JP2005065565A - Modified enzyme - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼを改変した改変酵素に関する。 The present invention relates to a modified enzyme obtained by modifying chondroitin polymerase derived from E. coli.
まず初めに、本明細書中で使用する略号の説明を行う。
GlcUA：グルクロン酸
GalNAc：N-アセチルガラクトサミン
UDP：ウリジン二リン酸
なお、本明細書における糖の鏡像異性体は、特記しない限り全てD体を示す。また、糖鎖を表す式中、数字はグリコシド結合が存在する炭素位置を示し、α及びβは1位グリコシド結合のアノマーを示す。
First, abbreviations used in this specification will be described.
GlcUA: Glucuronic acid
GalNAc: N-acetylgalactosamine
UDP: uridine diphosphate In addition, unless otherwise specified, the enantiomers of sugars in this specification all indicate the D form. In the formula representing a sugar chain, the number indicates the carbon position where the glycosidic bond exists, and α and β indicate the anomers of the 1-position glycosidic bond.
大腸菌K4株（Escherichia coli Serotype O5:K4(L):H4, ATCC23502）由来のコンドロイチンポリメラーゼ（以下、「本基本酵素」という）は、大腸菌K4株特有の莢膜多糖体（K4抗原）を合成する酵素の１つであり、K4抗原の主鎖である二糖繰り返し構造、コンドロイチン骨格（GlcUAβ1-3GalNAcβ1-4）ｎを合成する酵素である。すなわち、UDP-GlcUAおよびUDP-GalNAcを供与体として用いて、コンドロイチン骨格を持つ糖鎖の非還元末端に各々の供与体から交互に、GlcUAをβ1-3結合でGalNAc残基に、GalNAcをβ1-4結合でGlcUA残基に転移させ、糖鎖を伸長させていく二つの糖転移酵素活性を持つポリメラーゼである（非特許文献１）。非特許文献１には、更に本基本酵素の酵素活性を有するドメインは153-258番目及び435-539番目のアミノ酸配列中の位置に存在する旨が記載されている。同様なコンドロイチン骨格の合成酵素の一種にPasteurella multocida菌株由来のコンドロイチン合成酵素がある（非特許文献２）。また、最近ヒトを始め動物由来のコンドロイチン合成関連酵素遺伝子がいくつか見つかってきている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。しかしそれらは、本基本酵素と異なり、一方の糖転移活性だけしか持たないか、両糖転移活性があってもその組換えタンパク質ではポリメラーゼ活性は示さないと言われている（非特許文献３）。 Chondroitin polymerase derived from Escherichia coli Serotype O5: K4 (L): H4, ATCC23502 (hereinafter referred to as “the basic enzyme”) synthesizes a capsular polysaccharide (K4 antigen) unique to E. coli K4. It is an enzyme that synthesizes the disaccharide repeating structure, chondroitin skeleton (GlcUAβ1-3GalNAcβ1-4) n , which is the main chain of the K4 antigen. That is, using UDP-GlcUA and UDP-GalNAc as donors, alternately from each donor to the non-reducing end of a sugar chain having a chondroitin skeleton, GlcUA is β1-3 linked to a GalNAc residue, and GalNAc is β1 It is a polymerase having two glycosyltransferase activities that transfer to a GlcUA residue by -4 linkage and extend a sugar chain (Non-patent Document 1). Non-Patent Document 1 further describes that the domain having the enzyme activity of this basic enzyme exists at positions in the 153-258th and 435-539th amino acid sequences. A similar chondroitin skeleton synthase is chondroitin synthase derived from Pasteurella multocida strain (Non-patent Document 2). Recently, several chondroitin synthesis-related enzyme genes derived from animals including humans have been found (Non-patent Document 3, Non-patent Document 4, Non-patent Document 5). However, unlike the basic enzyme, they have only one transglycosylation activity, or even if they have both transglycosylation activities, the recombinant protein is said not to exhibit polymerase activity (Non-patent Document 3). .
コンドロイチン・コンドロイチン硫酸は、グリコサミノグリカンの一種であるが、同様にグリコサミノグリカンの一種であるヒアルロン酸を合成する酵素について、その活性部位を改変した改変酵素が知られている（非特許文献６）。 Chondroitin / chondroitin sulfate is a type of glycosaminoglycan, and similarly, an enzyme that synthesizes hyaluronic acid, which is a type of glycosaminoglycan, is known to be modified by modifying its active site (non-patented). Reference 6).
このように、本基本酵素は２つの糖転移酵素活性により、コンドロイチン糖鎖骨格（GlcUAとGalNAcとがβ1,3グリコシド結合した二糖がβ1,4グリコシド結合で連なってなる糖鎖骨格）を伸長させ高分子コンドロイチン糖鎖を合成するのに適した優れた酵素であるが、その２つの糖転移酵素活性がどの様に調整されているか、最初の糖転移を受ける受容体基質は何か、動物由来のコンドロイチン合成関連酵素群との関連性など、未だ不明であるため、それを解析する材料が望まれていた。 In this way, this basic enzyme extends the chondroitin sugar chain skeleton (a sugar chain skeleton in which GlcUA and GalNAc are linked by β1,3 glycoside bonds through β1,4 glycoside bonds) by two glycosyltransferase activities. It is an excellent enzyme suitable for synthesizing high-molecular chondroitin sugar chains, but how the two glycosyltransferase activities are regulated, what is the receptor substrate that undergoes the first glycosyltransferase, animal Since the relevance to the derived chondroitin synthesis-related enzyme group is still unclear, a material for analyzing it has been desired.
