JP2005065617A - Method for identifying individual - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子検査及びＤＮＡ鑑定に関する。 The present invention relates to genetic testing and DNA testing.
毛髪試料を利用した個人識別は、ＳＴＲ多型などのＤＮＡ型を判定する方法を用いて、従来から行われている。特に毛髪試料に毛根鞘が付着している場合は、ＭＣＴ１１８検査法やＨＬＡＤＱα検査法などによって、比較的容易にＤＮＡ型判定を行うことが可能である。（例えば、科学警察研究所報告法科学編、第５０巻、第１号、１９９７年２月参照。）しかしながら、毛髪試料が自然脱毛や毛幹部のみである場合は、試料中に含有されるＤＮＡが微量であり、かつ断片化が起こっているため、ゲノムを用いたＤＮＡ判定を行うことが難しい。一方、ミトコンドリアＤＮＡはその回収が容易であるためにＤＮＡ判定によく用いられるが、現状では５０〜１００人に１人の割合で同じ結果が出ると言われており、検出感度の低さが問題となる。 Individual identification using a hair sample has been conventionally performed using a method of determining a DNA type such as a STR polymorphism. In particular, when a root sheath is attached to a hair sample, DNA type determination can be performed relatively easily by the MCT118 inspection method, the HLADQα inspection method, or the like. (For example, see the National Police Research Institute Report on Legal Science, Vol. 50, No. 1, February 1997.) However, if the hair sample is only natural hair loss or hair shaft, DNA contained in the sample Is very small and fragmentation occurs, it is difficult to perform DNA determination using a genome. On the other hand, mitochondrial DNA is often used for DNA determination because it is easy to recover, but at present, it is said that the same result is obtained at a rate of 1 in 50 to 100 people, and low detection sensitivity is a problem. It becomes.
そこで本発明の目的は、含有ＤＮＡ量が極微量である試料や、ＤＮＡの断片化が起っている試料など、従来の個人識別法において判定が困難であった試料からも、容易に個人識別ができる方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to easily identify individuals even from samples that are difficult to judge by conventional individual identification methods, such as samples with a very small amount of DNA contained or samples with DNA fragmentation. It is to provide a method that can do this.
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）識別すべき個人のＤＮＡを含む試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を利用して個人を識別する、個人識別法。
（２）前記試料が毛髪、爪、皮膚、口腔粘膜及び血液から選ばれる、前記（１）に記載の個人識別法。
（３）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型を利用する、前記（１）又は（２）に記載の個人識別法。
（４）前記ＤＮＡの情報としてＳＴＲ多型を利用する、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の個人識別法。
（５）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型とＳＴＲ多型とを組み合わせて利用する、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の個人識別法。
（６）複数個人のＤＮＡの情報が、前記複数個人の名前又は前記複数個人を特定することができる記号と共に収納されたデータベースを用意し、
識別すべき特定個人のＤＮＡを含有する試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を得て、
前記データベースに収納された前記複数個人のＤＮＡの情報と、前記特定個人のＤＮＡの情報とを照合し、前記特定個人を識別する、個人識別法。
（７）前記試料が毛髪、爪、皮膚、口腔粘膜及び血液から選ばれる、前記（６）に記載の個人識別法。
（８）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型を利用する、前記（６）又は（７）に記載の個人識別法。
（９）前記ＤＮＡの情報としてＳＴＲ多型を利用する、前記（６）〜（８）のいずれかに記載の個人識別法。
（１０）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型とＳＴＲ多型とを組み合わせて利用する、前記（６）〜（９）のいずれかに記載の個人識別法。
The present invention includes the following inventions.
(1) A personal identification method in which genomic DNA extracted from a sample containing DNA of an individual to be identified is subjected to amplification processing of the entire genomic DNA, and then the individual is identified using the DNA information.
(2) The personal identification method according to (1), wherein the sample is selected from hair, nails, skin, oral mucosa and blood.
(3) The personal identification method according to (1) or (2), wherein a mitochondrial DNA polymorphism is used as the DNA information.
(4) The personal identification method according to any one of (1) to (3), wherein an STR polymorphism is used as the DNA information.
(5) The personal identification method according to any one of (1) to (4), wherein mitochondrial DNA polymorphism and STR polymorphism are used in combination as the DNA information.
