JP2005102657A

JP2005102657A - 細胞培養容器

Info

Publication number: JP2005102657A
Application number: JP2003344093A
Authority: JP
Inventors: Muneo Takaoki; 宗夫高沖; Junichiro Gyotoku; 淳一郎行徳; Mutsumi Nagase; 睦永瀬; Noboru Ando; 登安藤
Original assignee: CHIYODA ADVANCED SOLUTIONS KK; Japan Aerospace Exploration Agency JAXA
Current assignee: CHIYODA ADVANCED SOLUTIONS KK; Japan Aerospace Exploration Agency JAXA
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2003-10-02
Publication date: 2005-04-21
Anticipated expiration: 2023-10-02
Also published as: JP4378514B2

Abstract

【課題】周囲の相対湿度に関わりなく、培養過程で培養液中に気泡が発生するのを防止できる細胞培養容器を提供する。
【解決手段】培養液が充填されて細胞培養が行われる培養空間１２と、水または水溶液が充填される水溶液充填空間２２とがそれぞれ形成されて、両空間１２、２２がガス透過性を有する第１膜材３１によって隔てられている。また、水溶液充填空間２２と外部空間との境界面の少なくとも一部がガス透過性を有する第２膜材３２によって構成されている。
【選択図】図１

Description

本発明は、微小重力下において動物細胞等の細胞を培養試験する際に用いて好適な細胞培養容器に関するものである。

宇宙空間のような微小重力下で動物細胞の培養試験を行なう場合には、何等かの方法によって上記動物細胞に酸素を供給する必要がある。ところが、周知のように、上記微小重力下においては、気液が実質的に二層分離することが無いために、地上におけるような気液が二層分離した状態での静置観測による試験を行なうことができない。そこで、一般に微小重力下において動物細胞の培養試験を行なうに際しては、培養容器内に満液状態に培養液を充填するとともに、外部から連続的にあるいは間欠的に、所定の酸素を含有する新たな培養液を循環供給する方法が採用されている。

しかしながら、上記培養容器において、培養液中の酸素濃度を一定範囲に保持するためには、比較的頻繁に培養液を交換する必要があり、そのためには培養液循環ポンプや酸素供給用の設備を外部に別途設置する必要があることから、特に極力狭い空間での試験の実施が要請される宇宙空間にあっては、実施上の制約が大きくなるという問題点があった。

そこで、本発明者等は、先に、上記問題点を解消するために、図３に示すように、両面間に貫通して培養液が充填される空間部１Ａが形成された板状の本体１と、この本体１の一方の面に配設されて上記空間部１Ａを塞ぐとともに上記空間部１Ａ側の表面が細胞付着性を有する培養板２と、上記本体１の他方の面に配設されて上記空間部１Ａを覆う透明かつ酸素透過性を有する膜材３とが液密的に着脱自在に一体化されてなる細胞培養容器を開発するとともに、これを特許文献１において開示している。

上記構成からなる細胞培養容器によれば、膜材３を通じて空間部１Ａ内に常時一様の酸素が供給されるために、酸素供給用の設備が不要となり、付帯設備の簡易化を図ることができる。
特開２００２−１５３２６１号公報

しかしながら、上記従来の細胞培養容器においては、周囲の相対湿度が低い場合に、培養液中に気泡が発生するという現象が起こり、その気泡が細胞の観察を妨げるだけでなく、気泡周囲の培養環境の均一性を損ない、細胞培養の障害になるという問題点があった。そのため、上記従来の細胞培養容器においては、高相対湿度の環境のみでしか使用することができず、低相対湿度の環境下で使用する際には、保湿用の設備が別途必要になるという問題点があった。
また、培養容器に対して加速度が加わった場合あるいは意図的に加速度を負荷しようとする場合に、気泡と培養液の密度差によって培養液が不規則に流動し、培養条件の均一性が損なわれるという問題点もあった。

本発明は、かかる事情に鑑みてなされたもので、ガス透過性の膜材を利用して培養液に酸素供給を行う場合においても、周囲の相対湿度に関わりなく、培養過程で培養液中に気泡が発生するのを防止することができ、これによって、付帯設備の簡易化を図ることができる細胞培養容器を提供することを目的とする。

