JP2005013055A - う蝕細菌の検出方法及び該方法に使用されるプライマーセット - Google Patents
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Abstract
【課題】う触細菌であるS.mutans及びS.sobrinusの各々を簡便且つ迅速に、しかも高い精度で検出したい。
【解決手段】被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、特定な塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程により、口腔内のStreptococcus.mutansを検出する。
【選択図】図１
【解決手段】被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、特定な塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程により、口腔内のStreptococcus.mutansを検出する。
【選択図】図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、う蝕細菌の検出方法、該方法に使用されるプライマーセット及び該プライマーセットを含むう触細菌の検出のためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
う触の原因となる細菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ （Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ （Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）が知られている。う蝕の初期の段階において、患者の口腔内のこれらの細菌を検出し、う触リスクの判定を行うことにより、う蝕の予防計画の立案及び患者への指導に役立てることが考えられている。また、う蝕の治療のための情報として利用することも考えられている。
現在のところ、これらの細菌の検出は主に培養法により行われている。
また、ＰＣＲ法による検出も開発されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、培養法は、培養に数日かかるという欠点がある。
また、ＰＣＲ法は、高価な機材を必要とし、しかも判定までに数時間を要するため、臨床の現場で使用するための方法としては現実的でない。また、公衆において同様のう触リスク判定を行ったり、疫学調査等を行う際、安価で滅菌などの操作の必要のないつまようじ等にて口腔内の試料を採取することが望まれているが、このように採取した試料ではＰＣＲ反応がうまくいかない。
【０００４】
本発明者らは、近年開発されたＬｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８， ｅ６３ （２０００）； Ｙａｓｕｙｏｓｈｉ Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２８９， １５０−１５４ （２００１）； Ｋ． Ｎａｇａｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （２００２） １６， ２２３−２２９）を応用し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡの特定部位を増幅することにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの各々を簡便且つ迅速に検出する方法を見出した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
（１）本発明は、被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、各々配列表の配列番号１，２，３，４及び５記載の配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程を含む口腔内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出方法に関する。
【０００６】
（２）また、本発明は、被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、各々配列表の配列番号６，７，８、９、１０及び１１記載の配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定の反応温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程を含む口腔内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出方法に関する。
【０００７】
（３）さらに、本発明は、上記（１）または（２）の方法において、前記ＤＮＡ試料を調製する工程を、口腔からの採取物を溶菌液で処理した後、８０℃〜沸騰温度で１〜３０分間加熱した後、遠心分離し、その上清を採取することにより行うことを特徴とする方法に関する。
（４）さらに、本発明は、上記（１）〜（３）の方法において、前記標的ＤＮＡを増幅する工程において反応温度が６５℃の単一温度であることを特徴とする方法に関する。
【０００８】
（５）さらに、本発明は、各々配列表の配列番号１〜５に記載の配列を有するプライマーからなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのプライマーセットに関する。
（６）さらに、本発明は、各々配列表の配列番号６〜１１に記載の配列を有するプライマーからなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのプライマーセットに関する。
（７）さらに、本発明は、（５）のプライマーセットを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのキットに関する。
（８）さらに、本発明は、（６）のプライマーセットを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのキットに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）を利用して、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓを検出する方法に関するものである。
ＬＡＭＰ法は、図１に示すように、標的のＤＮＡ配列に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの三つの領域を定め、５’末端側からＢ１，Ｂ２，Ｂ３の三つの領域を定め、これらに対してＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ及びＢ３の４種類のプライマーを設計し、所望によりさらにＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＢ及び／またはＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＦを設計し、これらを用いてＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を検出する方法である。ＦＩＰプライマーはＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側に有し、Ｆ１ｃ領域と同じ配列を５’末端側に有する。Ｆ３プライマーは、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域を有する。ＢＩＰプライマーは、標的遺伝子のＢ２ｃ領域と相補的な領域を３’末端側に有し、Ｂ１ｃと同じ配列を５’末端側に有する。Ｂ３プライマーはＢ３ｃ領域と相補的な配列を有する。ＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を有し、ＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を有する。
