JP2005095171A - PROBE DETECTING CHANGE OF ENVIRONMENT, PROTEIN, GENE DNA ENCODING THE SAME, mRNA, AND METHOD FOR DETECTING THE CHANGE OF ENVIRONMENT - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体に影響を及ぼしうる環境の変化を検出するプローブに関し、さらには生体にかかるストレスを検出する分子プローブに関し、より詳細には、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いてストレスを検出する分子プローブに関する。また、該分子プローブを用いてストレスを検出する方法に関する。
さらには、環境の変化により構造が変化し、その構造変化を光学的手法により検出することが可能なタンパク質に関する。
加えてこのようなタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、ｍＲＮＡに関する。
The present invention relates to a probe that detects changes in the environment that can affect a living body, and more particularly to a molecular probe that detects stress applied to a living body, and more specifically, detects stress using fluorescence resonance energy transfer (FRET). It relates to a molecular probe. The present invention also relates to a method for detecting stress using the molecular probe.
Furthermore, the present invention relates to a protein whose structure changes due to a change in environment and whose structural change can be detected by an optical technique.
In addition, it relates to genetic DNA and mRNA encoding such proteins.
35億年前に地球上に現れたとされる最初の生命体は、主に発酵と呼ばれる酸素を必要としないいわゆる嫌気的な化学反応を行うことによって、生存に必要なエネルギーを獲得していたと考えられている。このころの地球上には、酸素はほとんど存在せず、大気は主に窒素、二酸化炭素、水から構成されており、極めて還元的な環境において生命は生存していた。その後、太陽光を利用して、光合成を行うラン藻類が出現し、水分子を分解することにより酸素を多量に排出しはじめた。その後、酸素は徐々に濃度を増してゆき、約１５億年前には、酸素呼吸を行う最初の生命体が現れたといわれている。 The first life form that appears to have appeared on the earth 3.5 billion years ago was thought to have acquired the energy necessary for survival by conducting so-called anaerobic chemical reactions that do not require oxygen, which is called fermentation. It has been. At this time, there was almost no oxygen on the earth, and the atmosphere was mainly composed of nitrogen, carbon dioxide, and water, and life survived in a very reducing environment. Later, cyanobacteria that perform photosynthesis using sunlight appeared, and began to release a large amount of oxygen by decomposing water molecules. Later, oxygen gradually increased in concentration, and it is said that about 1.5 billion years ago, the first life form to breathe oxygen appeared.
酸化反応は、物質を燃焼させた場合に激しい熱や光を放出する反応などを見てもわかるように、高いエネルギーを生じさせることができる、極めて有用な化学反応である。生命体は、この有利な反応を自身の機能として獲得することで、効率良くエネルギーを得ることができるようになった。我々人間を含めた現存する高等生物の多くは、酸素呼吸を行うことでエネルギーを獲得している。 The oxidation reaction is a very useful chemical reaction that can generate high energy as can be seen from a reaction that emits intense heat or light when a substance is burned. Living organisms can obtain energy efficiently by acquiring this advantageous reaction as their own function. Many of the existing higher organisms, including humans, gain energy through oxygen breathing.
酸素は、通常の分子状態(O2)では、反応性は比較的弱く、安定である。しかしながら、一電子が還元され、いわゆる活性酸素とよばれる状態になると、一転して高い反応性を持つようになる。還元的な環境で生きていた古代生物の名残か、酸素呼吸を行う高等生物の体内は、依然として高い還元状態に保たれている。 In the normal molecular state (O 2 ), oxygen is relatively weak and stable. However, when one electron is reduced to a state called so-called active oxygen, it turns to have high reactivity. The remains of ancient creatures that lived in a reductive environment or higher organisms that breathe oxygen remain highly reduced.
したがって、その体内では、電子と酸素分子が反応し、活性酸素が常に生じるという状態になっている。活性酸素は、生細胞中で代謝産物として産生されるほか、化学物質、紫外線、放射線等の環境変異原などによっても生成される。スーパーオキサイドアニオン(O2 .‐)、過酸化水素(H2O2)、ヒドロキシラジカル(HO.)、過酸化脂質(LOOH)などのような活性酸素種(ROS)は、前述したように強い反応性を持ち、核酸やタンパク質、脂質等の細胞を構成する全ての因子に損傷を与え得る。 Therefore, in the body, electrons and oxygen molecules react and active oxygen is always generated. In addition to being produced as a metabolite in living cells, active oxygen is also produced by environmental mutagens such as chemical substances, ultraviolet rays and radiation. Reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion (O 2 .- ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), hydroxy radical (HO . ), Lipid peroxide (LOOH), etc. are strong as described above. It is reactive and can damage all factors that make up cells such as nucleic acids, proteins, and lipids.
活性酸素種はまた、体内へ侵入した異物の無毒化や、不要な細胞の処理、細胞情報伝達など有用な役割も果たしているが、大抵の場合は有害な作用を及ぼしている。しかしながら、活性酸素は前述のように生命体の代謝産物であり、その生成を原因から断つことは不可能である。それに対処するため、生命体には、活性酸素に対する防御機構が備えられている。即ち、生命体は、常に発生する活性酸素と、それに対する防御機構のバランスの上に成り立っているといえる。このバランスが崩れ、防御機構の能力を活性酸素種の量が上回った状態を酸化ストレスと呼び、その原因となる刺激要因は、酸化ストレス因子と呼ばれる。 Reactive oxygen species also play a useful role in detoxifying foreign bodies that have entered the body, treating unwanted cells, and transmitting cell information, but in most cases they have detrimental effects. However, as described above, active oxygen is a metabolite of living organisms, and it is impossible to cut off its generation from the cause. In order to cope with this, life forms are equipped with a defense mechanism against active oxygen. In other words, life forms are based on the balance between the active oxygen that is always generated and the defense mechanism against it. A state in which this balance is lost and the capacity of the defense mechanism exceeds the amount of reactive oxygen species is called oxidative stress, and the stimulating factor that causes it is called an oxidative stress factor.
