JP2005046002A - Cd36/fat遺伝子プロモータおよびcd36/fat遺伝子関連疾患の判定 - Google Patents
Cd36/fat遺伝子プロモータおよびcd36/fat遺伝子関連疾患の判定 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】CD36/FAT遺伝子の転写調節機構およびCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の検出し得る方法を提供する
【解決手段】CD36/FAT遺伝子の既知のプロモータ領域以外にさらに上流に新規なプロモータDNAを提供する。このプロモータDNAは単独で使用することも下流側のプロモータと供にデュアルプロモータとして使用することもできる。このデュアルプロモータの上流側プロモータからの転写はペルオキシソーム増殖薬活性化受容体活性化因子により発現誘導され得る。さらに、CD36欠損症患者のゲノムDNAの解析から上記上流側プロモータ領域内およびCD36/FAT遺伝子の第12エキソンに変異が存在していた。
【選択図】 図3
【解決手段】CD36/FAT遺伝子の既知のプロモータ領域以外にさらに上流に新規なプロモータDNAを提供する。このプロモータDNAは単独で使用することも下流側のプロモータと供にデュアルプロモータとして使用することもできる。このデュアルプロモータの上流側プロモータからの転写はペルオキシソーム増殖薬活性化受容体活性化因子により発現誘導され得る。さらに、CD36欠損症患者のゲノムDNAの解析から上記上流側プロモータ領域内およびCD36/FAT遺伝子の第12エキソンに変異が存在していた。
【選択図】 図3
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトCD36/FAT遺伝子の既知のプロモータの上流に存在する新規なプロモータおよび該新規プロモータ領域内およびヒトCD36/FAT遺伝子第12番エキソンにおける変異に基づきCD36/FAT遺伝子関連疾患を判定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、注目されている生活習慣病に深い関わりを持つものに脂質代謝異常が挙げられる。この脂質代謝酵素遺伝子群の転写調節を行う中心的な核内受容体として、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体(Peroxisome Proliferator−activated receptor; PPAR)が知られている(Issemann I.ら, Nature 208:856−859(1990))。
【0003】
このPPARは、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、甲状腺ホルモン、脂溶性ビタミンなどをリガンドとする核内レセプターなどと同じファミリーに属し、これらレセプターと類似の機構により転写因子として機能する。PPARは3つのアイソフォームから構成されている。これらアイソフォームはリガンド依存的に活性化されて、9シスレチノイン酸をリガンドとするレチノイドXレセプター(RXR)とヘテロ二量体を形成する(Ranjan MらによるNature 386:407−410(1997)およびH. PoirierらによるFEBS Letters 412:480−484(1997))。そして、このヘテロ二量体が脂質代謝関連遺伝子の転写調節領域におけるDR−1(Direct Repeat 1)配列に結合し転写を調節している。
【0004】
このようなPPARを介する脂質代謝関連遺伝子の転写調節は、ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化、細胞質における脂肪酸合成、リポタンパク質の代謝、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしている。さらに、これら脂質代謝だけでなく、酸化脂質の取り込みと動脈硬化発症(11)、炎症応答(Devchand PRら, Nature 384:39−43(1996)、Gelman L, Cell Mol Life Sci 55: 932−943(1999))、大腸癌がん(Pasha Sarrafら, Nature Medicine 4(9):1046−1052(1998),Anne−Maie Leffbvreら,Nature Medicine 4(9): 1053−1057(1998))、乳がん(Enrique Saezら,Nature Medicine 4(9): 1058−1061(1998),Muller Eら,Mol. Cell. 3: 465−470 (1998))の発症にもPPARが関与するとの報告がある。そのため、今後更に増大するであろうと考えられる糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病へのPPARの関与が注目されている。
【0005】
一方、このPPARにより転写調節を受け、生活習慣病、特に動脈硬化と関わりがあると考えられている遺伝子に、CD36/FAT遺伝子がある。このCD36/FAT遺伝子は、ヒトでは第7番染色体に位置し(Kirk Tら, Gene 133: 205−212(1993)、Fernandez−Ruiz E.ら,Genomics 17:759−761(1993))12のコーディングエキソンから構成されていることが知られている(前掲Kirk T.ら、Tang Y.ら, J. Biol. Chem. 269: 6011−6015(1993)、Angel L.ら, J.Biol. Chem. 269(29): 18985−18991 (1994))。
【0006】
CD36/FATタンパク質は、472アミノ酸からなる糖タンパク質であり、糖鎖修飾により分子量は血小板で88K、乳腺上皮細胞では58K、赤血球では78Kである。また、このアミノ酸構造により膜2回貫通型構造をとることが考えられている(Nengbing Taoら, J. Biol. Chem. 271: 22315−22320)。また、CD36/FATタンパク質は、細胞接着に関わる分子であり、今までにトロンボスポンジン受容体(Asch AS.ら, J. Clin. Invest. 79(4): 1054−1061(1987))、コラーゲン受容体(Tandon NN.ら, J.Biol. Chem. 264: 7576−7583(1989))、マラリア感染赤血球の結合タンパク質(Ockenhouse CF.ら, Science 243(4897): 1469−1471 (1989))、長鎖脂肪酸の輸送担体(Abumrad NA.ら, J. Biol. Chem. 268: 17665−17668(1993))などとして機能することが報告されている。さらに、近年では、CD36/FATが酸化LDLの受容体として機能していることも報告され(Endemann Gら, J. Biol. Chem. 268: 11811−11816 (1993))、動脈硬化の発症・進展に関与すると考えられている。
【0007】
こうした多機能性タンパク質であるCD36/FATの欠損症としては、血小板の障害である血小板CD36欠損症が注目されている。この血小板CD36欠損症の罹患率は、日本では約3%(Y Tomiyamaら, Blood 75: 684−687 (1990))、アメリカでは約0.3%である。この血小板CD36欠損症は、血小板と単球におけるCD36/FATの発現量により二つのタイプ(タイプI、II)に分類されている。具体的には、タイプIでは血小板及び単球の双方におけるCD36発現が欠損し、タイプIIでは血小板のみでCD36発現が欠損している。
【0008】
CD36/FATは心筋において主たるエネルギー源である長鎖脂肪酸の取込みを担い、心筋代謝でも重要である。そのため、一部のCD36欠損症例では心筋症を合併するケースが観られ、心筋障害の新しい危険因子として作用し得ると考えられている。
【0009】
こうしたCD36/FAT欠損症患者のゲノムDNAの解析から、CD36/FATコーディング領域内における変異により、細胞膜表面にCD36が発現されていないことが報告されている(Hirokazu Kashiwagiら, Blood 83: 3545−3552(1994)、Hirokazu Kashiwagiら, Thrombosis and Haemostasis 69: 481−484 (1993)、Hirokazu Kashiwagiら, J. Clin. Invest. 95: 1040−1046 (1995)、Hirokazu Kashiwagiら, ArteriosclerThromb. Vasc. Biol. 16: 1026−1032 (1996)、Hirokazu Kashiwagiら, Thrombosis and Haemostasis 74(2): 758−763 (1995))。また、上記血小板CD36欠損症タイプIでは、コーディング領域内の変異をホモで持ち、血小板および単球でのCD36の発現がゼロであることが報告されている(Takao Tanakaら, J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 121−127 (1997)、Fumio Okamotoら, Japanese Circulation Journal 62: 499−504 (1998)、Kenichi Watanabeら, Annals of Nuclear Medicine 12(5): 261−266(1998))。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記タイプIIの血小板CD36欠損症では血小板のみで発現が観られないという表現形を示すが、この表現形は今まで報告されているコーディング領域内の変異によっては説明することはできない。
【0011】
他方、CD36/FAT遺伝子はPPARγ活性化薬により発現が誘導されることが報告されている(Laslo Nagyら, Cell 93: 229−240(1998)、 Peter Tontonzら, Cell 93: 241−252(1998))。しかし、その機序、さらにはPPARγ活性化薬がCD36/FAT遺伝子に直接または間接に作用する否かも分かっていない。
【0012】
また、本願発明者らはマウスCD36/FAT遺伝子は2つのプロモータにより転写が制御されるデュアルプロモータ構造をとることを明らかにしている。
【0013】
そこで、本願発明者は、血小板特異的な転写制御が存在するとの予測の下、CD36/FAT遺伝子の転写調節機構およびCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の原因を解明するために鋭意研究を行った結果、CD36/FAT遺伝子の新たなプロモータ領域およびその領域内における変異を見出し、本発明に至った。
【0014】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、CD36/FAT遺伝子には既知のプロモータ領域以外にさらに上流に新規なプロモータ活性を有する領域が存在し、デュアルプロモータ構造を有していることを見出した。このデュアルプロモータの上流側プロモータからの転写がPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子により調節されることを見出した。さらに、CD36欠損症患者のゲノムDNAの解析から上記上流側のプロモータ領域内およびCD36/FAT遺伝子の第12エキソンに変異が存在していることを見出した。
【0015】
すなわち、本発明は、(1)配列番号1に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有するDNA、(2)前記(1)のDNAにさらに配列番号2に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有する第二のプロモータ領域を連結したDNA、(3)前記(1)または(2)に記載のDNAを担持したベクター、(4)前記(1)又は(2)に記載のDNA下に転写可能に連結された遺伝子の発現がPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子により調節され得る前記(3)に記載のベクター、(5)前記(3)または(4)に記載のベクターを保持した細胞、(6)前記(1)又は(2)のDNA下に転写可能に連結された遺伝子の発現量をPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子を用いて調節する方法、(7)配列番号1に記載の塩基配列と、被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子デュアルプロモータの上流側プロモータ配列との比較に基づいて、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法、(8)被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子のデュアルプロモータの上流側プロモータ領域内における塩基配列に基づいてCD36/FAT遺伝子関与疾患の素因判定を行うためのキットであって、対照DNAとして請求項1もしくは2に記載のDNA又は請求項3に記載のベクターを含むキット、(9)被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子の第12番エキソンにおける変異に基づいてCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法、である。
