【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子治療等に用いられる医薬に関する。更に詳しくは、細胞接着活性及び繊維芽細胞成長因子活性を合わせ持つポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードする遺伝子からなる医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
虚血性心臓病や閉塞性動脈硬化症等の虚血性疾患における治療法はまず第１に血管形成手術が試みられる。これらの方法は確立された有効な治療法であるが、一定の確率（３０〜４０％）で拡張した血管の再閉塞がみられ、現在の臨床上の限界と考えられている。このような症例に対して虚血領域の周辺組織からの血管新生や側副血行の発達を人為的に促進し、虚血組織の傷害／壊死を軽減させ、本来の機能を回復させようとする治療的血管新生療法が試みられている。
基礎研究の場ではさまざまな成長因子を用いた血管新生療法が試みられており、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ等の効果が主に動物実験により確かめられている。臨床応用については１９９６年、米国タフツ大学のＩｓｎｅｒらの研究グループがＶＥＧＦ１６５遺伝子を含む発現プラスミドベクター（Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）を下肢虚血患者の血管内にカテーテルを用いて投与し、有意な側副血行の改善を報告した〔Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．；ランセット（Ｌａｎｃｅｔ），第３４８巻，第３７０〜３７４頁（１９９６）〕のをはじめ、１９９８年にはドイツのＳｃｈｕｍａｃｈｅｒらのグループが狭心症患者の冠動脈バイパス手術の際、ｂＦＧＦタンパク質を吻合部付近に注入し、有意な血管新生、側副血行が観察された〔Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．；サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ），第９７巻，第６４５〜６５０頁（１９９８）〕等の報告がされている。しかしながら、十分な治療効果が見られた症例はまだ報告されておらず、さらに効果の高い血管新生因子が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術を鑑み行われたもので、本発明の目的は、血管新生療法に有用な新規な遺伝子治療用医薬を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、既にフィブロネクチンの細胞結合領域とｂＦＧＦを融合させた新たな機能性ポリペプチドＣ−ＦＧＦを開発し、該ポリペプチドがｂＦＧＦよりも強力な血管新生能を有することを明らかにしている（日本特許公報第２８２９４０５号、米国特許公報第５３０２７０１号）。今回、本発明者らは、鋭意研究の結果、 前記Ｃ−ＦＧＦをコードする遺伝子が、遺伝子治療用医薬として有用であることを見出した。さらに本発明者らは、分泌シグナル配列を付加することにより、さらに効果が高まることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明を概説すると、本発明の第１の発明は、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び繊維芽細胞成長因子活性を有するポリぺプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる医薬に関する。
【０００６】
本発明の第２の発明は、分泌シグナルのアミノ酸配列、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、及び繊維芽細胞成長因子のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明の第３の発明は、第２の発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【０００８】
本発明の第４の発明は、第３の発明の遺伝子を有するベクターに関する。
【０００９】
本発明の第５の発明は、第４の発明のベクターからなる医薬に関する。
【００１０】
本発明の第６の発明は、第５の発明のベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００１１】
本発明の第７の発明は、第６の発明の形質転換体を培養し、該培養物より第２の発明のポリペプチドを採取することを特徴とする第２の発明のポリペプチドの製造方法に関する。
【００１２】
本発明の第８の発明は、第２の発明のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする医薬に関する。
【００１３】
本発明の第９の発明は、血管新生促進剤である第１、第５、第８の発明の医薬に関する。
【００１４】
本発明の第１０の発明は、動脈疾患治療剤である第１、第５、第８の発明の医薬に関する。
【００１５】
本発明の第１１の発明は、軟骨傷害治療剤である第１、第５、第８の発明の医薬に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（以下ＦＧＦを略記することがある）は、繊維芽細胞や内皮細胞等の増殖を促進する因子であり、生体内では血管新生、創傷治癒、発生等に関与していると考えられている。繊維芽細胞成長因子はファミリーを形成し、そのメンバーは少なくとも１８種類以上あると考えられている。
本発明に使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドとしては特に限定はなく、ＦＧＦファミリーに属する任意の成長因子が使用され、好適には、強い血管新生作用を有する塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ、ＦＧＦ２）が使用される。
ｂＦＧＦは１５５アミノ酸よりなるポリペプチドであるが、Ｎ末端側の２５アミノ酸が欠失した１３０アミノ酸からなるポリペプチドもＦＧＦ活性を有することが知られている。また、１５５アミノ酸のｂＦＧＦのＮ末側に、４１アミノ酸、４６アミノ酸又は５５アミノ酸が付加された、それぞれ１９６アミノ酸、２０１アミノ酸、２１０アミノ酸からなる高分子量型ｂＦＧＦが知られている。本発明においては、何れのｂＦＧＦも使用でき、好適には配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有する１５５アミノ酸からなるｂＦＧＦが使用される。
本発明に使用されるＦＧＦは、ＦＧＦ活性を有するものであれば、天然型のＦＧＦのアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたものであっても良い。かかる変異を有するＦＧＦとしては、例えば、日本特許公報第２８２９４０５号に記載のポリペプチド、即ち、本明細書の配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の１２８番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたものが挙げられる。
なお、ＦＧＦ活性は、公知の方法、例えば、細胞増殖促進の指標となる３Ｈ―チミジンの取込み活性を測定することにより測定可能であり、例えば、西川らの方法〔メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１４６巻、第１１〜２３頁（１９８７）〕に準じて測定することが出来る。
【００１７】
本発明に使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、特に限定はなく、上記した本発明で使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を使用することが出来る。例えば、配列番号の配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が使用され、その一例として、配列表の配列番号４に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
また、天然型のＦＧＦのアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子も使用することができる。例えば、日本特許公報第２８２９４０５号に記載のポリペプチドをコードする遺伝子、即ち、本明細書の配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の１２８番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたポリペプチドをコードする遺伝子が使用され、例えば、配列表の配列番号４に示す塩基配列の３８３番目のＡがＧに置換された配列を有するもの等が挙げられる。
また、本発明に使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、上記した塩基配列の相補鎖に、厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．）に記載の方法により実施することが出来る。また、上記厳密な条件下とは、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌ ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
なお、縮重遺伝子を介して、前記遺伝子とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明に使用できる。
【００１８】
本発明の、細胞接着活性を有するポリペプチドとしては特に限定はなく、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、テネイシン等の細胞外マトリックス分子、あるいは該分子のフラグメントが挙げられ、好適にはフィブロネクチンの細胞接着ドメインに由来するポリペプチドが使用される。フィブロネクチンの細胞接着ドメインとしては、ＶＬＡ−５レセプター結合性リガンドであるＲＧＤＳ配列を含む領域、ＶＬＡ−４レセプター結合性リガンドであるＣＳ−１配列を含む領域が存在し、何れも本発明に使用でき、特にＶＬＡ−５結合性ポリペプチドが好適に使用される。
ＶＬＡ―５結合性ポリペプチドとしては、例えば、特公平８―２９０９８号に記載のＣ−２８３（Ａｌａ１２３５―Ｍｅｔ１５１７）、特許第２５６１１１３号に記載のＣ−２０６（Ｇｌｕ１３１２−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−２１９（Ｐｒｏ１２９９−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−２５８（Ｐｒｏ１２６０−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−２７９（Ｐｒｏ１２３９−Ｍｅｔ１５１７）、特許第２５６１１３１号に記載のＣ−２７４（Ｐｒｏ１２３９−Ａｓｐ１５１２）、特許第２５６１５２６号に記載のＣ−３８５（Ａｌａ１１３３−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−４２８（Ｐｒｏ１０９０−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−４７８（Ｇｌｙ１０４０−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−４８１（Ａｌａ１０３７−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−５０４（Ｇｌｙ１０１４−Ｍｅｔ１５１７）、 特許第３１０４１７８号に記載のＣ−２７７（Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）等が挙げられ、好適には配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ−２７７が使用される。
ＶＬＡ−４結合性ポリペプチドとしては、例えば特許第３１０４１７８号に記載のＣＳ１が挙げられる。
ＶＬＡ−５結合性ポリペプチドとＶＬＡ−４結合性ポリペプチドの融合タンパク質も本発明に使用でき、例えば、特許第３１０４１７８号に記載のＣ−ＣＳ１が使用できる。
本発明に使用される細胞接着活性を有するポリペプチドは、細胞接着活性を有するものであれは、天然型のポリペプチドのアミノ酸に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などの変異が導入されたものであっても良い。かかる変異を有するポリペプチドとしては、例えば特許第２５６２９５１号に記載のＣ−２７９（Ｓ→Ｖ）等が挙げられる。
なお、細胞接着活性は、公知の方法、例えばルオスラティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）らの方法〔メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕にて測定することが出来る。
【００１９】
本発明の使用される細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には特に限定はなく、上記した本発明で使用される細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を使用することが出来る。例えば、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が使用され、その一例として、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
また、細胞接着活性を有する天然型のポリペプチドのアミノ酸に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などの変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子も使用することが出来る。
また、本発明に使用される細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、上記した塩基配列の相補鎖に、厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
ハイブリダイゼーションは前記した方法に従って行なうことが出来、また厳密な条件とは前記した条件が挙げられる。
なお、縮重遺伝子を介して、前記遺伝子とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明に使用できる。
【００２０】
本発明の細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とＦＧＦ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いは該ポリペプチドをコードする遺伝子において、細胞接着活性を有するポリペプチドとＦＧＦ活性を有するポリペプチドの順序に限定はなく、Ｎ末側は細胞接着活性を有するポリペプチドであっても良く、またＦＧＦ活性を有するポリペプチドであっても良い。
細胞接着活性を有するポリペプチドとＦＧＦ活性を有するポリペプチドは直接結合していても良く、またスペーサーを介して結合していても良い。
かかる細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とＦＧＦ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＣ−２７７のＣ末側に配列番号３のアミノ酸配列からなるｂＦＧＦが結合したＣ−ＦＧＦ、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＣ−２７７のＣ末側に配列番号３のアミノ酸配列の１２８番目のＬｙｓがＡｒｇに置換された点変異ｂＦＧＦが結合したＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）が挙げられ、特にＣ−ＦＧＦが好適に使用される。該Ｃ−ＦＧＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
