JP2004537282A - Use of biomolecular targets in the treatment and visualization of brain tumors - Google Patents

Abstract

The present invention relates to the use of proteins that are differentially expressed in primary brain tumor tissue compared to normal brain tissue as biomolecular targets for treatment of brain tumors. In particular, the invention relates to the use of immunotherapeutic and immunoimaging agents that specifically bind to one or more of the identified brain tumor protein targets. The present invention also provides compounds and pharmaceutically acceptable compositions for administration in the methods of the present invention. The present invention also provides novel splice variants of the protein PTP, PTP, PTPSM1 and PTPSM2. Also provided are nucleic acid probes specific for spliced mRNAs encoding these variants, and affinity reagents specific for the novel proteins.

Description

【００２３】
差次的に発現された遺伝子を表す転写物は、ディファレンシャルスクリーニング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、又は複数の遺伝子配列を含むアレイとのハイブリダイゼーションを含む当業者に既知の多様な方法を使用することにより、同定され得る。
【００２４】
「差次的な発現」とは、本明細書において使用されるように、遺伝子の時間的及び／又は組織的な発現パターンの量的及び質的な差をさす。従って、差次的に発現された遺伝子は、神経細胞疾患状態に比して正常状態において、又は実験状態に比して対照状態において、活性化又は不活化される発現を有し得る。そのような質的に制御された遺伝子は、対照試料又は腫瘍試料のいずれかで検出可能であり、両方では検出可能でない、特定の組織又は細胞型における発現パターンを示すと考えられる。検出可能とは、本明細書において使用されるように、当業者に周知のディファレンシャルディスプレイ、（逆転写）PCR、及び／又はノーザン分析の標準的な技術を介して検出可能なRNA発現パターンをさす。一般に、差次的な発現とは、疾患組織における発現と対照組織における発現との間に、少なくとも20％の変化、他の例においては、少なくとも2倍、3倍、5倍、又は10倍の差が存在することを意味する。差は、通常、統計的に有意、即ち偶然に起こる差の確率（P値）が、予め決定されたレベル（例えば、5％）より低いものである。通常、信頼区間（P値）は、＜0.05、より典型的には＜0.01、他の例においては＜0.001である。
【００２５】
又は、差次的に発現された遺伝子は、疾患状態に比して正常状態において、又は実験状態に比して対照状態において、調整される、即ち量的に増加又は減少する発現を有し得る。発現の差は、前記のような標準的な検出技術を介して可視化され得る程度に十分に大きいことのみを必要とする。一般に、mRNA又はタンパク質産物のいずれかの存在によって測定された発現レベルの差は、少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍、基底レベル（即ち、正常組織）と異なると考えられるが、10倍又は100倍又はそれ以上であってもよい。
【００２６】
T_BT経路遺伝子の同定は、遺伝子産物の物理的会合によって、又は既知の生理学的経路のデータベース同定によって実施され得る。タンパク質−タンパク質会合を検出するための方法としては、共免疫沈降、架橋、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムによる共精製がある。Chienら（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582により記載されたような2ハイブリッドシステムは、インビボにおけるタンパク質の会合を検出する。2ハイブリッドシステム又はその関連方法論は、既知の「ベイト」遺伝子タンパク質と相互作用するタンパク質に関して活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【００２７】
配列が差次的に発現されることが同定された後、その配列は、腫瘍の開始、進行、又は維持において遺伝子が役割を果たしているか否かを決定するため、機能確認プロセスに供され得る。そのような候補遺伝子は、極めて多様な細胞の状態又は活性と相関している可能性がある。「機能確認」という用語は、本明細書において使用されるように、候補遺伝子又はそのような遺伝子のセットの発現又は機能の調整が、組織又は生物全体のような細胞集団であり得る参照細胞に関する細胞の活性又は細胞の状態の検出可能な変化を引き起こすか否かを決定するためのプロセスをさす。検出される検出可能な変化又は改変は、参照細胞により示される任意の活性であり得る。改変が検出され得る活性又は状態の具体例には、表現型の変化（例えば、細胞形態学、細胞増殖、細胞生存、及び細胞死）；過去の感受性に対する抵抗性、又は以前には存在しなかった感受性の細胞による獲得；タンパク質／タンパク質相互作用；細胞移動；細胞内又は細胞間のシグナル伝達；細胞／細胞相互作用；細胞活性化（例えば、T細胞活性化、B細胞活性化、肥満細胞脱顆粒）；細胞構成成分（例えば、ホルモン、ケモカイン等）の放出；並びに代謝反応又は異化反応（これらに制限はされない）が含まれる。
【００２８】
候補遺伝子の機能確認には、多様な別法が使用可能である。RNAi技術のような方法が、使用され得る。アンチセンス技術も、候補遺伝子の機能確認に使用され得る。このアプローチでは、候補遺伝子のコーディング配列のセグメントと特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドが、それが導入される細胞における候補遺伝子の発現を阻害するために投与される。候補遺伝子が細胞内で果たしている機能的な役割は、候補遺伝子を一方又は両方の対立遺伝子において欠失させるか、修飾するか、又は阻害する遺伝子「ノックアウト」アプローチを使用して査定されてもよい。細胞又は動物は、場合により、さらなる分析の一部として野生型候補遺伝子を用いて再構成され得る。
【００２９】
本発明の一つの態様において、RNAi技術が、機能確認において使用される。本明細書において使用されるように、RNAi技術とは、候補遺伝子の発現を阻害するため、即ちその発現の「サイレンシング」のため、候補遺伝子を発現している細胞へ二本鎖RNAが導入されるプロセスをさす。dsRNAは、候補遺伝子との実質的な同一性を有するよう選択される。一般に、そのような方法は、まず、候補遺伝子の全部又は一部を含有している核酸を、一本鎖又は二本鎖のRNAへと転写することを含む。センスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖とが、dsRNAが形成されるよう適切な条件の下でアニーリングさせられる。得られたdsRNAが、様々な方法を介して参照細胞へと導入され、候補遺伝子の発現の減弱の程度が、様々な技術を使用して測定される。通常、阻害が細胞の状態又は細胞の活性を改変するか否かが検出される。dsRNAは、候補遺伝子の少なくとも一つのセグメントと実質的に同一であるよう調製される。候補遺伝子とdsRNAとの間の実質的な配列類似性のみが必要であるため、遺伝学的変異、進化上の分岐、及び多型から発生する二つの種の間の配列バリエーションは、容認され得る。さらに、dsRNAは、様々な修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含み得る。通常、dsRNAは2本の別々の相補的なRNA鎖からなる。しかしながら、いくつかの例において、dsRNAは、鎖が巻き戻りヘアピンループが形成されるような、自己相補的な一本のRNA鎖により形成されてもよい。形態に関わらず、RNA二重鎖形成は、細胞の内部又は外部で起こり得る。
【００３０】
dsRNAは、合成化学アプローチのみならず、インビトロ及びインビボの方法を含む当技術分野において既知の多数の方法のうちの任意のものに従い調製され得る。そのような方法の例には、Sadherら（Biochem.Int.14：1015、1987）；Bhattacharyya（Nature 343：484、1990）；及びLivacheら（米国特許第5,795,715号）（各々、参照として完全に本明細書に組み込まれる）により記載された方法が含まれるが、これらに制限はされない。一本鎖RNAは、酵素合成と有機合成との組み合わせを使用して、又は完全有機合成によっても作製され得る。合成化学法の使用により、dsRNAへ所望の修飾型ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を導入することが可能となる。dsRNAは、多数の確立されている方法に従い、インビボで調製されてもよい（Sambrookら（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版；Transcription and Translation（B.D.Hames及びS.J.Higgins編、1984）；DNA Cloning、第I及びII巻（D.N.Glover編、1985）；並びにOligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編、1984（各々、参照として完全に本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。dsRNAが形成された後は、それが細胞へ導入される。例えば、神経芽腫細胞系が、本明細書に記載された手法により同定された遺伝子の、腫瘍の成長、代謝、又は転移との機能的関連性を調査するためのモデル系として活用され得る。
【００３１】
多数の別法が、細胞、又は細胞培養物、組織、もしくは胚のような細胞集団へとdsRNAを送達するために使用され得る。例えば、RNAは直接的に細胞内に導入され得る。マイクロインジェクション（例えば、Zernicka-Goetzら（1997）Development 124：1133-1137；及びWiannyら（1998）Chromosoma 107：430-439）による投与のような様々な物理的方法が、一般に、そのような場合において使用される。細胞送達のためのその他の別法には、dsRNAの存在下での細胞膜の透過性化及び電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、又はリン酸カルシウムのような化学物質を使用したトランスフェクションが含まれる。多数の確立された遺伝子治療技術も、細胞へdsRNAを導入するために使用され得る。ウイルス粒子へウイルス構築物を導入することによって、例えば、発現構築物の細胞への導入、及び構築物によってコードされたRNAの転写が、効率的に達成され得る。
【００３２】
多数の別法が、候補遺伝子発現の妨害を検出するために（即ち、候補遺伝子サイレンシングを検出するために）使用可能である。一般に、発現の阻害は、候補遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルの減少の検出、遺伝子から転写されたmRNAのレベルの決定、及び／又は候補遺伝子発現と関連した表現型の変化の検出により検出される。
【００３３】
TBT遺伝子及びTBTポリペプチド
ARP-2（配列番号：7）は、アミノ酸1〜21の疎水性シグナル配列、およそアミノ酸配列22〜274のアミノ末端のコイルドコイルドメイン、及びほぼ残基275〜493のフィブリノーゲン様ドメインのような複数の機能ドメインを含んでいる、64kDa、一本鎖、酸性、アンジオポエチン様のタンパク質である。2個の主なイソ型が観察されており、一方は2.4Kb、他方は約4Kbのサイズである。目的のエピトープには、フィブリノーゲン領域、コイルドコイルドメイン、細胞外領域等が含まれる。ヒトARP-2のフィブリノーゲンドメインは、血管形成の目的のため、1個またはそれ以上の未知の受容体と相互作用するとの仮説が立てられている。ARP-2のこれらの分子との相互作用は、前述の構造モチーフのうちのいずれかによる可能性がある。
【００３４】
SPARC（配列番号：8）は、屈曲性N末端酸性ドメインI（およそ50アミノ酸）、フォリスタチン様（FS）ドメイン（およそ75残基）、及び1対のEF-ハンドループを含むC末端細胞外カルシウム結合（EC）ドメイン（およそ150残基）を含有している、存在量の多い、33kDa、一本鎖、酸性の細胞外カルシウム結合タンパク質である。N末端ドメインは、低親和性Ca2+結合部位、トランスグルタミナーゼ架橋部位を示し、細胞培養アッセイ法において細胞の延展を阻害する。SPARCの、いくつかの原繊維コラーゲン型及び基底膜コラーゲンIV型のトリプルヘリックスとのカルシウム依存性の結合は、ECドメインにマッピングされている。31,000kDaの分子量を有する骨SPARC及び33,000kDaの分子量を有する血小板SPARCという2個のイソ型が記載されている。ヒトSPARCのECドメインは、コラーゲンI、III、IV、及びVと相互作用し、ビトロネクチンと結合することが既知である（これらは全て、膠腫の周囲の細胞外マトリックスの構成成分である）。SPARCのこれらの分子との結合は、脳内の発癌及び新生物細胞の成長において重要な役割を果たしている場合がある。
【００３５】
c-MET（配列番号：9）は、I型膜タンパク質ヘテロダイマーである。170kDaの共通の一本鎖の前駆体から、翻訳後プロセシングにより、2個の異なる受容体バリアントが生成する。イソ型p190METは、ジスルフィド結合している50kDaのα鎖と145kDaのβ鎖とから形成されており、イソ型pl40Metは、50kDaのα鎖と、細胞質キナーゼドメインを欠いている85kDaのβ鎖から構成されている。この85kDaのβ鎖は、細胞表面に結合している膜貫通型糖タンパク質である可能性が高い。50kDaのα鎖とカルボキシル末端が短縮された75kDaのβサブユニットとを含有している短縮型c-METも記載されている。75kDa型は、翻訳後のタンパク質分解プロセシングにより発生し、膜貫通ドメインを欠いており、細胞から分泌される。分泌型及び膜結合型の両方が、興味深い。全長c-METのアミノ酸配列は、1408アミノ酸（Parkら（1987）P.N.A.S.84：6379-6383）及び1390アミノ酸（Pratら（1991）Mol.Cell.Biol.11：5954-5962）からなる。シグナル配列はN末端アミノ酸1〜24より構成されており；α鎖（アミノ酸24〜306）は細胞外ドメインを構成しており；β鎖は細胞外ドメイン（アミノ酸306〜932）を構成している。膜貫通セグメントは、アミノ酸933〜955であり、細胞内ドメインは、アミノ酸956〜1390より構成されている。
【００３６】
BEHAB（配列番号：12）は、2個のイソ型（細胞外マトリックスへと分泌される全長イソ型、及びグリコホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーを予測する疎水性カルボキシ末端を有する比較的短いイソ型）で存在する。BEHABは、免疫グロブリン様ループ及び2個のプロテオグリカンタンデムリピートを含むN末端ヒアルロナン（HA）結合ドメイン、C末端上皮増殖因子（EGF）様リピート、C型レクチン様ドメイン、並びに補体制御タンパク質（CRP）様ドメインを含有している。タンパク質の中央の領域は、グリコシル化、及びメタロプロテアーゼによる（シグナルペプチド分解後の成熟タンパク質のglu395-ser396の間の）タンパク質分解のための部位を含有している。分泌型イソ型の完全cDNAは、99kDaの912アミノ酸をコードする2878bpである。GPIイソ型は2558bpである。GPI結合型は、エキソン／イントロン結合部を通読し、それによりオープンリーディングフレームがさらに74ヌクレオチド下流の終止コドンまで拡張される転写物による「スプライスなし（no splice）」現象により生成する。BEHABの上方制御は、順応性のない成熟細胞外マトリックスを、細胞増殖を許容するより未熟なマトリックスへと戻し、それにより原発性脳腫瘍の進行を促進するための重大な工程である可能性がある。
【００３７】
CD-44（配列番号：10；11）は、2個の主要なスプライスバリアントとして発現されるプロテオグリカンである。CD-44Eは、上皮細胞から単離された150kDaタンパク質である。CD-44EはC末端の細胞質テール、23アミノ酸の疎水性膜貫通ドメイン、及び248アミノ酸のN末端細胞外領域を有している。細胞外ドメインは、O-グリコシル化されており、コンドロイチン硫酸とも結合する。さらに、CD-44Eは、天然型gp90ヘルメス（Hermes）の3個の免疫優性エピトープクラスタのうちの2個を有している。CD-44Eは、細胞外領域にさらに132個のアミノ酸を含有しており、CD-44Hは、造血細胞から単離された90kDaタンパク質である。さらに、CD-44R1及びCD-44R2は、造血細胞によって発現されている2個のイソ型である。90kDa CD-44Hイソ型の完全cDNA配列は、341アミノ酸タンパク質をコードする1795bpからなる。CD-44Hタンパク質は、341アミノ酸からなる90kDaの全体一次構造を有している。N末端は細胞外に位置し、及び細胞外ドメインは248アミノ酸からなる。C末端は、細胞内に位置し、細胞内ドメインは72アミノ酸からなり、膜貫通領域は、21アミノ酸からなる。CD-44遺伝子は、20個のエキソンを含有しており、そのうちのエキソン1〜5、15-17、及び19は、CD44Hイソ型をコードしている。介在しているエキソン6、6a、7〜14（v1〜v10とも呼ばれる）は、オルタナティブスプライシングを受け、細胞外ドメインの膜近位領域のアミノ酸202と203との間に挿入を有するバリアントイソ型を生成させる。CD-44は、ヒアルロン酸の主要な受容体のうちの一つである。正常なCNSにおいては、CD-44タンパク質は白質内の星状細胞に局在している。CD-44Hは、正常脳及び神経外胚葉由来腫瘍における優勢なイソ型であることが示されている。従って、CD-44の上方制御は、脳腫瘍の侵襲性及び遊走における重大な工程である可能性がある。
【００３８】
テトラスパニン（TSPAN3）（配列番号：13）は、253アミノ酸の膜結合型タンパク質である。TSPAN3は、アミノ酸12〜32、51〜71、86〜106、及び213〜233を含む4個の膜貫通ドメインを含有している。タンパク質は、2個の細胞外ドメイン、アミノ酸33〜50及び107〜212、並びに3個の細胞質ドメイン、アミノ酸1〜11、72〜85、及び234〜235を有している。第二の細胞外ドメインの147位、148位、及び197位のシステイン残基は、テトラスパニンファミリーにおいて高度に保存されており、適正なテトラスパニン機能にとって不可欠であると考えられている。
【００３９】
VIPR-2（配列番号：14）は、7回膜貫通型Gタンパク質受容体である。完全なVIPR-2タンパク質は、13個のエキソンによってコードされる。予測された438アミノ酸をコードしているオープンリーディングフレームの開始コドンは、エキソン1に位置しており、終結シグナルはエキソン13に位置している。5'非翻訳領域は、開始コドンの187bp上流にまで拡がっており、極めてGCリッチ（80％）である。ポリアデニル化シグナルは、終止コドンの2416bp下流に位置している。イントロンのサイズは、68bp（イントロン11）から45bp（イントロン4）までの範囲であり、ヒト遺伝子全体は117kbに及んでおり、cDNA配列は1317bpに及んでいる。最近の研究により、サイズが4.6kb及び2.3kbの2個のVIP-2受容体mRNAも単離された。受容体は、最初の22アミノ酸がシグナル配列を構成しており、残りのアミノ酸が、アミノ酸127〜148及び158〜178の2個の膜貫通領域、アミノ酸202〜227及び238〜261のさらに2個の膜貫通ドメイン、278〜303のもう一つ、並びに最後の327〜347及び359〜380の2個の膜貫通領域を構成しており、アミノ末端細胞外ドメインの残基57、87、及び91には3個の可能性のあるN結合型グリコシル化部位が見出される、7回膜貫通型タンパク質である。ヒトVIPR-2の細胞外ドメインは、PACAP-27、PACAP-38、VIP、及びセクレチンと結合する。
【００４０】
PTN又はOSF-1（配列番号：16）は、10個の保存されたジスルフィド結合システイン残基を含む、18kDa、一本鎖の分泌型タンパク質である。ヒトPTNの遺伝子配列は、5個のエキソン及び4個のイントロンからなる。エキソン1はアミノ酸配列をコードしておらず、エキソン2は32アミノ酸の疎水性シグナル配列をコードしており、エキソン3及び4は、アミノ末端及び10個のシステイン残基をコードしており、エキソン5は高度に塩基性のC末端ドメインをコードしている。成熟タンパク質は、エキソン2〜5によってコードされた136アミノ酸からなる。PTNは、RPTPβ及びζの細胞外ドメインと結合することが示されている。この結合は、RPTPの触媒活性を不活化し、PTNはRPTPβ及びζの3個の主要なイソ型全てと結合する。PTNは、シンデカン-3とも相互作用することが示されている。
【００４１】
OPN（配列番号：15）は、残基144〜148に推定細胞接着部位を有する、存在量の多い、34kDa、一本鎖のリン酸化された糖タンパク質である。3個のイソ型、OPN-A、OPN-B、及びOPNCが、オルタナティブスプライシングのような転写後修飾により生成することが同定されている。OPN-AとOPN-Bとは、タンパク質の残基58における14アミノ酸の付加によって異なっている。OPN-Bにはアミノ酸58〜71が存在せず、OPN-Cにはアミノ酸31〜57が存在しない。OPNは、負の電荷を有する、高度に親水性の分泌型タンパク質である。ヒト骨OPN（OPN-A）のcDNA配列は、ヒト骨肉腫から単離されたOPN（OPN-B）のcDNA配列より14アミノ酸少ない298アミノ酸からなるおよそ34kDAの全体構造を有している。OPN-AのcDNA転写物は、900ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1.5kbであり、そのうちの最初の16アミノ酸は疎水性であり、分泌型タンパク質のためのシグナル配列を構成している。OPN遺伝子は、オルタナティブスプライシングを受けバリアントイソ型を生成させる7個のエキソンを含有しており、最も一般的なバリアントは、OPN-Aの塩基280に位置する42bp（14アミノ酸）配列の付加である。ヒトOPNの細胞接着配列（アミノ酸144〜148）は、細胞接着に影響を与える（CD-44のような）様々な細胞表面タンパク質と相互作用すると考えられており、ほぼ排他的にアスパラギン酸残基から構成されている高度に酸性のストレッチ（アミノ酸72〜81）は、タンパク質内の無機質結合部位であると考えられている。
【００４２】
PTPζは、2個の膜結合型バリアント（全長：PTPζ-α及び比較的短いバージョンPTPζ-β）並びに1個の分泌型（ホスファカン（Phosphacan））を含むいくつかのスプライスバリアントとして存在する。イソ型PTPζ-αは、全長イソ型であり、配列番号：1及び配列番号：2に示されるような一次アミノ酸配列aa25〜2314を含有している（aa1〜24はシグナルポリペプチドである）。この全長型のPTPζは、I型膜タンパク質である。それは、シグナルペプチドの後に、炭酸脱水酵素様（CAH）ドメイン及びフィブロネクチンIII型様（FN3）ドメインを含有しており、その後に、システインを含まない長いスペーサー（S）ドメインを含有している。これは、グリコシル化され得る860アミノ酸長の挿入ドメインに続いている。それは、単一の膜貫通セグメントの後、細胞内領域に2個のホスファターゼドメインを有しているが、膜近位PTPaseドメインのみが触媒活性を有する（Krueger 1992）。
【００４３】
イソ型PTPζ-βにおいては、aa755〜1614（配列番号：2の番号付けに対応）が失われている。イソ型PTPζ-S（ホスファカン）は、PTPζ-αの細胞外ドメインを含む分泌型イソ型である。本出願人らは、ここで、2個の付加的な新規のスプライスバリアントPTPζSM1及びPTPζSM2（後に詳述される）を提供する。本出願人らは、公に使用可能なゲノム配列データベースを用いた、既知のスプライスバリアント配列と新規配列との比較により、新規の配列の位置を確認した。
【００４４】
全長PTPζのアミノ酸配列は、2307アミノ酸（参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,604,094号及び第6,160,090号を参照されたい）、又は2314アミノ酸（Kruegerら（1992）P.N.A.S.89：7417-7421）からなる。配列番号：2のアミノ酸1〜24は、膜貫通タンパク質の適正な配置を指図するシグナル配列である。成熟PTPζタンパク質の細胞外ドメインは、長い分泌型においては配列番号：2のアミノ酸25〜1635に相当し、短いイソ型においてはアミノ酸25〜754、1615〜1635に相当する。タンパク質の膜貫通領域は、配列番号2のアミノ酸1636〜1661に相当し、タンパク質の残りが細胞質ドメイン、アミノ酸1662-2314を形成している。
【００４５】
ヒトPTPζの細胞外ドメインは、テネイシン-C、テネイシン-R、プレイオトロフィン（NM_002825）、ミッドカイン（NM_002391）、FGF-2（XM_00366）、Nr-CAM（NM_005010）、L1/Ng-CAM、コンタクチン（contactin）（NM_001843）、N-CAM（XM_006332）、及びアキソニン（axonin）-1（NM_005076）と結合することが知られている。これらの分子のうち最初の5個は、膠腫における細胞外マトリックスの構成成分であるか、又は膠腫に存在することが既知の可溶性因子であり、後の4個は、神経細胞表面分子である。PTPζのこれらの分子との結合は、脳内の発癌及び新生物細胞の成長において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００４６】
タンパク質PTPζSM1（配列番号：3、4）は、3個の特有の付加的なカルボキシ末端アミノ酸を含む、PTPζ-αの最初の9個のエキソンによってコードされたアミノ酸を含む。これらは、エキソン9と10の間の遺伝子のイントロンに由来する付加的な3'mRNA配列（ヌクレオチド1262〜1272）によりコードされる。PTPζSM1クローンは、ヒト胎児脳cDNAライブラリーから単離され、いくつかのヒト神経膠芽腫細胞系において発現していることが示された。このSM1スプライスバリアントの発現は、原発性脳腫瘍試料においても確認された。タンパク質は、PTPζの細胞外ドメインのみを含み、細胞によって分泌されると予測される。従って、PTPζSM1は、細胞シグナル伝達又はメッセンジャー機能を果たす可能性があり、中枢神経系組織と会合しているか又はその一部である細胞の表面上の受容体と結合する可能性がある。PTPζSM1タンパク質は、主に、炭酸脱水酵素様ドメインを含む。
【００４７】
PTPζSM1の炭酸脱水酵素ドメインと、その他のヒト炭酸脱水酵素ドメイン（炭酸脱水酵素III、炭酸脱水酵素I、及び炭酸脱水酵素VIX[e］との比較が実施された。これらの触媒活性を有する炭酸脱水酵素とのアラインメントに基づき、CAドメインが炭酸脱水酵素酵素として機能する可能性は低いと考えられる。触媒亜鉛との結合に参加している3個のヒスチジンのうちの2個が、受容体のCAドメインからは失われている。活性を有する酵素においては、保存されたHxHWG{18、20｝ELHモチーフ（3個のヒスチジンが亜鉛と結合している）が存在するが、受容体においては、これがTFHWG{18、20}EMQへと修飾されている；即ち、3個の重要な亜鉛原子のうちの2個が失われている。比較のため、これらのヒスチジンのうちのわずか1個を欠いている炭酸脱水酵素関連タンパク質（CAH8）も、触媒活性を欠いていることが見出されている。
【００４８】
タンパク質PTPζSM2（配列番号5、6）は、PTPζ-αの全てのエキソン＋エキソン23と24の間の正確なリーディングフレーム内にある116ヌクレオチドの「エキストラ」エキソン（配列番号3のヌクレオチド6229〜6345）によりコードされたアミノ酸を含む。エキソン23aと名付けられたこのエキストラエキソンは、PTPζ遺伝子のエキソン23と24との間のイントロン配列の一部を含有している。PTPζSM2発現は、いくつかのヒト神経膠芽腫細胞系において確認され、原発性脳腫瘍試料においても確認された。PTPζSM2はPTPζαの全てのドメインを含むため、そのタンパク質は、膜結合型であると予測される。エキストラエキソンは、タンパク質の細胞質ドメインに存在し、従ってPTPζSM2のプロテインチロシンホスファターゼ機能を改変している可能性がある。
【００４９】
PTPζSM1及びPTPζSM2は、神経膠芽腫細胞系及び原発性腫瘍において発現していることが示されているため、これらのスプライスバリアントの発現のレベルは、病期決定又は膠芽腫細胞の特徴決定にとって有用である可能性がある。そのような細胞は、例えば、原発性腫瘍から抽出され得る。従って、本発明は、相互に比較された、又は既知のPTPζスプライスバリアントのうちの1個またはそれ以上と比較された、PTPζSM1又はPTPζSM2又は両方の相対発現レベルのモニタリングを提供する。一つの好ましい実施態様において、PTPζSM1の発現レベルが、PTPζSM2、PTPζα、PTPζβ、及びホスファカンより選択された少なくとも1個の他のスプライスバリアントと比較される。もう一つの好ましい態様において、PTPζSM2の発現のレベルが、PTPζSM1、PTPζα、PTPζβ、及びホスファカンより選択された少なくとも1個の他のスプライスバリアントと比較される。そのような比較は、定性的又は定量的になされ得る。
【００５０】
核酸
T_BT遺伝子の配列は、診断及び治療の方法、並びにコードされたポリペプチドの組換え作製等において有益である。本発明の核酸には、表1に提供された配列のうちの1個との高度の配列類似性又は配列同一性を有する核酸が含まれる。配列同一性は、ストリンジェントな条件、例えば50℃またはそれ以上及び0.1×SSC（9mM NaCl/0.9mMクエン酸Na）の下でのハイブリダイゼーションにより決定され得る。ハイブリダイゼーションの方法及び条件は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,707,829号を参照されたい。提供された核酸配列と実質的に同一の核酸、例えば対立形質バリアント、遺伝学的に改変された遺伝子のバージョン等は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、表1に提供された配列のうちの1個と結合する。核酸の調製に関するさらなる具体的な指針は、Fleuryら（1997）Nature Genetics 15：269-272；Tartagliaら、国際公開公報第96/05861号；及びChenら、国際公開公報第00/06087号（各々、完全に本明細書に組み込まれる）により提供される。
【００５１】
表1に挙げられた遺伝子は、適切なcDNA又はゲノムDNAライブラリーの中の遺伝子を検出するための適切なプローブの使用、共有された構造的特質を有するクローニングされたDNA断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、直接的な化学合成、及び増幅プロトコル（これらに制限はされない）を含む、当業者に周知の様々な方法を使用して入手され得る。ライブラリーは、好ましくは、正常脳又は脳腫瘍の細胞又は組織より調製される。クローニング法は、Berger及びKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enzymology、152（Academic Press,Inc.San Diego、CA）；Sambrookら（1989）Molecular Cloning-A Laboratory Manual（第2版）第1〜3巻（Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press、NY）；並びにCurrent Protocols（1994）（Greene Publishing Associates,Inc.とJohn Wiley and Sons,Incとの共同出版）に記載されている。
【００５２】
部分コーディング配列又は非コーディング配列を含有しているクローンから得られた配列は、RACE方法（Chenchikら（1995）CLONTECHniques（X）1：5-8）を使用することにより、完全コーディング領域を得るために使用され得る。オリゴヌクレオチドが、部分クローンの分析された配列から設計され、その後、完全コーディング配列をコードする逆転写されたmRNAを増幅するために使用され得る。又は、プローブが、遺伝子が転写される適切な細胞又は細胞系から調製されたcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。標的核酸が同定された後、それは、周知の増幅技術を使用して単離されクローニングされ得る。そのような技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Qβ-レプリカーゼ増幅、自律配列複製系（self-sustained sequence replication system）（SSR）、及び転写に基づく増幅系（TAS）が含まれる。そのような方法には、例えばMullisらの米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications（Innisら編）Academic Press Inc.San Diego、CA（1990）；Kwohら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173；Guatelliら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874；Lomellら（1989）J.Clin.Chem.35：1826；Landegrenら（1988）Science 241：1077-1080；Van Brunt（1990）Biotechnology 8：291-294；Wu及びWallace（1989）Gene 4：560；並びにBarringerら（1990）Gene 89：117に記載されたものが含まれる。
【００５３】
核酸のクローニングの代わりに、適当な核酸を化学合成することもできる。直接化学合成法には、例えばNarangら（1979）Meth.Enzymol.68：90-99のホスホトリエステル法；Brownら（1979）Meth.Enzymol.68：109-151のホスホジエステル法；Beaucageら（1981）Tetra.Lett.、22：1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第4,458,066号の固相法が含まれる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドが作製される。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって、又は一本鎖を鋳型として使用したDNAポリメラーゼによる重合によって、二本鎖DNAへと変換され得る。DNAの化学合成は、約100塩基の配列に制限される場合が多く、より長い配列は、より短い配列のライゲーションにより入手され得る。又は、配列をクローニングし、適切な制限酵素を使用して適切な部分配列を切断してもよい。