【0016】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【0017】
本発明は、ヒトCD36/FAT遺伝子のプロモータに関する。より具体的には、ヒトCD36/FAT遺伝子のプロモータは既知のプロモータ(以下、「下流側プロモータ」という)よりも上流にさらに別のプロモータ(以下、「上流側プロモータ」という)が備えられたデュアルプロモータ構造を有する。特に、本発明はこの新たに見出した上流側プロモータに関する。この上流側プロモータは既知の下流側プロモータと同じヒト第7番染色体上の上流13〜14kbpに位置し、下流側プロモータから転写される転写開始点よりも13〜14kbp上流の別の転写開始点からの転写を制御する。
【0018】
この上流側プロモータは、下流側プロモータとは別に単独で利用することも、また第二のプロモータとして下流側プロモータと共に利用することもできる。また、上流側プロモータは配列番号1に記載された配列から構成されるが、必ずしもこの全長を用いる必要はなく、プロモータ活性を有する一部配列として用いることもできる。また、下流側プロモータと共に用いる場合、下流側プロモータは配列番号2に記載された配列から構成され、この全長を用いても、またこのうちプロモータ活性を有する一部配列を用いてもよい。なお、プロモータとして機能する最小配列の決定は、先ず、上記配列番号1、2のDNAを段階的に欠失させたデリーションシリーズを作成し、その下流にリポータ遺伝子などを接続し、該リポータ遺伝子の発現量に基づいて、プロモータ活性を有する範囲を同定することにより実施することができる。
【0019】
上流側プロモータは、ヒトゲノミックライブラリー、例えばヒトBACライブラリーより配列番号1に記載の塩基配列又はその一部を用いて、スクリーニングより得ることができる。また、配列番号8および9に記載のプライマー(hCDp−L1、hCDe1−R)を用いて、ヒトゲノムDNAよりPCR(Polymerase Chain Reaction)により調製することもできる。また、上流側プロモータに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータは、配列番号1および2に記載の塩基配列又はそれらの一部配列を用いて、ヒトゲノミックライブラリー等またはその他生物由来のゲノミックライブラリーより類似のプロモータをスクリーニングすることもできる。
【0020】
また、当業者であれば、プロモータ活性を保持あるいは向上させ得るように、配列番号1又は2に記載の配列の一部を置換、欠失させることも、または、他の配列を付加することも可能である。
【0021】
上流側プロモータ又はさらに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータは、例えば、その生体内における変異に由来するCD36/FATタンパク質の欠損あるいは発現異常症、例えば血小板CD36欠損症、脂質代謝異常症などの治療や予防に利用することが可能である。すなわち、このプロモータを有するCD36/FAT遺伝子を適当なベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど)に挿入し、または生理学的もしくは物理的な方法(リポフェクチン法、エレクトロポーレーション法など)で生体内に導入し、正常な制御下でCD36/FAT遺伝子を発現させ、これによりCD36/FAT遺伝子の欠損あるいは発現異常などの改善を図ることができる。
【0022】
また、上流側プロモータ又はさらに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータをベクターに組み込んで、発現ベクターとして使用することもできる。特に、上流側プロモータはPPAR活性化薬に応答して該プロモータの下流に連結された遺伝子の発現が誘導されるため、本プロモータを備えた発現ベクターは、誘導的な発現を実行させたい場合に好適に使用し得る。例えば、前記上流側プロモータの下流に殺細胞遺伝子を連結させた発現ベクターを死滅させたい癌などの病巣組織に導入し、PPAR活性化薬により発現を誘導することにより、病巣組織を破壊するなどの応用に用いることもできる。
【0023】
また、PPAR活性化薬存在下の場合に発現が見られる細胞、例えば、ヒト単球/マクロファージ由来のTHP−1細胞株を用いることにより、種々の遺伝子の細胞内における機能解析に利用することもできる。すなわち、上流側プロモータに機能を調べたい遺伝子を連結させ、この遺伝子をTHP−1などの細胞株に導入し、PPAR活性化薬存在下、非存在下での発現を調節し、それぞれの作用を解析することにより当該遺伝子の機能を解析することもできる。
【0024】
上流側プロモータからの誘導的な発現を実行させるためのPPAR活性化薬は、α、γ活性化薬のいずれを用いてもよいが、緩やかに発現を誘導させる場合にはα活性化薬を用いることが好ましく、強く発現を誘導させる場合にはγ活性化薬を用いることが好ましい。また、PPARα活性化薬は、例えば、Bnezafibrate(Sigma)やWy14643 (4−chloro−6−(2,3−xylidino)−2−pyrimidinyl−thio) acetic acid、 東京化成)などが挙げられるが、これらに限定されない。また、PPARγ活性化薬は、例えば、PioglitazoneやTroglitazoneなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0025】
また上記発現ベクターは、PPAR活性化薬以外のCD36/FAT遺伝子にプロモータからの発現を制御し得る物質のスクリーニングに用いることもできる。また、上流側プロモータと下流側プロモータとは、細胞や発生段階で利用され方が異なるため、上記発現ベクターは種々の細胞あるいは発生段階における上流側プロモータまたは下流側プロモータの機能を解析する手段としても用いることができる。このような目的で発現ベクターを用いる場合には、上記プロモータの下流に、例えば、ルシフェラーゼなどのレポータ遺伝子などを接続することが好ましい。
【0026】
また、本発明の他の態様は、前記CD36/FAT遺伝子のプロモータ配列に基づき、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法に関する。具体的には、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域の塩基配列(例えば配列番号1または/および配列番号2に記載の配列)と被験者由来CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域の塩基配列とを比較し、被験者由来のプロモータ領域に変異を有する場合に、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因を有すると判定される。
【0027】
この変異としては、単一の塩基配列の多型(SNP)であっても、ある程度の塩基長の欠失、置換、付加などであってもよい。SNPの一例としては、上流側(エキソン1a)の転写開始点から−593位の「A」のホモ又はヘテロ変異が挙げられる。また、CD36/FAT遺伝子関連疾患としては、CD36/FAT遺伝子の発現異常により生じる疾患、例えば、血小板CD36欠損症や、CD36/FATタンパク質が関与する脂質代謝異常症などが挙げられる。また変異の検出の手法は、塩基配列を直接決定することにより変異を検出することもでき、また、制限酵素断片の多型(RFLP)に基づき変異を検出することもできる。
【0028】
上記CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を簡便に行うために、キット化することもできる。この場合には対照DNAとして、CD36/FAT遺伝子のプロモータDNA(例えば、配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAや配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA)またはプロモータDNAを保持するベクターをキットに含めることができる。
【0029】
さらに、本発明の他の態様は、被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子の第12番エキソンにおける変異に基づいてCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法に関する。この第12エキソンの変異としては、CD36/FATタンパク質の機能異常を導く変異、例えば、第12エキソン配列内のヌクレオチドの欠失、置換、付加など、さらには、第12エキソンと隣接するイントロン内のスプライシングのシグナル配列に変異による第12エキソンの欠落などが挙げられる。この第12エキソンの変異は被験者のmRNAを対象として検出してもよく、また、ゲノムDNAを対象として検出してもよい。例えば、mRNA上の第12エキソンは第12エキソンよりも上流のエキソン内に位置するプライマー(例えば、配列番号12(CMP9プライマー))と第12エキソンよりも下流のエキソン内に位置するプライマー(例えば、配列番号:13(MP12プライマー))とを用いてRT−PCRにより増幅することができる。また、ゲノムDNA上の第12エキソンは、上流のゲノムDNA上に位置にするプライマー(例えば、エキソン11内に位置するプライマー(例えば、配列番号:14(CD36−11U)など)と、第12エキソンよりも下流に位置するプライマー(例えば配列番号:15(CD36−13L)など)を用いてPCRにより増幅することができる。これら増幅されたDNAの長さ又はその詳細な塩基配列を解析し、変異が検出されることにより被験者がCD36/FAT遺伝子関連疾患の素因を判定することができる。
【0030】
以下に上記プロモータ領域の変異およびエキソン12内の変異の検出に関してさらに詳細に説明する。
【0031】
本発明の上記判定方法において、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域やエキソン12に生じた変異の検出は、例えば、被検者のCD36/FAT遺伝子のプロモーター領域やエキソン12の塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
【0032】
この方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。次いで、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、上述したようにCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことも可能である。最終的に、単離したDNAの塩基配列を決定し、対照と比較する。この単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。また「対照」は、配列番号1および2に記載の配列もしくは正常な(野生型)CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域または正常なエキソン12を含むDNAの配列を言う。一般に健常人のCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAの配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAの配列と比較することを意味するが、GenBank等に野生型として登録されているCD36/FAT遺伝子のエキソン12を含むDNAの配列や配列番号1または配列番号2における転写開始点上流配列と比較してもよい。このような比較の結果、被検者のCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAの配列が対照と異なっていた場合には、CD36/FAT遺伝子に関与する疾患の遺伝的素因を有すると判定することができる。
【0033】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【0034】
例えば、本発明における多型の検出は、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用した方法やPCR−RFLP法等によっても行うことができる。この場合には、被検者からDNA試料を調製し、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて電気泳動などにより分離し、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。なお、PCR−RFLP法では調べたいCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12含むDNAを増幅し、この増幅したDNAを制限酵素による切断および電気泳動に供する。このような方法では、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンド移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12のDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。
【0035】