なお、Ｃ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）は、配列表の配列番号５の４０５番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列を有する。
【００２１】
該ポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明に好適に使用され、特にＣ−ＦＧＦをコードする遺伝子が好適に使用される。該Ｃ−ＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号６に示す。また、Ｃ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）をコードする遺伝子の塩基配列としては、配列表の配列番号６の１２１４番目のＡがＧに置換されたもの等が挙げられる。
なお、配列表の配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドＣ−ＦＧＦをコードするプラスミドを保持する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＹＭＨ―ＣＦ・Ａと表示し、独立行政法人産業技術総合研究所にＦＥＲＭ ＢＰ―５２７８として寄託されている。
また、配列表の配列番号５のアミノ酸配列の４０５番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）をコードするプラスミドを保持する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ―ＣＦと表示し、独立行政法人産業技術総合研究所にＦＥＲＭ Ｐ―１２５５９として寄託されている。
【００２２】
本発明に使用される分泌シグナルに特に限定はなく、タンパク質を細胞外に分泌させることが出来る任意のシグナルを使用することが出来、例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する成長因子の分泌シグナルが使用でき、特にＦＧＦ−４の分泌シグナルが好適に使用される。配列表の配列番号１にＦＧＦ−４の分泌シグナルのアミノ酸配列を、配列番号４に該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。ＦＧＦ−４をコードする遺伝子は既にクローニングされており、その分泌シグナルのアミノ酸配列、遺伝子配列は公知である〔ＴａｉｒａＭ．，ｅｔ ａｌ．；プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ），第８４巻，第２９８０〜２９８４頁（１９８７）、ＢｏｖｉＰ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．；セル（Ｃｅｌｌ），第５０巻，第７２９〜７３７頁（１９８７）〕。
本発明の分泌シグナルをコードする遺伝子は、公知の方法で化学合成することが出来、また、培養細胞、組織より単離したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅することで得ることが出来る。
本発明の分泌シグナルは、本発明の細胞接着活性とＦＧＦ活性を有するポリペプチドに直接結合していても良く、またスペーサーを介して結合していても良い。
【００２３】
本発明の、分泌シグナルのアミノ酸配列、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸及びＦＧＦ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いは該ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に限定はないが、上記したＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）のＮ末端にＦＧＦ−４の分泌シグナルが付加したポリペプチドｓＣ―ＦＧＦ、ｓＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）及び該ｓＣ−ＦＧＦ、 ｓＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）をコードする遺伝子が好適に使用される。配列表の配列番号９にｓＣ−ＦＧＦのアミノ酸配列を、配列番号１０にｓＣ−ＦＧＦをコードする塩基配列を示す。
本発明の遺伝子、及びそれがコードするポリペプチドは、ＦＧＦ活性に加えて細胞接着活性を有し、生体内で発揮されるＦＧＦ活性、例えば血管新生作用が増強されている。
また、さらに分泌シグナルを付加することにより、細胞外への効率の良い分泌が可能となり、さらにその効果が発揮される。
【００２４】
本発明の遺伝子は、適当なプロモーターと連結し、その制御下で使用することが出来る。かかるプロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、α１ＡＴプロモーター、ｔｉｅプロモーター、ＡＦＰプロモーター、ＣＥＡプロモーター、ＰＳＡプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択すれば良い。
また、組織特異的プロモーターを使用することで、組織特異的な発現を行なうことが出来る。組織特異的なプロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、筋肉特異的プロモーターとして、α−アクチンプロモーター、γ−アクチンプロモーター、α−ミオシンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター等が挙げられ、血管特異的プロモーターとして、プレプロエンドセリン−１プロモーター、Ｅ−セレクチンプロモーター等が挙げられる。
【００２５】
本発明の遺伝子、ポリペプチドの管腔形成活性は、公知の方法によって測定することが出来、例えば、マトリゲル内におけるＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｃａｌ ｃｅｌｌ、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）の管腔形成を指標に測定することが出来る〔Ｈｕｇｈｅｓ Ｓ．Ｅ．；エクスペリメンタル セル リサーチ（Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ．），第２５巻，第１７１〜１８５頁（１９９６）〕。
また、本発明の遺伝子、ポリペプチドの血管新生活性は、公知の方法によって測定することが出来、例えば、ニワトリ漿尿膜を用いたアッセイ方法〔Ａｕｓｐｒｕｎｋ Ｄ． Ｈ．，ｅｔ ａｌ．；アメリカン ジャーナル オブ パソロジー（Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．），第７９巻，第５８７〜６２８頁（１９７５）〕、ウサギ角膜を用いたアッセイ方法〔Ｇｉｍｂｒｏｎｅ Ｍ．Ａ． Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．；ジャーナル オブ ナショナル キャンサー インスティテューツ（Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．），第５２巻，第４１３〜４２７頁（１９７４）〕によって測定することが出来る。
【００２６】
本発明における医薬とは、本発明の遺伝子、ポリペプチドの有する薬理活性に基づいた疾患の治療剤、予防剤を言い、例えば、血管新生促進剤、動脈疾患治療剤、軟骨傷害治療剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明の遺伝子の細胞内への導入方法としては、公知の方法が使用され、ウイルスベクターによる導入方法、ウイルスベクターを使用しない導入方法の何れも本発明に使用でき、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択することができ、特にレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが好適に使用され、更に好適にはレトロウイルスベクターが使用される。
本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、特に限定はないが、例えば、ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８７５４）、α−ＳＧＣベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８７５５）、ＬＸＳＮベクター（バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、第９８０〜９９０頁 （１９８９））、ｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）等が挙げれる。
ウイルスベクターを使用しない導入方法としては、特に限定はないが、例えば、Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法等が挙げられ、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
また、本発明の遺伝子は、Ｅｘ ｖｉｖｏ法、Ｉｎ ｖｉｖｏ法何れで投与しても良く、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
Ｅｘ ｖｉｖｏ法で投与する場合は、常法に従って本発明の遺伝子の導入が望まれる細胞、例えば、造血幹細胞、リンパ球、血管内皮前駆細胞等を採取し、採取された細胞に本発明の遺伝子を上記した方法によって導入し、得られた細胞を生体内に戻すことにより本発明の遺伝子を投与することが出来る。
Ｉｎ ｖｉｖｏ法で投与する場合、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内に投与、あるいは腎臓、肝臓、肺、脳、神経、心臓等の疾患の対象部位に直接投与することが出来る。製剤形態には、特に限定はないが、例えば注射溶剤とすることが出来る。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
実施例１：ＦＧＦ４分泌シグナルのクローニング及び、融合遺伝子の構築
１−１）ＦＧＦ４分泌シグナルをコードするＤＮＡの調製
ＦＧＦ４シグナルをコードするＤＮＡは以下のように、ヒトの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって調製した。鋳型として用いたヒトの染色体ＤＮＡは、ヒト由来２９３細胞由来より公知の方法によって調製したものを用いた。
このヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１１で表される塩基配列のプライマーＦ４−２５１４及び配列表の配列番号１２に示される塩基配列のプライマーＦ４−２６６７を用いて１次ＰＣＲ反応を行い、ＦＧＦ―４のエクソン１の分泌シグナルを含む１５３ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲ反応はＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする３５サイクルの条件で行なった。
次に、このようにして得られた１次ＰＣＲ産物を鋳型として、配列表の配列番号１３で表される塩基配列のプライマーＦ４−２５４１Ｍ及び配列表の配列番号１４に示される塩基配列のプライマーＦ４−２６１６を用いて２次ＰＣＲ反応を行い、Ｎ末端側にＸｍａＩ部位を付加したＦＧＦ―４分泌シグナル配列を含む７５ｂｐを増幅した。ＰＣＲ反応はサイクル数を２５サイクルとした以外は１次ＰＣＲと同様の条件で行なった。
このようにして得られた２次ＰＣＲ断片をＴａＫａＲａ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔを用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＸｍａＩで切断し、ＦＧＦ―４分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片を得た。
【００２９】
１−２）Ｃ−ＦＧＦをコードするプラスミドＤＮＡの調製
Ｃ−ＦＧＦをコードするプラスミドｐＹＭＨ―ＣＦ・Ａ（特許第２８２９４０５号）を鋳型として、配列表の配列番号１６で表される塩基配列のプライマーＣＦＧＦ−１及び、配列表の配列番号１７で示されるプライマーＦＮＬ３を用いてＰＣＲを行ない、Ｎ末端側にＳｍａＩ部位が付加されたＣ−ＦＧＦの５’側領域をコードする８５８ｂｐの領域を増幅した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする２５サイクルの条件で行った。
このようにして得られた８５８ｂｐのＰＣＲ断片を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩにより切断し、その結果生じたＣ−ＦＧＦの５’側領域をコードする４３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
次にｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、その結果生じたＣ−ＦＧＦの３’側領域をコードする８９５ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
このようにして得られたＣ−ＦＧＦの５’側領域をコードする４３０ｂｐの断片及び３’側領域をコードする８９５ｂｐの断片を、制限酵素ＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させたプラスミドｐＵＣ１１９にＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、その結果得られたＣ−ＦＧＦ全長をコードするプラスミドをｐＵＣ１１９−ＣＦと命名した。
【００３０】
１−３）ＦＧＦ−４分泌シグナルを融合したＣ−ＦＧＦ（ｓＣ−ＦＧＦ）をコードするプラスミドＤＮＡの調製
１−２）で調製したプラスミドｐＵＣ１１９−ＣＦを鋳型として、配列表の配列番号１８で表されるプライマーＣＦ−２８９９及び、配列表の配列番号１９で示されるプライマーＣＦ−３３６６を用いてＰＣＲを行い、Ｃ−ＦＧＦの５’側の４６７ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする２５サイクルの条件で行った。このようにして得られたＰＣＲ断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＡｐａＬＩで切断し、開始コドンからＡｐａＬＩ部位までの３２２ｂｐのＣ−ＦＧＦをコードするＤＮＡ断片を得た。
次にプラスミドｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、 Ｃ−ＦＧＦをコードする領域のＡｐａＬＩ部位から終始コドンまでの領域を含む９９９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
１−１）で調製したＦＧＦ４分泌シグナルをコードする７１ｂｐのＤＮＡ断片とＣ−ＦＧＦの開始コドンからＡｐａＬＩ部位までの３２２ｂｐのＤＮＡ断片及び、Ｃ−ＦＧＦのＡｐａＬＩ部位から終始コドンを含むＨｉｎｄＩＩＩ部位までの９９９ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＸｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させたプラスミドｐＵＣ１１９に挿入した。このようにして構築されたｓＣ−ＦＧＦをコードするプラスミドをｐＵＣ１１９−ｓＣＦと命名した。
【００３１】
１−４）ＦＧＦ−４分泌シグナルを融合したｂＦＧＦ（ｓｂＦＧＦ）をコードするプラスミドＤＮＡの調製
１−１）で調製したＦＧＦ４分泌シグナルをコードする１５３ｂｐの１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として、配列表の配列番号１３で表されるプライマーＦ４−２５４１Ｍ及び、配列表の配列番号１５で示されるプライマーＦ４−２６２８Ｍを用いてＰＣＲを行い、５’側に制限酵素ＸｍａＩ部位及び、３’側に制限酵素ＮｃｏＩ部位を人為的に付加したＦＧＦ４分泌シグナルをコードする８７ｂｐの領域を増幅した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする２５サイクルの条件で行った。