【００５４】
核酸は、cDNA又はゲノムDNA、並びにそれらの断片であり得る。「cDNA」という用語は、本明細書において使用されるように、天然型の成熟mRNA種に見い出される配列要素（エキソン並びに3'及び5'の非コーディング領域）の配置を共有している核酸を全て含むものとする。通常、mRNA種は、介在するイントロンが存在する場合にはそれが核RNAスプライシングによって除去された連続的なエキソンを有しており、本発明のポリペプチドをコードする連続的なオープンリーディングフレームを作出している。
【００５５】
目的のゲノム配列は、天然型染色体に通常存在するイントロンを全て含む、挙げられた配列において定義されたような開始コドンと終止コドンとの間に存在する核酸を含む。それは、成熟mRNAに見い出される3'及び5'の非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。それは、転写された領域の5'末又は3'末のいずれかに隣接している約1kb（それより大きくてもよい）ゲノムDNAを含む、プロモーター、エンハンサー等のような特定の転写及び翻訳の制御配列をさらに含んでいてもよい。コーディング領域の3'もしく5'のいずれかに隣接するゲノムDNA、又はイントロンに時々見い出されるような内部制御配列は、適正な組織特異的、段階特異的、又は疾患状態特異的な発現に必要とされる配列を含有しており、腫瘍細胞における発現の上方制御を調査するのに有用である。
【００５６】
本発明の核酸に特異的なプローブは、表1に開示された核酸配列を使用して生成させられ得る。プローブは、好ましくは、表1に提供された配列のうちの一つの対応する連続配列の少なくとも約18nt、25nt、又は50nt、又はそれ以上であり、通常、約2、1、又は0.5kb長未満である。好ましくは、プローブは、低い複雑度のマスキングのためのマスキングプログラムの適用の後、マスキングされずに残る連続配列に基づき設計される。二本鎖又は一本鎖の断片は、従来の方法によるオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素消化、PCR増幅等によって、DNA配列から入手され得る。プローブは、例えば放射性タグ、ビオチン化タグ、又は蛍光性タグにより標識され得る。
【００５７】
本発明の核酸は、一般的には完全な染色体以外として、実質的に純粋に単離され入手され得る。通常、核酸、DNA又はRNAのいずれかは、他の天然に存在する核酸配列を実質的に含まずに得られ、一般的には少なくとも約50％、通常は少なくとも約90％純粋であり、典型的には「組換え体」であり、例えば、天然に存在する染色体においては通常会合していない1個またはそれ以上のヌクレオチドと隣接している。
【００５８】
本発明の核酸は、直鎖状分子として提供されてもよいし、又は環状分子内に提供されてもよく、自律複製性分子（ベクター）、又は複製配列を含まない分子の中に提供されてもよい。核酸の発現は、当技術分野において既知の自己又は他の制御配列によって制御され得る。本発明の核酸は、トランスフェリンポリカチオン媒介DNA移入、裸の核酸又は封入された核酸を用いたトランスフェクション、リポソーム媒介DNA移入、DNAでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介移入等のような、当技術分野において使用可能な多様な技術を使用して、適当な宿主細胞へと導入され得る。
【００５９】
PCRのような増幅反応において使用するため、1対のプライマーが使用されると考えられる。プライマー配列の正確な組成は、本発明にとって重大ではないが、大部分の適用の場合、プライマーは、当技術分野において知られているようなストリンジェントな条件の下で本発明の配列とハイブリダイズすると考えられる。少なくとも約50nt、好ましくは少なくとも約100ntの増幅産物を生成させると考えられる1対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは、一般に既知であり、商業的なソフトウェアパッケージにおいて使用可能である。増幅プライマーは、DNAの相補鎖とハイブリダイズし、相互に向かって複製を開始させると考えられる。ハイブリダイゼーションプローブの場合、安定性及び結合親和性を改良するため、核酸類似体を使用することが望ましい場合がある。「核酸」という用語には、そのような類似体が包含されるものと理解されたい。
【００６０】
ポリペプチド
T_BT遺伝子によってコードされたポリペプチドには、スクリーニング法のための用途、抗体を作製するための試薬としての用途、治療薬としての用途等がある。そのようなポリペプチドは、天然起源からの単離、組換え法、及び化学合成により作製され得る。さらに、サイレント変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、付加、又は置換を含有しており、従って機能的に等価な差次的に発現される、又は経路の遺伝子産物を産生する、機能的に等価なポリペプチドも、有益であり得る。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づき作成され得る。「機能的に等価な」とは、本明細書において使用されるように、表1に提供されたような虚血関連遺伝子によりコードされたポリペプチドと実質的に類似のインビボ活性を示すことができるタンパク質をさす。
【００６１】
ポリペプチドは、当技術分野において周知の技術を使用して、組換えDNA技術によって作製され得る。当業者に周知の方法が、コーディング配列及び適切な転写／翻訳調節シグナルを含有している発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝学的組換えが含まれる。又は、目的のポリペプチドをコードすることができるRNAが、化学合成されてもよい。
【００６２】
典型的には、コーディング配列は、比較的大量の遺伝子産物を作製するため、所望の宿主細胞において機能性のプロモーターの調節下に置かれる。極めて多様なプロモーターが周知であり、特定の適用に応じて、本発明の発現ベクターにおいて使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性を有する細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位等のようなその他の発現調節配列も、場合により含まれていてもよい。これらの調節配列を1個またはそれ以上含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。発現は、プロモーター、及び特定の宿主細胞にとって適切なその他の制御剤を使用して、原核生物及び真核細胞において達成され得る。例示的な宿主細胞には、大腸菌、その他の細菌宿主、酵母、並びにCOS細胞系、CHO細胞系、及びHeLa細胞系、並びに骨髄腫細胞系のような様々な高等真核細胞（これらに制限はされない）が含まれる。
【００６３】
哺乳動物宿主細胞においては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等を含む多数のウイルスに基づく発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三成分リーダー配列とライゲートさせられる。次いで、このキメラ遺伝子が、インビトロ又はインビボの組換えによってアデノウイルスゲノムへと挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1又はE3）における挿入は、生存可能であり、感染宿主において差次的に発現される又は経路の遺伝子タンパク質を発現することができる組換えウイルスをもたらすと考えられる。
【００６４】
特定の開始シグナルも、遺伝子の効率的な翻訳のために必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接配列が含まれる。自己の開始コドン及び隣接配列を含む完全遺伝子が適切な発現ベクターに挿入される場合には、付加的な翻訳調節シグナルは必要とされない場合がある。しかしながら、遺伝子コーティング配列の一部のみが挿入される場合には、外因性の翻訳調節シグナルが提供されなければならない。これらの外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然であってもよいし合成であってもよい様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等の包含によって増強され得る。
【００６５】
さらに、宿主細胞株としては、挿入された配列の発現を調整するか、又は所望の特定の様式で遺伝子産物の修飾及びプロセシングを行うものが選択され得る。そのようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、分解）は、タンパク質の機能にとって重要である場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的な特定のメカニズムを有している。発現された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを保証するため、適切な細胞系又は宿主系が選択され得る。この目標のため、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を保有している真核宿主細胞が使用され得る。そのような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等が含まれるが、これらに制限はされない。
【００６６】
組換えタンパク質の長期的な高収量の作製のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、差次的に発現された又は経路の遺伝子タンパク質を安定的に発現する細胞系が工作され得る。ウイルスの複製開始点を含有している発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節要素によって調節されたDNA及び選択可能マーカーにより、宿主細胞が形質転換され得る。外来DNAの導入の後、工作された細胞は、濃縮培地中で1〜2日間増殖させられ、次いで選択培地へと切り替えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、染色体へプラスミドを安定的に組み込み、フォーカスを形成するよう増殖することを可能にする。そのフォーカスが、クローニングされ、細胞系へと繁殖させられ得る。この方法は、有利には、標的タンパク質を発現する細胞系を工作するために使用され得る。そのような工作された細胞系は、T_BTタンパク質の内因性の活性に影響する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（これらに制限はされない）を含む多数の選択系が使用され得る。代謝拮抗薬耐性は、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroのための選択の基礎として使用され得る。
【００６７】
ポリペプチドは、直接的又は間接的に標識され得る。¹²⁵Iのような放射性同位体；基質に露された場合に、検出可能な比色シグナル又は光を発生する酵素標識系；及び蛍光性標識（これらに制限はされない）を含む、多様で適当な標識系のうちの任意のものが使用され得る。間接標識には、目的のポリペプチドと特異的に結合する標識された抗体のようなタンパク質の使用が含まれる。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、及びFab発現ライブラリーにより産生された断片（これらに制限はされない）が含まれる。
【００６８】
発現の後、組換えポリペプチドは、硫安沈殿、アフィニティカラム、イオン交換及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当技術分野の標準的な手法によって精製され得る（一般には、R.Scopes、Protein Purification、Springer--Verlag、N.Y.（1982）、Deutscher、Methods in Enzymology 第182巻：Guide to Protein Purification.、Academic Press,Inc.N.Y.（1990）を参照されたい）。
【００６９】
組換え法の別法として、ポリペプチド及びオリゴペプチドは化学合成されてもよい。そのような方法には、典型的には、固相アプローチが含まれるが、溶液に基づく化学及び組み合わせ又は固相アプローチと溶液アプローチとの組み合わせが使用されてもよい。タンパク質を合成するための固相方法論の例は、Merrifield（1964）J.Am.Chem.Soc.85：2149；及びHoughton（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.、82：5132に記載されている。T_BTタンパク質の断片を合成し、次いでつなぎ合わせてもよい。そのような反応を実施するための方法は、Grant（1992）Synthetic Peptides：A User Guide、W.H.Freeman and Co.、N.Y.；及び「Principles of Peptide Synthesis」（Bodansky及びTrost編）、Springer-Verlag,Inc.N.Y.、（1993）に記載されている。
【００７０】
様々な目的のため、例えば免疫原として、T_BTポリペプチド全体又はそれに由来する断片が使用されてもよい。好ましくは、例えば細胞外ドメインの1個またはそれ以上の8〜30アミノ酸ペプチド部分が使用され得るが、10〜20の範囲のペプチドが経済的にはより望ましい。この範囲のカスタム合成ペプチドは、多数の供給元から入手可能であり、KLH又はBSAに結合したものを注文することもできる。又は、30アミノ酸を超えるペプチドは、固相法によって合成されてもよいし、又は適当な組換えタンパク質産生系において組換え作製されてもよい。適正なタンパク質のグリコシル化及びプロセシングを保証するため、動物細胞系（例えば、Sf9又はその他の昆虫細胞、CHO又はその他の哺乳動物細胞）が好ましい。
【００７１】
特異的結合メンバー
「特異的結合メンバー」又は「結合メンバー」という用語は、本明細書において使用されるように、特異的結合対、即ち一方の分子（即ち、第1の特異的結合メンバー）が、化学的又は物理的な手段により他方の分子（即ち、第2の特異的結合メンバー）と特異的に結合するような2個の分子、通常2個の異なる分子のメンバーをさす。特異的結合対の相補メンバーは、リガンドと受容体；又は受容体と対応受容体、と呼ばれる場合もある。本発明の目的のため、例えばアッセイ法が、既知の結合対の会合を妨害する化合物を検出するため行われる場合、2個の結合メンバーは、相互に会合することが既知のものであり得る。又は、目的の化合物の結合パートナーであると予測される候補化合物が使用されてもよい。
【００７２】
目的の特異的結合対には、炭水化物とレクチン；相補的なヌクレオチド配列；ペプチドリガンドと受容体；エフェクター分子と受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；脂質と脂質結合タンパク質等が含まれる。特異的結合対には、最初の特異的結合メンバーの類似体、誘導体、及び断片が含まれ得る。例えば、受容体とリガンドの対には、ペプチド断片、化学合成されたペプチド模倣体、標識されたタンパク質、誘導体化されたタンパク質等が含まれ得る。
【００７３】
好ましい態様において、特異的結合メンバーは抗体である。「抗体」又は「抗体部分」という用語には、1個またはそれ以上の非共有結合性の結合相互作用が分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化するような、エピトープに適合し、それを認識する特異的な形状を有する、任意のポリペプチド鎖含有分子構造が含まれるものとする。脳腫瘍タンパク質標的のうちの一つと特異的に結合する抗体は、抗脳腫瘍タンパク質標的抗体、又はα（TBT）と呼ばれる。特定の構造とその特異的エピトープとの特異的又は選択的な適合は、「鍵と鍵穴（lock and key）」適合と呼ばれることもある。原型抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての起源、例えばヒト、げっ歯動物、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、その他の哺乳動物、ニワトリ、その他のトリ等に由来する全ての型の免疫グロブリン、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等が、「抗体」と見なされる。本発明において使用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体は、細胞培養又は組換えによって作製すること、及び抗原性を減少させるために修飾することが可能であるため、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７４】
ポリクローナル抗体は、前記のように製剤化された抗原組成物を産生動物に注射することによる標準的なプロトコルにより作製され得る。例えば、HarlowとLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照されたい。一つのそのような技術においては、まず、脳腫瘍タンパク質標的のポリペプチドの抗原性部分を含むT_BT抗原が、極めて多様な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、又はヤギ）のうちの任意のものに注射される。完全タンパク質、又はタンパク質の比較的大きなセクションを使用する場合、抗体は、タンパク質及び適当なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、フロイント完全アジュバント、水中油乳剤等）で産生動物を免疫感作することにより作製され得る。比較的小さなペプチドが使用される場合には、免疫刺激性（immunostimulatory）複合体を作成するため、ペプチドを比較的大きな分子と結合させることが有利である。そのような使用のための商業的に入手可能な一般的に使用されている結合タンパク質には、ウシ血清アルブミン（BSA）及びスカシガイヘモシアニン（KLH）が含まれる。特定のエピトープに対する抗体を作製するためには、完全配列に由来するペプチドが使用され得る。又は、脳腫瘍タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を生成させるためには、ポリペプチドが、オボアルブミン、BSA、又はKLHのような担体タンパク質につながれた場合、優れた免疫応答が誘発され得る。ペプチド複合体が、好ましくは1回またはそれ以上の追加免疫感作が組み込まれた予定されたスケジュールに従い、動物宿主へと注射され、動物から定期的に採血が行われる。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば適当な固体支持体とカップリングしたポリペプチドを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって、そのような抗血清から精製され得る。
【００７５】
又は、モノクローナル抗体については、接種を受けた動物の脾臓に由来する細胞のような、刺激された免疫細胞を単離することにより、ハイブリドーマが形成され得る。次いで、これらの細胞を、細胞培養物中で無限に複製することができる、骨髄腫細胞又は形質転換細胞のような不死化細胞と融合させ、それにより免疫グロブリン分泌細胞系を生成させることができる。使用される不死細胞系としては、好ましくは、ある種の栄養素の使用に必要な酵素が欠損しているものが選択される。（骨髄腫のような）多くのそのような細胞系が、当業者に既知であり、例えば、チミジンキナーゼ（TK）又はヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）を含む。これらの欠損は、例えばヒポキサンチンアミノプテリンチミジン（HAT）上で増殖する能力による、融合細胞の選択を可能にする。
【００７６】
好ましくは、使用される不死融合パートナーは、免疫グロブリンを分泌しない系に由来する。得られた融合細胞、又はハイブリドーマは、融合細胞の生存を可能にし、非融合細胞の生存は可能にしない条件の下で培養され、得られたコロニーが、所望のモノクローナル抗体の産生に関してスクリーニングされる。そのような抗体を産生するコロニーは、クローニングされ、繁殖させられ、大量の抗体を産生するよう増殖させられる。例えば、Kohler及びMilstein、1975 Nature 256：495（これの開示は参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００７７】
次いで、分泌ハイブリドーマに由来する大量のモノクローナル抗体が、マウスの腹腔にクローンを注射し、そこから腹水を採取することにより作製され得る。好ましくはプリスタン、又はその他の何らかの腫瘍プロモーターでプライミングされ、化学的又は放射線的に免疫抑制されるマウスは、当業者に既知の様々な適当な系統のうちの任意のものであり得る。腹水がマウスから採取され、例えばCMセファロース（Sepharose）カラム又はその他のクロマトグラフィー手段によって、それらからモノクローナル抗体が精製される。又は、ハイブリドーマを、インビトロで又は懸濁培養物として培養してもよい。回分培養、連続培養、又はその他の適当な培養法が使用され得る。次いで、モノクローナル抗体が、培地又は上清から回収される。
【００７８】
脳腫瘍タンパク質標的の様々なイソ型に対するいくつかのモノクローナル抗体が、現在、商業的供給元より入手可能である。例えば、入手可能な商業的抗体の排他的ではないリストには、SPARC／オステオネクチンについては、Zymedのマウス抗ウシMab（カタログ番号33-5500）；c-METについてはZymedのウサギ抗ヒトポリクローナル、及びRDIのウサギ抗ヒトMAb；CD44については、RDIのマウス抗ヒトMAb、及びヒアルロン酸とその受容体CD44との結合を阻止することが既知のLab visionのマウス抗ヒトMab「CD44/H-CAM Ab-2」；ブレビカン／BEHABについては、BD Transduction Lab.のマウス抗ヒトMAb；VIP2受容体については、Exalphaのマウス抗ラットMAb；ラミニン受容体については、Lab visionのマウス抗ヒトMab「ラミニン受容体Ab-1」；オステオポンチンについては、rh-オステオポンチンに対して作製されたChemiconのラット抗ヒトMAb「MAB3057」；プレイオトロフィンについては、rh-プレイオトロフィンを認識するR＆Dの抗ヒトポリクローナル「BAF252」、及びrh-プレイオトロフィンを検出するOncogeneのヤギ抗ヒトポリクローナル「PC187L」；PTPζ-α及びPTPζ-βについては、BD Transduction Lab.のマウス抗ヒトMAb、及び膜貫通型イソ型及び可溶型イソ型（ホスファカン、PTPζ-S）の両方を認識するChemiconのマウス抗ヒトMabが含まれる。これらの抗体、特に（重鎖及び軽鎖の抗原性定常領域の相当部分が排除されている）Fab断片型は、本発明の組成物において使用するのに適している。しかしながら、そのような抗体は、後に概説される手法のうちの一つによって、ヒト化又はキメラ化されることが好ましい。
【００７９】
さらに、抗体、又は抗原結合断片は、遺伝子工学によって作製され得る。この技術においては、標準的なハイブリドーマ手法と同様に、抗体産生細胞が、所望の抗原又は免疫原に対して感作される。免疫脾臓細胞又はハイブリドーマから単離されたメッセンジャーRNAが、PCR増幅を使用してcDNAを作成するための鋳型として使用される。各々、初期の抗原特異性を保持している1個の重鎖遺伝子及び1個の軽鎖遺伝子を含有しているベクターのライブラリーが、増幅された免疫グロブリンcDNAの適切なセクションの発現ベクターへの挿入によって作製される。コンビナトリアルライブラリーは、重鎖遺伝子ライブラリーを軽鎖遺伝子ライブラリーと組み合わせることにより構築される。これは、（抗体分子のFab断片又は抗原結合断片と類似している）重鎖及び軽鎖を共発現するクローンのライブラリーをもたらす。これらの遺伝子を保持しているベクターは、宿主（例えば、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又はその他の適当なタンパク質産生宿主細胞）へと共にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた宿主において抗体遺伝子合成が誘導された場合、重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質が自己会合し、抗原又は免疫原を用いたスクリーニングにより検出され得る活性抗体が生成する。
【００８０】
好ましくは、組換え抗体は、昆虫細胞又は哺乳動物細胞のような免疫グロブリン鎖のグリコシル化及びプロセシングを正確に行う組換えタンパク質産生系において作製される。抗体の作製のため組換えバキュロウイルスを使用する、昆虫細胞の使用の利点は、バキュロウイルス系が、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞系よりはるかに迅速に、変異抗体の産生を可能にするという点である。さらに、昆虫細胞は、原核細胞が行わない真核生物タンパク質のプロセシング及びグリコシル化を正確に行うことが示されている。最後に、外来タンパク質のバキュロウイルス発現は、ウイルス感染後期の全細胞タンパク質の50〜75％もを構成することが示されており、従って、この系は、ミリグラム量の組換え抗体を作製する優れた手段である。
【００８１】
（アナフィラキシーショックのような）ヒトにおける激烈又は有害な免疫応答を誘導する傾向が低く、抗体治療剤又はイメージング剤の反復投薬を防止すると考えられる免疫応答のプライミングの傾向も低い抗体は、本発明における使用にとって好ましい。脳は血液脳関門の背後に比較的隔離されているにも関わらず、やはり、増加した白血球浸潤及び炎症という形態で免疫応答が起こる場合がある。腫瘍に対する増加した免疫応答は望ましいが、同時に起こる治療剤又はイメージング剤の結合及び不活化は、一般に、この利益を上回る。従って、ヒトに投与された場合に、より少ない免疫応答を生じるヒト化抗体、キメラ抗体、又は異種ヒト抗体が、本発明における使用にとって好ましい。
【００８２】
キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を作製するために、マウス（又は、その他の動物に由来する）ハイブリドーマクローンから得られたマウスの軽鎖及び重鎖の可変領域（VK及びVH）を、ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせることにより、組換え手段によって作成され得る。そのようなキメラ抗体の作成は、当技術分野において周知であり、（例えば、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,624,659号に記載されたような）標準的な手段によって達成され得る。ヒト化抗体は、はるかにヒト様の免疫グロブリンドメインを含有し、動物由来の抗体の相補性決定領域のみを取り込むよう、工作される。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検討し、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることにより達成される。一見複雑であるが、そのプロセスは実際は簡単である。例えば、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第6,187,287号を参照されたい。
【００８３】
又は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンを産生するよう遺伝学的に改変された動物から作製され得る。そのような動物を生成させ、それらから抗体を導出するための技術は、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第6,162,963号及び第6,150,584号に記載されている。
【００８４】
又は、単鎖抗体（下記のようなFv）が、ヒト可変領域を含有しているファージライブラリーから作製され得る。米国特許第6,174,708号を参照されたい。単鎖免疫毒素LMB-7［B3（Fv）-PE38］のクモ膜下腔内投与は、ラットモデルにおいて癌性髄膜炎を治癒させることが示されている（全て参照として完全に本明細書に組み込まれるProc.Natl.Acad.Sci. U S A 92、2765-9）。
【００８５】
完全免疫グロブリン（又はそれらの組換え対応物）に加え、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片（例えば、Fab'断片、F(ab')₂断片、又はその他の断片）が、本発明における抗体部分として有用である。そのような抗体断片は、フィシン、ペプシン、パパイン、又はその他のプロテアーゼによる分解により、完全免疫グロブリンから生成し得る。「断片」又は最小免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技術を使用して設計され得る。例えば、本発明において使用するための「Fv」免疫グロブリンは、ペプチドリンカー（例えば、αヘリックス又はβシートモチーフを形成しないポリグリシン又はその他の配列）を介して、軽鎖可変領域を重鎖可変領域と連結することにより作製され得る。
【００８６】
Fv断片は、重鎖可変ドメイン（V_H）と軽鎖可変ドメイン（V_L）とのヘテロダイマーである。完全IgGに存在する重鎖ドメインと軽鎖ドメインとのヘテロダイマーは、例えば、ジスルフィド結合によって接続されている。V_HとV_Lとがペプチドリンカーによって接続されている組換えFvは、典型的には安定である。例えば、Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883（1988）及びBirdら、Science 242：423-426（1988）（いずれも完全に参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらは、特異性及び親和性を保持していることが見出されており、腫瘍のイメージング及び腫瘍療法用の組換え免疫毒素の作成に有用であることが示されている単鎖Fvである。しかしながら、研究者らは、単鎖Fvの一部は減少した抗原に対する親和性を有していること、及びペプチドリンカーが結合を妨害する場合があることを見出した。完全に参照として本明細書に組み込まれる米国特許第6,147,203号に記載されるように、V_H領域とV_L領域との間の安定化ジスルフィド結合を含む、改良されたFvも、作成されている。これらの最小抗体のうちの任意のものが、本発明において使用され得るが、HAMA反応を回避するためにヒト化されたものが、本発明の態様における使用にとって好ましい。
【００８７】
さらに、化学的リンカー、蛍光色素、酵素、基質、化学発光部分等のような検出可能部分、又はストレプトアビジン、アビジン、もしくはビオチン等のような特異的結合部分が追加された誘導体化された免疫グロブリンが、本発明の方法及び組成物において使用され得る。便宜上、「抗体」又は「抗体部分」という用語は、一般に、脳腫瘍タンパク質標的のエピトープと特異的に結合する分子をさすために使用されるが、この用語には、前記のような免疫グロブリン、誘導体、断片、組換え又は工作された免疫グロブリン、及び修飾された免疫グロブリンが全て包含されると考えられる。
【００８８】
候補抗T_BT抗体は、任意の適当な標準的な手段により、抗T_BT活性に関して試験され得る。一次スクリーニングとして、抗体は、免疫原、又は完全な脳腫瘍タンパク質標的細胞外ドメインもしくはタンパク質との結合に関して試験され得る。二次スクリーニングとして、抗T_BT候補は、適切な腫瘍細胞系、又は原発性腫瘍組織試料との結合に関して試験され得る。これらのスクリーニングのため、抗T_BT候補抗体は検出のために標識され得る。脳腫瘍タンパク質標的との選択的な結合が確立された後、候補抗体、又は下記のようにして作製された抗体複合体は、下記のように、適切な腫瘍細胞系のようなインビボモデル、又はマウスもしくはラットのヒト脳腫瘍モデルにおいて、適切な活性（即ち、腫瘍細胞成長を減少させ、かつ／又は腫瘍細胞の可視化を補助する能力）に関して試験され得る。
【００８９】
T_BTタンパク質の生物学的活性を改変する抗体は、神経膠芽腫細胞培養物研究又はマウス／ラットCNS腫瘍モデル研究のような機能的なフォーマットにおいてアッセイされ得る。活性の神経膠芽腫細胞モデルにおいては、まず、タンパク質の発現が、使用される特定の細胞株において確認される。必要であれば、細胞系は、原発性腫瘍に見い出されるものに匹敵するレベルでタンパク質を発現するよう、適切な構成性プロモーターの調節下にあるタンパク質のコーディング配列により安定的にトランスフェクトされ得る。次いで、候補機能改変抗タンパク質抗体の存在下での神経膠芽腫細胞の生存能力が決定される。細胞生存アッセイ法に加え、細胞遊走アッセイ法が、細胞の腫瘍様挙動に対する候補抗体療法剤の効果を決定するために使用され得る。又は、脳腫瘍タンパク質標的が血管形成に関与している場合には、候補抗体治療薬の、腫瘍生物学における重要な機能である血管新生を阻害する能力を決定するためのアッセイ法が使用され得る。
【００９０】
同様に、ヒト脳腫瘍のインビボモデル、特にヌードマウス／SCIDマウスモデル又はラットモデルが記載されており、例えばAntunesら（2000）J Histochem Cytochem 48、847-58；Priceら（1999）Clin Cancer Res 5、845-54；及びSennerら（2000）Acta Neuropathol（Berl）99、603-8を参照されたい。腫瘍モデルにおいてタンパク質の正確な発現が確認された後は、これらのモデルにおける腫瘍塊に対する候補抗タンパク質抗体の効果が評価され、その際、腫瘍成長の減少又は腫瘍塊の縮小を、抗タンパク質抗体候補のタンパク質活性を改変する能力の指標とする。従って、タンパク質の発癌における特定の生物分子的役割に関する直接的な知識なしに、適切な抗腫瘍効果を示す抗体が選択され得る。
【００９１】
アレイ
アレイは、試料中の多数のポリヌクレオチドをアッセイすることができるハイスループット技術を提供する。本発明の一つの局面において、腫瘍細胞において上方制御又は下方制御されることが既知のその他の配列をさらに含んでいてもよい、T_BT遺伝子、T_BTタンパク質、又はT_BT抗体のうちの一つまたはそれ以上を含み、好ましくはこれらの配列全てを含むアレイが構築される。この技術は、差次的な発現に関して試験するための道具として使用され得る。結合したプローブを有する二次元マトリックス又はアレイにおいて、アレイは、ポリヌクレオチドプローブを基板（例えば、ガラス、ニトロセルロース等）へとスポットすることにより作出され得る。プローブは、共有結合、又は疎水性相互作用のような非特異的な相互作用のいずれかにより、基板へと結合させられ得る。アレイを構築するための技術、及びこれらのアレイを使用する方法は、例えば、Schenaら（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93（20）：10614-9；Schenaら（1995）Science 270（5235）：467-70；Shalonら（1996）Genome Res. 6（7）：639-45、米国特許第5,807,522号、欧州特許第799 897号；国際公開公報第97/29212；国際公開公報第97/27317；欧州特許第785 280号；国際公開公報第97/02357号；米国特許第5,593,839号；米国特許第5,578,832号；欧州特許第728 520号；米国特許第5,599,695号；欧州特許第721 016号；米国特許第5,556,752号；国際公開公報第95/22058号；及び米国特許第5,631,734号に記載されている。
