JP2005027527A

JP2005027527A - Method for identifying strain of sake yeast

Info

Publication number: JP2005027527A
Application number: JP2003193908A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Shimoii; 仁下飯; Koichi Miyashita; 晃一宮下; Masashi Shimizu; 正史清水
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2003-07-08
Filing date: 2003-07-08
Publication date: 2005-02-03
Anticipated expiration: 2023-07-08
Also published as: JP3834649B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To newly develop a method (system) for identifying the strain of a sake (Japanese alcoholic drink) yeast, by which the yeast can accurately and simply be identified, judged and/or classified in a short period. <P>SOLUTION: This method for identifying the strain of the sake yeast comprises amplifying the genome DNA of the fermentation yeast with a primer for amplifying a part or all of AWA1 gene by PCR method or LCR method, subjecting the amplified gene fragments to a direct agarose gel electrophoresis and then identifying the yeast on the basis of the difference of the electrophoresis patterns. The fermentation yeast can accurately, quickly and easily be classified/identified by the method. This identification method can give the result in high repeatability in an extremely short period, is especially effective for the identification of the sake yeast, and enables not only the identification of yeast strains for an identical sake fermentation purpose, such as the sake yeast association No. 7 and No. 9 yeasts, but also the identification/judgment of yeasts for different purposes. such as a sake yeast and a wine yeast. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の同定に関するものであり、更に詳細には、醸造用酵母、特に清酒酵母のＡＷＡ１遺伝子を指標とした清酒酵母の同定、検出、判別、分類法に関するものである。本発明は、清酒酵母の同定、検出、判別、分類の少なくともひとつに有用であり、また、モニタリングを必要とする清酒醸造産業に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来酵母の同定には、培養による糖の資化性検査などの生化学的検査に主に依存してきた。これらの検査は時間がかかり、また検査項目が非常に多岐にわたり煩雑である。また、培養条件の影響などにより、検査結果は必ずしも信頼に値するものではない。
【０００３】
一方、清酒酵母としては、清酒酵母協会１〜１５号等各種菌株が知られている。
しかしながら、これらの清酒醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に分類されるものであって、同一種に属し、同じ清酒醸造に使用されるため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間に且つ正確にそれぞれ区別することはきわめて困難である。
【０００４】
上述した生化学的検査では、清酒酵母の菌株を同定することは不可能であって、したがって、現在のところ、酵母を小仕込試験するなどして、その醸造特性から判別したり、薬剤や培養条件を変えることで酵母を判別したりする方法で酵母の判別を行わざるを得ないのが実情である。しかしながら、これらの同定、判別方法は、酵母を実際に培養したり、実際に仕込みを行ってその醸造特性を確認したりする必要があるため、判別に相当の時間を要したり熟練を要したりすることは不可避であり、当業界においてその改善が求められている。
【０００５】