本発明者等は、培養液中に気泡が発生するメカニズムについて鋭意研究を重ねた結果、次のような知見を得るに至った。すなわち、空気中の水蒸気が飽和状態でないときには、空気中の水蒸気の分圧が気泡中の水蒸気の分圧よりも低くなる分、その他のガス成分（酸素、窒素など）の分圧が気泡中よりも空気中の方が高くなるために、上記その他のガス成分が膜材を通じて気泡に輸送されて、気泡が徐々に大きくなるという現象が発生する。例えば３７℃における飽和水蒸気圧はＴｅｔｅｎｓ（１９３０）の式から求められ６．２７６ｋＰａとなる。つまり相対湿度１００％と５０％での圧力差０．０３気圧が輸送の原動力となる。これに対して、空気中の水蒸気が飽和状態にあるときには、各ガス成分の分圧が空気中と気泡中とでほぼ等しくなるために、上述したような気泡へのガスの輸送が発生せず、よって気泡が成長するという現象も起こらないと考えられる。

本発明者等は、このような気泡発生メカニズムに着目して、更なる研究を進めた結果、上記膜材の外面側に水溶液の層を形成して、培養液のガス交換を水溶液中の溶存ガスとの間で行うようにすれば、培養液中に気泡が発生するのを効果的に防止できることを見出し、本発明を完成させたものである。

すなわち、請求項１に記載の本発明に係る細胞培養容器は、培養液が充填されて細胞培養が行われる培養空間と、水または水溶液が充填される水溶液充填空間とがそれぞれ形成されて、両空間がガス透過性を有する第１膜材によって隔てられるとともに、上記水溶液充填空間と外部空間との境界面の少なくとも一部がガス透過性を有する第２膜材によって構成されていることを特徴とするものである。なお、上記水には純水も含まれる。

請求項１に記載の発明によれば、第２膜材を介して外部の空気と水溶液中の溶存ガスとの間でガス交換が行われ、その際に、空気中の水蒸気分圧が低いと、その分他のガス分圧が上がって飽和を超えることとなり、水溶液中に気泡が発生することとなるが、培養液のガス交換が第１膜材を介して水溶液中の溶存ガスとの間で行われ、この水溶液中のガス分圧が平衡となるために、培養液においては気泡が発生しなくなる。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の細胞培養容器において、両面間に貫通する上記培養空間が形成された第１板状部材と、両面間に貫通する上記水溶液充填空間が形成された第２板状部材とを有し、これら第１および第２板状部材の対向面間に、上記培養空間と上記水溶液充填空間とを隔てる上記第１膜材が介装され、上記第１板状部材の外面側に、上記培養空間を塞ぐとともに内面が細胞付着性を有する培養板が配設され、かつ上記第２板状部材の外面側に、上記水溶液充填空間を覆う上記第２膜材が配設されていることを特徴とするものである。

請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の細胞培養容器において、上記水溶液として、上記培養液またはそのベースとなる基礎培養液を用いたことを特徴とするものである。

本発明によれば、ガス透過性の膜材を利用して培養液に酸素供給を行う場合においても、周囲の相対湿度に関わりなく、培養過程で培養液中に気泡が発生するのを防止することができる。したがって、気泡の発生を防止するための保湿用の設備を別途設ける必要がなくなり、付帯設備の簡易化を図ることができる。また、培養液に気泡が発生しなくなることから、培養環境の均一性や観察性の向上を図ることができ、気泡発生に起因する種々の問題点を解消することができる。

図１および図２は、本発明に係る細胞培養容器の一実施形態を示すもので、図中符号１０が、フッ素樹脂やポリカーボネート、アセタール等の所定の強度と耐食性を有する合成樹脂によって矩形板状に形成された第１板状部材である。この第１板状部材１０の中央部には、両面間に貫通する孔部１１が形成されており、この孔部１１に、培養液を充填して細胞培養を行うための培養空間１２が形成されるようになっている。ここで、孔部１１は、その稜線が、長手方向の中央部において互いに平行になるとともに、両端部においてＶ字状に傾斜する６角形状に形成されている。また、第１板状部材１０には、一端が培養空間１２の長手方向一端に開口し、他端が第１板状部材１０の側面に開口する培養液供給孔（図示省略）と、一端が培養空間１２の長手方向他端に開口し、第１板状部材１０の側部に沿って延びて同様に第１板状部材１０の側面に開口する培養液排出孔（図示省略）とが穿設されている。

