JP2004538007A - 大環状ポリケチドを特定するための方法 - Google Patents
大環状ポリケチドを特定するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、バイオセンサー系を使用することによって大環状ポリケチドを特定するための方法、及びこのバイオセンサー系の成分に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー系によって大環状ポリケチドを特定するための方法及びこのバイオセンサー系の成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
大環状ポリケチドは、広い範囲の作用を特徴とすることから、薬理学的に最も重要な天然産物クラスの一つである。それらは、少なくとも１つのラクトン及び／又はラクタム結合をその特徴的性質とする、環の中に１０個以上の原子を含むポリケチド骨格を有する。マクロライド、すなわちラクトン環を有する大環状ポリケチドは、例えば抗菌活性であり、臨床的に使用される１４員及び１６員環ラクトン、カルボマイシン、エリスロマイシン、ロイコマイシン及びオレアンドマイシンを含む。それらは、７０Ｓ原核細胞型リボソームの５０Ｓサブユニットに結合することによってタンパク質生合成を阻害する。加えて、例えばソラフェン、アルボマイシン又は抗真菌及び細胞増殖抑制作用を有するエポチロンのように、環の大きさは同等であり、糖構築ブロック（ｓｕｇａｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）を持たないが、それにもかかわらず生物活性である「非古典的」マクロライドが存在する。エポチロンは広範囲の腫瘍細胞系統を抑制する。ポリエンマクロライドは、２０−３８員ラクトン環を含み、しばしばアミノ糖でグリコシル化されている。それらは抗真菌活性であり、一部は、真菌及び酵母感染に対して臨床的に使用されている（例えばナイスタチン）。スピロ−マクロライドは、動物における内部及び外部寄生生物の防除において及び作物保護における殺虫剤として大きな市場を有する、アベルメクチン及びミルベマイシンを含む。プレコ−マクロライドは、特徴的性質としてラクトン環のほかに折りたたみ側鎖を有する。これらのマクロライドは、例えばコンカナマイシンＡのように、高度に活性なＡＴＰアーゼ阻害因子である。マクロジオライド（例えばエライオフィリン）及びマクロテトロライド（例えばノナクチン）は、反復サブユニットで特徴的に構成される。ラクトンとラクタム結合の両方を有する大環状ポリケチドの例は、構造的に類似する免疫調節剤、ラパマイシン及びＦＫ−５０６である。リファマイシンは、同様に大環状ポリケチドであるが、ラクトン結合ではなくラクタム結合が存在する。リファンピシンは、より良好な薬理特性とより広範囲の作用を備えた、リファマイシンの半合成誘導体である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在の技術水準によれば、例えば天然産物抽出物の大環状ポリケチドを、生物学的スクリーニング法においてそれらの特徴的構造特性に基づいて検出することは不可能である。むしろ、各々の場合に使用されるスクリーニングアッセイは、前記物質が各々の場合にスクリーニングされる生物活性によって示されることに依存している。アッセイにおいてスクリーニングされるものとは異なる作用を有する大環状ポリケチドはこの方法では検出されない。しかしながら、大環状ポリケチドの生物学的効力の極めて高い潜在的可能性の故に、このクラスの物質をそれらの作用とは無関係に選択的に検出することが望ましい。
【０００４】
分析物を検出する１つの可能性はバイオセンサーの使用である。化学物質の構造にもかかわらず、熱ショック活性化又は発癌物質などの選択的に細胞作用を示す、様々な遺伝的に構築されたバイオセンサーの生物学的成分が存在する。いくつかの他の生物学的バイオセンサー成分は、主として特定金属塩又は特定細胞代謝産物の存在下で、測定可能なシグナルを生じうる（Ｄａｕｎｅｒｔら、２０００）。そのようなアッセイ系は、例えば硝化（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９９）又はクロメート塩（Ｐｅｉｔｚｓｃｈら、１９９８）を阻害する物質を検出するためのバイオセンサーに関して示されたように、高い検出感受性を有しうる。芳香族ポリケチドテトラサイクリンについてのバイオセンサー系も記述されている（Ｋｕｒｉｔｔｕら、２０００）。薬理学的に魅力のある天然産物クラスの大環状ポリケチドを検出するためのセンサーもこれまでに記述されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、大環状ポリケチド又は大環状ポリケチドを含む混合物をバイオセンサー系に供する、大環状ポリケチドを特定するための方法に関する。
【０００６】
本発明に従った方法は、バイオセンサー系の適用により、スクリーニングを魅力的な天然産物クラスの大環状ポリケチドに集中させる可能性を提供する。大環状ポリケチドの生物活性は、例えば保健衛生、農業又は環境保護の分野のように極めて多様な領域に関連すると考えられるので、この集中プロセスは、生物学的に興味深い新規大環状ポリケチドを検出するために必要な作用を少なからず軽減すると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ここで使用するとき、「バイオセンサー系」の語は、特に遺伝子操作された細胞バイオセンサーに基づく系を意味する。前記バイオセンサーは、生物学的成分である、特に大環状ポリケチドを検出するのに適した微生物検出系を含む。大環状ポリケチドの検出は生化学的情報のシミュレーションによって示される。この生化学的情報は、適切な技術的成分を用いて測定し、数量化しうる。
【０００８】
大環状ポリケチドのためのバイオセンサー系の生物学的成分は、好ましくは細胞レポーター−遺伝子アッセイ系である。そのような細胞レポーター−遺伝子アッセイ系は、特に好ましくは、その転写が大環状ポリケチドの関数として調節されるプロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む。
【０００９】
使用しうるレポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、細菌又はホタルルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子のような様々な遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子はバイオセンサーの開発において有用であることが証明されている（Ｄａｕｎｅｒｔら、２０００）。ルシフェラーゼをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として使用することが好ましい。
【００１０】
生物学的成分によって生成される生化学的情報は、例えば写真撮影法、ビデオ画像化又はその他のマニュアル描画法のような画像化法によって記録しうる。生物学的成分によって生成される生化学的情報はまた、技術的成分としてシグナル変換器を使用することによって物理的に定量可能なシグナルに変換しうる。前記シグナルは、例えば電子増幅にアクセス可能な電気シグナルでありうる。使用しうる変換器の例は、電流測定又は電位差測定電極、オプトロード、ピエゾクリスタル及びサーミスターである（Ｐüｈｌｅｒら、２０００）。
【００１１】
大環状ポリケチドの作用としてのレポーター遺伝子の転写を制御するために使用するプロモーターは、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域である。このプロモーター領域の調節は、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの対応する遺伝子を過剰発現することによって提供される、ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質を必要とする。
【００１２】