このようにして得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＸｍａＩとＮｃｏＩにより切断し、その結果生じたＦＧＦ４分泌シグナルをコードする７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
次にプラスミドｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＸｍａＩとＮｃｏＩにより切断し、開始コドンからＮｃｏＩ部位までの８３８ｂｐを除去した後、ＦＧＦ４分泌シグナルをコードする７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入した。このようにして得られたｓｂＦＧＦをコードするプラスミドをｐＵＣ１１９−ｓｂＦと命名した。
【００３２】
実施例２：動物細胞での発現ベクター構築
２−１） ｓＣ−ＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にｓＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―３）で得られたｐＵＣ１１９−ｓＣＦを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、ｓＣ−ＦＧＦ遺伝子全長を含む１３９６ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたｓＣ−ＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦと命名した。
【００３３】
２−２） Ｃ−ＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、Ｃ−ＦＧＦ遺伝子全長を含む１３３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたＣ−ＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦと命名した。
【００３４】
２−３） ｂＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にｂＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＮｃｏＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ｂＦＧＦ遺伝子全長含む４８８ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたｂＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−ｂＦＧＦと命名した。
【００３５】
２−４） ｓｂＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にｓｂＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―４）で得られたｐＵＣ１１９−ｓｂＦを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、ｓｂＦＧＦ遺伝子全長を含む５６１ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたｓｂＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−ｓｂＦＧＦと命名した。
【００３６】
２−５） ｓＣ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターの作製
レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）にｓＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―３）で得られたｐＵＣ１１９−ｓＣＦを制限酵素ＳｍａＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ｓＣ−ＦＧＦ遺伝子全長含む１３９２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＨｐａＩにより開裂させたプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩに挿入した。このようにして構築されたｓＣ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターをｐＤＯＮ−ＡＩ−ｓＣ−ＦＧＦと命名した。
【００３７】
２−６） Ｃ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターの作製
レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）にｓＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＳｍａＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、Ｃ−ＦＧＦ遺伝子全長を含む１３２６ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＨｐａＩにより開裂させたプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩに挿入した。このようにして構築されたＣ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターをｐＤＯＮ−ＡＩ−Ｃ−ＦＧＦと命名した。
【００３８】
２−７） ｂＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターの作製
レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）にｂＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＮｃｏＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ｂＦＧＦ遺伝子全長を含む４８８ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＨｐａＩにより開裂させたプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩに挿入した。このようにして構築されたｂＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターをｐＤＯＮ−ＡＩ−ｂＦＧＦと命名した。
【００３９】
実施例３：動物細胞での発現実験
３−１） 動物細胞へのＤＮＡトランスフェクションによる一過性発現の検討
３−１−１）動物細胞を用いたタンパク質発現
実施例２で構築したプラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−ｂＦＧＦ及びｐｃＤＮＡ−ｓｂＦＧＦ各々５μｇをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて、１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６ｃｍ径のプレートにセミコンフルエントに増殖させた２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入して１２時間後、新しい培地に交換し、５９時間培養した後、５ｍｌの血清未添加培地に交換し、２４時間培養した。その後、培養上清を集め、０．４５μｍのメンブランフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを培養上清試料とした。また、培養上清を回収した後の細胞を５ｍｌの血清未添加培地に浮遊させ、細胞破砕器により細胞膜及び核膜を破壊後、３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを細胞抽出液試料とした。各試料は−８０℃で保存した。
【００４０】
３−１−２）ウエスタンブロッティングによる発現タンパク質の検出
上記細胞抽出液１２μｌをＰＡＧＥＬ １２．５％（アトー社製）を用いてＳＤＳゲル電気泳動によりタンパク分画し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ミリポア社製）に転写した。抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−２（アップステート バイオテクノロジー社製）を一次抗体に、ＨＲＰ標識済抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（アマシャム ファルマシア社製）を二次抗体として、化学発光基質Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（ＮＥＮ社製）を用いて発現タンパク質を検出した。結果を図１に示す。（図１の各レーンの説明。ｖｅｃｔｏｒ：ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、ｓＣ−ＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―ｓＣ−ＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、Ｃ−ＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―Ｃ−ＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、ｓｂＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―ｓｂＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、ｂＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―ｂＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、Ｃ−ＦＧＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＹＭＨ―ＣＦ・ＡでトランスフォームしたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の抽出液）ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−２と反応するタンパク質は検出されず、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では４７．５ｋＤａのタンパク質の発現が、ｐｃＤＮＡ−ｂＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−ｓｂＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では１８ｋＤのタンパク質の発現が検出された。
【００４１】
３―１―３）トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞抽出液中の各発現タンパク質量の定量
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞抽出液中の各発現タンパク質量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）により測定した（表１参照のこと）。
【００４２】
【表１】
【００４３】
上清中に含まれる各発現タンパク質量を比較したところ、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦの培養上清におけるｓＣ−ＦＧＦはｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦの培養上清におけるＣ−ＦＧＦの２．５倍であった。更に各タンパク質の分布を検討すると、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦにおいては、培養上清に分泌されたＣ−ＦＧＦが細胞内に留まったＣ−ＦＧＦの８０分の１程度であった。一方、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦにおいては、培養上清に分泌されたｓＣ−ＦＧＦは細胞内に留まったｓＣ−ＦＧＦの半分であり、分泌シグナルが付加されることにより細胞外への分泌効率が４０倍近く向上したことが示された。
【００４４】
３−１−４）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｓＣ−ＦＧＦとＣ−ＦＧＦの生物活性の検討
上記の細胞培養上清又は細胞抽出液２５０μｌで浮遊させた５×１０４個のＨＵＶＥＣ細胞を、２４ウエルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）上で固化したグロース・ファクター・レデュースド・マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン社製）に重層し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５〜６時間培養した。
その結果、コントロールのｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした細胞の培養上清、細胞抽出液では認められなかったＨＵＶＥＣの管腔形成が、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦでトランスフェクトした細胞の培養上清、細胞抽出液、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦでトランスフェクトした細胞の培養上清、細胞抽出液では検出された。この管腔形成は内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ、バイオウイターカー社製）により検出されるものと同等であった。
このことは、導入された遺伝子から発現されたｓＣ−ＦＧＦおよびＣ−ＦＧＦが管腔形成活性を発揮することを示すものである。
【００４５】
３−２）レトロウイルスベクターをもちいたｓＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦ遺伝子の恒常発現細胞の作製
３−２−１）ｓＣ−ＦＧＦ−ＤＯＮ、Ｃ−ＦＧＦ−ＤＯＮ及びｂＦＧＦ−ＤＯＮレトロウイルス液の調製
実施例２に記載のｐＤＯＮ−ＡＩ−ｓＣ−ＦＧＦ、ｐＤＯＮ−ＡＩ−Ｃ−ＦＧＦ及びｐＤＯＮ−ＡＩ−ｂＦＧＦプラスミドをパッケージング細胞ＧＰ８６＋Ｅ細胞［ジャーナル オブ ウイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に遺伝子導入して作製したウイルスプロデューサー細胞を１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。上記プロデューサー細胞を１０ｃｍ径のプレートにセミコンフルエントに増殖させた後、培地を新しい培地５ｍｌに交換し、２４時間培養後、上清を０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものをウイルス上清液とし、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４６】
３−２−２）ウイルス上清液の力価測定
ウイルス上清液の力価測定はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）を使用して標準的な方法［ジャーナル オブ ウイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に従って測定した。６ウエルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の１ウエルあたり５×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、培地を除去し、各ウエルに系列希釈したウイルス上清液１ｍｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるよう加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養し、さらに培地１ｍｌを添加して１８時間培養した後、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地２ｍｌに交換し培養を続けた。３〜４日毎にＧ４１８含有培地を交換し、１３〜１４日後に生育したＧ４１８耐性コロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、そのコロニー数を計測した。計測されたコロニー数からウエル当たりの感染粒子数（ｃｆｕ／ｍｌ）を算出し、ウイルス力価とした。