【００９２】
アレイにおいて使用されるプローブは、様々な型のものであってよく、例えば、比較的短い長さ（例えば、20mer又は25mer）の合成プローブ、cDNA（全長又は遺伝子の断片）、増幅されたDNA、（例えば制限酵素により生成した）DNAの断片、及び逆転写されたDNAを含み得る。カスタムアレイ及び一般的アレイの両方が、差次的な発現レベルの検出において使用され得る。カスタムアレイは、mRNA遺伝子配列の特定の予め選択された内部配列、又はそれらから調製された増幅産物とハイブリダイズするプローブを使用して調製され得る。
【００９３】
アレイは、例えば、遺伝子の差次的な発現を検討するため、および遺伝子機能を決定するために使用され得る。例えば、アレイは、試験細胞と対照細胞との間で比較されたT_BT遺伝子の差次的な発現を検出するために使用され得る。アレイの例示的な使用は、例えばPappalaradoら（1998）Sem.Radiation Oncol.8：217；及びRamsay.（1998）Nature Biotechnol.16：40にさらに記載されている。さらに、アレイを使用した検出法に対する多くのバリエーションは、充分に、当技術分野の技術の範囲内、および本発明の範囲内にある。例えば、プローブを固体支持体へと固定化するのではなく、被験試料を固体支持体へと固定化し、次いでそれをプローブと接触させることが可能である。発現分析におけるマイクロアレイの使用に関するさらなる考察は、例えば、Dugganら、Nature Genetics Supplement 21：10-14（1999）；Bowtell、Nature Genetics Supplement 21：25-32（1999）；Brown及びBotstein、Nature Genetics Supplement 21：33-37（1999）；Coleら、Nature Genetics Supplement 21：38-41（1999）；Debouck及びGoodfellow、Nature Genetics Supplement 21：48-50（1999）；Bassett,Jr.ら、Nature Genetics Supplement 21：51-55（1999）；並びにChakravarti、Nature Genetics Supplement 21：56-60（1999）に見い出され得る。
【００９４】
発現レベルの検出のためには、通常、核酸が被験試料から得られ、直接標識されるか又は標識されたcDNAへと逆転写される。次いで、標識された核酸を含有している被験試料が、アレイと接触させられる。試料中に存在する任意の標識された核酸がプローブとハイブリダイズするのに十分な時間を経た後、典型的には、未結合の核酸を除去し、アレイの核酸プローブとの非特異的な結合を最小限に抑えるため、アレイは1回またはそれ以上の高ストリンジェンシー洗浄に供される。標識された配列の結合は、多様な商業的に入手可能なスキャナー及び添付のソフトウェアプログラムのうちの任意のものを使用して検出される。
【００９５】
例えば、試料由来の核酸が蛍光標識で標識される場合、ハイブリダイゼーション強度は、例えば光子計数モードの走査型共焦点顕微鏡により決定され得る。適切な走査装置は、例えばTrulsonらの米国特許第5,578,832号及びSternらの米国特許第5,631,734号により記載されており、GeneChip（商標）標識としてAffymetrix,Inc.より入手可能である。いくつかの型の標識は、酵素法によって増幅され得るシグナルを提供する（例えば、Broudeら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91、3072-3076（1994）を参照されたい）。例えば、放射性同位体、発色団、磁性粒子、及び高電子密度粒子を含む、その他の多様な標識も適当である。
【００９６】
標識された核酸とハイブリダイズするプローブアレイ上の位置は、米国特許第5,143,854号、国際公開公報第90/15070号、及び米国特許第5,578,832号に記載されたような読み取り装置を使用して検出される。カスタマイズされたアレイの場合には、次いで、国際公開公報第97/10365号に記載されるようにして分析される試料中の既知のmRNA種の存在及び／又は相対量もしくは絶対量を決定するため、ハイブリダイゼーションパターンが分析され得る。
【００９７】
診断及び予後判定の方法
腫瘍におけるT_BT遺伝子及び／又はT_BT遺伝子産物の差次的な発現は、これらが、治療適用のみならず、診断適用、イメージング適用のためのマーカーとしても活用され得ることを示す。一般に、そのような診断法は、個体の細胞もしくは組織、又はそれらに由来する試料におけるT_BT遺伝子転写物又はT_BT遺伝子産物の上昇した発現レベルを検出することを含む。遺伝子転写物のレベルを検出する方法及びタンパク質のレベルを検出する方法の両方を含む、多様な異なるアッセイ法が、遺伝子発現の増加を検出するために使用され得る。より具体的には、本明細書に開示された診断及び予後判定の方法は、個体から試料を得ること、試料中のT_BT遺伝子産物発現のレベルを、少なくとも定性的に、好ましくは定量的に決定することを含む。通常、この決定された値又は試験値は、何らかの型の参照又は基線値と比較される。
【００９８】
表1に提供された配列のうちの1個の配列に由来するポリペプチドに特異的な核酸、又は抗体のような結合メンバーが、対応するmRNA又はタンパク質の増加した発現、又は細胞中の増幅されたDNAの存在に関して患者の試料をスクリーニングするために使用される。試料は、多様な起源から入手され得る。試料は、典型的には、ヒト対象から得られる。しかしながら、方法は、霊長類、例えば類人猿及びチンパンジー、マウス、ネコ、ラット、及びその他の動物のような様々なその他の哺乳動物から得られた試料で使用されてもよい。そのような試料は、患者の試料と呼ばれる。
【００９９】
試料は、細胞培養物又は組織ホモジネートのみならず、個体の組織又は体液からも入手され得る。例えば、試料は、脊髄液、又は腫瘍生検試料から入手され得る。この用語には、そのような細胞及び体液の誘導体及び画分も含まれる。試料は、増殖培地、組換え細胞、及び細胞構成成分を含むインビトロ細胞培養物に由来してもよい。診断用試料は、脳腫瘍を有しているか又は有していると推測される個体から収集される。特異的マーカーの存在は、腫瘍の同定及び病期決定において有用である。
【０１００】
核酸スクリーニング法
T_BT遺伝子転写物の検出を含む診断及び予後判定の方法のうちのいくつかは、細胞の溶解、及びその後の他の細胞材料からの核酸、特にmRNA転写物の精製から出発する。mRNA転写物から派生した核酸とは、その合成のためにmRNA転写物又はその部分配列が鋳型として最終的に活用された核酸をさす。従って、mRNAから逆転写されたcDNA、そのcDNAから転写されたRNA、cDNAから増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNAは、全て、mRNA転写物から派生したものであり、そのような派生産物の検出は、試料中の最初の転写物の存在及び／又は存在量の指標となる。
【０１０１】
多数の方法が、特定の配列の存在、例えば上方制御又は下方制御された発現に関して核酸を分析するために使用可能である。核酸は、分析にとって十分な量を提供するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような従来の技術によって増幅され得る。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Saikiら（1985）Science 239：487に記載されており、技術の概説は、Sambrookら、Molecular Cloning ： A Laboratory Manual、CSH Press 1989、14.2〜14.33頁に見出され得る。
【０１０２】
増幅反応には検出可能標識が含まれていてもよい。適当な標識には、蛍光色素、例えばALEXA色素（Molecular Probes,Inc.より入手可能）；フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシ-2,4,7,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）、又はN,N,N,N-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、放射性標識、例えば³²P、³⁵S、³H等が含まれる。標識は、増幅されたDNAが、アビジン、特異的抗体等の高親和性結合パートナーを有するビオチン、ハプテン等と結合され、結合パートナーが検出可能標識と結合されている、二段階系であってもよい。標識は、プライマーの一方又は両方と結合されてもよい。又は、標識が増幅産物に取り込まれるよう、増幅において使用されるヌクレオチドのプールが標識される。
【０１０３】
試料核酸、例えば増幅され、標識され、クローニングされた断片等は、当技術分野において既知の多数の方法のうちの一つによって分析される。プローブがノーザンブロットもしくはドットブロットへとハイブリダイズさせられてもよいし、又は液体ハイブリダイゼーション反応が実施されてもよい。核酸が、ジデオキシ法又はその他の方法によって配列決定され、塩基配列が野生型配列と比較されてもよい。一本鎖高次構造多型（SSCP）分析、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、及びゲルマトリックス中のヘテロ二重鎖分析が、DNA配列バリエーションによって作出された高次構造の変化を電気泳動移動度の改変として検出するために使用される。分画は、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドゲル又はアガロースゲルによって実施される。
【０１０４】
インサイチューハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーションの前に細胞を溶解させないハイブリダイゼーション法である。この方法はインサイチューで実施されるため、細胞からRNAを調製する必要がないという利点を有する。この方法は、通常、まず支持体（例えば、顕微鏡用スライドの平面又はマイクロタイターウェルの壁）に被験細胞を固定し、次いで適切な透過性化溶液により細胞を透過性化することを含む。次いで、標識されたプローブを含有している溶液を、細胞と接触させ、プローブをハイブリダイズさせる。過剰のプローブを消化し、洗浄除去し、ハイブリダイズしたプローブの量を測定する。このアプローチは、Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach（Hamesら編、1987）に、より詳細に記載されている。
【０１０５】
多様ないわゆる「リアルタイム増幅」法又は「リアルタイム定量的PCR」法も、試料中に存在するmRNAの量を決定するために使用され得る。そのような方法は、増幅プロセスの間に形成された増幅産物の量を測定することを含む。蛍光発生ヌクレアーゼアッセイ法は、転写物を検出し定量するために使用され得るリアルタイム定量法の一つの具体例である。一般に、そのようなアッセイ法は、二重標識された蛍光発生性オリゴヌクレオチドプローブを使用して、PCR産物蓄積を連続的に測定する（文献では単に「タックマン（TaqMan）」法と呼ばれることが多いアプローチ）。増幅産物の濃度をリアルタイムに決定するための蛍光発生法の理論及び操作に関するさらなる詳細は、例えば、各々、参照として完全に組み込まれる、Gelfandの米国特許第5,210,015号、Livakらの米国特許第5,538,848号、及びHaalandの米国特許第5,863,736号に記載されている。
【０１０６】
ポリペプチドスクリーニング法
本発明の配列の発現に関するスクリーニングは、タンパク質の機能的又は抗原的な特徴に基づき得る。表1に提供された配列に対応する配列によりコードされたタンパク質の多型を発見するために設計された様々なイムノアッセイ法が、スクリーニングにおいて使用され得る。検出は、T_BTポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその他の特異的結合メンバーを使用して、従来の方式に従い実施される、細胞又は組織学的切片の染色を使用し得る。目的の抗体又はその他の特異的結合メンバーを細胞試料へと添加し、エピトープとの結合を可能にするために十分な時間、通常少なくとも約10分間、インキュベートする。抗体は、直接検出のための放射性同位体、酵素、蛍光団、化学発光団、又はその他の標識で標識され得る。又は、二次の抗体又は試薬が、シグナルを増幅するために使用される。そのような試薬は、当技術分野において周知である。例えば、一次抗体をビオチンと結合させ、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを二次試薬として添加することができる。最終検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色が変化する基質を使用する。抗体結合の欠如又は存在は、解離させた細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検、ラジオグラフィー、シンチレーション計数等を含む様々な方法によって決定され得る。
【０１０７】
別の診断法は、溶解物中の、抗体と、表1の配列に対応するポリペプチドとの間の結合のインビトロの検出に依存する。試料又はその画分の中の標的タンパク質の濃度の測定は、多様な特異的アッセイ法よって達成され得る。従来のサンドイッチ型アッセイ法が使用されてもよい。例えば、サンドイッチアッセイ法は、まず、特異的抗体を不溶性の表面又は支持体に付着させる。本発明の試薬及び全体的な方法と適合性である限り、特定の結合様式は重大ではない。それらは、共有結合的又は非共有結合的、好ましくは非共有結合的にプレートに結合させられ得る。
【０１０８】
不溶性の支持体は、ポリペプチドが結合することができ、可溶性材料から容易に分離され、かつその他の点において全体的な方法と適合性である、任意の組成物であり得る。そのような支持体の表面は、固体又は多孔性であってよく、任意の便利な形状であり得る。受容体が結合させられる適当な不溶性支持体の例には、ビーズ、例えば磁性ビーズ、膜、及びマイクロタイタープレートが含まれる。これらは、典型的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロン、又はニトロセルロースで作成されている。マイクロタイタープレートは、少量の試薬及び試料を使用して、多数のアッセイ法を同時に実施することができるため、特に便利である。
【０１０９】
次いで、患者の試料の溶解物は、抗体を含有している別々にアッセイ可能な支持体（例えば、マイクロタイタープレートの別々のウェル）に添加される。好ましくは、既知の濃度の被験タンパク質を含有している一連の標準が、対照として活用するため、試料又はその一部分と平行にアッセイされる。好ましくは、試料及び標準は、各々、各々の平均値が得られるよう、複数のウェルに添加されると考えられる。インキュベーション時間は、結合にとって十分なものであるべきである。インキュベーションの後は、一般に、不溶性支持体から未結合構成成分が洗浄される。洗浄後、二次抗体を含有している溶液が適用される。抗体は、存在するその他の構成成分と区別され得るよう十分な特異性で、目的のタンパク質のうちの一つと結合すると考えられる。二次抗体は、直接的又は間接的な結合の定量を容易にするため、標識され得る。好ましい態様において、抗体は、適当な基質の添加の後に検出可能な生成物シグナルを提供することができる共有結合した酵素で標識される。複合体物中に使用するのに適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。商業的に入手可能でない場合、そのような抗体−酵素複合体は、当業者に既知の技術によって容易に作製される。インキュベーション時間は、標識されたリガンドが使用可能な分子と結合するのに十分なものであるべきである。
【０１１０】
第二結合工程の後は、非特異的に結合した材料が除去されるよう再び不溶性支持体を洗浄し、標的タンパク質と特異的結合メンバーとの間で形成された特異的複合体を残す。結合した複合体から生成したシグナルが、従来の手段によって検出される。酵素複合体が使用される場合には、検出可能産物が形成されるよう適切な酵素基質が提供される。
【０１１１】
その他のイムノアッセイ法は当技術分野において既知であり、診断薬として有益であり得る。オクタロニープレートは、抗体結合の単純な決定を提供する。ウェスタンブロットは、サンドイッチアッセイ法に関して記載されたような標識法を便利に使用して、標的とされたポリペプチドに特異的な検出系を使用して、タンパク質ゲル又はフィルター上のタンパク質スポットに対して実施され得る。
【０１１２】
いくつかの場合には、競合アッセイ法が使用されると考えられる。患者の試料に加え、標的とされたタンパク質に対する競合剤が反応混合物に添加される。競合剤と標的とは、特異的結合パートナーとの結合に関して競合する。通常、以前に記載されたようにして、競合剤分子が標識され検出されると考えられる。その場合、競合剤結合の量が、存在する標的タンパク質の量に比例すると考えられる。競合剤分子の濃度は、検出の範囲を最も高感度で直線的なものにするため、最大予想タンパク質濃度の約10倍乃至ほぼ等しい濃度までであると考えられる。
【０１１３】
インビボイメージング
いくつかの態様において、方法は、例えば腫瘍細胞が存在する部位を位置決定又は同定するための、インビボのイメージングにおける使用に適合している。これらの態様においては、T_BTポリペプチドに特異的な検出可能に標識された部分、例えば抗体が、（例えば、注射により）個体に投与され、標識された細胞が、磁気共鳴イメージング、コンピュータ連動断層撮影法等（これらに制限はされない）を含む、標準的なイメージング技術を使用して位置決定される。
【０１１４】
診断インビボイメージングの場合、使用可能な検出装置の型が、特定の放射性核種の選択における主な要因である。選択された放射性核種は、特定の型の装置によって検出可能な型の崩壊を有していなければならない。一般に、診断イメージングを可視化するための任意の従来の方法が、本発明に従い使用され得る。インビボ分析用の放射性核種の選択におけるもう一つの重要な要因は、その半減期が、標的組織による最大取り込みの時点でまだ検出可能である程度に長く、しかし宿主への有害な照射が最小限に抑えられる程度に短いということである。^99mTcによる標識のための現在使用されている方法は、キレーティング前駆体の存在下で過テクネチウム酸塩を還元して、不安定な^99mTc-前駆体複合体を形成させ、それを、次に、二官能修飾された走化性ペプチドの金属結合基と反応させ、^99mTc-走化性ペプチド複合体を形成させるというものである。
【０１１５】
検出可能に標識されたT_BT特異的抗体は、標的の発現を分析するため、イメージング技術と共に使用される。一つの態様において、イメージング法は、放射性核種が合成的又は局所的に患者に投与されるイメージング技術であるPET又はSPECTのうちの一つである。その後の放射性トレーサーの取り込みが経時的に測定され、標的とされた組織に関する情報を得るために使用される。使用された特定の同位体の高エネルギー（□線）放射、並びにそれらを検出するために使用された装置の感度及び精度のため、放射能の二次元分布が体外から推量される。
【０１１６】
PETにおいて最も一般的に使用されている陽子放射核種には、¹¹C、¹³N、¹⁵0、及び¹⁸Fが含まれる。SPECTにおいては、電子捕捉及び／又は□放射により崩壊する同位体が使用されており、それには¹²³I及び^99mTcが含まれる。
【０１１７】
治療的／予防的な処置法
T_BT遺伝子又はT_BTタンパク質の活性を調整する薬剤、特にポリペプチドの活性又は遺伝子の発現を阻害又は上方制御する薬剤は、治療的又は予防的な介入のポイントを提供する。発現を直接的に調整する薬剤、例えば発現ベクター、標的とされたポリペプチドに特異的なアンチセンス；及びタンパク質に作用する薬剤、例えば特異的抗体及びその類似体、触媒活性を阻止する有機低分子等を含む多数の薬剤が、この活性の調整において有用である。
【０１１８】
ある種の細胞に選択的に核酸を送達するための方法が、設計され得る。そのような細胞の例には、神経細胞、小膠細胞、星状細胞、内皮細胞、乏突起膠細胞等が含まれる。ある種の処置法は、神経細胞細胞へ発現ベクターを選択的に発現させるため、及び／又は神経細胞（小膠細胞、星状細胞、内皮細胞、乏突起膠細胞）への送達のため核酸をターゲティングするために設計される。神経細胞における選択的な発現を達成するための一つの技術は、コーディング配列を、主として神経細胞において活性なプロモーターと機能的に連結させることである。そのようなプロモーターの例には、プリオンタンパク質プロモーター、カルシウム−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼプロモーターが含まれるが、これらに制限はされない。別法として、又はさらに、核酸は、核酸を神経細胞へとターゲティングする薬剤と共に投与され得る。例えば、核酸は、神経細胞上の細胞表面抗原と特異的に結合する抗体、又は神経細胞細胞上の受容体に対するリガンドと共に投与され得る。
【０１１９】
リポソームが使用される場合には、リポソームを神経細胞へとターゲティングし、取り込みを容易にするため、エンドシトーシスと関連した細胞表面膜タンパク質と結合する基質が、リポソームに付加され得る。付加され得るタンパク質の例には、神経細胞と結合するカプシドタンパク質又はそれらの断片、サイクリング中に内部移行する神経細胞上の細胞表面タンパク質と特異的に結合する抗体、及び神経細胞内の細胞内局在を標的とするタンパク質が含まれる（例えば、Wuら（1987）J.Biol.Chem.262：4429-4432；及びWagnerら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414参照）。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコルは、Andersonら（1992）Science 256：808-813により概説されている。様々な他の送達オプションも使用され得る。例えば、目的の配列を含有している核酸を、脳脊髄液へと直接注射することができる。又は、そのような核酸を脳室内注射により投与してもよい。
【０１２０】
アンチセンス分子は、細胞における発現を下方制御するために使用され得る。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）、特に天然型核酸からの化学修飾を有する合成ODN、又はRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物であり得る。アンチセンス配列は、標的とされた遺伝子のmRNAに相補的であり、標的とされた遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々なメカニズムによって、例えばRNAse Hの活性化又は立体障害により、翻訳に使用可能なmRNAの量を減少させることによって、遺伝子発現を阻害する。1個のアンチセンス分子が投与されてもよいし、又は複数の異なる配列を含んでいてもよいアンチセンス分子の組み合わせが投与されてもよい。
【０１２１】
アンチセンス鎖がRNA分子として産生されるよう転写開始が方向付けられている適切なベクターの中の標的遺伝子配列の全部又は一部の発現によって、アンチセンス分子は産生され得る。又は、アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも7ヌクレオチド長、一般的には少なくとも12ヌクレオチド長、より一般的には少なくとも20ヌクレオチド長であり、500ヌクレオチド長、一般的には約50ヌクレオチド長、より一般的には約35ヌクレオチド長は超えず、長さは、阻害の効率、特異性（交差反応性の欠如を含む）等により支配される。7〜8塩基長の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的な阻害剤であり得ることが見出されている（Wagnerら（1996）Nature Biotechnology 14：840-844参照）。
【０１２２】
内因性のセンス鎖mRNA配列の特定の1個またはそれ以上の領域が、アンチセンス配列と相補的であるよう選択される。オリゴヌクレオチドのための特定の配列の選択は、数個の候補配列が、インビトロ又は動物モデルにおける標的遺伝子の発現の阻害に関してアッセイされる、経験的方法を使用し得る。mRNA配列の数個の領域がアンチセンス相補のために選択される、配列の組み合わせが使用されてもよい。
【０１２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法によって化学合成され得る（Wagnerら（1993）（前記）及びMilliganら（前記）参照）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性及び結合親和性を増加させるため、天然型ホスホジエステル構造から化学修飾される。骨格、糖、又は複素環式塩基の化学を改変するそのような修飾は、多数、文献に記載されている。
【０１２４】
骨格化学の有用な変化としては、ホスホロチオエート；非架橋酸素が両方とも硫黄で置換されているホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートがある。アキラルなホスフェート誘導体には、3'-O'-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホネート、及び3'-NH-5'-O-ホスホロアミダイトが含まれる。ペプチド核酸は、完全なリボースホスホジエステル骨格をペプチド結合に交換したものである。糖修飾も、安定及び親和性を増強するために使用される。塩基が天然のβアノマーと逆であるデオキシリボースのαアノマーも使用され得る。リボース糖の2'-OHは、親和性を含まずに、分解に対する抵抗性を提供する2'-O-メチル糖又は2'-O-アリール糖を形成するよう改変させられ得る。複素環式塩基の修飾は、適切な塩基対形成を維持しなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンとデオキシチミジン；5-メチル-2'-デオキシシチジン及び5-ブロモ-2'-デオキシシチジンとデオキシシチジンが含まれる。5-プロピニル-2'-デオキシウリジン及び5-プロピニル-2'-デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジン及びデオキシシチジンに置換された場合、親和性及び生物学的活性を増加させることが示されている。
【０１２５】
化合物スクリーニング
化合物スクリーニングは、インビトロモデル、遺伝学的に改変された細胞もしくは動物、又は提供されたT_BT遺伝子のうちのいずれか一つに対応する精製されたタンパク質を使用して実施され得る。コードされたポリペプチドと結合するか、その作用を調整又は模倣するリガンド又は基質が同定され得る。
【０１２６】
ポリペプチドには、T_BT遺伝子によってコードされたもののみならず、遺伝暗号の縮重のため、開示された核酸と配列が同一でない核酸、及びそれらのバリアントによってコードされたものが含まれる。バリアントポリペプチドは、アミノ酸（aa）の置換、付加、又は欠失を含み得る。アミノ酸置換は、非必須アミノ酸を排除するための、例えばグリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を改変するための、又は機能にとって必要でない1個またはそれ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失による誤折り畳みを最小限に抑えるための、1個またはそれ以上の保存的アミノ酸置換であり得る。バリアントは、タンパク質の特定の領域（例えば、機能性ドメイン、及び／又は、ポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合には、コンセンサス配列に関連した領域）の生物学的活性を保持するか、又は増強されたそのような活性を有するよう設計され得る。バリアントには、本明細書に開示されたポリペプチドの断片、特に生物学的活性断片及び／又は機能性ドメインに相当する断片が含まれる。目的の断片は、典型的には、少なくとも約10aa乃至少なくとも約15aa長、一般的には少なくとも約50aa長であり、300aa長又はそれ以上の長さであってもよいが、一般的には約500aa長を超えず、脳腫瘍関連遺伝子又はそのホモログによってコードされたポリペプチドと同一の連続アミノ酸ストレッチを有すると考えられる。
【０１２７】
トランスジェニック動物又はそれらに由来する細胞も、化合物スクリーニングにおいて使用される。トランスジェニック動物は、T_BT遺伝子に対応する正常な遺伝子座が改変される相同的組換えによって作成され得る。又は、核酸構築物がランダムにゲノムへ組み込まれる。安定的組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス及びその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。酵素活性、発癌、シグナル伝達等における異なるエキソンの役割を決定するために、一連の小さな欠失及び／又は置換が、コーディング配列に作成され得る。目的の特異的構築物には、標的とされた遺伝子の発現及びドミナントネガティブ変異の発現を阻止するアンチセンス配列が含まれる。lacZのような検出可能マーカーが、目的の遺伝子座へ導入され得る。その場合、発現の上方制御により、容易に検出される表現型の変化がもたらされると考えられる。通常は発現されない細胞もしくは組織における、又は異常な発生時点における、標的遺伝子もしくはそのバリアントの発現を提供することも可能である。通常は産生されない細胞における標的タンパク質の発現を提供することにより、細胞挙動の変化を誘導することが可能である。
【０１２８】
化合物スクリーニングにより、T_BTポリペプチドの機能を調整する薬剤が同定される。特に重要であるのは、ヒトの細胞に対する低い毒性を有している薬剤に関するスクリーニングアッセイである。標識されたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、タンパク質結合に関するイムノアッセイ法等を含む極めて多様なアッセイ法が、この目的のために使用され得る。精製された組換えタンパク質の結晶化から導出されたコードされたタンパク質の三次元構造に関する知識は、活性を特異的に阻害する小さな薬物の合理的設計に結びつく可能性がある。これらの薬物は、特定のドメインに指向化され得る。
【０１２９】
「薬剤」という用語は、本明細書において使用されるように、T_BTポリペプチドの生理学的機能を改変又は模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質又は医薬品を記載するものである。一般に、様々な濃度に対する差次的な応答を得るために、複数のアッセイ混合物が、異なる薬剤濃度で平行に実行される。典型的には、これらの濃度のうちの一つは、陰性対照として使用される（即ち、ゼロ濃度又は検出レベル未満）。
【０１３０】
候補薬剤には多数の化学物質クラスが包含されるが、典型的には、それらは、有機分子、好ましくは50ダルトン超、約2,500ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも1個のアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を含み、好ましくは、官能化学基のうちの少なくとも2個を含む。候補薬剤は、上記の官能基のうちの1個またはそれ以上で置換された環式炭素又は複素環式構造、及び／又は芳香族もしくは多環芳香族構造を含む場合が多い。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見い出され得る。
【０１３１】
候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む極めて多様な起源より得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、極めて多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び特異的合成のための多数の手段が使用可能である。又は、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、使用可能であるか、又は容易に作製される。さらに、天然の又は合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生化学的な手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤は、構造類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、特異的又はランダムな化学修飾に供され得る。被験薬剤は、例えば天然生成物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーのようなライブラリーから入手され得る。多数の異なる型のコンビナトリアルライブラリー及びそのようなライブラリーを調製するための方法が、例えば、各々、参照として本明細書に組み込まれる国際公開公報第93/06121号、国際公開公報第95/12608号、国際公開公報第95/35503号、国際公開公報第94/08051号、及び国際公開公報第95/30642号に記載されている。
【０１３２】
スクリーニングアッセイ法が結合アッセイ法である場合、分子のうちの1個またはそれ以上が、直接的又は間接的に検出可能シグナルを提供することができる標識と結合させられ得る。様々な標識には、放射性同位体、蛍光団、化学発光団、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等のような対が含まれる。特異的結合メンバーの場合には、相補メンバーが、通常、既知の手法に従い、検出を提供する分子で標識されると考えられる。
【０１３３】
その他の多様な試薬が、スクリーニングアッセイ法に含まれ得る。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、かつ／又は非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のようなアッセイ法の効率を改善する試薬が、使用されてもよい。構成成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の適当な温度、典型的には4〜40℃の温度で実施される。インキュベーション時間は、最適な活性のため選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化されてもよい。典型的には、0.1〜1時間で十分であると考えられる。
【０１３４】
T_BTポリペプチドと結合することができる化合物に関するスクリーニングによる予備スクリーニングを実施してもよく、そのようにして同定された化合物のうちの少なくともいくつかは、阻害剤である可能性が高い。結合アッセイ法は、通常、T_BTポリペプチドを1個またはそれ以上の被験化合物と接触させること、及びタンパク質と被験化合物とが結合複合体を形成するために十分な時間を経過させることを含む。形成された任意の結合複合体は、多数の確立されている分析技術のうちの任意のものを使用して検出され得る。タンパク質結合アッセイ法には、共沈殿、非変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上の共移動、及びウェスタンブロット上の共移動を測定する方法が含まれる（例えば、Neurotransmitter Receptor Binding（Yamamura,H.I.ら編）61-89頁のBennet,J.P.及びYamamura,H.I.（1985）「Neurotransmitter,Hormone or Drug Receptor Binding Methods」参照）。
【０１３５】