さらに別の方法としてPCR−SSCP(single−strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法(Cloning and polymerase chain reaction−single−strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139−146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single−strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313−1318.、Multiple fluorescence−based PCR−SSCP analysis with postlabeling. 、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275−282.)を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したDNA試料から、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAを増幅する。ここで増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させた後、非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。この原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。この方法は、操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。
【0036】
さらに別の方法として変性剤濃度勾配ゲル(denaturant gradient gel electrophoresis: DGGE法)等を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したDNA試料から、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAを増幅する。増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
【0037】
このようなDGGE法は、変性剤存在下でのDNA断片の不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法であるため、ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために部分的に1本鎖へと解離される。この部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
【0038】
さらに別の方法として、DNAアレイ法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128−135)を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNA、および該DNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を作成し、該DNAと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12の配列の変異を検出する。
【0039】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。
【0040】
また、CD36/FAT遺伝子のエキソン12の変異はリボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって検出することも可能である。具体的には、被験試料であるCD36/FAT遺伝子のエキソン12を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだ野生型CD36/FAT遺伝子のエキソン12cDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行う。被験試料に変異が存在する場合には、その変異部分においてハイブリッドが一本鎖構造となるため、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断して、これをオートラジオグラフィー等で検出する。
【0041】
また、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域内における変異の検出方法としては、CD36/FAT遺伝子の発現量を指標とすることによって検査を行う方法である。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、mRNAおよびタンパク質が含まれる。例えば、mRNAの発現量の測定は、直接被検者から該RNA試料を調製し、その量をノーザンブロッティング法で対照と比較することの他に、当業者において公知のその他の方法、例えば、RT−PCR法によるcDNAの量に基づきmRNAを測定する方法や、DNAアレイ法(新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、p280−284)によるハイブリダイズの強度に基づいて測定する等によって実施することもできる。
【0042】
また、CD36/FATタンパク質の発現量の測定は、被験者からタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれるCD36/FATタンパク質の量をSDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びにCD36/FATタンパク質に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)または免疫蛍光法などにより測定することもできる。
【0043】
上記の方法において、対照と比較して、CD36/FAT 遺伝子の発現量、またはCD36/FATタンパク質の発現量が有意に減少していた場合には、CD36/FATに関連した疾患の遺伝的素因として、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域内における変異を有すると判定することができる。
【0044】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【0045】
[実施例1] PPARα、PPARγ活性化薬によるヒト細胞株におけるCD36/FAT遺伝子の発現誘導
ヒトCD36/FATがPPARγ活性化薬による発現誘導がみられるという報告がすでにあるが(前掲Tonotonzら)、その作用機序はわかっていない。そこで、本実施例1ではヒト由来単球/マクロファージ細胞株であるHL60とTHP−1を用いて、PPAR活性化薬によるCD36/FAT遺伝子の発現誘導実験を行った。
【0046】
THP−1、HL60をPPARα活性化薬(Bezafibrate、200μM)、PPARγ活性化薬(Pioglitazone、1μM)で24時間又は48時間処理した後、トータルRNAをAGPC法(Chomczynoki Sacchi (1987) Anal. Biohem. 162: 156−159)により調製した。CD36/FATmRNA量の変化をCD36/FATコーディング領域のcDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションにより定量した(図1)。
【0047】
図1に示すようにTHP−1ではPPARγ活性化薬だけでなくα活性化薬にも応答して発現誘導がみられた。一方、HL60ではPPARα、γ両活性化薬による刺激の有無にかかわらず発現は全く見られなかった。
【0048】
THP−1およびHL60は共にヒト由来単球/マクロファージであるが、PPAR活性化薬への応答は異なっていた。このような応答の違いは、おそらく細胞の分化状態の違いによることが考えられる。
【0049】
[実施例2] ヒトCD36/FAT遺伝子の転写開始領域の解析
ヒトCD36/FATの発現が、PPARα、γ両活性化薬により誘導する機構を解析するために、ヒトCD36/FAT遺伝子の転写調節領域を解析した。
【0050】
具体的には、変法5’RACE法(Motojima, Passillyら(1998) JBC 273: 16710−16714)によりヒトCD36/FATmRNAの5’末端の構造を調べた。ヒト肝癌細胞株HepG2細胞のpoly(A)RNAよりcDNAを合成し、そのcDNAの3’末端にオリゴdCテールを伸長付加し、図2(B)に模式的に示す各プライマー(1、2、3)とオリゴdGプライマーとを用いてPCRを行った。
【0051】
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、そのサイズを確認した(図2(A))。平滑末端化しpUC18ベクターのHincII部位にクローニングした。
【0052】
クローニングされた20個のcDNAの塩基配列決定を行った結果、従来の報告とは異なる5’非翻訳領域をもつCD36/FATcDNAが1クローン同定された(図2(A)において矢印で示す)。このことより、従来報告されている転写開始点とは別にさらに上流の転写開始点が存在することが示唆された。
【0053】
[実施例3] ヒトCD36/FAT遺伝子プロモータ領域のクローニング
ヒトCD36/FAT遺伝子における既知の下流側プロモータ領域については転写開始点から上流289bpまで報告されている(Angle Lら, J. Biol. Chem. 269(29): 18985−18991(1994))。この既に報告されている領域よりも上流の配列を決定するために、上記において新たに同定されたエキソン配列からプライマーを設計し、Human Genome Walker kit (Clontech)を用いて、上流領域のクローニングを行った。ここで得られた約500bpクローニング断片の塩基配列を解析し、上流側プロモータの一部を含む領域、エキソン1aの57塩基と転写開始点から上流429塩基までを決定した。
【0054】
さらに上流の配列を得るために、上記においてクローニングされた約500bp断片を基にプローブを調整し、ヒト染色体BACライブラリー(Incyte Genomics Inc.)のスクリーニングを行った。このスクリーニングにおいてハイブリダイズしたBACクローンを入手し、これら各クローンDNAを種々の制限酵素を用いて消化した後、上記と同様の500bp断片をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。このサザン解析において、適切な長さをもつ上流側および下流側プロモータ領域を含む断片をそれぞれ同定し(図3にA,Bとして示す)、同定された断片をプラスミドベクターにサブクローニングした。
【0055】
[実施例4] ヒトCD36/FAT遺伝子プロモータ領域の塩基配列
上流側プロモータ
実施例3におけるBACクローンからプロモータ領域を含む断片を得、GPSTM−1 Genome Priming System (BioLabs)を用いてトランスポゾンの挿入を利用した方法により更に上流の塩基配列を決定した。これらにより約2kbpのプロモータ領域の配列とエキソン1aから下流約2.5kbp(図3中「A」として示す領域の配列)の塩基配列が得られた。なお、塩基配列の決定は、SequiThermExcel II Long−ReadTM DNA Sequiencing Kit−ALFTM (EPIDCENTRE TECHNOLOGIES)を用い、添付のプロトコールに従って行った。配列番号1には上流側プロモータ領域における転写開始点から上流2kbpとエキソン1aの一部配列を示す。また、TFSEARCHを用いて主要な転写因子が結合することが予測される配列について解析し、その結果を配列番号1の配列の特徴として示す。
【0056】
得られた配列から予想されるシス因子には、典型的なPPAR応答配列(PPRE)は存在していなかった。一方、脂質代謝に関与するPPARγと相互作用し転写を調節すると言われているC/EBPα、βが結合する配列が存在していた。また、この上流プロモータ領域には転写開始点から−120bp付近まではマウスのプロモータ領域と高い相同性(79%)を持っていた。この領域は転写制御に生物種を越えて重要であることが考えられる。
【0057】
下流プロモータ
BACクローンからプロモータ領域を含む断片を得て、上記と同様にトランスポゾンの挿入により更に上流まで塩基配列を決定し、約4kbpのプロモータ領域の配列とエキソン1bから下流に約1.2kbpの配列を得た(図3中、「B」として示す領域の配列)。プロモータ領域の配列およびエキソン1bから下流の一部配列を配列番号2に示す。また、TFSEARCHを用いて主要な転写因子が結合することが予測される配列を配列番号2の配列の特徴として示す。
【0058】
得られた配列から予測されるシス因子には、−2600塩基にPPRE様の配列であるCOUP−Tが存在していた。また、転写開始点から−30bp付近にTATAボックスが存在し、−270bp付近にDR−1配列が存在していた。また、マウスCD36/FAT遺伝子の下流プロモータと相同性は上流プロモータにおける相同性よりも、より広範囲に存在していた。
【0059】
両プロモータ間の距離
それぞれのプロモータをサブクローニングすることはできたが、そのプロモータが一つの染色体上に存在していることを示すために、両プロモータ領域を含む単一のBACクローンを得ることを試みた。
【0060】