ウイルス力価はｓＣ−ＦＧＦ−ＤＯＮ ５．７×１０４ ｃｆｕ／ｍｌ、Ｃ−ＦＧＦ−ＤＯＮ ５．９×１０３ ｃｆｕ／ｍｌ及びｂＦＧＦ−ＤＯＮ ４．２×１０４ ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００４７】
３−２−３）レトロウイルスによる各種培養細胞へのｓＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦ遺伝子の導入
６ｃｍの組織培養用ディッシュに６×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、培地を除去し、新しい培地 １．１ｍｌと各ウイルス液 ９００μｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるよう加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養し、さらに培地２ｍｌを添加して１８時間培養した後、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地４ｍｌに交換し培養を続けた。３〜４日毎にＧ４１８含有培地を交換し、Ｇ４１８耐性となった細胞をｓＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦ遺伝子の恒常発現細胞株（ｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３）とした。
【００４８】
３−２−４）ｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞における目的タンパク質の発現確認
１６チェンバースライド（ヌンク社製）にチェンバーあたり５×１０３個の各遺伝子導入細胞を含む細胞浮遊液２００μｌを添加し、２４時間培養した。培地を除去した後、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）を添加し、室温で３０分間放置し細胞を固定した。固定終了後、ＰＢＳ（−）により細胞を３回洗浄し、０．１％トライトンＸ−１００を加えたブロックエース（雪印乳業社製）を添加し、室温で３０分間放置、抗体の非特異的吸着を阻止した。一次抗体反応は抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−２（アップステート バイオテクノロジー社製）を１０μｇ／ｍｌとなるようにブロックエース（雪印乳業社製）で希釈した後、この抗体と細胞を室温で１時間反応させることで行なった。一次抗体反応後、ＰＢＳ（−）により細胞を３回洗浄し、二次抗体反応を行なった。二次抗体反応は、抗マウスイムノグロブリン・オレゴングリーン５１４標識済抗体（モレキュラー プローブ社製）を２μｇ／ｍｌとなるようブロックエースで希釈した後、この抗体と細胞を室温で１時間反応させることによって行なった。反応終了後、ＰＢＳ（−）により細胞を３回洗浄し、少量の９０％グリセロールを滴下後カバーグラスを載せ、スライド試料とした。
スライド試料を蛍光顕微鏡で観察するとコントロールのＮＩＨ／３Ｔ３細胞を除いてｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞のほとんどが標識抗体による蛍光を発し、レトロウイルスによる目的遺伝子の導入及び発現は良好であった。ｂＦＧＦは論文報告〔Ｐｏｗｅｌｌ Ｐ．Ｐ．，ｅｔａｌ．；ジャーナル オブ セル フィジオロジー（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．），第１４８巻，第２０２〜２１０頁（１９９１）〕にあるように核に集積した像を示した。Ｃ−ＦＧＦも同様に核に集積しており、細胞外への分泌は少ないことが推測された。これらに対してｓＣ−ＦＧＦは核にほとんど認められず、細胞質に局在することがわかった。即ち、ｓＣ−ＦＧＦは、付加した分泌シグナルによる細胞内輸送機構を介して、細胞膜外へ分泌されていると考えられた。
【００４９】
３−２−５）ｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞の培養上清と細胞抽出液に含まれる発現タンパク質の定量
１０ｃｍの組織培養用ディッシュにｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞をコンフルエントに増殖させた後、培地を１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）５ｍｌに交換し、２４時間培養した。その後、培養上清を集め、０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを培養上清試料とした。また細胞を５ｍｌの同ＤＭＥＭ培地で集め、細胞破砕器により細胞膜及び核膜を破壊後、３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを細胞抽出液試料とした。
各発現タンパク質量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）により測定した（表２参照のこと）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
ＥＬＩＳＡの結果、培養上清中にはｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３においてのみ発現タンパク質が検出され、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３とｂＦＧＦ／３Ｔ３では検出されなかった。一方、細胞抽出液ではｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３では発現タンパク質が検出されず、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３とｂＦＧＦ／３Ｔ３で多量の発現タンパク質が認められた。これらの細胞株については、３−２−４）の項で各々タンパク質の発現を確認しており、遺伝子導入の不良ではないことを示している。これらの結果からＣ−ＦＧＦ遺伝子に分泌シグナルを付加することにより、細胞内で産生されたｓＣ−ＦＧＦタンパク質は核に蓄積することなく、効率よく細胞外に分泌されることが示された。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によって、血管新生に有用な新たなポリペプチド、遺伝子、及び該遺伝子からなる医薬が提供された。
本発明は、従来よりも優れた血管新生促進作用を有する遺伝子治療剤を提供するものであり、血管新生促成、動脈疾患治療、軟骨傷害治療等に対して優れた効果を示す遺伝子治療を可能とするものである。
【００５３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１ Ｃ２７７のアミノ酸配列
配列番号２ Ｃ２７７をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３ ｂＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号４ ｂＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号５ Ｃ−ＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号６ Ｃ−ＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号７ ＦＧＦ−４分泌シグナルのアミノ酸配列
配列番号８ ＦＧＦ−４分泌シグナルをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号９ ｓＣ−ＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号１０ ｓＣ−ＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１ ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー Ｆ４―２５１４
配列番号１２ ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー Ｆ４―２６６７
配列番号１３ ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー Ｆ４―２５１４Ｍ
配列番号１４ ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー Ｆ４―２６１６
配列番号１５ ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー Ｆ４−２６２８Ｍ
配列番号１６ Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー ＣＦＧＦ―１
配列番号１７ Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー ＦＮＬ３
配列番号１８ Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー ＣＦ―２８９９
配列番号１９ Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー ＣＦ―３３６６
【００５４】
【配列表】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２９３Ｔ細胞で一過性発現させた各タンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a medicine used for gene therapy and the like. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical comprising a polypeptide having both cell adhesion activity and fibroblast growth factor activity, or a gene encoding the polypeptide.
[0002]
[Prior art]
As a treatment method for ischemic diseases such as ischemic heart disease and obstructive arteriosclerosis, angioplasty is first attempted. Although these methods are established and effective therapies, vascular reocclusion with dilated blood vessels with a certain probability (30-40%) is seen and is considered a current clinical limit. For such cases, artificially promote the development of angiogenesis and collateral circulation from the surrounding tissue in the ischemic region, reduce injury / necrosis of the ischemic tissue, and restore the original function Therapeutic angiogenesis therapy has been attempted.
In the field of basic research, angiogenesis therapy using various growth factors has been attempted. For example, the effects of aFGF, bFGF, VEGF, HGF, Angiopoietin, etc. have been confirmed mainly by animal experiments. In 1996, the research group of Isner et al. 165 An expression plasmid vector (Naked DNA) containing the gene was administered into the blood vessels of patients with lower limb ischemia using a catheter and reported significant improvement in collateral circulation [Isner, J. et al. M.M. , Et al. Lancet, 348, 370-374 (1996)], and in 1998, a group of Schumacher et al. In Germany performed bFGF protein anastomosis during coronary artery bypass surgery in patients with angina Injected in the vicinity, significant angiogenesis and collateral circulation were observed [Schumacher, M .; D. , Et al. Circulation, Vol. 97, pp. 645-650 (1998)]. However, there have been no reports of cases in which a sufficient therapeutic effect has been seen, and a more effective angiogenic factor has been desired.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above prior art, and an object of the present invention is to provide a novel drug for gene therapy useful for angiogenesis therapy.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have already developed a novel functional polypeptide C-FGF in which a cell binding region of fibronectin and bFGF are fused, and clarified that the polypeptide has a stronger angiogenic ability than bFGF. (Japanese Patent Publication No. 2829405, US Patent Publication No. 5302701). As a result of intensive studies, the present inventors have found that the gene encoding C-FGF is useful as a gene therapy drug. Furthermore, the present inventors have found that the effect is further enhanced by adding a secretory signal sequence, and completed the present invention.
