JP2005043271A - データ処理方法及び装置、並びにマイクロチップ電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
電気泳動されたパターンのＳ／Ｎ比を向上させる。
【解決手段】
以下のステップ（Ａ）から（Ｄ）を備えて電気泳動パターンを作成する。
（Ａ）１つの泳動路の所定の範囲を複数の試料成分が泳動により展開されていく過程を時系列に取り込んで泳動パターンの軌跡をもつ２次元データを得るステップ。
（Ｂ）前記２次元データから軌跡をもつ泳動パターンを選び出すステップ。
（Ｃ）選びだされた泳動パターンをモデル化して推定泳動パターンを作成するステップ。
（Ｄ）軌跡をもつ全ての泳動パターンについてステップ（Ｂ）と（Ｃ）を繰り返した後、前記推定泳動パターンを組み合わせて試料成分の泳動停止時の泳動パターンを再構築するステップ。
【選択図】 図４

Description

本発明は、電気泳動分離された泳動パターンを検出するデータ処理方法とその装置、及びそのデータ処理装置を備えた電気泳動装置の一例としてのマイクロチップ電気泳動装置に関するものである。

極微量のタンパク質や核酸などを分析する場合には、従来から電気泳動法が用いられており、その装置化技術の例としてキャピラリ電気泳動装置がある。キャピラリ電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下のガラスキャピラリー内に泳動バッファを充填し、一端側に試料を導入した後、両端間に高電圧を印加して分析対象物をキャピラリー内で展開させるものである。キャピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高いことから、高電圧の印加が可能となり、ＤＮＡなどの極微量試料を高速、かつ高分解能にて分析することができる。

近年、取扱いが煩雑なフューズドシリカ・キャピラリーに代わって、分析の高速化、装置の小型化が期待できる形態として、非特許文献１に示されているように、２枚の基板を接合して形成されたキャピラリー電気泳動チップ（マイクロチップという）が提案されている。

マイクロチップ電気泳動の場合、光路長は汎用キャピラリー電気泳動と比べても約１／５程度の１０〜２０μｍ程度しか得られず、感度の低さが大きな欠点となっている。また、試料が泳動しているため、検出領域の前に試料が存在している時間が短く、長時間の積算処理を行なって感度の向上を図ることができない。

マイクロチップ電気泳動装置のＳ／Ｎ比を向上させ、検出感度を高めるための１つの方法として、移動する各試料のピークを追跡しながら、各時刻での同じ試料のピークを積算平均演算部によって積算平均化することにより、ＳＮ比を向上させること、具体的には、泳動中の平行四辺形の空間を、素子軸変換（投影変換）により、長方形の空間にした後、時間方向へ積算平均を行なう方法が提案されている（特許文献１参照。）。
D. J. Harrison et al./ Anal. Chim. Acta 283 (1993) 361-366 特許第３４０５１６２号公報

本発明は、特許文献１の方法と同様に、電気泳動されたパターンのＳ／Ｎ比を向上させようとするものであり、特許文献１とは別の方法により実現することを目的とするものである。

泳動中のデータでは複数のピークが重なっている部分があるので、泳動中の各ピーク波形を最小自乗法により推定し、泳動停止時の推定波形を求める。
本発明のデータ処理方法は、以下のステップ（Ａ）から（Ｄ）を備えて電気泳動パターンを作成するものである。
（Ａ）１つの泳動路の所定の範囲を複数の試料成分が泳動により展開されていく過程を時系列に取り込んで泳動パターンの軌跡をもつ２次元データを得るステップ。
（Ｂ）前記２次元データから軌跡をもつ泳動パターンを選び出すステップ。
（Ｃ）選びだされた泳動パターンをモデル化して推定泳動パターンを作成するステップ。
（Ｄ）軌跡をもつ全ての泳動パターンについてステップ（Ｂ）と（Ｃ）を繰り返した後、前記推定泳動パターンを組み合わせて試料成分の泳動停止時の泳動パターンを再構築するステップ。

ステップ（Ｃ）ではモデルパターンを実際の泳動パターンと比較し、最小自乗法によりモデルパターンのパラメータを決定して推定泳動パターンを作成することができる。
ステップ（Ｂ）では前記２次元データを残余マップの初期値として残余マップの中にある泳動パターンの軌跡データに対してラドン変換を施し、ラドン変換値の最大値をもつものを選び出すとともに、その選び出した泳動パターンの軌跡データを残余マップから除去するようにすることができる。