(6) preparing a database in which DNA information of a plurality of individuals is stored together with the names of the plurality of individuals or symbols that can identify the plurality of individuals;
The genomic DNA extracted from the sample containing the DNA of the specific individual to be identified is subjected to amplification processing of the entire genomic DNA, and then the information on the DNA is obtained.
A personal identification method in which the DNA information of the plurality of individuals stored in the database is compared with the DNA information of the specific individuals to identify the specific individuals.
(7) The personal identification method according to (6), wherein the sample is selected from hair, nails, skin, oral mucosa and blood.
(8) The personal identification method according to (6) or (7), wherein a mitochondrial DNA polymorphism is used as the DNA information.
(9) The personal identification method according to any one of (6) to (8), wherein an STR polymorphism is used as the DNA information.
(10) The personal identification method according to any one of (6) to (9), wherein mitochondrial DNA polymorphism and STR polymorphism are used in combination as the DNA information.
本発明によると、含有ＤＮＡ量が極微量である試料や、ＤＮＡの断片化が起っている試料など、従来の個人識別法において判定が困難であった試料からも、容易に個人識別ができる方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to easily identify individuals from samples that are difficult to determine by conventional individual identification methods, such as samples with a very small amount of DNA contained or samples in which DNA fragmentation has occurred. A method can be provided.
本発明において個人識別のために用いられる試料には、人体由来試料や人体由来試料を含む物体などが挙げられる。人体由来試料としては、体液、組織、及びそれらに由来する細胞などが挙げられる。体液としては、血液、唾液、精液などが挙げられる。組織としては、毛髪、骨、歯牙、爪、皮膚、口腔粘膜などが挙げられる。また、人体由来試料を含む物体としては、例えば血痕の付着した着衣、唾液が付着した切手などが挙げられ、また、血液を採取したろ紙や包埋試料切片などの組織標本なども挙げられる。本発明は特に、毛髪、爪、皮膚、口腔粘膜、血液（血痕）等を試料として用いる個人識別において好ましく用いられる。また本発明は、含まれるＤＮＡ量が極微量であったり、断片化していたりする試料から個人識別を行う場合に特に有効である。このような試料としては、例えば、毛根鞘がない毛幹部のみの毛髪試料などが挙げられる。 Samples used for personal identification in the present invention include human body-derived samples and objects containing human body-derived samples. Examples of the human body-derived sample include body fluids, tissues, and cells derived therefrom. Examples of the body fluid include blood, saliva and semen. Examples of the tissue include hair, bone, teeth, nails, skin, and oral mucosa. Further, examples of the object including the human body-derived sample include clothes with blood stains, stamps with saliva attached, and tissue samples such as filter paper from which blood is collected and embedded sample sections. In particular, the present invention is preferably used in personal identification using hair, nails, skin, oral mucosa, blood (blood stains) and the like as samples. The present invention is particularly effective when individual identification is performed from a sample in which the amount of contained DNA is extremely small or fragmented. Examples of such a sample include a hair sample having only a hair shaft portion without a root sheath.
本発明においては、上記試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いる。抽出方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。 In the present invention, genomic DNA is extracted from the sample and used. As the extraction method, a known method can be used without any particular limitation.
抽出されたゲノムＤＮＡに対しては、ゲノムＤＮＡ全体を増幅する処理を行う。このことによりゲノムＤＮＡ全体を数百万倍程度まで増幅することができる。ゲノムＤＮＡ全体の増幅法としては、GenomiPhi DNA Amplification kit（アマシャムファルマシア社製）による増幅法、ＤＯＰ(degenerate oligonucleotide primed)−ＰＣＲ法、ＰＥＰ(primer extension preamplification)−ＰＣＲ法などを用いることができる。試料のゲノムＤＮＡ全体を増幅する処理を行うことにより、試料から抽出することができるＤＮＡ量が極微量であったり、ＤＮＡの断片化が起ったりしていても、目的領域のＤＮＡ増幅が可能となる。毛髪を試料に用いた場合を例に挙げて説明すると、従来法では、試料の毛髪の洗浄・ＤＮＡの抽出を行った後にＰＣＲ処理を行っても、解析が不能となる場合がある。一方、本発明では、試料の毛髪の洗浄・ＤＮＡの抽出を行った後、ゲノムＤＮＡの増幅処理を行うため、その後のＰＣＲ反応、及びシーケンスやＳＴＲ解析などを行うことが可能になる。従って、個人識別の判定が可能となる。 The extracted genomic DNA is subjected to a process of amplifying the entire genomic DNA. As a result, the entire genomic DNA can be amplified up to several million times. As an amplification method of the entire genomic DNA, an amplification method using GenomiPhi DNA Amplification kit (manufactured by Amersham Pharmacia), a DOP (degenerate oligonucleotide primed) -PCR method, a PEP (primer extension preamplification) -PCR method, or the like can be used. By amplifying the entire genomic DNA of the sample, DNA can be amplified in the target region even if the amount of DNA that can be extracted from the sample is extremely small or DNA fragmentation occurs. It becomes. The case where hair is used as a sample will be described as an example. In the conventional method, analysis may be impossible even if PCR is performed after washing the hair of the sample and extracting DNA. On the other hand, in the present invention, since the hair of the sample is washed and the DNA is extracted, and then the genomic DNA is amplified, the subsequent PCR reaction, sequence, STR analysis, and the like can be performed. Accordingly, it is possible to determine personal identification.