従って、バイオセンサー系の生物学的部分は、好ましくは大腸菌からのエリスロマイシン耐性遺伝子オペロンの成分に基づく（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）。このｍｐｈ（Ａ）オペロンの公表されているモデルに従えば、３つの遺伝子産物：Ｍｐｈ（Ａ）、Ｍｒｘ及びＭｐｈＲ（Ａ）がコードされている。ここで、このオペロンの発現は、このオペロンの最初の遺伝子であるｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域へのＭｐｈＲ（Ａ）の結合により、転写のレベルで負に調節される。エリスロマイシンの不在下で、ＭｐｈＲ（Ａ）はｍｐｈ（Ａ）オペロンのプロモーター領域に結合し、後者の発現を抑制する。エリスロマイシンの存在は、ＭｐｈＲ（Ａ）がこのプロモーター領域に結合するのを停止させ、従って前記オペロンの発現を可能にする（図１）。
【００１３】
原核細胞及び真核細胞の両方が、本発明の方法のためのバイオセンサー系のもう１つの生物学的成分である宿主細胞として使用しうる。細菌、特に好ましくはグラム陰性微生物である大腸菌を使用することが好ましい。
【００１４】
本発明の方法のためのバイオセンサー系の極めて特に好ましい実施形態を作製するためには、下記の成分を調製し、組み合わせる：（ｉ）その発現がｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、（ｉｉ）ｍｐｈＲ（Ａ）遺伝子を過剰発現し、同時に、ｍｐｈ（Ａ）オペロン又はその部分を担う大腸菌細胞。
【００１５】
この非常に好ましい実施形態を作製する手順を下記でより詳細に述べる。
【００１６】
上記のルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドは、例えば、ＰＣＲを使用して、プラスミドｐＴＺ３５０９（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）のｍｐｈ（Ａ）オペロンのプロモーター領域をコードするＭｐｈＲ（Ａ）結合ＤＮＡ配列を増幅すること（実施例１参照）及びこの配列をプロモーター−スクリーニングベクターｐＵＣＤ６１５（Ｒｏｇｏｗｓｋｙら、１９８７）にクローニングすることによって作製する。この転写融合（オペロン融合）ベクターは、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルシフェラーゼについてのプロモーターなし構造遺伝子（ｌｕｘ遺伝子）をコードする。プロモーターを担うＤＮＡ断片を、ｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域がｌｕｘ遺伝子の転写を制御するようにｐＵＣＤ６１５にクローニングする。プラスミドｐＴＺ３５０９からのｍｐｈ（Ａ）オペロンをコードするＤＮＡフラグメントをトランスポゾン自殺ベクターｐＢＳＬ１８０（ＡｌｅｘｅｙｅｖとＳｈｏｋｏｌｅｎｋｏ，１９９５）に再クローニングすることにより、エリスロマイシンに対する耐性を付与するｍｐｈ（Ａ）オペロンを移入する（実施例２参照）。ＰＣＲ増幅によってプラスミドｐＴＺ３５０９からｍｐｈＲ（Ａ）遺伝子を得て、それをｐＡＣＹＣ１８４ベクター（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ，１９７８）にクローニングすることにより、ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質を過剰発現させる（実施例３参照）。
【００１７】
使用する大腸菌細胞の一例はＳＭ１０１（ＶｕｏｒｉｏとＶａａｒａ，１９９２）である。この菌株は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−アシルトランスフェラーゼを欠損するｌｐｘＡ２突然変異体である。この酵素は外細胞膜のリピドＡ生合成の最初の段階に必要である。ｌｐｘＡ２突然変異は、エリスロマイシン又はリファンピンなどの疎水性抗生物質に対する感受性の著しい上昇を生じさせる。
【００１８】
その発現がｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、ｍｐｈＲ（Ａ）を担うプラスミド及びｍｐｈ（Ａ）オペロン移入自殺プラスミドを、分子遺伝学の標準的方法によって前記細菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＭ１０１に導入する。
【００１９】
使用する宿主細胞はまた、ｔｏｌＣ突然変異を担う大腸菌株でありうる。機能的ｔｏｌＣ遺伝子産物は、有効なＡｃｒＡＢ排出システムのため及びＭａｒ表現型を発現するために必要である（Ｆｒａｌｉｃｋ，１９９６）。前記遺伝子産物は、有害な疎水性物質を分泌するのに役割を果たすと考えられる。言うまでもなく、本発明のバイオセンサー系の形成のための宿主生物として、ｌｐｘＡ２及びｔｏｌＣ突然変異の両方を担う大腸菌株を使用することも容易に可能である。
【００２０】
例として示した手順は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現という特性を持ち、従って発光が１２−１６員大環状ポリケチドによって促進されるバイオセンサー系を作製するために使用しうる。本発明のバイオセンサー系は、例えば、１４員天然マクロライド系タンパク質合成阻害因子、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマイシン及びナルボマイシンを指示する。本発明のバイオセンサー系の発光はまた、グラム陽性細菌に対して抗菌活性のある１２員マクロライド、メチマイシンによっても促進される。さらに、本発明のバイオセンサー系の発光は、同様に１５員半合成マクロライド、アジスロマイシンによっても誘発される。このバイオセンサー系はまた、大環状ラクタムポリケチド、リファンピシン、半合成リファマイシン誘導体及び転写阻害因子も指示する。
【００２１】
例えばタンパク質合成阻害因子、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール、細胞壁合成阻害因子、ホスホマイシン及びバンコマイシン、又はジャイレース阻害因子、ノボビオシンなどの、大環状ポリケチドのクラスに含まれない他の物質は、この種の発光の促進を生じさせない（図３）。
【００２２】
提示するモデルに従えば（図１及び２）、非常に好ましい実施形態における本発明のバイオセンサー系の特異性は、ＭｐｈＲ（Ａ）リプレッサーによって及びｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域へのその結合によって決定される。ＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４）、スタッガー延長プロセス（Ｚｈａｏら、１９９８）又は新しいＤＮＡシャフリング法（Ｃｏｃｏら、２００１）などの方法を用いて、ＭｐｈＲ（Ａ）の結合特性を変化させることが可能である。例えば、特定の大環状ポリケチドについてのＭｐｈＲ（Ａ）の結合特異性又は親和性を変化させることが可能である。さらに、ＭｐｈＲ（Ａ）のＤＮＡ結合及び転写調節特性を変化させうる。ＭｐｈＲ（Ａ）が結合するＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を変えることによってバイオセンサー系の選択性及び感受性を変化させることも可能である。加えて、ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質又はバイオセンサー系の他の成分の細胞アベイラビリティーを調節することによってセンサー特性に影響を及ぼすことも可能である。
【００２３】
これは、非常に好ましい実施形態によって特に指示されない物質を特異的に検出することができるように、バイオセンサー系の生物学的成分を変化させる可能性を容易に導く。これに関して特に興味深いのは、例えば、バンコマイシン又は類似体のような、非リボソーム的に合成される環状ペプチドを指示することができる生物学的バイオセンサー成分である。原則として、ＤＮＡシャフリング（上記参照）又は他の突然変異法などの方法を使用することにより、特定構造についてのバイオセンサー系の選択性及び感受性を最適化することが可能である。例えば、ｍｐｈ（Ａ）オペロンのプロモーターを、耐性遺伝子、例えばテトラサイクリン耐性遺伝子などの選択可能遺伝子の、プロモーターなし遺伝子の上流に置くことは、そのようなバイオセンサー特性の変化において有益である。これは、バイオセンサー系の変異体が、バイオセンサー特性を変化させる作業の間に刺激可能なテトラサイクリン耐性に基づいて正の選択されることを可能にする。