前述したように、酸化ストレス因子は、核酸やタンパク質、脂質等の細胞中の様々な因子に障害を与え得る。このことは、酸化ストレスが遺伝子損傷による発癌、老化、高血圧、そのほかの様々な生活習慣病の原因となることを示している。近年は遺伝子解析も進み、癌や高血圧等の原因遺伝子も特定されつつあり、生活習慣病に罹りやすい体質、すなわち遺伝子素因の存在が知られるようになってきた。しかしながら、そのような遺伝子素因があっても、日ごろの生活習慣等を整えることにより酸化ストレス量を抑えることで、発症を防ぐのに大きな効果があることもわかって来た。したがって、疾病、老化の予防のためには、食品や運動、喫煙、飲酒、日ごろの生活習慣についての酸化ストレスの増大または減少への影響を測定・評価し、酸化ストレス量を十分に小さくするための生活習慣の最適化を行うことが重要であるといえる。 As described above, oxidative stress factors can damage various factors in cells such as nucleic acids, proteins, and lipids. This indicates that oxidative stress causes carcinogenesis due to genetic damage, aging, hypertension, and various other lifestyle-related diseases. In recent years, genetic analysis has progressed and causative genes such as cancer and hypertension are being identified, and it has become known that there is a predisposition to suffering from lifestyle-related diseases, that is, genetic predisposition. However, it has been found that even if there is such a gene predisposition, suppressing the amount of oxidative stress by adjusting daily lifestyle habits has a great effect in preventing the onset. Therefore, in order to prevent diseases and aging, to measure and evaluate the effects of food, exercise, smoking, drinking, and daily lifestyle on the increase or decrease of oxidative stress, and to sufficiently reduce the amount of oxidative stress It can be said that it is important to optimize lifestyles.
酸化ストレス量を測定・評価する手段としては、酸化ストレス検出マーカを用いた測定方法が一般的に用いられている。酸化ストレス検出マーカには、主に用いられるものとして、抗酸化物質ビリルビンの活性酸素との反応分解物であるバイオピリン、DNAの酸化損傷物8-ヒドロキシ-2’-デオキシグアノシン(8-OHｄG)、酸化還元制御を担うチオレドキシンなどがある。いずれもヒトの体液中のそれらの成分を定量し、生体内の酸化ストレスの総量を定量することができる。この方法では、個体レベルでの酸化ストレス量を検出することができ、主に医療分野などで用いられることが多い。 As a means for measuring and evaluating the amount of oxidative stress, a measurement method using an oxidative stress detection marker is generally used. Oxidative stress detection markers are mainly used as biopyrin, which is a reaction decomposition product of antioxidant bilirubin with active oxygen, oxidative damage 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) of DNA, There are thioredoxins responsible for redox control. In any case, these components in human body fluid can be quantified, and the total amount of oxidative stress in the living body can be quantified. This method can detect the amount of oxidative stress at the individual level, and is often used mainly in the medical field.
一方、酸化ストレス因子が細胞レベルでどのような影響を与え得るかを評価することは、酸化ストレスの生体に及ぼす作用を解明するために必要不可欠である。しかしながら、前述の酸化ストレス検出マーカを用いた方法は、あくまで個体レベルでの酸化ストレス総量の測定を目的としており、細胞レベルでの酸化ストレス検出には不向きである。これは、前述の酸化ストレス検出マーカは、主に化学的反応や免疫学的反応による方法でしか検出できず、細胞内での総量や局在を測定することは、技術的に非常に困難であるという問題があった。 On the other hand, evaluating how oxidative stress factors can affect cells is indispensable for elucidating the effects of oxidative stress on living organisms. However, the above-described method using the oxidative stress detection marker is intended only to measure the total amount of oxidative stress at the individual level, and is not suitable for detecting oxidative stress at the cell level. This is because the aforementioned oxidative stress detection markers can only be detected mainly by a chemical reaction or an immunological reaction, and it is technically very difficult to measure the total amount and localization in cells. There was a problem that there was.
細胞レベルでの酸化ストレス量を測定するためには、さまざまな酸化ストレス因子を個別に追跡するという方法もある。しかしながら、前述したように、酸化ストレスをもたらしうる因子にはさまざまな種類があり、それらを全て追跡できないことには、細胞内の酸化ストレスの総量を計測することはできず、実際問題として全ての酸化ストレス因子を追跡するということは非常に困難であるという問題があった。 In order to measure the amount of oxidative stress at the cell level, there is also a method of individually tracking various oxidative stress factors. However, as described above, there are various types of factors that can cause oxidative stress, and if it is not possible to track all of them, it is impossible to measure the total amount of oxidative stress in the cell, and as a matter of fact all the problems There was a problem that it was very difficult to track oxidative stress factors.
一方で、細胞レベルでの酸化ストレスに関する研究は、別のアプローチによっても行われてきた。特に、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは真核細胞の酸化ストレス応答研究に適したモデルである。S. cerevisiaeにおける酸化ストレス耐性の重要な因子の一つは、Yap-1とよばれる転写因子の一種である。Yap-1は当初、細胞質において発見された。しかし、細胞が酸化ストレス因子にさらされると、Yap-1は核に移行する。Yap-1はそのN末側に核内移行シグナル(NLS)を、C末側に核外輸送シグナル（NES）を持つ。Yap-1のシステインリッチ領域はNESに存在する。 On the other hand, studies on oxidative stress at the cellular level have been conducted by other approaches. In particular, the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a suitable model for eukaryotic oxidative stress response studies. One of the important factors for oxidative stress tolerance in S. cerevisiae is a kind of transcription factor called Yap-1. Yap-1 was originally discovered in the cytoplasm. However, when cells are exposed to oxidative stress factors, Yap-1 translocates to the nucleus. Yap-1 has a nuclear localization signal (NLS) on the N-terminal side and a nuclear export signal (NES) on the C-terminal side. The cysteine-rich region of Yap-1 is present in NES.
Yap-1はNLSおよびNESを介して、インポーチンと呼ばれる核内輸送受容体と、エクスポーチンと呼ばれる核外輸送受容体によって、構成的に核の内外へ輸送される。酸化ストレスがかかっていない状態では、Yap-1は不活性状態であり、核内への局在レベルも低い。
ところが、細胞が酸化ストレスに晒されると、Yap-1のシステインリッチドメインのシステイン残基が酸化され、ジスルフィド結合を形成し、Yap-1は構造的変化を起こす。この構造的変化により、Yap-1とエクスポーチンとの結合が阻害され、一方でインポーチンとの結合は阻害されないため、Yap-1の核内外への輸送に偏りが起こり、結果としてYap-1は核内へ蓄積される。Yap-1は核内で、チオレドキシン、グルタチオン等のさまざまな抗酸化因子をコードする遺伝子の転写を活性化する。
Yap-1 is constitutively transported into and out of the nucleus via NLS and NES by a nuclear transport receptor called importin and a nuclear transport receptor called exportin. In the state where no oxidative stress is applied, Yap-1 is in an inactive state and has a low localization level in the nucleus.