上流側プロモータが含まれるBAC DNA断片A中のNcoI−HindIIIフラグメントと、下流側プロモータが含まれるBAC DNA断片B中のXbaI−NcoIフラグメントとをプローブとして用い、サザンブロットにより両プローブに反応するBACクローンをスクリーニングした。
【0061】
ここで得られたBACクローンの制限酵素地図を解析し、図3に示す制限酵素地図と比較した。その結果、新たに発見された上流側の転写開始点は、既知の下流側に位置する転写開始点より上流13kbに位置していた。
【0062】
この転写開始点間の距離をさらに確認するために、プライマー(hCDmt−L(配列番号3)、hCDp−vR1(配列番号4))を用いてPCRを行った(図4)。hCDmt−Lプライマーは上流側の転写開始点から転写されるエキソン1aの5’端側に位置し、hCDp−vR1プライマーは下流側の転写開始点から転写されるエキソン1bの3’端側に位置する。
【0063】
エキソン1a、1bをそれぞれ含むプローブで、得られたPCR産物のハイブリダイゼーションを行った。その結果、両プローブに反応する13kbpのPCR産物が得られた。この結果は、上記制限酵素を用いて距離の算定結果と一致することから、転写開始点間の距離は13kbpであることが確認された。以上より、新たに発見された転写開始点は、既知の転写開始点と同一の染色体上の上流13kbpに位置していた。
【0064】
CD36/FATの染色体位置
上記において新たに発見された転写開始点は、既知の転写開始点と同一の染色体上の上流13kbpに位置していることが確認されたが、さらにDNAデータベースを用いて確認を行った。
【0065】
DNAデータベースとしてNCBI Blastを用いて、上記(1)、(2)で塩基配列が決定された上流側の4.5kbpと下流側の5.3kbpの塩基配列を、公表されているヒト染色体配列と比較した。これら決定された配列は7番染色体の塩基配列と高いホモロジーを示し、これら転写開始点間の距離もデータベース上では14kbpと、算定された距離(13kbp)とほぼ一致していた。従って、CD36/FATの両転写開始点が包含されているBAC DNAは7番染色体由来であると考えられた。
【0066】
[実施例5] 上流エキソンの発現
ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2、ヒト由来単球/ヒトマクロファージであるTHP−1を用いてRT‐PCR法により両プロモータからの発現とPPAR活性化薬への応答を解析した。
【0067】
具体的には、PPARα活性化薬(Bezafibrate、200μM)又はPPARγ活性化薬(Pioglitazone、1μM)の存在下または非存在下で48時間培養し、その後、これら各細胞株からmRNAを抽出した。RNAの抽出は上述したAGPC法に従った。
【0068】
抽出したmRNAを図5および図6(A)に示すプライマー(e2:hCD300−R(配列番号5)と、v:hCDvg−L(配列番号6)またはm:hCDmt−L(配列番号7))を用いて、RT‐PCR(Molecular Cloning, 3rd ed (Sambrook, Russell) Cold Spring Harbor 2001)を行った。PCR産物を電気泳動により分画した(図6)。
【0069】
プライマーmとプライマー2または3の組合わせによるPCR産物はHepGs細胞(図6(B))およびTHP−1細胞(図6(D))で検出された。すなわちHepGs細胞、THP−1細胞において、新たに見出した1aエキソンは発現されていることが確認された。
【0070】
また、HepG2細胞では新たに見出した上流側プロモータのみから転写が行われることが確認された。しかし、PPAR活性化薬の添加の有無に拘わらず発現に変化は見られず、PPAR活性化薬への応答は見られなかった。
【0071】
THP−1細胞では下流側のプロモータでは、PPAR活性化薬の有無を問わず同様の強い転写活性が確認された。一方、新たに見出した上流側プロモータでは、PPAR活性化薬非存在下では転写活性は見られないが、PPAR活性化薬により発現が誘導された。特に、PPARγ活性化薬により強い発現誘導が確認された。
【0072】
[実施例6] 細胞株への遺伝子導入法を用いたヒトCD36/FAT遺伝子プロモータ領域の機能解析
上記でクローニングされたプロモータ領域に染色体内の遺伝子の応答と同じ機能があるか否かを、レポーターアッセイによって解析を行った。
【0073】
THP−1、HepG2を用い、遺伝子導入を行った。導入した遺伝子は、それぞれ転写開始点を含むそれぞれプロモータ領域(1.5kbp)をPCRにより増幅した。ここで用いたPCRプライマーの位置を図9に示す。エキソン1aの転写開始点を含むプロモータ領域をhCDp−L1(配列番号8)及びhCDe1−R(配列番号9)プライマーにより、また、エキソン1aの転写開始点を含むプロモータ領域をhCDp−vL1(配列番号10)及びhCDp−vR1(配列番号11)により増幅した。また、これらプライマーは、一方(hCDp−L1またはhCDp−vL1)にSacI認識配列を、他方(hCDe1−RまたはhCDp−vR1)にNheI認識配列を含むように設計された。
【0074】
ここで得られたPCR産物をSacI及びNheIで消化し、ホタルルシフェラーゼを含むpGL3−Promoterベクター(ProMega)のマルチクローニングサイトに挿入した(図8)。
【0075】
ここで調製されたベクターをHepG2にSuperFact (Qiagen)を用いリポフェクチン法により導入した。一方、遺伝子導入の困難なTHP−1(7〜8×106細胞/ml、500μl)はエレクトロポーション法(ELECTRO SQUARE PORETOR(BTX Electroporation System)、480V、90μsec、パルス回数3回)を用いて各ベクターを導入した。また、同様に陰性対照としてプロモータ領域を含まないpGL3−Promoterベクターを導入した細胞株を準備した。
【0076】
またルシフェラーゼアッセイはDual−Luciferase Reporter Assay System (Promega社)を用いて行った。このシステムでは調べたい転写調節領域を組込んだホタルルシフェラーゼをレポータとするベクターの他に、ウミシイタケルシフェラーゼをレポータとするベクターを上記ベクター導入の際に供にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定する際には、このコントロールベクターから得られた値を内部標準値として、調べたい転写調節領域を組込んだレポータの発現値を補正した。
【0077】
その結果、THP−1にプロモータ領域を含まない陰性対照ベクターを導入した場合に比べ、両プロモータ(上流側、下流側)供にルシフェラーゼ活性値が約2倍高い値が示された(図示せず)。構築したルシフェラーゼ発現ベクターにはプロモータ活性があることが確認された。
【0078】
次に、PPAR活性化薬(α活性化薬(Wy14643)、γ活性化薬(Troglitazone))で48時間処理した細胞株と、処理を行わなかった細胞株との比較を行った(図9、10)。
【0079】
THP−1細胞株において、上流側のプロモータ(Pm)約1.5kbpでは、薬物処理なしにおけるルシフェラーゼ活性値を基準として、PPARα活性化薬(Wy)処理細胞株で1.64倍ルシフェラーゼ活性が上昇していた。また、PPARγ活性化薬(Tro)処理細胞株で4.76倍と著しい活性の上昇が確認された(図9)。
【0080】
一方、下流側プロモータ(Pv)では、PPAR両活性化薬処理細胞株と、非処理の細胞株との間でルシフェラーゼ活性の値に有意な差は見なかった(図10)。
【0081】
また、HepG2細胞株においては、上流側プロモータ(Pm)でも、PPAR活性化薬処理の有無にかかわらずルシフェラーゼ活性に差は見られなかった(図9)。
【0082】
これらの結果は、実施例5に示したin vivoの発現結果を反映していた。すなわち、HepG2細胞では上流側プロモータのみから転写が行われるが、PPAR活性化薬への応答は見られなかったことや、THP−1細胞では下流側プロモータでは、PPAR活性化薬への応答はみられず、一方、上流側プロモータでは、PPAR活性化薬、特に、PPARγ活性化薬により強い発現誘導が見られたことを反映していた。
【0083】
[実施例7] ヒトCD36/FAT遺伝子の多型解析
本願によりヒトCD36/FAT遺伝子がデュアルプロモータ構造をとることが明らかとなったが、このプロモータ構造とCD36/FAT欠損症との関係を解析した。
【0084】
今までのCD36/FAT欠損症患者における遺伝子解析から報告されている変異部位はすべてコーディング領域内である。そこで、本実施例では、新たに見出したプロモータ領域内の遺伝子解析を行った。
【0085】
この解析は、CD36/FAT欠損症タイプI(血小板および単球の双方でCD36/FATの発現が見られない)患者由来が3サンプル、タイプII(血小板のみでCD36/FATの発現が見られない)患者由来が9サンプル、健常人由来が3サンプルで総計15サンプルを用いて実施した。
【0086】
遺伝子解析の結果、デュアルプロモータの上流側プロモータ約1kbpの間に5個のSNP(Single Nucleotide Polymorphism)を検出した(図11)。ここで検出されたSNPのうち、−593領域のSNPは健常人では見られないが、欠損症タイプI、IIではタイプIIの1サンプル(#8)を除き全てGがホモ又はヘテロで存在していた。
【0087】
また、−14領域のSNPは、健常人、欠損症タイプIではみられず、タイプIIの一人を除き、全てがホモで存在していた。
【0088】
[実施例8] CD36/FATコーディング領域内での新たなSNP
CD36/FATコーディング領域内のSNPの解析も行った。CD36/FATmRNA対象としてCMP9プライマー(配列番号12)とCMP12プライマー(配列番号13)とを用い、RT−PCR により1175から1715の領域を増幅した。
【0089】
これら両プライマーによるPCR産物を解析した結果、CD36/FAT欠損症患者のサンプルにおいて、エキソン12が欠落している変異を検出した。
【0090】
さらに、このサンプルのゲノムDNAを解析した。すなわち、エキソン11内の配列と相補するCD36−11Uプライマー(配列番号14)とエキソン13内の配列と相補するCD36−13Lプライマー(配列番号15)を用いて、エキソン12を含む領域を増幅し、その塩基配列を決定した。
【0091】
ゲノムDNA配列の解析結果、イントロン11とエキソン12との境界領域に7塩基(TTTAG/AT:「/」はイントロンとエキソンの境界線を示す)の欠損が検出された(図12)。この欠損配列内には、スプライシングのアクセプター配列が含まれていた。その結果、イントロン11の適切なスプライシングが行われず、エキソン12の欠落がもたらされたことが説明できる。
【0092】
【配列表】
【0093】
【発明の効果】
本発明により、CD36/FAT遺伝子における既知のプロモータとは別に上流に新たなプロモータが存在し、デュアルプロモータ構造をとっていること、また、この新たな上流プロモータはPPAR活性化薬により発現誘導が可能であることを明らかにした。さらに、CD36/FAT遺伝子に関与する疾患の患者において、有意に高い割合で、この新たなプロモータ領域内に変異が検出された。さらに、CD36/FAT遺伝子のエキソン12においても、エキソン12が欠損する変異を検出した。従って、これらプロモータ領域内における変異や、エキソン12内における変異を検出することにより、CD36/FAT遺伝子関連疾患の遺伝的素因を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】PPARα、γ活性化薬によるヒト細胞株HL60、THP−1におけるCD36/FAT遺伝子の発現誘導結果を示す電気泳動図である。
【図2】5’−RACE法によるヒトCD36/FAT遺伝子の5’非翻訳領域の解析に用いたプライマーの位置および得られたcDNAの電気泳動結果を示す図である。
【図3】ヒトCD/FAT遺伝子のデュアルプロモータ構造を示す図である。
【図4】実施例4における転写開始点間の距離を解析するために用いたプライマー位置を示す図である。
【図5】実施例5におけるRT−PCRで用いたプライマーの位置を示す図である。
【図6】ヒト細胞株HepG2、THP−1における上流側プロモータからのエキソン1aの発現をRT−PCRを用いて解析した結果を示す電気泳動図である。
【図7】実施例6におけるレポータ解析に使用するためのプロモータ領域をPCRにより調製するためのプライマー配列とそのPCR産物を模式的に示す図である。
【図8】実施例6におけるレポータ解析に使用するベクターの構成を示す図である。
【図9】THP−1およびHepG2細胞株におけるCD36/FAT遺伝子の上流側プロモータにおけるPPAR活性化薬への応答をルシフェラーゼレポータ解析により解析した結果を示すグラフである。
【図10】THP−1細胞株におけるCD36/FAT遺伝子の上流側プロモータにおけるPPAR活性化薬への応答をレポータ解析により解析した結果を示すグラフである。
【図11】ヒトCD36/FAT遺伝子の上流側プロモータ領域内の多型解析を行った結果を示す図である。
