RU2526499C1 - SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF ROSEROOT (Rhodiola quadrifida (Pall) Fisch et Mey) - Google Patents
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF ROSEROOT (Rhodiola quadrifida (Pall) Fisch et Mey) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2526499C1 RU2526499C1 RU2013126650/10A RU2013126650A RU2526499C1 RU 2526499 C1 RU2526499 C1 RU 2526499C1 RU 2013126650/10 A RU2013126650/10 A RU 2013126650/10A RU 2013126650 A RU2013126650 A RU 2013126650A RU 2526499 C1 RU2526499 C1 RU 2526499C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- species
- mey
- fisch
- pall
- rhodiola
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.). Изобретение может быть использовано для выявления видовой принадлежности данного растения; в ходе проведения скрининга растительного сырья, для контроля на соответствие состава, декларированного производителем.The invention relates to the field of molecular genetics, genosystematics and pharmacognosy. The use of a set of synthetic oligonucleotides allows one to reliably identify the species of a medicinal plant, Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. Et Mey.). The invention can be used to identify the species of this plant; during the screening of plant materials, to control the compliance of the composition declared by the manufacturer.
Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида растений в образце, в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля.Among a large number of genetic diagnostic methods in order to identify the presence of DNA of a plant species of interest in a sample, the PCR format with real-time detection based on a destructible probe was adopted as the basis of our invention. Real-time PCR has an advantage over conventional PCR identification systems - there is no need for further analysis, which minimizes the risk of contamination in the laboratory. Hypersensitivity and the absence of a false positive result with non-specific annealing of primers are also characteristic. In addition, it should be noted that virtually all molecular genetic diagnostic laboratories are equipped with the equipment necessary for real-time PCR testing and the widespread use of the method in clinical diagnostics and state control bodies.
При проведении анализа методов детекции продукта полимеразной цепной реакции выбран метод на основе разрушаемого зонда, так как он относится к специфичным методам детекции, возможно свободное использование без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).When analyzing the methods for detecting the product of the polymerase chain reaction, a method based on a destructible probe was chosen, since it relates to specific detection methods, free use is possible without violating copyright and related rights (initially, the system of destructible probe was proposed in 1991, with all patents for this moment ended their action).
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей ядерной ДНК растений. В качестве видоспецифичных участков нами используется ITS2 фрагмент ядерной ДНК (internal transcribed spacer 2), обладающий большой копийностью в геноме [Alvarez, I. & Wendel, J.F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434], и используемый в проектировании системы ДНК-баркодинга. В этом регионе показана высокая вариабельность и потенциальная применимость в качестве маркерного участка [Stoeckle, М. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53,2-3].The technical result of the claimed invention is the development of primers and destructible probes based on data of species-specific nucleotide sequences of plant nuclear DNA. As species-specific sites, we use the ITS2 fragment of nuclear DNA (internal transcribed spacer 2), which has a large copy number in the genome [Alvarez, I. & Wendel, J.F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434], and used in the design of a DNA barcoding system. This region shows high variability and potential applicability as a marker site [Stoeckle, M. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53,2-3].
Прототип - рассмотрим идентификацию лекарственных растений с использованием фрагмента ITS2, амплифицированного специфичными праймерами [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers/ZPlanta Med. 2007, Oct; 73(13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. В прототипе используются специфичные наборы праймеров BEL-1/BEL-3 и BEL-2/BEL-3 для амплификации ITS2 участка рДНК 55 лекарственных растений.Prototype - consider identification of medicinal plants using the ITS2 fragment amplified with specific primers [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers / ZPlanta Med. 2007, Oct; 73 (13): 1421-6. Epub 2007 Oct 1]. The prototype uses specific sets of primers BEL-1 / BEL-3 and BEL-2 / BEL-3 to amplify the ITS2 region of the 55 rDNA of 55 medicinal plants.
Принципиальные отличия прототипа от заявленного изобретения следующие: идентифицируется лекарственное растение с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров отличные от заявленных. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.), включающий проведение полимеразной цепной реакции с фрагментом ITS2 ядерной ДНК, где для идентификации данного растения используют специфичные прямой, обратный праймеры и разрушаемый зонд.The fundamental differences of the prototype from the claimed invention are as follows: a medicinal plant with nucleotide sequences of specific primers other than declared is identified. A set of synthetic oligonucleotides for identifying the species of a medicinal plant, Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. Et Mey.), Including a polymerase chain reaction with a fragment of ITS2 nuclear DNA, where specific direct, reverse primers and destructible are used to identify this plant probe.
Работа над созданием праймеров строится следующим образом.Work on the creation of primers is constructed as follows.