本発明者はこれら不明な点を解明し、あわせて遺伝子工学的にアミノ酸を置換することで本基本酵素の両糖転移酵素活性を分離し、各種コンドロイチン関連オリゴ糖を調製して糖鎖構造による酵素反応性を明確にし、基質特異性を解析するために検討を行った。その結果、本基本酵素の二つの領域を改変することで、その酵素活性が制御された改変酵素が生ずることを見い出し、本発明を完成させた。 The present inventor has clarified these unclear points, and also separated both glycosyltransferase activities of the basic enzyme by substituting amino acids by genetic engineering, and prepared various chondroitin-related oligosaccharides to determine the sugar chain structure. Studies were conducted to clarify enzyme reactivity and to analyze substrate specificity. As a result, it was found that a modified enzyme having a controlled enzyme activity was produced by modifying two regions of the basic enzyme, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） アミノ酸番号153〜258又は435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改変酵素。
（２） 下記の（ａ）及び（ｂ）記載の性質を有することを特徴とする（１）記載の改変酵素。
（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ａ）及び（ｂ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
（３） アミノ酸番号153〜258の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする（１）又は（２）記載の改変酵素。
（４） アミノ酸番号239〜241の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有することを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の改変酵素。
（５） 241番目のアミノ酸が置換されていることを特徴とする（１）〜（４）いずれか記載の改変酵素。
（６） 下記の（ｃ）及び（ｄ）記載の性質を有することを特徴とする（１）記載の改変酵素。
（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ｃ）及び（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
（７） アミノ酸番号435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする（１）又は（６）記載の改変酵素。
（８） アミノ酸番号519〜521の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有することを特徴とする（１）、（６）及び（７）いずれか記載の改変酵素。
（９） 521番目のアミノ酸が置換されていることを特徴とする（１）及び（６）〜（８）いずれか記載の改変酵素。
（１０） （１）〜（９）いずれか記載の改変酵素をコードする遺伝子を発現するように構築された、発現ベクター。
（１１） （１０）記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる組換体。
（１２） （１１）記載の組換体を生育させ、組換体の生育物に改変酵素を蓄積させることを特徴とする、改変酵素の製造方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A modified enzyme comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 having 1 to several amino acid substitutions within the range of amino acid numbers 153 to 258 or 435 to 539.
(2) The modified enzyme according to (1), which has the following properties (a) and (b):
(A) Transfer GlcUA from the GlcUA donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(B) It has substantially no function of transferring GalNAc from the GalNAc donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(In the above (a) and (b), GlcUA represents D-glucuronic acid, and GalNAc represents N-acetyl-D-galactosamine)
(3) The modified enzyme according to (1) or (2), comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 having 1 to several amino acid substitutions within the range of amino acid numbers 153 to 258.
(4) The modified enzyme according to any one of (1) to (3), which has 1 to several amino acid substitutions within the range of amino acid numbers 239 to 241.
(5) The modified enzyme according to any one of (1) to (4), wherein the 241st amino acid is substituted.
(6) The modified enzyme according to (1), which has the following properties (c) and (d):
(C) Transfer of GalNAc from the GalNAc donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(D) It has substantially no function of transferring GlcUA from the GlcUA donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(In the above (c) and (d), GlcUA represents D-glucuronic acid, and GalNAc represents N-acetyl-D-galactosamine)
(7) The modified enzyme according to (1) or (6), comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 having 1 to several amino acid substitutions within the range of amino acid numbers 435 to 539.
(8) The modified enzyme according to any one of (1), (6) and (7), which has substitution of one to several amino acids within the range of amino acid numbers 519 to 521.
(9) The modified enzyme according to any one of (1) and (6) to (8), wherein the amino acid at position 521 is substituted.
(10) An expression vector constructed so as to express a gene encoding the modified enzyme according to any one of (1) to (9).
(11) A recombinant obtained by introducing the expression vector according to (10) into a host cell.
(12) A method for producing a modified enzyme, comprising growing the recombinant according to (11) and accumulating the modified enzyme in a grown product of the recombinant.
本発明により、GlcUA又はGalNAcを糖鎖に転移する新たな改変酵素が提供される。 According to the present invention, a novel modified enzyme that transfers GlcUA or GalNAc to a sugar chain is provided.
（Ａ）本発明改変酵素
本発明改変酵素は、アミノ酸番号153〜258又は435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改変酵素である。
(A) Invention Modified Enzyme The invention modification enzyme is a modification enzyme comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 having substitution of one to several amino acids within the range of amino acid numbers 153 to 258 or 435 to 539.
本発明改変酵素における「配列番号２記載のアミノ酸配列」は、本基本酵素のアミノ酸配列であり、かかる酵素のタンパク質は前述のように２つの糖転移酵素活性を持つ、アミノ酸686個からなるポリペプチドである。この中で糖供与体である糖ヌクレオチド結合モチーフ（DXD）が２ヶ所、239〜241と519〜521がありこの近傍が糖転移活性部位であると推定される。 The “amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2” in the modified enzyme of the present invention is the amino acid sequence of the basic enzyme, and the protein of such an enzyme is a polypeptide consisting of 686 amino acids having two glycosyltransferase activities as described above. It is. Among them, there are two sugar nucleotide binding motifs (DXD) which are sugar donors, 239 to 241 and 519 to 521, and it is presumed that the vicinity is a transglycosylation active site.
