JP2005062187A - 生体分子を多重表面プラズモン共鳴で検出するためのアレイ - Google Patents

Abstract

【課題】 ＳＰＲイメージングにおいて、画像のコントラストを改善する。
【解決手段】 コントラストの大きい表面プラズモン共鳴画像を得ることができる多重エバネッセント・スキャンのためのアレイが提供される。アレイターゲットフィーチャは、典型的には、バイオポリマーである。このスキャンにおいて、プローブをラベリングする必要はない。本発明のアレイにおいて、ターゲットフィーチャは基板に付着された貴金属上に設けられる。フィーチャ間の領域は、光を補足し、そらし、及び／又は放出して、基板を通って向けられる光がこれらの領域で反射しないように、そしてターゲットフィーチャを備える反射領域のエバネッセント・スキャンを妨害しないようにする。幾何学的な、または物質に基づく光減衰フィーチャが企図される。上記アレイ、アレイを読み取るために必要なハードウェア及びソフトウェア、及び関連する方法が提供される。
【選択図】 図１

Description

本発明は、化学アレイまたはリガンドアレイのスキャンに関し、より具体的には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析によるバイオポリマーアレイのエバネッセント・スキャンに関する。

薬品、バイオテクノロジー、または、ゲノミクスの会社は、創薬におけるターゲットの同定と薬物のスクリーニングのためにＤＮＡ解析システムを使用する。これらのシステムの多くでは、種々の染料で標識した生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質）が、チップの異なる位置に結合する、異なる分子プローブの対応する部分を提示するチップに結合する。ついで光スキャナを使用して、適切な光（ほとんどの場合、レーザ光である）を照射して結果として得られた表面結合分子の蛍光を読み取る。別のタイプのアレイ検出は、表面上に種々の生体分子でパターン化された多数の電極素子を使用し、電子化学的に活性なプローブで標識された検体を検出することを含む。第３のアレイ方法は、生体分子に付着する半導体ナノ粒子を光学検出することで動作する。

特許文献１には別の態様のスキャンが提示されている。上記他の検出態様と同様に、この特許文献１に記載された方法では、プローブを目的の生体分子に付着させることが必要である。特許文献１の場合、蛍光標識を使用する。しかし上記の蛍光ベースの検出技術とは異なり、特許文献１の方法では、タグまたは標識の直接照射ではなくタグまたは標識のエバネッセント励起を使用する。

エバネッセンスとは、入射光が表面で全反射されるが、電磁場成分が隣接する媒体を短距離（数十ナノメートル）だけ貫通する状況を含む。

多くのバイオアフィニティ相互作用のアレイベースの研究では蛍光標識バイオポリマーを使用するが、分子標識またはタグを必要としないで、生体サンプルにおけるバイオアフィニティ相互作用を検出するために使用できる高感度の解析方法の継続的な発展が必要であることが認められている。このことは、標識が困難で標識するとタンパク質の機能と干渉する可能性のある、タンパク質間の相互作用の研究に特に当てはまる。

今日、ＳＰＲイメージングは、吸着の際に生じる局所的な屈折率の変化によって、化学修飾された金の表面上のバイオポリマーの存在を検出するために使用されている。従来のＳＰＲ解析の実施には、並列配置で最高でも一つだけの要素（検出が測定できる領域は一つだけ）または３から５の要素だけしか含まれていない。しかしこのようなシステムは高スループットの方法を行うように修正できない。

米国特許第５，６３３，７２４号

本発明の実施形態は、特にアレイフィーチャデータを検出するための画像解像方法に関して、異なる方法を提供する。本発明の実施形態は、画像のコントラストを改善するための反射後フィルタおよび／または回転台を必要とせずに、ＳＰＲ画像データを得るように動作する。この結果、本発明の実施形態は、任意の知られたシステムと比較すると、多重ＳＰＲ実施において容易に進歩（および精度の向上）を提供することができる。さらに、当業者であれば、本発明の実施形態に関する次の説明を読めば、他の利点、長所、独特の特徴も明らかであろう。

似たような文脈で、本発明の実施形態を典型的なアレイの使用法の点で論じているが、提供される「アレイ」は、ミクロ流体（例えば、「ラボオンチップ」用途）、診断用途などを含む他の設定でも使用できることを理解されたい。

次の各図は、本発明の態様を概略的に示す。理解を容易にするために、（可能な場合は）図面の中で共通の同様な要素を示すために同じ参照番号を使用した。

定義
特段の記載のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する業界の当業者であれば一般に理解される意味と同じ意味を有する。しかし、明確と参照の容易さのために一部の要素を次に定義する。

「バイオポリマー」は、一つまたは複数のタイプの繰り返し単位を有するポリマーである。バイオポリマーは典型的には生体系に見られ、特に多糖類（炭水化物など）、ペプチド（ペプチドという用語を使用する場合はポリペプチドとタンパク質も含む）、ポリヌクレオチド、およびこれらの類似体が含まれる。類似体には、アミノ酸類似体または非アミノ酸グループ、ヌクレオチド類似体または非ヌクレオチドグループからなるか、またはこれらを含む化合物が含まれる。バイオポリマーは、従来の骨格鎖を非天然または合成の骨格鎖に置換したポリヌクレオチド、従来の塩基のうち一つまたは複数をワトソンクリックタイプの水素結合相互作用と関与できる基（天然または合成の）に置換した核酸（または合成類似体または天然類似体）を含む。ポリヌクレオチドは、単一らせん構造または多重らせん構造を含み、らせんのうち１本または複数は、他のらせんと完全に整列してもよいし整列しなくてもよい。「ヌクレオチド」は核酸のサブユニットを指し、リン酸基、五炭糖、窒素含有塩基、および機能的類似体（合成または天然）を有する。このようなサブユニットは、ポリマー形態（ポリヌクレオチドとして）では、二つの天然のポリヌクレオチドと同様にシーケンス特異的に天然のポリヌクレオチドとハイブリダイズできる。バイオポリマーは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、および、米国特許第５，９４８，９０２号およびこの特許に引用された参考文献に説明されている他のポリヌクレオチドを含み、これらの由来は問わない。米国特許第５，９４８，９０２号およびこの特許において引用された参考文献はすべて、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。「オリゴヌクレオチド」は一般に、約１０から１００ヌクレオチド長のヌクレオチドマルチマー／ポリマーを指し、「ポリヌクレオチド」は、任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチドマルチマーを含む。「バイオモノマー」は単一の単位を指し、同じバイオモノマーまたは別のバイオモノマーと結合してバイオポリマーを形成することができる（例えば、二つの結合基を有し、このうち一つまたは両方が除去可能な保護基を有していてもよい、単一のアミノ酸またはヌクレオチド）。