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов растений либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности растений выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.1) Using open and commercial databases of nucleotide sequences of various plant species or as a result of independent determination of the nucleotide sequence of plants, a portion of the genome that is found in all species is selected.
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для растений участков.2) Based on the selected region of the genome, using the special software or manually selects the sequence of oligonucleotides used for the PCR reaction (2 primers and probe). At this stage, the work consists in creating the alignment of many sequences and selecting a portion of the sequence where differences are present to create forward, reverse primers and probe. Alignment of genomic sequences means comparing the sequences of many species with each other, searching for sites homologous to plants.
3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.3) The manufacture of primers and probe is made on automatic synthesizers.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.4) Using practical experiments, the suitability of the selected sequences for specific purposes is proved.
Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности ITS2 на основании данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland Р М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.//Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 August 15; 88(16): 7276-7280).Analysis of the nucleotide polymorphism of the ITS2 sequence based on the NCBI data (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and de novo sequenced sequences of species that are not located in the genebank allows us to use these sequences as the basis for creating primers. For the detection of the accumulation of the PCR product during the reaction, a destructible probe technology is used (Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3 'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase .//Proc Natl Acad Sci US A. 1991 August 15; 88 (16): 7276-7280).
В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей и это не является предметом охраны авторских прав).For example, FAM is used as a fluorescent label, as a BHQ1 quencher (other combinations of fluorophores and quenchers are possible and this is not subject to copyright).
Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) не известны.Similar kits, reaction mixtures, primers for amplification and identification of species of Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. Et Mey.) Are not known.
Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.The progress using a set of synthetic oligonucleotides for amplification consists of the following steps.
Пример:Example:
1) Растительный материал перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из растительного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.1) Plant material before PCR using the inventive kit is carried out through a sample preparation procedure using the Diamont DNA kit, in accordance with the manufacturer's instructions; during this procedure, DNA is extracted from the plant material, which in turn is used for PCR.
2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 3 мин; 40 циклов: 95°С - 10 сек, 58°С - 30 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь конечным объемом 25 мкл содержит: 14,1 мкл Н2O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgCl2; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции, рис.1.2) The polymerase chain reaction is carried out on a CFX96 thermocycler (Bio-Rad, USA). Amplification is carried out according to the following program: 1 cycle: 95 ° C - 3 min; 40 cycles: 95 ° С - 10 sec, 58 ° С - 30 sec (at this stage, the fluorescence level is scanned). The incubation mixture with a final volume of 25 μl contains: 14.1 μl of H 2 O; 2 μl of DNA; 2.5 μl of 10X buffer; 2.5 μl 25 mM MgCl 2 ; 1 μl of 10 mm each primer; 0.5 μl of probe; 1.2 μl of 20 mM dNTPs; 0.2 μl of Taq polymerase. The amplification result is determined by the increase in the fluorescence level, Fig. 1.
Для выявления родиолы четырехнадрезной {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.), в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CGGCAACGGATATCTCGGCT-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GGCCTCGCAACCACCACTTGTC-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3'-(гаситель). Гаситель располагается и на 5'-конце, а флуоресцентная метка на 3'-конце разрушаемых зондов. Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - родиолы четырехнадрезной (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) методом полимеразной цепной реакцией с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющий быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренного лекарственного растения.To identify the Rhodiola four-notched {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.), a DNA sequence with the following nucleotide composition is used as a direct primer: 5'-CGGCAACGGATATCTCGGCT-3 ', a DNA sequence with the following nucleotide composition is used as a reverse primer: 5'-GGCCTCGCAACCACCACTTGTC-3', a destructible probe is used DNA sequence with the following nucleotide composition: (fluorescent label) -5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3 '- (quencher). The quencher is located at the 5'-end, and the fluorescent label at the 3'-end of the destroyed probes. A set of synthetic oligonucleotides has been developed for identifying the species of a medicinal plant - Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. Et Mey.) By real-time polymerase chain reaction detection. The kit has high sensitivity and specificity, allowing you to quickly and reliably identify the considered medicinal plant.