【００１０】
これらのプライマーにより、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素及びｄＮＴＰの存在下、６０〜６５℃の温度で反応させると、同一鎖上に相補的な配列が繰り返す構造を有する増幅産物ができる。この方法は、ＰＣＲ法に比べ、一定温度で反応させればよい、短時間で増幅可能である等の点で優れている。
本発明の方法において、被験者の口腔からの採取物は、例えば、唾液、歯垢等である。
【００１１】
唾液は、パラフィン等を噛ませた後に採取したものでよい。
歯垢は例えば探針または爪楊枝を用いて採取したものである。
ＤＮＡ試料の調製は、例えば被験者の口腔からの採取物に、１０〜１００μｌの溶菌液を添加し、混和した後、８０℃〜沸騰温度、好ましくは沸騰温度で１〜３０分間、好ましくは５〜１５分間加熱し、遠心分離した上清を採取することにより行うことができる。
【００１２】
本発明の方法において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出の場合は、標的ＤＮＡ、即ちＳ．ｍｕｔａｎｓのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｔｆＢ，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ１７３６，配列表の配列番号１２に記載）の配列の一部（塩基番号２２５５−２３２５）を増幅する。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出の場合は、標的ＤＮＡ、即ちＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｔｆＩ，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ９０２１３，配列表の配列番号１３に記載）の配列の一部（塩基番号２３１１−２３８２）を増幅する。
【００１３】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのプライマーセット（プライマーセットＡ）は、下記のプライマーからなり、常法により合成することができる。
ＳｍｕＦ３：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧ−３’（配列表の配列番号１）
ＳｍｕＢ３：５’−ＡＡＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣ−３’（配列表の配列番号２）
ＳｍｕＦＩＰ：５’−ＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＣ−３’（配列表の配列番号３）
ＳｍｕＢＩＰ：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号４）
ＳｍｕＬＢ：５’−ＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＣＡＡ−３’（配列表の配列番号５）
Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのプライマーセット（プライマーセットＢ）は、下記のプライマーからなり、常法により合成することができる。
ＳｓｏｂＦ３：５’−ＡＧＡＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＧ−３’（配列表の配列番号６）
ＳｓｏｂＢ３：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡ−３’（配列表の配列番号７）
ＳｓｏｂＦＩＰ：５’−ＣＣＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣ−３’（配列表の配列番号８）
ＳｓｏｂＢＩＰ：５’−ＴＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＧＧＴＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴ−３’（配列表の配列番号９）
ＳｓｏｂＬＦ：５’−ＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列表の配列番号１０）
ＳｓｏｂＬＢ：５’−ＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＡ−３’（配列表の配列番号１１）
本発明の方法において、「検出」の語は、定量的検出及び定性的検出の両方を意味する。
【００１４】
増幅のためのプライマーとの反応は、例えば上記ＤＮＡ試料１〜２μｌ、プライマー（Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためには配列番号１〜５の配列を有するプライマー、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためには配列番号６〜１１の配列を有するプライマー、好ましくはＦ３，Ｂ３については０．１〜０．５μＭ、ＦＩＰ，ＢＩＰについては１．０〜２．０μＭ、ＦＬＰ，ＢＬＰについては０．５〜１．０μＭ）、ｄＮＴＰ各１〜２μＭ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ５〜３２Ｕを反応緩衝液中に最終容量が２５μｌとなるように混合し、好ましくは６５℃で、好ましくは１０〜４０分間、より好ましくは１５〜３０分間保温することにより行われる。
【００１５】
増幅されたＤＮＡの検出は、例えば、ＤＮＡの増幅の副産物として生じるピロリン酸マグネシウムによる白濁の程度を測定することにより行うことができる。なお、白濁の程度または有無の判定は目視により行うこともできる。また、増幅産物の検出は、電気泳動により行うこともできる。さらに、増幅を蛍光インターカレーターの存在下で行い、蛍光強度を測定することにより行うこともできる。
【００１６】
判定はう触細菌の数が、１０６個未満であるか、または１０６個以上であるかで行う。１０６個以上である場合には口腔内がう蝕になりやすい環境にあると判定される。この場合、患者にう触になりやすいことを認識してもらい、患者口腔内清掃意識の向上をねらったり、う触予防処置を施すことにより、う蝕を予防することができる。また、将来的には検出された細菌を特異的に抑制する予防処置も考えられている。
【００１７】
本発明の方法は、さらに、上記う蝕細菌の検出結果に基づき、被験者の口腔内のう蝕の状態を判定する工程を含むこともできる。
本発明は、上記プライマーセットＡまたはＢを含むキットに関する。本発明のキットは、さらに鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。
本発明のキットは、例えば、口腔内のう触細菌による汚染状況の判定、う触リスクの診断、さらに予防処置法の選択の判断基準のためのものである。
【００１８】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明はこれに限定されることはない。
実施例１ 爪楊枝にて採取した歯垢中のＳ．ｍｕｔａｎｓ菌の検出
爪楊枝によりヒトの歯垢を採取し、これを２００μｌの溶菌液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ８）に入れ、激しく混和し、１０分間煮沸した後、遠心分離し、その上清を試料とした。