【図12】CD36/FAT欠損症患者で検出されたヒトCD36/FAT遺伝子の第11イントロン−第12エキソンの変異を模式的に示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトCD36/FAT遺伝子の既知のプロモータの上流に存在する新規なプロモータおよび該新規プロモータ領域内およびヒトCD36/FAT遺伝子第12番エキソンにおける変異に基づきCD36/FAT遺伝子関連疾患を判定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、注目されている生活習慣病に深い関わりを持つものに脂質代謝異常が挙げられる。この脂質代謝酵素遺伝子群の転写調節を行う中心的な核内受容体として、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体(Peroxisome Proliferator−activated receptor; PPAR)が知られている(Issemann I.ら, Nature 208:856−859(1990))。
【0003】
このPPARは、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、甲状腺ホルモン、脂溶性ビタミンなどをリガンドとする核内レセプターなどと同じファミリーに属し、これらレセプターと類似の機構により転写因子として機能する。PPARは3つのアイソフォームから構成されている。これらアイソフォームはリガンド依存的に活性化されて、9シスレチノイン酸をリガンドとするレチノイドXレセプター(RXR)とヘテロ二量体を形成する(Ranjan MらによるNature 386:407−410(1997)およびH. PoirierらによるFEBS Letters 412:480−484(1997))。そして、このヘテロ二量体が脂質代謝関連遺伝子の転写調節領域におけるDR−1(Direct Repeat 1)配列に結合し転写を調節している。
【0004】
このようなPPARを介する脂質代謝関連遺伝子の転写調節は、ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化、細胞質における脂肪酸合成、リポタンパク質の代謝、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしている。さらに、これら脂質代謝だけでなく、酸化脂質の取り込みと動脈硬化発症(11)、炎症応答(Devchand PRら, Nature 384:39−43(1996)、Gelman L, Cell Mol Life Sci 55: 932−943(1999))、大腸癌がん(Pasha Sarrafら, Nature Medicine 4(9):1046−1052(1998),Anne−Maie Leffbvreら,Nature Medicine 4(9): 1053−1057(1998))、乳がん(Enrique Saezら,Nature Medicine 4(9): 1058−1061(1998),Muller Eら,Mol. Cell. 3: 465−470 (1998))の発症にもPPARが関与するとの報告がある。そのため、今後更に増大するであろうと考えられる糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病へのPPARの関与が注目されている。
【0005】
一方、このPPARにより転写調節を受け、生活習慣病、特に動脈硬化と関わりがあると考えられている遺伝子に、CD36/FAT遺伝子がある。このCD36/FAT遺伝子は、ヒトでは第7番染色体に位置し(Kirk Tら, Gene 133: 205−212(1993)、Fernandez−Ruiz E.ら,Genomics 17:759−761(1993))12のコーディングエキソンから構成されていることが知られている(前掲Kirk T.ら、Tang Y.ら, J. Biol. Chem. 269: 6011−6015(1993)、Angel L.ら, J.Biol. Chem. 269(29): 18985−18991 (1994))。
【0006】
CD36/FATタンパク質は、472アミノ酸からなる糖タンパク質であり、糖鎖修飾により分子量は血小板で88K、乳腺上皮細胞では58K、赤血球では78Kである。また、このアミノ酸構造により膜2回貫通型構造をとることが考えられている(Nengbing Taoら, J. Biol. Chem. 271: 22315−22320)。また、CD36/FATタンパク質は、細胞接着に関わる分子であり、今までにトロンボスポンジン受容体(Asch AS.ら, J. Clin. Invest. 79(4): 1054−1061(1987))、コラーゲン受容体(Tandon NN.ら, J.Biol. Chem. 264: 7576−7583(1989))、マラリア感染赤血球の結合タンパク質(Ockenhouse CF.ら, Science 243(4897): 1469−1471 (1989))、長鎖脂肪酸の輸送担体(Abumrad NA.ら, J. Biol. Chem. 268: 17665−17668(1993))などとして機能することが報告されている。さらに、近年では、CD36/FATが酸化LDLの受容体として機能していることも報告され(Endemann Gら, J. Biol. Chem. 268: 11811−11816 (1993))、動脈硬化の発症・進展に関与すると考えられている。
【0007】
こうした多機能性タンパク質であるCD36/FATの欠損症としては、血小板の障害である血小板CD36欠損症が注目されている。この血小板CD36欠損症の罹患率は、日本では約3%(Y Tomiyamaら, Blood 75: 684−687 (1990))、アメリカでは約0.3%である。この血小板CD36欠損症は、血小板と単球におけるCD36/FATの発現量により二つのタイプ(タイプI、II)に分類されている。具体的には、タイプIでは血小板及び単球の双方におけるCD36発現が欠損し、タイプIIでは血小板のみでCD36発現が欠損している。
【0008】
CD36/FATは心筋において主たるエネルギー源である長鎖脂肪酸の取込みを担い、心筋代謝でも重要である。そのため、一部のCD36欠損症例では心筋症を合併するケースが観られ、心筋障害の新しい危険因子として作用し得ると考えられている。
【0009】
こうしたCD36/FAT欠損症患者のゲノムDNAの解析から、CD36/FATコーディング領域内における変異により、細胞膜表面にCD36が発現されていないことが報告されている(Hirokazu Kashiwagiら, Blood 83: 3545−3552(1994)、Hirokazu Kashiwagiら, Thrombosis and Haemostasis 69: 481−484 (1993)、Hirokazu Kashiwagiら, J. Clin. Invest. 95: 1040−1046 (1995)、Hirokazu Kashiwagiら, ArteriosclerThromb. Vasc. Biol. 16: 1026−1032 (1996)、Hirokazu Kashiwagiら, Thrombosis and Haemostasis 74(2): 758−763 (1995))。また、上記血小板CD36欠損症タイプIでは、コーディング領域内の変異をホモで持ち、血小板および単球でのCD36の発現がゼロであることが報告されている(Takao Tanakaら, J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 121−127 (1997)、Fumio Okamotoら, Japanese Circulation Journal 62: 499−504 (1998)、Kenichi Watanabeら, Annals of Nuclear Medicine 12(5): 261−266(1998))。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記タイプIIの血小板CD36欠損症では血小板のみで発現が観られないという表現形を示すが、この表現形は今まで報告されているコーディング領域内の変異によっては説明することはできない。
【0011】
他方、CD36/FAT遺伝子はPPARγ活性化薬により発現が誘導されることが報告されている(Laslo Nagyら, Cell 93: 229−240(1998)、 Peter Tontonzら, Cell 93: 241−252(1998))。しかし、その機序、さらにはPPARγ活性化薬がCD36/FAT遺伝子に直接または間接に作用する否かも分かっていない。
【0012】
また、本願発明者らはマウスCD36/FAT遺伝子は2つのプロモータにより転写が制御されるデュアルプロモータ構造をとることを明らかにしている。
【0013】
そこで、本願発明者は、血小板特異的な転写制御が存在するとの予測の下、CD36/FAT遺伝子の転写調節機構およびCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の原因を解明するために鋭意研究を行った結果、CD36/FAT遺伝子の新たなプロモータ領域およびその領域内における変異を見出し、本発明に至った。
【0014】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、CD36/FAT遺伝子には既知のプロモータ領域以外にさらに上流に新規なプロモータ活性を有する領域が存在し、デュアルプロモータ構造を有していることを見出した。このデュアルプロモータの上流側プロモータからの転写がPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子により調節されることを見出した。さらに、CD36欠損症患者のゲノムDNAの解析から上記上流側のプロモータ領域内およびCD36/FAT遺伝子の第12エキソンに変異が存在していることを見出した。
【0015】
すなわち、本発明は、(1)配列番号1に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有するDNA、(2)前記(1)のDNAにさらに配列番号2に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有する第二のプロモータ領域を連結したDNA、(3)前記(1)または(2)に記載のDNAを担持したベクター、(4)前記(1)又は(2)に記載のDNA下に転写可能に連結された遺伝子の発現がPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子により調節され得る前記(3)に記載のベクター、(5)前記(3)または(4)に記載のベクターを保持した細胞、(6)前記(1)又は(2)のDNA下に転写可能に連結された遺伝子の発現量をPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子を用いて調節する方法、(7)配列番号1に記載の塩基配列と、被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子デュアルプロモータの上流側プロモータ配列との比較に基づいて、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法、(8)被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子のデュアルプロモータの上流側プロモータ領域内における塩基配列に基づいてCD36/FAT遺伝子関与疾患の素因判定を行うためのキットであって、対照DNAとして請求項1もしくは2に記載のDNA又は請求項3に記載のベクターを含むキット、(9)被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子の第12番エキソンにおける変異に基づいてCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法、である。
【0016】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【0017】
本発明は、ヒトCD36/FAT遺伝子のプロモータに関する。より具体的には、ヒトCD36/FAT遺伝子のプロモータは既知のプロモータ(以下、「下流側プロモータ」という)よりも上流にさらに別のプロモータ(以下、「上流側プロモータ」という)が備えられたデュアルプロモータ構造を有する。特に、本発明はこの新たに見出した上流側プロモータに関する。この上流側プロモータは既知の下流側プロモータと同じヒト第7番染色体上の上流13〜14kbpに位置し、下流側プロモータから転写される転写開始点よりも13〜14kbp上流の別の転写開始点からの転写を制御する。
【0018】
この上流側プロモータは、下流側プロモータとは別に単独で利用することも、また第二のプロモータとして下流側プロモータと共に利用することもできる。また、上流側プロモータは配列番号1に記載された配列から構成されるが、必ずしもこの全長を用いる必要はなく、プロモータ活性を有する一部配列として用いることもできる。また、下流側プロモータと共に用いる場合、下流側プロモータは配列番号2に記載された配列から構成され、この全長を用いても、またこのうちプロモータ活性を有する一部配列を用いてもよい。なお、プロモータとして機能する最小配列の決定は、先ず、上記配列番号1、2のDNAを段階的に欠失させたデリーションシリーズを作成し、その下流にリポータ遺伝子などを接続し、該リポータ遺伝子の発現量に基づいて、プロモータ活性を有する範囲を同定することにより実施することができる。
【0019】