However, when cells are exposed to oxidative stress, cysteine residues in the cysteine-rich domain of Yap-1 are oxidized and form disulfide bonds, causing Yap-1 to undergo structural changes. Due to this structural change, the binding between Yap-1 and exportin is inhibited, while the binding with importin is not inhibited, resulting in a bias in the transport of Yap-1 into and out of the nucleus. As a result, Yap-1 Accumulated in the nucleus. Yap-1 activates transcription of genes encoding various antioxidant factors such as thioredoxin and glutathione in the nucleus.
一方最近、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた細胞内でのタンパク質間相互作用を追跡する分子プローブが開発された。FRETは分子間の相互作用を観察する技術である。供与側の蛍光分子の蛍光波長が、受容側の蛍光分子の励起波長と重なり、さらに二つの蛍光分子が互いに近接した場合に、FRETのシグナルを検出することができる。シアン色蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）との組み合わせでは、CFPが短波長の光により励起されただけでは、CFPの蛍光波長が観察されるだけであるが、CFPのエネルギーがYFPへ移動したときには、FRETのシグナルが観察される。FRETを利用した最初の細胞内分子プローブは、カメレオンと呼ばれ、カルシウム結合性タンパク質であるカルモジュリンを基にした、細胞内のカルシウム検出プローブであった。 Recently, however, molecular probes have been developed that track protein-protein interactions in cells using fluorescence resonance energy transfer (FRET). FRET is a technique for observing interactions between molecules. The FRET signal can be detected when the fluorescence wavelength of the donor fluorescent molecule overlaps with the excitation wavelength of the acceptor fluorescent molecule and the two fluorescent molecules are close to each other. In the combination of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP), the fluorescence wavelength of CFP is only observed when CFP is excited by short wavelength light, but the energy of CFP is YFP When moving to, a FRET signal is observed. The first intracellular molecular probe using FRET, called chameleon, was an intracellular calcium detection probe based on calmodulin, a calcium binding protein.
上に述べたような理由から、細胞レベルでの酸化ストレスの局在や経時変化を測定できる方法が求められていた。すなわち、本発明の目的は、細胞レベルでの酸化ストレス総量を測定することができる細胞内酸化ストレス追跡用の分子プローブを提供することにある。また本発明の目的は、細胞内酸化ストレス追跡用の分子プローブを用いて、細胞レベルまたは試験管内での酸化ストレスの局在や経時変化を測定する方法を提供することにある。
さらには、本発明者らは広い課題としてとらえ、環境の変化、特には生体における環境の半価を容易にかつリアルタイムで測定できる、分子プローブ、測定方法、新規なタンパク質を提供することにある。
For the reasons described above, there has been a demand for a method capable of measuring the localization of oxidative stress and changes with time at the cellular level. That is, an object of the present invention is to provide a molecular probe for tracking intracellular oxidative stress that can measure the total amount of oxidative stress at the cell level. Another object of the present invention is to provide a method for measuring the localization and temporal change of oxidative stress at the cellular level or in vitro using a molecular probe for tracking intracellular oxidative stress.
Furthermore, the present inventors regard as a broad problem, and to provide a molecular probe, a measurement method, and a novel protein that can easily and in real time measure environmental changes, particularly the half-value of the environment in a living body.
前述の目的を達成するために、本発明者らは鋭意検討重ね、光学的性質を用いた分子プローブにより環境変化特に酸化ストレスの局在や経時変化を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have made extensive studies and found that a molecular probe using optical properties can detect environmental changes, in particular, localization of oxidative stress and changes over time, and thus complete the present invention. It came.
即ち、本発明は。環境の変化を検出するための分子プローブであって、該分子プローブは少なくとも１つの色素が結合されており、酸化ストレスに応答してプローブの光学的性質が変化することを特徴とする生体に影響を及ぼしうる環境の変化を検出するための分子プローブである。 That is, the present invention. A molecular probe for detecting an environmental change, wherein the molecular probe is bound to at least one dye, and the optical property of the probe changes in response to oxidative stress. It is a molecular probe for detecting environmental changes that can cause
上記において、環境の変化が酸化ストレスであることができる。 In the above, the environmental change can be oxidative stress.
上記において、分子プローブが、タンパク質であることができる。 In the above, the molecular probe can be a protein.
上記において、タンパク質が単一の分子から構成されることができる。 In the above, the protein can be composed of a single molecule.
上記において、タンパク質が、酸化ストレスに応答して立体構造を変化させる性質であることができる。 In the above, the protein may have a property of changing the three-dimensional structure in response to oxidative stress.
上記において、分子プローブが蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が結合されていることができる。 In the above, the molecular probe can be bound to a fluorescent protein or a fluorescent dye.
上記において、光学的性質の変化が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものであることができる。 In the above, the change in optical properties can be due to fluorescence resonance energy transfer (FRET).
上記において、タンパク質が酸化ストレスに応答して立体構造を変化させ、２種以上の蛍光タンパク質あるいは蛍光色素の互いの距離が変化することで、２種以上の蛍光タンパク質あるいは蛍光色素間で蛍光共鳴エネルギー移動が発生または消滅するものであることができる。 In the above, the protein changes its three-dimensional structure in response to oxidative stress, and the distance between two or more fluorescent proteins or fluorescent dyes changes, whereby the fluorescence resonance energy between two or more fluorescent proteins or fluorescent dyes. The movement can occur or disappear.
上記において、タンパク質が転写因子あるいは転写因子を改変した変異タンパク質であることができる。 In the above, the protein can be a transcription factor or a mutant protein obtained by modifying a transcription factor.
上記において、転写因子が、酵母由来のYAP‐1タンパク質であることをができる。 In the above, the transcription factor can be a YAP-1 protein derived from yeast.
蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択される蛍光タンパク質であることができる。 Fluorescent protein or fluorescent dye is a fluorescent protein derived from Aequorea jellyfish such as GFP, YFP, CFP, BFP, Venus and the like, Renilla derived fluorescent protein and its analog, DsRed, HcRed, AsRed, ZsGreen, ZsYellow, AmCyan, AcGFP , A fluorescent protein selected from coral-derived fluorescent proteins such as Kaede and analogs thereof.
