JP2005062145A - バイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システム - Google Patents

Abstract

【課題】 効率的かつ多種類のバイオ分子に対応し得るハイブリダイゼーションの確認システムを提供すること。
【解決手段】 バイオチップ又はマイクロプレート、及び蛍光剤を使用したハイブリダイゼーションの確認システムにおいて、複数個の量子ドット蛍光剤を用意し、必要に応じて量子ドット蛍光剤同士を相互に混合することによって、中間カラーによる蛍光を発生させることに基づき、多種類の標的バイオ分子を一挙に特定することを可能とするバイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システム。
【選択図】 図１

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの人工核酸、タンパク質、ペプチドなどのバイオ分子の種類を特定するために行われているバイオチップ又はマイクロプレートを用いたハイブリダイゼーションの確認システムに関するものである。

バイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システムは、所定の形状を有しているバイオチップ又はマイクロプレートに対し、基準となるバイオ分子を所定の規則に従って配列したうえで、試験の対象となっている標的バイオ分子を投与し、前記のように配列された基準バイオ分子との間にて結合、即ちＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸の場合の相補結合、及びタンパク質の場合の親和結合が行われたか否か、及び結合が行われた場合、如何なる基準バイオ分子との間において結合が行われたかを確認することによって、標的バイオ分子の種類を特定するという方法を採用している。

前記バイオチップは、通常ガラス又はプラスチックによる平板形状の素材が採用されているが、近年、中空繊維を並列状に配列したことによる立体型のバイオチップも採用されるに至っている。

前記マイクロプレートは、１枚のプレートに、バイオ分子による反応を行うための容器（ウエル）を複数個所定の順序にて配列した構成を採用しており、通常ポリスチレンを素材として採用する場合が多い。

主たる利用方法としては、複数個の反応容器に基準となる抗体を配列したうえで、多数の標的サンプルを各反応容器に投与し、標的抗源の有無を確認するという所謂マイクロプレート法を典型例として挙げることができる。

上記特定方法としては、電気的手法と光学的手法とが存在する。

電気的手法は、ハイブリダイゼーションにおける結合が生じていない場合には、鎖状のバイオ分子が高抵抗を呈するのに対し、鎖状のバイオ分子同士の結合が生じている場合には、π電子の共有結合（π結合）に基づいて結合している基準バイオ分子の一方端と、標的バイオ分子の他方端との間の抵抗値が低下することによって、結合の有無を確認している。

しかしながら、前記電気的手法の場合には、バイオチップ又はマイクロプレートを構成する各素子として、高純度の貴金属（通常の場合、金）を用いることが要求されるため、高い経済コストを余儀なくされ、しかも前記バイオ分子鎖の抵抗値の測定には、高度の熟練技術を必要とする。

他方、光学的手法としては、標的バイオ分子に対し、それぞれ個別に蛍光剤を付着し、順次バイオチップ上の基準バイオ分子に投与した場合に、結合しない場合には蛍光剤による蛍光が発生せず、結合が生じた場合には、蛍光剤による固有のカラーを有している蛍光が発生することを利用して、発生した蛍光のカラーがバイオチップ又はマイクロプレートにおいて如何なる配列部位に生じているかを判別することによって、各蛍光剤を付着したバイオ分子の種類を特定することを基本原理としている。

前記光学的手法においては、通常図１に示すように、反射機能と透過機能とを有しているビー厶スプリッター１２、及び対物用レンズ１１を介してレーザービームを入射光としてバイオチップ又はマイクロプレート２上の標的バイオ分子にそれぞれ付着している蛍光剤に照射することによって、励起した蛍光剤が発生する蛍光は、当該対物用レンズ１１、ビームスプリッター１２を通過したうえで、フィルター１４、更には検出用レンズ１５を通過することによって、前記光の検出を伴う前記確認が行われている。

