離アミノ酸含量のダイズを作出することに有効な手法であることが検証できる。
実施例４
次に、本発明の高遊離アミノ酸ダイズが異なる分析方法においても、高濃度に遊離アミノ酸を子実に含有することを検証した。β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失したQF2F6-4の子実を加温ガラス室内（広島県福山市 平均気温25℃に調整、自然日長）のポット（培養土と腐植土を2：1に混合して充填）に2002年12月に播種し、子実を2003年3月に得る。この子実を粉砕しその約250mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。なお、比較のため、β-コングリシニンならびにグリシニンを構成するサブユニットを全て有する栽培ダイズ（Jack）をQF2F6-4と同じ条件で栽培し子実を得る。この比較子実も粉砕し、約250mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。
次に、本発明の高遊離アミノ酸ダイズが異なる分析方法においても、高濃度に遊離アミノ酸を子実に含有することを検証した。β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失したQF2F6-4の子実を加温ガラス室内（広島県福山市 平均気温25℃に調整、自然日長）のポット（培養土と腐植土を2：1に混合して充填）に2002年12月に播種し、子実を2003年3月に得る。この子実を粉砕しその約250mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。なお、比較のため、β-コングリシニンならびにグリシニンを構成するサブユニットを全て有する栽培ダイズ（Jack）をQF2F6-4と同じ条件で栽培し子実を得る。この比較子実も粉砕し、約250mgを精秤して、遊離アミノ酸の定量に用いる。
遊離アミノ酸の定量のために、上記の精秤した粉砕子実250mgに8%TCA（トリクロロ酢酸）を含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH5.6)を2ml加え、常温にて1時間攪拌後、10,000gで10分間遠心分離し、上清を得る。上清は0.45mmのフィルターで濾過し、そのうち10mlを日立L-8500型高速アミノ酸分析計で分析を行い、その総和を総遊離アミノ酸含量として算出する。結果を表４に示す。
表４のβ-コングリシニンならびにグリシニンを構成するサブユニットを全て有する栽培ダイズ（Jack）の子実中の総遊離アミノ酸含量は2.03mg/gであり、分析方法が異なる表３の栽培ダイズ（フクユタカ、タチユタカ、エンレイ）や交雑親（九系305、EnB1）と同程度であるが、β-コングリシニンおよびグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失したQF2F6-4の子実中総遊離アミノ酸含量は35.3mg/gであり、表３のQF2F6-1、QF2F6-2、QF2F6-3の総遊離アミノ酸含量の３倍以上含有していた。また、QF2F6-4と同一条件下で栽培された栽培ダイズ（Jack）と比較すると17倍以上であった。また、増加が顕著であった遊離アミノ酸はアルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンであり、実施例２、３で検証した高遊離アミノ酸ダイズ認められたアミノ酸の増加と一致している。特にアルギニンは栽培ダイズ（Jack）の58倍以上含まれていた。
以上を要約するに、2種の異なるアミノ酸の測定法（実施例３および４）においても栽培ダイズの総遊離アミノ酸含量はほぼ同等であるが、β-コングリシニンならびにグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失したダイズの子実には遊離アミノ酸が栽培ダイズの約３〜17倍含有されており、異なるアミノ酸分析法でも高遊離アミノ酸という特性が維持されることが明らかとなり、β-コングリシニン欠失性とグリシニンの各サブユニットの欠失性を全て組み合わせる手法が、高遊離アミノ酸含量のダイズを作出することに有効な手法であることが検証できる。
実施例５
高遊離アミノ酸ダイズを作出するためにはβ-コングリシニンのサブユニットの全てを遺伝的に欠失させることが重要であることをβ-コングリシニンのサブユニットのうち、α、α’サブユニットを遺伝的に欠失しさらにβ-サブユニットを低減することで、β-コングリシニンのほとんどを遺伝的に欠失する栽培ダイズ（以後、β-コングリシニン不完全欠失ダイズと呼ぶ）を九系305（β-コングリシニンサブユニット完全欠失ダイズ）の代わりに交雑親として使用して検証する。即ち、β-コングリシニン不完全欠失ダイズであるゆめみのりをグリシンの全サブユニットを遺伝的に欠失するEnB1と交雑し、その後代をからβ-コングリシニン不完全欠失・グリシニン欠失ダイズ（以後、TF2と呼ぶ）を得、その遊離アミノ酸含量を実施例１と同様に測定する。
高遊離アミノ酸ダイズを作出するためにはβ-コングリシニンのサブユニットの全てを遺伝的に欠失させることが重要であることをβ-コングリシニンのサブユニットのうち、α、α’サブユニットを遺伝的に欠失しさらにβ-サブユニットを低減することで、β-コングリシニンのほとんどを遺伝的に欠失する栽培ダイズ（以後、β-コングリシニン不完全欠失ダイズと呼ぶ）を九系305（β-コングリシニンサブユニット完全欠失ダイズ）の代わりに交雑親として使用して検証する。即ち、β-コングリシニン不完全欠失ダイズであるゆめみのりをグリシンの全サブユニットを遺伝的に欠失するEnB1と交雑し、その後代をからβ-コングリシニン不完全欠失・グリシニン欠失ダイズ（以後、TF2と呼ぶ）を得、その遊離アミノ酸含量を実施例１と同様に測定する。