上流側プロモータは、ヒトゲノミックライブラリー、例えばヒトBACライブラリーより配列番号1に記載の塩基配列又はその一部を用いて、スクリーニングより得ることができる。また、配列番号8および9に記載のプライマー(hCDp−L1、hCDe1−R)を用いて、ヒトゲノムDNAよりPCR(Polymerase Chain Reaction)により調製することもできる。また、上流側プロモータに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータは、配列番号1および2に記載の塩基配列又はそれらの一部配列を用いて、ヒトゲノミックライブラリー等またはその他生物由来のゲノミックライブラリーより類似のプロモータをスクリーニングすることもできる。
【0020】
また、当業者であれば、プロモータ活性を保持あるいは向上させ得るように、配列番号1又は2に記載の配列の一部を置換、欠失させることも、または、他の配列を付加することも可能である。
【0021】
上流側プロモータ又はさらに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータは、例えば、その生体内における変異に由来するCD36/FATタンパク質の欠損あるいは発現異常症、例えば血小板CD36欠損症、脂質代謝異常症などの治療や予防に利用することが可能である。すなわち、このプロモータを有するCD36/FAT遺伝子を適当なベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど)に挿入し、または生理学的もしくは物理的な方法(リポフェクチン法、エレクトロポーレーション法など)で生体内に導入し、正常な制御下でCD36/FAT遺伝子を発現させ、これによりCD36/FAT遺伝子の欠損あるいは発現異常などの改善を図ることができる。
【0022】
また、上流側プロモータ又はさらに下流側プロモータを備えたデュアルプロモータをベクターに組み込んで、発現ベクターとして使用することもできる。特に、上流側プロモータはPPAR活性化薬に応答して該プロモータの下流に連結された遺伝子の発現が誘導されるため、本プロモータを備えた発現ベクターは、誘導的な発現を実行させたい場合に好適に使用し得る。例えば、前記上流側プロモータの下流に殺細胞遺伝子を連結させた発現ベクターを死滅させたい癌などの病巣組織に導入し、PPAR活性化薬により発現を誘導することにより、病巣組織を破壊するなどの応用に用いることもできる。
【0023】
また、PPAR活性化薬存在下の場合に発現が見られる細胞、例えば、ヒト単球/マクロファージ由来のTHP−1細胞株を用いることにより、種々の遺伝子の細胞内における機能解析に利用することもできる。すなわち、上流側プロモータに機能を調べたい遺伝子を連結させ、この遺伝子をTHP−1などの細胞株に導入し、PPAR活性化薬存在下、非存在下での発現を調節し、それぞれの作用を解析することにより当該遺伝子の機能を解析することもできる。
【0024】
上流側プロモータからの誘導的な発現を実行させるためのPPAR活性化薬は、α、γ活性化薬のいずれを用いてもよいが、緩やかに発現を誘導させる場合にはα活性化薬を用いることが好ましく、強く発現を誘導させる場合にはγ活性化薬を用いることが好ましい。また、PPARα活性化薬は、例えば、Bnezafibrate(Sigma)やWy14643 (4−chloro−6−(2,3−xylidino)−2−pyrimidinyl−thio) acetic acid、 東京化成)などが挙げられるが、これらに限定されない。また、PPARγ活性化薬は、例えば、PioglitazoneやTroglitazoneなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0025】
また上記発現ベクターは、PPAR活性化薬以外のCD36/FAT遺伝子にプロモータからの発現を制御し得る物質のスクリーニングに用いることもできる。また、上流側プロモータと下流側プロモータとは、細胞や発生段階で利用され方が異なるため、上記発現ベクターは種々の細胞あるいは発生段階における上流側プロモータまたは下流側プロモータの機能を解析する手段としても用いることができる。このような目的で発現ベクターを用いる場合には、上記プロモータの下流に、例えば、ルシフェラーゼなどのレポータ遺伝子などを接続することが好ましい。
【0026】
また、本発明の他の態様は、前記CD36/FAT遺伝子のプロモータ配列に基づき、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法に関する。具体的には、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域の塩基配列(例えば配列番号1または/および配列番号2に記載の配列)と被験者由来CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域の塩基配列とを比較し、被験者由来のプロモータ領域に変異を有する場合に、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因を有すると判定される。
【0027】
この変異としては、単一の塩基配列の多型(SNP)であっても、ある程度の塩基長の欠失、置換、付加などであってもよい。SNPの一例としては、上流側(エキソン1a)の転写開始点から−593位の「A」のホモ又はヘテロ変異が挙げられる。また、CD36/FAT遺伝子関連疾患としては、CD36/FAT遺伝子の発現異常により生じる疾患、例えば、血小板CD36欠損症や、CD36/FATタンパク質が関与する脂質代謝異常症などが挙げられる。また変異の検出の手法は、塩基配列を直接決定することにより変異を検出することもでき、また、制限酵素断片の多型(RFLP)に基づき変異を検出することもできる。
【0028】
上記CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を簡便に行うために、キット化することもできる。この場合には対照DNAとして、CD36/FAT遺伝子のプロモータDNA(例えば、配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAや配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA)またはプロモータDNAを保持するベクターをキットに含めることができる。
【0029】
さらに、本発明の他の態様は、被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子の第12番エキソンにおける変異に基づいてCD36/FAT遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法に関する。この第12エキソンの変異としては、CD36/FATタンパク質の機能異常を導く変異、例えば、第12エキソン配列内のヌクレオチドの欠失、置換、付加など、さらには、第12エキソンと隣接するイントロン内のスプライシングのシグナル配列に変異による第12エキソンの欠落などが挙げられる。この第12エキソンの変異は被験者のmRNAを対象として検出してもよく、また、ゲノムDNAを対象として検出してもよい。例えば、mRNA上の第12エキソンは第12エキソンよりも上流のエキソン内に位置するプライマー(例えば、配列番号12(CMP9プライマー))と第12エキソンよりも下流のエキソン内に位置するプライマー(例えば、配列番号:13(MP12プライマー))とを用いてRT−PCRにより増幅することができる。また、ゲノムDNA上の第12エキソンは、上流のゲノムDNA上に位置にするプライマー(例えば、エキソン11内に位置するプライマー(例えば、配列番号:14(CD36−11U)など)と、第12エキソンよりも下流に位置するプライマー(例えば配列番号:15(CD36−13L)など)を用いてPCRにより増幅することができる。これら増幅されたDNAの長さ又はその詳細な塩基配列を解析し、変異が検出されることにより被験者がCD36/FAT遺伝子関連疾患の素因を判定することができる。
【0030】
以下に上記プロモータ領域の変異およびエキソン12内の変異の検出に関してさらに詳細に説明する。
【0031】
本発明の上記判定方法において、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域やエキソン12に生じた変異の検出は、例えば、被検者のCD36/FAT遺伝子のプロモーター領域やエキソン12の塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
【0032】
この方法においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。次いで、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、上述したようにCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことも可能である。最終的に、単離したDNAの塩基配列を決定し、対照と比較する。この単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。また「対照」は、配列番号1および2に記載の配列もしくは正常な(野生型)CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域または正常なエキソン12を含むDNAの配列を言う。一般に健常人のCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAの配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAの配列と比較することを意味するが、GenBank等に野生型として登録されているCD36/FAT遺伝子のエキソン12を含むDNAの配列や配列番号1または配列番号2における転写開始点上流配列と比較してもよい。このような比較の結果、被検者のCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAの配列が対照と異なっていた場合には、CD36/FAT遺伝子に関与する疾患の遺伝的素因を有すると判定することができる。
【0033】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のDNAの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【0034】
例えば、本発明における多型の検出は、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用した方法やPCR−RFLP法等によっても行うことができる。この場合には、被検者からDNA試料を調製し、調製したDNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて電気泳動などにより分離し、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からDNA試料を調製する。なお、PCR−RFLP法では調べたいCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12含むDNAを増幅し、この増幅したDNAを制限酵素による切断および電気泳動に供する。このような方法では、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンド移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12のDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。
【0035】
さらに別の方法としてPCR−SSCP(single−strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法(Cloning and polymerase chain reaction−single−strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139−146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single−strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313−1318.、Multiple fluorescence−based PCR−SSCP analysis with postlabeling. 、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275−282.)を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したDNA試料から、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAを増幅する。ここで増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させた後、非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。この原理は次の通りである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。この方法は、操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のDNA試料をスクリーニングするのに好適である。
【0036】