図１に示す光学上の方式は、「共焦点方式」と称されているが、従来の光学的手法では、各固有のカラーを発する蛍光剤を励起する入射光は、それぞれ波長領域が限定されている。

このため、各蛍光剤に基づく前記確認作業は、各蛍光剤をそれぞれ励起するための異なる入射光を使用することを不可欠とすることから、ハイブリダイゼーションにおける結合の有無は、個別の各蛍光剤、及び対応する励起用の入射光毎に個別に行うことを余儀なくされ、バイオチップ又はマイクロプレート２における配列について、一挙に検出することは事実上不可能であった。

従って、図２（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すように、各蛍光剤に基づく発色状況によって個別の光学的処理を行い、これらを合成（重畳）しなければ、図２（ｄ）に示すような１個のバイオチップ又はマイクロプレート２における蛍光カラーによる全発色状況を確認することは不可能であった。

しかしながら、このような各蛍光剤毎に個別の確認作業を行うことは、作業効率として極めて煩雑であり、この点を改善することは不可欠の事項として要請されていた。

他方、各蛍光剤を相互に混合することによって、所望の中間色（中間カラー）を得ることによって、多数のカラーを用いて、多種類のバイオ分子の種類の特定を行うことが要請されるが、従来の蛍光剤の場合には、励起するための入射光の波長領域が限定されているため、このような混合による中間色を得ることは、事実上困難とならざるを得ない。

関連特許

関連特許１

特開２０００−２３５０３５号公報

関連特許２

特開２００２−３３０７６８号公報

関連特許３

特表２００２−５２１０６６号公報

関連特許４

特表２００２−５４４４８８号公報

発明が解決しようとする課題

本発明は、前記の如き従来技術の問題点を克服し、ハイブリダイゼーションにおける基準バイオ分子と標的バイオ分子との結合の有無、及び結合における組み合わせに関し、１個のバイオチップ又はマイクロプレートにおいて、各蛍光剤が発生する蛍光による全発色状況を一挙に確認し得ると共に、バイオ分子の多数の種類の特定についても、十分対応可能であるようなシステムを提供することを課題とするものである。

課題を解決するための手段

前記課題を解決するため、本発明の構成は、バイオチップ又はマイクロプレートに、所定の順序にて配列されている基準バイオ分子に対し、固有のカラーを有する蛍光剤を個別に付着した標的バイオ分子を投与し、基準バイオ分子と標的バイオ分子とが結合した場合に、蛍光剤が発生する蛍光のカラーによって、各標的バイオ分子の種類を特定するハイブリダイゼーションの確認システムにおいて、約１０ｎｍの単位の半導体内に電子を閉じ込め、電子のエネルギー順位が離散的な量子エネルギー順位となるような状態にあり、かつ蛍光剤を構成する粒子の大きさが異なることによって、発生する蛍光カラーが相違している複数個の量子ドット蛍光剤を用意し、当該用意した量子ドット蛍光剤が発生する蛍光カラーの中間色による蛍光カラーを必要とするときには、当該複数個の量子ドット蛍光剤の全部又は一部を所定の割合にて相互に混合したことによる蛍光剤を採用し、前記結合の確認に際し、各蛍光剤が発生する蛍光が有している波長よりも小さな波長の入射光によって混合前、及び、又は混合したことによる各量子ドット蛍光剤が有している固有の各カラーによる蛍光を発生させることに基づくバイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システムからなる。

本発明は、光学方式によるハイブリダイゼーションにおいて、量子ドットによる蛍光剤を使用していることを要件としている。

このため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸などの相補性による結合、及びタンパク質の親和性による結合を実現するための実施形態として、共焦点方式を採用し得る点では、従来技術の場合と共通している。

量子ドットによる蛍光素材においては、電子を単位空間を約１０ｎｍの空間に閉じ込めることによって、個別の電子が有するエネルギーを、連続的なバンド構造ではなく、量子単位による離散的なエネルギー順位とし、電子による当該エネルギー順位の変化によって蛍光を発生するが、当該蛍光が有している固有のカラーを左右する光の波長は、量子ドット蛍光剤を形成する粒子の大きさによって左右されることを基本的な特徴としている。