「アレイ」は、ある領域に関連づけられた特定の化学部分（複数可）を有するアドレス指定可能な領域の、任意の二次元的または実質的に二次元的な構成を含む（例えば、ポリヌクレオチドシーケンス（核酸）などのバイオポリマー、ポリペプチド（例えば、タンパク質）など）。もっとも広い意味では、典型的なアレイは、リガンドのアレイまたは化学（例えば、ポリマーまたはバイオポリマー）ポリマー結合剤のフィーチャのアレイであり、ここでポリマー結合剤は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、このようなバイオポリマー結合剤の合成模倣物のうち任意のものであってよい。多くの実施形態では、アレイは核酸のアレイであり、この中にはオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、これらの合成模倣物などを含む。アレイが核酸アレイである場合、核酸アレイは核酸鎖に沿った任意のポイントでこのアレイに共有結合してもよいが、一般には一つの末端（例えば、３’末端または５’末端）で結合する。場合によっては、アレイはポリペプチド（例えば、タンパク質）またはポリペプチドのフラグメントである。

任意の所与の基板は、基板の前面上に配置された一つ、二つ、４つ、またはそれ以上のアレイを担持することができる。「基板」は、本発明のＳＰＲ解析に使用することが望ましい光に対する透過性を提供する材料（例えば、誘電材料）である。本発明の基板は、基板上にアレイフィーチャを支持する領域を含むだけでなく、後述の光減衰フィーチャを含むことができる。基板は典型的には、光を照射すると弱い蛍光を発する材料で作成する。入射光の吸収を低減し、基板を通って反射する光の検出を促進し、基板の加熱を避けるために、典型的には透過率の高い材料を使用する。一般に、基板は、照射光の全体の積分スペクトルに渡って測定するかまたは別法としては可視光線または赤外線またはＵＶ光源からの選択された波長で測定したときに、前面に入射する照射光の少なくとも８５％、９０％、または、９５％を透過する。適切な基板材には、ガラス、石英、および／または、選択されたポリマー（所望の光の波長（複数可）に依存する）が含まれる。一つの適切なポリマーはポリフェニルである。しかし、ガラス材または石英材も使用できる。

用途に依存して、アレイのうち任意のアレイまたは全部のアレイは互いに同じであってもよいしまたは異なっていてもよく、各アレイは多数のスポットまたはフィーチャを含んでいてもよい。典型的なアレイは２０ｃｍ²未満または１０ｃｍ²未満の面積に、１０以上、１００以上、１０００以上、１００００以上、または、１０万以上のフィーチャを含んでいてもよい。例えば、フィーチャは１０μｍから１．０ｃｍの範囲の幅を有していてもよい（すなわち円形のスポットの場合は直径）。他の実施形態では、各フィーチャは１．０μｍから１．０ｍｍ、一般には５．０μｍから５００μｍ、より一般には１０μｍから２００μｍの範囲の幅を有していてもよい。非円形のフィーチャは、前述の幅（直径）の範囲の円形のフィーチャと同等な面積の範囲を有していてもよい。これらのフィーチャのうち少なくとも一部または全部は異なる構成である（例えば、各フィーチャ構成のうち任意の繰り返し（repeat）を除去すると、残りのフィーチャはフィーチャの合計数の少なくとも５％、１０％、または、２０％を占めてもよい）。フィーチャ間の領域も提供される。これについては後述する。もちろん、フィーチャ間の領域は、本明細書で論じる動作の原理に一致するか、次に論じる構造を暗に含んでいる限り、種々の大きさと構成であってよい。しかしより一般には、フィーチャ間の領域またはアレイフィーチャ自体は、完全に反復的または周期的なパターンを示してもよいことに注意されたい。別法としては、適切なアドレス指定手段（例えば、アレイフィーチャのレイアウトと調和するデータファイル）が提供される限り、構造の変更も可能である。

各アレイは、１００ｃｍ²未満、または、５０ｃｍ²未満、１０ｃｍ²未満、１ｃｍ²未満の面積をカバーしていてもよい。多くの実施形態では、一つまたは複数のアレイを担持する基板の形状は一般に、四角形の固体の形状であり（他の形状も可能である）、長さは４ｍｍを超え１ｍ未満、一般には４ｍｍを超え６００ｍｍ未満、より一般には４００ｍｍ未満であり、幅は４ｍｍを超え１ｍ未満、一般には５００ｍｍ未満、より一般には４００ｍｍ未満であり、また、厚さは０．０１ｍｍを超え５．０ｍｍ未満、一般には０．１ｍｍを超え２ｍｍ未満、より一般には０．２ｍｍを超え１ｍｍ未満である。