次に、増幅されたゲノムＤＮＡから目的の領域、すなわち、個人識別に利用するＤＮＡの情報が存在する部位を含む領域を増幅する。このような部位としては、ＤＮＡの情報を利用する通常の個人識別の場合と同様に、個人間で多型性を示すことが知られている部位を選択することができる。このような部位は、ミトコンドリアＤＮＡや核ＤＮＡなどに存在する。 Next, a target region, that is, a region including a site where DNA information used for personal identification exists is amplified from the amplified genomic DNA. As such a site, a site known to exhibit polymorphism among individuals can be selected as in the case of ordinary personal identification using DNA information. Such a site is present in mitochondrial DNA or nuclear DNA.
ミトコンドリアＤＮＡは個人間の多型性が高いことで知られている。従って本発明においては、ミトコンドリアＤＮＡ多型の情報を利用することが好ましい。特にミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域には多くの多型が蓄積されているため、Ｄループ領域の多型情報を利用することはより好ましい。 Mitochondrial DNA is known for its high polymorphism among individuals. Therefore, in the present invention, it is preferable to use information on mitochondrial DNA polymorphism. In particular, since many polymorphisms are accumulated in the D loop region of mitochondrial DNA, it is more preferable to use the polymorphism information of the D loop region.
核ＤＮＡにおいては、ミニサテライト・マイクロサテライトの反復数が個人間で異なることが知られている。従って、ミニサテライト・マイクロサテライト多型情報から個人を識別することができる。本発明においては、マイクロサテライト多型としてＳＴＲ多型の情報を利用することが好ましい。ＳＴＲ型としては、ＴＨ０１型などが挙げられる。また、一塩基多型を必要数解析することによって個人を識別することも可能である。 In nuclear DNA, it is known that the number of repeats of minisatellite and microsatellite varies among individuals. Therefore, an individual can be identified from the minisatellite / microsatellite polymorphism information. In the present invention, it is preferable to use STR polymorphism information as the microsatellite polymorphism. Examples of the STR type include TH01 type. It is also possible to identify individuals by analyzing the required number of single nucleotide polymorphisms.
さらに本発明においては、上記多型情報を２種類以上組み合わせて利用することにより個人識別の判定の確度を高めることが好ましい。例えば、いくつかのＳＴＲ多型の情報を組み合わせて判定しても良いし、ＳＴＲ多型とミトコンドリア多型との情報を組み合わせて判定しても良い。この中でも、本発明においては、ＳＴＲ多型とミトコンドリア多型との情報を組み合わせて個人識別の判定を行うことが好ましい。 Furthermore, in the present invention, it is preferable to improve the accuracy of personal identification determination by using a combination of two or more types of polymorphic information. For example, it may be determined by combining information on several STR polymorphisms, or may be determined by combining information on STR polymorphisms and mitochondrial polymorphisms. Among these, in the present invention, it is preferable to determine personal identification by combining information on the STR polymorphism and the mitochondrial polymorphism.
上述の多型部位を含む領域を増幅する方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。例えば、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの方法を用いることができる。
増幅された領域のＤＮＡに対しては、公知の方法によって解析を行うことにより配列の解読やタイプの分類を行い、ＤＮＡ多型情報を得る。
As a method for amplifying the region containing the polymorphic site described above, a known method can be used without any particular limitation. For example, a method such as a PCR method or a LAMP method can be used.