また、ステップ（Ｂ）では前記２次元データを残余マップの初期値として残余マップの中にある泳動パターンの軌跡データに対してラドン変換を施し、ラドン変換値の大きいものから順に複数個を選び出すとともに、その選び出した泳動パターンの軌跡データを残余マップから除去するようにしてもよい。

ノイズパターンを除去するために、再構築した泳動パターンからノイズパターンを除去するようにしてもよく、ステップ（Ｃ）で、選びだされた泳動パターンをモデル化する際にピークパラメータがノイズピークのパラメータになったものについては推定泳動パターンを作成しないようにしてもよい。

本発明のデータ処理装置は、このデータ処理方法を実現するように構成されたものである。
本発明のデータ処理方法は、キャピラリー電気泳動装置やマイクロチップ電気泳動装置など、微細な分離流路を備えた電気泳動装置に適用することができる。

そのような電気泳動装置のうちで、本発明のデータ処理方法が特に効果的に適用されるものとしてマイクロチップ電気泳動装置を挙げることができる。本発明のマイクロチップ電気泳動装置は、透明板状部材の内部に分離流路を形成してなるマイクロチップと、前記分離流路の両端間に流動電圧を印加する泳動電源部と、前記分離流路の所定の範囲にわたって光源からの光を集光させる光照射部と、前記分離流路内で分離された目的成分による前記光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って複数個の光検出素子が配列されたアレイ光検出部と、前記アレイ光検出部の各検出素子の出力を取り込んでデータ処理するデータ処理装置とを備えたものであって、前記データ処理装置は各光検出素子の出力を記憶部に記憶し、その記憶部に記憶された光検出素子の出力について本発明のデータ処理方法を実現するものである。

本発明では、２次元データから軌跡をもつ泳動パターンを選び出し、モデル化した推定泳動パターンに置き換えるので、ノイズピーク、ランダムノイズ、ベースラインなどを除去した鮮明な波形が得られる。
また、泳動中は見えていても泳動を停止することにより拡散して見えなくなるピークも得られる。
泳動中のサンプル数は多いので、ランダムノイズに埋もれたピークも得られる可能性が高まる。

ステップ（Ｃ）で最小自乗法を適用すれば、自乗誤差が最小となる正確な波形が得られる。
ステップ（Ｂ）でラドン変換を適用すれば、軌跡をもつ泳動パターンを選び出すのが容易である。その際、ラドン変換値の最大値をもつものを選び出すようにしてもよく、ラドン変換値の大きいものから順に複数個を同時に選び出すようにしてもよい。複数個の泳動パターンを同時に選び出すことにより、処理時間を短縮できる効果がある。

軌跡をもつ泳動パターンがノイズパターンであることもあるので、ノイズパターンであるか否かを判別するプログラムを用意しておき、再構築した泳動パターンからノイズパターンを除去するようにしてもよい。

また、ノイズパターンであるか否かを判別するプログラムはピークパラメータによって判別するものとすることもでき、選びだされた泳動パターンをモデル化するステップ（Ｃ）で、ピークパラメータがノイズピークのパラメータになったものについては推定泳動パターンを作成しないことによってノイズパターンを除去することができる。その場合には、処理時間を短縮できる効果がある。

本発明が適用されるマイクロチップ電気泳動装置のマイクロチップの一例を図１に示す。一対の透明基板（ガラス、石英、樹脂など）５１，５２からなり、一方の基板５２の表面に互いに交差する泳動用キャピラリー溝５４，５５が形成され、他方の基板５１にはその溝５４，５５の端に対応する位置にリザーバ５３が貫通穴として設けられ、両基板５１，５２がキャピラリー溝５４，５５を内側にして（Ｃ）に示されるように接合されている。短い方のキャピラリー溝５４は試料導入流路、長い方のキャピラリー５５は分離流路である。