ある種のスクリーニング法は、T_BT遺伝子の発現を調整する化合物に関するスクリーニングを含む。そのような方法は、一般に、被験化合物を、T_BT遺伝子を発現している1個またはそれ以上の細胞と接触させる細胞に基づくアッセイ法を実施すること、次いで発現の増加を検出することを含む。いくつかのアッセイ法は、内因性T_BT遺伝子を発現する腫瘍細胞を用いて実行される。その他の発現アッセイ法は、外因性T_BT遺伝子を発現する非神経細胞細胞を用いて実施される。
【０１３６】
発現又は活性のレベルは、基線値と比較され得る。既に示されたように、基線値は、対照試料に関する値、又は対照集団に関する発現レベルを代表する統計値であり得る。発現レベルは、陰性対照としてのT_BT遺伝子を発現していない細胞に関して決定されてもよい。そのような細胞は、一般に、その他の点では実質的に遺伝学的に被験細胞と同じである。レポーター構築物を欠く細胞を用いた平行反応を実行すること、又はレポーター構築物を保有している細胞を試験化合物と接触させないことを含む、様々な対照が、観察された活性が真正のものであることを保証するために実施され得る。化合物は、下記のようにして、さらに確認され得る。
【０１３７】
前述のスクリーニング法のうちのいずれかにより最初に同定された化合物は、明白な活性を確認するためにさらに試験され得る。そのような方法の基本的なフォーマットは、ヒトのモデルとして活用される動物へ、一次スクリーニングにおいて同定されたリード化合物を投与すること、次いで、T_BT遺伝子が実際に上方制御されるか否かを決定することを含む。確認研究において使用される動物モデルは、一般に、哺乳動物である。適当な動物の具体例には、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに制限はされない。
【０１３８】
本明細書に記載されたスクリーニング法により同定された、T_BTポリペプチド活性及び／又は腫瘍成長を阻害する活性被験薬剤は、類似体化合物の合成のためのリード化合物として活用され得る。典型的には、類似体化合物は、リード化合物と類似した電子配置及び分子高次構造を有するよう合成される。類似体化合物の同定は、自己無撞着場（SCF）分析、配置間相互作用（CI）分析、及び正規モード動態分析のような技術の使用により実施され得る。これらの技術を実行するためのコンピュータープログラムが使用可能である。例えば、Reinら（1989）Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions（Alan Liss、New York）を参照されたい。
【０１３９】
抗体複合体
脳腫瘍タンパク質標的の天然型活性が腫瘍細胞において改変されている場合、本発明において使用するための抗T_BT抗体は、結合なしに、有用性を有し得る。前記のようにして選択され得るそのような抗体は、治療剤として使用され得る。本発明のもう一つの態様において、標的ポリペプチドの活性を改変してもよいし、又は改変しなくてもよいT_BT特異的抗体が、抗体に機能性を追加する細胞毒性剤又はイメージング剤と結合させられる。
【０１４０】
抗T_BT抗体は、1個またはそれ以上の治療用細胞毒性部分又はイメージング部分とカップリング又は結合させられ得る。本明細書において使用されるように、「細胞毒性部分」とは、細胞と接近しているか又は細胞に吸収された場合に、細胞成長を阻害するか又は細胞死を促進する部分である。この点に関して適当な細胞毒性部分には、放射性同位体（放射性核種）、分化誘導剤及び小さな化学毒性薬物のような化学毒性剤、毒素タンパク質、並びにそれらの誘導体が含まれる。「イメージング部分」（I）とは、可視化技術（例えば、ラジオグラフィー、陽電子放射断層撮影、核磁気共鳴イメージング、直接的又は間接的な視覚的検査）における腫瘍と周囲の健康な組織との対比を増加させるために使用され得る部分である。従って、適当なイメージング部分には、ラジオグラフィー部分（例えば、重金属及び放射線放射部分）、陽電子放射部分、磁気共鳴造影部分、及び光学的に可視の部分（例えば、蛍光性又は可視スペクトル色素、可視粒子等）が含まれる。治療用部分とイメージング部分との間にいくらかのオーバーラップが存在することは、当業者には理解されると思われる。例えば、²¹²Pb及び²¹²Biは、両方とも、治療用組成物のための有用な同位体であるが、高電子密度でもあり、従ってX線ラジオグラフィーイメージング技術のための対比を提供し、シンチレーションイメージング技術においても使用され得る。
【０１４１】
一般に、治療剤又はイメージング剤は、薬物動態学的安定性及び減少した患者への全体毒性の必要を適切に考慮しつつ、任意の適当な技術によって抗T_BT部分と結合させられ得る。治療剤は、直接的又は間接的に（例えば、リンカー基を介して）、適当な抗体部分とカップリングさせられ得る。各々が相互に反応することができる官能基を保有している場合には、薬剤と抗体との間の直接反応が可能である。例えば、アミノ基又はスルフヒドリル基のような求核性の基は、無水物もしくは酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基、又は優れた脱離基（例えば、ハライド）を含有しているアルキル基と反応することができる場合がある。又は、適当な化学的リンカー基が使用されてもよい。リンカー基は、結合能の妨害を回避するために、抗体を薬剤から隔離するためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基は、部分又は抗体の上の置換基の化学的反応性を増加させ、従ってカップリング効率を増加させるためにも活用され得る。化学的反応性の増加は、そうでなければ不可能であると考えられる部分又は部分上の官能基の使用も容易にし得る。
【０１４２】
適当な結合化学には、（抗体部分上のスルフヒドリルと反応する）マレイミジルリンカー及びハロゲン化アルキルリンカー、並びに（抗体部分上の第一級アミンと反応する）スクシンイミジルリンカーが含まれる。数個の第一級アミン及びスルフヒドリル基が、免疫グロブリン上に存在しており、組換え免疫グロブリン分子へと付加的な基が設計されてもよい。（Pierce Chemical Co.、Rockford、Illのカタログに記載されているもののような）多様な二官能性又は多官能性の試薬（同種官能性及び異種官能性の両方）が、リンカー基として使用され得ることは、当業者には明らかであると考えられる。カップリングは、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、又は酸化型炭水化物残基によって達成され得る。多数の参照が、そのような方法論を記載している（例えば、米国特許第4,671,958号）。別のカップリング方法として、米国特許第5,057,313号及び第5,156,840号に記載されたように、細胞毒性部分又はイメージング部分は、グリコシル化部位において酸化型炭水化物基によって抗T_BT抗体部分とカップリングさせられてもよい。抗体部分を細胞毒性部分又はイメージング部分とカップリングさせるためのさらにもう一つの別法は、ストレプトアビジン／ビオチン又はアビジン／ビオチンのような非共有結合性の結合対の使用によるものである。これらの態様においては、対の一方のメンバーが、抗体部分と共有結合的にカップリングさせられ、結合対の他方のメンバーが、細胞毒性部分又はイメージング部分と共有結合的にカップリングさせられる。
【０１４３】
本発明の免疫複合体の抗体部分がない場合に、細胞毒性部分がより強力である場合には、細胞への侵入の間もしくは後に分解可能であるか、又は細胞外環境において経時的に徐々に分解可能であるリンカー基を使用することが望ましいと思われる。多数の異なる分解可能リンカー基が、記載されている。これらのリンカー基からの細胞毒性部分剤の細胞内放出のメカニズムには、ジスルフィド結合の還元による分解（例えば、米国特許第4,489,710号）、光不安定結合の放射による分解（例えば、米国特許第4,625,014号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による分解（例えば、米国特許第4,638,045号）、血清中の補体により媒介される加水分解による分解（例えば、米国特許第号4,671,958）、及び酸触媒加水分解による分解（例えば、米国特許第4,569,789号）が含まれる。
【０１４４】
同じであってもよいし又は異なっていてもよい2個またはそれ以上の細胞毒性部分及び／又はイメージング部分が、抗体と結合させられてもよい。抗T_BT抗体の多重誘導体化によって、いくつかの細胞毒性戦略が同時に実行され得る。抗体は、いくつかの可視化技術のための造影剤として有用になる場合がある；又は、治療用抗体は、可視化技術による追跡のため標識され得る。複数個の部分を有する免疫複合体は、多様な方式で調製され得る。例えば、複数個の部分が、抗体分子に直接カップリングさせられてもよいし、又は付加のための複数の部位を提供するリンカー（例えば、デンドリマー）が使用されてもよい。又は、複数個の細胞毒性部分又はイメージング部分を担持する能力を有する担体が使用され得る。
【０１４５】
担体は、直接的な又はリンカー基を介した共有結合、及び非共有結合性の会合を含む様々な方式で、細胞毒性部分又はイメージング部分を保持し得る。適当な共有結合担体には、各々、部分の付加のための部位を複数個有しているアルブミンのようなタンパク質（例えば、米国特許第4,507,234号）、ペプチド、及びアミノデキストランのような多糖（例えば、米国特許第4,699,784号）が含まれる。担体は、非共有結合のような非共有結合性の会合、又はリポソーム小胞（例えば、米国特許第4,429,008号及び第4,873,088号）への封入のような封入により、薬剤を保持していてもよい。封入担体は、検出のための十分な量のイメージング部分（色素、磁気共鳴造影試薬等）を、より容易に、抗体部分と会合させ得るため、本発明において使用するための抗T_BT抗体部分へのイメージング部分の結合に特に有用である。さらに、腫瘍細胞の近傍に集中させながら、治療用組成物が経時的に徐々に化学毒性部分を放出することを可能にし得るため、封入担体は、化学毒性治療態様においても有用である。
【０１４６】
放射性核種薬剤（細胞毒性部分として使用するためのもの又は陽電子放射イメージング部分として使用するためのもの両方）に特異的な担体及びリンカーには、放射性ハロゲン化低分子及びキレーティング化合物が含まれる。例えば、米国特許第4,735,792号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子及びそれらの合成を開示している。放射性核種キレートは、金属、又は金属酸化物、放射性核種との結合のためのドナー原子としての窒素原子及び硫黄原子を含有しているものを含むキレーティング化合物から形成され得る。例えば、Davisonらの米国特許第4,673,562号は、代表的なキレーティング化合物及びそれらの合成を開示している。そのようなキレーション担体は、磁気共鳴イメージング腫瘍可視化法において使用するための磁気スピンコントラストイオン、及びラジオグラフィー可視化法において使用するための重金属イオンのキレーションにも有用である。
【０１４７】
細胞毒性部分として使用するための好ましい放射性核種は、薬理学的投与に適した放射性核種である。そのような放射性核種には、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、⁹⁰Y、²¹¹At、⁶⁷Cu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹²Pb、及び²¹²Biが含まれる。ヨウ素及びアスタチンの使用に関しては大量の文献が蓄積されているため、ヨウ素及びアスタチンの同位体は、本発明の治療用組成物において使用するためのより好ましい放射性核種である。¹³¹Iは、数ミリメートルの有効域を有している他のβ線放射核種と同様に、特に好ましい。¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、又は²¹¹Atは、ヨウ素、N-スクシンイミジル3-［²¹¹At］アスタトベンゾエート、N-スクシンイミジル3-[¹³¹I］ヨードベンゾエート（SIB）、及びN-スクシンイミジル5-［¹³¹I］ヨード-3-ピリジンカルボキシレート（SIPC）を含むいくつかの既知の結合試薬のうちの任意のものを使用して、組成物及び方法において使用するための抗体部分と結合させられ得る。任意のヨウ素同位体が、列挙されたヨード試薬において使用され得る。放射性核種は、核医学分野の当業者に既知の適当なキレーション剤により、抗T_BT抗体部分として結合させられてもよい。
【０１４８】
好ましい化学毒性薬剤には、カルボプラチン、シスプラチン、ビンクリスチン、パクリタキセル及びドセタキセルのようなタキサン類、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、チラパザミン、マトリリシン、メトトレキサート、ピリミジン及びプリンの類似体、並びに当技術分野において既知のその他の適当な小さな毒素のような低分子薬物が含まれる。好ましい化学毒素分化誘導剤には、ホルボールエステル及び酪酸が含まれる。化学毒性部分は、化学的リンカーを介して直接的に抗T_BT抗体部分と結合させられてもよいし、又は担体へと封入され、それが抗T_BT抗体部分と結合させられてもよい。
【０１４９】
化学療法は、高グレードの膠腫の調節において役に立つ。化学療法薬の一般的な組み合わせは、プロカルバジン、CCNU、及びビンクリスチンという3個の薬物をさす「PCV」である。テモゾロミド（Temozolomide）（テモダー（Temodar））は、退形成性星状細胞腫の処置のためFDAによって承認されており、この薬物は、現在、高グレードの膠腫のために広く使用されている。ノイポゲン（Neupogen）は、化学療法の後に白血球数が極めて低いレベルにまで減少した患者へと投与され得る。
【０１５０】
細胞毒性部分として使用するための好ましい毒素タンパク質には、リシンA及びB、アブリン、ジフテリア毒素、ブリオジン（bryodin）1及び2、モモルジン（momordin）、トリコキリン（trichokirin）、コレラ毒素、ゲロニン（gelonin）、シュードモナス外毒素、シゲラ毒素、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、並びに医学生化学分野において既知のその他の毒素タンパク質が含まれる。非毒性リシンB鎖は、細胞と結合する部分であり、A鎖が、タンパク質合成を不活化する毒性部分である（ただし、ガラクトース末端膜タンパク質と結合するジスルフィド結合B鎖により細胞質へと送達された後にのみ）。アブリン、ジフテリア毒素、及びシュードモナス外毒素は、全て、類似した二本鎖構成成分を有しており；一本は、細胞膜結合及び侵入を媒介する鎖であり、A鎖が毒性の酵素的な鎖である。コレラは、毒性A鎖とカップリングされたペンタマーの結合サブユニットを有している。これらの毒素剤は、血管内に注射された場合には特に、患者において望ましくない免疫応答を誘発し得るため、抗T_BT抗体部分とのカップリングのためには担体へと封入されることが好ましい。
【０１５１】
本発明においてイメージング部分として使用するための好ましいラジオグラフィー部分には、金、イリジウム、テクネチウム、バリウム、タリウム、ヨウ素、及びそれらの同位体のような比較的大きな原子を含む化合物及びキレートが含まれる。本発明の組成物及び方法においては、ヨウ素又はヨウ素同位体のような低毒性のラジオグラフィーイメージング部分が使用されることが好ましい。X線ラジオグラフィーのため使用され得るそのような組成物の例は、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,709,846号に記載されている。そのような部分は、許容される化学的リンカー又はキレーション担体によって抗T_BT抗体部分と結合させられ得る。さらに、頭蓋を透過することができる放射線を放射する放射性核種が、シンチレーションイメージング技術に有用であり得る。結合のための適当な放射性核種には、⁹⁹Tc、¹¹¹In、及び⁶⁷Gaが含まれる。本発明において使用するための陽電子放射部分には、米国特許第6,187,284号に記載された方法に従い、抗T_BT抗体部分とのフッ素化反応によって容易に結合させられ得る¹⁸Fが含まれる。
【０１５２】
好ましい磁気共鳴コントラスト部分には、クロミウム（III）イオン、マンガン（II）イオン、鉄（II）イオン、ニッケル（II）イオン、銅（II）イオン、プラセオジム（III）イオン、ネオジウム（III）イオン、サマリウム（III）イオン、及びイッテルビウム（III）イオンのキレートが含まれる。ガドリニウム（III）イオン、テルビウム（III）イオン、ジスプロシウム（III）イオン、ホルミウム（III）イオン、エルビウム（III）イオン、及び鉄（III）イオンは、極めて強い磁気モーメントのため、特に好ましい。磁気共鳴スピンイメージングに適したそのようなキレートの例は、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,733,522号に記載されている。核スピンコントラストキレートは、適当な化学的リンカーによって抗T_BT抗体部分と結合させられ得る。
【０１５３】
イメージング部分として使用するための光学的に可視の部分には、蛍光色素、並びに可視スペクトル色素、可視の粒子、及びその他の可視の標識部分が含まれる。アレキサ（ALEXA）色素、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、ボディピー（bodipy）テキサスレッド、及びシアニン色素のような蛍光色素が、視覚的に検査すべき部位に十分な励起エネルギーが提供された場合、有用である。内視鏡的可視化法は、そのような標識の使用と比較的適合性であり得る。脳腫瘍を切除する手術のような、イメージング剤が有用である多くの手法については、可視スペクトル色素が好ましい。許容される色素には、非毒性のFDAにより承認されている食用の色素及び着色料が含まれるが、内用として承認された薬学的に許容される色素が好ましい。好ましい態様において、そのような色素は、担体部分に封入され、それらが、抗T_BT抗体と結合させられる。又は、コロイド金粒子又はラテックス粒子のような可視の粒子が、適当な化学的リンカーを介して抗T_BT抗体部分とカップリングさせられ得る。
【０１５４】
薬学的製剤
血液脳関門（BBB）を通した薬物送達のための一つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエンのような浸透圧手段によるか、又は生化学的に、ブラジキニンのような血管作用物質の使用による、BBBの破壊を要する。特定の薬剤を脳腫瘍へターゲティングするためにBBBオープニングを使用することも、選択可能である。BBB破壊剤は、組成物が血管内注射によって投与される場合、本発明の治療用組成物又はイメージング組成物と共投与され得る。BBBを貫通するためのその他の戦略は、グルコース担体及びアミノ酸担体のような担体により媒介されるトランスポーター、インスリン又はトランスフェリンのための受容体により媒介されるトランスサイトーシス、並びにp糖タンパク質のような能動排出輸送体を含む内因性の輸送系の使用を要する。能動輸送部分も、血管の上皮壁を横切る輸送を容易にするため、本発明において使用するための治療用化合物又はイメージング化合物と結合させられ得る。又は、BBBの後ろへの薬物送達は、例えばオマヤレザバーによる、治療薬又はイメージング剤の頭蓋への直接的なクモ膜下腔内送達による。
【０１５５】
薬学的組成物には、望まれる製剤に依って、動物又はヒトへの投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されている媒体と定義される、薬学的に許容される非毒性の希釈剤の担体が含まれ得る。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水溶液、生理食塩水、PBS、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。さらに、薬学的組成物又は製剤には、その他の担体、佐剤、又は非毒性の非治療用の非免疫原性の安定化剤、賦形剤等が含まれ得る。組成物には、pH調整緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤のような生理学的条件に接近するための付加的な物質が含まれ得る。
【０１５６】
組成物には、例えば抗酸化剤のような多様な安定剤のうちの任意のものが含まれ得る。薬学的組成物がポリペプチドを含んでいる場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ安定性を増強するか、又は薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、毒性を減少させる、可溶性又は取り込みを増強する）、様々な周知の化合物と複合体化され得る。そのような修飾又は複合体化剤の例には、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が含まれる。組成物のポリペプチドは、インビボ属性を増強する分子と複合体化されてもよい。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、その他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が含まれる。
【０１５７】
様々な型の投与に適した製剤に関するさらなる手引きは、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mace Publishing Company、Philadelphia、PA）第17版（1985）に見い出され得る。薬物送達のための方法の簡潔な概説については、Langer、Science 249：1527-1533（1990）を参照されたい。
【０１５８】
薬学的組成物は、予防的及び／又は治療的な処置のため投与され得る。活性成分の毒性及び治療効力は、例えばLD₅₀（集団の50％にとって致死的な用量）及びED₅₀（集団の50％において治療的に有効な用量）の決定を含む、細胞培養物及び／又は実験動物における標準的な薬学的手法に従い決定され得る。毒性効果と治療効果との用量比が、治療指数であり、比率LD₅₀／ED₅₀として表され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１５９】
細胞培養物及び／又は動物研究から得られたデータは、ヒトのための投薬量の範囲を規定するのに使用され得る。活性成分の投薬量は、典型的には、低い毒性と共にED₅₀を含む循環血中濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形及び使用される投与経路に依って、この範囲内で変動し得る。
【０１６０】
本明細書に記載された薬学的組成物は、多様な異なる方式で投与され得る。例には、経口、鼻腔内、直腸内、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、クモ膜下腔内、及び頭蓋内の方法を介した、薬学的に許容される担体を含有している組成物の投与が含まれる。
【０１６１】
経口投与の場合、活性成分は、カプセル、錠剤、及び粉末のような固体剤形、又はエリキシル、シロップ、及び懸濁液のような液体剤形で投与され得る。（1個またはそれ以上の）活性構成成分は、不活性成分、及びグルコース、乳糖、ショ糖、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムのような粉末化担体と共にゼラチンカプセルに封入され得る。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散、又はその他の既知の望ましい特質を提供するために添加され得る付加的な不活性成分の例は、べんがら、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、及び食用白色顔料である。類似の希釈剤が、圧縮錠を作成するために使用され得る。錠剤及びカプセルの両方は、数時間にわたり医薬品の連続的な放出を提供するため、徐放性製品として製造され得る。圧縮錠は、不快な味をマスキングし、環境から錠剤を保護するための糖コーティングもしくはフィルムコーティング、又は胃腸管における選択的な崩壊のための腸溶コーティングを施され得る。経口投与用の液体剤形は、患者による受け入れを増加させるため、着色料及び香料を含有し得る。
【０１６２】
活性成分は、単独で、又は他の適当な構成成分と組み合わされて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にされ得る（即ち、「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素のような加圧された許容される噴霧剤の中に置かれ得る。
【０１６３】
例えば、関節内経路（関節の中）、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、及び皮下経路のような非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。
【０１６４】
薬学的組成物を製剤化するために使用される構成成分は、好ましくは高純度であり、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（National Food）（NF）等級、一般には、少なくとも分析的等級、より典型的には少なくとも薬学的等級）。さらに、インビボ使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。特定の化合物が使用前に合成されなければならない場合、得られる産物は、典型的には、合成又は精製の過程で存在する可能性のある潜在的に毒性の薬剤、特に内毒素を実質的に含まない。非経口投与用の組成物も、無菌であり、実質的に等張であり、GMP条件の下で作成される。
【０１６５】
本発明の組成物は、任意の医学的に適切な手法、例えば血管内（静脈内、動脈内、毛細血管内）投与、脳脊髄液への注射、腔内注射、又は腫瘍への直接注射を使用して投与され得る。クモ膜下腔内投与は、既知の技術に従い、オマヤレザバーの使用により実施され得る（F.Balisら、Am J.Pediatr.Hematol.Oncol.11、74、76（1989）。本発明のイメージング組成物については、血管内注射を介した投与が、腫瘍の術前可視化にとって好ましい。術後の可視化又は手術と同時の可視化は、例えばオマヤレザバーによる、クモ膜下腔内もしくは腔内投与によってもよいし、又は血管内投与によってもよい。
【０１６６】
本発明の治療用組成物の投与のための一つの方法は、（必要であれば、注射シリンジの定位固定によって補助される）直接注射、又は投与のための腔もしくは嚢胞へのオマヤレザバーのチップの設置のような、任意の適当な技術による嚢胞性腫瘍の内腔への沈積によるものである。腫瘍が固形腫瘍である場合には、まず、腫瘍の位置に切除腔を作出することにより、抗体が投与され得る。この手法は、少数の微細な点でのみ通常の開頭及び腫瘍切除と異なっている。腫瘍切除は、一般的な処置法であり、圧力を緩和するために指示される場合が多いため、本発明の治療用組成物の投与は、腫瘍切除の後に実施され得る。標準的な神経外科的な全切除の後、全ての出血が焼灼によって止められるまで、腔は好ましくは生理食塩水で濯がれる。次に、表面で腫瘍腔を囲んでいる軟膜くも膜が、繊維芽細胞反応及び軟膜くも膜区域における斑痕の形成を増強するために焼灼される。その結果、脳組織内の腫瘍が除去された位置に、閉鎖された体液で満たされた腔が形成される。嚢胞が形成された後、ポンプ装置に接続され、腔への抗体溶液の連続注入を可能にするオマヤレザバー又はミクロカテーテルのチップが腔内に設置され得る。例えば、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,558,852号を参照されたい。
【０１６７】
又は、対流増強送達カテーテルが、腫瘍塊、天然もしくは外科的に作出された嚢胞、又は正常脳塊へと直接移植されてもよい。そのような対流増強薬学的組成物送達装置は、脳塊全体への組成物の拡散を大きく改善する。これらの送達装置の移植されたカテーテルは、脳及び／又は腫瘍塊へと治療用組成物又はイメージング組成物を送達するため、拡散流ではなく高流速微量注入（約0.5〜15.0μl／分の範囲の流速）を使用する。そのような装置は、参照として完全に本明細書に組込まれる米国特許第5,720,720号に記載されている。
【０１６８】
特定の患者へと与えるべき治療組成物の有効量は、多様な要因に依存すると考えられるが、それらのいくつかは、患者によって異なっていると考えられる。有能な医師であれば、腫瘍細胞の成長を遅延させ、死滅を促進するため患者に投与すべき治療剤の有効量、又は腫瘍の可視化を容易にするため患者に投与すべきイメージング組成物の有効量を決定することができると考えられる。抗体複合体の投薬量は、腫瘍の処置、投与の経路、治療薬の性質、治療薬に対する腫瘍の感受性等に依存すると考えられる。結合した細胞毒性部分又はイメージング部分に関して入手可能なLD₅₀動物データ及びその他の情報を使用して、医師は、投与の経路に依って、個体のための最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、治療用組成物が投与される体液がより多いため、クモ膜下腔内投与される用量よりも大きい。同様に、身体から迅速に排泄される組成物は、治療的濃度を維持するために、より高用量で、又は反復的に投与され得る。イメージング部分は、典型的には、細胞毒性部分より低毒性であり、いくつかの態様において、より高い用量で投与され得る。有能な医師であれば、通常の技術を使用して、日常の臨床試験の過程で、特定の治療用組成物又はイメージング組成物の投薬量を最適化することができよう。
【０１６９】
典型的には、投薬量は、対象の体重1キログラム当たり0.001〜100ミリグラムの複合体であると考えられる。クモ膜下腔内投与される放射性核種治療用組成物の場合には、患者の体重1キログラム当たり0.01〜1mgの範囲の用量が、使用され得る。比較的非毒性のイメージング部分を含むイメージング複合体の場合には、患者の体重1キログラム当たり0.1〜10mgの範囲の比較的大きな用量が、使用され得る。使用される量は、イメージング法の感度及びイメージング部分の相対毒性に依存すると考えられる。例えば、治療用組成物が¹³¹I細胞毒性部分を含む治療の例においては、患者への投薬量は、典型的には、10mCiという比較的低い範囲から出発し、100mCi、300mCi、又はさらには500mCiにまで引き上げられると考えられる。換言すると、治療剤が¹³¹Iである場合、患者への投薬量は、典型的には、5,000ラド〜100,000ラド（好ましくは、少なくとも13,000ラド、又はさらには少なくとも50,000ラド）と考えられる。その他の放射性核種の用量は、典型的には、殺腫瘍用量が上記の¹³¹Iの範囲と等価になるよう選択される。同様に、化学毒性タンパク質又は毒素タンパク質の用量は、相応じて計測され得る。
【０１７０】
組成物は、一連の複数回の投与で対象へと投与され得る。治療用組成物の場合には、規則的な周期的な投与（例えば、2〜3日毎）が、毒性を減少させるため、必要とされるか、又は望ましい場合がある。治療用組成物が反復用量計画において使用される場合には、免疫応答を惹起しない抗体部分が好ましい。イメージング抗体複合体組成物は、可視化技術の前の適切な時点で投与され得る。例えば、直接視覚的検査の前1時間以内の投与が適切である場合がある、又はMRIスキャンの前12時間以内の投与が適切である場合がある。しかしながら、イメージング化合物は最終的には患者の系から排泄されるため、投与と可視化との間にあまりに多くの時間を経過させないよう、注意すべきである。
【０１７１】
単純な可視化のためのイメージング抗体複合体の使用に加え、これらの組成物は、比較的高毒性の細胞毒性抗体複合体のための「模擬試験」として使用され得る。治療用複合体と同じ抗体部分がイメージング複合体のために使用される場合、医師は、まず、細胞毒性複合体が集中すると考えられる脳内の位置を正確に決定するために、可視化技術を使用することができる。十分な程度の組織選択性が達成されない場合（例えば、腫瘍細胞が正常な組織にも過剰に分散している場合、又は選択された特定の脳腫瘍タンパク質標的が特定の患者の腫瘍細胞において十分に過剰発現されていない場合）、医師は、もう一つの脳腫瘍タンパク質標的を選択することができる。イメージング剤及び治療剤の両方と併せた、多数の脳腫瘍タンパク質標的の本発明による提供は、個々の患者にとって有効な治療計画の設計における高度の柔軟性を可能にする。
【０１７２】
組み合わせ療法
脳腫瘍は、不均一な特徴を有し、脳組織全体に蔓延する傾向がある。この組み合わせのため、それらの処置は困難である場合が多い。いくつかの場合には、殺腫瘍特徴を示す細胞全てをより完全にターゲティングするため、様々な治療剤又はイメージング剤の組み合わせを使用することが好ましい場合がある。そのような組み合わせ処置は、前記のようにして個々に調製された治療用又はイメージング用の抗体組成物を混和したものの投与、及び記載されたような患者への混和された治療剤の投与による。熟練した医師であれば、そのような組み合わせ薬剤を投与する場合に、組み合わせ毒性、及び個々の薬剤の効力のような要因を考慮に入れることができよう。さらに、当業者であれば、各薬剤の完全な効力を保証するため、可能性のある相互の交差反応に関してスクリーニングすることができると考えられる。
【０１７３】
又は、数個の個々の脳腫瘍タンパク質標的組成物が、組み合わせ療法のため、同時又は連続的に投与され得る。これは、数個の抗体複合体試薬から蓄積される毒性を回避するため、又は個々の抗体試薬に対する可能性のある有害反応をより緊密にモニタリングするため、望ましい場合がある。従って、第一の抗体治療剤を1日目に投与し、続いて第二を2日目に投与し、次いで投与を行わない期間の後、異なる連続日に抗体治療薬を再投与するというようなサイクルが、本発明に包含される。
【０１７４】
実験
以下の実施例は、本発明をいかにして作成及び使用するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制限するためのものではないし、実施された実験が下記の実験のみであることを表すためのものでもない。使用された数（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証すべく努力がなされたが、いくつかの実験の誤差及び偏差は斟酌されるべきである。特記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【０１７５】
この明細書中に引用された全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が各々特別に個別に参照として組み込まれると示されたかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１７６】
本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むことが本発明者らによって見出された又は提唱された特定の態様に関して記載された。本開示を考慮することにより、本発明の意図された範囲を逸脱することなく、例証された特定の態様に多数の修飾及び変化を施し得ることが、当業者には理解されると思われる。例えば、コドンの縮重により、タンパク質配列に影響を与えることなく、基となるDNA配列を変化させることが可能である。さらに、生物学的機能的等価性の考察により、生物学的作用の種類又は量に影響を与えることなく、タンパク質構造を変化させることが可能である。そのような修飾は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【０１７７】
実施例1
差次的に発現された配列の同定
脳腫瘍：