バイオポリマーアレイは、あらかじめ得られたバイオポリマー（例えば、合成または天然のバイオポリマー）を基板上に付着させるか、またはｉｎ ｓｉｔｕ合成方法で製造することができる。得られたバイオポリマーを付着させる方法は、ピンまたは毛細管（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている）などの分注器か、または、パルスジェット（国際公開第９５／２５１１６号パンフレットおよび国際公開第９８／４１５３１号パンフレットなどに記載されている圧電インクジェットヘッドなど）から基板上に液滴を付着させることを含む。基板は一般には、付着の前に適切な結合層でコーティングする。例えば、米国特許第６，０７７，６７４号およびこの中の引用文献に説明されたポリリシンまたは他の適切なコーティングなどである。発明者らによるｉｎ ｓｉｔｕアレイ製造およびアレイ製造のための付着システムの態様を説明する追加の参考文献は、米国特許第６，２４２，２６６号、米国特許６，２３２，０７２号、米国特許第６，１８０，３５１号、米国特許第６，１７１，７９７号、米国特許第６，３２３，０４３号、Ｃａｒｅｎらによって１９９９年４月３０日に提出された米国特許出願番号第０９／３０２，８９８号を含む。アレイ製造に関する上記のすべての開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

アレイは、アレイ上の特定の既定の位置（すなわち「アドレス」）の領域（すなわち、アレイの「フィーチャ」または「スポット」）が、特定のターゲットまたはターゲットクラスを検出するように異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチドシーケンス）の多数の領域を有するときに「アドレス指定可能」である（しかしあるフィーチャはそのフィーチャのターゲットではないものを偶然検出することもある）。アレイフィーチャのうち少なくとも一部は間に存在するスペースによって分離されている。これらのスペースのうち少なくとも一部、典型的には全部が光減衰機能を備える。

アレイの場合、「ターゲット」は、種々の領域で基板に結合するプローブ（「ターゲットプローブ」）で検出すべき移動相（典型的には液体）の部分と呼ばれる。しかし「ターゲット」または「ターゲットプローブ」のいずれかは、他によって評価すべきものであってもよい（すなわち、いずれかは他と結合することで評価される、未知のポリヌクレオチドの混合物であってよい）。ポリヌクレオチドに関する「ハイブリダイゼーション」および「結合」という用語は、相互に交換可能に使用される。

「センサ領域」は、上記に定義した目的のアレイスポット、フィーチャ、要素がある、連続的な（例えば、円形、四角形など）の領域を指す。ＳＰＲ解析では、このようなフィーチャの背面を照射する。したがって収集される画像（複数可）は、センサまたはスキャン領域の背面に対応する。したがって、センサ領域は、この結果得られる光の角度の変化を測定することのできるアレイの部分に対応する。「表面プラズモン共鳴センサ領域」は、基板材の実質的に平面で透過的な（transparent）部分によって裏打ちされた金属膜上に設定されたセンサ領域である。

「アレイレイアウト」は、基板上のプローブフィーチャまたは光減衰フィーチャの配置、一つまたは複数のフィーチャの大きさ、所与の位置の部分の指示など、フィーチャの一つまたは複数の特徴を指す。

「遠隔の場所」は、アレイが存在しハイブリダイゼーションを行う場所とは異なる場所を指す。例えば、遠隔の場所は同じ町の別の場所（例えば、オフィス、研究室など）であってもよいし、別の町の別の場所、別の州の別の場所、別の国の別の場所であってもよい。したがって一つの項目が他の項目から「遠隔である」と示されるとき、この意味は、これらの二つの項目は少なくとも異なる部屋、異なる建物にあり、少なくとも１マイル、１０マイル、少なくとも１００マイル離れている場合もあることを意味する。情報の「通信」は、情報を表すデータを電気信号として適切な通信チャネル（例えば、私設ネットワークまたは公共ネットワーク）上で送信することを指す。項目の「転送」は、ある項目を物理的に輸送するか、または（可能な場合は）他の方法でその項目を一つの場所から別の場所に移動する任意の手段を指し、少なくともデータの場合は、このデータを担持する媒体を物理的に輸送すること、またはこのデータを通信することを含む。アレイの「パッケージ」は、アレイと、アレイが付着している基板だけであってもよいが、他のフィーチャを含んでいてもよい（例えば、チャンバを伴う筐体）。「チャンバ」は、任意の閉じた容量を指す（しかしチャンバは一つまたは複数のポートを介してアクセス可能であってもよい）。また本出願全体で、「上」、「上方」、「下方」などの言葉は相対的な意味だけで使用されることを理解されたい。

「コンピュータに基づくシステム」は、本発明により情報を解析するために使用するハードウェア手段、ソフトウェア手段、および、データ記憶手段を指す。コンピュータに基づくシステムの最小のハードウェアは典型的には、中央演算処理装置（ＣＰＵ）と、入力手段と、出力手段と、データ記憶手段とを含んでなる。当業者であれば、現在入手可能なコンピュータに基づくシステムのうち任意のシステムが、本発明の実施形態での使用に適していることが容易に理解されるであろう。データ記憶手段は、上記の情報の記録を含む任意の製品と、このような製品にアクセスできるメモリアクセス手段とを含んでいてよい。

データ、プログラミング、または、他の情報を、コンピュータ読み取り可能な媒体上に「記録」することは、当技術分野で知られた任意の方法を使用して情報を記憶するプロセスを指す。記憶された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて、任意の便利なデータ記憶構造を選択することができる。例えば、ワードプロセッサのテキストファイル、データベースフォーマットなど、種々のデータプロセッサプログラムとフォーマットを記憶のために使用できる。