本実施例は実施例１および３で示した実施例と同時に同条件で実施する。即ち、β-コングリシニン不完全欠失ダイズ（ゆめみのり）とグリシニン欠失ダイズ（EnB1）を1997年12月から1998年3月の期間、加温ガラス室内のポット栽培にて養成後、交雑し、F1子実を得る。次にF1子実を1998年7月に一般圃場に播種し、発芽したF1個体が成熟する1998年10月上旬まで養成しF2子実を得る。得られたF2子実は子葉部分（約10mg）を削り取り、β-コングリシニンおよびグリシニンの各サブユニットグループの有無をKitamura et al.の方法（1984）に準じSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判定する。これによってグリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失し、かつβ-コングリシニンのサブユニットのうちα、α’サブユニットを遺伝的に欠失しβ-サブユニットを低減したTF2を選抜する。さらに、このF2子実を加温ガラス室内のポットに1998年12月に播種し、発芽したF2個体を養成後、F3子実を1999年3月に得る。これらのF3子実について、得られた約10粒を用いてβ-コングリシニンおよびグリシニンの各サブユニットの有無をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により再度判定する。これによって、グリシニンの全てのサブユニットを遺伝的に欠失し、かつβ-コングリシニンのサブユニットのうちα、α’サブユニットを遺伝的に欠失しβ-サブユニットを低減したβ-コングリシニン不完全欠失・グリシニン欠失系統を選抜する。この選抜したβ-コングリシニン不完全欠失・グリシニン欠失系統は、β-コングリシニン不完全欠失品種ゆめみのりとともに、上記実施例２で示したと同じ条件で1999年から2001年の3年間一般圃場で栽培し、それらの子実を得る。
上記選抜したTF2F6-1系統ならびにβ-コングリシニン不完全欠失品種ゆめみのりから得た粉砕子実を用いて、上記実施例１と同様の方法により総遊離アミノ酸含量を算出する。結果を表５に示す。
表５から明らかなように、β-コングリシニン不完全欠失品種ゆめみのりの総遊離アミノ酸含量は2.07mg/gで、同じ条件で栽培した栽培ダイズ（表３）と大差ないが、グルタミン酸、アルギニン含量がやや高い。
また、TF2F6-1系統の総遊離アミノ酸含量は、同じ条件で栽培した栽培ダイズ（表３）に比べやや高いが、実施例３で得た３つの系統（QF2F6-1、QF2QF6-2、QF2F6-3）に比べると（表３参照）、その増加量は明らかに少ない。
上記の実施例により、グリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失させ、さらにβ-コングリシニンのほとんどを遺伝的に欠失させるが、β-コングリシニンサブユニットの一部を含有すれば、高遊離アミノ酸含量ダイズとはならないことが検証できる。
実施例６
次に上述の実施例１、２、３で示したβ-コングリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失した九系305とグリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失したEnB1との交配組合せ以外においても、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズを作出できることを検証する。すなわち、上述、実施例３で得られたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズQF2F3-1と、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有する栽培ダイズであるフクユタカとを交雑することによっても、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズを作出できることを実証する。
次に上述の実施例１、２、３で示したβ-コングリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失した九系305とグリシニンの各サブユニットを遺伝的に欠失したEnB1との交配組合せ以外においても、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズを作出できることを検証する。すなわち、上述、実施例３で得られたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズQF2F3-1と、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有する栽培ダイズであるフクユタカとを交雑することによっても、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズを作出できることを実証する。
QF2F3-1の子実ならびにフクユタカの子実を2001年2月に加温ガラス室（熊本県西合志町 最低気温22℃、最高気温32℃に調整、播種後１ヶ月間は毎日、蛍光灯照明を午後4時〜午後９時、翌朝3時〜8時の２回行い、18時間日長とする。以後、自然日長とする。）内のポット（黒ボク火山灰土壌を充填）に、播種し、約40〜45日間養成後交雑し、2001年5月にそのF1子実を15粒得る。得られたF1子実15粒は2001年7月に一般圃場（熊本県西合志町 黒ボク火山灰土壌）に播種し、2001年10月にF2子実を得る（平均気温24.1℃、平均最高気温29.2℃、平均最低気温19.4℃、降水量682.5mm）。これらF2子実中のうち、405粒のβ-コングリシニンならびにグリシニンの各サブユニットの有無について、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて測定したところ、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するF2子実を4粒選抜することができた。このことより、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズと、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有するダイズとを交雑することによっても、β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失するダイズを作出できることがわかった。