わずかに、清酒酵母協会７号は、高温でパントテン酸を要求することが知られているが（例えば、非特許文献１参照）、この方法は清酒酵母協会７号のみにしか応用することができず、きわめて限定された菌株同定方法であって、汎用性を欠くものである。また、培養後の菌体を染色して清酒酵母の菌株を同定する方法も提唱されているが（例えば、非特許文献２参照）、染色後の色調で判断するために、検査結果には個人差が伴い、信頼性のある結果を得るには熟練が必要である。近年では従来の菌株同定の欠点を補うものとしてゲノムＤＮＡの多型を検出する方法が使用されるようになってきたが、清酒酵母間は類縁性が高いため同定が困難であることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、現時点においては、遺伝子、特にＡＷＡ１遺伝子に着目した同定に成功した例は未だ報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】
菅間誠之助ほか４名、「日本醸造協会誌」、６０巻、ｐ．４５３〜４５６、１９６５年
【０００７】
【非特許文献２】
村上英也ほか４名、「日本醸造協会誌」、７７巻、ｐ．１８１〜１８４、１９８２年
【０００８】
【非特許文献３】
Ｍ．Ａｚｕｍｉｅｔａｌ．，「Ｙｅａｓｔ」、Ｖｏｌ．１８、ｐ．１１４５〜１１５４、２００１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
清酒の醸造において清酒酵母は、アルコール発酵を行うのみならず、様々な香味成分を生成する。清酒酵母の菌株によって生成される清酒の品質に特徴があるので、清酒酵母の菌株を分類・同定することは適切な醸造管理を行う上で欠かせない技術である。このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来より重要な課題である。本発明は、このような技術の現状に鑑み、例えば清酒酵母協会６号、７号、９号、１０号といった清酒醸造という同一用途の酵母間において、それを短期間で正確且つ簡易に同定、判別及び／又は分類できるシステムを新たに開発する目的でなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために各方面から検討の結果、先の報告（非特許文献３）のように清酒酵母の同定には不適とされて研究対象から外されている観もあったゲノムＤＮＡにあえて着目し、ＰＣＲなどの遺伝子増幅法は、適切なプライマーを開発することができれば、菌株の同定に有効であるとの観点にたち、清酒酵母の菌株間で多型を示す遺伝子増幅産物を得るようなプライマーを新たに設定し、清酒酵母の同定及び検出を可能にする手段を新たに提供することとした。
【００１１】
しかしながら、一般に、同種の菌株間ではゲノムの多型が少なく、適切なプライマーを設定することは容易なことではなく、きわめて困難である。ましてや、例えば清酒酵母協会６号、同７号、同９号、同１０号等といった清酒醸造という同一用途に用いる酵母菌株間ではゲノムの多型が更に少なく、困難性は更に倍加している。換言すれば、清酒酵母に属する各酵母菌株間での同定、つまり、同一用途間での同定は容易なことではなく、困難を極める。
【００１２】
このようにきわめて困難な技術の現状において、本発明者らは、清酒酵母協会７号から酵母細胞に高泡形成能及び細胞表層の疎水性を与える遺伝子ＡＷＡ１を取得した（Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｏｋｕｄａ，Ｒ．Ａｔｔｈｉ，Ｋ．ＩｗａｓｈｉｔａａｎｄＫ．Ｉｔｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，１９３２−１９７３，２００２）。本遺伝子について研究を行っている過程で、本遺伝子は実験室酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ株：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（株）より購入）の相同遺伝子ＹＯＬ１５５ＣとＯＲＦの大きさが異なることを見出した。さらに研究を進めた結果、ＡＷＡ１遺伝子には清酒酵母菌株間にも遺伝子の大きさに多様性が存在し、これを利用することで清酒酵母菌株間の分類・同定が可能であることがわかった。以上の知見に基づき本発明は完成されたものである。
【００１３】
即ち、本発明は、ＡＷＡ１遺伝子とホモロジーを持ち実質的なプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドを、少なくとも一方のＰＣＲプライマーとして清酒酵母のＤＮＡを増幅し、増幅断片長に基づき清酒酵母の同定を行うことを特徴とする清酒酵母の同定法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、清酒酵母のＡＷＡ１遺伝子の全部又は一部をＰＣＲなどの遺伝子増幅法により特異的に増幅し、その増幅断片の大きさ（長さ）及び／又は数に基づき、清酒酵母の同定、検出、判定、分類の少なくともひとつを行うものである。ＡＷＡ１遺伝子は、上記したように、本発明者らによって既に明らかにされているが、その塩基配列を配列番号１に示し（図１〜図９の上段）、それに対応するアミノ酸配列を配列番号２（図１〜図９の下段）に示す。
【００１５】
プライマーとしては、ＡＷＡ１遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と相同性を有し実質的なプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドであればすべてのものが使用可能である。好適なプライマーとしては、その塩基配列を、それぞれ、配列番号３（図１０）、及び、配列番号（図１１）に示すプライマーＳ１、及び、プライマーＳ２が例示される。
【００１６】
本発明にしたがって清酒酵母の分類・同定を行うには、例えば次の工程を実施すればよい。