「プロセッサ」は、求められる機能を実行する任意のハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせを指す。例えば、本明細書の任意のプロセッサは、電子コントローラ、メインフレーム、サーバ、または、パーソナルコンピュータ（デスクトップまたはポータブル）などの形態で入手可能なプログラマブルディジタルマイクロプロセッサであってよい。プロセッサがプログラマブルな場合、適切なプログラミングを遠隔の場所からプロセッサに通信してもよいし、またはコンピュータプログラム製品（例えば、ポータブルまたは固定式のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体など。磁気ベース、光ベース、ソリッドステートデバイスベースのいずれであってもよい）にあらかじめ保存してもよい。例えば、磁気媒体または光ディスクがプログラミングを担持し、対応するステーションで各プロセッサと通信する適切な読み取り装置で読み取ることができる。

本発明を、上記の要約、背景技術、定義より詳細に記述するに当たって、本発明の実施に関する詳細を、アレイの読み取りまたはスキャンの方法と、これに関連するソフトウェア／ハードウェアとしてまず説明する。次に、特定のアレイ／アレイ基板構成を説明する。この議論の次に、本発明の実施形態にしたがってアレイを使用する方法と、この方法に使用するキットを説明する。

しかしまず、本明細書に説明する方法では、事象は説明された順序だけではなく、論理的に可能な任意の順序で実行できることに注意されたい。さらに、値の範囲が提供されている場合、この範囲の上限と下限の間、およびこの述べられた範囲の間にある任意の値が、本発明に含まれることを理解されたい。また、説明される本発明の変形例の任意の選択肢の特徴は、本明細書に説明された機能のうち一つまたは複数とは独立して述べられるかまたはこれらと組み合わされて述べられ、請求される。さらに、一つの項目への言及は、複数の同じ項目が存在する可能性を含む。より具体的には、本明細書および添付の請求の範囲では、文脈内で特段の記載のない限り、単数形は複数の対象物を含む。さらに、請求の範囲は任意の選択肢の要素を排除するように書かれていることに注意されたい。すなわちこの言明は、請求の範囲の要素の言及に関して「単一」、「唯一」などの排除的な用語の使用、または、「否定的な」限定の使用、「含む」または「本質的に含む」という用語を使用することの根拠となることを目的としたものである。

本発明の一態様は、高コントラストのＳＰＲ画像を提供するように構成されたアレイ（基板構成を介して）を提供する。本発明の別の態様は、このようなアレイと、アレイと共に機能するように構成されたスキャナとを含む。スキャナハードウェア、関連するハードウェア、ソフトウェア、使用方法のすべてが本発明でカバーされている。同様な文脈で、アレイの物理的な態様、アレイの作成または製造方法、アレイを読み取る方法、これに従って得られた結果も、本発明に含まれる。

アレイの仕様に関しては、アレイは比較的反射が少ないかまったく反射しない領域で、金属膜上に設定されたパターン状のセンサフィーチャを有する基板を含む。ターゲットとプローブの結合によって金属膜から反射した光の性質により、アレイデータ取得の手段が提供される。アレイの周期的な構造とここから得られる反射率により、対応するアレイセンサ領域の測定値が区別できる。さらに、アレイセンサ領域に対応する領域に隣接する領域から光センサ（複数可）が収集する意図しない反射を避けることによって、信号ノイズも低減する。したがって、本発明による実施形態は、アレイ要素の測定値を互いに区別でき、またバックグラウンドからも区別でき、センサ領域を約１０まで、２０まで、５０まで、１００まで、１０００まで、５０００まで、１００００まで、またはこれ以上多重化できるアレイ構造を提供する。この数の限度は、使用するイメージング装置の解像度と光の波長だけである。後者の考慮点は、任意の限定的な回折効果にも関する。

本発明の実施形態の変形例は、光の直接反射が非センサ領域から検出器に向かうことを少なくとも避けるように構成する。このためには、これらの領域の基板は、反射を乱すフィーチャに隣接するか、または反射を乱すフィーチャを含む（少なくとも内部全反射の形態で）。基板上に設定された材料（または基板自体）は、非センサ領域の反射を減衰させる幾何学的なフィーチャを含んでいてもよい。材料自体は光吸収材であってよい。フィーチャは比較的大きいかまたは表面格子の形態であってもよい。

格子を備える場合、一つまたは複数の単色ソース信号の全反射を個別に低減するために格子を使用できる。また、色に基づくＳＰＲ信号の区別における広帯域源（フィルタおよび／または色区別検出装置と共に）と共に使用することもできる。

いずれにしても、本発明の態様による反射減衰フィーチャの組み合わせが可能であることを理解されたい。典型的な順列を次に示す。

解析方法
本発明の実施形態で、ＳＰＲ解析の多重化は、多数のアレイフィーチャセンサ領域を裏打ちする薄い金属層（例えば、金（gold）層）から反射された光の分解を可能にするフィーチャに基づいて達成される。上記のように、金属の裏打ちの上に設定されたセンサ領域はＳＰＲセンサ領域と呼ばれる。このような要素は、ＳＰＲセンサ領域から光が反射するような内部全反射を行わないアレイ基板の部分があるため、要素同士およびバックグラウンドノイズから区別される。

反射ゾーンと反射が比較的少ないゾーンまたは非反射ゾーンとを交互に配置したアレイ構造（特に周期的に配置する）を作成し提供することによって、比較的容易に基板の関連する部分から反射される光のパワーと角度を決定することができる。上記のＳＰＲ解析の導入部で論じたように、あるアレイの位置で起こる結合の量に関する情報は、目的の領域の共鳴エネルギーおよび最終的には光の反射率に影響を与える、分子が結合した結果の質量濃度によって駆動される、反射された光の角度および／または強度に相関する。