未詳の患者に由来する、神経病理学によって神経膠芽腫グレードIVと確認された腫瘍組織が、手術室において急速凍結させられ、実験試料として活用された。ヒト全脳組織（Clontech Laboratrories、Palo Aloto、USA）を、対照試料として活用した。細胞から調製されたポリA⁺ RNAを、二本鎖cDNA（dscDNA）へと変換し、標準化した。腫瘍に由来するdscDNAを、非癌性脳の同じ領域から調製された過剰のdscDNAと共に使用して、サブトラクティブハイブリダイゼーションを実施した。差次的に発現された遺伝子断片を、プラスミドベクターへとクローニングし、得られたライブラリーを大腸菌細胞へと形質転換した。組換えクローンの挿入断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した。PCR産物（200〜2000bpのサイズの断片）を、一般的なベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用して配列決定した。得られた配列情報を、BLAST（blastn）及びスミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用して、公共データベースと比較した。このようにして同定された差次的に発現された配列を、表1に挙げる。
【０１７８】
実施例 2 ：
PTP ζの 2 個の新たなスプライシングバリアントイソ型： PTP ζ SM1 及び SM2 の同定
PTPζSM1のmRNAヌクレオチド配列は、ヒト胎児脳ファージcDNAライブラリーにおいて同定され、PTPζSM2のmRNAヌクレオチド配列は、成人ヒト脳cDNAのPCR増幅によって同定された。
【０１７９】
下記のように実施されたRT-PCR分析のため、製造業者のプロトコルに従い、Trizol（Gibco Life Technologies,Inc.）を使用して、細胞（神経膠芽腫培養系）又は組織のいずれかから全RNAを単離した。Gibco Life Technologies,Inc.製の第一鎖（1^st Strand）合成キット、及びオリゴdT₃₀アンカープライマー（anchored primer）を使用して、全RNAからcDNAを生成させた。各RT-PCR反応に、1μlのcDNAを使用した。PCR反応は、標準的な条件の下で、アドバンテージ（Advantage）2キット（Clontech）を使用して実施した。PCR反応の産物を、配列決定を介して確認した。
【０１８０】
両方のクローンが、膠芽腫細胞系及び原発性腫瘍のRT-PCR分析によって確認された。PTPζSM1については、同定可能な1116bpの産物が産生されるプライマー

及び

を使用した。プローブのハイブリダイゼーション標的として特有の3'末及び3'非翻訳領域の部分を使用して、RT-PCR分析を実施し、試験された17個の異なる神経膠芽腫細胞系のうちの11個、胎児脳、及び成人脳において、SM1スプライスバリアントの発現を確認した。さらに、28個の原発性脳腫瘍試料に対してRT-PCR分析を実施し、28個の腫瘍のうちの16個においてPTPζSM1バリアントの発現を確認した。
【０１８１】
PTPζSM2については、エキストラエキソン23aが存在する場合には130bp産物が産生され、エキソン23aが存在しない場合には産物が産生されないプライマー

及び

を使用した。RT-PCR分析を実施し、試験された17個の異なる神経膠芽腫細胞系のうちの6個において発現を確認した。さらに、28個の原発性脳腫瘍試料に対してRT-PCR分析を実施し、28個の腫瘍のうち19個においてPTPζSM1バリアントの発現を確認した。
【０１８２】
比較のため、28個の脳腫瘍組織試料において、PTPζ-α（プライマー

及び

及びPTPζ-β（プライマー

及び

の発現についても、RT-PCR分析を行った。PTPζ-αは、28個の試料のうち16個において発現されていることが示され、短縮型PTPζ-βは、28個の試料のうち19個において発現されていることが示された。
【０１８３】
2個の新たなスプライスバリアントの、PTPζ-αについての参照配列とのヌクレオチド配列アラインメントを、表2に示す。
【０１８４】
【表２】

^＊＊ヒト第7染色体解析途中のドラフト（NT_007845.3）より決定された境界
^＊＊ヌクレオチド位置は全長RPTPZ（アクセッション番号M93426）における位置をさす
【０１８５】
実施例 3
タンパク質標的に対する抗体の活性を決定するための細胞遊走アッセイ法
腫瘍細胞は化学誘引物質へと比較的迅速に遊走することが知られており、遊走の能力は、腫瘍形成性の尺度として扱われている。一般に使用されている化学誘引物質は、ウシ胎仔血清、プレイオトロフィン、bFGF、及びVEGFである。このアッセイ法は、標的遺伝子がノックダウン又は過剰発現させられている細胞の遊走能を決定するために使用される。
【０１８６】
製造業者の指示をわずかに修飾したものに従い、ChemoTx（登録商標）ディスポーザブルケモタキシスシステム（Neuroprobe Inc.、Gaithersburg、MD）を使用する。簡単に説明すると、細胞系G55T2に由来する神経膠芽腫培養細胞を、アッセイ法を実施する前の日に細胞を分割することにより調製する。以下の仕様のChemoTx（登録商標）チャンバーを使用する：孔サイズ8μM、露出フィルター面積8mm²、露出フィルターエリア直径3.2mm。プレートの配置は：1ウェル当たり30μl、96穴プレートである。膜の型は、トラックエッチド（Track-etched）ポリカーボネートである。
【０１８７】
アッセイ法の準備として、フィルター膜を、37℃で一夜、0.1％酢酸及び3.5mlのビトロジェン（Vitrogen）100（Cohesion製）を含有している100mlのPBSでコーティングする。アッセイ開始の約30分前に、コーティングされた膜を洗浄し、0.1％BSAを含有しているPBSで濯ぐ。標準的な技術（トリプシン-EDTA）を使用することにより、細胞を採集する。細胞を、DMEM10％FBSで一回洗浄し、次いで室温で5分間1000RPMでスピンする。ペレットを、0.1％BSAを含有している無血清DMEM（無血清培地）に再懸濁させる。細胞をスピンし、再び無血清培地に懸濁させ、次いでスピンし、1mio.細胞/ml又は25ul当たり25,000細胞という濃度を提供するために必要な量の無血清培地に再懸濁させる。アッセイの直前に、抗標的機能活性に関して試験すべき抗体を、適当量、細胞懸濁液に添加する。
【０１８８】
アッセイ法については、標準的な化学誘引物質を、細胞の移動度を測定するために使用する。化学誘引物質を無血清培地で稀釈する。適当な非特異的化学誘引物質は、5％FBSを含むDMEMである。化学誘引物質溶液及び化学誘引物質を含まない対照溶液を、ピペットで、下方プレートウェルへと移す（29μl）。下方ウェル内の溶液との接触が保証されるよう、下方ウェルの上にフィルタープレートを設置し固定した後、細胞懸濁液の段階稀釈物を、フィルタートップ上の各部位へとピペットで移す。次いで、プレートを覆い、37℃、5％CO₂で、3〜4時間インキュベートする。
【０１８９】
インキュベーションの後、上方フィルター側面をPBSで濯ぎ、露出させ、上方フィルターエリアを湿った綿球で清浄化する。製造業者の指示に従い、Diff-Quik（商標）（VWR）色素キットを使用して、フィルターを染色する。1ウェル当たり5個の高倍率視野セクションを計数することにより、顕微鏡（倍率200×）を使用して、下方フィルター側面に遊走した細胞を計数する。
【０１９０】
実施例 2
抗体の活性を決定するための内皮発芽アッセイ法
細胞発芽形態学は、ARP2のような内皮細胞発芽を刺激するタンパク質標的に関するタンパク質標的機能に対する候補抗体の阻害効果を決定するため、容易に可視化されるアッセイ法として使用されている。そのようなアッセイ法は、文献に充分に記載されている（Nehls,V.ら、Histochem.Cell Biol.104：459-466（1995）；Koblizek,T.I.ら、Curr.Biol.8：529-532（1988）；及びKwak,H.J.ら、FEBS Lett.448：249-253）。簡単に説明すると、HUVEC又はPPAEC（ブタ肺動脈内皮細胞）のような、適切な起源に由来する内皮細胞を、マイクロキャリアー（MC）ビーズ（直径175μm、Sigmaより入手可能）の上でコンフルエンスにまで増殖させ、適切な有効濃度のタンパク質標的（200ng/mlが、当業者が最適化し得る適当な出発である）、及び適切な濃度範囲（これは、抗体の力価及び標的に対する親和性に依存すると考えられる）の抗体、及び200単位/mlのトラジロール（Trasylol）（Bayerより入手可能）を含有している2.5mg/mlフィブリノーゲンゲルへと置く。フィブリンゲルを、同じ量の組換えタンパク質及び抗体、2.0％熱不活化ウシ胎仔血清、並びに200単位/mlのトラジロールを毎日補足しながら、M-199の中でインキュベートする。3日後に、位相差顕微鏡を使用して発芽の程度を決定する。抗体を含まない対照と比較した細胞発芽の減少を、抗体によるタンパク質標的活性の減少の指標とする。
【０１９１】
以上は、本発明の態様を例示するためのものであり、決して、本発明を制限するためのものではない。特定の修飾に関して本発明を記載したが、それらの詳細は制限として解釈されるべきではなく、本発明の本旨及び範囲を逸脱することなく、様々な等価物、変化、及び修飾が可能であることが明らかであると考えられ、そのような等価な態様は、本発明に含まれることが理解される。全ての出版物及び特許出願が、個々の出版物又は特許出願が各々特別に個別に参照として組み込まれると示されたかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】2個の新たに発見されたPTPζのスプライシングバリアントイソ型の概略図。イソ型のドメインのおよその位置が、およそのエキソンサイズと共に、イソ型の下に示されている（サイズの参照について、エキソン12は3.6キロ塩基である）。SM1は、第9エキソンの後で正確なスプライシングを受けることができず、エキソン9の正常な末端の後に、2個の余分なコドンが存在し、その後に終止コドンが存在するmRNAを与える。SM2は、エキソン23とエキソン24との間に116ヌクレオチドの挿入を含有している。[Background Art]
[0001]
Background of the Invention
Among tumors, brain tumors are thought to have one of the least favorable prognosis for long-term survival: the life expectancy of individuals diagnosed with central nervous system (CNS) tumors is only 8 to 12 months. Several unique characteristics of both the brain and its particular type of neoplastic cells make perfect treatment and management of brain tumors difficult. Among these are the physical characteristics of the intracranial space; the relative biological isolation of the brain from the rest of the body; the relatively essential and inexchangeable nature of organ masses; and the unique properties of brain tumor cells. included.
[0002]
The intracranial space and physical layout of the brain create significant obstacles to treatment and recovery. The brain consists of astrocytes, which make up the bulk of the brain mass and function as scaffolds and supports for nerve cells, nerve cells that conduct the actual electrical shock of the nervous system, and insulating cells that make up myelin. It is mainly composed of other minor cell populations, such as oligodendrocytes. These cell types give rise to primary brain tumors, including astrocytomas, neuroblastomas, glioblastomas, oligodendrogliomas, and the like.
[0003]
The brain is housed in a rigid skull shell and protected by a cushion of cerebrospinal fluid. Due to the relatively small volume of the cranial cavity, small changes in the volume of tissue in the brain can dramatically increase intracranial pressure and cause injury to whole organs. Thus, even small tumors can have significant deleterious effects on brain function. Brain surgery and procedures are also difficult and subtle procedures due to the cramped physical location of the skull. However, surgery is often the first attack strategy in treating brain tumors due to the risk of increased intracranial pressure from the tumor.
[0004]
In addition to physical isolation, the brain is chemically and biologically isolated from the rest of the body by the "blood-brain barrier" (or BBB). This physiological phenomenon is due to the "tightness" of epithelial cell junctions in the lining of blood vessels in the brain. Nutrients actively transported through the cell lining can reach the brain, but exclude other molecules from the bloodstream. This prevents toxins, viruses, and other potentially dangerous molecules from entering the brain cavity. However, it also prevents therapeutic molecules, including many chemotherapeutic agents useful in other types of tumors, from passing into the brain. Thus, many therapeutic agents that are directed to the brain are delivered directly to the brain cavity, for example, by an Ommaya reservoir, or are elevated to ensure diffusion of an effective amount through the BBB. Must be administered in dosages.
[0005]
Because of the difficulty in administering chemotherapeutic drugs to the brain, radiation therapy approaches have also been tried. However, the amount of radiation required to completely destroy potential tumorigenic cells also results in unacceptable loss of healthy brain tissue. Preserving a patient's cognitive function while eliminating the tumor mass is another challenge in treating brain tumors. Neoplastic brain cells are often prone to spread and migrate throughout the brain mass. Thus, unlike, for example, lung or bladder cancer, it is not possible to define a true “tumor margin”. Unlike cancers of the genital tract (ovary, uterus, testis, prostate, etc.), breast, kidney, or lung cancers, whole organs cannot be removed, or a significant portion of them, must be removed to prevent the growth of new tumors. It cannot even be removed. In addition, brain tumors are highly heterogeneous, with different cell doubling times, treatment resistance, and other biochemical specificities between the various cell populations that make up the tumor. This breadth and variability greatly increases the difficulty of treating brain tumors while preserving the health and function of normal brain tissue.
[0006]
Current surgical methods have provided patients with a much better post-operative life, but current combination therapies (surgery, low-dose radiation, and chemotherapy) have been compared to methods 30 years ago. Only improved the life expectancy of the patient for a month. The prognosis of these patients cannot be significantly improved because there is no effective drug to prevent the growth of brain tumor cells outside the main tumor mass. Although several immunoaffinity agents have been proposed and tested for the treatment of brain tumors (see, for example, Tenascin targeting agents described in US Pat. No. 5,624,659), these agents are Has not been proven to be sufficient for Thus, there is an urgent need for therapeutic agents that can specifically target and kill brain tumor cells, directed to new molecular targets, for the treatment of brain tumors.
[0007]
Related literature
Analysis of differential gene expression in glioblastomas is particularly described, for example, in Mariani et al. (2001).J Neurooncol 53 (2): 161-76; Markert et al. (2001).Physiol Genomics 5 (1): 21-33; Yano et al. (2000)Neurol Res 22 (7): 650-6; Kroes et al. (2000)Cancer Lett 156 (2): 191-8; and Reis et al. (2000).Am J Pathol 156 (2): 425-32.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0008]
Summary of the Invention
The present invention relates to a brain tumor protein target (T_BTThe present invention provides methods and reagents for specifically targeting brain tumor neoplastic cells for both therapeutic and imaging purposes. These targets have been identified to be overexpressed in brain tumors and, therefore, selectively inhibit or inhibit cellular function by therapeutic or visualizing compositions with specific affinity for these protein targets. Enables selective marking for visualization. The present invention provides methods for identifying compounds that modulate the expression of genes involved in such tumors or the activity of gene products, and administering such compounds to individuals suffering from such tumors. Also provided is a method for the treatment of a disease by: The present invention also includes two novel isoforms of PTPζ, SM1 and SM2.
[0009]
Detailed description of the embodiment
Provided herein are brain tumor protein targets and genes that are differentially expressed between brain tumor tissue and normal brain tissue. Differential cloning between cancerous and normal brain identified brain tumor protein target genes by DNA sequence analysis. Genes and their protein products that are up-regulated in glioblastomas are important because they provide specific markers for neoplastic cells and are predicted to mediate brain tumor initiation and progression. Inhibition of gene and / or protein activity can be attributed to brain tumors such as glioblastoma multiforme; ependymoma; glioma; astrocytoma; medulloblastoma; glioma; oligodendrogliomas; It may be advantageous in treatment. Overexpressed brain oncoprotein targets can be used to deliver cytotoxic agents that directly promote tumor cell death or to modify the function of brain tumor protein targets to inhibit the normal physiology of tumor cells Provide an excellent target for In addition, immunoimaging agents directed to brain tumor protein targets can be used in diagnostic methods, such as magnetic resonance imaging (MRI), radiography, and the like, for example, by the use of optically visible dye moieties in immunoimaging agents, and // In surgery, it can be used to visualize a tumor mass.
[0010]
Therapeutic and prophylactic treatments for individuals who have or are at high risk of having a brain tumor include T_BTModulate the activity of the protein or gene, or_BTAdministering a therapeutic or prophylactic amount of an agent that specifically binds to the protein is included. For example, if the chemotherapeutic agent is T_BTIt can be coupled to a specific binding moiety.
[0011]
Screening methods include T_BTIf it involves performing various types of assays to identify agents that modulate the expression or activity of the gene or protein, or_BTScreening for specific binding activity to a gene or protein may be included. The lead compounds and / or binding moieties identified in these screens can be used as a basis for the synthesis of more active analogs. The lead compounds and / or active analogs generated therefrom can be formulated into pharmaceutical compositions that are effective in treating brain tumors.
[0012]
Disease state
The method of the present invention is applicable to brain tumors, especially glioblastomas. In general, the goal of brain tumor treatment is to remove as much of the tumor cells as possible, for example by surgery, to kill as much of the cells remaining after surgery as possible by radiotherapy and / or chemotherapy, radiation therapy and chemotherapy Is to put the remaining tumor cells into a non-dividing dormant state for as long as possible. Careful image surveillance is an important part of medical care, as tumor regrowth requires a change in current treatment or, for patients in the observation phase, resumption of treatment.
[0013]
Brain tumors are classified by the type of cells that the tumor is thought to have originated. Diffuse fibrous astrocytoma is the most common type of primary brain tumor in adults. These tumors are histopathologically called World Health Organization (WHO) grade II astrocytomas, WHO grade III anaplastic astrocytomas, and WHO grade IV glioblastoma multiforme (GBM). Classified into three grades. WHO grade II astrocytomas are the most inactive in the diffuse astrocytoma spectrum. Astrocytomas show a pronounced tendency to invade the surrounding brain, and therefore, attempting therapeutic local regulation is difficult. These invasive abilities are often found in low-grade as well as high-grade tumors.
[0014]
Glioblastoma multiforme is the most aggressive astrocytoma stage, with survival less than 2 years in most patients. Histologically, these tumors are characterized by dense cellularity, high growth index, endothelial proliferation, and localized necrosis. The high proliferative potential of these lesions is likely due to multiple mitogenic effects. One of the characteristics of GBM is endothelial proliferation. Numerous angiogenic growth factors and their receptors are found in GBM.
[0015]
Astrocytomas have a biological subset, which may reflect the clinical heterogeneity observed in these tumors. These subsets include brainstem gliomas, a form of childhood diffuse fibrous astrocytoma that often follows a malignant course. Brain stem GBMs have the same genetic characteristics as adult GBMs, which occur in relatively young patients. Pleomorphic astrocytoma (PXA) is a superficial, low-grade astrocytic tumor that primarily affects young adults. These tumors have a strange histological appearance, but are typically slow growing tumors that are susceptible to surgical healing. However, PXA can recur as GBM. Piliocyte astrocytoma is the most common astrocytoma in children and differs clinically and histopathologically from diffuse fibrous astrocytoma that develops in adults . Pilocytic astrocytomas do not have the same genomic alterations as diffuse fibrous astrocytomas. Subependymal giant cell astrocytoma (SEGA) is usually associated with tuberous sclerosis (TS) and is called "candle-gutterings" that line the ventricles of TS patients. Histologically identical, low-grade astrocytic tumors around the ventricle. Like other neoplastic lesions in TS, they grow slowly and are more like hamartomas than true neoplasms. Infantile fibrogenic cerebral astrocytoma (DCAI) and fibrogenic infant ganglion glioma (DIGG) occur in large, superficial, usually cystic, one- or two-year-old children. It is a benign astrocytoma.