先ずはじめに、清酒酵母を含むサンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＷＡ１遺伝子の一部と相同性を持つプライマーを用いてＡＷＡ１遺伝子の全部又は一部を既知の遺伝子増幅法によって増幅する。増幅されたヌクレオチド配列の長さの比較測定は電気泳動ゲル上でのそれらの移動度の分析（既知の分子量マーカーと比較することによる）によって行うことができる。遺伝子増幅法はＰＣＲ（米国特許４９６５１８８）、ＬＣＲ（Ｌａｎｄｇｒｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４１、ｐｐ．１０７７−１０８０（１９８８））などを用いることが可能である。場合によっては、遺伝子増幅産物の塩基配列を相互に比較することも可能である。
【００１７】
このように、本発明によれば、酵母のゲノムＤＮＡをＡＷＡ１遺伝子の全部又は一部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動することで、その泳動パターンを観察すればよいので、作業が容易かつシンプルである。また、特定の遺伝子（この場合、ＡＷＡ１遺伝子の一部又は全部）を増幅させるプライマーを用いることで、ＰＣＲ法での増幅が得られるＤＮＡ断片の種類も安定している点など、優れた点が多い。
【００１８】
すなわち、このようにして増幅して得た遺伝子断片は、これを直接アガロースゲル電気泳動して、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また、所望するのであれば、ＰＣＲにて増幅された遺伝子断片を制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で切断し、これを電気泳動してその泳動パターンを観察することによっても、酵母の判別を簡便且つ明確に行うことができる。
【００１９】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつについて、その種類を変えることによって、各種の清酒醸造用酵母の判別、同定が可能となり、あるいは逆に、特定の清酒醸造用酵母を判別、同定するためには、プライマー等を選別すればよく、目的の酵母に適合した各種設計が可能である。
【００２０】
このようにして本発明によれば、清酒醸造用酵母の判別、同定、分類の少なくともひとつが可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。したがって、例えばプライマーＳ１及びＳ２を用いて、あるいは、これらのプライマーのＰＣＲ産物を用いて、例えば、特に清酒酵母協会７号といった特定の酵母の同定、分類、判別用キットを組むことができる。
【００２１】
以上、清酒酵母の同定・分類について述べたが、本発明においては、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母が使用可能である。例えば、本発明は、清酒酵母（清酒酵母協会１号〜１５号酵母等）の実用酵母に適用できるほか、ワイン酵母（協会ブドウ酒１号酵母、協会ブドウ酒３号酵母、協会ブドウ酒４号酵母等）、焼酎酵母（鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号等）にも適用できる。
【００２２】
なお、本発明を清酒酵母菌株での同定を例にとって説明したが、本発明は、清酒酵母とワイン酵母の判別、ワイン酵母と焼酎酵母の判別といった異なった用途の酵母間の判別が可能であるだけでなく、清酒酵母の場合と同様に、同じワイン酵母であって、協会ブドウ酒１号酵母と同３号酵母、同３号酵母と同４号酵母の判別といった同一用途の酵母間の判別も可能であるという著効も奏するものである。特に後者については、判別自体が困難であって非常にデリケートな要件が必要とされ、従来、簡便にして正確な方法で満足できる方法は報告されていなかったのである。
【００２３】
以下に、本発明の実施例について述べる。
【００２４】
【実施例１】
配列番号３（図１０）及び配列番号４（図１１）に記載の塩基配列により表されるオリゴヌクレオチドをプライマーＳ１及びＳ２とし、ＡＷＡ１遺伝子を含むプラスミド、実験室酵母Ｘ２１８０（ＡＴＣＣ２６１０９）、清酒酵母協会７号（日本醸造協会）、清酒酵母協会７０１号（日本醸造協会）、清酒酵母協会９号（日本醸造協会）、清酒酵母協会９０１号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１００１号（日本醸造協会）由来のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、図１２に示すような結果が得られ、増幅されたＤＮＡ断片の大きさから各清酒酵母を同定することが可能であつた。
【００２５】
ＰＣＲ増幅条件：９４℃１分、６０℃１分、７２℃５分、３０サイクル、プライマー濃度各１μＭ、ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ＜１μｇ／１００μＬＰｒｅｍｉｘＴａｑＥｘＴａｑＶｅｒｓｉｏｎ添付のＰＣＲＢｕｆｆｅｒ及びデオキシリボヌクレオチドを使用（タカラバイオ）。
【００２６】
図中、各レーンは、それぞれ次のことを示す。
番号試料断片長（塩基）
１マーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）
２配列番号１を含むプラスミド５１４２
３実験室酵母Ｘ２１８０（ＡＴＣＣ２６１０９）３０００
４清酒酵母協会７号（日本醸造協会）６５００
５清酒酵母協会７０１号（日本醸造協会）６３００
６清酒酵母協会９号（日本醸造協会）４０００
７清酒酵母協会９０１号（日本醸造協会）４０００
８清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）５５００
９清酒酵母協会１００１号（日本醸造協会）５０００
１０マーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）
【００２７】
【実施例２】