また、本発明は上記の分子プローブのタンパク質をコードする遺伝子DNAまたは該遺伝子DNAより転写反応によって生成されるｍRNAである。 Further, the present invention is a gene DNA encoding the protein of the molecular probe described above or an mRNA produced from the gene DNA by a transcription reaction.
本発明は、環境の変化に応答して変化する光学的性質を測定することを特徴とする環境の変化の検出方法である。 The present invention is a method for detecting an environmental change characterized by measuring an optical property that changes in response to an environmental change.
上記の検出方法において環境の変化が酸化ストレスであることができる。 In the above detection method, the environmental change can be oxidative stress.
上記の検出方法において光学的性質がＦＲＥＴであることができる。 In the above detection method, the optical property can be FRET.
上記の検出方法において、前述の分子プローブを用いて環境の変化を検出することができる。 In the above detection method, an environmental change can be detected using the molecular probe described above.
上記の検出方法において、前述の分子プローブを用いて細胞内での蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することができる。 In the above detection method, an oxidative stress site in a cell can be detected by detecting a change in fluorescence in the cell using the molecular probe described above.
上記の検出方法において、前述の分子プローブを細胞内に導入し、細胞内での蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することができる。 In the above detection method, an oxidative stress site in a cell can be detected by introducing the molecular probe described above into the cell and detecting a change in fluorescence in the cell.
本発明は、上記の遺伝子DNAまたは遺伝子DNAより転写反応によって生成されるmRNAを細胞内に導入し、細胞内で翻訳反応によってタンパク質を生成し、そのタンパク質の蛍光変化を検出することによって細胞内での被酸化ストレス部位を検出することを特徴とする酸化ストレスの検出方法である。 The present invention introduces the above gene DNA or mRNA produced by transcription reaction from gene DNA into a cell, produces a protein by translation reaction in the cell, and detects the fluorescence change of the protein in the cell. This is a method for detecting oxidative stress, which comprises detecting a site of oxidative stress in the oxidant.
本発明は、環境の変化に応答して構造が変化する部位、色素として機能する部位を含有することを特徴とするタンパク質である。 The present invention is a protein comprising a site whose structure changes in response to a change in environment and a site that functions as a pigment.
上記において環境の変化が酸化ストレスであることができる。 In the above, the environmental change can be oxidative stress.
上記において色素として機能する部位が蛍光を発する部位であることができる。 In the above, the site functioning as a pigment may be a site that emits fluorescence.
上記において、蛍光を発する部位が蛍光タンパク質あるいは蛍光色素であることができる。 In the above, the site emitting fluorescence can be a fluorescent protein or a fluorescent dye.
上記において、蛍光タンパク質あるいは蛍光色素が、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択される蛍光タンパク質であることができる。 In the above, the fluorescent protein or fluorescent dye is a fluorescent protein derived from Aequorea jellyfish such as GFP, YFP, CFP, BFP, Venus and the like, Renilla derived fluorescent protein and the analog thereof, DsRed, HcRed, AsRed, ZsGreen, ZsYellow, It can be a fluorescent protein selected from coral-derived fluorescent proteins such as AmCyan, AcGFP, Kaede and their analogs.
上記において、環境の変化に応答して構造が変化する部位が転写因子あるいは転写因子を改変した変異タンパク質であることができる。
上記において、転写因子が、酵母由来のYAP‐1タンパク質であることができる。
In the above, the site where the structure changes in response to a change in the environment can be a transcription factor or a mutant protein obtained by modifying the transcription factor.
In the above, the transcription factor can be YAP-1 protein derived from yeast.
本発明により、細胞レベルでの環境変化の測定が可能となり、特に酸化ストレスの局在や経時変化を測定でき、細胞内酸化ストレス等が可能となった。 According to the present invention, it is possible to measure environmental changes at the cell level, and in particular, it is possible to measure the localization and temporal change of oxidative stress, and to make intracellular oxidative stress and the like possible.
本発明において、生体に影響を及ぼしうる環境の変化とは、具体的には、温度、ｐＨ等の変化、各種の薬品類、天然および合成の毒物の有無や、これらの濃度の濃度変化等で、生体の機能等に影響を及ぼすものが挙げられ、特には酸化ストレスである。 In the present invention, environmental changes that may affect the living body specifically include changes in temperature, pH, etc., the presence or absence of various chemicals, natural and synthetic toxins, and changes in the concentration of these concentrations. Those that affect the function of the living body are mentioned, and in particular, oxidative stress.
ここでいう酸化ストレスとは、細胞になんらかの障害を生じさせ得る活性酸素種を指し、より具体的にはスーパーオキサイドアニオン(O2 .‐)、過酸化水素(H2O2)、ヒドロキシラジカル(HO.)、過酸化脂質(LOOH)などを指す。 Oxidative stress as used herein refers to reactive oxygen species that can cause some damage to cells. More specifically, superoxide anion (O 2 .- ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), hydroxy radical ( HO . ), Lipid peroxide (LOOH) and the like.
また、ここでいう分子プローブとは、一分子または数個の分子の集合体で、何らかの対象を検出する機能を持つ分子を指し、その構造は特に限定されないが、タンパク質や核酸などの高分子が好ましく、特に一分子のタンパク質であることが好ましい。 A molecular probe as used herein refers to a molecule that is a single molecule or an assembly of several molecules and has a function of detecting some target, and its structure is not particularly limited. A single molecule protein is particularly preferable.
また、光学的特性とは光の吸収、放出の強度の変化であり、好ましくは４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視光内の変化であることが好ましい。
光学的性質が変化する機構としては、環境の変化による色素自体の構造及び化学的変化であっても良いが、特には２つの蛍光色素間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の状態の変化であることが好ましい。
The optical characteristics are changes in the intensity of light absorption and emission, and are preferably changes in visible light of 400 nm to 700 nm.
The mechanism by which the optical properties change may be the structure and chemical changes of the dye itself due to environmental changes, but in particular the change in the state of fluorescence resonance energy transfer (FRET) that occurs between the two fluorescent dyes. Preferably there is.
色素としては、光の吸収、放出をになうものであり、ＦＲＥＴを用いることが好ましいことから、蛍光分子であることが好ましい。 The dye is a fluorescent molecule because it absorbs and emits light and preferably uses FRET.