【００２４】
本発明のバイオセンサー系はまた、コンビナトリアル生合成の枠内でも使用しうる。例えば、最近記述されたような（Ｔａｎｇら、２００１）ポリケチドライブラリーの物質を指示するためにこのバイオセンサー系を使用することができる。この検出法は、試験する物質の抗菌活性とは無関係である。それに加えて、このポリケチドライブラリー又は同様の種類のポリケチドライブラリーを形成するさらなる系を本発明のバイオセンサー系の中に形成することも容易に可能である。これは、細胞内で生体内結合的に生成される大環状ポリケチドを提供する微生物の細胞を容易に検出することを可能にする。使用するレポーター遺伝子産物がグリーン蛍光タンパク質である場合は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてそのような細胞を選別しうる。
【００２５】
本発明のバイオセンサー系は広い範囲の適用を有する。例えば、天然又は人に起因した生存又は非生存環境において大環状ポリケチドを検出するためにインサイチューで使用しうる。そこで、例えば、濃縮又は単離微生物又は他の生物によって生産される大環状ポリケチドを検出するために使用しうる（実施例５参照）。言うまでもなく、天然又は遺伝子操作されたものだけでなく、合成大環状ポリケチドを検出するためにも使用しうる。特に、実験室又は生産環境で、試薬容器内又はマイクロタイタープレート形式でのスクリーニング法の一環として均一アッセイにおいて使用しうる。また、寒天平板拡散アッセイにおいて、薄層クロマトグラフィーの間に（Ｓｈａｗら、１９９７；Ｅｂｅｒｚら、１９９６）、連続形式の高流量スクリーニング（ＷＯ９９／３０１５４号）において又はセンサー−レイヤー様式（ＤＥ−Ａ１９９１５３１０号）においても適用しうる。
【００２６】
本発明の方法は、特に寒天平板拡散アッセイを適用して実施しうる。発光促進の場合は、インキュベーションの約２時間後から既に検出が可能である。通常は、一晩のインキュベーション（１５時間から２４時間）が好都合である。
【００２７】
また、例えば発光の促進を測定することなどの測定に基づいて大環状ポリケチドを産生する生物を検出するために、例えばコロニーなどの被験生物の増殖の上に、軟寒天に懸濁したバイオセンサー細胞を展開することも容易に可能である。
【００２８】
また、本発明に基づいて、本発明のバイオセンサー系の細胞内成分、例えば特定タンパク質又は補因子を使用することにより、大環状ポリケチドを検出するための非細胞スクリーニングアッセイを開発することも可能である。
【００２９】
本発明はまた、本発明のバイオセンサー系を形成する宿主細胞及び対応するＤＮＡ構築物に関する。
【００３０】
本発明はさらに、本発明のバイオセンサー系を含むキットに関する。
【００３１】
実施例
【実施例１】
【００３２】
ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製するためのプロトコール
プラスミドｐＥＢＺ５１１の作製
最初に、ＰＣＲ増幅を使用して、ｍｐｈ（Ａ）オペロンオペロンのプロモーター及びＭｐｈＲタンパク質が結合するＤＮＡ配列を得ることにより、プラスミドｐＥＢＺ５１１を作製した。使用した鋳型は、プラスミドｐＴＺ３５０９（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）のＤＮＡであった。使用したプライマーは、末端ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を有する所望のＤＮＡフラグメントを増幅するのに役立つオリゴヌクレオチドｍｐｈｆ２１６及びｍｐｈｒ２１７であった。ＰＣＲ混合物を最初に９５℃で３分間変性し、その後９５℃で６０秒間の変性、５８℃で９０秒間のアニーリング及び６８℃で２分間の伸長の３０サイクルに供した。このＰＣＲ混合物は、前記の２個のプライマー１００ｐｍｏｌ、ｐＴＺ３５０９ １０ｎｇ、ｄＮＴＰ ０．５ｍＭ、１×Ｐｆｘ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＰＣＲエンハンサー溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰｆｘポリメラーゼ５Ｕ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。標準分子生物学法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、得られたＤＮＡアンプリコンを単離し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断しておいたベクターｐＵＣＤ６１５（Ｒｏｇｏｗｓｋｙら、１９８７）にクローニングした。
【００３３】
【化１】
【実施例２】
【００３４】
ｍｐｈ（Ａ）オペロンを担う自殺ベクターを作製するためのプロトコール
ｍｐｈ（Ａ）オペロンを担う自殺トランスポゾンプラスミドｐＥＢＺ５１２の作製及び大腸菌ＳＭ１０１へのｍｐｈ（Ａ）オペロンの転位
ＰｓｔＩを使用して、プラスミドｐＴＺ３５０９（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）から４．１ｋｂ ＤＮＡフラグメント上でｍｐｈ（Ａ）オペロンを切り出し、標準分子生物学法を用いて、自殺トランスポゾンベクターｐＢＳＬ１８０（ＡｌｅｘｅｙｅｖとＳｈｏｋｏｌｅｎｋｏ、１９９５）のＰｓｔＩ開裂部位、プラスミドの転移性部分にクローニングした。形質転換のために使用した宿主は、大腸菌ＣＣ１１８ Ｌａｍｂｄａｐｉｒ（Ｈｅｒｒｅｒｏら、１９９０）であった。この菌株は、プラスミドの複製に必要なπタンパク質を有する。作製したプラスミドをｐＥＢＺ５１２と称した。標準形質転換法を用いてこのプラスミドを大腸菌ＳＭ１０１に導入し、ｍｐｈ（Ａ）オペロンを担うトランスポゾンの転位後に形質転換体を選択した。この手順によってゲノムに組み込まれたＤＮＡのｍｐｈ（Ａ）オペロンを担う転位断片をＥＢＺ５１２と称した。標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて分子生物学的作業（ＤＮＡ単離、制限、連結及び形質転換）を実施した。
【実施例３】
【００３５】
ｍｐｈＲ（Ａ）をコードするプラスミドを作製するためのプロトコール
ｍｐｈＲ（Ａ）をコードするプラスミドｐＥＢＺ５１４の作製
プライマーＭＬＶ６３７及びＭＬＶ６３８及びｐＥＢＺ５１２−ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによってｍｐｈＲ（Ａ）の遺伝子領域を増幅した。リボソーム結合部位及びＳｐｈＩ開裂部位をプライマーＭＬＶ６３７に組み込み、ＳａｌＩ開裂部位をプライマーＭＬＶ６３８に組み込んだ。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ型エッペンドルフサーモサイクラーでＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ混合物を最初に９６℃で１０分間変性し、その後９６℃で６０秒間の変性、５６℃で９０秒間のアニーリング及び７２℃で４０秒間の伸長という３０回の伸長サイクルに供した。このＰＣＲ混合物は、前記の２個のプライマー１００ｐｍｏｌ、ｐＥＢＺ５１２−ＤＮＡ １０ｎｇ、ｄＮＴＰ ０．５ｍＭ、１×Ｐｆｘ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＰＣＲエンハンサー溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰｆｘポリメラーゼ５Ｕ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。生成されたＤＮＡフラグメントを単離し、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで切断して、ＳｐｈＩとＳａｌＩで同様に切断しておいたベクターｐＡＣＹＣ１８４（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ、１９７８）に連結した。ｍｐｈＲ（Ａ）をコードする領域は、従って、対応する耐性遺伝子プロモーターの下流の、テトラサイクリン耐性遺伝子内に位置した。標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて分子生物学的作業（ＤＮＡ単離、制限、連結及び形質転換）を実施した。