配列番号３（図１０）及び配列番号４（図１１）に記載の塩基配列により表されるオリゴヌクレオチドをプライマーＳ１及びＳ２とし、清酒酵母協会１号（ＩＦＯ２１６４）、清酒酵母協会２号（ＩＦＯ２３４２）、清酒酵母協会３号（ＩＦＯ２３４３）、清酒酵母協会４号（ＩＦＯ２３４４）、清酒酵母協会５号（ＩＦＯ２３４５）、清酒酵母協会６号（日本醸造協会）、清酒酵母協会７号（日本醸造協会）、清酒酵母協会８号（ＩＦＯ２３７６）、清酒酵母協会９号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１１号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１２号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１３号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１４号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１５号（日本醸造協会）から由来のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、図１３に示すような結果が得られ、増幅されたＤＮＡ断片の大きさから各清酒酵母を分類・同定することが可能であった。
【００２８】
ＰＣＲ増幅条件：９４℃１分、６０℃１分、７２℃５分、３０サイクル、プライマー濃度各１μＭ、ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ＜１μｇ／１００μＬＰｒｅｍｉｘＴａｑＥｘＴａｑＶｅｒｓｉｏｎ添付のＰＣＲＢｕｆｆｅｒ及びデオキシリボヌクレオチドを使用（タカラバイオ）。
【００２９】
図中、各レーンは、それぞれ次のことを示す。
番号試料
１マーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）
２清酒酵母協会１号（ＩＦＯ２１６４）
３清酒酵母協会２号（ＩＦＯ２３４２）
４清酒酵母協会３号（ＩＦＯ２３４３）
５清酒酵母協会４号（ＩＦＯ２３４４）
６清酒酵母協会５号（ＩＦＯ２３４５）
７清酒酵母協会６号（日本醸造協会）
８清酒酵母協会７号（日本醸造協会）
９清酒酵母協会８号（ＩＦＯ２３７６）
１０清酒酵母協会９号（日本醸造協会）
１１清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）
１２清酒酵母協会１１号（日本醸造協会）
１３清酒酵母協会１２号（日本醸造協会）
１４清酒酵母協会１３号（日本醸造協会）
１５清酒酵母協会１４号（日本醸造協会）
１６清酒酵母協会１５号（日本醸造協会）
１７マーカー（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）
【００３０】
【発明の効果】
本発明は、酵母の分類、同定、あるいは判別を迅速且つ高精度に行うことを可能にするのである。本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００３１】
更に本発明によれば、清酒酵母とブドウ酒酵母といった異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えば清酒酵母協会７号と９号といった同じ清酒酵母間の菌株の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【００３２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＷＡ１遺伝子の塩基配列（配列番号１）を上段に示し、それに対応するアミノ酸配列（配列番号２）を下段に示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】同上続きを示す。
【図９】同上続きを示す。
【図１０】プライマーＳ１（配列番号１の１番目から３０番目に相当）を示す。
【図１１】プライマーＳ２（配列番号１の５１１３番目から５１４２番目までの配列の相補鎖に相当）を示す。
【図１２】各種清酒酵母の同定・判別を示すＡＷＡ１遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。
【図１３】各種清酒酵母の同定・判別を示すＡＷＡ１遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to yeast identification, and more particularly to a method for identification, detection, discrimination and classification of sake yeast using the AWA1 gene of brewing yeast, particularly sake yeast. The present invention is useful for at least one of identification, detection, discrimination, and classification of sake yeast, and is useful for the sake brewing industry that requires monitoring.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, the identification of yeast has mainly relied on biochemical tests such as a sugar assimilation test by culture. These inspections take time, and the inspection items are very diverse and complicated. Also, the test results are not always reliable due to the influence of culture conditions.