The amplified region DNA is analyzed by a known method to decode the sequence and classify the type to obtain DNA polymorphism information.
個人識別の判定は、例えば、以下のようにして行うことができる。由来元となる特定個人を識別すべき未知試料から、上述のようにゲノムＤＮＡの増幅を行うことによってＤＮＡの情報を得る。別途、前記未知試料の由来元となる特定個人である可能性がある個人から、ＤＮＡを含む試料を採取し、同様の操作を行い、ＤＮＡの情報を得る。両方のＤＮＡの情報を照合する。照合の結果、双方が一致する場合、前記個人は前記未知試料の由来元となる特定個人であると高い確率で判定することができる。反対に一致しない場合、前記個人は前記特定個人でないと高い確率で判定することができる。なお、上述の例においては、未知試料、及び、特定個人である可能性がある個人から採取したＤＮＡを含む試料の両方に対して、ゲノムＤＮＡの増幅処理を行っているが、どちらか一方のみ、例えば回収することができるＤＮＡ量が極少ない試料に対してのみ、前記処理を行っても構わない。 The determination of personal identification can be performed as follows, for example. DNA information is obtained by amplifying genomic DNA as described above from an unknown sample that should identify a specific individual as a source of origin. Separately, a sample containing DNA is collected from an individual who may be a specific individual from which the unknown sample is derived, and the same operation is performed to obtain DNA information. The information of both DNAs is collated. As a result of the collation, if both match, it can be determined with a high probability that the individual is a specific individual from which the unknown sample is derived. On the other hand, if they do not match, it can be determined with a high probability that the individual is not the specific individual. In the above example, genomic DNA amplification processing is performed for both unknown samples and samples containing DNA collected from individuals who may be specific individuals. For example, the above-described treatment may be performed only on a sample with an extremely small amount of DNA that can be recovered.
また本発明においては、特定個人である可能性がある個人を複数選択してもよい。この場合は、複数個人から採取した試料と前記未知試料とのＤＮＡの情報をそれぞれ照合する。照合の結果、前記未知試料とＤＮＡの情報が一致する試料がある場合、一致した試料の採取元が前記特定個人であると高い確率で判定することができる。反対にＤＮＡの情報が一致する試料がない場合、前記複数個人の中に前記特定個人はいないと高い確率で判定することができる。 In the present invention, a plurality of individuals who may be specific individuals may be selected. In this case, DNA information of a sample collected from a plurality of individuals and the unknown sample are collated. As a result of the collation, when there is a sample whose DNA information matches the unknown sample, it can be determined with a high probability that the source of the matched sample is the specific individual. On the contrary, when there is no sample whose DNA information matches, it can be determined with a high probability that the specific individual is not among the plurality of individuals.
さらに、複数個人のそれぞれのＤＮＡの情報が、それぞれの個人名又は個人を特定することができる記号とともに収納されたデータベースを用いることによって個人識別することもできる。すなわち、未知試料から上述のようにゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を経ることによって得られたＤＮＡの情報と、前記データベースに収納されたＤＮＡの情報とを照合して個人を識別することができる。ここで前記記号としては、アルファベットや数字などから構成される番号や、バーコードなども含まれる。記号を用いたデータベースを用いるときは、通常、データベースとは別に、記号と個人名とを対応させたリストも共に用いる。このリストによって、記号から個人を特定することができる。 Furthermore, it is also possible to identify individuals by using a database in which information on each DNA of a plurality of individuals is stored together with a symbol that can identify each individual name or individual. That is, it is possible to identify an individual by comparing DNA information obtained by performing amplification processing on the entire genomic DNA from an unknown sample as described above with DNA information stored in the database. Here, the symbols include numbers composed of alphabets and numbers, barcodes, and the like. When a database using symbols is used, a list in which symbols and personal names are associated with each other is usually used separately from the database. With this list, an individual can be identified from the symbol.