【００３６】
【化２】
【実施例４】
【００３７】
寒天平板拡散アッセイにおける発光測定
バイオセンサー、大腸菌ＳＭ１０１（ＥＢＺ５１２、ｐＥＢＺ５１１、ｐＥＢＺ５１４）をＬＢ培地で対数増殖後期まで好気的に増殖させ、標準微生物学的方法を用いて軟寒天に混合して、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ−寒天平板に塗布した。軟寒天が凝固した後、検定する物質を既に含む感受性アッセイディスク又は検定する物質を適用されている非充填アッセイディスク（Ｏｘｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ａｍ Ｌｉｐｐｅｇｌａｃｉｓ ４−８，４６４８３ Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を寒天上に置いた。この寒天平板拡散アッセイを２８℃で２時間から４時間又は１５時間から２４時間インキュベートし、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈ ＬＢ９８０を用いて発光を記録した（図３、４及び５）。発光が促進される場合は、配置した試料の周囲の拡散帯域内で検出できる。検定する試料が、同時に、より長時間のインキュベーションの非常に好ましい実施形態において阻害帯域として示される、センサー生物に対する抗菌活性を有する場合は、発光の促進は、致死量以下の濃度範囲内でこの阻害の輪の外側で検出されうる。
【実施例５】
【００３８】
マクロライド（エリスロマイシン）産生生物の検出
バイオセンサーを使用して、大環状ポリケチドの生産生物として知られる微生物をもう１つ別の微生物からインサイチューで識別することも可能であった。このために、微生物バイオセンサー細胞を寒天平板拡散アッセイにおいて使用した。寒天ブロックを、軟寒天に包埋したバイオセンサー懸濁液上に置いた。これらの寒天ブロックを、エリスロマイシン生産生物として記述されているサッカロポリスポラ・エリトラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＤＳＭ４０５１７又はアビラマイシン生産生物として記述されているストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ４０７２１のいずれかで被覆した。もう１つの寒天ブロックは増殖物を含まなかった。発光の促進は、付加的に適用したエリスロマイシンアッセイディスク及びサッカロポリスポラ・エリトラエア被覆寒天ブロックに関してのみ検出可能であった（図５）。
【００３９】
（寄託）
ブタペスト条約の必要条件に従って、２００１年６月６日に、下記の菌株をｔｈｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託した：
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｍｐｈ（Ａ）オペロン調節のモデル（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００による、修正）。
【図２】バイオセンサー系の生物学的成分の非常に好ましい実施形態のモデル。ＬｕｘＣ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＬｕｘＣ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＥ構造遺伝子、及びそれぞれ、ビブリオ・フィスシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼの構造遺伝子の産物。ｍｐｈＲ（Ａ）、ＭｐｈＲ（Ａ）、Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００参照。
【図３】大腸菌バイオセンサー系を用いた寒天平板拡散アッセイ及び発光測定。生物学的センサー成分の選択性の例示。被験物質に関する情報の中で示す数字は、μｇで表わした適用物質の量を表わす。
【図４】大腸菌バイオセンサー系を用いた寒天平板拡散アッセイ及び発光測定。時間の関数としての生物学的センサー成分の発光の促進の例示。被験物質に関する情報の中で示す数字は、μｇで表わした適用物質の量を表わす。
【図５】大腸菌バイオセンサー系を用いた寒天平板拡散アッセイ及び発光測定。エリスロマイシン産生サッカロポリスポラ・エリトラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）培養によるインサイチューでの発光の促進。標準物質エリスロマイシンに関する情報の中で示す数字は、μｇで表わした適用物質の量を表わす。
【０００１】
本発明は、バイオセンサー系によって大環状ポリケチドを特定するための方法及びこのバイオセンサー系の成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
大環状ポリケチドは、広い範囲の作用を特徴とすることから、薬理学的に最も重要な天然産物クラスの一つである。それらは、少なくとも１つのラクトン及び／又はラクタム結合をその特徴的性質とする、環の中に１０個以上の原子を含むポリケチド骨格を有する。マクロライド、すなわちラクトン環を有する大環状ポリケチドは、例えば抗菌活性であり、臨床的に使用される１４員及び１６員環ラクトン、カルボマイシン、エリスロマイシン、ロイコマイシン及びオレアンドマイシンを含む。それらは、７０Ｓ原核細胞型リボソームの５０Ｓサブユニットに結合することによってタンパク質生合成を阻害する。加えて、例えばソラフェン、アルボマイシン又は抗真菌及び細胞増殖抑制作用を有するエポチロンのように、環の大きさは同等であり、糖構築ブロック（ｓｕｇａｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）を持たないが、それにもかかわらず生物活性である「非古典的」マクロライドが存在する。エポチロンは広範囲の腫瘍細胞系統を抑制する。ポリエンマクロライドは、２０−３８員ラクトン環を含み、しばしばアミノ糖でグリコシル化されている。それらは抗真菌活性であり、一部は、真菌及び酵母感染に対して臨床的に使用されている（例えばナイスタチン）。スピロ−マクロライドは、動物における内部及び外部寄生生物の防除において及び作物保護における殺虫剤として大きな市場を有する、アベルメクチン及びミルベマイシンを含む。プレコ−マクロライドは、特徴的性質としてラクトン環のほかに折りたたみ側鎖を有する。これらのマクロライドは、例えばコンカナマイシンＡのように、高度に活性なＡＴＰアーゼ阻害因子である。マクロジオライド（例えばエライオフィリン）及びマクロテトロライド（例えばノナクチン）は、反復サブユニットで特徴的に構成される。ラクトンとラクタム結合の両方を有する大環状ポリケチドの例は、構造的に類似する免疫調節剤、ラパマイシン及びＦＫ−５０６である。リファマイシンは、同様に大環状ポリケチドであるが、ラクトン結合ではなくラクタム結合が存在する。リファンピシンは、より良好な薬理特性とより広範囲の作用を備えた、リファマイシンの半合成誘導体である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在の技術水準によれば、例えば天然産物抽出物の大環状ポリケチドを、生物学的スクリーニング法においてそれらの特徴的構造特性に基づいて検出することは不可能である。むしろ、各々の場合に使用されるスクリーニングアッセイは、前記物質が各々の場合にスクリーニングされる生物活性によって示されることに依存している。アッセイにおいてスクリーニングされるものとは異なる作用を有する大環状ポリケチドはこの方法では検出されない。しかしながら、大環状ポリケチドの生物学的効力の極めて高い潜在的可能性の故に、このクラスの物質をそれらの作用とは無関係に選択的に検出することが望ましい。