本発明におけるタンパク質は特に環境の変化に応答して立体構造を変化させる性質のものであることが好ましい。このようなタンパク質はどのようなものを用いてもよいが、FRETを用いて検出するという特性上、何らかの物質との相互作用によりその立体構造を変化させる性質をもつものが好ましい。より具体的には、酸化ストレス因子との相互作用によりその立体構造を変化させる性質をもつものであり、立体構想を変化させる部位にアミノ酸としてシステインを２個以上、さらには３個以上、特には４個以上持つものであることが好ましい。また、天然タンパク質であることが好ましく、さらに具体的にはYap-1等の酸化ストレス応答に関与する転写因子等の構造を任意に改変したものが好適に用いられる。 It is preferable that the protein in the present invention has a property of changing the three-dimensional structure in response to a change in environment. Any protein may be used, but a protein having a property of changing its three-dimensional structure by interaction with a certain substance is preferable because of the property of detection using FRET. More specifically, it has the property of changing its three-dimensional structure by interaction with an oxidative stress factor, and has two or more cysteine as an amino acid at a site that changes the three-dimensional concept, and more particularly three or more. It is preferable to have four or more. Further, it is preferably a natural protein, and more specifically, a protein obtained by arbitrarily modifying the structure of a transcription factor involved in oxidative stress response such as Yap-1 is suitably used.
また、ＦＲＥＴを利用するという点でタンパク質には２種以上の蛍光分子が結合していることが好ましい。 Moreover, it is preferable that 2 or more types of fluorescent molecules are couple | bonded with protein from the point of utilizing FRET.
本発明における蛍光分子は、天然および合成の各種蛍光色素や、各種蛍光タンパク質が好ましいが、細胞内で発現させるという目的においては、蛍光タンパク質を用いることが好ましい。具体的には、GFP、YFP、CFP、BFP、Venusなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、DsRed、HcRed、AsRed、ZsGreen、ZsYellow、AmCyan、AcGFP、Kaedeなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体等の各種蛍光タンパク質を用いることが好ましい。 As the fluorescent molecule in the present invention, various natural and synthetic fluorescent dyes and various fluorescent proteins are preferable. For the purpose of expression in cells, it is preferable to use fluorescent proteins. Specifically, Aequorea-derived fluorescent proteins such as GFP, YFP, CFP, BFP, Venus and their analogs, Renilla-derived fluorescent proteins and their analogs, DsRed, HcRed, AsRed, ZsGreen, ZsYellow, AmCyan, AcGFP, Kaede It is preferable to use various fluorescent proteins such as coral-derived fluorescent proteins and analogs thereof.
また、ＦＲＥＴ以外では蛍光タンパクが環境の変化によって、蛍光を失う、蛍光波長がシフトする等、その蛍光特性が変化するものであっても良い。また、吸収スペクトル特性が変化するようなものであっても良い。 In addition to FRET, the fluorescence characteristics of the fluorescent protein may change such that the fluorescent protein loses fluorescence or the fluorescence wavelength shifts due to environmental changes. Further, the absorption spectrum characteristic may be changed.
本発明はまた、前述の分子プローブのタンパク質をコードする遺伝子DNAおよび該遺伝子DNAより転写反応によって生成されるｍRNAである。 The present invention is also a gene DNA encoding the protein of the molecular probe described above and mRNA produced from the gene DNA by a transcription reaction.
さらに本発明は、環境の変化に応答して変化する光学的性質を測定することを特徴とする環境の変化の検出方法である。 Furthermore, the present invention is a method for detecting an environmental change, characterized by measuring an optical property that changes in response to the environmental change.
検出対象については特に限定されないが、細胞レベルでの検出対象としては、すべての生細胞もしくは各種タンパク質等の機能が保持された状態で固定化された細胞、部分的に細胞膜に穿孔したセミインタクトセルなどが用いられ、あるいは試験管レベルでの検出対象としては、生体から抽出した試料、あるいは細胞培養液もしくはその抽出液などが好適に用いられる。 The detection target is not particularly limited, but the detection target at the cell level includes all living cells or cells immobilized with the functions of various proteins retained, semi-intact cells partially perforated in the cell membrane, etc. As a detection target at the test tube level, a sample extracted from a living body, a cell culture solution or an extract thereof is preferably used.
本発明における細胞への遺伝子DNAあるいはRNAの導入法は、いかなる方法を用いてもよいが、一般的に多用されるエレクトロポレーション法や、陽イオンリポソーム法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、ウィルス感染法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、活性型デンドリマー法、非リポソーム系脂質法などが好適に使用される。また本発明における遺伝子DNAあるいはRNAを導入した細胞については、一過性にDNAあるいはRNAが導入された細胞（トランジエントトランスフォーマント）であってもよいし、安定的にDNAが導入された細胞（ステーブルトランスフォーマント）であってもよい。 Any method may be used for introducing the gene DNA or RNA into the cells in the present invention, but the electroporation method, the cationic liposome method, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the virus infection, which are commonly used in general. The method, particle gun method, microinjection method, active dendrimer method, non-liposomal lipid method and the like are preferably used. In addition, the cell into which the gene DNA or RNA is introduced in the present invention may be a cell into which DNA or RNA has been introduced transiently (transient transformant), or a cell into which DNA has been stably introduced (transient transformant). (Stable transformant).
また、本発明のタンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡをプラスミドに組み込み、これを酵母や大腸菌等の菌類等に形質転換して発現させることが好ましい。 The protein of the present invention is preferably expressed by incorporating a gene DNA encoding the protein into a plasmid and transforming it into a fungus such as yeast or Escherichia coli.
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。 The details of the present invention will be described in Examples. The present invention is not limited to these examples.