本発明改変酵素は、上記糖ヌクレオチド結合モチーフ近傍にアミノ酸の置換を有していることが好ましい。すなわち配列番号２中、アミノ酸番号153〜258の範囲又はアミノ酸番号435〜539の範囲に１又は数個のアミノ酸の置換を有することが好ましい。ここで「1〜数個」とは、1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個を示し、最も好ましくは1個が挙げられるが、本発明の所期の目的を果たしうる限りにおいてこれに限定はされない。 The modified enzyme of the present invention preferably has an amino acid substitution in the vicinity of the sugar nucleotide-binding motif. That is, in SEQ ID NO: 2, it is preferable to have one or several amino acid substitutions in the range of amino acid numbers 153 to 258 or amino acid numbers 435 to 539. Here, “1 to several” refers to 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and most preferably 1. The intended purpose of the present invention This is not limited as long as the above can be achieved.
以下、便宜上、アミノ酸番号153〜258にアミノ酸の置換を有する本発明改変酵素を本発明改変酵素１と、アミノ酸番号435〜539にアミノ酸の置換を有する本発明改変酵素を本発明改変酵素２として説明する。 Hereinafter, for convenience, the modified enzyme of the present invention having an amino acid substitution at amino acid numbers 153 to 258 will be described as the modified enzyme 1 of the present invention, and the modified enzyme of the present invention having an amino acid substitution at amino acid numbers 435 to 539 will be described as the modified enzyme 2 of the present invention. To do.
（１）本発明改変酵素１
本発明改変酵素１は、本発明改変酵素のうち、下記の（ａ）及び（ｂ）記載の性質を有することを特徴とする改変酵素である。
（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ａ）及び（ｂ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
(1) Invention modified enzyme 1
The modified enzyme 1 of the present invention is a modified enzyme having the properties described in the following (a) and (b) among the modified enzymes of the present invention.
(A) Transfer GlcUA from the GlcUA donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(B) It has substantially no function of transferring GalNAc from the GalNAc donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(In the above (a) and (b), GlcUA represents D-glucuronic acid, and GalNAc represents N-acetyl-D-galactosamine)
本発明改変酵素１は、本基本酵素の改変酵素である。本基本酵素のアミノ酸配列（配列番号２記載のアミノ酸配列）中、アミノ酸番号239〜241の範囲内にアミノ酸の置換を有していることが好ましい。本基本酵素においては、上記アミノ酸番号239〜241はアスパラギン酸−システイン−アスパラギン酸という配列からなるが、本発明改変酵素１においては、これらが本基本酵素とは異なるアミノ酸に置換している。本発明改変酵素１においては、これらの３残基のアミノ酸のうち、特に何れかのアスパラギン酸に置換が起こっていることがより好ましい。例えばアスパラギン酸が置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、アスパラギン酸以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。同様にシステインが置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、システイン以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、セリン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。例えば241番目のアスパラギン酸をリジンに置換する場合には、アスパラギン酸のトリプレット（gat）をリジンのトリプレット（例えば「aaa」）に置換することで、アミノ酸の置換を行うことができる。 The modified enzyme 1 of the present invention is a modified enzyme of the basic enzyme. In the amino acid sequence of the basic enzyme (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2), it preferably has an amino acid substitution within the range of amino acid numbers 239 to 241. In the basic enzyme, the amino acid numbers 239 to 241 are composed of the sequence aspartic acid-cysteine-aspartic acid. In the modified enzyme 1 of the present invention, these amino acids are substituted with amino acids different from the basic enzyme. In the modified enzyme 1 of the present invention, it is more preferable that substitution of any of the aspartic acids among these three-residue amino acids occurs. For example, amino acids after substitution with aspartic acid include amino acids other than aspartic acid among amino acids constituting proteins in the body, and among them, substitution with alanine, lysine and threonine is particularly preferred, and substitution with lysine is particularly preferred. Is preferred. Similarly, the amino acid after cysteine substitution includes amino acids other than cysteine among the amino acids constituting the protein in the living body, and among them, substitution to alanine, serine, lysine, threonine is particularly preferred, and especially to lysine. Substitution is preferred. For example, when substituting the 241st aspartic acid with lysine, an amino acid can be substituted by substituting a triplet of aspartic acid (gat) with a triplet of lysine (for example, “aaa”).
本発明改変酵素１の最も好ましい態様である、配列番号２中のアミノ酸番号241のアスパラギン酸がリジンに置換したものをコードする塩基配列とコードされるアミノ酸配列とを配列番号７に、アミノ酸配列のみを配列番号８に示す。 The most preferred embodiment of the modified enzyme 1 of the present invention, the base sequence encoding the aspartic acid of SEQ ID NO: 2 in which aspartic acid is substituted with lysine and the encoded amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 7, and only the amino acid sequence Is shown in SEQ ID NO: 8.
本発明改変酵素１は、上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有している。かかる性質のうち、（ａ）の性質は、本基本酵素が有する活性と同様の活性である。
GlcUA供与体としては、グルクロン酸ヌクレオチドが好ましい。グルクロン酸ヌクレオチドとしては、例えばUDP-GlcUA、アデノシン二リン酸(ADP)-GlcUA、シチジン二リン酸(CMP)-GalUA、及びグアノシン二リン酸(GDP)-GlcUAが挙げられ、その中でも特にUDP-GlcUAが好ましくは例示される。
The modified enzyme 1 of the present invention has the above properties (a) and (b). Among these properties, the property (a) is the same activity as that of the basic enzyme.
As the GlcUA donor, glucuronic acid nucleotides are preferred. Examples of glucuronic acid nucleotides include UDP-GlcUA, adenosine diphosphate (ADP) -GlcUA, cytidine diphosphate (CMP) -GalUA, and guanosine diphosphate (GDP) -GlcUA. GlcUA is preferably exemplified.