【０００４】
分析物を検出する１つの可能性はバイオセンサーの使用である。化学物質の構造にもかかわらず、熱ショック活性化又は発癌物質などの選択的に細胞作用を示す、様々な遺伝的に構築されたバイオセンサーの生物学的成分が存在する。いくつかの他の生物学的バイオセンサー成分は、主として特定金属塩又は特定細胞代謝産物の存在下で、測定可能なシグナルを生じうる（Ｄａｕｎｅｒｔら、２０００）。そのようなアッセイ系は、例えば硝化（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９９）又はクロメート塩（Ｐｅｉｔｚｓｃｈら、１９９８）を阻害する物質を検出するためのバイオセンサーに関して示されたように、高い検出感受性を有しうる。芳香族ポリケチドテトラサイクリンについてのバイオセンサー系も記述されている（Ｋｕｒｉｔｔｕら、２０００）。薬理学的に魅力のある天然産物クラスの大環状ポリケチドを検出するためのセンサーもこれまでに記述されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、大環状ポリケチド又は大環状ポリケチドを含む混合物をバイオセンサー系に供する、大環状ポリケチドを特定するための方法に関する。
【０００６】
本発明に従った方法は、バイオセンサー系の適用により、スクリーニングを魅力的な天然産物クラスの大環状ポリケチドに集中させる可能性を提供する。大環状ポリケチドの生物活性は、例えば保健衛生、農業又は環境保護の分野のように極めて多様な領域に関連すると考えられるので、この集中プロセスは、生物学的に興味深い新規大環状ポリケチドを検出するために必要な作用を少なからず軽減すると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ここで使用するとき、「バイオセンサー系」の語は、特に遺伝子操作された細胞バイオセンサーに基づく系を意味する。前記バイオセンサーは、生物学的成分である、特に大環状ポリケチドを検出するのに適した微生物検出系を含む。大環状ポリケチドの検出は生化学的情報のシミュレーションによって示される。この生化学的情報は、適切な技術的成分を用いて測定し、数量化しうる。
【０００８】
大環状ポリケチドのためのバイオセンサー系の生物学的成分は、好ましくは細胞レポーター−遺伝子アッセイ系である。そのような細胞レポーター−遺伝子アッセイ系は、特に好ましくは、その転写が大環状ポリケチドの関数として調節されるプロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む。
【０００９】
使用しうるレポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、細菌又はホタルルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子のような様々な遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子はバイオセンサーの開発において有用であることが証明されている（Ｄａｕｎｅｒｔら、２０００）。ルシフェラーゼをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として使用することが好ましい。
【００１０】
生物学的成分によって生成される生化学的情報は、例えば写真撮影法、ビデオ画像化又はその他のマニュアル描画法のような画像化法によって記録しうる。生物学的成分によって生成される生化学的情報はまた、技術的成分としてシグナル変換器を使用することによって物理的に定量可能なシグナルに変換しうる。前記シグナルは、例えば電子増幅にアクセス可能な電気シグナルでありうる。使用しうる変換器の例は、電流測定又は電位差測定電極、オプトロード、ピエゾクリスタル及びサーミスターである（Ｐüｈｌｅｒら、２０００）。
【００１１】
大環状ポリケチドの作用としてのレポーター遺伝子の転写を制御するために使用するプロモーターは、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域である。このプロモーター領域の調節は、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの対応する遺伝子を過剰発現することによって提供される、ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質を必要とする。
【００１２】
従って、バイオセンサー系の生物学的部分は、好ましくは大腸菌からのエリスロマイシン耐性遺伝子オペロンの成分に基づく（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）。このｍｐｈ（Ａ）オペロンの公表されているモデルに従えば、３つの遺伝子産物：Ｍｐｈ（Ａ）、Ｍｒｘ及びＭｐｈＲ（Ａ）がコードされている。ここで、このオペロンの発現は、このオペロンの最初の遺伝子であるｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域へのＭｐｈＲ（Ａ）の結合により、転写のレベルで負に調節される。エリスロマイシンの不在下で、ＭｐｈＲ（Ａ）はｍｐｈ（Ａ）オペロンのプロモーター領域に結合し、後者の発現を抑制する。エリスロマイシンの存在は、ＭｐｈＲ（Ａ）がこのプロモーター領域に結合するのを停止させ、従って前記オペロンの発現を可能にする（図１）。
【００１３】
原核細胞及び真核細胞の両方が、本発明の方法のためのバイオセンサー系のもう１つの生物学的成分である宿主細胞として使用しうる。細菌、特に好ましくはグラム陰性微生物である大腸菌を使用することが好ましい。
【００１４】
本発明の方法のためのバイオセンサー系の極めて特に好ましい実施形態を作製するためには、下記の成分を調製し、組み合わせる：（ｉ）その発現がｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、（ｉｉ）ｍｐｈＲ（Ａ）遺伝子を過剰発現し、同時に、ｍｐｈ（Ａ）オペロン又はその部分を担う大腸菌細胞。
【００１５】
この非常に好ましい実施形態を作製する手順を下記でより詳細に述べる。
【００１６】
上記のルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドは、例えば、ＰＣＲを使用して、プラスミドｐＴＺ３５０９（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）のｍｐｈ（Ａ）オペロンのプロモーター領域をコードするＭｐｈＲ（Ａ）結合ＤＮＡ配列を増幅すること（実施例１参照）及びこの配列をプロモーター−スクリーニングベクターｐＵＣＤ６１５（Ｒｏｇｏｗｓｋｙら、１９８７）にクローニングすることによって作製する。この転写融合（オペロン融合）ベクターは、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉルシフェラーゼについてのプロモーターなし構造遺伝子（ｌｕｘ遺伝子）をコードする。プロモーターを担うＤＮＡ断片を、ｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域がｌｕｘ遺伝子の転写を制御するようにｐＵＣＤ６１５にクローニングする。プラスミドｐＴＺ３５０９からのｍｐｈ（Ａ）オペロンをコードするＤＮＡフラグメントをトランスポゾン自殺ベクターｐＢＳＬ１８０（ＡｌｅｘｅｙｅｖとＳｈｏｋｏｌｅｎｋｏ，１９９５）に再クローニングすることにより、エリスロマイシンに対する耐性を付与するｍｐｈ（Ａ）オペロンを移入する（実施例２参照）。ＰＣＲ増幅によってプラスミドｐＴＺ３５０９からｍｐｈＲ（Ａ）遺伝子を得て、それをｐＡＣＹＣ１８４ベクター（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ，１９７８）にクローニングすることにより、ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質を過剰発現させる（実施例３参照）。