図１に示すように、全アレイについてデータを得るタスクを行うために使用されるスキャナまたは読み取り装置２８に典型的な光の検出、任意のアレイの動き、計算、他の作用は、ソフトウェア制御されたコンピュータ４０などの電子手段の制御の下で行われる。この方法を具体化するプログラミングを読取／スキャナコンピュータにロードすることもできるし、コンピュータ／マイクロプロセッサをこれらのプログラムを動かすようにプログラミングすることもできる。プログラミングはコンピュータ読み取り可能な媒体４２上に記録することができる（例えば、コンピュータが直接読み取りアクセスできる任意の媒体）。このような媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭなどの光記憶媒体、ＲＡＭとＲＯＭなどの電気記憶媒体、磁気／光記憶媒体などのカテゴリのハイブリッドなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、現在知られたコンピュータ読み取り可能な媒体のうち任意の媒体を使用して、データベース情報の記録を含む製品を作成する方法を容易に理解されるであろう。

ＳＰＲ解析の単一の領域を図１に示す。図１ではＳＰＲシステムの要素を示す。光源２が提供される。一般にはコラムネータを含む種々の光学素子を使用してビーム４をプリズム６に向ける。ビームはアレイ基板８に入り、ここを通過する。ビーム４は、少なくともこの領域において、基板の実質的に平面である表面上に設定された薄い金属コーティング１０で、基板の境界線で基板内の内部全反射を受ける。

アレイフィーチャ２０は、基板の金属層に結合または付着する。プローブ２２は選択されたターゲットアレイフィーチャと相互作用するように示されている。ここに結合する生体分子の数が増えると、これらの質量濃度が増大し、この結果（適用された範囲のビーム角「Ｒ」における所与の入射光の角度について）、光反射率角は「θ」となり、光強度は最大化、最小化、または変化する。

この結果得られる信号２４は典型的には、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージャまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャなどの２次元光検出装置で収集される。この方法でアレイ全体のデータまたはアレイの選択されたセクションのデータを同時に収集することができる。

しかし特に小さな光源ビームを使用する場合、読み取り装置またはスキャナ２８に移動ステージを備え（例えば、ｘ軸、ｙ軸）、ＳＰＲを使用してアレイをラスタスキャンまたは他の方法でスキャンしてもよいことに注意されたい。さらに、このような方法または別の方法でスキャンを行うにしても、アレイの多数のスキャンを行うと、信号の時間的な展開を観察するのに便利である。

スキャンにおいては、選択した光の波長は通常は重要ではない。しかし、反射された光が偏光依存であるという事実を考えると、偏光を調節して反射信号を最小化することが必要な場合がある。別法としては、光源を偏光するより、偏光感知検出を使用するほうが好ましい場合もある。

アレイ
例としてのアレイまたはアレイ３０の一部を図２に示す。上記のように、アレイ３０は基板８を含む。図面を参照すると分かるように、ＳＰＲ感知要素または領域３２（薄い金属膜上に設定された種々のプローブを有する）が基板の実質的に平面な部分上に周期的に備えられる。もちろん、他のパターンまたは周期的なレイアウトを使用してもよいし、また、別の形状のセンサ領域も使用できる。しかし、構成された非反射または反射率の少ない分離領域３４がセンサフィーチャ領域３２の間に配置される。上記のようにこれらの光減衰フィーチャまたは「光減衰手段」により、センサ２６が集める光と暗い反射パターンによって、光が完全に反射される種々のＳＰＲセンサ要素の間を明確に区別することができる。

図３Ａから図３Ｃは、光減衰構造のもっとも基本的なフォーマットを示す。これらは持ち上がった構造５０の形態をとる。光減衰構造は基板および／またはこの上に画定されたセンサ領域（複数可）の高さ（level）に対して持ち上げられている。図示されるように、構造を高くすると光線が側面から逃げるように機能する傾向がある。非常に高く持ち上がった構造では、構造内で反射された光はいくつかの壁に接触し（接触するたびにある程度逃げる）、センサ２６に向けて反射される光よりも多くの光がバックグラウンドとして消散する。フィーチャの適切な高さ（ｈ）と幅（ｗ）は選択される幾何形状に依存する。四角形の幾何形状では、持ち上がった構造５０は有利には、約ｓｉｎβ／ｓｉｎ（９０−β）の高さ／幅の比を有し、上式でβは、基板面に対して垂直な光の入射角である。隣接するフィーチャ３２の間に検出可能なコントラストの線がある限り、幅の大きさは重要ではない。しかし一般に、高さは約１μｍから５μｍのオーダである。

持ち上がった光減衰構造を製造する一つの方法は、基板のインデックスに非常によく一致したインデックスを伴う光パターン形成可能な有機ポリマーまたは無機ポリマーの膜で基板８をスピンコーティングすることである。リソグラフィ曝露の後、膜を生成させ、金などの薄い金属層１０を基板上に蒸着または蒸気付着させる。金はあらゆる場所に付着するが、センサ領域３２を区別する充分に異なる反射率（少なくとも縁において）を充分高く持ち上げた部分５０で得なければならない。上記のように、構造を高くすると、より良好なコントラストが提供される。

しかし図３Ｂに提示される構造５０’は一般に、図３Ａに示される性能と比較して改善された性能を提供する。持ち上がった構造５０’は、図３Ａに示すような、構造５０上に設定された反射性の金のキャップ層１０がない。したがって図３Ｂに示すように光がさらに光減衰構造から逃げられる。追加のフォトリソグラフィステップが必要であるが、図３Ｂに示す持ち上がった構造は、構造５０’を規定する表面層をパターン形成する前に単に金の層をパターン形成することによって容易に形成することができる。

図３Ｃでは、持ち上がった層５０’’は、光源からの光を吸収する色素または染料５２を含む。染料または色素の選択は選択される基板の媒体と光の波長（複数可）に依存する。一般に、染料／色素は、高い吸収率「ε」を有する染料／色素でなければならない。材料に含まれる光吸収媒体の効果に依存して、図３Ａと図３Ｂの本発明の変形例と比べた場合、所望の結果を達成するための光をトラップする幾何形状の重要性は低くなる。図示するように、持ち上がった構造の側面から逃げない光は吸収されるだけである。