実施例１
酸化ストレス分子プローブの大腸菌発現系の構築
酵母由来のｙａｐ１遺伝子を元に、酸化ストレス分子プローブタンパク質の発現系を構築した。具体的には、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３Ｂ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてセンスプライマーＣＲＤ１（６０１）−Ｓｐｈ−Ｆｗ（配列番号１）とアンチセンスプライマーＣＲＤ１−Ｇｌｙ２−Ｃｌａ−Ｒｖ（配列番号２）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＣＲＤ１（６０１）−Ｓｐｈ−ＦｗにはＳｐｈ Ｉ切断部位、ＣＲＤ１−Ｇｌｙ２−Ｃｌａ−ＲｖにはＣｌａ Ｉ切断部位が含まれている。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−専用ＰＣＲバッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、｛９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃２分｝ｘ２５サイクル、６８℃７分の温度で反応を行った。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素Ｓｐｈ ＩおよびＣｌａ Ｉを使用して切断し、その処理後のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ （プロメガ社製）のＳｐｈ ＩおよびＣｌａ Ｉの位置にサブクローニングを行い、プラスミドＣＲＤ１（６０１−６５０）／ｐＧＥＭを構築した。
Example 1
Construction of Escherichia coli Expression System for Oxidative Stress Molecular Probes Based on the yeast-derived yap1 gene, an expression system for oxidative stress molecular probe proteins was constructed. Specifically, sense primer CRD1 (601) -Sph-Fw (SEQ ID NO: 1) and antisense primer CRD1-Gly2-Cla-Rv (SEQ ID NO: 2) were used with genomic DNA derived from yeast Saccharomyces cerevisiae W303B as a template. A PCR reaction was performed. CRD1 (601) -Sph-Fw contains a Sph I cleavage site, and CRD1-Gly2-Cla-Rv contains a Cla I cleavage site. For the PCR reaction, KOD-Plus-DNA polymerase (manufactured by Toyobo) was used, each primer 50 pmol, magnesium sulfate 1 mM, dATP, dTTP, dCTP, dGTP 0.2 mM each, KOD-Plus-dedicated PCR buffer 1x concentration , KOD-Plus-DNA polymerase 1 unit, final reaction volume 50 μl, at 94 ° C. for 2 minutes, {94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 20 seconds, 68 ° C. for 2 minutes} × 25 cycles, 68 ° C. for 7 minutes Reaction was performed. Both ends of the PCR product are cleaved using restriction enzymes Sph I and Cla I, and the PCR product after the treatment is subcloned at positions Sph I and Cla I of pGEM-T Easy Vector (manufactured by Promega). Plasmid CRD1 (601-650) / pGEM was constructed.
次に、酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３Ｂ株由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてセンスプライマーＣＲＤ２（２８１）−Ｃｌａ−Ｆｗ（配列番号３）とアンチセンスプライマーＣＲＤ２−Ｓａｃ−Ｒｖ（配列番号４）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＣＲＤ２（２８１）−Ｃｌａ−ＦｗにはＣｌａ Ｉ切断部位、ＣＲＤ２−Ｓａｃ−ＲｖにはＳａｃ Ｉ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素Ｃｌａ ＩおよびＳａｃ Ｉを使用して切断し、その処理後のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ＶｅｃｔｏｒのＣｌａ ＩおよびＳａｃ Ｉの位置にサブクローニングを行い、プラスミドＣＲＤ２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭを構築した。 Next, PCR was performed using sense primer CRD2 (281) -Cla-Fw (SEQ ID NO: 3) and antisense primer CRD2-Sac-Rv (SEQ ID NO: 4) using genomic DNA derived from yeast Saccaromyces cerevisiae W303B as a template. went. CRD2 (281) -Cla-Fw contains a Cla I cleavage site and CRD2-Sac-Rv contains a Sac I cleavage site. Both ends of the PCR product are cleaved using restriction enzymes Cla I and Sac I, and the treated PCR product is subcloned into the positions of Cla I and Sac I of pGEM-T Easy Vector to obtain plasmid CRD2 (601 -650) / pGEM was constructed.
次に、プラスミドＣＲＤ１（６０１−６５０）／ｐＧＥＭから、制限酵素Ｓｐｈ ＩとＣｌａ ＩによってＣＲＤ（６０１−６５０）の断片を切り出し、プラスミドＣＲＤ２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭのＳｐｈ ＩおよびＣｌａ Ｉの位置にサブクローニングして、プラスミドＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭを構築した。 Next, a fragment of CRD (601-650) was excised from plasmid CRD1 (601-650) / pGEM with restriction enzymes Sph I and Cla I, and positions of Sph I and Cla I of plasmid CRD2 (601-650) / pGEM To construct plasmid CRD1 / 2 (601-650) / pGEM.
また、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（ＢＤバイオサイエンス社製）を鋳型としてセンスプライマーＣＦＰ−Ｂａｍ−Ｆｗ（配列番号５）とアンチセンスプライマーＣＦＰ−Ｓｐｈ−Ｒｖ（配列番号６）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＣＦＰ−Ｂａｍ−ＦｗにはＢａｍ Ｈ Ｉ切断部位が、ＣＦＰ−Ｓｐｈ−ＲｖにはＳｐｈ Ｉ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を、制限酵素Ｂａｍ Ｈ ＩおよびＳｐｈ Ｉを使用して切断し、その処理後のＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ＶｅｃｔｏｒのＢａｍ Ｈ ＩおよびＳｐｈ Ｉの位置にサブクローニングを行い、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＧＥＭを構築した。このプラスミドから制限酵素Ｂａｍ Ｈ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いてＣＦＰ−Ｎ断片を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）のＢａｍ Ｈ ＩおよびＮｏｔ Ｉ部位にサブクローニングし、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを構築した。さらにこのプラスミドから制限酵素Ｂａｍ Ｈ ＩおよびＳａｃ Ｉを用いてＣＦＰ−Ｎ断片を切り出し、ｐＲＳＥＴ Ａ（インビトロジェン社製）のＢａｍ Ｈ ＩおよびＳａｃ Ｉの位置にサブクローニングし、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＲＳＥＴを構築した。このプラスミドに、前述のプラスミドＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＧＥＭから、制限酵素Ｓｐｈ ＩおよびＳａｃ Ｉを用いてＣＲＤ１／２（６０１−６５０）断片を切り出し、プラスミドＣＦＰ−Ｎ／ｐＲＳＥＴのＳｐｈ ＩおよびＳａｃ Ｉ部位にサブクローニングし、プラスミドＣＦＰ−ＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＲＳＥＴを構築した。 Further, PCR reaction was performed using sense primer CFP-Bam-Fw (SEQ ID NO: 5) and antisense primer CFP-Sph-Rv (SEQ ID NO: 6) using pECFP-N1 (manufactured by BD Bioscience) as a template. CFP-Bam-Fw contains a BamHI cleavage site, and CFP-Sph-Rv contains a SphI cleavage site. Both ends of the PCR product are cleaved using restriction enzymes Bam H I and Sph I, and the treated PCR product is subcloned into Bam H I and Sph I positions of pGEM-T Easy Vector to obtain plasmid CFP. -N / pGEM was constructed. A CFP-N fragment was excised from this plasmid using restriction enzymes Bam HI and Not I and subcloned into the Bam HI and Not I sites of pBluescript SK + (Stratagene) to construct plasmid CFP-N / pBluescript. . Further, a CFP-N fragment was excised from this plasmid using restriction enzymes Bam H I and Sac I, and subcloned into Bam H I and Sac I positions of pRSET A (Invitrogen) to construct plasmid CFP-N / pRSET. did. From this plasmid, the CRD1 / 2 (601-650) fragment was excised from the aforementioned plasmid CRD1 / 2 (601-650) / pGEM using restriction enzymes Sph I and Sac I, and Sph I of plasmid CFP-N / pRSET was obtained. And subcloned into the Sac I site to construct plasmid CFP-CRD1 / 2 (601-650) / pRSET.