Claims (1)
в качестве прямого праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CGGCAACGGATATCTCGGCT-3',
в качестве обратного праймера - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-GGCCTCGCААССАССACTTGTC-3',
в качестве разрушаемого зонда - последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3'-(гаситель). A set of synthetic oligonucleotides for identifying the species of Rhodiola quadrifida {Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey), including carrying out a polymerase chain reaction with a fragment of ITS2 nuclear DNA, characterized in that for the detection of four-notched Rhodiola (Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.) use species-specific sites to create direct, reverse primers and destructible probe:
as a direct primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition: 5'-CGGCAACGGATATCTCGGCT-3 ',
as a reverse primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition: 5'-GGCCTCGCAACCASSACTACTTGTC-3 ',
as a destructible probe, a DNA sequence with the following nucleotide composition: (fluorescent label) -5'-CCGTGAACCATCGAGTTTTT-3 '- (quencher).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013126650/10A RU2526499C1 (en) | 2013-06-10 | 2013-06-10 | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF ROSEROOT (Rhodiola quadrifida (Pall) Fisch et Mey) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013126650/10A RU2526499C1 (en) | 2013-06-10 | 2013-06-10 | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF ROSEROOT (Rhodiola quadrifida (Pall) Fisch et Mey) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2526499C1 true RU2526499C1 (en) | 2014-08-20 |
Family
ID=51384875
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013126650/10A RU2526499C1 (en) | 2013-06-10 | 2013-06-10 | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF ROSEROOT (Rhodiola quadrifida (Pall) Fisch et Mey) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2526499C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107653339A (en) * | 2017-11-21 | 2018-02-02 | 刘志伟 | For identifying the special primer and authentication method of Tibet Langkazi area rhodiola |
-
2013
- 2013-06-10 RU RU2013126650/10A patent/RU2526499C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHIOU S.J. ET AL., Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers, Planta Med, 2007, v.73, no.13, p. 1421-1426. ALVAREZ I. ET Al., Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference, Mol Phylogenet Evol, 2003, v.29, no.3, p. 417-434. HOLLAND P.M. ET AL., Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase, Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, v.88, no.16, p. 7276-7280 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107653339A (en) * | 2017-11-21 | 2018-02-02 | 刘志伟 | For identifying the special primer and authentication method of Tibet Langkazi area rhodiola |
CN107653339B (en) * | 2017-11-21 | 2021-06-22 | 刘志伟 | Specific primer and identification method for identifying rhodiola crenulata in Tibet wave checkpost region |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Aslam et al. | Recent advances in molecular techniques for the identification of phytopathogenic fungi–a mini review | |
Farrington et al. | Mitochondrial genome sequencing and development of genetic markers for the detection of DNA of invasive bighead and silver carp (Hypophthalmichthys nobilis and H. molitrix) in environmental water samples from the United States | |
CN102337345B (en) | Medicolegal composite assay kit based on twenty triallelic SNP (single nucleotide polymorphism) genetic markers | |
CN101611155B (en) | Diagnostic sequences for shrimp pathogens | |
KR20110106922A (en) | Single-cell nucleic acid analysis | |
US20210246499A1 (en) | Detection of short homopolymeric repeats | |
Adamek et al. | Comparison of PCR methods for the detection of genetic variants of carp edema virus | |
CN107988427A (en) | Prawn hepatopancreatic parvovirus(HPV)RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent | |
Badali et al. | Molecular tools in medical mycology; where we are! | |
RU2573937C1 (en) | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF BUPLEURUM MULTINERVE (Bupleurum multinerve DC) | |
Niu et al. | Highly sensitive detection method for HV69-70del in SARS-CoV-2 alpha and omicron variants based on CRISPR/Cas13a | |
Erster et al. | High-resolution melting (HRM) for genotyping bovine ephemeral fever virus (BEFV) | |
RU2526499C1 (en) | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF ROSEROOT (Rhodiola quadrifida (Pall) Fisch et Mey) | |
CN116479093A (en) | Rhinoceros nucleic acid rapid detection method and detection kit based on CRISPR fluorescence method | |
RU2535060C1 (en) | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF JAPANESE ANGELICA TREE (Aralia elata (Miq.) Seem.) | |
CN107937617A (en) | Detect the RT LAMP primer compositions thing and its kit and method of Sai Neijia paddy viruses | |
RU2549453C2 (en) | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR IDENTIFICATION OF SPECIES AFFILIATION OF COMMON HEATHER (Calluna vulgaris (L.) Hull.) | |
RU2535063C1 (en) | KIT OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR IDENTIFYING SPECIES OF COTTON WEED (Filaginella uliginosa (L) Opiz) | |
RU2535064C1 (en) | SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF SPINY ELEUTEROCOCUS, ELEUTHEROCOCCUS (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.) | |
CN107400722B (en) | Competitive real-time fluorescent PCR SNP probe for detecting human genome | |
KR101346261B1 (en) | Sets of primers and TaqMan MGB probes for real-time PCR-based assays to discriminate ginseng cultivars | |
JP6468555B2 (en) | Detection kit and detection method | |
RU2791958C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 MUTATION S:N501Y | |
RU2795016C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTION OF MUTATION S:delVYY143-145 OF SARS-CoV-2 | |
KR20170092216A (en) | Kit and Method of identifying Mycobacterium abscessus strains based on amplification of hsp65 gene |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180611 |