この第１板状部材１０の一方の面側（外面側）には、表面が細胞付着性を有するポリスチレン等の素材によって矩形状に形成された培養板３０が設けられ、他方の面側（内面側）には、例えばフッ素樹脂、シリコーン、ポリメチルペンテン等からなる透明でかつガス透過性を有する薄肉素材によって矩形状に形成された第１膜材３１が設けられている。これら培養板３０および第１膜材３１は、第１板状部材１０の外面全体および内面全体を覆うように、何れも外形が第１板状部材１０とほぼ同寸法に設定されている。すなわち、第１板状部材１０の孔部１１の両開口が培養板３０と第１膜材３１とによって塞がれることにより、密閉状態の培養空間１２が形成されるようになっている。なお、本実施形態では、第１板状部材１０の厚さ寸法が約３ｍｍ、培養板３０の厚さ寸法が約１．５ｍｍ、各膜材３１、３２の厚さ寸法が約０．１ｍｍ、後述する第２板状部材２０の厚さ寸法が約２ｍｍにそれぞれ設定されている。

第２板状部材２０は、第１板状部材１０と同質の素材により同平面形状に形成された板状部材であって、第１板状部材１０との間に第１膜材３１を狭持するようになっている。この第２板状部材２０の中央部には、第１板状部材１０と同様に、両面間に貫通する孔部２１が形成されており、この孔部２１に、水または水溶液が充填される水溶液充填空間２２が形成されるようになっている。この水溶液充填空間２２に充填される水溶液としては、種々の水溶液を使用することが可能であるが、水溶液充填空間２２と培養空間１２との浸透圧の差をなくして培養空間１２内の培養液の希釈を抑制するためには、培養空間１２と同じ培養液や、そのベースとなる基礎培養液などを水溶液として用いることが好ましい。

また、第２板状部材２０の外面側には、透明でガス透過性を有する第１膜材３１と同様の薄肉素材によって矩形状に形成された第２膜材３２が設けられている。この第２膜材３２は、第２板状部材２０の外面全体を覆うように、外形が第２板状部材２０とほぼ同寸法に設定されている。すなわち、第２板状部材２０の孔部２１の両開口が第１膜材３１および第２膜材３２によって塞がれることにより、密閉状態の水溶液充填空間２２が形成されるようになっている。

このように本実施形態では、培養板３０、第１板状部材１０、第１膜材３１、第２板状部材２０および第２膜材３２を順番に積層した状態でそれぞれを一体化することにより、培養空間１２および水溶液充填空間２２を有する細胞培養容器が構成されている。

上記構成からなる細胞培養容器においては、培養板３０に細胞を付着させて、培養空間１２に培養液を、水溶液充填空間２２に水溶液をそれぞれ充填した状態で、細胞培養が行われる。培養に伴い細胞は呼吸するが、その際に酸素を消費し、炭酸ガスを発生する。その結果、培養液中の溶存酸素は減少して、水溶液中の溶存酸素との間で濃度差が生じることにより、水溶液から溶存酸素が第１膜材３１を通じて培養液中に移動する受動輸送が発生する。同様に、水溶液中の溶存酸素濃度が減少すると、空気中の酸素分圧との平衡が崩れて、酸素が水溶液中に移動する受動輸送が発生する。一方、炭酸ガスについても、培養液中の溶存濃度が増大することにより、培養液中の溶存ガスが水溶液に移動して当該水溶液中の溶存ガスが空気中に放出される受動輸送が発生する。このように各ガス成分について受動輸送が発生することにより、培養液中の各ガス成分の濃度がほぼ一定に保持されることとなる。

また、空気中の水蒸気が飽和状態でないときには、その分他のガス成分（酸素、窒素など）の分圧が高くなる。このとき、水溶液中に発生した気泡中の上記他のガス成分の分圧は、同じ大気圧の場合、水蒸気の分圧が高い分低くなっている。そのため水溶液中の気泡に上記他のガスが輸送されて大きくなる。しかし水溶液中のガス分圧は平衡となるため、培養液に気泡が発生することがない。