[0005]
That is, when the present invention is outlined, the first invention of the present invention relates to a gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence of a polypeptide having cell adhesion activity and an amino acid sequence of a polypeptide having fibroblast growth factor activity. It relates to a medicine consisting of
[0006]
The second invention of the present invention relates to a polypeptide characterized by having an amino acid sequence of a secretion signal, an amino acid sequence of a polypeptide having cell adhesion activity, and an amino acid sequence of fibroblast growth factor.
[0007]
The third invention of the present invention relates to a gene encoding the polypeptide of the second invention.
[0008]
The fourth invention of the present invention relates to a vector having the gene of the third invention.
[0009]
The fifth invention of the present invention relates to a medicament comprising the vector of the fourth invention.
[0010]
The sixth invention of the present invention relates to a transformant transformed with the vector of the fifth invention.
[0011]
The seventh invention of the present invention is a method for producing the polypeptide of the second invention, wherein the transformant of the sixth invention is cultured, and the polypeptide of the second invention is collected from the culture. About.
[0012]
The eighth invention of the present invention relates to a pharmaceutical comprising the polypeptide of the second invention as an active ingredient.
[0013]
The ninth invention of the present invention relates to the medicaments of the first, fifth and eighth inventions which are angiogenesis promoting agents.
[0014]
The tenth invention of the present invention relates to the medicaments of the first, fifth and eighth inventions which are therapeutic agents for arterial diseases.
[0015]
The eleventh invention of the present invention relates to the medicaments of the first, fifth and eighth inventions which are therapeutic agents for cartilage injury.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Fibroblast growth factor (hereinafter sometimes abbreviated as FGF) is a factor that promotes the proliferation of fibroblasts, endothelial cells, and the like, and in vivo, angiogenesis, wound healing, development, etc. It is thought to be involved. Fibroblast growth factors form a family and are believed to have at least 18 members.
The polypeptide having FGF activity used in the present invention is not particularly limited, and any growth factor belonging to the FGF family is used, and preferably a basic fibroblast growth factor (basic) having a strong angiogenic action. FGF, FGF2) are used.
Although bFGF is a polypeptide consisting of 155 amino acids, a polypeptide consisting of 130 amino acids from which 25 amino acids on the N-terminal side have been deleted is also known to have FGF activity. Further, high molecular weight type bFGF consisting of 196 amino acids, 201 amino acids, and 210 amino acids, respectively, having 41 amino acids, 46 amino acids, or 55 amino acids added to the N-terminal side of 155 amino acids bFGF is known. In the present invention, any bFGF can be used, and bFGF consisting of 155 amino acids having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is preferably used.
As long as it has FGF activity, the FGF used in the present invention is one in which one or more amino acid substitutions, deletions, additions, insertions and other mutations are introduced into the amino acid sequence of natural FGF. May be. Examples of the FGF having such a mutation include a polypeptide described in Japanese Patent Publication No. 2829405, that is, a substance in which the 128th Lys of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing of the present specification is substituted with Arg. Is mentioned.
FGF activity is a known method, for example, an index for promoting cell proliferation. 3 It can be measured by measuring the uptake activity of H-thymidine, for example, according to the method of Nishikawa et al. [Methods in Enzymology, Volume 146, Pages 11-23 (1987)]. It can be measured.
[0017]
The gene encoding the polypeptide having FGF activity used in the present invention is not particularly limited, and any gene encoding the above-described polypeptide having FGF activity used in the present invention can be used. . For example, a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is used, and an example thereof is one having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
In addition, a gene encoding a polypeptide in which one or more amino acid substitutions, deletions, additions, insertions and the like have been introduced into the natural FGF amino acid sequence can also be used. For example, a gene encoding the polypeptide described in Japanese Patent Publication No. 2829405, that is, a polypeptide in which the 128th Lys of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing of the present specification is substituted with Arg is encoded. A gene is used, and examples thereof include those having a sequence in which the 383rd A in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is replaced with G.
In addition, the gene encoding the polypeptide having FGF activity used in the present invention has a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the above base sequence, and has a FGF activity. A gene having a base sequence encoding a peptide is also included.
Hybridization is described in, for example, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, T.A. Edited by Maniatis T. et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.). The above strict conditions include, for example, 6 × SSC (composition of 1 × SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhardt, A condition is that the solution is kept overnight at 65 ° C. with a probe in a solution containing 100 mg / ml herring sperm DNA.
A gene having a base sequence different from that of the gene can also be used in the present invention via a degenerate gene.
[0018]
The polypeptide having cell adhesion activity of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include extracellular matrix molecules such as fibronectin, laminin, collagen, vitronectin, osteopontin, thrombospondin, tenascin, or fragments of the molecule. Preferably, a polypeptide derived from the cell adhesion domain of fibronectin is used. The cell adhesion domain of fibronectin includes a region containing an RGDS sequence that is a VLA-5 receptor binding ligand and a region containing a CS-1 sequence that is a VLA-4 receptor binding ligand, both of which can be used in the present invention. In particular, VLA-5 binding polypeptides are preferably used.
Examples of VLA-5 binding polypeptides include C-283 (Ala) described in JP-B-8-29098. 1235 -Met 1517 ), C-206 (Glu) described in Japanese Patent No. 2561113 1312 -Met 1517 ), C-219 (Pro1299-Met) 1517 ), C-258 (Pro 1260 -Met 1517 ), C-279 (Pro 1239 -Met 1517 ), C-274 (Pro 1239 -Asp 1512 ), C-385 (Ala) described in Japanese Patent No. 2561526 1133 -Met 1517 ), C-428 (Pro 1090 -Met 1517 ), C-478 (Gly 1040 -Met 1517 ), C-481 (Ala) 1037 -Met 1517 ), C-504 (Gly 1014 -Met 1517 ), C-277 (Pro 1239 ~ Ser 1515 C-277 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is preferably used.
Examples of the VLA-4 binding polypeptide include CS1 described in Japanese Patent No. 3104178.
A fusion protein of a VLA-5 binding polypeptide and a VLA-4 binding polypeptide can also be used in the present invention. For example, C-CS1 described in Japanese Patent No. 3104178 can be used.
If the polypeptide having cell adhesion activity used in the present invention has cell adhesion activity, one or more amino acid substitutions, deletions, additions, insertions and the like are substituted for the amino acid of the natural polypeptide. May be introduced. Examples of the polypeptide having such a mutation include C-279 (S → V) described in Japanese Patent No. 2566291.
The cell adhesion activity can be measured by a known method, for example, the method of Ruoslahti et al. (Methods in Enzymology, Volume 82, pages 803-831 (1981)). I can do it.
[0019]
The gene encoding the polypeptide having cell adhesion activity used in the present invention is not particularly limited, and any gene encoding the above-mentioned polypeptide having cell adhesion activity used in the present invention may be used. I can do it. For example, a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is used, and an example thereof has a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
In addition, a gene encoding a polypeptide in which one or more amino acid substitutions, deletions, additions, insertions and the like are introduced into amino acids of a natural polypeptide having cell adhesion activity can also be used.
In addition, the gene encoding the polypeptide having cell adhesion activity used in the present invention has a base sequence that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the above base sequence, and has cell adhesion activity. Also included is a gene having a base sequence encoding a polypeptide having the same.
Hybridization can be performed according to the method described above, and the strict conditions include those described above.
A gene having a base sequence different from that of the gene can also be used in the present invention via a degenerate gene.
[0020]
A polypeptide having the amino acid sequence of a polypeptide having cell adhesion activity of the present invention and a polypeptide having the amino acid sequence of a polypeptide having FGF activity, or a gene encoding the polypeptide, having a polypeptide having cell adhesion activity and FGF activity The order of the polypeptides is not limited, and the N-terminal side may be a polypeptide having cell adhesion activity or a polypeptide having FGF activity.
The polypeptide having cell adhesion activity and the polypeptide having FGF activity may be directly bonded or may be bonded via a spacer.
Examples of the polypeptide having the amino acid sequence of the polypeptide having cell adhesion activity and the amino acid sequence of the polypeptide having FGF activity include the sequence at the C-terminal side of C-277 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. C-FGF to which bFGF consisting of the amino acid sequence of No. 3 is bound, C-277 of C-277 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID No. 1 in the sequence listing is substituted with Arg at the 128th Lys of the amino acid sequence of SEQ ID No. 3. C-FGF (K → R) to which the point mutation bFGF is bound is exemplified, and C-FGF is particularly preferably used. The amino acid sequence of the C-FGF is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
C-FGF (K → R) has an amino acid sequence in which Lys at position 405 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is replaced with Arg.
[0021]
A gene encoding the polypeptide is preferably used in the present invention, and in particular, a gene encoding C-FGF is preferably used. The base sequence of the gene encoding C-FGF is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing. Examples of the base sequence of the gene encoding C-FGF (K → R) include those in which the 1214th A in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is replaced with G.
In addition, Escherichia coli holding a plasmid encoding the polypeptide C-FGF consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is indicated as Escherichia coli JM109 / pYMH-CF · A, and FERM is provided to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. It is deposited as BP-5278.
In addition, Escherichia coli JM109 / Escherichia coli holding a plasmid encoding a polypeptide C-FGF (K → R) consisting of an amino acid sequence in which 405th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is substituted with Arg is used. Displayed as pYMH-CF and deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as FERM P-12559.