[0016]
Oligodendroma and oligoastrocytoma (mixed glioma) are the most closely related, both clinically and biologically, to diffuse fibrous astrocytomas, A cerebral tumor. However, these tumors are less common than astrocytomas and generally have a better prognosis than diffuse astrocytomas. Oligodendroma and oligodendroastrocytoma may progress to WHO grade III anaplastic oligodendrogliomas or anaplastic oligoastrocytomas, or WHO grade IV GBM. Thus, genetic changes that lead to oligodendrocyte tumors constitute yet another pathway to GBM.
[0017]
Ependymomas are a group of clinically diverse gliomas, ranging from aggressive intraventricular tumors in children to benign spinal cord tumors in adults. Ependymoma progression to GBM is rare. Choroid plexus tumors are also a diverse group of tumors that occur preferentially in the ventricular system, from aggressive supratentorial ventricular tumors in children to benign cerebellar pontine angle tumors in adults. Choroid plexus tumors have been reported occasionally in patients with Li-Fraumeni syndrome and von Hippel-Lindau (VHL) disease.
[0018]
Medulloblastoma is a highly malignant, undifferentiated tumor that originates in the posterior fossa, mainly in children. Meningioma is a common intracranial tumor that begins in the meninges and compresses the basal brain. Meningiomas are usually benign, but there are also "atypical" meningiomas that recur locally, and meningiomas that are clearly malignant and invade or metastasize to the brain. Atypical meningioma and malignant meningioma are less common than benign meningioma. Schwannomas are benign tumors that occur on peripheral nerves. Schwannomas occur in cranial nerves, especially in the vestibular part of the eighth cranial nerve where they exist as cerebellar pontine horns (vestibular schwannoma, acoustic neuroma). Hemangioblastomas are tumors of unknown origin, composed of endothelial cells, pericytes, and so-called stromal cells. These benign tumors are most frequent in the cerebellum and spinal cord of young adults. Multiple hemangioblastomas are characteristic of von Hippel-Lindau (VHL) disease. Hemangiopericytoma (HPC) is a dural tumor that behaves locally and may metastasize. The histogenesis of dura-based hemangiopericytoma (HPC) has been debated for many years, and some authors have classified it as a separate entity, while others have classified it as a subtype of meningioma.
[0019]
Both the symptoms of primary and metastatic brain tumors depend mainly on their location in the brain and on the size of the tumor. Symptoms are likely to fluctuate significantly because each area of the brain performs a specific function. Tumors in the frontal lobe of the brain can cause weakness and paralysis, mental illness, impaired thinking, confusion and disorientation, and wide mood swings. Parietal lobe tumors can cause seizures, numbness or numbness, impaired writing, loss of ability to answer simple math problems, impaired movements, and loss of touch. Occipital lobe tumors can cause visual loss, hallucinations, and seizures in half of each field. Temporal lobe tumors can cause seizures, impaired perception and space, and receptive aphasia. If the tumor develops in the cerebellum, ataxia, loss of coordination, headache, and vomiting can occur. Hypothalamic tumors can cause changes in emotions, as well as changes in the perception of heat and cold. In addition, hypothalamic tumors can affect the growth and nutrition of children. With the exception of the cerebellum, tumors on one side of the brain cause symptoms and disability on the other side of the body.
[0020]
Other diseases of the nervous system that can be treated or imaged by the compositions of the present invention include ischemic stroke, brain cancer, epilepsy, schizophrenia, depression, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, head trauma, Dementia, coma, stupor, headache (and other neurological pain), dizziness, weakness, myasthenia gravis (and other disorders of the neuromuscular junction), ataxia, and cerebellar disorders (such as Bell's palsy) Infectious disorders, including cranial nerve disorders, cerebrovascular disorders, bacterial, fungal, viral, and parasitic infections, multiple sclerosis, and pregnancy, medical illness, alcohol and substance abuse, toxins, and metabolic deficiencies Other complications associated with, but not limited to,
[0021]
T_BTGene identification
A gene sequence comprising all or part of a cDNA sequence that is differentially expressed in brain tumor cells, particularly glioblastoma cells, as compared to a normal or non-disease state, is referred to herein as "T_BT"T" that encodes "protein"_BTGene ". T_BTGenes were identified by generating subtracted and standardized cDNA libraries from glioblastoma tissue. CDNAs from control and disease states were subjected to kinetic reannealing hybridizations, during which normalization of transcript abundance and enrichment of low abundance transcripts were performed. Transcripts that are differentially up- or down-regulated in the tumor can be enriched by using a second driver cDNA, followed by a "forward" or "reverse" subtraction step. Only clones showing significant transcriptional induction and / or repression were sequenced and advanced to expression profiling using a variety of temporal, spatial and disease-related probe sets. Selected clones showing significant transcriptional induction and / or repression were sequenced and functionally annotated in the proprietary database structure (see WO 01/13105). Because the large sequence fragments were used in the sequencing step, the data generated is much more reliable and specific than other approaches such as SAGE. The resulting sequence information was compared to public databases using the BLAST (blastn) algorithm for DNA sequence comparison and iterative Smith-Waterman analysis for protein sequence comparison. The results are listed in Table 1. Table 1 includes human and animal sequence counterparts, as indicated by shared internal reference names in some cases.
[0022]
[Table 1]

[0023]
Transcripts representing differentially expressed genes use a variety of methods known to those of skill in the art, including differential screening, subtractive hybridization, differential display, or hybridization to an array containing multiple gene sequences. Thus, it can be identified.
[0024]
"Differential expression", as used herein, refers to the quantitative and qualitative differences in the temporal and / or systematic expression patterns of a gene. Thus, a differentially expressed gene may have expression that is activated or inactivated in a normal state as compared to a neuronal disease state, or in a control state as compared to an experimental state. Such qualitatively regulated genes are likely to exhibit an expression pattern in a particular tissue or cell type that is detectable in either control samples or tumor samples, but not both. Detectable, as used herein, refers to an RNA expression pattern that is detectable via standard techniques of differential display, (reverse transcription) PCR, and / or Northern analysis known to those of skill in the art. . Generally, differential expression is at least a 20% change between expression in diseased tissue and control tissue, and in other examples, at least 2-fold, 3-fold, 5-fold, or 10-fold. It means that there is a difference. The difference is usually statistically significant, ie, the probability of a difference occurring by chance (P value) being lower than a predetermined level (eg, 5%). Typically, the confidence interval (P value) is <0.05, more typically <0.01, and in other examples <0.001.
[0025]
Alternatively, a differentially expressed gene may have regulated, ie, quantitatively increased or decreased, expression in a normal state compared to a disease state, or in a control state compared to an experimental state. . The difference in expression need only be large enough to be visualized via standard detection techniques as described above. Generally, the difference in expression level as measured by the presence of either mRNA or protein product will be at least about 2-fold, usually at least about 5-fold, and will differ from basal levels (ie, normal tissue), but will be 10-fold or It may be 100 times or more.
[0026]
T_BTIdentification of pathway genes can be performed by physical association of gene products or by database identification of known physiological pathways. Methods for detecting protein-protein association include co-immunoprecipitation, cross-linking, and co-purification by gradient or chromatography columns. Chien et al. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 9578-9582 detects the association of proteins in vivo. The two-hybrid system or its associated methodology can be used to screen activation domain libraries for proteins that interact with known "bait" gene proteins.
[0027]
After a sequence has been identified to be differentially expressed, the sequence can be subjected to a function confirmation process to determine if the gene plays a role in tumor initiation, progression, or maintenance. Such candidate genes may be correlated with a wide variety of cellular states or activities. The term "functional confirmation", as used herein, relates to a reference cell in which modulation of the expression or function of a candidate gene or set of such genes can be a cell population, such as a tissue or an entire organism. A process for determining whether to cause a detectable change in the activity or state of a cell. The detectable change or modification that is detected can be any activity exhibited by the reference cell. Specific examples of activities or conditions in which the alteration may be detected include phenotypic changes (eg, cell morphology, cell proliferation, cell survival, and cell death); resistance to past susceptibility, or not previously present. Protein / protein interaction; cell migration; intracellular or intercellular signaling; cell / cell interaction; cell activation (eg, T cell activation, B cell activation, mast cell depopulation). Granules); release of cell components (eg, hormones, chemokines, etc.); and metabolic or catabolic reactions (including but not limited to).
[0028]
Various alternatives can be used to confirm the function of a candidate gene. Methods such as RNAi technology can be used. Antisense technology can also be used to confirm the function of a candidate gene. In this approach, an antisense polynucleotide that specifically hybridizes to a segment of the coding sequence of the candidate gene is administered to inhibit expression of the candidate gene in cells into which it is introduced. The functional role that a candidate gene plays in a cell may be assessed using a gene `` knockout '' approach that deletes, modifies, or inhibits the candidate gene in one or both alleles . Cells or animals can optionally be reconstituted with the wild-type candidate gene as part of further analysis.
[0029]
In one embodiment of the invention, RNAi technology is used in function confirmation. As used herein, RNAi technology refers to the transfer of double-stranded RNA into cells expressing a candidate gene to inhibit the expression of the candidate gene, i.e., for `` silencing '' its expression. Refers to the process performed. The dsRNA is selected to have substantial identity with the candidate gene. Generally, such methods involve first transcribing a nucleic acid containing all or a portion of a candidate gene into single-stranded or double-stranded RNA. The sense and antisense RNA strands are annealed under appropriate conditions to form dsRNA. The resulting dsRNA is introduced into a reference cell via various methods, and the degree of attenuation of the expression of the candidate gene is measured using various techniques. Usually, it is detected whether the inhibition alters the state of the cell or the activity of the cell. The dsRNA is prepared to be substantially identical to at least one segment of the candidate gene. Sequence variation between two species arising from genetic variation, evolutionary divergence, and polymorphisms may be tolerated because only substantial sequence similarity between the candidate gene and the dsRNA is required . In addition, dsRNA may contain various modified nucleotides or nucleotide analogs. Usually, dsRNA consists of two separate complementary RNA strands. However, in some cases, the dsRNA may be formed by a single self-complementary RNA strand, such that the strand unwinds to form a hairpin loop. Regardless of the form, RNA duplex formation can occur inside or outside the cell.
[0030]
dsRNA can be prepared according to any of a number of methods known in the art, including in vitro and in vivo methods, as well as synthetic chemistry approaches. Examples of such methods include Sadher et al. (Biochem. Int. 14: 1015, 1987); Bhattacharyya (Nature 343: 484, 1990); and Livache et al. (US Pat. No. 5,795,715), each of which is fully incorporated by reference. (Incorporated herein), but is not limited thereto. Single-stranded RNA can also be made using a combination of enzymatic and organic synthesis, or by completely organic synthesis. The use of synthetic chemistry makes it possible to introduce the desired modified nucleotides or nucleotide analogs into dsRNA. dsRNA may be prepared in vivo according to a number of established methods (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed .; Transcription and Translation (ed. BD Hames and SJ Higgins, 1984); DNA Cloning, Volumes I and II (Ed. DNGlover, 1985); and Oligonucleotide Synthesis (Ed. MJ Gait, 1984, each of which is fully incorporated herein by reference) dsRNA was formed. Later, it is introduced into the cell, eg, the neuroblastoma cell line determines the functional association of the gene identified by the techniques described herein with tumor growth, metabolism, or metastasis. It can be used as a model system for investigation.
[0031]
A number of alternatives can be used to deliver dsRNA to a cell or cell population, such as a cell culture, tissue, or embryo. For example, RNA can be introduced directly into cells. Various physical methods, such as administration by microinjection (e.g., Zernicka-Goetz et al. (1997) Development 124: 1133-1137; and Wianny et al. (1998) Chromosoma 107: 430-439) are generally used in such cases. Used in Other alternatives for cell delivery include permeabilization and electroporation of cell membranes in the presence of dsRNA, liposome-mediated transfection, or transfection using chemicals such as calcium phosphate. Numerous established gene therapy techniques can also be used to introduce dsRNA into cells. By introducing a viral construct into a viral particle, for example, introduction of an expression construct into a cell and transcription of the RNA encoded by the construct can be efficiently achieved.
[0032]
Numerous alternatives can be used to detect interference with candidate gene expression (ie, to detect candidate gene silencing). Generally, inhibition of expression is detected by detecting a decrease in the level of a protein encoded by the candidate gene, determining the level of mRNA transcribed from the gene, and / or detecting a phenotypic change associated with the candidate gene expression. You.
[0033]
TBT gene and TBT polypeptide
ARP-2 (SEQ ID NO: 7) has multiple proteins, such as a hydrophobic signal sequence of amino acids 1-21, a coiled-coil domain at the amino terminus of about amino acids 22-274, and a fibrinogen-like domain of about residues 275-493. A 64 kDa, single-chain, acidic, angiopoietin-like protein containing a functional domain. Two major isoforms have been observed, one 2.4 Kb in size and the other about 4 Kb in size. Epitopes of interest include fibrinogen regions, coiled coil domains, extracellular regions, and the like. It has been hypothesized that the fibrinogen domain of human ARP-2 interacts with one or more unknown receptors for the purpose of angiogenesis. The interaction of ARP-2 with these molecules may be due to any of the aforementioned structural motifs.
[0034]
SPARC (SEQ ID NO: 8) is a C-terminal extracellular cell containing a flexible N-terminal acidic domain I (approximately 50 amino acids), a follistatin-like (FS) domain (approximately 75 residues), and a pair of EF-hand loops Abundant, 33 kDa, single-chain, acidic extracellular calcium-binding protein containing a calcium-binding (EC) domain (approximately 150 residues). The N-terminal domain represents a low-affinity Ca2 + binding site, a transglutaminase cross-linking site, and inhibits cell spreading in cell culture assays. Calcium-dependent binding of SPARC to several fibrillar collagen types and basement membrane collagen type IV triple helices has been mapped to the EC domain. Two isoforms have been described, bone SPARC with a molecular weight of 31,000 kDa and platelet SPARC with a molecular weight of 33,000 kDa. The EC domain of human SPARC is known to interact with collagens I, III, IV, and V and bind vitronectin (all of which are components of the extracellular matrix surrounding gliomas). The association of SPARC with these molecules may play an important role in carcinogenesis and neoplastic cell growth in the brain.
[0035]
c-MET (SEQ ID NO: 9) is a type I membrane protein heterodimer. From a 170 kDa common single-stranded precursor, two different receptor variants are generated by post-translational processing. The isoform p190MET is composed of a disulfide-bonded 50 kDa α-chain and a 145 kDa β-chain, and the isoform pl40Met consists of a 50 kDa α-chain and an 85 kDa β-chain lacking the cytoplasmic kinase domain Have been. This 85 kDa β chain is likely to be a transmembrane glycoprotein bound to the cell surface. A truncated c-MET containing a 50 kDa α chain and a 75 kDa β subunit with a truncated carboxyl terminus has also been described. The 75 kDa form is generated by post-translational proteolytic processing, lacks the transmembrane domain, and is secreted from cells. Both secreted and membrane-bound forms are of interest. The amino acid sequence of full length c-MET consists of 1408 amino acids (Park et al. (1987) P.N.A.S.84: 6379-6383) and 1390 amino acids (Prat et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11: 5954-5962). The signal sequence is composed of the N-terminal amino acids 1 to 24; the α-chain (amino acids 24-306) constitutes the extracellular domain; the β-chain constitutes the extracellular domain (amino acids 306-932) . The transmembrane segment is between amino acids 933 and 955, and the intracellular domain is composed of amino acids 956-1390.
[0036]
BEHAB (SEQ ID NO: 12) has two isoforms, a full-length isoform secreted into the extracellular matrix and a relatively short isoform with a hydrophobic carboxy terminus that predicts a glycophosphatidylinositol (GPI) anchor. Exists in. BEHAB is an N-terminal hyaluronan (HA) -binding domain containing an immunoglobulin-like loop and two proteoglycan tandem repeats, a C-terminal epidermal growth factor (EGF) -like repeat, a C-type lectin-like domain, and a complement control protein (CRP) -Like domain. The central region of the protein contains sites for glycosylation and proteolysis (during the mature protein, glu395-ser396, after signal peptide degradation) by metalloproteases. The complete cDNA of the secreted isoform is 2878 bp, encoding 912 amino acids of 99 kDa. The GPI isoform is 2558 bp. GPI-linked forms are generated by the "no splice" phenomenon of transcripts that read through exon / intron junctions, thereby extending the open reading frame to a stop codon 74 nucleotides downstream. Up-regulation of BEHAB may be a critical step in transforming a non-compliant mature extracellular matrix into a more immature matrix that allows cell growth, thereby promoting primary brain tumor progression .
[0037]
CD-44 (SEQ ID NOs: 10; 11) is a proteoglycan expressed as two major splice variants. CD-44E is a 150 kDa protein isolated from epithelial cells. CD-44E has a C-terminal cytoplasmic tail, a 23 amino acid hydrophobic transmembrane domain, and a 248 amino acid N-terminal extracellular region. The extracellular domain is O-glycosylated and also binds chondroitin sulfate. In addition, CD-44E has two of the three immunodominant epitope clusters of native gp90 Hermes. CD-44E contains an additional 132 amino acids in the extracellular region, and CD-44H is a 90 kDa protein isolated from hematopoietic cells. In addition, CD-44R1 and CD-44R2 are two isoforms expressed by hematopoietic cells. The complete cDNA sequence of the 90 kDa CD-44H isoform consists of 1795 bp encoding a 341 amino acid protein. The CD-44H protein has an overall primary structure of 90 kDa consisting of 341 amino acids. The N-terminus is located extracellularly and the extracellular domain consists of 248 amino acids. The C-terminus is located intracellularly, the intracellular domain consists of 72 amino acids, and the transmembrane region consists of 21 amino acids. The CD-44 gene contains 20 exons, of which exons 1-5, 15-17, and 19 encode the CD44H isoform. The intervening exons 6, 6a, 7-14 (also called v1-v10) undergo alternative splicing and form a variant isoform with an insertion between amino acids 202 and 203 in the membrane proximal region of the extracellular domain. Generate. CD-44 is one of the major receptors for hyaluronic acid. In the normal CNS, the CD-44 protein is localized to astrocytes in white matter. CD-44H has been shown to be the predominant isoform in normal brain and neuroectoderm-derived tumors. Thus, up-regulation of CD-44 may be a critical step in the invasiveness and migration of brain tumors.
[0038]
Tetraspanin (TSPAN3) (SEQ ID NO: 13) is a 253 amino acid membrane-bound protein. TSPAN3 contains four transmembrane domains that include amino acids 12-32, 51-71, 86-106, and 213-233. The protein has two extracellular domains, amino acids 33-50 and 107-212, and three cytoplasmic domains, amino acids 1-11, 72-85, and 234-235. Cysteine residues at positions 147, 148, and 197 of the second extracellular domain are highly conserved in the tetraspanin family and are believed to be essential for proper tetraspanin function.
[0039]
VIPR-2 (SEQ ID NO: 14) is a seven-transmembrane G protein receptor. The complete VIPR-2 protein is encoded by 13 exons. The start codon of the open reading frame encoding the predicted 438 amino acids is located at exon 1 and the termination signal is located at exon 13. The 5 'untranslated region extends 187 bp upstream of the start codon and is extremely GC-rich (80%). The polyadenylation signal is located 2416 bp downstream of the stop codon. Intron sizes range from 68 bp (intron 11) to 45 bp (intron 4), with the entire human gene ranging 117 kb and the cDNA sequence ranging 1317 bp. Recent studies have also isolated two VIP-2 receptor mRNAs, 4.6 kb and 2.3 kb in size. In the receptor, the first 22 amino acids make up the signal sequence, the remaining amino acids are two transmembrane regions of amino acids 127-148 and 158-178, and two more of amino acids 202-227 and 238-261. The other transmembrane domains of 278-303 and the last two transmembrane regions of 327-347 and 359-380, and residues 57, 87, and 91 of the amino-terminal extracellular domain. Is a seven-transmembrane protein with three potential N-linked glycosylation sites. The extracellular domain of human VIPR-2 binds PACAP-27, PACAP-38, VIP, and secretin.
[0040]
PTN or OSF-1 (SEQ ID NO: 16) is an 18 kDa, single-chain secreted protein containing 10 conserved disulfide-linked cysteine residues. The human PTN gene sequence consists of 5 exons and 4 introns. Exon 1 does not encode an amino acid sequence, exon 2 encodes a 32-amino acid hydrophobic signal sequence, exons 3 and 4 encode the amino terminus and 10 cysteine residues, 5 encodes a highly basic C-terminal domain. The mature protein consists of 136 amino acids encoded by exons 2-5. PTN has been shown to bind to the extracellular domains of RPTPβ and ζ. This binding inactivates the catalytic activity of RPTP, and PTN binds to all three major isoforms of RPTPβ and ζ. PTN has also been shown to interact with syndecan-3.
[0041]
OPN (SEQ ID NO: 15) is a abundant, 34 kDa, single-chain phosphorylated glycoprotein with putative cell adhesion sites at residues 144-148. Three isoforms, OPN-A, OPN-B, and OPNC, have been identified to be generated by post-transcriptional modifications such as alternative splicing. OPN-A and OPN-B differ by the addition of a 14 amino acid residue at residue 58 of the protein. OPN-B does not have amino acids 58-71, and OPN-C does not have amino acids 31-57. OPN is a highly hydrophilic secreted protein with a negative charge. The cDNA sequence of human bone OPN (OPN-A) has an overall structure of approximately 34 kDA consisting of 298 amino acids, 14 amino acids less than the cDNA sequence of OPN (OPN-B) isolated from human osteosarcoma. The OPN-A cDNA transcript is 1.5 kb containing a 900 nucleotide open reading frame, of which the first 16 amino acids are hydrophobic and constitute the signal sequence for secreted proteins. The OPN gene contains seven exons that splicate alternatively to generate variant isoforms, the most common variant being the addition of a 42 bp (14 amino acid) sequence located at base 280 of OPN-A. . The human OPN cell adhesion sequence (amino acids 144-148) is thought to interact with various cell surface proteins (such as CD-44) that affect cell adhesion, and almost exclusively aspartic acid residues The highly acidic stretch (amino acids 72-81) composed of is thought to be a mineral binding site in proteins.
[0042]
PTPζ exists as several splice variants, including two membrane-bound variants (full length: PTPζ-α and a relatively short version, PTPζ-β) and one secreted form (Phosphacan). The isoform PTPζ-α is a full-length isoform and contains a primary amino acid sequence aa25 to 2314 as shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (aa1 to 24 are signal polypeptides). This full-length form of PTPζ is a type I membrane protein. It contains a carbonic anhydrase-like (CAH) domain and a fibronectin type III-like (FN3) domain after the signal peptide, followed by a long cysteine-free spacer (S) domain. This is followed by an 860 amino acid long insertion domain that can be glycosylated. It has two phosphatase domains in the intracellular region after a single transmembrane segment, but only the membrane-proximal PTPase domain has catalytic activity (Krueger 1992).
[0043]
In the isoform PTP （-β, aa755 to 1614 (corresponding to the numbering of SEQ ID NO: 2) has been lost. Isoform PTPζ-S (phosphacan) is a secreted isoform containing the extracellular domain of PTPζ-α. Applicants now provide two additional novel splice variants, PTPζSM1 and PTPζSM2 (detailed below). Applicants have identified the location of the novel sequence by comparing known splice variant sequences to the novel sequence using a publicly available genomic sequence database.
[0044]
The amino acid sequence of full length PTPζ may be 2307 amino acids (see US Patent Nos. 5,604,094 and 6,160,090, which are fully incorporated herein by reference), or 2314 amino acids (Krueger et al. (1992) PNAS 89: 7417-7421). ). Amino acids 1 to 24 of SEQ ID NO: 2 are signal sequences that direct the proper placement of the transmembrane protein. The extracellular domain of the mature PTPζ protein corresponds to amino acids 25-1635 of SEQ ID NO: 2 in the long secreted form and amino acids 25-754 and 1615-1635 in the short isoform. The transmembrane region of the protein corresponds to amino acids 1636 to 1661 of SEQ ID NO: 2, and the rest of the protein forms the cytoplasmic domain, amino acids 1662-2314.
[0045]
Extracellular domains of human PTPζ include tenascin-C, tenascin-R, pleiotrophin (NM_002825), midkine (NM_002391), FGF-2 (XM_00366), Nr-CAM (NM_005010), L1 / Ng-CAM, contactin It is known to bind to (contactin) (NM_001843), N-CAM (XM_006332), and axonin (axonin) -1 (NM_005076). The first five of these molecules are components of the extracellular matrix in gliomas or are soluble factors known to be present in gliomas, and the last four are neuronal surface molecules. is there. The binding of PTPζ to these molecules may play an important role in carcinogenesis and neoplastic cell growth in the brain.
[0046]
The protein PTPζSM1 (SEQ ID NO: 3,4) contains the amino acids encoded by the first nine exons of PTPζ-α, including three unique additional carboxy-terminal amino acids. These are encoded by additional 3 'mRNA sequences (nucleotides 1262-1272) derived from the intron of the gene between exons 9 and 10. The PTPΔSM1 clone was isolated from a human fetal brain cDNA library and shown to be expressed in several human glioblastoma cell lines. The expression of this SM1 splice variant was also confirmed in primary brain tumor samples. The protein contains only the extracellular domain of PTPζ and is predicted to be secreted by cells. Thus, PTPΔSM1 may perform cell signaling or messenger functions and may bind to receptors on the surface of cells that are associated with or part of central nervous system tissue. The PTPζSM1 protein mainly contains a carbonic anhydrase-like domain.
[0047]
A comparison was made between the carbonic anhydrase domain of PTPζSM1 and other human carbonic anhydrase domains (carbonic anhydrase III, carbonic anhydrase I, and carbonic anhydrase VIX [e]. Based on alignment with the enzyme, the CA domain is unlikely to function as a carbonic anhydrase.Two of the three histidines that participate in binding to the catalytic zinc bind to the receptor CA In the active enzyme, there is a conserved HxHWG {18,20｝ ELH motif (three histidines bound to zinc), but in the receptor, this is Modified to TFHWG {18, 20} EMQ; ie, two of the three key zinc atoms are missing, and for comparison, lacking only one of these histidines Carbonic anhydrase related tamper Quality (CAH8) have also been found to be devoid of catalytic activity.
[0048]
The protein PTPζSM2 (SEQ ID NO: 5, 6) is a 116 nucleotide “extra” exon (nucleotides 6229-6345 of SEQ ID NO: 3) that is in all exons of PTPζ-α plus the correct reading frame between exons 23 and 24. And the amino acid encoded by This extra exon, named exon 23a, contains part of the intron sequence between exons 23 and 24 of the PTPζ gene. PTPΔSM2 expression was confirmed in several human glioblastoma cell lines and also in primary brain tumor samples. Since PTPΔSM2 contains all the domains of PTPΔα, its protein is predicted to be membrane-bound. Extra exons are present in the cytoplasmic domain of the protein and may therefore alter the protein tyrosine phosphatase function of PTPζSM2.