【００１９】
前述のプライマー、ＳｍｕＦ３（配列番号１）、ＳｍｕＢ３（配列番号２）、ＳｍｕＦＩＰ（配列番号３）、ＳｍｕＢＩＰ（配列番号４）、ＳｍｕＬＢ（配列番号５）は、北海道システムサイエンス社のカスタムオリゴＤＮＡサービスにより合成したものを使用した（プライマーセットＡ）。
上記で調製した試料溶液２μｌ、プライマーＳｍｕＦ３０．２μＭ、プライマーＳｍｕＢ３ ０．２μＭ、プライマーＳｍｕＦＩＰ１．６μＭ、プライマーＳｍｕＢＩＰ１．６μＭ及びプライマーＳｍｕＬＰ０．８μＭ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）８Ｕｎｉｔ及び２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）（和光純薬）、１０ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬）、８ｍＭのＭｇＳＯ４（和光純薬）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬）０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬）含有するＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液）、０．８Ｍのベタイン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、各１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを透明マイクロチューブ（ＡＢｇｅｎｅ製）に入れて混合し、６５℃で３０分間インキュベートすることにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｇｔｆＢ遺伝子内の標的配列（配列表の配列番号１２の２２５５〜２３２５の配列）を増幅した。
【００２０】
増幅後のマイクロチューブ内の溶液を目視したところ、白濁しており、ＤＮＡが増幅された。即ち、試料中にＳ．ｍｕｔａｎｓが存在することが確認された。
試験例 １
本発明の検出方法の感度を調べるために、各濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓの試料溶液及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの試料溶液を調製し、本発明の方法及び従来のＰＣＲ法により検出した。
【００２１】
（１）Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液の調製
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ Ｘｃ株（九州大学大学院歯学研究院口腔保健推進学講座より供与）の染色体ＤＮＡは、Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａら（１９８２）によって報告されている方法に基づいて調製した。Ｓ． ｍｕｔａｎｓは、ＴＨブロスを用いて３７℃で培養し、対数増殖期（５５０ ｎｍでの吸光度が約０．５）にある菌液１０ ｍｌに２０％グリシンを２．５ ｍｌ加えてさらに３７℃で６０分間培養した。菌体を遠沈によって回収し、ＴＥ緩衝液［１ ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ ８．０］で遠沈洗浄後、菌体を２０％グルコースを含むＴＥ緩衝液２５０μｌに浮遊させた。その菌体浮遊液に１ ｍｇ／ｍｌのムタノリシンＫ−１（Ｙｏｋｏｇａｗａら、１９７４；Ｈａｍａｄａら、１９７８）を２５ μｌ加えて６５℃で２０分間反応させた。ついで、１０ ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（和光純薬、大阪）を１００μｌ加えて４２℃で４０分間反応させた後、０．５ Ｍ ＥＤＴＡを１００μｌと１０ ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ（和光純薬）を２μｌ加えて３７℃で３０分間保温した。さらに、２０ ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．， ＵＳＡ）を５μｌ加えて３７℃で６０分間反応させた後、１０％ＳＤＳ溶液を１００μｌ加えて３７℃で３０分間保温した。こうしてＳ． ｍｕｔａｎｓを溶菌させた液に、剪断力がかからないように穏やかにフェノール・クロロホルム処理を水層がほぼ透明になるまで行い、最終的に単離した水層に等容量のイソプロパノールと１／１０容量の３ Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加えて穏やかに混和した。この処理で不溶化したＤＮＡをガラス棒で巻き取り、１．０ ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した後、室温で自然乾燥し、最後に１００ μｌのＴＥ緩衝液に溶解して染色体ＤＮＡを得た。
【００２２】
（２）Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ溶液の調製
Ｓ． ｍｕｔａｎｓの代わりに、Ｓ． ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＯＭＺ１７６株（九州大学大学院歯学研究院口腔保健推進学講座より供与）を用いること以外は、上記Ｓ． ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液の調製方法と同じ方法にてＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ 溶液を調製した。
【００２３】
（３）本発明の方法による増幅
試料として、爪楊枝抽出物の代わりに上記で調製したＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ溶液を用いること以外は、実施例１と同じ方法により、増幅を行った。なお、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためには、前述のプライマーセットＡを実施例１に示した量で用い、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためには、前述のプライマー、ＳｓｏｂＦ３（配列番号６）、ＳｓｏｂＢ３（配列番号７）、ＳｓｏｂＦＩＰ（配列番号８）、ＳｓｏｂＢＩＰ（配列番号９）、ＳｓｏｂＬＦ（配列番号１０）、ＳｓｏｂＬＢ（配列番号１１）からなるプライマーセットＢを試料溶液２μｌに対してプライマーＳｓｏｂＦ３ ０．２μＭ、プライマーＳｓｏｂＢ３ ０．２μＭ、プライマーＳｓｏｂＦＩＰ １．６μＭ、プライマーＳｓｏｂＢＩＰ １．６μＭ及びプライマーＳｓｏｂＬＦ ０．８μＭ 及びＳｓｏｂＢＦ ０．８μＭの量で用いた。
【００２４】
（４）ＰＣＲによる増幅
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、１μＭの下記のプライマー（ＧＴＦＢ−Ｆ，−Ｒ）、１ＵのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株））及び２μｌの上記のＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ溶液からなるＰＣＲ反応液を用い、９５℃で３０秒間５９℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクルのＰＣＲをでＰＣＲを行うことにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｇｔｆＢ遺伝子の一部を増幅した。