また、GlcUA受容体としては、非還元末端にGalNAc残基が存在するコンドロイチン糖鎖骨格が好ましく、特にかかるGalNAcは硫酸化などの修飾がされていない残基であることが好ましい。かかるGlcUA受容体としてのコンドロイチン糖鎖骨格の長さは特に限定はされないが、少なくとも4糖残基以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格であることが好ましい。 The GlcUA receptor is preferably a chondroitin sugar chain skeleton in which a GalNAc residue is present at the non-reducing end, and such GalNAc is particularly preferably a residue that is not modified such as sulfation. The length of the chondroitin sugar chain skeleton as such a GlcUA receptor is not particularly limited, but is preferably a chondroitin sugar chain skeleton composed of at least four sugar residues.
また、本発明改変酵素１は、GalNAc供与体からGalNAcをコンドロイチン糖鎖骨格に転移する働きを実質的に有しないが、ここでGalNAc供与体とは、例えばGalNAcヌクレオチド（ADP-GalNAc、GDP-GalNAc、UDP-GalNAc、CDP-GalNAcなど）が挙げられる。さらにGalNAc受容体とは、GalNAcが上記GalNAc供与体から転移されうる物質を指し、好ましくはGalNAcヌクレオチドから、本基本酵素の作用によりGalNAcが転移されうる糖鎖を指す。かかる糖鎖の例としては、非還元末端にGlcUA残基を有する４糖以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格が挙げられる。 The modified enzyme 1 of the present invention has substantially no function of transferring GalNAc from the GalNAc donor to the chondroitin sugar chain skeleton. Here, the GalNAc donor is, for example, a GalNAc nucleotide (ADP-GalNAc, GDP-GalNAc , UDP-GalNAc, CDP-GalNAc, etc.). Furthermore, the GalNAc acceptor refers to a substance to which GalNAc can be transferred from the above-mentioned GalNAc donor, and preferably refers to a sugar chain from which GalNAc can be transferred by the action of this basic enzyme. An example of such a sugar chain is a chondroitin sugar chain skeleton composed of four or more sugars having a GlcUA residue at the non-reducing end.
上記（ａ）及び（ｂ）の性質は、後述の実施例２及び実施例３記載の手法を用いることで容易に同定することが可能である。なお、ここで「実質的に有しない」とは、陽性対象である本基本酵素が有する活性と比して活性が5%以下であることを指して使用する。 The properties (a) and (b) can be easily identified by using the techniques described in Example 2 and Example 3 described later. Here, “substantially free” is used to indicate that the activity is 5% or less compared to the activity of the basic enzyme, which is a positive target.
（２）本発明改変酵素２
本発明改変酵素２は、本発明酵素のうち、下記の（ｃ）及び（ｄ）記載の性質を有することを特徴とする改変酵素である。
（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ｃ）及び（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
(2) The modified enzyme 2 of the present invention
The modified enzyme 2 of the present invention is a modified enzyme having the properties described in the following (c) and (d) among the enzymes of the present invention.
(C) Transfer of GalNAc from the GalNAc donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(D) It has substantially no function of transferring GlcUA from the GlcUA donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(In the above (c) and (d), GlcUA represents D-glucuronic acid, and GalNAc represents N-acetyl-D-galactosamine)
本発明改変酵素２は、本基本酵素の改変酵素である。本基本酵素のアミノ酸配列（配列番号２記載のアミノ酸配列）中、アミノ酸番号519〜521の範囲内にアミノ酸の置換を有していることが好ましい。本基本酵素においては、上記アミノ酸番号519〜521はアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸という配列からなるが、本発明改変酵素２においては、これらが本基本酵素とは異なるアミノ酸に置換している。本発明改変酵素２においては、これらの３残基のアミノ酸のうち、特に何れかのアスパラギン酸に置換が起こっていることがより好ましい。例えばアスパラギン酸が置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、アスパラギン酸以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。同様にセリンが置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、セリン以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。 The modified enzyme 2 of the present invention is a modified enzyme of the basic enzyme. In the amino acid sequence of the basic enzyme (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2), it preferably has an amino acid substitution within the range of amino acid numbers 519 to 521. In the basic enzyme, the amino acid numbers 519 to 521 are composed of the sequence aspartic acid-serine-aspartic acid. In the modified enzyme 2 of the present invention, these amino acids are substituted with amino acids different from the basic enzyme. In the modified enzyme 2 of the present invention, it is more preferable that substitution is performed on any of the aspartic acids among these three-residue amino acids. For example, amino acids after substitution with aspartic acid include amino acids other than aspartic acid among amino acids constituting proteins in vivo, and among them, substitution with alanine, lysine and threonine is particularly preferred, and substitution with lysine is particularly preferred. Is preferred. Similarly, examples of amino acids after substitution with serine include amino acids other than serine among amino acids constituting proteins in vivo. Among them, substitution with alanine, lysine and threonine is preferred, and substitution with lysine is particularly preferred. preferable.
本発明改変酵素２の最も好ましい態様である、配列番号２中のアミノ酸番号521のアスパラギン酸がリジンに置換したものをコードする塩基配列とコードされるアミノ酸配列とを配列番号１１に、アミノ酸配列のみを配列番号１２に示す。 The most preferred embodiment of the modified enzyme 2 of the present invention, the base sequence encoding the aspartic acid of amino acid number 521 in SEQ ID NO: 2 substituted with lysine and the encoded amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 11, and only the amino acid sequence Is shown in SEQ ID NO: 12.
本発明改変酵素２は、上記（ｃ）及び（ｄ）の性質を有している。かかる性質のうち、（ｃ）の性質は、本基本酵素が有する活性と同様の活性である。 The modified enzyme 2 of the present invention has the above properties (c) and (d). Among these properties, the property (c) is the same activity as that of the basic enzyme.