[0049]
Since PTPζSM1 and PTPζSM2 have been shown to be expressed in glioblastoma cell lines and primary tumors, the level of expression of these splice variants is important for staging or glioblastoma cell characterization. Could be useful. Such cells can be extracted, for example, from a primary tumor. Accordingly, the present invention provides for monitoring the relative expression levels of PTPζSM1 or PTPζSM2 or both, compared to each other or to one or more of the known PTPζ splice variants. In one preferred embodiment, the expression level of PTPζSM1 is compared to at least one other splice variant selected from PTPζSM2, PTPζα, PTPζβ, and phosphacan. In another preferred embodiment, the level of expression of PTPζSM2 is compared to at least one other splice variant selected from PTPζSM1, PTPζα, PTPζβ, and phosphacan. Such a comparison can be made qualitatively or quantitatively.
[0050]
Nucleic acid
T_BTThe sequence of the gene is useful in diagnostic and therapeutic methods, as well as in the recombinant production of the encoded polypeptide. Nucleic acids of the invention include nucleic acids having a high degree of sequence similarity or sequence identity to one of the sequences provided in Table 1. Sequence identity can be determined by stringent conditions, such as hybridization at 50 ° C. or higher and under 0.1 × SSC (9 mM NaCl / 0.9 mM Na citrate). Hybridization methods and conditions are well known in the art, see, for example, US Pat. No. 5,707,829. Nucleic acids that are substantially identical to the provided nucleic acid sequences, e.g., allelic variants, versions of genetically modified genes, etc., can be obtained from the sequences provided in Table 1 under stringent hybridization conditions. And one of More specific guidance on nucleic acid preparation can be found in Fleury et al. (1997).Nature Genetics 15: 269-272; Tartaglia et al., WO 96/05861; and Chen et al., WO 00/06087, each of which is fully incorporated herein.
[0051]
The genes listed in Table 1 were used to detect appropriate cDNA or appropriate probes to detect genes in genomic DNA libraries, to detect cloned DNA fragments with shared structural characteristics. It can be obtained using a variety of methods well known to those of skill in the art, including, but not limited to, antibody screening of expression libraries, direct chemical synthesis, and amplification protocols. The library is preferably prepared from cells or tissues of normal brain or brain tumor. The cloning method is described in Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152 (Academic Press, Inc. San Diego, Calif.); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual (second edition) first to first. 3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY); and Current Protocols (1994) (co-published with Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc.).
[0052]
Sequences obtained from clones containing partial or non-coding sequences were used to obtain the complete coding region by using the RACE method (Chenchik et al. (1995) CLONTECHniques (X) 1: 5-8). Can be used for Oligonucleotides can be designed from the analyzed sequences of the partial clones and then used to amplify the reverse transcribed mRNA encoding the complete coding sequence. Alternatively, probes can be used to screen cDNA libraries prepared from appropriate cells or cell lines into which the gene will be transcribed. After the target nucleic acid has been identified, it can be isolated and cloned using well-known amplification techniques. Such techniques include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), Qβ-replicase amplification, self-sustained sequence replication system (SSR), and transcription-based amplification system (TAS). ) Is included. Such methods include, for example, U.S. Patent No. 4,683,202 to Mullis et al .; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (ed. By Innis et al.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Kwoh et al. (1989) Proc. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241. : 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; and Barringer et al. (1990) Gene 89: 117.
[0053]
Instead of nucleic acid cloning, an appropriate nucleic acid can be chemically synthesized. Direct chemical synthesis methods include, for example, the phosphotriester method of Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; the phosphodiester method of Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; Beaucage et al. 1981) The diethyl phosphoramidite method of Tetra. Lett., 22: 1859-1862; and the solid-phase method of US Pat. No. 4,458,066. Single-stranded oligonucleotides are made by chemical synthesis. It can be converted to double-stranded DNA by hybridization with a complementary sequence or by polymerization with a DNA polymerase using single-stranded as a template. Chemical synthesis of DNA is often limited to sequences of about 100 bases, and longer sequences can be obtained by ligation of shorter sequences. Alternatively, the sequence may be cloned and the appropriate subsequence cut using an appropriate restriction enzyme.
[0054]
Nucleic acids can be cDNA or genomic DNA, as well as fragments thereof. The term "cDNA", as used herein, refers to nucleic acids that share the arrangement of sequence elements (exons and 3 'and 5' non-coding regions) found in the native mature mRNA species. All shall be included. Usually, an mRNA species will have a continuous open exon in which any intervening introns, if present, have been removed by nuclear RNA splicing, creating a continuous open reading frame encoding a polypeptide of the invention. are doing.
[0055]
Genomic sequences of interest include nucleic acids present between the start and stop codons as defined in the listed sequences, including all introns normally present on the native chromosome. It may further include the 3 'and 5' untranslated regions found in the mature mRNA. It contains specific transcript and translational promoters, such as promoters, enhancers, etc., containing about 1 kb (which may be larger) genomic DNA flanking either the 5 'or 3' end of the transcribed region. A control sequence may be further included. Genomic DNA flanking either the 3 'or 5' of the coding region, or internal control sequences that are sometimes found in introns, are required for proper tissue-specific, stage-specific, or disease state-specific expression And useful for investigating the up-regulation of expression in tumor cells.
[0056]
Probes specific for the nucleic acids of the invention can be generated using the nucleic acid sequences disclosed in Table 1. The probe is preferably at least about 18 nt, 25 nt, or 50 nt or more of the corresponding contiguous sequence of one of the sequences provided in Table 1, and usually less than about 2, 1, or 0.5 kb in length. It is. Preferably, the probes are designed based on a continuous sequence that remains unmasked after application of a masking program for low complexity masking. Double- or single-stranded fragments can be obtained from the DNA sequence by conventional methods such as chemical synthesis of oligonucleotides, restriction enzyme digestion, PCR amplification and the like. Probes can be labeled, for example, with a radioactive, biotinylated, or fluorescent tag.
[0057]
The nucleic acids of the invention can be isolated and obtained substantially purely, generally other than intact chromosomes. Usually, any of the nucleic acids, DNA or RNA, is obtained substantially free of other naturally occurring nucleic acid sequences and is generally at least about 50%, usually at least about 90% pure, typically It is "recombinant" in nature, for example, adjacent to one or more nucleotides that are not normally associated in a naturally occurring chromosome.
[0058]
The nucleic acid of the invention may be provided as a linear molecule or in a circular molecule, provided in an autonomously replicating molecule (vector), or a molecule that does not contain a replication sequence. Is also good. Nucleic acid expression can be controlled by self or other regulatory sequences known in the art. The nucleic acids of the invention can be transferrin polycation-mediated DNA transfer, transfection with naked or encapsulated nucleic acid, liposome-mediated DNA transfer, intracellular transport of DNA-coated latex beads, protoplast fusion, viral infection, A variety of techniques available in the art, such as electroporation, gene guns, calcium phosphate mediated transfer, and the like, can be used to introduce into appropriate host cells.
[0059]
For use in amplification reactions such as PCR, a pair of primers will be used. The exact composition of the primer sequence is not critical to the invention, but for most applications the primer will hybridize to the sequence of the invention under stringent conditions as known in the art. It is thought that. It is preferred to select a pair of primers that will generate an amplification product of at least about 50 nt, preferably at least about 100 nt. Algorithms for the selection of primer sequences are generally known and are available in commercial software packages. Amplification primers are believed to hybridize to the complementary strand of DNA and initiate replication toward each other. For hybridization probes, it may be desirable to use nucleic acid analogs to improve stability and binding affinity. It is to be understood that the term "nucleic acid" includes such analogs.
[0060]
Polypeptide
T_BTPolypeptides encoded by genes have uses for screening methods, as reagents for producing antibodies, as therapeutic agents, and the like. Such polypeptides can be made by isolation from natural sources, by recombinant methods, and by chemical synthesis. In addition, it contains deletions, additions, or substitutions of amino acid residues that result in a silent change, and thus is functionally equivalent, differentially expressed, or produces a gene product of the pathway. Polypeptides can also be useful. Amino acid substitutions can be made based on the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity of the residues involved. "Functionally equivalent", as used herein, refers to a molecule that exhibits substantially similar in vivo activity to a polypeptide encoded by an ischemia-related gene as provided in Table 1. Refers to a protein that can be made.
[0061]
Polypeptides can be made by recombinant DNA technology, using techniques well known in the art. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing the coding sequence and appropriate transcription / translation control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo / genetic recombination. Alternatively, RNA capable of encoding the polypeptide of interest may be chemically synthesized.
[0062]
Typically, the coding sequence is placed under the control of a promoter that is functional in the desired host cell to produce relatively large quantities of the gene product. A wide variety of promoters are well known and can be used in the expression vectors of the invention, depending on the particular application. Usually, the promoter selected will depend on the cell in which the promoter is active. Other expression control sequences, such as a ribosome binding site, transcription termination site, etc., may optionally be included. Constructs containing one or more of these regulatory sequences are called "expression cassettes." Expression can be achieved in prokaryotes and eukaryotic cells using promoters and other regulators appropriate for the particular host cell. Exemplary host cells include E. coli, other bacterial hosts, yeast, and various higher eukaryotic cells such as COS, CHO, and HeLa cell lines, and myeloma cell lines, including but not limited to Not included).
[0063]
In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems can be used, including retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and the like. When an adenovirus is used as an expression vector, the coding sequence of interest is ligated to an adenovirus transcription / translation control complex, such as the late promoter and ternary leader sequence. This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertions in non-essential regions of the viral genome (eg, regions E1 or E3) may result in a recombinant virus that is viable and capable of expressing differentially expressed or pathway gene proteins in the infected host. Conceivable.
[0064]
Certain initiation signals may also be required for efficient translation of the gene. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. If the complete gene, including its own initiation codon and adjacent sequences, is inserted into the appropriate expression vector, no additional translational control signals may be required. However, if only a portion of the gene coating sequence is inserted, an exogenous translational control signal must be provided. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, which can be natural or synthetic. The efficiency of expression can be enhanced by the inclusion of appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, and the like.
[0065]
In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Modification (eg, glycosylation) and processing (eg, degradation) of such protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic specific mechanisms for the post-translational processing and modification of proteins. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells that possess the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation and phosphorylation of the gene product can be used. Such mammalian host cells include, but are not limited to, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, and the like.
[0066]
For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. For example, cell lines can be engineered that stably express differentially expressed or pathway gene proteins. Rather than using an expression vector containing the viral origin of replication, the host cells can be transformed with the DNA and selectable markers regulated by appropriate expression control elements. Following the introduction of foreign DNA, engineered cells can be grown for 1-2 days in an enriched media, and then switched to a selective media. The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows the cell to stably integrate the plasmid into the chromosome and grow to form foci. The foci can be cloned and propagated into a cell line. This method can advantageously be used to engineer a cell line that expresses a target protein. Such engineered cell lines are T_BTIt may be particularly useful in screening and evaluating compounds that affect the intrinsic activity of the protein. Numerous selection systems can be used, including, but not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase gene, the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene, and the adenine phosphoribosyltransferase gene. Antimetabolite resistance is the basis for selection for dhfr, which confers resistance to methotrexate, gpt, which confers resistance to mycophenolic acid; neo, which confers resistance to aminoglycoside G-418; and hygro, which confers resistance to hygromycin. Can be used as
[0067]
Polypeptides can be labeled directly or indirectly.¹²⁵A variety of suitable labels, including but not limited to radioisotopes such as I; an enzyme labeling system that produces a detectable colorimetric signal or light when exposed to a substrate; Any of the systems can be used. Indirect labeling involves the use of proteins, such as labeled antibodies, that specifically bind to the polypeptide of interest. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries.
[0068]
After expression, the recombinant polypeptide can be purified by standard techniques in the art, including ammonium sulfate precipitation, affinity columns, ion exchange and / or size exclusion chromatography, gel electrophoresis, etc. .Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Volume 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. NY (1990)).
[0069]
As an alternative to recombinant methods, polypeptides and oligopeptides may be chemically synthesized. Such methods typically include a solid-phase approach, but solution-based chemistry and combinations or a combination of the solid-phase and solution approaches may be used. Examples of solid phase methodology for synthesizing proteins are described in Merrifield (1964) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; and Houghton (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 5132. I have. T_BTProtein fragments may be synthesized and then spliced. Methods for performing such reactions are described in Grant (1992) Synthetic Peptides: A User Guide, WH Freeman and Co., NY; and "Principles of Peptide Synthesis" (ed. Bodansky and Trost), Springer-Verlag, Inc. .NY, (1993).
[0070]
For various purposes, for example as an immunogen, T_BTEntire polypeptides or fragments derived therefrom may be used. Preferably, for example, one or more 8-30 amino acid peptide portions of the extracellular domain may be used, but peptides in the range of 10-20 are more economically desirable. Custom synthetic peptides in this range are available from a number of sources and can be ordered conjugated to KLH or BSA. Alternatively, peptides larger than 30 amino acids may be synthesized by the solid phase method, or may be made recombinantly in a suitable recombinant protein production system. Animal cell lines (eg, Sf9 or other insect cells, CHO or other mammalian cells) are preferred to ensure proper protein glycosylation and processing.
[0071]
Specific binding member
The terms “specific binding member” or “binding member” as used herein, refer to a specific binding pair, ie, one molecule (ie, a first specific binding member) that is chemically or Two molecules, usually members of two different molecules, that specifically bind to another molecule (ie, a second specific binding member) by physical means. The complementary members of a specific binding pair are sometimes referred to as a ligand and a receptor; or a receptor and a corresponding receptor. For the purposes of the present invention, two binding members may be known to associate with each other, for example when the assay is performed to detect a compound that interferes with the association of a known binding pair. Alternatively, a candidate compound predicted to be a binding partner of the compound of interest may be used.
[0072]
Specific binding pairs of interest include carbohydrates and lectins; complementary nucleotide sequences; peptide ligands and receptors; effector molecules and receptor molecules; hormones and hormone binding proteins; enzyme cofactors and enzymes; Includes lipids and lipid binding proteins. Specific binding pairs can include analogs, derivatives, and fragments of the original specific binding member. For example, a receptor and ligand pair can include peptide fragments, chemically synthesized peptidomimetics, labeled proteins, derivatized proteins, and the like.
[0073]
In a preferred embodiment, the specific binding member is an antibody. The term `` antibody '' or `` antibody portion '' refers to an epitope that is such that one or more non-covalent binding interactions stabilize the complex between the molecular structure and the epitope; It is intended to include any polypeptide chain-containing molecular structure having a specific shape that recognizes it. Antibodies that specifically bind to one of the brain tumor protein targets are called anti-brain tumor protein target antibodies, or α (TBT). A specific or selective match between a particular structure and its specific epitope is sometimes referred to as a "lock and key" match. Prototypic antibody molecules are immunoglobulins and all types of immunoglobulins from all sources, including humans, rodents, rabbits, cows, sheep, pigs, dogs, other mammals, chickens, other birds, etc. , IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc. are considered "antibodies". The antibodies used in the present invention may be polyclonal antibodies, but monoclonal antibodies can be produced by cell culture or recombination, and can be modified to reduce antigenicity. Antibodies are preferred.
[0074]
Polyclonal antibodies can be made by standard protocols by injecting a producer animal with the antigen composition formulated as described above. See, for example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In one such technique, first, a T-protein comprising an antigenic portion of a brain tumor protein target polypeptide is included._BTThe antigen is injected into any of a wide variety of mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, or goats). When using whole proteins, or relatively large sections of proteins, antibodies are made by immunizing producer animals with the protein and an appropriate adjuvant (eg, Freund's adjuvant, Freund's complete adjuvant, oil-in-water emulsion, etc.). obtain. Where relatively small peptides are used, it is advantageous to couple the peptides with relatively large molecules to create an immunostimulatory complex. Commonly used binding proteins that are commercially available for such use include bovine serum albumin (BSA) and keyhole limpet hemocyanin (KLH). To generate antibodies against a particular epitope, peptides derived from the complete sequence can be used. Alternatively, a superior immune response may be elicited if the polypeptide is tethered to a carrier protein such as ovalbumin, BSA, or KLH, in order to generate antibodies against the relatively short peptide portion of the brain tumor protein target. The peptide conjugate is injected into the animal host, preferably according to a predetermined schedule incorporating one or more booster immunizations, and the animals are bled periodically. Polyclonal antibodies specific for the polypeptide can then be purified from such antisera, for example, by affinity chromatography using the polypeptide coupled to a suitable solid support.
[0075]
Alternatively, for monoclonal antibodies, hybridomas can be formed by isolating stimulated immune cells, such as cells from the spleen of the inoculated animal. These cells can then be fused with immortalized cells, such as myeloma cells or transformed cells, that can replicate indefinitely in cell culture, thereby producing an immunoglobulin-secreting cell line. . The immortal cell line used is preferably selected from those deficient in enzymes necessary for the use of certain nutrients. Many such cell lines (such as myeloma) are known to those of skill in the art and include, for example, thymidine kinase (TK) or hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT). These deficiencies allow selection of fused cells, for example, by their ability to grow on hypoxanthine aminopterin thymidine (HAT).
[0076]
Preferably, the immortal fusion partner used is from a system that does not secrete immunoglobulins. The resulting fused cells, or hybridomas, are cultured under conditions that allow for the survival of the fused cells, but not the unfused cells, and the resulting colonies are screened for production of the desired monoclonal antibody. . Colonies producing such antibodies are cloned, propagated, and expanded to produce large quantities of antibody. See, for example, Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
[0077]
Large quantities of monoclonal antibodies derived from secretory hybridomas can then be made by injecting the clone into the peritoneal cavity of the mouse and collecting ascites therefrom. Mice that are primed, preferably with pristane, or some other tumor promoter, and that are chemically or radioimmunosuppressed may be any of a variety of suitable strains known to those of skill in the art. Ascites is collected from the mice and the monoclonal antibodies are purified therefrom, for example, by a CM Sepharose column or other chromatographic means. Alternatively, the hybridoma may be cultured in vitro or as a suspension culture. Batch culture, continuous culture, or other suitable culture methods may be used. The monoclonal antibody is then recovered from the medium or supernatant.
[0078]
Several monoclonal antibodies to various isoforms of the brain tumor protein target are currently available from commercial sources. For example, a non-exclusive list of available commercial antibodies includes Zymed's mouse anti-bovine Mab (catalog number 33-5500) for SPARC / osteonectin; Zymed's rabbit anti-human polyclonal for c-MET; And rabbit anti-human MAb of RDI; CD44, mouse anti-human MAb of RDI, and mouse anti-human Mab of Labvision known to block the binding of hyaluronic acid to its receptor CD44 “CD44 / H-CAM Ab-2 "; Brevican / BEHAB, BD Transduction Lab. Mouse anti-human MAb; VIP2 receptor, Exalpha mouse anti-rat MAb; Laminin receptor, Lab vision mouse anti-human Mab" Laminin receptor Ab-1 "; for osteopontin, Chemicon's rat anti-human MAb" MAB3057 "made against rh-osteopontin; for pleiotrophin, it recognizes rh-pleiotrophin R & D anti-human polyclonal "BAF252", and Oncogene goat anti-human polyclonal "PC187L" for detecting rh-pleiotrophin; For PTPζ-α and PTPζ-β, BD Transduction Lab.'S mouse anti-human MAb and membrane Includes a Chemicon mouse anti-human Mab that recognizes both penetrating and soluble isoforms (phosphacan, PTPζ-S). These antibodies, especially Fab fragment forms (where a substantial portion of the heavy and light chain antigenic constant regions have been excluded) are suitable for use in the compositions of the present invention. However, such antibodies are preferably humanized or chimerized by one of the techniques outlined below.
[0079]
Further, antibodies, or antigen-binding fragments, can be produced by genetic engineering. In this technique, antibody-producing cells are sensitized to a desired antigen or immunogen, as in standard hybridoma techniques. Messenger RNA isolated from immune spleen cells or hybridomas is used as a template to make cDNA using PCR amplification. A library of vectors containing one heavy chain gene and one light chain gene, each retaining the initial antigen specificity, was transferred to an expression vector in the appropriate section of the amplified immunoglobulin cDNA. Prepared by inserting Combinatorial libraries are constructed by combining a heavy chain gene library with a light chain gene library. This results in a library of clones that co-express heavy and light chains (similar to Fab or antigen binding fragments of the antibody molecule). Vectors carrying these genes are co-transfected into a host (eg, a bacterial, insect cell, mammalian cell, or other suitable protein-producing host cell). When antibody gene synthesis is induced in the transfected host, the heavy and light chain proteins self-associate, producing active antibodies that can be detected by screening with antigens or immunogens.
[0080]
Preferably, the recombinant antibodies are produced in a recombinant protein production system that accurately performs glycosylation and processing of immunoglobulin chains, such as insect cells or mammalian cells. The advantage of using insect cells, which use recombinant baculoviruses for the production of antibodies, is that the baculovirus system allows for the production of mutant antibodies much more rapidly than stably transfected mammalian cell lines. That is. In addition, insect cells have been shown to accurately process and glycosylate eukaryotic proteins that prokaryotic cells do not. Finally, baculovirus expression of foreign proteins has been shown to constitute as much as 50-75% of total cellular proteins late in viral infection, thus making this system an excellent choice for producing milligram quantities of recombinant antibodies. Means.
[0081]
Antibodies that are less prone to induce a violent or deleterious immune response in humans (such as anaphylactic shock) and have a lower tendency to prime an immune response that would prevent repeated dosing of antibody therapeutics or imaging agents Preferred for use. Even though the brain is relatively isolated behind the blood-brain barrier, an immune response can still occur in the form of increased leukocyte infiltration and inflammation. While an increased immune response to tumors is desirable, concomitant binding and inactivation of therapeutic or imaging agents generally outweigh this benefit. Thus, humanized, chimeric, or xenogeneic human antibodies that produce a lesser immune response when administered to a human are preferred for use in the present invention.
[0082]
Chimeric antibodies are derived from mouse light and heavy chain variable regions (VK and VH) obtained from mouse (or other animal-derived) hybridoma clones, in order to produce antibodies having mainly human domains. Can be produced by recombinant means, in combination with the constant regions of the human light and heavy chains. The generation of such chimeric antibodies is well known in the art and can be accomplished by standard means (eg, as described in US Pat. No. 5,624,659, which is fully incorporated herein by reference). . A humanized antibody contains a much more human-like immunoglobulin domain and is engineered to incorporate only the complementarity-determining regions of an antibody from an animal. This is achieved by carefully examining the sequences of the hypervariable loops of the variable region of the monoclonal antibody and adapting them to the structure of the human antibody chain. Although seemingly complicated, the process is actually simple. See, for example, US Pat. No. 6,187,287, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0083]
Alternatively, polyclonal or monoclonal antibodies can be produced from animals that have been genetically modified to produce human immunoglobulins. Techniques for generating such animals and deriving antibodies therefrom are described in US Pat. Nos. 6,162,963 and 6,150,584, which are incorporated herein by reference in their entirety.
[0084]
Alternatively, single-chain antibodies (Fv as described below) can be generated from a phage library containing human variable regions. See U.S. Patent No. 6,174,708. Intrathecal administration of single-chain immunotoxin LMB-7 [B3 (Fv) -PE38] has been shown to cure cancerous meningitis in a rat model (all fully incorporated herein by reference). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2765-9).
[0085]
In addition to intact immunoglobulins (or their recombinant counterparts), immunoglobulin fragments containing an epitope binding site (eg, Fab 'fragments, F (ab')_TwoFragments, or other fragments) are useful as the antibody portion in the present invention. Such antibody fragments may be generated from intact immunoglobulins by degradation with ficin, pepsin, papain, or other proteases. "Fragments" or minimal immunoglobulins can be designed using recombinant immunoglobulin technology. For example, an “Fv” immunoglobulin for use in the present invention comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region via a peptide linker (eg, polyglycine or other sequence that does not form an α-helix or β-sheet motif). And can be made by linking
[0086]
The Fv fragment comprises the heavy chain variable domain (V_H) And the light chain variable domain (V_L) And a heterodimer. Heterodimers of heavy and light chain domains present in a complete IgG are connected, for example, by disulfide bonds. V_HAnd V_LRecombinant Fvs are connected by a peptide linker and are typically stable. For example, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988), both of which are fully incorporated herein by reference. Please refer to. These are single-chain Fvs that have been found to retain specificity and affinity and have been shown to be useful for tumor imaging and the production of recombinant immunotoxins for tumor therapy . However, researchers have found that some of the single-chain Fvs have reduced affinity for the antigen and that peptide linkers can interfere with binding. As described in U.S. Pat.No. 6,147,203, which is incorporated herein by reference in its entirety, V_HRegion and V_LImproved Fvs containing stabilizing disulfide bonds between regions have also been created. Although any of these minimal antibodies can be used in the present invention, those that are humanized to avoid a HAMA reaction are preferred for use in embodiments of the present invention.
[0087]
Further, a derivatized immunoglobulin to which a detectable moiety such as a chemical linker, a fluorescent dye, an enzyme, a substrate, a chemiluminescent moiety or the like, or a specific binding moiety such as streptavidin, avidin or biotin is added. Can be used in the methods and compositions of the present invention. For convenience, the terms "antibody" or "antibody portion" are generally used to refer to molecules that specifically bind to an epitope of a brain tumor protein target, including the term immunoglobulin, derivative, as described above. , Fragments, recombinant or engineered immunoglobulins, and modified immunoglobulins are all contemplated to be included.
[0088]
Candidate anti-T_BTAntibodies can be raised against anti-T by any appropriate standard means._BTCan be tested for activity. As a primary screen, antibodies can be tested for binding to the immunogen, or to the complete brain tumor protein target extracellular domain or protein. As a secondary screening, anti-T_BTCandidates can be tested for binding to an appropriate tumor cell line, or primary tumor tissue sample. For these screenings, anti-T_BTCandidate antibodies can be labeled for detection. After selective binding to the brain tumor protein target has been established, the candidate antibodies, or antibody conjugates generated as described below, can be used as described below for in vivo models, such as appropriate tumor cell lines, or mice. Alternatively, it can be tested in a rat human brain tumor model for appropriate activity (ie, the ability to reduce tumor cell growth and / or assist in visualizing tumor cells).
[0089]
T_BTAntibodies that alter the biological activity of the protein can be assayed in functional formats such as glioblastoma cell culture studies or mouse / rat CNS tumor model studies. In a glioblastoma cell model of activity, protein expression is first confirmed in the particular cell line used. If necessary, the cell line can be stably transfected with the protein's coding sequence under the control of a suitable constitutive promoter to express the protein at levels comparable to those found in primary tumors. The viability of the glioblastoma cells in the presence of the candidate function-modified anti-protein antibody is then determined. In addition to cell survival assays, cell migration assays can be used to determine the effect of a candidate antibody therapeutic on the tumor-like behavior of cells. Alternatively, where the brain tumor protein target is involved in angiogenesis, assays to determine the ability of the candidate antibody therapeutic to inhibit angiogenesis, a key function in tumor biology, may be used.
[0090]
Similarly, in vivo models of human brain tumors, especially nude mice / SCID mouse models or rat models, have been described, such as Antunes et al. (2000) J Histochem Cytochem 48, 847-58; Price et al. (1999) Clin Cancer Res 5, 845-54; and Senner et al. (2000) Acta Neuropathol (Berl) 99, 603-8. Once the correct expression of the protein has been confirmed in tumor models, the effect of the candidate anti-protein antibodies on tumor mass in these models is evaluated, with a decrease in tumor growth or shrinkage of As an indicator of the ability to alter the protein activity. Thus, without direct knowledge of the specific biomolecular role of the protein in carcinogenesis, antibodies exhibiting appropriate antitumor effects can be selected.