図４Ａと図４Ｂは、光減衰の別の手段を示す。持ち上がった面のフィーチャ６０と６０’は、光減衰フィーチャと接触する入射角度「α」を大きくすることによって光線が出ることを促進するように構成された形状で備えられる。典型的には、形状と光の入射角は、出て行く光が、表面に対して実質的に垂直（９０°）である角度αであり、逆反射を最小化するような形状と入射角である。

しかし、入射光を一定範囲の角度全体でスキャンする場合がしばしばあるため、出射角はその角度だけで垂直である。したがって光減衰フィーチャの正しい形状は、検体へのもっとも強い一過性の結合が期待できる位置を考慮して構成しなければならない。したがって、図４Ａに示すようにαは（９０°−λ）という最適値を有する。

図４Ａは、基板面に対して角度のついた縁を伴う三角形の断面の形状６０を示す（すなわち実質的に四角形でもなく基板面に対して垂直でもない）。図４Ｂはカーブした断面の形状６０’を伴う構造を示す。このような方法で機能する他の形状は（少なくとも図３Ａから図３Ｂに示すような単に持ち上がっただけか、９０°の直線的な構造と比較して）、放物線、半円筒型、半球型、ピラミッド型、鋸歯型の構成を含む。他の形状も同様に使用できる。どの場合でもこれらのフィーチャは、上記の色素を使う方法と共に有利に使用できる。

本発明の別の実施形態では、光減衰のために表面格子７０が備えられる。基本的にはこれらのフィーチャは望ましくない光を「漏らして出す」粗い面としての機能を有する。便利には、格子はアレイ要素間で基板上に直接パターン形成することができる。もちろん、選択される格子のピッチは、スキャンのために選択される光の波長に依存する。

別法としては（図６に示す）、格子は持ち上がった層５０の上に設定してもよい。この場合、上の格子７０は図５の場合とほとんど同様に機能するが、スペーサ５０の側面は図３Ａ、図３Ｂ、および／または、図３Ｃと同様に機能する。この反射された光減衰フィーチャの組み合わせは、感知要素領域と、隣接する領域からのバックグラウンドノイズの間のコントラストを改善させなければならない。

しかし一部の場合では、格子は、製造コストが高いかおよび／または製造に時間がかかる、比較的高い構造を深くエッチングしたりまたは構成したりせずに生成できるので、図５に示すように格子だけを使用する場合もある。さらに、格子だけの方法の場合、単色光源で照射し、その結果得られる、反射されたパターン上の異なる色の領域を探すほうが便利である。このようにして、異なる色のスポットの動きを観察することにより、プローブに結合した検体に相関する屈折率の変化を追跡することができる。

本発明のアレイを生成するために多くの製造技術のうち任意の製造技術を使用できる。もちろん、上記のＭＥＭＳとナノ製造技術も使用できる。場合によっては、成型、ホットエンボス、鋳造、スタンプ技術を共に使用してもよいし、別法として使用してもよい。

どの場合でも、屈折率が一致する材料または屈折率が低い材料を基板ベースにオーバレイすることによって、幾何学的な光減衰フィーチャを提供する必要はないことに注意されたい。実際場合によっては、光減衰フィーチャを含む基板は、最初から一片の材料で形成することができる。この場合、モノリシック構造を形成した後、必要な金属層（複数可）およびバイオポリマー剤（複数可）を付着させることができる。さらに、本発明のアレイは複数の予め形成された部分を共に接着することによって形成することも意図されている。

構成する技術にかかわらず、本発明の特徴はルーチンのデザインの最適化の主題である。すなわち、フィーチャの数、正確な形状、フィーチャ間のピッチ、フィーチャの高さ、アスペクト比、材料の組成などの仕様は、導入する化学反応および付随するハードウェアと互換性を有するように選択する。この中には液体送達スキームも含まれる。

有用性
本発明のバイオポリマー光スキャナには種々の用途があるが、一般的な用途は、所与のサンプル内の特定の検体の存在を、定量的ではなくても少なくとも定性的に検出する、検体検出用途である。アレイアッセイを行うプロトコルは当業者によく知られており、ここで詳細に説明する必要はない。一般に、目的の検体を含むと考えられるサンプルを、アレイ上に存在するそれぞれの結合対部材と検体が結合するのに充分な条件下でアレイと接触させる。したがって目的の検体がサンプル内に存在する場合、検体は相補的な結合部材の部位でアレイに結合し、複合体がアレイ面に形成される。センサ領域３４におけるこのアレイ面上の結合複合体の存在はＳＰＲを介して検出される。

目的の特定の検体検出用途には、本発明の核酸アレイを使用するハイブリダイゼーションアッセイを含む。これらのアッセイでは、ターゲット核酸のサンプルをまず調製する。ここで調製にはターゲット核酸を、例えば、信号生成系の部材などの標識で標識することを含んでいてもよい。サンプル調製の後、サンプルをハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させ、これによって、アレイ面に接着したプローブシーケンスと相補的なターゲット核酸（または他の分子）との間で複合体を形成する。ついでハイブリダイズした複合体の存在を検出する。