使用に際し、いずれかのリザーバ５３から泳動液が溝５４，５５中に注入される。その後、試料導入流路５４の一方の端のリザーバ５３に試料が注入され、試料導入流路５４の両端のリザーバ５３，５３間に所定時間だけ高電圧が印加される。これにより、試料は試料導入流路５４中を移動する。次に、分離流路５５の両端のリザーバ５３，５３に泳動電圧が印加される。これにより、両溝５４，５５の交差部分５６に存在する試料が分離流路５５内を電気泳動する。分離流路５５の所定の範囲の泳動パターンを時間の経過とともに順次取り込んで記憶装置に記憶していくことにより、２次元データが得られる。本発明はその２次元データを処理して試料成分の泳動パターンを作成するものである。

マイクロチップ電気泳動装置の一実施例を図２に示す。
例えばＤ₂ランプやタングステンランプなどの光源１が備えられており、光源１からの光の光路にはミラー３、レンズ５、スリット７及びミラー９が設けられている。レンズ５は、ミラー３により反射された光源１からの光を平行光にするものである。光路のミラー９による反射光の光路上には、レンズ５により平行光にされた光を分光するグレーティング１１が設けられており、グレーティング１１により分光された光をスリット１５に導くミラー１３が設けられている。マイクロチップ１７の分離流路のみに光照射するために、スリット１５は長方形の開口をもってマイクロチップ１７の光入射側に備えられている。マイクロチップ１７の反対側には分離流路を透過した光を検出する複数の光検出素子が配列されたＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）１９が備えられている。

ＰＤＡ１９から各検出素子の検出出力を取り込み、吸光度変換などの信号処理後、ピーク波形を作成する本発明のデータ処理装置２１が備えられている。データ処理装置２１には、取り込まれた検出信号を例えば吸光度変換する信号変換部２３、信号変換部２３からのデータを記憶する記憶部２５、記憶部２５に記憶されたデータを基にしてピーク波形を作成する演算部２７が備えられている。
高圧電源２９は、データ処理装置２１により制御され、マイクロチップ１７の分離流路に泳動電圧を印加する。

次に動作について説明する。光源１から放射された光がミラー３、レンズ５、スリット７、スリット９を介してグレーティング１１に入射させる。グレーティング１１で分光された光をミラー１３、スリット１５を介してマイクロチップ１７の分離流路全体に集光する。その光を分離流路を通ってＰＤＡ１９に入射させる。高圧電源２９によりマイクロチップ１７の分離流路に泳動電圧を印加し、電気泳動を行なう。その際、等時間間隔でＰＤＡ１９により光検出を行なう。得られたデータを信号変換部２３により例えば吸光度変換を行なって信号処理を行なった後、記憶部２５に記憶する。電気泳動終了後、記憶部２５に記憶されたデータを基にして泳動パターンを作成する。
演算部２７における処理手順を説明する。

分離流路に沿った泳動パターンを時間経過に従って取り込んで得られる２次元の泳動データとして、図３に示すシミュレーションデータを用いる。図４は処理方法の動作を示すフローチャート図であり、図５は処理途中のデータを図示したものである。図３、図５（Ａ），（Ｃ），（Ｄ）において横軸はセンサーの位置であり、分離流路上の位置に対応しており、縦軸は泳動開始からの時間である。

図３において、Ａは泳動されるもので最も遅く最も大きい試料ピーク、Ｂは泳動速度がＡとほぼ同じで、泳動でＡと完全に分離されない試料ピーク、Ｃは泳動されるが、泳動停止時にノイズピーク（Ｆ）と重なる試料ピーク、Ｄはホワイトノイズと同程度の大きさを持つため、泳動中には見えないが積算平均することにより見える試料ピーク、Ｅは泳動される中で最も早く泳動停止時にはセンサ領域から外れている試料ピーク、Ｆは泳動開始時に試料注入位置から大きく離れ、ゆっくり移動しながら徐々に大きくなるノイズピーク、ＧはＤと同様に積算平均でしか見えないが、泳動開始時に試料注入位置から大きく離れ、泳動中も移動しないノイズピークをそれぞれ表わしている。

処理に先立ち、ピーク形状をモデル化する。本実施例ではピークを（１）式に示すガウス関数 f でモデル化した。

ここで、Ａはピーク面積、ｗは半値幅、ｐはピーク中心位置初期値、ｖはピーク中心移動速度で、ｘはセンサ位置、ｔは時間を表す。必要に応じて、半値幅を時間に比例する関数としたり、ガウス関数以外の関数式でピークをモデル化することも可能である。場合によっては、ピークモデル関数とともにベースラインを表す関数を利用することも可能である。