次に、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１（ＢＤバイオサイエンス社製）を鋳型としてセンスプライマーＹＦＰ−Ｓａｃ−Ｆｗ（配列番号７）とアンチセンスプライマーＹＦＰ−Ｅｃｏ−Ｒｖ（配列番号８）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＹＦＰ−Ｓａｃ−ＦｗにはＳａｃ Ｉ切断部位、ＹＦＰ−Ｅｃｏ−ＲｖにはＥｃｏ ＲＩ切断部位が含まれている。ＰＣＲ産物の両端を制限酵素Ｓａｃ ＩおよびＥｃｏ ＲＩで切断し、プラスミドＣＦＰ−ＣＲＤ１／２（６０１−６５０）／ｐＲＳＥＴのＳａｃ ＩおよびＥｃｏ ＲＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐＣＹ２（６０１−６５０）を構築した。 Next, PCR reaction was performed using sense primer YFP-Sac-Fw (SEQ ID NO: 7) and antisense primer YFP-Eco-Rv (SEQ ID NO: 8) using pEYFP-N1 (BD Bioscience) as a template. . YFP-Sac-Fw contains a Sac I cleavage site, and YFP-Eco-Rv contains an Eco RI cleavage site. Both ends of the PCR product were cleaved with restriction enzymes Sac I and Eco RI, and subcloned into the Sac I and Eco RI sites of plasmid CFP-CRD1 / 2 (601-650) / pRSET to construct plasmid pCY2 (601-650). .
実施例２
酸化ストレス分子プローブの大腸菌における発現
プラスミドｐＣＹ２（６０１−６５０）を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換した。形質転換菌をアンピシリンナトリウム入りのＬＢ培地プレートにまき、３７℃で１６時間インキュベートし、シングルコロニーをピックアップした。ピックアップした株をアンピシリンナトリウム入りのＬＢ液体培地１００ｍｌに植菌し、２３℃で約５時間、ＯＤ６１０が０．５になるまで培養した。組換タンパク質はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように加えてタンパク質発現誘導をかけ、更に３時間培養し、その後に０．４ｍＭのＩＰＴＧを更に添加して１２時間培養することによって発現させた。
図１に発現させたＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の分子構造を示す。
Example 2
Expression of Oxidative Stress Molecular Probe in E. coli Plasmid pCY2 (601-650) was used to transform E. coli BL21 (DE3) (Novagen). The transformed bacterium was spread on an LB medium plate containing ampicillin sodium and incubated at 37 ° C. for 16 hours to pick up a single colony. The picked strain was inoculated into 100 ml of LB liquid medium containing ampicillin sodium, and cultured at 23 ° C. for about 5 hours until OD610 became 0.5. As for the recombinant protein, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.1 mM to induce protein expression, and further cultured for 3 hours, after which 0.4 mM IPTG was added. Furthermore, it was made to express by adding and culturing for 12 hours.
FIG. 1 shows the molecular structure of the expressed CY2 (601-650) protein.
実施例３
大腸菌で発現させた酸化ストレス分子プローブの精製
培養終了後の菌体は６０００ｘｇで１０分間の遠心分離を行って回収し、１ｍＭ ＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌ ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ ペプスタチンを含有するＰＢＳバッファに再懸濁した。４倍量の同バッファを更に加え、フレンチプレス細胞破砕機（サーモスペクトロニック社製）を用いて細胞を破砕した。破砕液を４００００ｘｇで一時間遠心分離し、可溶化したタンパク質を含有する上清を回収した。得られたタンパク質溶液から、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡績製）を用いて、酸化ストレス分子プローブタンパク質を精製した。
Example 3
Purification of Oxidative Stress Molecular Probes Expressed in E. coli The cells after completion of the culture are collected by centrifugation at 6000 × g for 10 minutes and re-applied in a PBS buffer containing 1 mM PMSF, 3 μg / ml leupeptin, 3 μg / ml pepstatin. Suspended. A 4-fold amount of the same buffer was further added, and the cells were disrupted using a French press cell disrupter (manufactured by ThermoSpectronic). The disrupted solution was centrifuged at 40000 × g for 1 hour, and the supernatant containing the solubilized protein was collected. From the obtained protein solution, the oxidative stress molecular probe protein was purified using MagExtractor (manufactured by Toyobo).
図２に精製したＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す。ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質は、単一のバンドとなって表れ、純度の高い状態で精製されたことが示された。 FIG. 2 shows the analysis results of the purified CY2 (601-650) protein by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The CY2 (601-650) protein appeared as a single band, indicating that it was purified in a high purity state.
実施例４
精製した酸化ストレス分子プローブのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける過酸化水素濃度変化による蛍光特性の変化の測定
得られた精製ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質について、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいての、酸化ストレス因子として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加していった場合の蛍光特性の変化を、分光蛍光光度計ＲＦ５３００−ＰＣ（島津製作所製）を用いて、ＣＦＰの励起光（４３４ｎｍ）下での蛍光スペクトル分析を行うことで測定した。
Example 4
Measurement of changes in fluorescence characteristics due to changes in hydrogen peroxide concentration in vitro of the purified oxidative stress molecular probe The purified CY2 (601-650) protein thus obtained was treated with hydrogen peroxide (H 2 as an oxidative stress factor in vitro. The change in fluorescence characteristics when O 2 ) was added was performed by performing a fluorescence spectrum analysis under CFP excitation light (434 nm) using a spectrofluorometer RF5300-PC (manufactured by Shimadzu Corporation). It was measured.