【００１７】
使用する大腸菌細胞の一例はＳＭ１０１（ＶｕｏｒｉｏとＶａａｒａ，１９９２）である。この菌株は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−アシルトランスフェラーゼを欠損するｌｐｘＡ２突然変異体である。この酵素は外細胞膜のリピドＡ生合成の最初の段階に必要である。ｌｐｘＡ２突然変異は、エリスロマイシン又はリファンピンなどの疎水性抗生物質に対する感受性の著しい上昇を生じさせる。
【００１８】
その発現がｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、ｍｐｈＲ（Ａ）を担うプラスミド及びｍｐｈ（Ａ）オペロン移入自殺プラスミドを、分子遺伝学の標準的方法によって前記細菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＭ１０１に導入する。
【００１９】
使用する宿主細胞はまた、ｔｏｌＣ突然変異を担う大腸菌株でありうる。機能的ｔｏｌＣ遺伝子産物は、有効なＡｃｒＡＢ排出システムのため及びＭａｒ表現型を発現するために必要である（Ｆｒａｌｉｃｋ，１９９６）。前記遺伝子産物は、有害な疎水性物質を分泌するのに役割を果たすと考えられる。言うまでもなく、本発明のバイオセンサー系の形成のための宿主生物として、ｌｐｘＡ２及びｔｏｌＣ突然変異の両方を担う大腸菌株を使用することも容易に可能である。
【００２０】
例として示した手順は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現という特性を持ち、従って発光が１２−１６員大環状ポリケチドによって促進されるバイオセンサー系を作製するために使用しうる。本発明のバイオセンサー系は、例えば、１４員天然マクロライド系タンパク質合成阻害因子、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマイシン及びナルボマイシンを指示する。本発明のバイオセンサー系の発光はまた、グラム陽性細菌に対して抗菌活性のある１２員マクロライド、メチマイシンによっても促進される。さらに、本発明のバイオセンサー系の発光は、同様に１５員半合成マクロライド、アジスロマイシンによっても誘発される。このバイオセンサー系はまた、大環状ラクタムポリケチド、リファンピシン、半合成リファマイシン誘導体及び転写阻害因子も指示する。
【００２１】
例えばタンパク質合成阻害因子、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール、細胞壁合成阻害因子、ホスホマイシン及びバンコマイシン、又はジャイレース阻害因子、ノボビオシンなどの、大環状ポリケチドのクラスに含まれない他の物質は、この種の発光の促進を生じさせない（図３）。
【００２２】
提示するモデルに従えば（図１及び２）、非常に好ましい実施形態における本発明のバイオセンサー系の特異性は、ＭｐｈＲ（Ａ）リプレッサーによって及びｍｐｈ（Ａ）プロモーター領域へのその結合によって決定される。ＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４）、スタッガー延長プロセス（Ｚｈａｏら、１９９８）又は新しいＤＮＡシャフリング法（Ｃｏｃｏら、２００１）などの方法を用いて、ＭｐｈＲ（Ａ）の結合特性を変化させることが可能である。例えば、特定の大環状ポリケチドについてのＭｐｈＲ（Ａ）の結合特異性又は親和性を変化させることが可能である。さらに、ＭｐｈＲ（Ａ）のＤＮＡ結合及び転写調節特性を変化させうる。ＭｐｈＲ（Ａ）が結合するＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を変えることによってバイオセンサー系の選択性及び感受性を変化させることも可能である。加えて、ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質又はバイオセンサー系の他の成分の細胞アベイラビリティーを調節することによってセンサー特性に影響を及ぼすことも可能である。
【００２３】
これは、非常に好ましい実施形態によって特に指示されない物質を特異的に検出することができるように、バイオセンサー系の生物学的成分を変化させる可能性を容易に導く。これに関して特に興味深いのは、例えば、バンコマイシン又は類似体のような、非リボソーム的に合成される環状ペプチドを指示することができる生物学的バイオセンサー成分である。原則として、ＤＮＡシャフリング（上記参照）又は他の突然変異法などの方法を使用することにより、特定構造についてのバイオセンサー系の選択性及び感受性を最適化することが可能である。例えば、ｍｐｈ（Ａ）オペロンのプロモーターを、耐性遺伝子、例えばテトラサイクリン耐性遺伝子などの選択可能遺伝子の、プロモーターなし遺伝子の上流に置くことは、そのようなバイオセンサー特性の変化において有益である。これは、バイオセンサー系の変異体が、バイオセンサー特性を変化させる作業の間に刺激可能なテトラサイクリン耐性に基づいて正の選択されることを可能にする。
【００２４】
本発明のバイオセンサー系はまた、コンビナトリアル生合成の枠内でも使用しうる。例えば、最近記述されたような（Ｔａｎｇら、２００１）ポリケチドライブラリーの物質を指示するためにこのバイオセンサー系を使用することができる。この検出法は、試験する物質の抗菌活性とは無関係である。それに加えて、このポリケチドライブラリー又は同様の種類のポリケチドライブラリーを形成するさらなる系を本発明のバイオセンサー系の中に形成することも容易に可能である。これは、細胞内で生体内結合的に生成される大環状ポリケチドを提供する微生物の細胞を容易に検出することを可能にする。使用するレポーター遺伝子産物がグリーン蛍光タンパク質である場合は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてそのような細胞を選別しうる。
【００２５】
本発明のバイオセンサー系は広い範囲の適用を有する。例えば、天然又は人に起因した生存又は非生存環境において大環状ポリケチドを検出するためにインサイチューで使用しうる。そこで、例えば、濃縮又は単離微生物又は他の生物によって生産される大環状ポリケチドを検出するために使用しうる（実施例５参照）。言うまでもなく、天然又は遺伝子操作されたものだけでなく、合成大環状ポリケチドを検出するためにも使用しうる。特に、実験室又は生産環境で、試薬容器内又はマイクロタイタープレート形式でのスクリーニング法の一環として均一アッセイにおいて使用しうる。また、寒天平板拡散アッセイにおいて、薄層クロマトグラフィーの間に（Ｓｈａｗら、１９９７；Ｅｂｅｒｚら、１９９６）、連続形式の高流量スクリーニング（ＷＯ９９／３０１５４号）において又はセンサー−レイヤー様式（ＤＥ−Ａ１９９１５３１０号）においても適用しうる。
【００２６】
本発明の方法は、特に寒天平板拡散アッセイを適用して実施しうる。発光促進の場合は、インキュベーションの約２時間後から既に検出が可能である。通常は、一晩のインキュベーション（１５時間から２４時間）が好都合である。
【００２７】
また、例えば発光の促進を測定することなどの測定に基づいて大環状ポリケチドを産生する生物を検出するために、例えばコロニーなどの被験生物の増殖の上に、軟寒天に懸濁したバイオセンサー細胞を展開することも容易に可能である。
【００２８】
また、本発明に基づいて、本発明のバイオセンサー系の細胞内成分、例えば特定タンパク質又は補因子を使用することにより、大環状ポリケチドを検出するための非細胞スクリーニングアッセイを開発することも可能である。
【００２９】
本発明はまた、本発明のバイオセンサー系を形成する宿主細胞及び対応するＤＮＡ構築物に関する。
【００３０】
本発明はさらに、本発明のバイオセンサー系を含むキットに関する。
【００３１】
実施例
【実施例１】
【００３２】
ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製するためのプロトコール