プライマーとしてＧＴＦＢ−Ｆ，ＧＴＦＢ−Ｒの代わりに下記のＧＴＦＩ−Ｆ，ＧＴＦＩ−Ｒを用いてＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのｇｔｆＩ遺伝子の一部を増幅した。
ＧＴＦＢ−Ｆ：５’−ＡＣＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＧＴＧＧＣＴＴＧＧ（配列番号１４）
ＧＴＦＢ−Ｒ：５’−ＣＡＧＴＡＴＡＡＧＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣ（配列番号１５）
ＧＴＦＩ−Ｆ：５’−ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣ（配列番号１６）
ＧＴＦＩ−Ｒ：５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡＣＴ（配列番号１７）
【００２５】
（５）検出
増幅産物を２％アガロース電気泳動にかけ（約２０分間）、比較した。結果を図２（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）及び図３（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）に示す。
図より、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡを本発明の方法で増幅した場合、ＰＣＲで増幅した場合に比べて検出感度が約１０倍となることがわかる。
また、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡを本発明の方法で増幅した場合、ＰＣＲで増幅した場合に比べて検出感度が約１００倍となることがわかる。
【００２６】
試験例２
試料として、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ染色体ＤＮＡを１ｍｌ中に１０３，１０５，１０６個相当分含む溶液を用い、増幅のための反応時間を１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間または３５分間とした以外は、実施例１と同様の方法により、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｇｔｆＢ遺伝子を増幅し、白濁の有無を目視により判定した。結果を下記の表に示す。表中、＋は白濁が観察されたことを示し、−は白濁が観察されなかったことを示す。
【００２７】
【００２８】
上表より、試料中のＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ濃度と白濁が観察される反応時間との間に相関関係があることがわかる。従って、試料溶液中のＳ．ｍｕｔａｎｓのおおよその量を白濁が生じる反応時間により知ることができる。また、唾液１ｍｌ中、Ｓ．ｍｕｔａｎｓが１０６以上である場合、う触発生の可能性が高いため、この試験例の測定条件においては、反応時間を１５分とすることにより、増幅産物の白濁の有無を目視することにより、高度にう触の生じやすい状態であるか否かを判定することができる。
【００２９】
試験例３
試料として、爪楊枝により採取した歯垢試料の代わりに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ Ｘｃ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＬＭ７、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ６２１９、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＯＭＺ１７６、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＰＭＺ６５、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＭＴ８２４５、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＨＨＴ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＨＴ９Ｒ、Ｓ．ｓａｎｇｉｕｓ ＡＴＣＣ１０５５６、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｃｈａｌｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ、Ａ． ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ Ｙ４及びＰ．ｇｌｕｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３（上記菌株は全て九州大学大学院歯学研究院口腔保険推進学講座より供与された）を用い、上記実施例１の方法により、上記プライマーセットＡを用いた増幅（結果を図４に示す）及び上記プライマーセットＢを用いた増幅（結果を図５に示す）を行った。
図より明らかなように、プライマーセットＡを用いるとＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＢを用いるとＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡが特異的に増幅される。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、う触細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの各々が簡便且つ迅速に、しかも高い精度で検出することができる。しかも増幅反応を一定温度で行うことができるため、高価な機器を必要とすることもない。これにより、臨床においてこれらのう触細菌による口腔内の汚染状況を検査することが可能となり、歯科治療において予防及び治療に役立てることが可能になる。また、ＰＣＲにて増幅の難しい爪楊枝で採取した試料においても本発明による方法では増幅が可能であり、公衆におけるう触細菌の調査や予防意識の向上にも役立てることができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に用いるＬＡＭＰ法を説明する模式図である。
【図２】本発明の方法及びＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図３】本発明の方法及びＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図４】本発明の方法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図５】本発明の方法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、う蝕細菌の検出方法、該方法に使用されるプライマーセット及び該プライマーセットを含むう触細菌の検出のためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
う触の原因となる細菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ （Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ （Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）が知られている。う蝕の初期の段階において、患者の口腔内のこれらの細菌を検出し、う触リスクの判定を行うことにより、う蝕の予防計画の立案及び患者への指導に役立てることが考えられている。また、う蝕の治療のための情報として利用することも考えられている。