その結果を図３に示す。過酸化水素を添加しない条件（０ｍＭ）では、ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質にそれぞれ融合されたＣＦＰおよびＹＦＰとが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こし、ＣＦＰの励起光下で強いＹＦＰの蛍光シグナルが検出されたが、過酸化水素濃度を段階的に上げていくことにより、ＹＦＰのシグナルが減少し、ＣＦＰのシグナルが増加するのが確認され、ＣＹ２（６０１−６５０）が過酸化水素濃度依存的に構造変化を引き起こし、徐々にＦＲＥＴが解除されていることが示唆された。 The result is shown in FIG. Under the condition where hydrogen peroxide is not added (0 mM), CFP and YFP respectively fused to CY2 (601-650) protein cause fluorescence resonance energy transfer (FRET), and a strong YFP fluorescence signal is generated under the excitation light of CFP. However, it was confirmed that the YFP signal decreased and the CFP signal increased by gradually increasing the hydrogen peroxide concentration, and CY2 (601-650) was dependent on the hydrogen peroxide concentration. It was suggested that FRET was released gradually.
実施例５
精製した酸化ストレス分子プローブのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける酸化ストレス因子添加時の蛍光特性の経時変化の測定
Example 5
Measurement of time-dependent changes in fluorescence characteristics of purified oxidative stress molecular probes when oxidative stress factors are added in vitro
ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質に加え、ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の４箇所のシステイン残基をすべてアラニンに置き換えたＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡタンパク質を合成し精製した。ＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡの分子構造を図４に示す。 In addition to CY2 (601-650) protein, CY2 (601-650) AAAA protein in which all four cysteine residues of CY2 (601-650) protein were replaced with alanine was synthesized and purified. The molecular structure of CY2 (601-650) AAAA is shown in FIG.
ＣＹ２（６０１−６５０）およびＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、酸化ストレス因子として過酸化水素、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジアミドをそれぞれ添加したときの、ＣＦＰの励起光下でのＣＦＰとＹＦＰのそれぞれの蛍光シグナルの強度の比率（ＦＲＥＴ比率)を、分光蛍光光度計ＲＦ５３００−ＰＣ（島津製作所製）を用いて検討した。 For CY2 (601-650) and CY2 (601-650) AAAA in vitro, hydrogen peroxide, dithiothreitol (DTT), and diamide were added as oxidative stress factors, respectively, under the excitation light of CFP. The intensity ratio (FRET ratio) of the fluorescence signals of CFP and YFP was examined using a spectrofluorometer RF5300-PC (manufactured by Shimadzu Corporation).
それぞれの結果を図５、６、７に示す。ＣＹ２（６０１−６５０）は、酸化ストレス因子添加時には時間経過とともにＦＲＥＴ比率が低下しているが、ＣＹ２（６０１−６５０）ＡＡＡＡでは、ほとんど変化が起こらないことが示された。 The respective results are shown in FIGS. CY2 (601-650) showed that the FRET ratio decreased with time when an oxidative stress factor was added, but CY2 (601-650) AAAA showed almost no change.
実施例６
酵母細胞内での酸化ストレス分子プローブの発現とＦＲＥＴ解析
ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の遺伝子を、ＧＡＰプロモータ下流に組み込んだ発現プラスミドを構築し、酵母細胞へ導入して、ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質の酵母細胞内での発現を行った。酵母細胞へのプラスミド導入による形質転換は、改変酢酸リチウム法（Ｓａｋａｉ, Ｙ．， ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５： ３５５６−６２）によって行った。具体的には、プラスミドを用いて酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ３０３Ｂ株を形質転換した。得られた４５８ｎｍの励起光下での蛍光スペクトル分析を行った。
Example 6
Expression and FRET analysis of oxidative stress molecular probe in yeast cells An expression plasmid in which the gene of CY2 (601-650) protein is incorporated downstream of the GAP promoter is constructed and introduced into yeast cells, and CY2 (601-650) Protein expression in yeast cells was performed. Transformation by introduction of a plasmid into yeast cells was performed by a modified lithium acetate method (Sakai, Y., et al. 1993 J Bacteriol 175: 3556-62). Specifically, the yeast Saccaromyces cerevisiae W303B strain was transformed with the plasmid. The obtained fluorescence spectrum was analyzed under the excitation light of 458 nm.
その結果を図８に示す。実施例４に示した結果とは、励起光の波長が異なるため波形が異なっているが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける場合と同様のＦＲＥＴの波形が確認された。 The result is shown in FIG. Although the waveform is different from the result shown in Example 4 because the wavelength of the excitation light is different, the same FRET waveform as that in the in vitro was confirmed.
実施例７
酵母細胞内での酸化ストレス分子プローブの酸化ストレス因子添加時の蛍光特性の経時変化の測定
形質転換株ＣＹ２（６０１−６５０）タンパク質を発現している酵母細胞に、酸化ストレス因子として、１ｍＭのジアミドを添加し、スライドガラス上に載せ、共焦点レーザ顕微鏡ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ（カールツァイス社製）を用い、蛍光の１０分間の経時変化について、蛍光顕微鏡観察を行った。
Example 7
Measurement of time-dependent change in fluorescence characteristics of oxidative stress molecular probe in yeast cells upon addition of oxidative stress factor 1 mM diamide as an oxidative stress factor in yeast cells expressing transformed CY2 (601-650) protein Was placed on a slide glass, and the fluorescence was observed with a confocal laser microscope LSM510 META (manufactured by Carl Zeiss) for 10 minutes of fluorescence over time.
その結果を図９に示す。測定した結果、ＦＲＥＴが時間の経過とともに徐々に解除されていく様子が観察され、ＣＹ２（６０１−６５０）はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける場合と同様の酸化ストレスに対する反応性を示すことが確認された。 The result is shown in FIG. As a result of the measurement, it was observed that FRET was gradually released over time, and CY2 (601-650) was confirmed to exhibit the same reactivity to oxidative stress as in vitro.
本発明により、細胞レベルでの環境変化の測定が可能となり、さらに、酸化ストレスの局在や経時変化を測定でき、細胞内酸化ストレスの追跡等が可能となり、産業界に寄与すること大である。 According to the present invention, it is possible to measure environmental changes at the cellular level, and further, it is possible to measure the localization and temporal changes of oxidative stress, and to track intracellular oxidative stress, which contributes to the industry. .
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