プラスミドｐＥＢＺ５１１の作製
最初に、ＰＣＲ増幅を使用して、ｍｐｈ（Ａ）オペロンオペロンのプロモーター及びＭｐｈＲタンパク質が結合するＤＮＡ配列を得ることにより、プラスミドｐＥＢＺ５１１を作製した。使用した鋳型は、プラスミドｐＴＺ３５０９（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）のＤＮＡであった。使用したプライマーは、末端ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を有する所望のＤＮＡフラグメントを増幅するのに役立つオリゴヌクレオチドｍｐｈｆ２１６及びｍｐｈｒ２１７であった。ＰＣＲ混合物を最初に９５℃で３分間変性し、その後９５℃で６０秒間の変性、５８℃で９０秒間のアニーリング及び６８℃で２分間の伸長の３０サイクルに供した。このＰＣＲ混合物は、前記の２個のプライマー１００ｐｍｏｌ、ｐＴＺ３５０９ １０ｎｇ、ｄＮＴＰ ０．５ｍＭ、１×Ｐｆｘ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＰＣＲエンハンサー溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰｆｘポリメラーゼ５Ｕ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。標準分子生物学法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、得られたＤＮＡアンプリコンを単離し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断しておいたベクターｐＵＣＤ６１５（Ｒｏｇｏｗｓｋｙら、１９８７）にクローニングした。
【００３３】
【化１】
【００３４】
ｍｐｈ（Ａ）オペロンを担う自殺ベクターを作製するためのプロトコール
ｍｐｈ（Ａ）オペロンを担う自殺トランスポゾンプラスミドｐＥＢＺ５１２の作製及び大腸菌ＳＭ１０１へのｍｐｈ（Ａ）オペロンの転位
ＰｓｔＩを使用して、プラスミドｐＴＺ３５０９（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００）から４．１ｋｂ ＤＮＡフラグメント上でｍｐｈ（Ａ）オペロンを切り出し、標準分子生物学法を用いて、自殺トランスポゾンベクターｐＢＳＬ１８０（ＡｌｅｘｅｙｅｖとＳｈｏｋｏｌｅｎｋｏ、１９９５）のＰｓｔＩ開裂部位、プラスミドの転移性部分にクローニングした。形質転換のために使用した宿主は、大腸菌ＣＣ１１８ Ｌａｍｂｄａｐｉｒ（Ｈｅｒｒｅｒｏら、１９９０）であった。この菌株は、プラスミドの複製に必要なπタンパク質を有する。作製したプラスミドをｐＥＢＺ５１２と称した。標準形質転換法を用いてこのプラスミドを大腸菌ＳＭ１０１に導入し、ｍｐｈ（Ａ）オペロンを担うトランスポゾンの転位後に形質転換体を選択した。この手順によってゲノムに組み込まれたＤＮＡのｍｐｈ（Ａ）オペロンを担う転位断片をＥＢＺ５１２と称した。標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて分子生物学的作業（ＤＮＡ単離、制限、連結及び形質転換）を実施した。
【実施例３】
【００３５】
ｍｐｈＲ（Ａ）をコードするプラスミドを作製するためのプロトコール
ｍｐｈＲ（Ａ）をコードするプラスミドｐＥＢＺ５１４の作製
プライマーＭＬＶ６３７及びＭＬＶ６３８及びｐＥＢＺ５１２−ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによってｍｐｈＲ（Ａ）の遺伝子領域を増幅した。リボソーム結合部位及びＳｐｈＩ開裂部位をプライマーＭＬＶ６３７に組み込み、ＳａｌＩ開裂部位をプライマーＭＬＶ６３８に組み込んだ。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ型エッペンドルフサーモサイクラーでＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ混合物を最初に９６℃で１０分間変性し、その後９６℃で６０秒間の変性、５６℃で９０秒間のアニーリング及び７２℃で４０秒間の伸長という３０回の伸長サイクルに供した。このＰＣＲ混合物は、前記の２個のプライマー１００ｐｍｏｌ、ｐＥＢＺ５１２−ＤＮＡ １０ｎｇ、ｄＮＴＰ ０．５ｍＭ、１×Ｐｆｘ緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＰＣＲエンハンサー溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰｆｘポリメラーゼ５Ｕ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。生成されたＤＮＡフラグメントを単離し、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで切断して、ＳｐｈＩとＳａｌＩで同様に切断しておいたベクターｐＡＣＹＣ１８４（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ、１９７８）に連結した。ｍｐｈＲ（Ａ）をコードする領域は、従って、対応する耐性遺伝子プロモーターの下流の、テトラサイクリン耐性遺伝子内に位置した。標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて分子生物学的作業（ＤＮＡ単離、制限、連結及び形質転換）を実施した。
【００３６】
【化２】
【００３７】
寒天平板拡散アッセイにおける発光測定
バイオセンサー、大腸菌ＳＭ１０１（ＥＢＺ５１２、ｐＥＢＺ５１１、ｐＥＢＺ５１４）をＬＢ培地で対数増殖後期まで好気的に増殖させ、標準微生物学的方法を用いて軟寒天に混合して、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ−寒天平板に塗布した。軟寒天が凝固した後、検定する物質を既に含む感受性アッセイディスク又は検定する物質を適用されている非充填アッセイディスク（Ｏｘｏｉｄ ＧｍｂＨ，Ａｍ Ｌｉｐｐｅｇｌａｃｉｓ ４−８，４６４８３ Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を寒天上に置いた。この寒天平板拡散アッセイを２８℃で２時間から４時間又は１５時間から２４時間インキュベートし、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈ ＬＢ９８０を用いて発光を記録した（図３、４及び５）。発光が促進される場合は、配置した試料の周囲の拡散帯域内で検出できる。検定する試料が、同時に、より長時間のインキュベーションの非常に好ましい実施形態において阻害帯域として示される、センサー生物に対する抗菌活性を有する場合は、発光の促進は、致死量以下の濃度範囲内でこの阻害の輪の外側で検出されうる。
【実施例５】
【００３８】
マクロライド（エリスロマイシン）産生生物の検出
バイオセンサーを使用して、大環状ポリケチドの生産生物として知られる微生物をもう１つ別の微生物からインサイチューで識別することも可能であった。このために、微生物バイオセンサー細胞を寒天平板拡散アッセイにおいて使用した。寒天ブロックを、軟寒天に包埋したバイオセンサー懸濁液上に置いた。これらの寒天ブロックを、エリスロマイシン生産生物として記述されているサッカロポリスポラ・エリトラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＤＳＭ４０５１７又はアビラマイシン生産生物として記述されているストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ４０７２１のいずれかで被覆した。もう１つの寒天ブロックは増殖物を含まなかった。発光の促進は、付加的に適用したエリスロマイシンアッセイディスク及びサッカロポリスポラ・エリトラエア被覆寒天ブロックに関してのみ検出可能であった（図５）。
【００３９】
（寄託）
ブタペスト条約の必要条件に従って、２００１年６月６日に、下記の菌株をｔｈｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託した：