現在のところ、これらの細菌の検出は主に培養法により行われている。
また、ＰＣＲ法による検出も開発されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、培養法は、培養に数日かかるという欠点がある。
また、ＰＣＲ法は、高価な機材を必要とし、しかも判定までに数時間を要するため、臨床の現場で使用するための方法としては現実的でない。また、公衆において同様のう触リスク判定を行ったり、疫学調査等を行う際、安価で滅菌などの操作の必要のないつまようじ等にて口腔内の試料を採取することが望まれているが、このように採取した試料ではＰＣＲ反応がうまくいかない。
【０００４】
本発明者らは、近年開発されたＬｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８， ｅ６３ （２０００）； Ｙａｓｕｙｏｓｈｉ Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２８９， １５０−１５４ （２００１）； Ｋ． Ｎａｇａｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （２００２） １６， ２２３−２２９）を応用し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡの特定部位を増幅することにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの各々を簡便且つ迅速に検出する方法を見出した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
（１）本発明は、被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、各々配列表の配列番号１，２，３，４及び５記載の配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程を含む口腔内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出方法に関する。
【０００６】
（２）また、本発明は、被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、各々配列表の配列番号６，７，８、９、１０及び１１記載の配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定の反応温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程を含む口腔内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出方法に関する。
【０００７】
（３）さらに、本発明は、上記（１）または（２）の方法において、前記ＤＮＡ試料を調製する工程を、口腔からの採取物を溶菌液で処理した後、８０℃〜沸騰温度で１〜３０分間加熱した後、遠心分離し、その上清を採取することにより行うことを特徴とする方法に関する。
（４）さらに、本発明は、上記（１）〜（３）の方法において、前記標的ＤＮＡを増幅する工程において反応温度が６５℃の単一温度であることを特徴とする方法に関する。
【０００８】
（５）さらに、本発明は、各々配列表の配列番号１〜５に記載の配列を有するプライマーからなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのプライマーセットに関する。
（６）さらに、本発明は、各々配列表の配列番号６〜１１に記載の配列を有するプライマーからなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのプライマーセットに関する。
（７）さらに、本発明は、（５）のプライマーセットを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのキットに関する。
（８）さらに、本発明は、（６）のプライマーセットを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのキットに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）を利用して、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓを検出する方法に関するものである。
ＬＡＭＰ法は、図１に示すように、標的のＤＮＡ配列に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの三つの領域を定め、５’末端側からＢ１，Ｂ２，Ｂ３の三つの領域を定め、これらに対してＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ及びＢ３の４種類のプライマーを設計し、所望によりさらにＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＢ及び／またはＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＦを設計し、これらを用いてＤＮＡの増幅を行い、増幅産物を検出する方法である。ＦＩＰプライマーはＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側に有し、Ｆ１ｃ領域と同じ配列を５’末端側に有する。Ｆ３プライマーは、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域を有する。ＢＩＰプライマーは、標的遺伝子のＢ２ｃ領域と相補的な領域を３’末端側に有し、Ｂ１ｃと同じ配列を５’末端側に有する。Ｂ３プライマーはＢ３ｃ領域と相補的な配列を有する。ＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を有し、ＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を有する。
【００１０】
これらのプライマーにより、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素及びｄＮＴＰの存在下、６０〜６５℃の温度で反応させると、同一鎖上に相補的な配列が繰り返す構造を有する増幅産物ができる。この方法は、ＰＣＲ法に比べ、一定温度で反応させればよい、短時間で増幅可能である等の点で優れている。
本発明の方法において、被験者の口腔からの採取物は、例えば、唾液、歯垢等である。
【００１１】
唾液は、パラフィン等を噛ませた後に採取したものでよい。
歯垢は例えば探針または爪楊枝を用いて採取したものである。
ＤＮＡ試料の調製は、例えば被験者の口腔からの採取物に、１０〜１００μｌの溶菌液を添加し、混和した後、８０℃〜沸騰温度、好ましくは沸騰温度で１〜３０分間、好ましくは５〜１５分間加熱し、遠心分離した上清を採取することにより行うことができる。
【００１２】
本発明の方法において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出の場合は、標的ＤＮＡ、即ちＳ．ｍｕｔａｎｓのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｔｆＢ，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ１７３６，配列表の配列番号１２に記載）の配列の一部（塩基番号２２５５−２３２５）を増幅する。Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出の場合は、標的ＤＮＡ、即ちＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｔｆＩ，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ９０２１３，配列表の配列番号１３に記載）の配列の一部（塩基番号２３１１−２３８２）を増幅する。