GalNAc供与体とは、GalNAcヌクレオチドが好ましい。GlcUAヌクレオチドとしては、例えばUDP-GalNAc、ADP-GalNAc、CMP-GalNAc、及びGDP-GalNAcが挙げられ、その中でも特にUDP-GalNAcが好ましくは例示される。 The GalNAc donor is preferably a GalNAc nucleotide. Examples of the GlcUA nucleotide include UDP-GalNAc, ADP-GalNAc, CMP-GalNAc, and GDP-GalNAc, and among them, UDP-GalNAc is particularly preferable.
また、GalNAc受容体としては、非還元末端にGlcUAが存在するコンドロイチン糖鎖骨格が好ましい。かかるGlcNAc受容体としてのコンドロイチン糖鎖骨格の長さは特に限定はされないが、少なくとも4糖残基以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格であることが好ましい。 The GalNAc receptor is preferably a chondroitin sugar chain skeleton in which GlcUA is present at the non-reducing end. The length of the chondroitin sugar chain skeleton as such a GlcNAc receptor is not particularly limited, but is preferably a chondroitin sugar chain skeleton composed of at least four sugar residues.
また、本発明改変酵素２は、GlcUA供与体からGlcUAをコンドロイチン糖鎖骨格に転移する働きを実質的に有しないが、ここでGlcUA供与体とは、例えばGlcUAヌクレオチド（ADP-GlcUA、GDP-GlcUA、UDP-GlcUA、CDP-GlcUAなど）が挙げられる。さらにGlcUA受容体とは、GlcUAが上記GlcUA供与体から転移されうる物質を指し、好ましくはGlcUAヌクレオチドから、本基本酵素の作用によりGlcUAが転移されうる糖鎖を指す。かかる糖鎖の例としては、非還元末端にGalNAc残基を有する４糖以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格が挙げられる。 The modified enzyme 2 of the present invention has substantially no function of transferring GlcUA from the GlcUA donor to the chondroitin sugar chain skeleton. Here, the GlcUA donor is, for example, a GlcUA nucleotide (ADP-GlcUA, GDP-GlcUA , UDP-GlcUA, CDP-GlcUA, etc.). Furthermore, the GlcUA receptor refers to a substance to which GlcUA can be transferred from the GlcUA donor, and preferably refers to a sugar chain from which GlcUA can be transferred by the action of the basic enzyme from a GlcUA nucleotide. An example of such a sugar chain is a chondroitin sugar chain skeleton composed of four or more sugars having a GalNAc residue at the non-reducing end.
上記（ｃ）及び（ｄ）の性質は、後述の実施例２及び実施例３記載の手法を用いることで容易に同定することが可能である。なお、ここで「実質的に有しない」とは、陽性対象である本基本酵素が有する活性と比して活性が5%以下であることを指して使用する。 The properties (c) and (d) can be easily identified by using the methods described in Example 2 and Example 3 described later. Here, “substantially free” is used to indicate that the activity is 5% or less compared to the activity of the basic enzyme, which is a positive target.
（Ｂ）本発明改変酵素の製造方法
本発明改変酵素は下記の方法により製造することができる。
すなわち、本基本酵素の遺伝子を含む発現ベクター（例えばJ. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575に記載された発現ベクター「pTrcHisC-K4CP」など）を鋳型として、ポリメラーゼチェインリアクション（PCR）法により、本基本酵素の遺伝子に点変異を有する塩基配列を有するベクターを増幅することにより、本発明改変酵素をコードする遺伝子を得ることができる。特にベクターとして環状DNA構造を有する発現ベクターを用いた場合には、変異を挿入したい領域に、予め変異を挿入したプライマーを使用する。かかる方法を用いると、環状DNAそのものが増幅されて、発現ベクターに変異が挿入された状態で複製が行われ、変異を有する発現ベクターのコピーが生ずるため好ましい。前記ベクターに予め薬剤（ネオマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子を組み込んでおくことで、後述の組換体の選択を容易とすることも可能であり、また、PCR法の鋳型として使用する発現ベクターを、本基本酵素とタグ（Hisタグ、プロテインA、FLAG等の公知のタグ配列）とを連続して（複合タンパク質として）発現するように構築しておくことで、後述の組換体を生育させた生育物からの本発明改変酵素の精製、単離を容易とすることも可能である。
(B) Production method of the modified enzyme of the present invention The modified enzyme of the present invention can be produced by the following method.
That is, using an expression vector containing the gene of this basic enzyme (for example, the expression vector “pTrcHisC-K4CP” described in J. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575, etc.) as a template, the polymerase chain reaction (PCR) ) Method, the gene encoding the modified enzyme of the present invention can be obtained by amplifying a vector having a base sequence having a point mutation in the gene of the basic enzyme. In particular, when an expression vector having a circular DNA structure is used as a vector, a primer in which a mutation has been previously inserted is used in a region where the mutation is to be inserted. Use of such a method is preferable because the circular DNA itself is amplified and replicated in a state in which the mutation is inserted into the expression vector, thereby producing a copy of the expression vector having the mutation. By incorporating a gene (neomycin, ampicillin, erythromycin, chloramphenicol, etc.) resistance gene in advance into the vector, it is possible to facilitate the selection of the recombinants described below, and as a template for the PCR method. By constructing the expression vector to be used so that the basic enzyme and a tag (known tag sequences such as His tag, protein A, and FLAG) are expressed continuously (as a complex protein), It is also possible to facilitate the purification and isolation of the modified enzyme of the present invention from the grown product in which the recombinant is grown.