実施例７
さらに、本発明の高遊離アミノ酸ダイズが野外の一般圃場においても正常に生育し、正常な子実を生産でき、事実上支障のないこと検証する。先述の実施例で2001年に野外の一般圃場に栽培した３系統（QF2F5-1、QF2F5-2、QF2F5-3）、および栽培ダイズ（フクユタカ、エンレイ、タチユタカ）、および上記系統の交配親であるβ-コングリシニン欠失ダイズ（九系305）、グリシニン欠失ダイズ（EnB1）について調べる。
さらに、本発明の高遊離アミノ酸ダイズが野外の一般圃場においても正常に生育し、正常な子実を生産でき、事実上支障のないこと検証する。先述の実施例で2001年に野外の一般圃場に栽培した３系統（QF2F5-1、QF2F5-2、QF2F5-3）、および栽培ダイズ（フクユタカ、エンレイ、タチユタカ）、および上記系統の交配親であるβ-コングリシニン欠失ダイズ（九系305）、グリシニン欠失ダイズ（EnB1）について調べる。
上記のそれぞれの系統を、野外の一般圃場で栽培した個体のうち、半数以上が開花始めとなった日を開花期とし、さらに80%以上が成熟に達した日を成熟期として判定する。成熟期には20株を抜き取り、主茎長、主茎節数、分枝数、百粒重、子実重について種苗特性分類調査報告書（日本特産農作物種苗協会 1995年3月）の記載にしたがって測定する。その結果を表６に示す。
表６から明らかなようにQF2F5-1の開花期ならびに成熟期はEnB1とほぼ同じで、一方の交雑親である九系305よりかなり早い。これに対して、QF2F5-2、QF2F5-3の開花期ならびに成熟期はやや遅く、EnB1と九系305の中間的な期日となった。栄養生長に関する特性のうち主茎長については、いずれの高遊離アミノ酸系統とも交雑親に比べ低いが、主茎節数についてはQF2F5-3がEnB1よりやや多く、分枝数ついてはいずれの高遊離アミノ酸系統とも九系305より少ないものの、EnB1とほぼ同じがやや多かった。栽培ダイズとの比較では、主茎長を除き、開花期、成熟期が近かったエンレイ、タチユタカに大きく劣るものではない。
子実の大きさを表す百粒重は、QF2F5-1、QF2F5-2、QF2F5-3とも九系305に比べ小さいが、EnB1に比べるとQF2F5-2、QF2F5-3はやや大きい。子実重についても、QF2F5-1、QF2F5-2、QF2F5-3とも九系305に比べると明らかに少ないが、EnB1とは大きな差はなかった。栽培ダイズとの比較では、開花期、成熟期が近かったエンレイとタチユタカの中間的な値をとった。さらに、子実重が最も高かったQF2F5-3から得られるQF2F6-3子実の総遊離アミノ酸含量は３つの系統の中で、最も高かった（表３参照）。
以上より、QF2F5-1、QF2F5-2、QF2F5-3の３つの系統とも、その一般農業特性は、開花期、成熟期が近かった栽培ダイズに比べ大きく劣るものではなく、農業的利用性には差し支えないダイズ系統であるといえる。
実施例８
以下、実施例により本発明のダイズを原料に用いることによって総遊離アミノ酸、またはある種の遊離アミノ酸含量の高いダイズ加工食品が得られることを例示する。しかしながら、本発明の範囲はかかる実施例に制限されるものではない。
以下、実施例により本発明のダイズを原料に用いることによって総遊離アミノ酸、またはある種の遊離アミノ酸含量の高いダイズ加工食品が得られることを例示する。しかしながら、本発明の範囲はかかる実施例に制限されるものではない。
豆乳の作成方法を以下に説明する。高遊離アミノ酸含有ダイズQF2（β−コンググリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを欠失するダイズ）と栽培ダイズ（フクユタカ）の２種類のダイズ各５０ｇ（乾物重あたり）を蒸留水２００ｍｌ中に２５℃で１６時間浸漬し、浸漬したダイズに蒸留水を加え合わせて合計３５０ｇし、磨砕（６，０００ｒｐｍ、１分）してこれを得、更に加熱（１００℃、５分）した後、遠心分離器を用いて濾過（３、０００ｒｐｍ、９０秒）し、おからを除き豆乳を得、氷水を用いて豆乳を常温にまで冷却した。
このようにして得られた豆乳をアミノ酸分析計（日立製作所 Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ−８８００形高速アミノ酸分析計）を用いて遊離アミノ酸含量を測定した。各試料２００μｌ程度に８％TCA（トリクロロ酢酸）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐH５．６）を１、６００μｌ加え、１時間攪拌後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分）し上清を得る。上清を０．４５mmのフィルターで濾過したものを遊離アミノ酸分析の試料として用いた。分析結果は豆乳１ｇ中のアミノ酸含量（ｍｇ）で表した。その結果を表７に示す。高遊離アミノ酸含有ダイズを原料に用いた豆乳では総遊離アミノ酸含量が栽培ダイズに比べ５倍以上含まれていた。その中で、アルギニンが栽培ダイズに比べ１８倍以上多く含まれているほか、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、ヒスチジンで栽培ダイズを原料とした豆乳に比べ多く含まれていた。
引用文献
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Claims (16)
- 子実中の総遊離アミノ酸含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカおよびタチユタカ、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、ならびにグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中の該含量に比べて高いダイズ。