[0003]
On the other hand, as sake yeast, various strains such as sake yeast associations 1 to 15 are known.
However, all of these yeasts for sake brewing are classified as Saccharomyces cerevisiae, belong to the same species, and are used for the same sake brewing. It is extremely difficult to distinguish each of these yeasts in a short time and accurately.
[0004]
In the biochemical test described above, it is impossible to identify a strain of sake yeast. Therefore, at present, it is possible to discriminate from the brewing characteristics, such as by conducting a small preparation test of yeast, and to determine the drug or culture. In fact, it is necessary to discriminate yeast by a method of discriminating yeast by changing conditions. However, these identification and discrimination methods require a considerable amount of time or skill to discriminate because it is necessary to actually cultivate yeast or to check the brewing characteristics by actually preparing the yeast. Is unavoidable and there is a need for improvement in the industry.
[0005]
Sake Yeast Association No. 7 is known to require pantothenic acid at high temperatures (see, for example, Non-Patent Document 1), but this method can be applied only to Sake Yeast Association No. 7. It is a very limited strain identification method and lacks versatility. In addition, a method for identifying strains of sake yeast by staining cells after culturing has also been proposed (see, for example, Non-Patent Document 2). There are differences, and skill is required to obtain reliable results. In recent years, methods to detect genomic DNA polymorphisms have been used to compensate for the drawbacks of conventional strain identification, but it has been reported that identification is difficult due to the high affinity between sake yeasts. (For example, refer nonpatent literature 3). However, at present, no example has been reported that has succeeded in identification focusing on genes, particularly the AWA1 gene.
[0006]
[Non-Patent Document 1]
Seinosuke Sakuma and 4 others, “Japan Brewing Association Magazine”, Volume 60, p. 453-456, 1965 [0007]
[Non-Patent Document 2]
Hideya Murakami and four others, “Japan Brewing Association Magazine”, vol. 77, p. 181 to 184, 1982 [0008]
[Non-Patent Document 3]
M.M. Azumi et al. , “Yeast”, Vol. 18, p. 1145 to 1154, 2001
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
In sake brewing, sake yeast not only performs alcoholic fermentation but also produces various flavor components. Since the quality of sake produced by sake yeast strains is characteristic, classification and identification of sake yeast strains is an indispensable technique for appropriate brewing management. Thus, establishment of an accurate and simple yeast discrimination system in a short period of time has been an important issue in the field of actual liquor production and also in test and research institutions. In view of the present state of the art, the present invention, for example, between sake yeast brewers such as Sake Yeast Association No. 6, No. 7, No. 9, No. 10, and the like, for accurate and simple identification in a short period of time, It was made for the purpose of newly developing a system capable of discrimination and / or classification.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of examinations from various directions in order to achieve the above object, the present inventors have found that they are not suitable for the identification of sake yeast as described in the previous report (Non-Patent Document 3) and are excluded from the research subjects. Focusing on the existing genomic DNA, gene amplification methods such as PCR are effective for identifying strains if appropriate primers can be developed. It was decided to newly provide a means for enabling identification and detection of sake yeast by newly setting a primer for obtaining the gene amplification product shown.
[0011]
However, in general, there are few genome polymorphisms among strains of the same species, and setting appropriate primers is not easy and extremely difficult. Furthermore, for example, there are fewer genome polymorphisms among yeast strains used for the same purpose of sake brewing, such as Sake Yeast Association No. 6, No. 7, No. 9, No. 10, etc., and the difficulty is further doubled. In other words, identification between each yeast strain belonging to sake yeast, that is, identification between the same uses is not easy, but is extremely difficult.