[0022]
The secretion signal used in the present invention is not particularly limited, and any signal capable of secreting a protein outside the cell can be used. For example, a growth factor belonging to the fibroblast growth factor (FGF) family can be used. A secretion signal can be used, and in particular, the secretion signal of FGF-4 is preferably used. The amino acid sequence of the secretion signal of FGF-4 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4. The gene encoding FGF-4 has already been cloned, and the amino acid sequence and gene sequence of its secretion signal are known [TairaM. , Et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Vol. 84, pp. 2980-2984 (1987), BoviP., Proceedings of the National Academy of Science, USA. D. , Et al. Cell, Vol. 50, pp. 729-737 (1987)].
The gene encoding the secretion signal of the present invention can be chemically synthesized by a known method, and amplified by PCR or RT-PCR using DNA or RNA isolated from cultured cells or tissues as a template. Can be obtained.
The secretion signal of the present invention may be directly bound to the polypeptide having cell adhesion activity and FGF activity of the present invention, or may be bound via a spacer.
[0023]
The amino acid sequence of the secretory signal of the present invention, the amino acid of the polypeptide having cell adhesion activity and the polypeptide having the amino acid sequence of polypeptide having FGF activity, or the gene encoding the polypeptide are not particularly limited, Polypeptides sC-FGF, sC-FGF (K → R), and sC-FGF, sC-FGF in which a secretion signal of FGF-4 is added to the N-terminus of C-FGF and C-FGF (K → R) described above A gene encoding (K → R) is preferably used. The amino acid sequence of sC-FGF is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and the base sequence encoding sC-FGF is shown in SEQ ID NO: 10.
The gene of the present invention and the polypeptide encoded by the gene have cell adhesion activity in addition to FGF activity, and have enhanced FGF activity, for example, angiogenic action, which is exhibited in vivo.
Further, by adding a secretion signal, efficient secretion to the outside of the cell becomes possible, and the effect is further exhibited.
[0024]
The gene of the present invention can be linked to an appropriate promoter and used under its control. The promoter is not particularly limited, and for example, CMV promoter, RSV promoter, CAG promoter, SRα promoter, EF1 promoter, PGK promoter, α1AT promoter, tie promoter, AFP promoter, CEA promoter, PSA promoter, retrovirus LTR promoter And a suitable one may be selected according to the purpose.
Moreover, tissue-specific expression can be performed by using a tissue-specific promoter. The tissue-specific promoter is not particularly limited, and examples of the muscle-specific promoter include α-actin promoter, γ-actin promoter, α-myosin promoter, creatine kinase promoter, and the like. Examples include preproendothelin-1 promoter and E-selectin promoter.
[0025]
The tube formation activity of the gene or polypeptide of the present invention can be measured by a known method. For example, the tube formation of HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelical Cell) in Matrigel is used as an index. [Hughes S. et al. E. Experimental Cell Research (Exp. Cell. Res.), Vol. 25, pp. 171-185 (1996)].
The angiogenic activity of the gene and polypeptide of the present invention can be measured by a known method. For example, an assay method using chicken chorioallantoic membrane [Ausprunk D. et al. H. , Et al. American Journal of Pathology (Am. J. Pathol.), 79, 587-628 (1975)], assay method using rabbit cornea [Gimbrone M .; A. Jr. , Et al. J. Natl. Cancer Inst., Vol. 52, pp. 413-427 (1974)].
[0026]
The drug in the present invention refers to a therapeutic agent or preventive agent for a disease based on the pharmacological activity of the gene and polypeptide of the present invention, and examples thereof include angiogenesis promoters, arterial disease therapeutic agents, cartilage injury therapeutic agents and the like. It is done.
[0027]
As a method for introducing the gene of the present invention into a cell, a known method is used, and any of a method of introducing a viral vector and a method of not using a viral vector can be used in the present invention, and a suitable method depending on the purpose. Should be selected.
Examples of virus vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, herpes virus vectors, HIV vectors and the like, and suitable ones can be selected according to the purpose, particularly retroviruses. Vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors are preferably used, and retrovirus vectors are more preferably used.
The retroviral vector used in the present invention is not particularly limited. For example, MFG vector (ATCC No. 68754), α-SGC vector (ATCC No. 68755), LXSN vector (Biotechniques), No. 1 7, 980-990 (1989)), pDON-AI (Takara Shuzo) and the like.
The introduction method without using a viral vector is not particularly limited, and examples thereof include the Naked DNA method, the liposome method, the calcium phosphate method, the electroporation method, and the gene gun method, and a suitable method is selected according to the purpose. Just do it.
In addition, the gene of the present invention may be administered by either the Ex vivo method or the In vivo method, and a suitable method may be selected according to the purpose.
When administered by the ex vivo method, cells in which the gene of the present invention is desired to be introduced according to a conventional method, such as hematopoietic stem cells, lymphocytes, vascular endothelial progenitor cells, etc. are collected, and the gene of the present invention is collected in the collected cells The gene of the present invention can be administered by introducing by the above-described method and returning the obtained cells to the living body.
When administered by the in vivo method, for example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intramuscularly, or directly to the target site of a disease such as kidney, liver, lung, brain, nerve, heart and the like. There are no particular limitations on the form of the preparation, but for example, an injection solvent can be used.
[0028]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1: Cloning of FGF4 secretion signal and construction of a fusion gene
1-1) Preparation of DNA encoding FGF4 secretion signal
DNA encoding FGF4 signal was prepared by PCR using human chromosomal DNA as a template as follows. The human chromosomal DNA used as the template was prepared from human-derived 293 cells by a known method.
Using this human chromosomal DNA as a template, a primary PCR reaction was carried out using primer F4-2514 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and primer F4-2667 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 of the sequence listing. The 153 bp region containing the exon 1 secretion signal of FGF-4 was amplified. The PCR reaction was performed using Takara Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) under conditions of 35 cycles with 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
Next, using the primary PCR product thus obtained as a template, primer F4-2541M having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and primer F4 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 in the sequence listing A secondary PCR reaction was performed using -2616, and 75 bp containing an FGF-4 secretion signal sequence with an XmaI site added to the N-terminal side was amplified. The PCR reaction was performed under the same conditions as the primary PCR except that the number of cycles was 25.
The secondary PCR fragment thus obtained was treated with a blunt end using TaKaRa Blunting Kit and then cleaved with restriction enzyme XmaI to obtain a DNA fragment encoding the FGF-4 secretion signal.
[0029]
1-2) Preparation of plasmid DNA encoding C-FGF
Using the plasmid pYMH-CF • A (Patent No. 2829405) encoding C-FGF as a template, the primer CFGF-1 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 in the sequence listing and SEQ ID NO: 17 in the sequence listing PCR was performed using the primer FNL3 to amplify a 858 bp region encoding the 5 ′ region of C-FGF with a SmaI site added to the N-terminal side.
PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) under the conditions of 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
The 858 bp PCR fragment thus obtained was cleaved with restriction enzymes SmaI and EcoRI, and the resulting 430 bp DNA fragment encoding the 5 ′ region of C-FGF was recovered.
Next, pYMH-CF · A was cleaved with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and the resulting 895 bp DNA fragment encoding the 3 ′ region of C-FGF was recovered.
The TaKaRa DNA Ligation Kit was obtained by cleaving the 430 bp fragment encoding the 5 ′ region of C-FGF and the 895 bp fragment encoding the 3 ′ region thus obtained with restriction enzymes SmaI and HindIII. Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted, and the resulting plasmid encoding the full length C-FGF was named pUC119-CF.
[0030]
1-3) Preparation of plasmid DNA encoding C-FGF (sC-FGF) fused with FGF-4 secretion signal
Using the plasmid pUC119-CF prepared in 1-2) as a template, PCR was performed using primer CF-2899 represented by SEQ ID NO: 18 in the sequence listing and primer CF-3366 represented by SEQ ID NO: 19 in the sequence listing. The 467 bp region on the 5 ′ side of C-FGF was amplified. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) under the conditions of 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. The PCR fragment thus obtained was subjected to blunt end treatment using TaKaRa DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) and then cleaved with the restriction enzyme ApaLI to encode 322 bp C-FGF from the start codon to the ApaLI site. A DNA fragment was obtained.
Next, plasmid pUC119-CF was cleaved with restriction enzymes ApaLI and HindIII to obtain a 999 bp DNA fragment containing the region from the ApaLI site to the termination codon of the region encoding C-FGF.
1-1) a 71 bp DNA fragment encoding the FGF4 secretion signal prepared in 1-1), a 322 bp DNA fragment from the start codon to the ApaLI site of C-FGF, and a HindIII site including the stop codon from the ApaLI site of C-FGF A 999 bp DNA fragment was obtained from TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into plasmid pUC119 cleaved with restriction enzymes XmaI and HindIII. The plasmid encoding sC-FGF thus constructed was named pUC119-sCF.
[0031]
1-4) Preparation of plasmid DNA encoding bFGF (sbFGF) fused with FGF-4 secretion signal
1-1) Using the 153 bp 1st PCR product encoding the FGF4 secretion signal prepared in 1-1) as a template, primer F4-2541M represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and primer F4- represented by SEQ ID NO: 15 in the sequence listing PCR was performed using 2628M, and an 87 bp region encoding an FGF4 secretion signal in which a restriction enzyme XmaI site was artificially added on the 5 ′ side and a restriction enzyme NcoI site was artificially added on the 3 ′ side was amplified.
PCR was performed using TaKaRa Ex-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) under conditions of 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
The PCR fragment thus obtained was cleaved with restriction enzymes XmaI and NcoI, and the resulting 70 bp DNA fragment encoding the FGF4 secretion signal was recovered.