本発明のアレイを使用して実行できる特定のハイブリダイゼーションアッセイには、遺伝子発見アッセイ、遺伝子発現差解析アッセイ、核酸シーケンシングアッセイなどが含まれる。種々の用途にアレイを使用する方法を説明した参考文献は、米国特許第５，１４３，８５４号、米国特許第５，２８８，６４４号、米国特許第５，３２４，６３３号、米国特許第５，４３２，０４９号、米国特許第５，４７０，７１０号、米国特許第５，４９２，８０６号、米国特許第５，５０３，９８０号、米国特許第５，５１０，２７０号、米国特許第５，５２５，４６４号、米国特許第５，５４７，８３９号、米国特許第５，５８０，７３２号、米国特許第５，６６１，０２８号、米国特許第５，８００，９９２号を含む。これらの開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。アレイがポリペプチド結合剤のアレイである場合（例えば、タンパク質アレイ）、目的となる特定の用途には、検体検出／プロテオミクス用途が含まれ、この中には、米国特許第４，５９１，５７０号、米国特許第５，１７１，６９５号、米国特許第５，４３６，１７０号、米国特許第５，４８６，４５２号、米国特許第５，５３２，１２８号、米国特許第６，１９７，５９９号、および、国際公開第９９／３９２１０号パンフレット、国際公開第００／０４８３２号パンフレット、国際公開第００／０４３８９号パンフレット、国際公開第００／０４３９０号パンフレット、国際公開第００／５４０４６号パンフレット、国際公開第００／６３７０１号パンフレット、国際公開第０１／１４４２５号パンフレット、国際公開第０１／４０８０３号パンフレットが含まれる。これらの開示も引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

いずれにしても、アレイの測定値の結果は、生の結果であってもよいし（例えば、各フィーチャの一つまたは複数の色チャネルの強度の測定値など）、または、測定値に飽和率を適用すること、既定の閾値を超えるかまたは既定の閾値未満のフィーチャの測定値を拒否すること、および／または、アレイから読み取られたパターンに基づいて結論を形成する（例えば、特定のターゲットシーケンスがサンプル内に存在していたかどうかに関する結論）などによって得られる、処理された結果であってもよい。場合によっては、測定値の結果（処理される場合もあれば処理されない場合もある）は、（通信などにより）遠隔の場所に転送し、ここで受信してさらに使用してもよい（さらに処理するなど）。言い換えれば、一部の変形例では、本発明の方法は、データを、検出および導出ステップのうち少なくとも一つから遠隔の場所に送信するステップを含んでいてもよい。データは遠隔の場所に送信しさらに評価および／または使用することができる。例えば、ファクシミリ、モデム、インターネットなど、任意の便利な通信手段を使用してデータを送信することができる。別法または追加としては、アレイの結果を表すデータを上記または他の、種々のコンピュータ読み取り可能な媒体上に記憶してもよい。当業者であれば明らかなように、このような情報の保持は種々の理由のうち任意の理由で便利である。

キット
本発明と共に使用するキットも提供することができる。このようなキットは典型的には、少なくとも、上記の機能を具体化するかまたは上記の機能を指示するように構成された説明書およびプログラミングを含むコンピュータ読み取り可能な媒体を含む。説明書にはソフトウェアのインストールまたはセットアップの指示を含んでいてもよい。説明書はスキャナに所望の機能を実行させる指示を含んでいてもよい。典型的には、説明書は両方のタイプの情報を含む。

ソフトウェアおよび説明書をキットとして提供することにはいくつかの目的がある。図１に示すように、組み合わせはパッケージ８０内にパッケージングし、既存のスキャナを更新する手段として購入できるようにしてもよい。全プログラムまたはプログラムの一部（典型的には、少なくとも本発明の方法を定義するコードだけか、またはすでに入手可能なコードとの組み合わせ）を更新パッチとして提供することができる。別法としては、ソフトウェアを予めロードした新しいスキャナと共にこの組み合わせを提供してもよい。どの場合でも、説明書はリファレンスマニュアル（またはその一部）として、および、予めロードされたユーティリティのバックアップコピーのコンピュータ読み取り可能な媒体として機能することができる。

別の場合では、本発明によるキットは、上記のアレイ３０のうち少なくとも一つをパッケージ８０の中に含む。特に一つまたは複数のアレイを含むキットでは、一つまたは複数のサンプル調製試薬、バッファなどの検体検出アッセイを行うために必要な一つまたは複数の追加の構成要素を含むことが望ましい場合もある。したがってキットは、バイアルまたはボトルなど一つまたは複数の容器８４を含み、各容器は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイなどのアレイアッセイを行うための、アッセイの別の構成要素および試薬を含んでいてもよい。キットはまた、バッファ（ハイブリダイゼーションバッファなど）、洗浄用媒質、酵素基質、標識したターゲット核酸サンプルなどの標識ターゲットサンプルを生成するための試薬、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールなどを含んでいてもよい。上記のように、取扱説明書（しかし、今回はアレイベースのアッセイを行うためにアレイアッセイデバイスを使用するための説明書である）をキット内で提供してもよい。

任意の説明書は一般には適切な記録媒体に記録する。例えば、説明書は紙またはプラスチックなどの印刷物に印刷してもよい。したがって説明書は、パッケージ挿入物８２、キットの容器またはキットの構成要素のラベル（すなわちパッケージまたは内側のパッケージと関連づける）などとしてキットに入れることができる。別の実施形態では、説明書は、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体４２上に存在する電子記憶データファイルとして存在しており、プログラムが存在する媒体と同じ媒体でもよい。

さらに別の実施形態では、説明書はキット内には存在せず、例えばインターネットを介して遠隔の供給源から説明書を得る手段を提供する。この実施形態の例は、説明書を見るか、および／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。逆に、ウェブアドレスを提供するなどで、遠隔の供給源から本発明のプログラミングを得る手段を提供してもよい。さらに、キットは、インターネットまたはワールドワイドウェブなど遠隔の場所から説明書とソフトウェアの両方を得るかまたはダウンロードできるものであってもよい。もちろん、所定の形態のアクセスセキュリティまたは識別プロトコルを使用して、本発明を使用する権利のある者にアクセスを限定することができる。説明書に関しては、説明書および／またはプログラミングを得るための手段は一般に、適切な記録媒体上に記録する。

本発明を特定の具体例を参照して説明し、選択肢としては種々の機能を組み込んだが、本発明は具体的に記載された例に限定されない。本発明の実施形態の範囲は、添付の請求の範囲文言通り、または均等な範囲によってのみ限定されることを理解されたい。