そして、量子ドット蛍光剤の内部における電子のエネルギー順位を上昇させるために、蛍光剤を励起する入射光波は、当該量子ドット蛍光剤が発生する光の波長よりも短い波長であれば良く、従来の蛍光剤の場合のように、励起用の入射光につき、特定の波長領域に属することを必要としない点に、画期的な意義が存在する。

このような量子ドット蛍光剤をハイブリダイゼーションにおいて採用することによって、標的となっているバイオ分子に付着した各量子ドット蛍光剤が発生する蛍光が有している波長よりも短い波長を有する光を入射光線として、各量子ドット蛍光剤を励起すれば良く、従来技術の場合のように、各蛍光剤毎に励起を行うための入射光をそれぞれ選択したうえで、個別にハイブリダイゼーションの確認作業を行わねばならないという煩雑な作業を免れ、共通の励起用入射光を使用し得る点に、第１の基本的技術思想が存在する。

このため、図１に示すような共焦点方式においても、各蛍光剤が発する蛍光が有している波長よりも短い共通の励起用入射光を使用することによって、図２（ｄ）に示すようなバイオチップ又はマイクロチップの配列基準に従った基準バイオ分子と標的バイオ分子とによる結合による全発色状況を一挙に確認し、当該確認に基づく画像処理を行うことができる。

しかも、量子ドット蛍光剤の場合には、蛍光剤を形成する粒子の大きさによって発生する蛍光のカラーが左右されることから、色々なカラーの蛍光剤を使用することが可能であり、これによって多種類の標的バイオ分子の特定を実現することができる。

しかしながら、ハイブリダイゼーションの確認を行うに際し、常に目標となるようなカラーの蛍光を発生するような量子ドット蛍光剤が備わっているとは限らない。

本願発明は、必要に応じて、既存の量子ドット蛍光剤を相互に混合することによって、発色光の混合による中間色（中間カラー）による蛍光のカラーを得ることを第２の基本的技術思想としている。

このような中間色を得ることによって、備えている量子ドット蛍光剤の種類が限定されているとしても、色々な標的バイオ分子に対して、多数のカラーによる蛍光を発生する量子ドット蛍光剤を付着することができるため、多種類のバイオ分子の特定を行うことが可能となる。

各量子ドット蛍光剤を励起するための入射光として、可視光線を使用する場合には、バイオチップ又はマイクロプレートからの反射光によって、各量子ドット蛍光剤による発色光がディスターブされることを防止するために、当該反射された入射光を遮断し、かつ各量子ドット蛍光剤が発生する蛍光を透過するようなフィルター、即ち各量子ドット蛍光剤が発生する蛍光が有している波長領域の光線を透過する一方、励起用入射光による波長領域の光線を遮断するようなフィルターを採用することによって、前記画像処理が行われることが多い。

これに対し、各量子ドット蛍光剤を励起する入射光として紫外線を採用した場合には、当該紫外線は、可視光線に該当しないため、各量子ドット蛍光剤が発生した蛍光と共存したところで、当該蛍光のカラーをディスターブする訳ではないので、可視光線を使用する場合のようなカラーフィルターを使用する必要はない。

画像処理の方式としては、通常のカメラ、及びデジタルカメラによる撮影、ビデオカメラ、及びテレビカメラによる撮影などが可能であり、この点は、従来技術の場合と同様である。

このような画像処理においては、通常ＲＧＢによる原色を用いた撮影による画像を得ているが、各量子ドット蛍光剤が発生した蛍光の各カラーによる分布状況は、前記ＲＧＢの原色の混合によって概略再現することができる。