【００１３】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのプライマーセット（プライマーセットＡ）は、下記のプライマーからなり、常法により合成することができる。
ＳｍｕＦ３：５’−ＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧ−３’（配列表の配列番号１）
ＳｍｕＢ３：５’−ＡＡＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣ−３’（配列表の配列番号２）
ＳｍｕＦＩＰ：５’−ＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＣ−３’（配列表の配列番号３）
ＳｍｕＢＩＰ：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＧ−３’（配列表の配列番号４）
ＳｍｕＬＢ：５’−ＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＣＡＡ−３’（配列表の配列番号５）
Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのプライマーセット（プライマーセットＢ）は、下記のプライマーからなり、常法により合成することができる。
ＳｓｏｂＦ３：５’−ＡＧＡＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＧ−３’（配列表の配列番号６）
ＳｓｏｂＢ３：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡ−３’（配列表の配列番号７）
ＳｓｏｂＦＩＰ：５’−ＣＣＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＧＴＣＧＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣ−３’（配列表の配列番号８）
ＳｓｏｂＢＩＰ：５’−ＴＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＣＧＧＴＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴ−３’（配列表の配列番号９）
ＳｓｏｂＬＦ：５’−ＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列表の配列番号１０）
ＳｓｏｂＬＢ：５’−ＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＡ−３’（配列表の配列番号１１）
本発明の方法において、「検出」の語は、定量的検出及び定性的検出の両方を意味する。
【００１４】
増幅のためのプライマーとの反応は、例えば上記ＤＮＡ試料１〜２μｌ、プライマー（Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためには配列番号１〜５の配列を有するプライマー、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためには配列番号６〜１１の配列を有するプライマー、好ましくはＦ３，Ｂ３については０．１〜０．５μＭ、ＦＩＰ，ＢＩＰについては１．０〜２．０μＭ、ＦＬＰ，ＢＬＰについては０．５〜１．０μＭ）、ｄＮＴＰ各１〜２μＭ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ５〜３２Ｕを反応緩衝液中に最終容量が２５μｌとなるように混合し、好ましくは６５℃で、好ましくは１０〜４０分間、より好ましくは１５〜３０分間保温することにより行われる。
【００１５】
増幅されたＤＮＡの検出は、例えば、ＤＮＡの増幅の副産物として生じるピロリン酸マグネシウムによる白濁の程度を測定することにより行うことができる。なお、白濁の程度または有無の判定は目視により行うこともできる。また、増幅産物の検出は、電気泳動により行うこともできる。さらに、増幅を蛍光インターカレーターの存在下で行い、蛍光強度を測定することにより行うこともできる。
【００１６】
判定はう触細菌の数が、１０６個未満であるか、または１０６個以上であるかで行う。１０６個以上である場合には口腔内がう蝕になりやすい環境にあると判定される。この場合、患者にう触になりやすいことを認識してもらい、患者口腔内清掃意識の向上をねらったり、う触予防処置を施すことにより、う蝕を予防することができる。また、将来的には検出された細菌を特異的に抑制する予防処置も考えられている。
【００１７】
本発明の方法は、さらに、上記う蝕細菌の検出結果に基づき、被験者の口腔内のう蝕の状態を判定する工程を含むこともできる。
本発明は、上記プライマーセットＡまたはＢを含むキットに関する。本発明のキットは、さらに鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。
本発明のキットは、例えば、口腔内のう触細菌による汚染状況の判定、う触リスクの診断、さらに予防処置法の選択の判断基準のためのものである。
【００１８】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明はこれに限定されることはない。
実施例１ 爪楊枝にて採取した歯垢中のＳ．ｍｕｔａｎｓ菌の検出
爪楊枝によりヒトの歯垢を採取し、これを２００μｌの溶菌液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ８）に入れ、激しく混和し、１０分間煮沸した後、遠心分離し、その上清を試料とした。
【００１９】
前述のプライマー、ＳｍｕＦ３（配列番号１）、ＳｍｕＢ３（配列番号２）、ＳｍｕＦＩＰ（配列番号３）、ＳｍｕＢＩＰ（配列番号４）、ＳｍｕＬＢ（配列番号５）は、北海道システムサイエンス社のカスタムオリゴＤＮＡサービスにより合成したものを使用した（プライマーセットＡ）。
上記で調製した試料溶液２μｌ、プライマーＳｍｕＦ３０．２μＭ、プライマーＳｍｕＢ３ ０．２μＭ、プライマーＳｍｕＦＩＰ１．６μＭ、プライマーＳｍｕＢＩＰ１．６μＭ及びプライマーＳｍｕＬＰ０．８μＭ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）８Ｕｎｉｔ及び２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）（和光純薬）、１０ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬）、８ｍＭのＭｇＳＯ４（和光純薬）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬）０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬）含有するＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液）、０．８Ｍのベタイン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、各１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを透明マイクロチューブ（ＡＢｇｅｎｅ製）に入れて混合し、６５℃で３０分間インキュベートすることにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｇｔｆＢ遺伝子内の標的配列（配列表の配列番号１２の２２５５〜２３２５の配列）を増幅した。