PCR法の増幅産物である「点変異を有する本基本酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター」を、発現ベクターが所望の発現を行うことができる宿主細胞に形質転換又は形質導入させて、組換体を調製する。例えば上記で例示したpTrcHisC-K4CPを使用して本発明改変酵素をコードするDNAを調製した場合には、宿主細胞としては大腸菌（E. coli）などが例示される。かかる発現ベクターと宿主との組み合わせは、当業者であれば適宜容易に選択しうる。 A recombinant product obtained by transforming or transducing an expression vector containing a gene encoding the basic enzyme having a point mutation, which is an amplification product of the PCR method, into a host cell in which the expression vector can perform desired expression. To prepare. For example, when DNA encoding the modified enzyme of the present invention is prepared using pTrcHisC-K4CP exemplified above, examples of host cells include E. coli. A person skilled in the art can easily select a combination of the expression vector and the host as appropriate.
組換体を適切な条件下で生育させることで、本発明改変酵素を生育物（培養上清、組換体内等）に蓄積させることが可能である。また、適当なタグとの融合タンパク質として本発明改変酵素を発現させた場合には、かかるタグに対する抗体等特異的に結合しうる物質を用いて、容易に本発明改変酵素を精製、単離することが可能である。 By growing the recombinant under an appropriate condition, the modified enzyme of the present invention can be accumulated in a grown product (culture supernatant, recombinant, etc.). In addition, when the modified enzyme of the present invention is expressed as a fusion protein with an appropriate tag, the modified enzyme of the present invention is easily purified and isolated using a substance that can specifically bind to the tag, such as an antibody. It is possible.
点改変酵素の取得
J. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575に記載された、大腸菌K4株由来のコンドロイチン合成酵素タンパク質発現ベクター（pTrcHisC-K4CP）0.05μgを鋳型として、プライマー１（配列番号３）12pmolとプライマー２（配列番号４）12pmolを用い、pfu-turbo DNA ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）2.5単位を加えてポリメラーゼチェインリアクション（PCR）反応を行った。反応条件は、反応液50μlを、95℃で30秒前処理後、95℃で30秒；55℃で1分；68℃で12分のサイクルを16回繰り返し、最後に68℃で10分間反応して終了させた。反応液に制限酵素Dpn1（NEB社製）を10単位添加して37℃で1時間処理し、その処理液1μlを50μlの大腸菌 XL1-Blue supercompetent cells （ストラタジーン社製）に添加してトランスフォーメーションを行った。アンピシリン（100μｇ/ml）含有LBプレート培地上で37℃で一晩培養して、育成してきたクローンのうち6個を選択して、各クローン中のプラスミドのDNA配列を確認して、求める変異が起こっているプラスミドが入ったクローンを選んだ。この物は配列番号６のアミノ酸配列からなるペプチド（Hisタグ）に配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド（241番目のアスパラギン酸をリジンに改変した本発明改変酵素１）が結合したタンパク質（以下「D241K」とも記載する）を発現する。
Acquisition of point modification enzyme
J. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575 described in E. coli K4 strain chondroitin synthase protein expression vector (pTrcHisC-K4CP) 0.05 μg as a template, primer 1 (SEQ ID NO: 3) 12 pmol And 12 pmol of primer 2 (SEQ ID NO: 4), 2.5 units of pfu-turbo DNA polymerase (Stratagene) was added, and a polymerase chain reaction (PCR) reaction was performed. The reaction conditions were: 50 μl of the reaction solution was pretreated at 95 ° C. for 30 seconds, then 95 ° C. for 30 seconds; 55 ° C. for 1 minute; 68 ° C. for 12 minutes. And ended. Add 10 units of restriction enzyme Dpn1 (NEB) to the reaction solution, treat at 37 ° C for 1 hour, add 1 µl of the treatment solution to 50 µl of E. coli XL1-Blue supercompetent cells (Stratagene), and transform. Went. Incubate overnight at 37 ° C. on LB plate medium containing ampicillin (100 μg / ml), select 6 of the clones that have been grown, confirm the DNA sequence of the plasmid in each clone, and determine the desired mutation. A clone was selected containing the occurring plasmid. This product is a protein (hereinafter referred to as “the modified enzyme 1 of the present invention in which the 241st aspartic acid is changed to lysine)” and a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (His tag) bound to the peptide (His tag) (hereinafter “ Also expressed as “D241K”).
上記と同様にしてプライマー３（配列番号９）およびプライマー４（配列番号１０）を用いてPCRを行い、Dpn1処理後、トランスフォーメーションして、求める変異が起こっているプラスミドが入ったクローンを選んだ。この物は配列番号６のアミノ酸配列からなるペプチド（Hisタグ）に配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチド（521番目のアスパラギン酸をリジンに改変した本発明改変酵素２）が結合したタンパク質（以下「D521K」とも記載する）を発現する。 In the same manner as described above, PCR was performed using primer 3 (SEQ ID NO: 9) and primer 4 (SEQ ID NO: 10). After Dpn1 treatment, transformation was performed and a clone containing a plasmid in which the desired mutation occurred was selected. . This product is a protein in which a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (His tag) and a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 (the present modified enzyme 2 in which the 521st aspartic acid is changed to lysine) are bound (hereinafter “ D521K ").