データベースの対象となる複数個人としては、未知試料の由来元となる特定個人である可能性がある者が挙げられる。例えば、未知試料が製品又は製品の製造にかかわる設備中に混入した毛髪などの異物である場合、データベースの対象となる複数個人は、製品又は製品の製造に関わる設備中にその異物を混入させる機会のある従業員などである。 Examples of the plurality of individuals to be the target of the database include those who may be specific individuals from which the unknown sample is derived. For example, if an unknown sample is a foreign substance such as hair mixed in a product or equipment involved in the manufacture of the product, multiple individuals subject to the database have the opportunity to mix the foreign substance into the product or equipment related to the manufacture of the product. Employees who have
このようなデータベースは、例えば、以下のように作成することができる。
まず、未知試料の由来元となる特定個人である可能性がある複数個人から構成される母集団を選択する。選択された母集団の各個人について、ＤＮＡの情報を得て、記録する。
Such a database can be created as follows, for example.
First, a population composed of a plurality of individuals who may be specific individuals from which unknown samples are derived is selected. For each individual in the selected population, DNA information is obtained and recorded.
例えば、ミトコンドリアＤＮＡの多型情報について記録する場合は、以下のように記録することができる。まず、前記複数個人から採取された試料のＤＮＡ配列をそれぞれ解読する。別途、前記複数個人の以外の個人をモデル試料提供者として選択し、選択された個人から採取されたモデル試料のＤＮＡ塩基配列を解読する。モデル試料についてはそのＤＮＡ塩基配列を記録し、複数個人から採取された試料については、モデル試料のＤＮＡ塩基配列と異なる塩基を有する部位の塩基のみを記録することができる。このとき、前記母集団の各個人の名前又は各個人を特定することができる記号とともにそれぞれの多型情報を記録する。 For example, when recording polymorphism information of mitochondrial DNA, it can be recorded as follows. First, the DNA sequences of the samples collected from the plurality of individuals are each decoded. Separately, an individual other than the plurality of individuals is selected as a model sample provider, and the DNA base sequence of the model sample collected from the selected individual is decoded. The DNA base sequence can be recorded for a model sample, and only the bases of sites having different bases from the DNA base sequence of the model sample can be recorded for samples collected from a plurality of individuals. At this time, each polymorphic information is recorded together with a name of each individual of the population or a symbol that can identify each individual.
また例えば、ＳＴＲ多型情報について記録する場合は、以下のように記録することができる。すなわち、前記母集団の各個人から採取された試料について多型のタイプを特定し、各個人の名前または各個人を特定することができる記号とともに、特定されたそれぞれの多型のタイプを記録することができる。 For example, when recording about STR polymorphism information, it can record as follows. That is, the type of polymorphism is specified for the sample collected from each individual of the population, and each identified polymorphic type is recorded together with the name of each individual or a symbol that can identify each individual. be able to.
上記のように記録されたものを、データベースとして利用することができる。前記未知試料のＤＮＡの情報とデータベース中のＤＮＡの情報とを照合した結果、前記未知試料とＤＮＡの情報が一致する試料がある場合、一致した試料の採取元が前記特定個人であると高い確率で判定することができる。反対にＤＮＡの情報が一致する試料がデータベース中にない場合、前記母集団の中に前記特定個人はいないと高い確率で判定することができる。 What was recorded as described above can be used as a database. As a result of comparing the DNA information of the unknown sample with the DNA information in the database, if there is a sample whose DNA information matches the unknown sample, there is a high probability that the source of the matched sample is the specific individual Can be determined. Conversely, if there is no sample in the database that matches the DNA information, it can be determined with a high probability that the specific individual is not in the population.
以下、さらに具体的な例を挙げて本発明を説明する。
［毛幹部からのゲノムＤＮＡの抽出］
成人５名にＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧのそれぞれの検体記号を付し、検査試料として頭毛の毛幹部６cmをそれぞれ採取した。それぞれの検査試料をエタノールで洗浄、乾燥した後、０．５〜１cmに細切した。市販の抽出キット「ＩＳＯＨＡＩＲ」（日本ジーン製）を使用し、キットに添付された説明書のプロトコルに従ってそれぞれの試料からＤＮＡの抽出を行った。
Hereinafter, the present invention will be described with further specific examples.
[Extraction of genomic DNA from hair shaft]
Five adults were given the specimen symbols A, B, D, F and G, respectively, and 6 cm of hair shafts were collected as test samples. Each test sample was washed with ethanol and dried, and then cut into 0.5 to 1 cm. Using a commercially available extraction kit “ISOHAIR” (manufactured by Nippon Gene), DNA was extracted from each sample according to the protocol of the instructions attached to the kit.