【００２０】
増幅後のマイクロチューブ内の溶液を目視したところ、白濁しており、ＤＮＡが増幅された。即ち、試料中にＳ．ｍｕｔａｎｓが存在することが確認された。
試験例 １
本発明の検出方法の感度を調べるために、各濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓの試料溶液及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの試料溶液を調製し、本発明の方法及び従来のＰＣＲ法により検出した。
【００２１】
（１）Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液の調製
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ Ｘｃ株（九州大学大学院歯学研究院口腔保健推進学講座より供与）の染色体ＤＮＡは、Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａら（１９８２）によって報告されている方法に基づいて調製した。Ｓ． ｍｕｔａｎｓは、ＴＨブロスを用いて３７℃で培養し、対数増殖期（５５０ ｎｍでの吸光度が約０．５）にある菌液１０ ｍｌに２０％グリシンを２．５ ｍｌ加えてさらに３７℃で６０分間培養した。菌体を遠沈によって回収し、ＴＥ緩衝液［１ ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ ８．０］で遠沈洗浄後、菌体を２０％グルコースを含むＴＥ緩衝液２５０μｌに浮遊させた。その菌体浮遊液に１ ｍｇ／ｍｌのムタノリシンＫ−１（Ｙｏｋｏｇａｗａら、１９７４；Ｈａｍａｄａら、１９７８）を２５ μｌ加えて６５℃で２０分間反応させた。ついで、１０ ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（和光純薬、大阪）を１００μｌ加えて４２℃で４０分間反応させた後、０．５ Ｍ ＥＤＴＡを１００μｌと１０ ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ（和光純薬）を２μｌ加えて３７℃で３０分間保温した。さらに、２０ ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．， ＵＳＡ）を５μｌ加えて３７℃で６０分間反応させた後、１０％ＳＤＳ溶液を１００μｌ加えて３７℃で３０分間保温した。こうしてＳ． ｍｕｔａｎｓを溶菌させた液に、剪断力がかからないように穏やかにフェノール・クロロホルム処理を水層がほぼ透明になるまで行い、最終的に単離した水層に等容量のイソプロパノールと１／１０容量の３ Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加えて穏やかに混和した。この処理で不溶化したＤＮＡをガラス棒で巻き取り、１．０ ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した後、室温で自然乾燥し、最後に１００ μｌのＴＥ緩衝液に溶解して染色体ＤＮＡを得た。
【００２２】
（２）Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ溶液の調製
Ｓ． ｍｕｔａｎｓの代わりに、Ｓ． ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＯＭＺ１７６株（九州大学大学院歯学研究院口腔保健推進学講座より供与）を用いること以外は、上記Ｓ． ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液の調製方法と同じ方法にてＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ 溶液を調製した。
【００２３】
（３）本発明の方法による増幅
試料として、爪楊枝抽出物の代わりに上記で調製したＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ溶液を用いること以外は、実施例１と同じ方法により、増幅を行った。なお、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためには、前述のプライマーセットＡを実施例１に示した量で用い、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためには、前述のプライマー、ＳｓｏｂＦ３（配列番号６）、ＳｓｏｂＢ３（配列番号７）、ＳｓｏｂＦＩＰ（配列番号８）、ＳｓｏｂＢＩＰ（配列番号９）、ＳｓｏｂＬＦ（配列番号１０）、ＳｓｏｂＬＢ（配列番号１１）からなるプライマーセットＢを試料溶液２μｌに対してプライマーＳｓｏｂＦ３ ０．２μＭ、プライマーＳｓｏｂＢ３ ０．２μＭ、プライマーＳｓｏｂＦＩＰ １．６μＭ、プライマーＳｓｏｂＢＩＰ １．６μＭ及びプライマーＳｓｏｂＬＦ ０．８μＭ 及びＳｓｏｂＢＦ ０．８μＭの量で用いた。
【００２４】
（４）ＰＣＲによる増幅
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、１μＭの下記のプライマー（ＧＴＦＢ−Ｆ，−Ｒ）、１ＵのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株））及び２μｌの上記のＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ溶液またはＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡ溶液からなるＰＣＲ反応液を用い、９５℃で３０秒間５９℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクルのＰＣＲをでＰＣＲを行うことにより、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｇｔｆＢ遺伝子の一部を増幅した。
プライマーとしてＧＴＦＢ−Ｆ，ＧＴＦＢ−Ｒの代わりに下記のＧＴＦＩ−Ｆ，ＧＴＦＩ−Ｒを用いてＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのｇｔｆＩ遺伝子の一部を増幅した。
ＧＴＦＢ−Ｆ：５’−ＡＣＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＧＴＧＧＣＴＴＧＧ（配列番号１４）
ＧＴＦＢ−Ｒ：５’−ＣＡＧＴＡＴＡＡＧＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣ（配列番号１５）
ＧＴＦＩ−Ｆ：５’−ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣ（配列番号１６）
ＧＴＦＩ−Ｒ：５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡＣＴ（配列番号１７）
【００２５】
（５）検出
増幅産物を２％アガロース電気泳動にかけ（約２０分間）、比較した。結果を図２（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）及び図３（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）に示す。
図より、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡを本発明の方法で増幅した場合、ＰＣＲで増幅した場合に比べて検出感度が約１０倍となることがわかる。
また、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡを本発明の方法で増幅した場合、ＰＣＲで増幅した場合に比べて検出感度が約１００倍となることがわかる。
【００２６】
試験例２