これらのクローンを常法により培養し、イソプロピル-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）で誘導して組換えタンパク質を発現させ、ソニケータで菌体破砕後、その上清より Ni-NTAアガロース（キアゲン社製）カラムを用いて精製して、それぞれのタンパク質（D241K、D521K）を得た。また、野生型構造のプラスミド（pTrcHisC-K4CP）を持つクローンからも同様にして野生型の組換え酵素タンパク質（本基本酵素）がHisタグと結合してなるタンパク質（以下「K4CP」と記載する）を得た。 These clones are cultured by a conventional method, induced with isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) to express a recombinant protein, disrupted by a sonicator, and Ni-NTA from the supernatant. Each protein (D241K, D521K) was obtained by purification using an agarose (Qiagen) column. Similarly, from a clone having a wild-type plasmid (pTrcHisC-K4CP), a protein obtained by binding a wild-type recombinant enzyme protein (this basic enzyme) to a His tag (hereinafter referred to as “K4CP”) Got.
酵素活性測定
20mmol/l MnCl2, 0.1mol/l (NH4)2SO4, 1mol/l エチレングリコールを含む 50 mmol/l Tris-HCl緩衝液（pH7.2）に、受容体基質として100pmolのCSC-6（サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸C（生化学工業株式会社製）を睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で分解して精製することで得られるコンドロイチン硫酸C六糖）あるいはCSC-7(6+1)（CSC-6に本基本酵素を作用させその非還元末端にUDP-GalNAcを導入して得られる七糖）を用い、供与体基質としてそれぞれ 3nmolのUDP-GalNAc とUDP-GlcUAを用いた。必要に応じて供与体基質は放射活性体 UDP-[3H]GalNAcあるいはUDP-[14C]GlcUAを用いた。酵素タンパク質としては上記K4CP、D241K及びD521Kを、それぞれ一種類ずつ、タンパク質量として0.15μg添加した。全量を50μlに調製し、30℃で30分間酵素反応させた後、加熱して酵素を失活させた（沸騰水中1分間）。その反応液を氷冷し、1.3%(v/v)酢酸カリウムを含む95%(v/v)エタノールを150μl添加し、析出した沈殿を10,000×gで20分間遠心分離することで採取した。沈殿を50μlの蒸留水に溶解し、Superdex Peptide HR10/30 カラム（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）にアプライし、0.2mol/l 食塩水を0.5 ml／分の流速で流し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出液を0.5ml毎に分画し、画分中の放射能をシンチレーションカウンターで計測した。酵素反応で得られた生成物の分子量は放射活性の溶出位置から求め、糖転移酵素活性は放射活性の量より計算した。
Enzyme activity measurement
20 mmol / l MnCl 2 , 0.1 mol / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 mol / l 50 mmol / l Tris-HCl buffer (pH 7.2) containing ethylene glycol and 100 pmol CSC-6 as acceptor substrate (Chondroitin sulfate C hexasaccharide obtained by degrading shark cartilage-derived chondroitin sulfate C (manufactured by Seikagaku Corporation) with testicular hyaluronidase (manufactured by Sigma) or CSC-7 (6 + 1) (CSC No. 6 was used to make UDP-GalNAc into the non-reducing end of this basic enzyme and 3 nmol of UDP-GalNAc and UDP-GlcUA were used as donor substrates. If necessary, the donor substrate used was the radioactive substance UDP- [ 3 H] GalNAc or UDP- [ 14 C] GlcUA. As enzyme proteins, K5CP, D241K, and D521K were each added in an amount of 0.15 μg as a protein amount. The total amount was adjusted to 50 μl, and the enzyme reaction was carried out at 30 ° C. for 30 minutes, followed by heating to inactivate the enzyme (1 minute in boiling water). The reaction solution was cooled on ice, 150 μl of 95% (v / v) ethanol containing 1.3% (v / v) potassium acetate was added, and the deposited precipitate was collected by centrifugation at 10,000 × g for 20 minutes. Dissolve the precipitate in 50 μl of distilled water, apply it to a Superdex Peptide HR10 / 30 column (Amersham Biosciences), run 0.2 mol / l saline at a flow rate of 0.5 ml / min, and perform gel filtration chromatography It was. The eluate was fractionated every 0.5 ml, and the radioactivity in the fraction was measured with a scintillation counter. The molecular weight of the product obtained by the enzyme reaction was determined from the elution position of radioactivity, and the glycosyltransferase activity was calculated from the amount of radioactivity.
その結果、K4CPは受容体基質（CSC-6, CSC7(6+1)）に関わらず良く反応し、分子量2,500から20,000の高分子コンドロイチン糖鎖を合成した。ところが、D241KはCSC-6を基質として用いると糖転移反応は起こらず、CSC-7(6+1) を基質に用いると、UDP-GlcUAからGlcUAを１糖のみ転移させて８糖のみを合成した。また、D521KはCSC-7(6+1) では酵素反応が起こらず、CSC-6を基質とすると、UDP-GalNAcからGalNAcを１糖のみ転移させて７糖のみを合成した。 As a result, K4CP reacted well regardless of the receptor substrate (CSC-6, CSC7 (6 + 1)), and synthesized high molecular chondroitin sugar chains with molecular weights from 2,500 to 20,000. However, D241K does not cause a transglycosylation reaction when CSC-6 is used as a substrate, and when CSC-7 (6 + 1) is used as a substrate, only one sugar is transferred from UDP-GlcUA to synthesize only eight sugars. did. D521K did not undergo an enzymatic reaction with CSC-7 (6 + 1). When CSC-6 was used as a substrate, only one sugar was synthesized by transferring only one sugar from UDP-GalNAc.
したがって、D241KはK4CPのうちGlcUA転移酵素活性のみを保持し、D521KはGalNAc転移酵素活性だけを持つ酵素になったことが明らかである。
さらに、D241K及びD521Kを同時に反応系に加え同様に酵素反応を行うと、お互いに補完し合い、K4CPと同様な高分子コンドロイチン糖鎖を合成することが分かった。
Therefore, it is clear that D241K retained only GlcUA transferase activity in K4CP, and D521K became an enzyme having only GalNAc transferase activity.