Next, plasmid pUC119-CF was cleaved with restriction enzymes XmaI and NcoI to remove 838 bp from the start codon to the NcoI site, and then a 70 bp DNA fragment encoding the FGF4 secretion signal was obtained from TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used for insertion. The plasmid encoding sbFGF thus obtained was named pUC119-sbF.
[0032]
Example 2: Construction of an expression vector in animal cells
2-1) Preparation of animal cell expression plasmid vector encoding sC-FGF
The sC-FGF gene was cloned into the plasmid pcDNA3 for mammalian cell expression (manufactured by Invitrogen).
PUC119-sCF obtained in 1-3) of Example 1 was cleaved with the restriction enzyme HindIII, treated with a blunt end using TaKaRa DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo), cleaved with the restriction enzyme KpnI, and sC- A 1396 bp DNA fragment containing the full length of the FGF gene was obtained. This fragment was designated as TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into the plasmid pcDNA3 cleaved with restriction enzymes KpnI and EcoRV. The animal expression plasmid vector encoding sC-FGF thus constructed was named pcDNA-sC-FGF.
[0033]
2-2) Preparation of animal cell expression plasmid vector encoding C-FGF
The C-FGF gene was cloned into a mammalian cell expression plasmid pcDNA3 (Invitrogen).
The pUC119-CF obtained in 1-2) of Example 1 was cleaved with the restriction enzyme HindIII, treated with a blunt end using TaKaRa DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo), cleaved with the restriction enzyme KpnI, and C- A 1330 bp DNA fragment containing the full length of the FGF gene was obtained. This fragment was added to TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into the plasmid pcDNA3 cleaved with restriction enzymes KpnI and EcoRV. The animal expression plasmid vector encoding C-FGF thus constructed was named pcDNA-C-FGF.
[0034]
2-3) Preparation of animal cell expression plasmid vector encoding bFGF
The bFGF gene was cloned into the mammalian cell expression plasmid pcDNA3 (Invitrogen).
PUC119-CF obtained in 1-2 of Example 1 was cleaved with restriction enzymes NcoI and HindIII, and subjected to blunt end treatment using TaKaRa DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and 488 bp including the full length of bFGF gene. A DNA fragment was obtained. This fragment was added to TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo) was inserted into plasmid pcDNA3 cleaved with EcoRV. The animal expression plasmid vector encoding bFGF thus constructed was named pcDNA-bFGF.
[0035]
2-4) Preparation of animal cell expression plasmid vector encoding sbFGF
The sbFGF gene was cloned into a plasmid pcDNA3 for mammalian cell expression (manufactured by Invitrogen).
The pUC119-sbF obtained in 1-4 of Example 1 was cleaved with the restriction enzyme HindIII, treated with a blunt end using TaKaRa DNA Blunting Kit (Takara Shuzo), cleaved with the restriction enzyme KpnI, and sbFGF gene A 561 bp DNA fragment containing the full length was obtained. This fragment was added to TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into the plasmid pcDNA3 cleaved with restriction enzymes KpnI and EcoRV. The animal expression plasmid vector encoding sbFGF thus constructed was named pcDNA-sbFGF.
[0036]
2-5) Preparation of retroviral vector encoding sC-FGF
The sC-FGF gene was cloned into the retroviral vector pDON-AI (Takara Shuzo).
PUC119-sCF obtained in 1-3) of Example 1 is cleaved with restriction enzymes SmaI and HindIII, subjected to blunt end treatment using TaKaRa DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and contains the full length of the sC-FGF gene. A 1392 bp DNA fragment was obtained. This fragment was added to TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into the plasmid pDON-AI cleaved with HpaI. The retroviral vector encoding sC-FGF thus constructed was named pDON-AI-sC-FGF.
[0037]
2-6) Preparation of retroviral vector encoding C-FGF
The sC-FGF gene was cloned into the retroviral vector pDON-AI (Takara Shuzo).
PUC119-CF obtained in 1-2 of Example 1 was cleaved with restriction enzymes SmaI and HindIII, subjected to blunt end treatment using TaKaRa DNA Blunting Kit (manufactured by Takara Shuzo), and the full length of C-FGF gene was A 1326 bp DNA fragment was obtained. This fragment was added to TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into the plasmid pDON-AI cleaved with HpaI. The retroviral vector encoding C-FGF thus constructed was named pDON-AI-C-FGF.
[0038]
2-7) Preparation of retroviral vector encoding bFGF
The bFGF gene was cloned into the retroviral vector pDON-AI (Takara Shuzo).
PUC119-CF obtained in 1-2 of Example 1 was digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, subjected to blunt end treatment using TaKaRa DNA Blunting Kit (Takara Shuzo), and 488 bp including the full length of the bFGF gene. DNA fragment was obtained. This fragment was added to TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was inserted into the plasmid pDON-AI cleaved with HpaI. The retroviral vector encoding bFGF thus constructed was named pDON-AI-bFGF.
[0039]
Example 3: Expression experiment in animal cells
3-1) Examination of transient expression by DNA transfection into animal cells
3-1-1) Protein expression using animal cells
Using 5 μg each of the plasmid pcDNA3, pcDNA-sC-FGF, pcDNA-C-FGF, pcDNA-bFGF and pcDNA-sbFGF constructed in Example 2, 10% fetal bovine serum (Amersham Pharmacia) was used. In Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Sigma) containing 50 units / ml penicillin (Gibco) and 50 μg / ml streptomycin (Gibco), 37 ° C., 5% CO 2 The gene was introduced into 293T cells grown semi-confluent on a 6 cm diameter plate under the conditions described above. Twelve hours after gene introduction, the medium was replaced with a new medium, cultured for 59 hours, then replaced with 5 ml of serum-free medium and cultured for 24 hours. Thereafter, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 μm membrane filter (Millipore) to obtain a culture supernatant sample. Further, the cells after collecting the culture supernatant are suspended in 5 ml of serum-free medium, the cell membrane and the nuclear membrane are disrupted with a cell crusher, and then centrifuged at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant is 0.45 μm. A cell extract sample was filtered through a membrane filter. Each sample was stored at -80 ° C.
[0040]
3-1-2) Detection of expressed protein by Western blotting
12 μl of the cell extract was subjected to protein fractionation by SDS gel electrophoresis using PAGEL 12.5% (manufactured by Ato) and transferred to an Immobilon-P membrane (manufactured by Millipore). Using chemiluminescent substrate Renaissance (manufactured by NEN) with anti-bFGF antibody bFM-2 (manufactured by Upstate Biotechnology) as the primary antibody and HRP-labeled anti-mouse IgG sheep antibody (manufactured by Amersham Pharmacia) as the secondary antibody The detected protein was detected. The results are shown in FIG. (Description of each lane in FIG. 1. vector: extract of 293T cells transfected with pcDNA3, extract of 293T cells transfected with sC-FGF: pcDNA-sC-FGF, C-FGF: pcDNA-C-FGF Extract of 293T cells transfected with sbFGF: pcDNA-sbFGF transfected 293T cells, bFGF: pcDNA-bFGF transfected 293T cells extract, C-FGF (E. coli): pYMH -Extract of E. coli JM109 transformed with CF.A) In 293T cells transfected with pcDNA3, no protein reacting with anti-bFGF antibody bFM-2 was detected, and pcDNA-sC-FGF and pcDNA-C-FGF To Expression of 47.5 kDa protein was detected in transfected 293T cells, and expression of 18 kD protein was detected in 293T cells transfected with pcDNA-bFGF and pcDNA-sbFGF.
[0041]
3-1-3) Quantification of the amount of each expressed protein in the culture supernatant and cell extract of transfected 293T cells
The amount of each expressed protein in the culture supernatant and cell extract of the transfected 293T cells was measured by Quantikine human FGF basic ELISA Kit (manufactured by R & D Systems) (see Table 1).
[0042]
[Table 1]
[0043]
When the amount of each expressed protein contained in the supernatant was compared, the sC-FGF in the culture supernatant of pcDNA-sC-FGF was 2.5 times the C-FGF in the culture supernatant of pcDNA-C-FGF. . Further, the distribution of each protein was examined. In pcDNA-C-FGF, C-FGF secreted into the culture supernatant was about 1/80 of C-FGF remaining in the cells. On the other hand, in pcDNA-sC-FGF, sC-FGF secreted into the culture supernatant is half of sC-FGF remaining in the cell, and the secretion efficiency is 40% by adding a secretion signal. It was shown that the improvement was nearly double.
[0044]
3-1-4) Examination of biological activity of sC-FGF and C-FGF in vitro
5 × 10 suspended in 250 μl of the above cell culture supernatant or cell extract 4 Individual HUVEC cells were layered on growth factor reduced matrigel (Becton Dickinson) solidified on a 24-well tissue culture plate (Iwaki Glass Co., Ltd.) at 37 ° C., 5% CO 2 Cultured under conditions for 5-6 hours.
As a result, the culture supernatant of the cells transfected with the control pcDNA3, the HUVEC tube formation that was not observed in the cell extract, the culture supernatant of the cells transfected with pcDNA-sC-FGF, the cell extract, It was detected in the culture supernatant and cell extract of cells transfected with pcDNA-C-FGF. This tube formation was equivalent to that detected by the medium for endothelial cells (EGM-2 Bulletkit, manufactured by BioWitaker).
This indicates that sC-FGF and C-FGF expressed from the introduced gene exert a lumen forming activity.