[0012]
In this extremely difficult state of the art, the present inventors have obtained a gene AWA1 that gives yeast cells high foam-forming ability and hydrophobicity of the cell surface layer from Sake Yeast Association No. 7 (H. Shimoi, K. et al.). Sakamoto, M. Okuda, R. Atthi, K. Iwashita and K. Ito, Appl. Environ, Microbiol., 68, 1932-1973, 2002). In the course of studying this gene, it was found that the size of the ORF differs from that of the homologous gene YOL155C of laboratory yeast (Saccharomyces cerevisiae S288C strain: purchased from Invitrogen Corp.). As a result of further research, it was found that the AWA1 gene has diversity in the size of sake yeast strains, and by using this, it is possible to classify and identify between sake yeast strains. . The present invention has been completed based on the above findings.
[0013]
That is, the present invention amplifies sake yeast DNA using at least one PCR primer with an oligonucleotide having homology with the AWA1 gene and having a substantial primer function, and identifies sake yeast based on the amplified fragment length. It is the identification method of sake yeast characterized by this.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The present invention specifically amplifies all or part of the AWA1 gene of sake yeast by a gene amplification method such as PCR, and based on the size (length) and / or number of the amplified fragment, At least one of detection, determination, and classification is performed. As described above, the AWA1 gene has already been clarified by the present inventors. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (the upper part of FIGS. 1 to 9), and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. (The lower part of FIGS. 1 to 9).
[0015]
Any primer can be used as long as it is an oligonucleotide having homology with at least a part of the nucleotide sequence of the AWA1 gene and having a substantial primer function. Examples of suitable primers include primer S1 and primer S2 whose base sequences are shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 10) and SEQ ID NO: (FIG. 11), respectively.
[0016]
In order to classify and identify sake yeast according to the present invention, for example, the following steps may be performed.
First, genomic DNA is extracted from a sample containing sake yeast, and all or part of the AWA1 gene is amplified by a known gene amplification method using a primer having homology with a part of the AWA1 gene. Comparative measurements of the length of the amplified nucleotide sequences can be made by analysis of their mobility on an electrophoresis gel (by comparison with known molecular weight markers). As the gene amplification method, PCR (US Pat. No. 4,965,188), LCR (Landgren et al., Sciences, 241, pp. 1077-1080 (1988)) and the like can be used. In some cases, the base sequences of gene amplification products can be compared with each other.
[0017]
Thus, according to the present invention, yeast genomic DNA is amplified by PCR using primers that amplify all or part of the AWA1 gene, and the amplified gene fragments are directly subjected to agarose gel electrophoresis. Therefore, since the migration pattern has only to be observed, the operation is easy and simple. In addition, by using a primer that amplifies a specific gene (in this case, a part or all of the AWA1 gene), the DNA fragment that can be amplified by the PCR method is stable, and so on. Many.
[0018]
That is, the gene fragment obtained by amplification in this way can be distinguished from yeast by directly agarose gel electrophoresis and observing the migration pattern. By selecting the type and combination of primers, a clear migration pattern unique to yeast can be obtained. If desired, yeast can be easily and easily discriminated by cleaving a gene fragment amplified by PCR with a restriction enzyme (for example, EcoRI), electrophoresing it, and observing the migration pattern. Can be done clearly.
[0019]
Therefore, according to the present invention, it is possible to discriminate and identify various sake brewing yeasts by changing the kind of at least one of the primer, the genomic DNA used as a template, the amplified DNA fragment, and the restriction enzyme digest. On the contrary, in order to discriminate and identify a specific sake brewing yeast, a primer or the like may be selected, and various designs suitable for the target yeast are possible.
[0020]
In this way, according to the present invention, at least one of sake brewing yeast can be identified, identified, and classified, and therefore, a kit for identifying, identifying, and classifying yeast is assembled using at least one of the above-described primers and the like. be able to. Therefore, for example, using the primers S1 and S2 or using the PCR products of these primers, a kit for identifying, classifying, and discriminating a specific yeast such as, for example, the Sake Yeast Association No. 7 can be assembled.