- 子実中の総遊離アミノ酸含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカおよびタチユタカ、グリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、ならびにグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中の該含量に比べて少なくとも2倍以上高いことを特徴とする、請求項１記載のダイズ。
- 子実中の総遊離アミノ酸含量が、子実乾物重1g当たり8mg以上であることを特徴とする、請求項１記載のダイズ。
- 子実中に含まれる各遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、およびグルタミンからなる群より選択される少なくとも1種の遊離アミノ酸の含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、およびグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中に含まれるその含量に比べて高いことを特徴とする、請求項１記載のダイズ。
- 子実中に含まれる各遊離アミノ酸のうち、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジンおよびグルタミンの全ての遊離アミノ酸の含量が、同様の条件下で栽培されたβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを有しているフクユタカ、タチユタカおよびグリシニンサブユニットA5A4B3のみを欠失するエンレイ、β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305、およびグリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1のいずれの子実中のそれぞれの含量に比べて高いことを特徴とする、請求項４記載のダイズ。
- β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうち、少なくともβ-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットを遺伝的に欠失する、請求項１記載のダイズ。
- β-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを遺伝的に欠失している、請求項６記載のダイズ。
- β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1bおよびA5A4B3サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニット全てを欠失しているダイズとを交雑させるか、または上記サブユニット全てを欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含み、ここで交雑する両ダイズの少なくとも一方はグリニシンのA3B4サブユニットを有するものとする、請求項６記載のダイズを作出する方法。
- β-コングリシニンのα、α’およびβサブユニット、ならびにグリシニンのA1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3およびA3B4サブユニットからなる群より選択される1つ以上のサブユニットを欠失するダイズと、上記サブユニットのうち該ダイズが有するサブユニットを全て欠失しているダイズとを交雑させるか、または上記サブユニットを全て欠失するダイズとこれらの全てあるいは一部を有するダイズとを交雑させるかのいずれかの交雑ステップを含む、請求項７記載のダイズを作出する方法。
- β-コングリシニンの全サブユニットを欠失する九系305と、グリシニンの全サブユニットを欠失するEnB1とを交雑するステップを含む、請求項８または９記載の方法。
- 交雑ステップの後、β-コングリシニンおよびグリシニンのサブユニットのうちグリシニンサブユニットA3B4のみを有する系統、またはβ-コングリシニンおよびグリシニンの全サブユニットを欠失した系統を選抜するステップをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料として用いて製造される、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された場合に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、遊離アミノ酸含有ダイズ食品材料。
- 請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて製造される、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された場合に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、機能性食品。
- 請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて製造される豆乳であって、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された豆乳に比べて、総遊離アミノ酸含量が増加していることを特徴とする、豆乳。
- 請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて、総遊離アミノ酸含量が増加している機能性食品を製造する方法。
- 請求項１〜７のいずれか1項に記載のダイズの子実を原料の１つとして用いて、従来のダイズの子実を原料とする同様の方法で製造された豆乳に比べて総遊離アミノ酸含量が増加している豆乳を製造する方法。
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