さらに別の方法として変性剤濃度勾配ゲル(denaturant gradient gel electrophoresis: DGGE法)等を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したDNA試料から、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNAを増幅する。増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。
【0037】
このようなDGGE法は、変性剤存在下でのDNA断片の不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法であるため、ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために部分的に1本鎖へと解離される。この部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
【0038】
さらに別の方法として、DNAアレイ法(SNP遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128−135)を用いることもできる。この方法では、被検者から調製したCD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12を含むDNA、および該DNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を作成し、該DNAと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域またはエキソン12の配列の変異を検出する。
【0039】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。
【0040】
また、CD36/FAT遺伝子のエキソン12の変異はリボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって検出することも可能である。具体的には、被験試料であるCD36/FAT遺伝子のエキソン12を含むDNAをPCR法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだ野生型CD36/FAT遺伝子のエキソン12cDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行う。被験試料に変異が存在する場合には、その変異部分においてハイブリッドが一本鎖構造となるため、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断して、これをオートラジオグラフィー等で検出する。
【0041】
また、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域内における変異の検出方法としては、CD36/FAT遺伝子の発現量を指標とすることによって検査を行う方法である。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、mRNAおよびタンパク質が含まれる。例えば、mRNAの発現量の測定は、直接被検者から該RNA試料を調製し、その量をノーザンブロッティング法で対照と比較することの他に、当業者において公知のその他の方法、例えば、RT−PCR法によるcDNAの量に基づきmRNAを測定する方法や、DNAアレイ法(新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、p280−284)によるハイブリダイズの強度に基づいて測定する等によって実施することもできる。
【0042】
また、CD36/FATタンパク質の発現量の測定は、被験者からタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれるCD36/FATタンパク質の量をSDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びにCD36/FATタンパク質に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)または免疫蛍光法などにより測定することもできる。
【0043】
上記の方法において、対照と比較して、CD36/FAT 遺伝子の発現量、またはCD36/FATタンパク質の発現量が有意に減少していた場合には、CD36/FATに関連した疾患の遺伝的素因として、CD36/FAT遺伝子のプロモータ領域内における変異を有すると判定することができる。
【0044】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【0045】
[実施例1] PPARα、PPARγ活性化薬によるヒト細胞株におけるCD36/FAT遺伝子の発現誘導
ヒトCD36/FATがPPARγ活性化薬による発現誘導がみられるという報告がすでにあるが(前掲Tonotonzら)、その作用機序はわかっていない。そこで、本実施例1ではヒト由来単球/マクロファージ細胞株であるHL60とTHP−1を用いて、PPAR活性化薬によるCD36/FAT遺伝子の発現誘導実験を行った。
【0046】
THP−1、HL60をPPARα活性化薬(Bezafibrate、200μM)、PPARγ活性化薬(Pioglitazone、1μM)で24時間又は48時間処理した後、トータルRNAをAGPC法(Chomczynoki Sacchi (1987) Anal. Biohem. 162: 156−159)により調製した。CD36/FATmRNA量の変化をCD36/FATコーディング領域のcDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションにより定量した(図1)。
【0047】
図1に示すようにTHP−1ではPPARγ活性化薬だけでなくα活性化薬にも応答して発現誘導がみられた。一方、HL60ではPPARα、γ両活性化薬による刺激の有無にかかわらず発現は全く見られなかった。
【0048】
THP−1およびHL60は共にヒト由来単球/マクロファージであるが、PPAR活性化薬への応答は異なっていた。このような応答の違いは、おそらく細胞の分化状態の違いによることが考えられる。
【0049】
[実施例2] ヒトCD36/FAT遺伝子の転写開始領域の解析
ヒトCD36/FATの発現が、PPARα、γ両活性化薬により誘導する機構を解析するために、ヒトCD36/FAT遺伝子の転写調節領域を解析した。
【0050】
具体的には、変法5’RACE法(Motojima, Passillyら(1998) JBC 273: 16710−16714)によりヒトCD36/FATmRNAの5’末端の構造を調べた。ヒト肝癌細胞株HepG2細胞のpoly(A)RNAよりcDNAを合成し、そのcDNAの3’末端にオリゴdCテールを伸長付加し、図2(B)に模式的に示す各プライマー(1、2、3)とオリゴdGプライマーとを用いてPCRを行った。
【0051】
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、そのサイズを確認した(図2(A))。平滑末端化しpUC18ベクターのHincII部位にクローニングした。
【0052】
クローニングされた20個のcDNAの塩基配列決定を行った結果、従来の報告とは異なる5’非翻訳領域をもつCD36/FATcDNAが1クローン同定された(図2(A)において矢印で示す)。このことより、従来報告されている転写開始点とは別にさらに上流の転写開始点が存在することが示唆された。
【0053】
[実施例3] ヒトCD36/FAT遺伝子プロモータ領域のクローニング
ヒトCD36/FAT遺伝子における既知の下流側プロモータ領域については転写開始点から上流289bpまで報告されている(Angle Lら, J. Biol. Chem. 269(29): 18985−18991(1994))。この既に報告されている領域よりも上流の配列を決定するために、上記において新たに同定されたエキソン配列からプライマーを設計し、Human Genome Walker kit (Clontech)を用いて、上流領域のクローニングを行った。ここで得られた約500bpクローニング断片の塩基配列を解析し、上流側プロモータの一部を含む領域、エキソン1aの57塩基と転写開始点から上流429塩基までを決定した。
【0054】
さらに上流の配列を得るために、上記においてクローニングされた約500bp断片を基にプローブを調整し、ヒト染色体BACライブラリー(Incyte Genomics Inc.)のスクリーニングを行った。このスクリーニングにおいてハイブリダイズしたBACクローンを入手し、これら各クローンDNAを種々の制限酵素を用いて消化した後、上記と同様の500bp断片をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。このサザン解析において、適切な長さをもつ上流側および下流側プロモータ領域を含む断片をそれぞれ同定し(図3にA,Bとして示す)、同定された断片をプラスミドベクターにサブクローニングした。
【0055】
[実施例4] ヒトCD36/FAT遺伝子プロモータ領域の塩基配列
上流側プロモータ
実施例3におけるBACクローンからプロモータ領域を含む断片を得、GPSTM−1 Genome Priming System (BioLabs)を用いてトランスポゾンの挿入を利用した方法により更に上流の塩基配列を決定した。これらにより約2kbpのプロモータ領域の配列とエキソン1aから下流約2.5kbp(図3中「A」として示す領域の配列)の塩基配列が得られた。なお、塩基配列の決定は、SequiThermExcel II Long−ReadTM DNA Sequiencing Kit−ALFTM (EPIDCENTRE TECHNOLOGIES)を用い、添付のプロトコールに従って行った。配列番号1には上流側プロモータ領域における転写開始点から上流2kbpとエキソン1aの一部配列を示す。また、TFSEARCHを用いて主要な転写因子が結合することが予測される配列について解析し、その結果を配列番号1の配列の特徴として示す。
【0056】
得られた配列から予想されるシス因子には、典型的なPPAR応答配列(PPRE)は存在していなかった。一方、脂質代謝に関与するPPARγと相互作用し転写を調節すると言われているC/EBPα、βが結合する配列が存在していた。また、この上流プロモータ領域には転写開始点から−120bp付近まではマウスのプロモータ領域と高い相同性(79%)を持っていた。この領域は転写制御に生物種を越えて重要であることが考えられる。
【0057】
下流プロモータ
BACクローンからプロモータ領域を含む断片を得て、上記と同様にトランスポゾンの挿入により更に上流まで塩基配列を決定し、約4kbpのプロモータ領域の配列とエキソン1bから下流に約1.2kbpの配列を得た(図3中、「B」として示す領域の配列)。プロモータ領域の配列およびエキソン1bから下流の一部配列を配列番号2に示す。また、TFSEARCHを用いて主要な転写因子が結合することが予測される配列を配列番号2の配列の特徴として示す。
【0058】
得られた配列から予測されるシス因子には、−2600塩基にPPRE様の配列であるCOUP−Tが存在していた。また、転写開始点から−30bp付近にTATAボックスが存在し、−270bp付近にDR−1配列が存在していた。また、マウスCD36/FAT遺伝子の下流プロモータと相同性は上流プロモータにおける相同性よりも、より広範囲に存在していた。
【0059】
両プロモータ間の距離
それぞれのプロモータをサブクローニングすることはできたが、そのプロモータが一つの染色体上に存在していることを示すために、両プロモータ領域を含む単一のBACクローンを得ることを試みた。
【0060】
上流側プロモータが含まれるBAC DNA断片A中のNcoI−HindIIIフラグメントと、下流側プロモータが含まれるBAC DNA断片B中のXbaI−NcoIフラグメントとをプローブとして用い、サザンブロットにより両プローブに反応するBACクローンをスクリーニングした。
【0061】
ここで得られたBACクローンの制限酵素地図を解析し、図3に示す制限酵素地図と比較した。その結果、新たに発見された上流側の転写開始点は、既知の下流側に位置する転写開始点より上流13kbに位置していた。
【0062】
この転写開始点間の距離をさらに確認するために、プライマー(hCDmt−L(配列番号3)、hCDp−vR1(配列番号4))を用いてPCRを行った(図4)。hCDmt−Lプライマーは上流側の転写開始点から転写されるエキソン1aの5’端側に位置し、hCDp−vR1プライマーは下流側の転写開始点から転写されるエキソン1bの3’端側に位置する。
【0063】
エキソン1a、1bをそれぞれ含むプローブで、得られたPCR産物のハイブリダイゼーションを行った。その結果、両プローブに反応する13kbpのPCR産物が得られた。この結果は、上記制限酵素を用いて距離の算定結果と一致することから、転写開始点間の距離は13kbpであることが確認された。以上より、新たに発見された転写開始点は、既知の転写開始点と同一の染色体上の上流13kbpに位置していた。
【0064】
CD36/FATの染色体位置
上記において新たに発見された転写開始点は、既知の転写開始点と同一の染色体上の上流13kbpに位置していることが確認されたが、さらにDNAデータベースを用いて確認を行った。
【0065】