[0021]
The identification and classification of sake yeast has been described above. In the present invention, any yeast can be used as long as it belongs to the genus Saccharomyces cerevisiae. For example, the present invention can be applied to practical yeasts such as sake yeast (Sake Yeast Association Nos. 1 to 15 yeast, etc.), wine yeast (Association Wine No. 1 yeast, Association Wine No. 3 yeast, Association wine No. 4). Yeast), shochu yeast (Kagoshima yeast K2, Miyazaki yeast MK, association shochu yeast SH-4, Awamori yeast No. 1, etc.).
[0022]
Although the present invention has been described by taking the identification with sake yeast strains as an example, the present invention can distinguish between yeasts of different uses such as discrimination between sake yeast and wine yeast, discrimination between wine yeast and shochu yeast. As well as the sake yeast, it is the same wine yeast that distinguishes between the yeasts of the same use, such as discriminating between the association wine No. 1 and No. 3 yeast, the No. 3 yeast and the No. 4 yeast. It also has a remarkable effect that it is possible. In particular, for the latter, discrimination itself is difficult, and very sensitive requirements are required. Conventionally, no method that can be satisfied with a simple and accurate method has been reported.
[0023]
Examples of the present invention will be described below.
[0024]
[Example 1]
Oligonucleotides represented by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 10) and SEQ ID NO: 4 (FIG. 11) are used as primers S1 and S2, a plasmid containing the AWA1 gene, laboratory yeast X2180 (ATCC 26109), sake yeast association 7 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association 701 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association 9 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association 901 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association 10 (Japan Brewing Association) ), PCR was performed using DNA from the Sake Yeast Association No. 1001 (Japan Brewing Association) as a template. As a result, the results as shown in FIG. 12 were obtained, and it was possible to identify each sake yeast from the size of the amplified DNA fragment.
[0025]
PCR amplification conditions: 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 5 minutes, 30 cycles, primer concentration of 1 μM each, Template DNA <1 μg / 100 μL Premix Taq Ex Taq Version attached PCR Buffer and deoxyribonucleotide used (Takara Bio) ).
[0026]
In the figure, each lane indicates the following.
Number Sample Fragment length (base)
1 Marker (λ / Hind III, φX174 / Hae III)
2 Plasmid 5142 containing SEQ ID NO: 1
3 Laboratory Yeast X2180 (ATCC 26109) 3000
4 Sake Yeast Association No. 7 (Japan Brewing Association) 6500
5 Sake Yeast Association No. 701 (Japan Brewing Association) 6300
6 Sake Yeast Association No. 9 (Japan Brewing Association) 4000
7 Sake Yeast Association 901 (Japan Brewing Association) 4000
8 Sake Yeast Association No. 10 (Japan Brewing Association) 5500
9 Sake Yeast Association No. 1001 (Japan Brewing Association) 5000
10 Marker (λ / Hind III, φX174 / Hae III)
[0027]
[Example 2]
Oligonucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 (FIG. 10) and SEQ ID NO: 4 (FIG. 11) are used as primers S1 and S2, and Sake Yeast Association No. 1 (IFO 2164), Sake Yeast Association No. 2 (IFO 2342), Sake Yeast Association No. 3 (IFO 2343), Sake Yeast Association No. 4 (IFO 2344), Sake Yeast Association No. 5 (IFO 2345), Sake Yeast Association No. 6 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 7 ( Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 8 (IFO 2376), Sake Yeast Association No. 9 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 10 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 11 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Derived from Association No. 12 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 13 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 14 (Japan Brewing Association), Sake Yeast Association No. 15 (Japan Brewing Association) DNA PCR was performed using as a template. As a result, a result as shown in FIG. 13 was obtained, and it was possible to classify and identify each sake yeast from the size of the amplified DNA fragment.
[0028]
PCR amplification conditions: 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 5 minutes, 30 cycles, primer concentration of 1 μM each, Template DNA <1 μg / 100 μL Premix Taq Ex Taq Version attached PCR Buffer and deoxyribonucleotide used (Takara Bio) ).
[0029]
In the figure, each lane indicates the following.