Furthermore, it was found that when D241K and D521K were added to the reaction system at the same time and the enzyme reaction was carried out in the same manner, they complement each other and synthesized a high-molecular chondroitin sugar chain similar to K4CP.
基質特異性
実施例２記載のオリゴ糖CSC-6及びCSC-7(6+1)に加え、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸A（生化学工業株式会社製）から同様の手法で得た６糖（CSA-6）、コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したコンドロイチン（生化学工業株式会社製）から同様の手法で得た６糖（CH-6）、さらにサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Cをヒアルロニダーゼで分解して得た８糖をβ-グルクロニダーゼ（シグマ社製）を用いて非還元末端のGlcUA残基を除いた７糖（CSC-7(8-1)）、クジラ由来コンドロイチン硫酸Aから得た８糖からCSC-7(8-1)と同様にして得た７糖（CSA-7(8-1)）、およびコンドロイチン由来の８糖から同様にして得た７糖（CH-7(8-1)）を酵素反応の受容体基質として用いた。
Substrate specificity In addition to oligosaccharides CSC-6 and CSC-7 (6 + 1) described in Example 2, hexasaccharide (CSA) obtained from whale cartilage-derived chondroitin sulfate A (Seikagaku Corporation) in the same manner -6) Degradation of chondroitin sulfate (C-6) obtained by the same method from chondroitin (manufactured by Seikagaku Corporation) obtained by chemically desulfating chondroitin sulfate, and chondroitin sulfate C derived from shark cartilage The obtained 8-saccharide was obtained from β-glucuronidase (manufactured by Sigma) by removing the non-reducing terminal GlcUA residue (CSC-7 (8-1)), from the 8 sugars obtained from whale-derived chondroitin sulfate A 7 sugars obtained in the same manner as CSC-7 (8-1) (CSA-7 (8-1)) and 7 sugars obtained from 8 sugars derived from chondroitin (CH-7 (8-1)) ) Was used as the acceptor substrate for the enzymatic reaction.
CSC-6, CSA-6, CH-6 を用いて酵素反応を行うと、K4CPはすべて高分子コンドロイチン糖鎖を合成し、D521KはGalNAc１糖を転移して７糖を合成した。D241Kは反応しなかった。
CSC-7(6+1)及びCH-7(8-1)を用いると、K4CPは高分子コンドロイチン糖鎖を合成し、D241KはGlaUA１糖を転移して８糖を合成し、D521Kは反応しなかった。ところが、CSC-7(8-1)およびCSA-7(8-1)を用いると、どの酵素も糖転移が起こらなかった。
When enzymatic reactions were performed using CSC-6, CSA-6, and CH-6, all K4CPs synthesized high-molecular chondroitin sugar chains, and D521K synthesized GalNAc monosaccharides to synthesize 7 sugars. D241K did not react.
Using CSC-7 (6 + 1) and CH-7 (8-1), K4CP synthesizes high molecular chondroitin sugar chain, D241K transfers GlaUA1 sugar to synthesize octasaccharide, and D521K reacts. There wasn't. However, when CSC-7 (8-1) and CSA-7 (8-1) were used, no sugar transfer occurred in any enzyme.
CSC-7(6+1)及びCH-7(8-1)と、CSC-7(8-1)及びCSA-7(8-1)との構造上の相違点は非還元末端にある。すなわち、CSC-7(6+1)及びCH-7(8-1)の非還元末端は修飾（硫酸化）を受けていないGalNAc残基であり、CSC-7(8-1)及びCSA-7(8-1) の非還元末端は硫酸基の修飾を受けているGalNAc(6S)あるいはGlaNAc(4S)残基である。 The structural difference between CSC-7 (6 + 1) and CH-7 (8-1) and CSC-7 (8-1) and CSA-7 (8-1) is in the non-reducing end. That is, the non-reducing ends of CSC-7 (6 + 1) and CH-7 (8-1) are GalNAc residues that have not been modified (sulfated), and CSC-7 (8-1) and CSA- The non-reducing end of 7 (8-1) is a GalNAc (6S) or GlaNAc (4S) residue that has been modified with a sulfate group.
したがって、K4CP及びD241Kの酵素活性発現には、受容体基質の非還元末端構造が硫酸基などの修飾を受けていないことが条件であることが分かった。 Therefore, it was found that the enzyme activity expression of K4CP and D241K is a condition that the non-reducing terminal structure of the receptor substrate is not modified with a sulfate group or the like.
本発明により、酵素の機能の解明が可能となるとともに、改変酵素を医薬、試薬などに利用することができる。 According to the present invention, the function of an enzyme can be elucidated, and the modified enzyme can be used in medicines, reagents, and the like.
Claims (12)
（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ａ）及び（ｂ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す） The modified enzyme according to claim 1, which has the following properties (a) and (b).
(A) Transfer GlcUA from the GlcUA donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(B) It has substantially no function of transferring GalNAc from the GalNAc donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(In the above (a) and (b), GlcUA represents D-glucuronic acid, and GalNAc represents N-acetyl-D-galactosamine)
（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ｃ）及び（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す） The modified enzyme according to claim 1, which has the following properties (c) and (d).
(C) Transfer of GalNAc from the GalNAc donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(D) It has substantially no function of transferring GlcUA from the GlcUA donor to the non-reducing end of the sugar chain.
(In the above (c) and (d), GlcUA represents D-glucuronic acid, and GalNAc represents N-acetyl-D-galactosamine)
A method for producing a modified enzyme, comprising growing the recombinant product according to claim 11 and accumulating the modified enzyme in a grown product of the recombinant product.
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