上記から、上記の本発明は、光スキャナの精度を向上させ寿命を延ばす、効果的で容易に適用可能な方法を提供することが明らかである。

本明細書に引用されたすべての刊行物および特許は、個別の刊行物または特許が引用することにより具体的および個別に本明細書の一部をなすように、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。任意の刊行物を引用したのは、これらが本明細書の提出日以前に開示されたために過ぎない。本発明の実施形態は、以前の発明によるこのような刊行物から予期されるものではないことを理解されたい。

本発明の特定の実施形態を説明したが、当業者であれば、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができ、また等価物と置き換えられることが理解されるであろう。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップ（複数可）、を、本発明の目的、精神、範囲に適応させるために種々の修正を行うこともできる。このような修正も添付の請求の範囲内にあることが意図されている。特段の記載のない限り、本発明の実施形態は、添付の請求の範囲を除外するものではない。

アレイ解析のためのＳＰＲ設定を例示する図である。 図１に示された設定で使用できるアレイを例示する図である。 基本的な光減衰構造の変形例を使用した、本発明のアレイ実施形態の側面断面図である。 基本的な光減衰構造の変形例を使用した、本発明のアレイ実施形態の側面断面図である。 基本的な光減衰構造の変形例を使用した、本発明のアレイ実施形態の側面断面図である。 大規模な光減衰構造のための代替の幾何形状の側面断面図である。 大規模な光減衰構造のための代替の幾何形状の側面断面図である。 図４に示された光減衰構造より小規模な光減衰構造を示す図である。 図３Ａから図３Ｃに示された特徴と、図５に示された特徴とを組み合わせた組み合わせ型の光減衰構造を示す図である。

符号の説明

２ 光源
４ ビーム
６ プリズム
８ アレイ基板
１０ 金属コーティング
２０ アレイフィーチャ
２２ プローブ
２４ 信号
２６ センサ
２８ スキャナ
３０ アレイ
３２ センサ領域
３４ 分離領域
４０ コンピュータ
４２ コンピュータ読み取り可能な記憶媒体
５０ 持ち上がった構造
６０ 持ち上がったフィーチャ
７０ 表面格子
８０ パッケージ
８２ パッケージ挿入物

Claims (24)

1. 光減衰領域によって互いから分離された複数の化学プローブ表面プラズモン共鳴センサ領域を伴う表面を有する基板を含み、
   前記アレイは、該アレイ上の表面結合の多重表面プラズモン共鳴検出のために構成されている化学プローブアレイ。
2. 前記光減衰領域は光減衰のための手段である請求項１に記載のアレイ。
3. 前記光減衰領域のうち少なくとも一部は、前記表面プラズモン共鳴センサ領域の高さに対して持ち上がった構造を有する請求項１に記載のアレイ。
4. 前記持ち上がった構造は金属キャップ膜を含んでいない請求項３に記載のアレイ。
5. 前記持ち上がった構造は光吸収材を含む請求項３に記載のアレイ。
6. 前記持ち上がった構造は前記表面プラズモン共鳴センサ領域に対して角度を有するかまたはカーブしている請求項３に記載のアレイ。
7. 少なくとも１０個の表面プラズモン共鳴センサ領域を備える請求項３に記載のアレイ。
8. 前記持ち上がった構造は格子で覆われている請求項３に記載のアレイ。
9. 前記光減衰領域のうち少なくとも一部は格子を含む請求項１に記載のアレイ。
10. 前記アレイの化学物質はポリペプチドと核酸とから選択されるバイオポリマーである請求項１に記載のアレイ。
11. 検体を含むと考えられるサンプルを化学アレイと接触させるステップであって、該アレイは多重表面プラズモン共鳴のために構成され、前記アレイは、基板と、複数のセンサ領域と、反射された光においてパターンを生成する該センサ領域間の複数のフィーチャ間光減衰領域とを含み、
    前記アレイに光を向けるステップと、
    反射された光を収集するステップと、
    前記反射された光の性質に基づいて前記サンプル内で前記検体の存在を決定するステップと
    を含む多重表面プラズモン共鳴解析方法。
12. 前記検体はポリペプチドと核酸とから選択される請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法は、前記検体の存在を決定するステップから得られた結果を第１の場所から第２の場所に送信するデータ送信操作をさらに含む請求項１１に記載の方法。
14. 前記第２の場所は遠隔の場所である請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１１に記載の方法の結果を表すデータを受信するステップをさらに含む方法。
16. 請求項１１に記載の方法を指示するように構成されたプログラムの少なくとも一部を含むコンピュータ読み取り可能な媒体。
17. 前記プログラム全体が前記コンピュータ読み取り可能な媒体に提供されている請求項１６に記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
18. キットの使用説明書と組み合わせてパッケージされた、請求項１６に記載のコンピュータ読み取り可能な媒体を含むキット。
19. 請求項１１に記載の方法に従って生成されるアレイの結果を表すデータを含むコンピュータ読み取り可能な媒体。
20. 請求項１に記載のアレイと、
    アッセイを行うための使用説明書の少なくとも一つ、または、アッセイを行うための試薬を含む少なくとも一つの容器と
    を含むキット。
21. 請求項１に記載のアレイと、
    光源と、検出装置と、マイクロプロセッサとを含むアレイ読み取り装置と
    を含んでなるアレイ読み取りシステム。
22. 請求項１１に記載の方法に従って動作するようにプログラミングされた請求項２１に記載のシステム。
23. 前記読み取り装置は前記アレイに隣接したプリズムをさらに含み、光が該プリズムを通って前記センサ領域に向けられ、該センサ領域から反射される請求項２１に記載のシステム。
24. 前記アレイはバイオポリマーアレイである請求項２１に記載のシステム。

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