以上のように、本実施形態の細胞培養容器によれば、培養液を覆う第１膜材３１の外面側に水溶液の層が形成されて、培養液のガス交換が水溶液中の溶存ガスとの間で行われることとなるので、周囲の相対湿度に関わりなく、培養過程で培養液中に気泡が発生するのを防止することができる。したがって、気泡の発生を防止するための保湿用の設備を別途設ける必要がなくなり、付帯設備の簡易化を図ることができる。また、培養液に気泡が発生しなくなることから、培養環境の均一性や観察性の向上を図ることができ、気泡発生に起因する種々の問題点を解消することができる。

次に、本発明の効果を実施例により明らかにする。
本発明を適用した実施例では、３ｃｍ×６ｃｍの袋状に形成した厚さ０．２ｍｍのシリコーンフィルムバッグの中に水を入れ、空気が入らないように封をした。そして、水を張った培養皿に、作製したシリコーンフィルムバッグを沈めて、２２℃、相対湿度６０％の設定条件下でインキュベータにより１１０時間保温し、その前後の質量を比較するとともに気泡の発生状況を観察した。なお、この実施例では、シリコーンフィルムバッグが本発明に係る細胞培養容器の第１膜材に対応し、シリコーンフィルムバッグの内部が培養空間に対応し、培養皿の内面とシリコーンフィルムバッグの外面との間に形成される空間が水溶液充填空間に対応するものである。

これに対して、比較例１では、実施例と同様に作製したシリコーンフィルムバッグを、水を張らない培養皿に置くようにして、これ以外の条件を実施例と同条件とした。この比較例１は、空気中の水蒸気が飽和状態でないときに、従来の細胞培養容器（培養液を覆う膜材３の外面側に水溶液の層が形成されていない細胞培養容器）を使用した場合に対応するものである。一方、比較例２では、比較例１と同様に、水を張らない培養皿にシリコーンフィルムバッグを置いて、これを２４℃、相対湿度１００％の設定条件下でインキュベータにより１１０時間保温するようにした。この比較例２は、空気中の水蒸気が飽和状態にあるときに、従来の細胞培養容器を使用した場合に対応するものである。実施例および各比較例のシリコーンフィルムバッグの試験前後の変化を表１に示す。

この表１からわかるように、実施例では、シリコーンフィルムバッグ内に気泡が発生せず、試験前後でシリコーンフィルムバッグの質量に僅かな変化（約２％の減少）しか見られなかったのに対して、比較例１では、シリコーンフィルムバッグ内に約２ｍｌの気泡が発生し、シリコーンフィルムバッグの質量についても実施例よりも大きな変化（約１０％の減少）が見られた。他方、比較例２では、実施例と同様に、シリコーンフィルムバッグ内に気泡が発生せず、試験前後でシリコーンフィルムバッグの質量に殆ど変化がなかった。
このように、従来の細胞培養容器に対応する比較例では、周囲の相対湿度如何によって、気泡の発生状況が大きく変化するのに対して、本発明を適用した実施例においては、周囲の相対湿度に関わりなく、気泡の発生を防止できることが確認された。

本発明に係る細胞培養容器の一実施形態を示す分解斜視図である。図１の細胞培養容器の断面図である。従来の細胞培養容器の一例を示す分解斜視図である。

符号の説明

１０第１板状部材
１２培養空間
２０第２板状部材
２２水溶液充填空間
３０培養板
３１第１膜材
３２第２膜材

Claims

培養液が充填されて細胞培養が行われる培養空間と、水または水溶液が充填される水溶液充填空間とがそれぞれ形成されて、両空間がガス透過性を有する第１膜材によって隔てられるとともに、上記水溶液充填空間と外部空間との境界面の少なくとも一部がガス透過性を有する第２膜材によって構成されていることを特徴とする細胞培養容器。
両面間に貫通する上記培養空間が形成された第１板状部材と、両面間に貫通する上記水溶液充填空間が形成された第２板状部材とを有し、これら第１および第２板状部材の対向面間に、上記培養空間と上記水溶液充填空間とを隔てる上記第１膜材が介装され、
上記第１板状部材の外面側に、上記培養空間を塞ぐとともに内面が細胞付着性を有する培養板が配設され、かつ上記第２板状部材の外面側に、上記水溶液充填空間を覆う上記第２膜材が配設されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
上記水溶液として、上記培養液またはそのベースとなる基礎培養液を用いたことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養容器。