ステップ１では、残差マップデータとして泳動データそのもの（図５（Ａ））をセットする。また、後のステップで使用するピークパラメータの初期値と最終値を格納するためのメモリをクリアしておく。さらに、便宜上、後で（５）式により定義されるＡＩＣの値は無限大としておく。

ステップ２では、残差マップに対し（２）式に示すラドン変換を行なう。

ラドン変換は、直交したｘ−ｔ座標の観測点を極座標現したｙ−θ座標空間に変換することにより、ｘ−ｔ座標における直線上の積分値をｙ−θ座標空間の各座標値として算出することができる。ラドン変換した結果（以下、ラドンマップと呼ぶ）を図５（Ｂ）に示す。図５（Ｂ）における最大値を持つ座標点（ｙ’，θ’）とその値ｇ（ｙ’，θ’）から、ｘ−ｔ座標上に現れる最も鮮明な直線を表す（１）式のパラメータは（３）式で表せる。

ここで、Ａ₀、ｗ₀、ｐ₀、ｖ₀はそれぞれピークの面積、半値幅、初期位置、速度を表し、Ｉｘ、Ｉｙは残差マップのサイズ、ｎ（ｙ、θ）はＩｘ行Ｉｙ列の全要素が１の行列をラドン変換した場合の（ｙ、θ）要素、ｙ₁’、ｙ₂’はｇ（ｙ’、θ’）がθ軸上で１／√２に減衰するｙ座標値である。そして、（３）式で算出したパラメータをピークパラメータの初期値のメモリに追加する。

ステップ３では、ステップ２で算出したピークパラメータ初期値を用いて非線形最小自乗法を実行し、泳動中の計測データと推定データの自乗誤差ｑを最小とするようなピークパラメータを求める。

ここで、ｄ_txは時刻ｔ、位置ｘのセンサによる計測値で、＾はパラメータの推定値、ｋはピークの個数を示す。推定データを図５（Ｃ）に示す。

ステップ４では、適切なピーク数を決定するために、情報量基準を利用する。情報量基準は、計測データに対する当てはまりの良さとモデルの自由度とのバランスを取ることにより、最良のモデルを選択する基準として利用される。ここでは情報量基準として（５）式により定義されるＡＩＣを使用した。ＡＩＣによるモデル選択は、ＡＩＣ値が最小となるモデルを最良のモデルと考える。

ここで、ｋＬは未知数の総数を表し、ｋはピークの個数、Ｌはピーク1つあたりの未知数の個数であり、この例ではＬは４である。あらかじめ記憶していた（ピークを追加する前に計算された）ＡＩＣの値に対し、ピークを追加して計算されたＡＩＣの値が増加すればステップ６に進み、ＡＩＣの値が減少すればステップ５に進む。

ステップ５では、計測データと推定データの差を残差マップとし（図５（Ｄ））、最適化パラメータを初期値メモリと最終値メモリに記憶するとともにＡＩＣの値を記憶し、ステップ２に進む。
ステップ２からステップ５をＡＩＣの値が増加するまで繰り返す。

ステップ６では、ステップ５で記憶されたピークパラメータの最終値の中で、ノイズを表すピークを除去する。この時のノイズとは、例えば初期位置ｐがゼロから大きく外れるものなどであり、ノイズと判別するための条件をプログラムしておく。
ノイズピークを除去した残りのピークにより（１）式を用いて、泳動停止時の泳動データを推定し表示する。図６には、泳動停止時の推定データを真値とともに表示した結果を示す。横軸はセンサーの位置であり、分離流路上の位置に対応している。縦軸は吸光度である。推定データと真値はよく一致しており、１本の曲線として表現されている。

さらに推定結果の信頼度が必要な場合には、（６）式を用い、各推定ピークパラメータの標準偏差σ_xを計算することが可能である。

ここで、Ｑはステップ５で記憶されたピークパラメータの最終値から推定した泳動データと計測した泳動データの残差ベクトルを、σはＱの標準偏差を表す。なお、（△Ｑ）は推定パラメータによるＱの偏微分を表すヤコビアン行列で（Ｎ_ii ^-1）は行列Ｎの逆行列のｉ行ｉ列要素を表す。