[0045]
3-2) Preparation of constitutively expressing cells of sC-FGF, C-FGF and bFGF genes using retroviral vectors
3-2-1) Preparation of sC-FGF-DON, C-FGF-DON and bFGF-DON retroviral fluid
The pDON-AI-sC-FGF, pDON-AI-C-FGF and pDON-AI-bFGF plasmids described in Example 2 were used as packaging cells GP86 + E cells [Journal of Virology, Vol. 62, 1120. ˜1124 (1988)], a virus producer cell prepared by introducing a gene into 10% fetal bovine serum (BioWitaker), 50 units / ml penicillin (Gibco) and 50 μg / ml streptomycin ( In Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) containing Gibco) at 37 ° C, 5% CO 2 The culture was performed under the following conditions. After the above producer cells were grown semi-confluent on a 10 cm diameter plate, the medium was replaced with 5 ml of fresh medium, cultured for 24 hours, and the supernatant filtered through a 0.45 μm membrane filter was used as the virus supernatant. And stored at −80 ° C. until use.
[0046]
3-2-2) Titer measurement of virus supernatant
Titration of virus supernatant is performed using NIH / 3T3 cells (ATCC CRL-1658) using standard methods [Journal of virology, 62, 1120-1124 (1988). ] And was measured according to. 5 x 10 per well of a 6-well tissue culture plate (Iwaki Glass Co., Ltd.) 4 Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum (BioWitaker) containing 50 pieces of NIH / 3T3 cells and 50 units / ml penicillin (Gibco) and 50 μg / ml streptomycin (Gibco) Add 2 ml (DMEM, Sigma), 37 ° C, 5% CO 2 After overnight culture under the above conditions, remove the medium, add 1 ml of serially diluted virus supernatant to each well, and add hexadimethrin bromide (polybrene: Aldrich) to a final concentration of 8 μg / ml. It was. This is 37 ° C, 5% CO 2 Then, 1 ml of medium was further added and cultured for 18 hours, and then the medium was replaced with 2 ml of medium containing 800 μg / ml G418 (manufactured by Gibco), and the culture was continued. The G418-containing medium was changed every 3 to 4 days, G418-resistant colonies grown after 13 to 14 days were stained with a methanol solution containing 0.2% methylene blue, and the number of colonies was counted. From the counted number of colonies, the number of infectious particles per well (cfu / ml) was calculated and used as the virus titer.
Viral titer is sC-FGF-DON 5.7 × 10 4 cfu / ml, C-FGF-DON 5.9 × 10 3 cfu / ml and bFGF-DON 4.2 × 10 4 cfu / ml.
[0047]
3-2-3) Introduction of sC-FGF, C-FGF and bFGF genes into various cultured cells by retrovirus
6 x 10 in a 6 cm tissue culture dish 5 Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum (BioWitaker) containing 50 pieces of NIH / 3T3 cells and 50 units / ml penicillin (Gibco) and 50 μg / ml streptomycin (Gibco) Add 2 ml (DMEM, Sigma), 37 ° C, 5% CO 2 After overnight culture under the above conditions, the medium was removed, 1.1 ml of fresh medium and 900 μl of each virus solution were added, and hexadimethrin bromide (polybrene: Aldrich) was added to a final concentration of 8 μg / ml. . This is 37 ° C, 5% CO 2 Then, 2 ml of medium was further added and cultured for 18 hours, and then the medium was replaced with 4 ml of medium containing 800 μg / ml G418 (manufactured by Gibco) and the culture was continued. The G418-containing medium was changed every 3 to 4 days, and cells that became G418-resistant were transformed into cell lines (sC-FGF / 3T3, C-FGF / 3T3, and bFGF / 3T3) that constantly express sC-FGF, C-FGF, and bFGF genes. ).
[0048]
3-2-4) Confirmation of target protein expression in sC-FGF / 3T3, C-FGF / 3T3 and bFGF / 3T3 cells
16 chamber slides (manufactured by Nunk) 5 × 10 per chamber 3 200 μl of cell suspension containing each of the gene-introduced cells was added and cultured for 24 hours. After removing the medium, PBS (−) containing 4% paraformaldehyde was added, and the cells were fixed by allowing to stand at room temperature for 30 minutes. After fixation, the cells were washed 3 times with PBS (−), Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) supplemented with 0.1% Triton X-100 was added, and left at room temperature for 30 minutes. Adsorption was blocked. In the primary antibody reaction, the anti-bFGF antibody bFM-2 (manufactured by Upstate Biotechnology) is diluted with Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) to 10 μg / ml, and then this antibody and cells are reacted at room temperature for 1 hour. It was done. After the primary antibody reaction, the cells were washed three times with PBS (−), and a secondary antibody reaction was performed. The secondary antibody reaction was carried out by diluting an anti-mouse immunoglobulin / Oregon Green 514 labeled antibody (Molecular Probes) with Block Ace to 2 μg / ml, and then reacting the antibody with cells at room temperature for 1 hour. I did it. After completion of the reaction, the cells were washed three times with PBS (−), a small amount of 90% glycerol was dropped, and a cover glass was placed to prepare a slide sample.
When the slide sample is observed with a fluorescence microscope, most of the sC-FGF / 3T3, C-FGF / 3T3 and bFGF / 3T3 cells, except for the control NIH / 3T3 cells, fluoresce with the labeled antibody, and the target gene is introduced by the retrovirus. And the expression was good. bFGF is reported in a paper [Powell P. P. Et al. J. Cell Physiol., Vol. 148, pp. 202-210 (1991)], shows an image accumulated in the nucleus. Similarly, C-FGF was also accumulated in the nucleus, and it was speculated that there was little secretion outside the cell. In contrast, sC-FGF was hardly found in the nucleus and was found to be localized in the cytoplasm. That is, sC-FGF was thought to be secreted out of the cell membrane via an intracellular transport mechanism based on the added secretion signal.
[0049]
3-2-5) Quantification of expression protein contained in culture supernatant and cell extract of sC-FGF / 3T3, C-FGF / 3T3 and bFGF / 3T3 cells
After confluently growing sC-FGF / 3T3, C-FGF / 3T3 and bFGF / 3T3 cells in a 10 cm tissue culture dish, the medium was supplemented with 10% fetal calf serum (BioWitaker) and 50 units / ml. Were replaced with 5 ml Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Sigma) containing 50 μg / ml streptomycin (Gibco) and cultured for 24 hours. Thereafter, the culture supernatant was collected and filtered through a 0.45 μm membrane filter to obtain a culture supernatant sample. The cells were collected in 5 ml of the same DMEM medium, and the cell membrane and nuclear membrane were disrupted with a cell disrupter, centrifuged at 3000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant filtered through a 0.45 μm membrane filter. A sample was used.
The amount of each expressed protein was measured by Quantikine human FGF basic ELISA Kit (manufactured by R & D Systems) (see Table 2).
[0050]
[Table 2]
[0051]
As a result of ELISA, the expressed protein was detected only in sC-FGF / 3T3 and not detected in C-FGF / 3T3 and bFGF / 3T3 in the culture supernatant. On the other hand, in the cell extract, no expressed protein was detected in sC-FGF / 3T3, and a large amount of expressed protein was observed in C-FGF / 3T3 and bFGF / 3T3. With respect to these cell lines, the expression of each protein was confirmed in the section 3-2-4), indicating that the gene transfer was not defective. From these results, it was shown that by adding a secretion signal to the C-FGF gene, the sC-FGF protein produced in the cell was efficiently secreted outside the cell without accumulating in the nucleus.
[0052]
【The invention's effect】
According to the present invention, a new polypeptide useful for angiogenesis, a gene, and a medicine comprising the gene are provided.
The present invention provides a gene therapy agent having an angiogenesis promoting action superior to that of the prior art, and enables gene therapy exhibiting excellent effects on angiogenesis promotion, arterial disease treatment, cartilage injury treatment, etc. To do.
[0053]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of C277
SEQ ID NO: 2 nucleotide sequence of gene encoding C277
SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of bFGF
SEQ ID NO: 4 Base sequence of gene encoding bFGF
SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of C-FGF
SEQ ID NO: 6 nucleotide sequence of gene encoding C-FGF
SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of FGF-4 secretion signal
SEQ ID NO: 8 nucleotide sequence of gene encoding FGF-4 secretion signal
SEQ ID NO: 9 amino acid sequence of sC-FGF
SEQ ID NO: 10 Base sequence of gene encoding sC-FGF
SEQ ID NO: 11 PCR primer for amplifying FGF-4 secretion signal gene F4-2514
SEQ ID NO: 12 PCR primer for amplifying FGF-4 secretion signal gene F4-2667
SEQ ID NO: 13 PCR primer for amplifying FGF-4 secretion signal gene F4-2514M
SEQ ID NO: 14 PCR primer for amplifying FGF-4 secretion signal gene F4-2616
SEQ ID NO: 15 PCR primer for amplifying FGF-4 secretion signal gene F4-2628M
SEQ ID NO: 16 PCR primer for C-FGF gene amplification CFGF-1
SEQ ID NO: 17 PCR primer for amplification of C-FGF gene FNL3
SEQ ID NO: 18 PCR primer for amplification of C-FGF gene CF-2899
SEQ ID NO: 19 PCR primer for amplification of C-FGF gene CF-3366
[0054]
[Sequence Listing]
[0055]
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[0057]
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[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of Western blot analysis of each protein transiently expressed in 293T cells.