以下、実施例に従って説明する。

実施例においては、緑色（Ｇ）の蛍光カラーを発生する量子ドット蛍光剤と赤色（Ｒ）を発光する量子ドット蛍光剤を所定の比率にて相互に混合することによって、黄緑色、黄色、オレンジ色、オレンジレッド色、レッドオレンジ色の中間色を得ることを特徴としている。

具体的には、緑色量子ドット蛍光剤として、波長を５２５ｎｍの発光カラーを有する素材を選択し、赤色量子ドット蛍光剤として、波長を６５１ｎｍによる蛍光カラーを発生する素材を選択し、その混合比率を変えることによって、以下のような中間色を得ることができた。

緑色量子ドット蛍光剤／赤色量子ドット蛍光剤による重量比率 中間カラー
１０／２ 黄緑色
８／４ 黄色
６／６ オレンジ色
４／８ オレンジレッド色
２／１０ レッドオレンジ色

発明の効果

以上による本願発明においては、共通の励起用入射光を採用することによって、各バイオチップ又はマイクロプレートの配列に対応したハイブリダイゼーションによる全結合状況を一挙に確認することが可能となると共に、多数の発色光を採用することによって多種類の標的バイオ分子の特定を実現することが可能となる。

しかも、一挙に画像処理を行うことができるため、操作も簡単であり、然したる熟練を必要とする訳ではない。

このように、本願発明は、光学方式によるハイブリダイゼーションの確認システ厶において、画期的な意義を有しており、その価値は絶大である。

従来技術及び本発明の実施形態として採用されている共焦点方式に関する基本原理図である。 １個のバイオチップ又はマイクロプレートにおいて、確認される基準バイオ分子と標的バイオ分子との結合結果を示す平面図であり、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は従来技術において個別の蛍光剤に対応した発色状況を示しており、（ｄ）は、従来技術において各結合結果を重畳することによって得られた全発色状況、及び本発明によって一挙に得られた全発色状況をそれぞれ示している。

符号の説明

１ 検出装置
１１ 対物用レンズ
１２ ビームスプリッター
１３ ミラー
１４ フィルター
１５ 検出用レンズ
１６ 検出器
２ バイオチップ又はマイクロプレート
ａ、ｂ、ｃ 各蛍光による色（カラー）を示す。

Claims (3)

1. バイオチップ又はマイクロプレートに、所定の順序にて配列されている基準バイオ分子に対し、固有のカラーを有する蛍光剤を個別に付着した標的バイオ分子を投与し、基準バイオ分子と標的バイオ分子とが結合した場合に、蛍光剤が発生する蛍光のカラーによって、各標的バイオ分子の種類を特定するハイブリダイゼーションの確認システムにおいて、約１０ｎｍの単位の半導体内に電子を閉じ込め、電子のエネルギー順位が離散的な量子エネルギー順位となるような状態にあり、かつ蛍光剤を構成する粒子の大きさが異なることによって、発生する蛍光カラーが相違している複数個の量子ドット蛍光剤を用意し、当該用意した量子ドット蛍光剤が発生する蛍光カラーの中間色による蛍光カラーを必要とするときには、当該複数個の量子ドット蛍光剤の全部又は一部を所定の割合にて相互に混合したことによる蛍光剤を採用し、前記結合の確認に際し、各蛍光剤が発生する蛍光が有している波長よりも小さな波長の入射光によって混合前、及び、又は混合したことによる各量子ドット蛍光剤が有している固有の各カラーによる蛍光を発生させることに基づくバイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システム。
2. 蛍光剤を励起する入射光として、紫外線を採用することを特徴とする請求項１記載のバイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システム。
3. 緑色（Ｇ）の蛍光カラーを発生する量子ドット蛍光剤と赤色（Ｒ）を発光する量子ドット蛍光剤を所定の比率にて相互に混合することによって、黄緑色、黄色、オレンジ色、オレンジレッド色、レッドオレンジ色の中間色を得ることを特徴とする請求項１記載のバイオ分子におけるハイブリダイゼーションの確認システム。

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