［ゲノムＤＮＡの増幅］
抽出したＤＮＡから１μlを用いて、ゲノムＤＮＡの増幅を行った。このとき、市販の抽出キット「GenomiPhi DNA Amplification kit」（アマシャムファルマシア社製）を使用し、キットに添付された説明書のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡの増幅を行った。３０℃での増幅反応は、１６時間行った。ここで、ゲノムＤＮＡ増幅を行う前のゲノムＤＮＡと、ゲノム増幅を行った後のゲノムＤＮＡとについて、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図１に示す。ここで、＋は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行った試料を表し、−は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行う前の試料を表す。図１が示すように、明らかな増幅が観察された。
[Amplification of genomic DNA]
Genomic DNA was amplified using 1 μl of the extracted DNA. At this time, a commercially available extraction kit “GenomiPhi DNA Amplification kit” (manufactured by Amersham Pharmacia) was used, and genomic DNA was amplified according to the protocol of the instructions attached to the kit. The amplification reaction at 30 ° C. was performed for 16 hours. Here, agarose gel electrophoresis was performed on genomic DNA before genomic DNA amplification and genomic DNA after genomic amplification. The result is shown in FIG. Here, + represents a sample subjected to genomic DNA amplification processing, and − represents a sample before genomic DNA amplification processing. As FIG. 1 shows, a clear amplification was observed.
［目的領域の核酸増幅］
目的とする増幅領域を、ＳＴＲ領域及びミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域とした。
ＳＴＲ解析用の蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーを用意した。これは、ＳＴＲ領域としてＴＨ０１領域の１５４〜１７８ｂｐを増幅するものを選択し、プライマーセットの配列をＤＮＡ多型Vol6 264-267より入手した。フォワードプライマーについては、ＴＡＭＲＡ蛍光標識を行った。以下に、用いたプライマーの配列を示す。
フォワードプライマー GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT （配列番号１）
リバースプライマー GTGATTCCCATTGGCCTGTTCCTC （配列番号２）
[Nucleic acid amplification of target region]
The target amplification region was defined as the STR region and the D-loop region of mitochondrial DNA.
Fluorescently labeled oligonucleotide primers for STR analysis were prepared. For this, a STR region that amplifies 154 to 178 bp of the TH01 region was selected, and the primer set sequence was obtained from DNA polymorphism Vol6 264-267. For the forward primer, TAMRA fluorescent labeling was performed. The primer sequences used are shown below.
Forward primer GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer GTGATTCCCATTGGCCTGTTCCTC (SEQ ID NO: 2)
ミトコンドリアＤＮＡのＤループ解析用のオリゴヌクレオチドプライマーを用意した。これは、Ｄループ領域の中でも多型の多い１５９７８〜３８ｂｐの６２９ｂｐを増幅するものを選択した。以下に、用いたプライマーの配列を示す。
フォワードプライマー ACCATTAGCACCCAAAGCTA （配列番号３）
リバースプライマー GAGGGCACTCACCAATTATCC （配列番号４）
Oligonucleotide primers for D-loop analysis of mitochondrial DNA were prepared. This selected the thing which amplifies 629 bp of 15978-38 bp with many polymorphisms among D loop area | regions. The primer sequences used are shown below.
Forward primer ACCATTAGCACCCAAAGCTA (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer GAGGGCACTCACCAATTATCC (SEQ ID NO: 4)
上記プライマーを用いて、各領域のＰＣＲ増幅を下記の方法で行った。増幅したＤＮＡを１〜１０6倍まで１０倍ずつ段階希釈を行ったものを１μlずつ反応に用いた。上記各プライマーを３pmolずつ、各ヌクレオチド３リン酸（dNTP）を１０nmolずつ、１０× Ex Taq bufferを１μl、ET Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を０．３unit加え、全液量を１０μlとしてＰＣＲ反応を行った。 PCR amplification of each region was performed by the following method using the above primers. Amplified DNA was serially diluted 10 to 10 times to 1 to 10 6 times, and 1 μl was used for the reaction. PCR reaction was performed with 3 pmol of each primer, 10 nmol of each nucleotide triphosphate (dNTP), 1 μl of 10 × Ex Taq buffer, 0.3 unit of ET Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), and a total volume of 10 μl. went.