試料として、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ染色体ＤＮＡを１ｍｌ中に１０３，１０５，１０６個相当分含む溶液を用い、増幅のための反応時間を１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間または３５分間とした以外は、実施例１と同様の方法により、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｇｔｆＢ遺伝子を増幅し、白濁の有無を目視により判定した。結果を下記の表に示す。表中、＋は白濁が観察されたことを示し、−は白濁が観察されなかったことを示す。
【００２７】
上表より、試料中のＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡ濃度と白濁が観察される反応時間との間に相関関係があることがわかる。従って、試料溶液中のＳ．ｍｕｔａｎｓのおおよその量を白濁が生じる反応時間により知ることができる。また、唾液１ｍｌ中、Ｓ．ｍｕｔａｎｓが１０６以上である場合、う触発生の可能性が高いため、この試験例の測定条件においては、反応時間を１５分とすることにより、増幅産物の白濁の有無を目視することにより、高度にう触の生じやすい状態であるか否かを判定することができる。
【００２９】
試験例３
試料として、爪楊枝により採取した歯垢試料の代わりに、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ Ｘｃ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＬＭ７、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＭＴ６２１９、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＯＭＺ１７６、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＰＭＺ６５、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ ＭＴ８２４５、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＨＨＴ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＨＴ９Ｒ、Ｓ．ｓａｎｇｉｕｓ ＡＴＣＣ１０５５６、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｃｈａｌｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ、Ａ． ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ Ｙ４及びＰ．ｇｌｕｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３（上記菌株は全て九州大学大学院歯学研究院口腔保険推進学講座より供与された）を用い、上記実施例１の方法により、上記プライマーセットＡを用いた増幅（結果を図４に示す）及び上記プライマーセットＢを用いた増幅（結果を図５に示す）を行った。
図より明らかなように、プライマーセットＡを用いるとＳ．ｍｕｔａｎｓのＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＢを用いるとＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのＤＮＡが特異的に増幅される。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、う触細菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓ及びＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの各々が簡便且つ迅速に、しかも高い精度で検出することができる。しかも増幅反応を一定温度で行うことができるため、高価な機器を必要とすることもない。これにより、臨床においてこれらのう触細菌による口腔内の汚染状況を検査することが可能となり、歯科治療において予防及び治療に役立てることが可能になる。また、ＰＣＲにて増幅の難しい爪楊枝で採取した試料においても本発明による方法では増幅が可能であり、公衆におけるう触細菌の調査や予防意識の向上にも役立てることができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に用いるＬＡＭＰ法を説明する模式図である。
【図２】本発明の方法及びＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図３】本発明の方法及びＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図４】本発明の方法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
【図５】本発明の方法による増幅産物の電気泳動分析の結果を示す写真である。
Claims (8)
- 被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、各々配列表の配列番号１，２，３，４及び５記載の配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程を含む口腔内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出方法。
- 被験者の口腔からの採取物からＤＮＡ試料を調製する工程、該ＤＮＡ試料を鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の存在下で、各々配列表の配列番号６，７，８、９、１０及び１１記載の配列を有するプライマーからなるプライマーセットと一定の反応温度で一定時間反応させることにより、標的ＤＮＡを増幅させる工程、及び得られた増幅産物を検出する工程を含む口腔内のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出方法。
- 前記ＤＮＡ試料を調製する工程を、口腔からの採取物を溶菌液で処理した後、８０℃〜沸騰温度で１〜３０分間加熱した後、遠心分離し、その上清を採取することにより行うことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡを増幅する工程において反応温度が６５℃の単一温度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 各々配列表の配列番号１〜５に記載の配列を有するプライマーからなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのプライマーセット。
- 各々配列表の配列番号６〜１１に記載の配列を有するプライマーからなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのプライマーセット。
- 請求項５のプライマーセットを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓの検出のためのキット。
- 請求項６のプライマーセットを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの検出のためのキット。
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2003
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