DNAデータベースとしてNCBI Blastを用いて、上記(1)、(2)で塩基配列が決定された上流側の4.5kbpと下流側の5.3kbpの塩基配列を、公表されているヒト染色体配列と比較した。これら決定された配列は7番染色体の塩基配列と高いホモロジーを示し、これら転写開始点間の距離もデータベース上では14kbpと、算定された距離(13kbp)とほぼ一致していた。従って、CD36/FATの両転写開始点が包含されているBAC DNAは7番染色体由来であると考えられた。
【0066】
[実施例5] 上流エキソンの発現
ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2、ヒト由来単球/ヒトマクロファージであるTHP−1を用いてRT‐PCR法により両プロモータからの発現とPPAR活性化薬への応答を解析した。
【0067】
具体的には、PPARα活性化薬(Bezafibrate、200μM)又はPPARγ活性化薬(Pioglitazone、1μM)の存在下または非存在下で48時間培養し、その後、これら各細胞株からmRNAを抽出した。RNAの抽出は上述したAGPC法に従った。
【0068】
抽出したmRNAを図5および図6(A)に示すプライマー(e2:hCD300−R(配列番号5)と、v:hCDvg−L(配列番号6)またはm:hCDmt−L(配列番号7))を用いて、RT‐PCR(Molecular Cloning, 3rd ed (Sambrook, Russell) Cold Spring Harbor 2001)を行った。PCR産物を電気泳動により分画した(図6)。
【0069】
プライマーmとプライマー2または3の組合わせによるPCR産物はHepGs細胞(図6(B))およびTHP−1細胞(図6(D))で検出された。すなわちHepGs細胞、THP−1細胞において、新たに見出した1aエキソンは発現されていることが確認された。
【0070】
また、HepG2細胞では新たに見出した上流側プロモータのみから転写が行われることが確認された。しかし、PPAR活性化薬の添加の有無に拘わらず発現に変化は見られず、PPAR活性化薬への応答は見られなかった。
【0071】
THP−1細胞では下流側のプロモータでは、PPAR活性化薬の有無を問わず同様の強い転写活性が確認された。一方、新たに見出した上流側プロモータでは、PPAR活性化薬非存在下では転写活性は見られないが、PPAR活性化薬により発現が誘導された。特に、PPARγ活性化薬により強い発現誘導が確認された。
【0072】
[実施例6] 細胞株への遺伝子導入法を用いたヒトCD36/FAT遺伝子プロモータ領域の機能解析
上記でクローニングされたプロモータ領域に染色体内の遺伝子の応答と同じ機能があるか否かを、レポーターアッセイによって解析を行った。
【0073】
THP−1、HepG2を用い、遺伝子導入を行った。導入した遺伝子は、それぞれ転写開始点を含むそれぞれプロモータ領域(1.5kbp)をPCRにより増幅した。ここで用いたPCRプライマーの位置を図9に示す。エキソン1aの転写開始点を含むプロモータ領域をhCDp−L1(配列番号8)及びhCDe1−R(配列番号9)プライマーにより、また、エキソン1aの転写開始点を含むプロモータ領域をhCDp−vL1(配列番号10)及びhCDp−vR1(配列番号11)により増幅した。また、これらプライマーは、一方(hCDp−L1またはhCDp−vL1)にSacI認識配列を、他方(hCDe1−RまたはhCDp−vR1)にNheI認識配列を含むように設計された。
【0074】
ここで得られたPCR産物をSacI及びNheIで消化し、ホタルルシフェラーゼを含むpGL3−Promoterベクター(ProMega)のマルチクローニングサイトに挿入した(図8)。
【0075】
ここで調製されたベクターをHepG2にSuperFact (Qiagen)を用いリポフェクチン法により導入した。一方、遺伝子導入の困難なTHP−1(7〜8×106細胞/ml、500μl)はエレクトロポーション法(ELECTRO SQUARE PORETOR(BTX Electroporation System)、480V、90μsec、パルス回数3回)を用いて各ベクターを導入した。また、同様に陰性対照としてプロモータ領域を含まないpGL3−Promoterベクターを導入した細胞株を準備した。
【0076】
またルシフェラーゼアッセイはDual−Luciferase Reporter Assay System (Promega社)を用いて行った。このシステムでは調べたい転写調節領域を組込んだホタルルシフェラーゼをレポータとするベクターの他に、ウミシイタケルシフェラーゼをレポータとするベクターを上記ベクター導入の際に供にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定する際には、このコントロールベクターから得られた値を内部標準値として、調べたい転写調節領域を組込んだレポータの発現値を補正した。
【0077】
その結果、THP−1にプロモータ領域を含まない陰性対照ベクターを導入した場合に比べ、両プロモータ(上流側、下流側)供にルシフェラーゼ活性値が約2倍高い値が示された(図示せず)。構築したルシフェラーゼ発現ベクターにはプロモータ活性があることが確認された。
【0078】
次に、PPAR活性化薬(α活性化薬(Wy14643)、γ活性化薬(Troglitazone))で48時間処理した細胞株と、処理を行わなかった細胞株との比較を行った(図9、10)。
【0079】
THP−1細胞株において、上流側のプロモータ(Pm)約1.5kbpでは、薬物処理なしにおけるルシフェラーゼ活性値を基準として、PPARα活性化薬(Wy)処理細胞株で1.64倍ルシフェラーゼ活性が上昇していた。また、PPARγ活性化薬(Tro)処理細胞株で4.76倍と著しい活性の上昇が確認された(図9)。
【0080】
一方、下流側プロモータ(Pv)では、PPAR両活性化薬処理細胞株と、非処理の細胞株との間でルシフェラーゼ活性の値に有意な差は見なかった(図10)。
【0081】
また、HepG2細胞株においては、上流側プロモータ(Pm)でも、PPAR活性化薬処理の有無にかかわらずルシフェラーゼ活性に差は見られなかった(図9)。
【0082】
これらの結果は、実施例5に示したin vivoの発現結果を反映していた。すなわち、HepG2細胞では上流側プロモータのみから転写が行われるが、PPAR活性化薬への応答は見られなかったことや、THP−1細胞では下流側プロモータでは、PPAR活性化薬への応答はみられず、一方、上流側プロモータでは、PPAR活性化薬、特に、PPARγ活性化薬により強い発現誘導が見られたことを反映していた。
【0083】
[実施例7] ヒトCD36/FAT遺伝子の多型解析
本願によりヒトCD36/FAT遺伝子がデュアルプロモータ構造をとることが明らかとなったが、このプロモータ構造とCD36/FAT欠損症との関係を解析した。
【0084】
今までのCD36/FAT欠損症患者における遺伝子解析から報告されている変異部位はすべてコーディング領域内である。そこで、本実施例では、新たに見出したプロモータ領域内の遺伝子解析を行った。
【0085】
この解析は、CD36/FAT欠損症タイプI(血小板および単球の双方でCD36/FATの発現が見られない)患者由来が3サンプル、タイプII(血小板のみでCD36/FATの発現が見られない)患者由来が9サンプル、健常人由来が3サンプルで総計15サンプルを用いて実施した。
【0086】
遺伝子解析の結果、デュアルプロモータの上流側プロモータ約1kbpの間に5個のSNP(Single Nucleotide Polymorphism)を検出した(図11)。ここで検出されたSNPのうち、−593領域のSNPは健常人では見られないが、欠損症タイプI、IIではタイプIIの1サンプル(#8)を除き全てGがホモ又はヘテロで存在していた。
【0087】
また、−14領域のSNPは、健常人、欠損症タイプIではみられず、タイプIIの一人を除き、全てがホモで存在していた。
【0088】
[実施例8] CD36/FATコーディング領域内での新たなSNP
CD36/FATコーディング領域内のSNPの解析も行った。CD36/FATmRNA対象としてCMP9プライマー(配列番号12)とCMP12プライマー(配列番号13)とを用い、RT−PCR により1175から1715の領域を増幅した。
【0089】
これら両プライマーによるPCR産物を解析した結果、CD36/FAT欠損症患者のサンプルにおいて、エキソン12が欠落している変異を検出した。
【0090】
さらに、このサンプルのゲノムDNAを解析した。すなわち、エキソン11内の配列と相補するCD36−11Uプライマー(配列番号14)とエキソン13内の配列と相補するCD36−13Lプライマー(配列番号15)を用いて、エキソン12を含む領域を増幅し、その塩基配列を決定した。
【0091】
ゲノムDNA配列の解析結果、イントロン11とエキソン12との境界領域に7塩基(TTTAG/AT:「/」はイントロンとエキソンの境界線を示す)の欠損が検出された(図12)。この欠損配列内には、スプライシングのアクセプター配列が含まれていた。その結果、イントロン11の適切なスプライシングが行われず、エキソン12の欠落がもたらされたことが説明できる。
【0092】
【配列表】
【0093】
【発明の効果】
本発明により、CD36/FAT遺伝子における既知のプロモータとは別に上流に新たなプロモータが存在し、デュアルプロモータ構造をとっていること、また、この新たな上流プロモータはPPAR活性化薬により発現誘導が可能であることを明らかにした。さらに、CD36/FAT遺伝子に関与する疾患の患者において、有意に高い割合で、この新たなプロモータ領域内に変異が検出された。さらに、CD36/FAT遺伝子のエキソン12においても、エキソン12が欠損する変異を検出した。従って、これらプロモータ領域内における変異や、エキソン12内における変異を検出することにより、CD36/FAT遺伝子関連疾患の遺伝的素因を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】PPARα、γ活性化薬によるヒト細胞株HL60、THP−1におけるCD36/FAT遺伝子の発現誘導結果を示す電気泳動図である。
【図2】5’−RACE法によるヒトCD36/FAT遺伝子の5’非翻訳領域の解析に用いたプライマーの位置および得られたcDNAの電気泳動結果を示す図である。
【図3】ヒトCD/FAT遺伝子のデュアルプロモータ構造を示す図である。
【図4】実施例4における転写開始点間の距離を解析するために用いたプライマー位置を示す図である。
【図5】実施例5におけるRT−PCRで用いたプライマーの位置を示す図である。
【図6】ヒト細胞株HepG2、THP−1における上流側プロモータからのエキソン1aの発現をRT−PCRを用いて解析した結果を示す電気泳動図である。
【図7】実施例6におけるレポータ解析に使用するためのプロモータ領域をPCRにより調製するためのプライマー配列とそのPCR産物を模式的に示す図である。
【図8】実施例6におけるレポータ解析に使用するベクターの構成を示す図である。
【図9】THP−1およびHepG2細胞株におけるCD36/FAT遺伝子の上流側プロモータにおけるPPAR活性化薬への応答をルシフェラーゼレポータ解析により解析した結果を示すグラフである。
【図10】THP−1細胞株におけるCD36/FAT遺伝子の上流側プロモータにおけるPPAR活性化薬への応答をレポータ解析により解析した結果を示すグラフである。
【図11】ヒトCD36/FAT遺伝子の上流側プロモータ領域内の多型解析を行った結果を示す図である。
【図12】CD36/FAT欠損症患者で検出されたヒトCD36/FAT遺伝子の第11イントロン−第12エキソンの変異を模式的に示す図である。
Claims (9)
- 配列番号1に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有するDNA。
- さらに配列番号2に記載の塩基配列の少なくとも一部を備えプロモータ活性を有する第二のプロモータ領域を連結した、請求項1記載のDNA。
- 請求項1又は2に記載のDNAを担持したベクター。
- 前記請求項1又は2に記載のDNA下に転写可能に連結された遺伝子の発現がPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子により調節され得る、請求項3に記載のベクター。
- 請求項3または4に記載のベクターを保持した細胞。
- 請求項1又は2のDNA下に転写可能に連結された遺伝子の発現量をPPAR(ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体)活性化因子を用いて調節する方法。
- 配列番号1に記載の塩基配列と、被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子デュアルプロモータの上流側プロモータ配列との比較に基づいて、CD36/FAT遺伝子関連疾患の素因判定を行う方法。
- 被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子のデュアルプロモータの上流側プロモータ領域内における塩基配列に基づいてCD36/FAT遺伝子関与疾患の素因判定を行うためのキットであって、対照DNAとして請求項1もしくは2に記載のDNA又は請求項3に記載のベクターを含む、キット。
- 被験者由来の核酸試料におけるCD36/FAT遺伝子の第12番エキソンにおける変異に基づいて、CD36/FAT遺伝子に関与する疾患の素因判定を行う方法。
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