ＰＣＲ反応の条件は、最初の変性条件のみ９５℃で２分間、その後は、それぞれ次の条件下で増幅反応を行った。変性条件が９５℃で３０秒間、アニーリングは５８℃で３０秒間、伸長反応は７２℃で４５秒間のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で８分間の伸長反応を行い、目的のＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応の確認は、２〜５μlのＰＣＲ産物を２％アガロースで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、増幅産物のバンドを確認した。この結果、Ｄループ領域のＰＣＲ増幅産物で１０5倍、ＴＨ０１領域のＰＣＲ増幅産物で１０3倍希釈した試料においてＰＣＲ産物のバンドが確認できた。 The PCR reaction was carried out under the first denaturing condition only at 95 ° C. for 2 minutes, and thereafter under the following conditions. The denaturation conditions were 95 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 45 seconds repeated 40 times. Finally, extension reaction was carried out at 72 ° C for 8 minutes to obtain the desired PCR product. Obtained. For confirmation of the PCR reaction, 2 to 5 μl of the PCR product was electrophoresed with 2% agarose and stained with ethidium bromide to confirm the band of the amplified product. As a result, a band of the PCR product was confirmed in the sample diluted 10 5 times with the PCR amplification product in the D loop region and 10 3 times with the PCR amplification product in the TH01 region.
［ゲノムＤＮＡ増幅の効果の検証］
また別途、ゲノムＤＮＡ増幅を行う前の抽出ＤＮＡ１μlについても上記プライマーを用いて各領域のＰＣＲ増幅処理を行った。ゲノムＤＮＡ増幅を行った後にＰＣＲ増幅した試料と、ゲノム増幅を行わずにＰＣＲ増幅した試料とのアガロースゲル電気泳動の結果を図２の（ａ）及び（ｂ）に示す。図２の（ａ）は、ミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域のＰＣＲ増幅結果である。図２の（ｂ）は、ＴＨ０１領域のＰＣＲ増幅結果である。両方の図において、＋は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行った試料を表し、−は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行わなかった試料を表す。両方の図が示すように、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行なわかった試料はＰＣＲ増幅が認められないが、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行った試料はＰＣＲ増幅が認められた。
[Verification of genomic DNA amplification effect]
Separately, 1 μl of the extracted DNA before genomic DNA amplification was subjected to PCR amplification treatment of each region using the above primers. The results of agarose gel electrophoresis of a sample amplified by PCR after genomic DNA amplification and a sample amplified by PCR without genomic amplification are shown in FIGS. FIG. 2 (a) shows the PCR amplification result of the D loop region of mitochondrial DNA. FIG. 2B shows the PCR amplification result of the TH01 region. In both figures, + represents a sample subjected to genomic DNA amplification treatment, and − represents a sample not subjected to genomic DNA amplification treatment. As shown in both figures, PCR amplification was not observed in the sample that was not subjected to genomic DNA amplification treatment, but PCR amplification was observed in the sample that was subjected to genomic DNA amplification treatment.
［解析結果］
ＴＨ０１領域のＰＣＲ産物については、さらに１０倍に希釈した後、RISA 384 sequencer（島津製作所製）を用いて電気泳動し、蛍光を検出することで多型のバンドを確認し、ＴＨ０１型を判定した。この結果を図３に示す。図３が示すように、全ての検体において明瞭なバンドの分離が認められた。これらの泳動パターンから、５検体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧは、ＡＡ、ＢＤ及びＡＤの３種類のタイプに分類することができた。
[Analysis result]
The TH01 region PCR product was further diluted 10-fold, then electrophoresed using a RISA 384 sequencer (manufactured by Shimadzu Corporation), and a polymorphic band was confirmed by detecting fluorescence to determine TH01 type. . The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, clear band separation was observed in all specimens. From these electrophoretic patterns, the five specimens A, B, D, F and G could be classified into three types of AA, BD and AD.
ミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域のＰＣＲ産物については、オートシークエンサーを用いたダイレクトシーケンス法により塩基配列を解析した。すなわちＰＣＲ産物からプライマー除去キット（EXO-SAP、アマシャムファルマシア社製）を用いてプライマーを除き、Thermo Sequenase cycle sequencing kit（アマシャムファルマシア社製）によってサイクルシーケンシング反応を行い、RISA 384 sequencer（島津製作所製）で電気泳動して塩基配列を決定した。また、別途、５検体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧ以外の個人からモデル試料として頭毛の毛幹部を採取し、５検体から採取した試料に対して行った処理と同様の処理を行うことによって、ミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域のＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。 Regarding the PCR product in the D-loop region of mitochondrial DNA, the base sequence was analyzed by the direct sequence method using an autosequencer. In other words, the primer was removed from the PCR product using a primer removal kit (EXO-SAP, manufactured by Amersham Pharmacia), a cycle sequencing reaction was performed using Thermo Sequenase cycle sequencing kit (Amersham Pharmacia), and RISA 384 sequencer (Shimadzu) ) And the base sequence was determined. Separately, the hair shaft of the head hair is collected as a model sample from individuals other than the five specimens A, B, D, F, and G, and the same processing as that performed on the samples collected from the five specimens is performed. Was used to determine the base sequence of the PCR product in the D-loop region of mitochondrial DNA.
表１に、モデル試料（sample）の塩基配列及び５検体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧから採取した試料の１５９７８〜３８ｂｐの塩基配列中、多型が認められた１５の部位（１６１２９、１６１３７、１６１４７、１６１４９、１６１５９、１６１８４、１６１９４、１６２４５、１６２７５、１６２８２、１６２９５、１６２９６、１６２９８、１６３３３、及び１６４９０番目のポジション）を表した。モデル試料については、１５の部位全てを具体的にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣで表した。５検体から採取した試料については、便宜的に、モデル試料の多型部位の塩基と異なる塩基のみを具体的にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣで表し、モデル試料の多型部位の塩基と同じ塩基は＊で表している。さらに表１には、前述のようにして得られた５検体のＴＨ０１型（TH01 type）も記載した。表１が示すように、５検体の全てにおいて異なるハプロタイプが判定した。 Table 15 shows 15 sites (16129, 16137) in which polymorphisms were found in the base sequence of the model sample (sample) and 15978-38 bp of the base sequence of the samples collected from 5 specimens A, B, D, F and G. , 16147, 16149, 16159, 16184, 16194, 16245, 16275, 16282, 16295, 16296, 16298, 16333, and 16490th position). For the model sample, all 15 sites were specifically represented by A, T, G or C. For samples collected from 5 specimens, for convenience, only the base different from the polymorphic site base of the model sample is specifically represented by A, T, G or C, and the same base as the polymorphic site base of the model sample Is represented by *. Further, Table 1 also shows five TH01 types obtained as described above. As Table 1 shows, different haplotypes were determined in all 5 samples.
従って、表１は、個人識別のためのデータベースとして利用することができる。すなわち、未知試料から、上述のようにゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を経て得られたＤＮＡの情報と、表１のデータベースとを照合し、ＤＮＡの情報が一致するかどうかを調べる。例えば、未知試料について個人ＡとＤＮＡの情報が一致した場合、未知試料の由来元は個人Ａであると高い確率で判定することができる。反対に、未知試料について表１中にＤＮＡの情報が一致するものがない場合、未知試料の由来元は個人Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧのいずれでもないと高い確率で判定することができる。 Therefore, Table 1 can be used as a database for personal identification. That is, the DNA information obtained from the unknown sample through the amplification process of the entire genomic DNA as described above is compared with the database in Table 1 to check whether the DNA information matches. For example, when the information of the individual A and DNA matches for an unknown sample, it can be determined with high probability that the source of the unknown sample is the individual A. On the other hand, if there is no DNA information in Table 1 that matches the unknown sample, it can be determined with a high probability that the source of the unknown sample is not an individual A, B, D, F, or G. .
Claims (5)
識別すべき特定個人のＤＮＡを含有する試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を得て、
前記データベースに収納された前記複数個人のＤＮＡの情報と、前記特定個人のＤＮＡの情報とを照合し、前記特定個人を識別する、個人識別法。 Preparing a database in which DNA information of a plurality of individuals is stored together with the names of the plurality of individuals or symbols capable of specifying the plurality of individuals;
The genomic DNA extracted from the sample containing the DNA of a specific individual to be identified is subjected to amplification processing of the entire genomic DNA, and then the information on the DNA is obtained.
A personal identification method in which the DNA information of the plurality of individuals stored in the database is compared with the DNA information of the specific individuals to identify the specific individuals.
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