Number Sample 1 Marker (λ / Hind III, φX174 / HaeIII)
2 Sake Yeast Association No.1 (IFO 2164)
3 Sake Yeast Association No. 2 (IFO 2342)
4 Sake Yeast Association No. 3 (IFO 2343)
5 Sake Yeast Association No. 4 (IFO 2344)
6 Sake Yeast Association No.5 (IFO 2345)
7 Sake Yeast Association No. 6 (Japan Brewing Association)
8 Sake Yeast Association No. 7 (Japan Brewing Association)
9 Sake Yeast Association No.8 (IFO 2376)
10 Sake Yeast Association No. 9 (Japan Brewing Association)
11 Sake Yeast Association No. 10 (Japan Brewing Association)
12 Sake Yeast Association No. 11 (Japan Brewing Association)
13 Sake Yeast Association No. 12 (Japan Brewing Association)
14 Sake Yeast Association No. 13 (Japan Brewing Association)
15 Sake Yeast Association No. 14 (Japan Brewing Association)
16 Sake Yeast Association No. 15 (Japan Brewing Association)
17 Marker (λ / Hind III, φX174 / Hae III)
[0030]
【The invention's effect】
The present invention makes it possible to classify, identify, or discriminate yeasts quickly and with high accuracy. According to the present invention, compared to conventional methods such as small preparation test, determination by changing drugs and culture conditions, etc., there is a remarkable effect that it can be determined in a short time, and it can be clearly distinguished and stable. Results are obtained, have reproducibility, and can be easily operated.
[0031]
Furthermore, according to the present invention, discrimination between different brewing yeasts, such as sake yeast and wine yeast, as well as discrimination between the same very difficult and delicate brewing yeasts, for example, Sake Yeast Association Nos. 7 and 9 It is also possible to discriminate strains between the same sake yeast, and the present invention makes it possible to easily and accurately classify, identify and discriminate yeasts in a short period of time in the liquor manufacturing industry, test research institutes, etc. It is also possible to clearly distinguish the yeast in the mash from the wild yeast.
[0032]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the base sequence of the AWA1 gene (SEQ ID NO: 1) at the top, and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) at the bottom.
FIG. 2 shows the continuation of the above.
FIG. 3 shows the continuation of the above.
FIG. 4 shows the continuation of the above.
FIG. 5 shows the continuation of the above.
FIG. 6 shows the continuation of the above.
FIG. 7 shows the continuation of the above.
FIG. 8 shows the continuation of the above.
FIG. 9 shows the continuation of the above.
FIG. 10 shows primer S1 (corresponding to the first to 30th positions of SEQ ID NO: 1).
FIG. 11 shows primer S2 (corresponding to the complementary strand of the sequence from 5113 to 5142 of SEQ ID NO: 1).
FIG. 12 is a photograph of an electrophoresis pattern of a PCR amplification product of AWA1 gene showing identification and discrimination of various sake yeasts (drawing substitute photograph).
FIG. 13 is a photograph of an electrophoresis pattern of a PCR amplification product of AWA1 gene showing identification and discrimination of various sake yeasts (drawing substitute photograph).

Claims

Sake yeast DNA is amplified using an oligonucleotide having a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of AWA1 gene shown in SEQ ID NO: 1 as a primer, and sake yeast is identified based on the size of the amplified fragment. Identification method of sake yeast.

Sake yeast DNA is amplified using primers S1 and S2 represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as primers, and the sake yeast is identified based on the size of the amplified fragment. Item 2. The identification method according to Item 1.

The identification method according to claim 1 or 2, wherein the amplification is performed by a PCR method or an LCR method.

The amplified gene fragment is directly subjected to agarose electrophoresis, and yeast is identified by a difference in the electrophoresis pattern or by comparing its base sequence. 2. The identification method according to item 1.

A DNA for sake yeast identification primer S1 represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

A DNA for sake yeast identification primer S2 represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

A sake yeast identification kit comprising the primer DNA according to any one of claims 5 to 6, or a PCR method or LCR amplification product using the primer.