ステップ２において選択しピークパラメータを初期値に追加するピークは１つに限定する必要はない。ラドンマップで値が大きな点を複数個（２〜５個程度）選択し、それらを全て初期値に追加しても実用的には問題なく、処理時間を短縮できる効果がある。

ステップ６でノイズピークを除去するかわりに、ステップ２において算出したピークパラメータからノイズピークを除去しても実用的には問題なく、処理時間を短縮できる効果がある。この場合、ピークパラメータ自体によってノイズであるか否かを判別する基準をプログラムとして保持しておく。

本発明のデータ処理方法は、キャピラリー電気泳動装置やマイクロチップ電気泳動装置など、微細な分離流路を備えた電気泳動装置に利用することができる。

マイクロチップ電気泳動装置で使用するマイクロチップを示す図であり、（Ａ）は一方の基板の平面図、（Ｂ）は他方の基板の平面図、（Ｃ）は両基板を接合してマイクロチップとして状態の正面図である。 一実施例のマイクロチップ電気泳動装置を示す概略構成図である。 ２次元泳動データを示すシミュレーションデータの図である。 データ処理方法の一実施例を示すフローチャート図である。 処理途中のデータを示す図である。 泳動停止時の推定データを真値とともに表示したグラフである。

符号の説明

１ 光源
１７ マイクロチップ
１９ フォトダイオードアレイ
２１ データ処理装置
２３ 信号変換部
２５ 記憶部
２７ 演算部
２９ 高圧電源
５５ 分離流路

Claims (8)

1. 以下のステップ（Ａ）から（Ｄ）を備えて電気泳動パターンを作成するデータ処理方法。
   （Ａ）１つの泳動路の所定の範囲を複数の試料成分が泳動により展開されていく過程を時系列に取り込んで泳動パターンの軌跡をもつ２次元データを得るステップ。
   （Ｂ）前記２次元データから軌跡をもつ泳動パターンを選び出すステップ。
   （Ｃ）選びだされた泳動パターンをモデル化して推定泳動パターンを作成するステップ。
   （Ｄ）軌跡をもつ全ての泳動パターンについてステップ（Ｂ）と（Ｃ）を繰り返した後、前記推定泳動パターンを組み合わせて試料成分の泳動停止時の泳動パターンを再構築するステップ。
2. ステップ（Ｃ）ではモデルパターンを実際の泳動パターンと比較し、最小自乗法によりモデルパターンのパラメータを決定して推定泳動パターンを作成する請求項1に記載のデータ処理方法。
3. ステップ（Ｂ）では前記２次元データを残余マップの初期値として残余マップの中にある泳動パターンの軌跡データに対してラドン変換を施し、ラドン変換値の最大値をもつものを選び出すとともに、その選び出した泳動パターンの軌跡データを残余マップから除去する請求項1又は２に記載のデータ処理方法。
4. ステップ（Ｂ）では前記２次元データを残余マップの初期値として残余マップの中にある泳動パターンの軌跡データに対してラドン変換を施し、ラドン変換値の大きいものから順に複数個を同時に選び出すとともに、その選び出した泳動パターンの軌跡データを残余マップから除去する請求項1又は２に記載のデータ処理方法。
5. 再構築した泳動パターンからノイズパターンを除去するステップをさらに含んでいる請求項1から４のいずれかに記載のデータ処理方法。
6. ステップ（Ｃ）は選びだされた泳動パターンをモデル化する際にピークパラメータがノイズピークのパラメータになったものについては推定泳動パターンを作成しない請求項1から５のいずれかに記載のデータ処理方法。
7. 請求項1から６のいずれかに記載のデータ処理方法を実現するデータ処理装置。
8. 透明板状部材の内部に分離流路を形成してなるマイクロチップと、
   前記分離流路の両端間に流動電圧を印加する泳動電源部と、
   前記分離流路の所定の範囲にわたって光源からの光を集光させる光照射部と、
   前記分離流路内で分離された目的成分による前記光の吸収又は発光を検出するための、分離流路に沿って複数個の光検出素子が配列されたアレイ光検出部と、
   前記アレイ光検出部の各検出素子の出力を取り込んでデータ処理するデータ処理装置とを備え、
   前記データ処理装置は各光検出素子の出力を記憶部に記憶し、その記憶部に記憶された光検出素子の出力について請求項1から６のいずれかに記載のデータ処理方法を実現するものであるマイクロチップ電気泳動装置。
   

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