【００４０】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｍｐｈ（Ａ）オペロン調節のモデル（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００による、修正）。
【図２】バイオセンサー系の生物学的成分の非常に好ましい実施形態のモデル。ＬｕｘＣ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＬｕｘＣ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＥ構造遺伝子、及びそれぞれ、ビブリオ・フィスシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼの構造遺伝子の産物。ｍｐｈＲ（Ａ）、ＭｐｈＲ（Ａ）、Ｎｏｇｕｃｈｉら、２０００参照。
【図３】大腸菌バイオセンサー系を用いた寒天平板拡散アッセイ及び発光測定。生物学的センサー成分の選択性の例示。被験物質に関する情報の中で示す数字は、μｇで表わした適用物質の量を表わす。
【図４】大腸菌バイオセンサー系を用いた寒天平板拡散アッセイ及び発光測定。時間の関数としての生物学的センサー成分の発光の促進の例示。被験物質に関する情報の中で示す数字は、μｇで表わした適用物質の量を表わす。
【図５】大腸菌バイオセンサー系を用いた寒天平板拡散アッセイ及び発光測定。エリスロマイシン産生サッカロポリスポラ・エリトラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）培養によるインサイチューでの発光の促進。標準物質エリスロマイシンに関する情報の中で示す数字は、μｇで表わした適用物質の量を表わす。
Claims (32)
- 大環状ポリケチド又は大環状ポリケチドを含む混合物をバイオセンサー系に供することを特徴とする、大環状ポリケチドを特定するための方法。
- 前記大環状ポリケチドがマクロライドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記バイオセンサー系が細胞レポーター−遺伝子アッセイ系であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記細胞レポーター−遺伝子アッセイ系が、その転写が大環状ポリケチドの作用として調節されるプロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
- 使用する前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
- 使用する前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 前記プロモーター領域が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域であること及び前記アッセイ系が大腸菌ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質をさらに含むことを特徴とする、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
- 前記ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質が、ｍｐｈＲ（Ａ）遺伝子を過剰発現することによって提供されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- 前記アッセイ系が、完全な大腸菌ｍｐｈ（Ａ）オペロン又はその部分をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
- 前記細胞が細菌であることを特徴とする、請求項３から９のいずれかに記載の方法。
- 前記細菌が大腸菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
- 前記大腸菌が、ＤＳＭ１４３３４の下に寄託されている大腸菌ＳＭ１０１（ＥＢＺ５１２、ｐＥＢＺ５１１、ｐＥＢＺ５１４）であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- 前記大腸菌が、ｌｐｘＡ２遺伝子及び／又はｔｏｌＣ遺伝子内に突然変異を有する菌株であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- その転写が、大環状ポリケチドの関数として調節されるプロモーター領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む宿主細胞。
- 前記大環状ポリケチドがマクロライドであることを特徴とする、請求項１４に記載の宿主細胞。
- 前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の宿主細胞。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１６に記載の宿主細胞。
- 前記プロモーター領域が大腸菌ｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域であること及び前記宿主細胞が大腸菌ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質をさらに含むことを特徴とする、請求項１４から１７のいずれかに記載の宿主細胞。
- 前記ＭｐｈＲ（Ａ）タンパク質が、ｍｐｈＲ（Ａ）遺伝子を過剰発現することによって提供されることを特徴とする、請求項１８に記載の宿主細胞。
- 完全な大腸菌ｍｐｈ（Ａ）オペロン又はその部分をさらに含むことを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の宿主細胞。
- 細菌細胞であることを特徴とする、請求項１４から２０のいずれかに記載の宿主細胞。
- 大腸菌であることを特徴とする、請求項２１に記載の宿主細胞。
- ＤＳＭ１４３３４の下に寄託されている大腸菌ＳＭ１０１（ＥＢＺ５１２、ｐＥＢＺ５１１、ｐＥＢＺ５１４）であることを特徴とする、請求項２２に記載の宿主細胞。
- 前記大腸菌が、ｌｐｘＡ２遺伝子及び／又はｔｏｌＣ遺伝子内に突然変異を有する菌株であることを特徴とする、請求項２２に記載の宿主細胞。
- 大環状ポリケチドを特定するための、請求項１４から２４のいずれかに記載の宿主細胞の使用。
- 大環状ポリケチドの作用として調節されるプロモーター領域を有するレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物。
- 前記大環状ポリケチドがマクロライドであることを特徴とする、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
- 前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニルコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項２６又は２７に記載のＤＮＡ構築物。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項２８に記載のＤＮＡ構築物。
- 前記プロモーター領域が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｐｈ（Ａ）遺伝子のプロモーター領域であることを特徴とする、請求項２６から２９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
- 環状ペプチドを特定するためのバイオセンサー系を開発するための、請求項１４から２４のいずれかに記載の宿主細胞又は請求項２６から３０のいずれかに記載のＤＮＡ構築物の使用。
- 請求項１から１３のいずれかで定義されるバイオセンサー系又は請求項１４から２４のいずれかに記載の宿主細胞を含むキット。
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