[0091]
array
Arrays provide a high-throughput technique that can assay large numbers of polynucleotides in a sample. In one aspect of the invention, T may further comprise other sequences known to be up-regulated or down-regulated in tumor cells._BTGene, T_BTProtein, or T_BTAn array is constructed that includes one or more of the antibodies, and preferably includes all of these sequences. This technique can be used as a tool to test for differential expression. In a two-dimensional matrix or array with bound probes, the array can be created by spotting polynucleotide probes onto a substrate (eg, glass, nitrocellulose, etc.). Probes can be attached to the substrate either by covalent bonds or by non-specific interactions such as hydrophobic interactions. Techniques for constructing arrays and methods for using these arrays are described, for example, in Schena et al. (1996).Proc. Natl. Acad. Sci. USA  93 (20): 10614-9; Schena et al. (1995)Science 270 (5235): 467-70; Shalon et al. (1996).Genome Res. 6 (7): 639-45, U.S. Pat. No. 5,807,522, EP 799 897; WO 97/29212; WO 97/27317; EP 785 280; WO 97/27317. US Patent No. 5,593,839; US Patent No. 5,578,832; European Patent No. 728 520; US Patent No. 5,599,695; European Patent No. 721016; US Patent No. 5,556,752; WO 95/22058. And US Patent No. 5,631,734.
[0092]
The probes used in the array can be of various types, for example, synthetic probes of relatively short length (eg, 20-mer or 25-mer), cDNA (full-length or gene fragments), amplified DNA, It can include fragments of DNA (eg, produced by restriction enzymes), and reverse transcribed DNA. Both custom and generic arrays can be used in detecting differential expression levels. Custom arrays can be prepared using probes that hybridize to specific preselected internal sequences of the mRNA gene sequence, or amplification products prepared therefrom.
[0093]
Arrays can be used, for example, to study differential expression of genes and to determine gene function. For example, an array can be used to compare T cells between test and control cells._BTIt can be used to detect differential expression of a gene. Exemplary uses of arrays are described, for example, in Pappalarado et al. (1998)Sem.Radiation Oncol.8: 217; and Ramsay. (1998)Nature Biotechnol.16:40. In addition, many variations on detection methods using arrays are well within the skill of the art and within the present invention. For example, instead of immobilizing the probe on a solid support, it is possible to immobilize the test sample on a solid support and then contact it with the probe. Further discussion regarding the use of microarrays in expression analysis can be found, for example, in Duggan et al., Nature Genetics Supplement 21: 10-14 (1999); Bowtell, Nature Genetics Supplement 21: 25-32 (1999); Brown and Botstein, Nature Genetics Supplement 21. : 33-37 (1999); Cole et al., Nature Genetics Supplement 21: 38-41 (1999); Debouck and Goodfellow, Nature Genetics Supplement 21: 48-50 (1999); Bassett, Jr. et al., Nature Genetics Supplement 21: 51-55 (1999); and Chakravarti, Nature Genetics Supplement 21: 56-60 (1999).
[0094]
For detection of expression levels, the nucleic acid is usually obtained from a test sample and directly labeled or reverse transcribed into labeled cDNA. Then, a test sample containing the labeled nucleic acid is contacted with the array. After a period of time sufficient for any labeled nucleic acid present in the sample to hybridize to the probe, unbound nucleic acid is typically removed and non-specific binding to the nucleic acid probes of the array The array is subjected to one or more high stringency washes in order to minimize contamination. Binding of the labeled sequence is detected using any of a variety of commercially available scanners and accompanying software programs.
[0095]
For example, if the nucleic acid from the sample is labeled with a fluorescent label, the hybridization intensity can be determined, for example, by a scanning confocal microscope in photon counting mode. Suitable scanning devices are described, for example, in US Pat. No. 5,578,832 to Trulson et al. And US Pat. No. 5,631,734 to Stern et al., And are available from Affymetrix, Inc. as GeneChip ™ labels. Some types of labels provide signals that can be amplified by enzymatic methods (see, for example, Broude et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 3072-3076 (1994)). A variety of other labels are also suitable, including, for example, radioisotopes, chromophores, magnetic particles, and electron-dense particles.
[0096]
Positions on the probe array that hybridize to the labeled nucleic acid are detected using a reader as described in U.S. Pat.No. 5,143,854, WO 90/15070, and U.S. Pat.No.5,578,832. You. In the case of a customized array, then to determine the presence and / or the relative or absolute amount of a known mRNA species in the sample analyzed as described in WO 97/10365 The hybridization pattern can be analyzed.
[0097]
Diagnosis and prognostic methods
T in tumor_BTGene and / or T_BTThe differential expression of gene products indicates that they can be used as markers for diagnostic, imaging applications as well as therapeutic applications. Generally, such diagnostics involve the use of T or T in an individual's cells or tissues or samples derived therefrom._BTGene transcript or T_BTDetecting elevated expression levels of the gene product. A variety of different assays can be used to detect an increase in gene expression, including both methods of detecting levels of gene transcripts and methods of detecting levels of proteins. More specifically, the diagnostic and prognostic methods disclosed herein include obtaining a sample from an individual,_BTIt involves determining the level of gene product expression at least qualitatively, preferably quantitatively. Typically, this determined or test value is compared to some type of reference or baseline value.
[0098]
A nucleic acid, or a binding member, such as an antibody, specific for a polypeptide derived from one of the sequences provided in Table 1 is increased expression of the corresponding mRNA or protein, or is amplified in a cell. Used to screen patient samples for the presence of the DNA. Samples can be obtained from a variety of sources. The sample is typically obtained from a human subject. However, the method may be used with samples obtained from a variety of other mammals, such as primates, for example, apes and chimpanzees, mice, cats, rats, and other animals. Such a sample is called a patient sample.
[0099]
Samples can be obtained from tissue or body fluids of an individual, as well as cell cultures or tissue homogenates. For example, the sample can be obtained from spinal fluid, or a tumor biopsy sample. The term also includes derivatives and fractions of such cells and body fluids. The sample may be derived from an in vitro cell culture containing growth media, recombinant cells, and cell components. Diagnostic samples are collected from individuals who have or are suspected of having a brain tumor. The presence of specific markers is useful in identifying and staging tumors.
[0100]
Nucleic acid screening method
T_BTSome of the diagnostic and prognostic methods, including detection of gene transcripts, start with cell lysis and subsequent purification of nucleic acids, especially mRNA transcripts, from other cellular material. The nucleic acid derived from the mRNA transcript refers to a nucleic acid whose mRNA transcript or a partial sequence thereof has finally been used as a template for its synthesis. Therefore, cDNA reverse transcribed from mRNA, RNA transcribed from the cDNA, DNA amplified from the cDNA, RNA transcribed from the amplified DNA are all derived from mRNA transcripts, and so on. Detection of such a derivative is indicative of the presence and / or amount of the first transcript in the sample.
[0101]
Numerous methods are available for analyzing nucleic acids for the presence of a particular sequence, eg, up-regulated or down-regulated expression. Nucleic acids can be amplified by conventional techniques, such as the polymerase chain reaction (PCR), to provide a sufficient amount for analysis. The use of the polymerase chain reaction has been described by Saiki et al. (1985).Science 239: 487, and a review of the technology can be found in Sambrook et al.,Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CSH Press 1989, 14.2-14.33.
[0102]
The amplification reaction may include a detectable label. Suitable labels include fluorescent dyes such as ALEXA dye (available from Molecular Probes, Inc.); fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, Texas red, phycoerythrin, allophycocyanin, 6-carboxyfluorescein (6-FAM), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 6-carboxy-2,4,7,4,7-hexachlorofluorescein (HEX) , 5-carboxyfluorescein (5-FAM), or N, N, N, N-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), a radiolabel, for example³²P,³⁵S,^ThreeH etc. are included. The label may be a two-step system in which the amplified DNA is bound to biotin, hapten, etc., having a high affinity binding partner such as avidin, a specific antibody, and the binding partner is bound to a detectable label. Good. The label may be attached to one or both of the primers. Alternatively, the pool of nucleotides used in the amplification is labeled so that the label is incorporated into the amplification product.
[0103]
Sample nucleic acids, such as amplified, labeled, cloned fragments, etc., are analyzed by one of a number of methods known in the art. Probes may be hybridized to Northern or dot blots, or liquid hybridization reactions may be performed. The nucleic acid may be sequenced by the dideoxy method or other methods, and the nucleotide sequence compared to the wild-type sequence. Single-stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and heteroduplex analysis in gel matrices electrophoretically transfer conformational changes created by DNA sequence variation Used to detect as a modification of the degree. Fractionation is performed by gel electrophoresis or capillary electrophoresis, especially acrylamide gel or agarose gel.
[0104]
In situ hybridization is a hybridization method that does not lyse cells before hybridization. Since this method is performed in situ, it has the advantage that it is not necessary to prepare RNA from cells. This method usually involves first fixing the test cells to a support (eg, the plane of a microscope slide or the wall of a microtiter well) and then permeabilizing the cells with a suitable permeabilizing solution. The solution containing the labeled probe is then contacted with the cells and the probe is hybridized. Excess probe is digested, washed away, and the amount of hybridized probe is determined. This approach is described in more detail in Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (ed. By Hames et al., 1987).
[0105]
A variety of so-called "real-time amplification" or "real-time quantitative PCR" methods can also be used to determine the amount of mRNA present in a sample. Such methods include measuring the amount of amplification product formed during the amplification process. Fluorogenic nuclease assays are one example of a real-time quantification method that can be used to detect and quantify transcripts. Generally, such assays use a dual-labeled fluorogenic oligonucleotide probe to continuously measure PCR product accumulation (often referred to in the literature simply as the "TaqMan" method). approach). Further details regarding the theory and operation of fluorogenesis for determining the concentration of amplification products in real time can be found, for example, in Gelfand U.S. Pat.No. 5,210,015, Livak et al. U.S. Pat. And Haaland, US Patent No. 5,863,736.
[0106]
Polypeptide screening method
Screening for expression of the sequences of the invention can be based on functional or antigenic characteristics of the protein. Various immunoassays designed to find polymorphisms in the protein encoded by sequences corresponding to the sequences provided in Table 1 can be used in the screening. Detection is T_BTStaining of cells or histological sections, performed according to conventional methods, using antibodies or other specific binding members that specifically bind to the polypeptide may be used. The antibody of interest or other specific binding member is added to the cell sample and incubated for a time sufficient to allow binding to the epitope, usually at least about 10 minutes. Antibodies can be labeled with radioisotopes, enzymes, fluorophores, chemiluminophores, or other labels for direct detection. Alternatively, a secondary antibody or reagent is used to amplify the signal. Such reagents are well-known in the art. For example, a primary antibody can be conjugated to biotin and horseradish peroxidase-conjugated avidin can be added as a secondary reagent. Final detection uses a substrate that changes color in the presence of peroxidase. Absence or presence of antibody binding can be determined by various methods, including flow cytometry of dissociated cells, microscopy, radiography, scintillation counting, and the like.
[0107]
Another diagnostic method relies on the in vitro detection of binding between an antibody and a polypeptide corresponding to a sequence in Table 1 in a lysate. Determining the concentration of the target protein in a sample or a fraction thereof can be achieved by a variety of specific assays. Conventional sandwich-type assays may be used. For example, a sandwich assay first attaches a specific antibody to an insoluble surface or support. The particular mode of attachment is not critical so long as it is compatible with the reagents and overall method of the present invention. They can be attached to the plate covalently or non-covalently, preferably non-covalently.
[0108]
The insoluble support can be any composition to which the polypeptide can bind, that is easily separated from the soluble material, and that is otherwise compatible with the overall method. The surface of such a support can be solid or porous and can be of any convenient shape. Examples of suitable insoluble supports to which the receptor is attached include beads, such as magnetic beads, membranes, and microtiter plates. These are typically made of glass, plastic (eg, polystyrene), polysaccharide, nylon, or nitrocellulose. Microtiter plates are particularly convenient because a large number of assays can be performed simultaneously using small amounts of reagents and samples.
[0109]
The lysate of the patient sample is then added to a separately assayable support containing the antibody (eg, a separate well of a microtiter plate). Preferably, a series of standards containing known concentrations of the test protein are assayed in parallel with the sample or a portion thereof to serve as a control. Preferably, the samples and standards will each be added to multiple wells so that respective averages are obtained. Incubation time should be sufficient for binding. After incubation, unbound components are generally washed from the insoluble support. After washing, a solution containing the secondary antibody is applied. Antibodies will bind to one of the proteins of interest with sufficient specificity to allow them to be distinguished from other components present. Secondary antibodies can be labeled to facilitate quantification of direct or indirect binding. In a preferred embodiment, the antibody is labeled with a covalently linked enzyme that can provide a detectable product signal after addition of a suitable substrate. Examples of suitable enzymes for use in the conjugate include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, malate dehydrogenase, and the like. If not commercially available, such antibody-enzyme conjugates are readily made by techniques known to those skilled in the art. The incubation time should be sufficient to allow the labeled ligand to bind to the available molecule.
[0110]
After the second binding step, the insoluble support is washed again to remove non-specifically bound material, leaving the specific complex formed between the target protein and the specific binding member. The signal generated from the bound complex is detected by conventional means. If an enzyme conjugate is used, a suitable enzyme substrate is provided so that a detectable product is formed.
[0111]
Other immunoassays are known in the art and may be useful as diagnostics. Ouchterlony plates provide a simple determination of antibody binding. Western blots are conveniently performed on protein gels or protein spots on filters using a detection system specific for the targeted polypeptide, conveniently using labeling methods as described for sandwich assays. Can be implemented.
[0112]
In some cases, a competition assay will be used. In addition to the patient sample, a competitor for the targeted protein is added to the reaction mixture. The competitor and the target compete for binding with the specific binding partner. Generally, it will be assumed that the competitor molecule is labeled and detected as previously described. In that case, the amount of competitor binding would be proportional to the amount of target protein present. The concentration of the competitor molecule will be from about 10 times to about equal to the maximum expected protein concentration in order to make the range of detection most sensitive and linear.
[0113]
In vivo imaging
In some embodiments, the methods are adapted for use in in vivo imaging, for example, to localize or identify a site where a tumor cell is present. In these embodiments, T_BTA detectably labeled moiety, e.g., an antibody, specific for the polypeptide is administered to the individual (e.g., by injection), and the labeled cells are subjected to magnetic resonance imaging, computed tomography, etc. Not determined) using standard imaging techniques.
[0114]
For diagnostic in vivo imaging, the type of detection device available is a major factor in the selection of a particular radionuclide. The radionuclide selected must have a type of decay that is detectable by a particular type of device. In general, any conventional method for visualizing diagnostic imaging can be used in accordance with the present invention. Another important factor in selecting a radionuclide for in vivo analysis is that its half-life is still long enough to be detectable at the time of maximum uptake by the target tissue, but minimizes harmful irradiation of the host. Is short enough to be^99mCurrently used methods for labeling with Tc reduce pertechnetate in the presence of a chelating precursor to produce an unstable^99mForming a Tc-precursor complex, which is then reacted with the metal binding group of the bifunctionally modified chemotactic peptide,^99mIt forms a Tc-chemotactic peptide complex.
[0115]
T detectably labeled_BTSpecific antibodies are used with imaging techniques to analyze target expression. In one embodiment, the imaging method is one of PET or SPECT, an imaging technique in which a radionuclide is administered to a patient synthetically or locally. Subsequent radiotracer uptake is measured over time and used to obtain information about the targeted tissue. Due to the high energy (□ -ray) emissions of the particular isotopes used, and the sensitivity and accuracy of the equipment used to detect them, the two-dimensional distribution of radioactivity is extrapolated from outside the body.
[0116]
The most commonly used proton emitting nuclides in PET include:¹¹C,¹³N,¹⁵0, and¹⁸F is included. SPECT uses isotopes that decay by electron capture and / or □ radiation, including:^{one two Three}I and^99mTc is included.
[0117]
Therapeutic / prophylactic treatment
T_BTGene or T_BTAgents that modulate protein activity, particularly those that inhibit or up-regulate polypeptide activity or gene expression, provide a point of therapeutic or prophylactic intervention. Agents that directly regulate expression, such as expression vectors, antisense specific for the targeted polypeptide; and agents that act on proteins, such as specific antibodies and analogs thereof, small organic molecules that block catalytic activity A number of agents are useful in modulating this activity, including and the like.
[0118]
Methods for selectively delivering nucleic acids to certain cells can be designed. Examples of such cells include neurons, microglia, astrocytes, endothelial cells, oligodendrocytes, and the like. Certain treatments involve the selective expression of an expression vector in neuronal cells and / or the delivery of nucleic acids to neuronal cells (microglia, astrocytes, endothelial cells, oligodendrocytes). Designed for targeting. One technique for achieving selective expression in neural cells is to operably link the coding sequence to a promoter that is primarily active in neural cells. Examples of such promoters include, but are not limited to, the prion protein promoter, the calcium-calmodulin-dependent protein kinase promoter. Alternatively, or in addition, the nucleic acid may be administered with an agent that targets the nucleic acid to a nerve cell. For example, the nucleic acid can be administered with an antibody that specifically binds to a cell surface antigen on the nerve cell, or a ligand for a receptor on the nerve cell.
[0119]
If liposomes are used, a substrate that binds to cell surface membrane proteins associated with endocytosis can be added to the liposomes to target the liposomes to nerve cells and facilitate uptake. Examples of proteins that may be added include capsid proteins or fragments thereof that bind to nerve cells, antibodies that specifically bind to cell surface proteins on nerve cells that internalize during cycling, and intracellular localization within nerve cells. (See, e.g., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432; and Wagner et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414). ). Gene marking and gene therapy protocols are reviewed by Anderson et al. (1992) Science 256: 808-813. Various other delivery options may also be used. For example, a nucleic acid containing the sequence of interest can be injected directly into the cerebrospinal fluid. Alternatively, such nucleic acids may be administered by intraventricular injection.
[0120]
Antisense molecules can be used to down regulate expression in cells. The antisense reagent can be an antisense oligonucleotide (ODN), particularly a synthetic ODN with chemical modification from a naturally occurring nucleic acid, or a nucleic acid construct that expresses an antisense molecule such as RNA. The antisense sequence is complementary to the mRNA of the targeted gene and inhibits expression of the targeted gene product. Antisense molecules inhibit gene expression by reducing the amount of mRNA available for translation by various mechanisms, such as by activating RNAse H or steric hindrance. One antisense molecule may be administered, or a combination of antisense molecules, which may comprise a plurality of different sequences, may be administered.
[0121]
An antisense molecule can be produced by expression of all or a portion of the target gene sequence in a suitable vector, wherein transcription initiation is directed such that the antisense strand is produced as an RNA molecule. Alternatively, the antisense molecule is a synthetic oligonucleotide. Antisense oligonucleotides are generally at least 7 nucleotides in length, generally at least 12 nucleotides in length, more usually at least 20 nucleotides in length, and 500 nucleotides in length, generally about 50 nucleotides in length, more commonly Does not exceed about 35 nucleotides in length, the length being governed by the efficiency of inhibition, specificity (including lack of cross-reactivity), and the like. It has been found that short oligonucleotides, 7-8 bases in length, can be potent and selective inhibitors of gene expression (Wagner et al. (1996)).Nature Biotechnology 14: 840-844).
[0122]
One or more specific regions of the endogenous sense strand mRNA sequence are selected to be complementary to the antisense sequence. Selection of a particular sequence for an oligonucleotide can use empirical methods where several candidate sequences are assayed for inhibition of expression of the target gene in an in vitro or animal model. Sequence combinations may be used in which several regions of the mRNA sequence are selected for antisense complementation.
[0123]
Antisense oligonucleotides can be chemically synthesized by methods known in the art (see Wagner et al. (1993) (supra) and Milligan et al. (Supra)). Preferred oligonucleotides are chemically modified from the native phosphodiester structure to increase intracellular stability and binding affinity. Many such modifications that alter the skeleton, sugar, or heterocyclic base chemistry have been described in the literature.
[0124]
Useful changes in backbone chemistry include phosphorothioates; phosphorodithioates in which both non-bridging oxygens are replaced by sulfur; phosphoramidites; alkyl phosphotriesters and boranophosphates. Achiral phosphate derivatives include 3'-O'-5'-S-phosphorothioate, 3'-S-5'-O-phosphorothioate, 3'-CH2-5'-O-phosphonate, and 3'-NH- 5'-O-phosphoramidites are included. Peptide nucleic acids are those in which the complete ribose phosphodiester backbone has been exchanged for peptide bonds. Sugar modifications are also used to enhance stability and affinity. An α-anomer of deoxyribose in which the base is opposite to the natural β-anomer may also be used. The 2'-OH of the ribose sugar can be modified to form a 2'-O-methyl or 2'-O-aryl sugar that provides resistance to degradation without affinity. Modification of the heterocyclic base must maintain proper base pairing. Some useful substitutions include deoxyuridine and deoxythymidine; 5-methyl-2'-deoxycytidine and 5-bromo-2'-deoxycytidine and deoxycytidine. 5-propynyl-2'-deoxyuridine and 5-propynyl-2'-deoxycytidine have been shown to increase affinity and biological activity when substituted with deoxythymidine and deoxycytidine, respectively.
[0125]
Compound screening
Compound screening can be performed using in vitro models, genetically modified cells or animals, or provided T_BTIt can be performed using a purified protein corresponding to any one of the genes. Ligands or substrates that bind to, modulate or mimic the effect of, the encoded polypeptide can be identified.
[0126]
Polypeptides include T_BTIncluded are not only those encoded by genes, but also those encoded by variants that are not identical in sequence to the disclosed nucleic acids due to the degeneracy of the genetic code, and variants thereof. A variant polypeptide may include amino acid (aa) substitutions, additions, or deletions. Amino acid substitutions may be made to eliminate non-essential amino acids, e.g., to modify a glycosylation, phosphorylation, or acetylation site, or to replace or delete one or more cysteine residues that are not required for function. There may be one or more conservative amino acid substitutions to minimize misfolding due to loss. A variant retains the biological activity of a particular region of a protein (eg, a functional domain and / or a region associated with a consensus sequence if the polypeptide is a member of a protein family), or It can be designed to have enhanced such activity. Variants include fragments of the polypeptides disclosed herein, particularly biologically active fragments and / or fragments corresponding to functional domains. The fragment of interest is typically at least about 10 aa to at least about 15 aa in length, generally at least about 50 aa in length, and may be as long as 300 aa or more, but is generally about It does not exceed 500 aa in length and is thought to have the same continuous amino acid stretch as the polypeptide encoded by the brain tumor associated gene or a homolog thereof.
[0127]
Transgenic animals or cells derived therefrom are also used in compound screening. Transgenic animals are T_BTThe normal locus corresponding to the gene can be created by homologous recombination, which is modified. Alternatively, the nucleic acid construct is randomly integrated into the genome. Vectors for stable integration include plasmids, retroviruses and other animal viruses, YACs, and the like. A series of small deletions and / or substitutions can be made in the coding sequence to determine the role of the different exons in enzymatic activity, carcinogenesis, signaling, etc. Specific constructs of interest include antisense sequences that block the expression of the targeted gene and the expression of a dominant negative mutation. A detectable marker such as lacZ can be introduced at the locus of interest. In that case, up-regulation of expression would result in an easily detected phenotypic change. It is also possible to provide expression of the target gene or a variant thereof in cells or tissues that are not normally expressed or at the time of abnormal development. By providing expression of the target protein in cells that are not normally produced, it is possible to induce changes in cell behavior.
[0128]
By compound screening, T_BTAgents that modulate the function of the polypeptide are identified. Of particular interest are screening assays for drugs that have low toxicity to human cells. A wide variety of assays can be used for this purpose, including labeled in vitro protein-protein binding assays, electrophoretic mobility shift assays, immunoassays for protein binding, and the like. Knowledge of the three-dimensional structure of the encoded protein derived from crystallization of the purified recombinant protein may lead to the rational design of small drugs that specifically inhibit activity. These drugs can be directed to specific domains.
[0129]
The term "drug", as used herein,_BTDescribes any molecule that has the ability to modify or mimic the physiological function of the polypeptide, such as a protein or pharmaceutical. Generally, multiple assay mixtures are run in parallel with different drug concentrations to obtain differential responses to different concentrations. Typically, one of these concentrations is used as a negative control (ie, zero concentration or below the level of detection).
[0130]
Candidate agents encompass numerous chemical classes, but typically they are organic molecules, preferably small organic compounds having a molecular weight of more than 50 daltons and less than about 2,500 daltons. The candidate agent comprises a functional group necessary for structural interaction with the protein, in particular hydrogen bonding, and typically comprises at least one amine, carbonyl, hydroxyl, or carboxyl group, preferably Contains at least two of the functional chemical groups. Candidate agents often comprise cyclical carbon or heterocyclic structures and / or aromatic or polyaromatic structures substituted with one or more of the above functional groups. Candidate agents can also be found in biomolecules, including peptides, sugars, fatty acids, steroids, purines, pyrimidines, derivatives, structural analogs, or combinations thereof.
[0131]
Candidate agents are obtained from a wide variety of sources including libraries of synthetic or natural compounds. Numerous means are available for random and specific synthesis of a wide variety of organic compounds and biomolecules, including, for example, expression of randomized oligonucleotides and oligopeptides. Alternatively, libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant, and animal extracts are available or readily made. In addition, natural or synthetically produced libraries and compounds can be readily modified by conventional chemical, physical, and biochemical means and used to create combinatorial libraries. Known pharmacological agents can be subjected to specific or random chemical modifications, such as acylation, alkylation, esterification, amidation, etc., to create structural analogs. The test agent can be obtained from a library, such as a natural product library or a combinatorial library. A number of different types of combinatorial libraries and methods for preparing such libraries are described, for example, in WO 93/06121, WO 95/12608, each of which is incorporated herein by reference. No. WO 95/35503, WO 94/08051, and WO 95/30642.
[0132]
Where the screening assay is a binding assay, one or more of the molecules may be conjugated, directly or indirectly, to a label capable of providing a detectable signal. Various labels include radioisotopes, fluorophores, chemiluminophores, enzymes, specific binding molecules, particles such as magnetic particles, and the like. Specific binding molecules include pairs such as biotin and streptavidin, digoxin and antidigoxin, and the like. In the case of a specific binding member, the complementary member will usually be labeled with a molecule that provides for detection, according to known techniques.
[0133]
A variety of other reagents can be included in the screening assays. These include salts, neutral proteins such as albumins, detergents, etc., used to facilitate optimal protein-protein binding and / or reduce non-specific or background interactions. Various reagents. Reagents that improve the efficiency of the assay, such as protease inhibitors, nuclease inhibitors, antimicrobial agents, etc., may be used. The mixture of components is added in any order that provides for the requisite binding. Incubations are performed at any suitable temperature, typically between 4 and 40 ° C. Incubation times are selected for optimal activity, but may be optimized to facilitate rapid high-throughput screening. Typically, 0.1 to 1 hour is considered sufficient.
[0134]
T_BTPre-screening may be performed by screening for compounds that can bind to the polypeptide, and at least some of the compounds so identified are likely to be inhibitors. Binding assays are usually performed using T_BTContacting the polypeptide with one or more test compounds and allowing sufficient time for the protein and the test compound to form a binding complex. Any binding complexes formed can be detected using any of a number of established analytical techniques. Protein binding assays include methods for measuring co-precipitation, co-migration on non-denaturing SDS-polyacrylamide gels, and co-migration on Western blots (eg, Neurotransmitter Receptor Binding (Ed. Yamamura, HI et al.) 61 -See Bennet, JP and Yamamura, HI (1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods" on page 89).
[0135]
One type of screening method is T_BTIncludes screening for compounds that modulate gene expression. Such methods generally involve converting the test compound to T_BTPerforming a cell-based assay that contacts one or more cells expressing the gene, and then detecting an increase in expression. Some assays use endogenous T_BTPerformed using tumor cells expressing the gene. Other expression assays include exogenous T_BTIt is performed using non-neuronal cells that express the gene.
[0136]
The level of expression or activity can be compared to a baseline value. As already indicated, the baseline value can be a value for a control sample or a statistic representative of the expression level for a control population. Expression levels were determined by T_BTThe determination may be made for cells that do not express the gene. Such cells are generally otherwise genetically identical to the test cells. Various controls, including performing a parallel reaction with cells lacking the reporter construct, or not contacting cells bearing the reporter construct with the test compound, confirm that the activity observed is genuine. Can be implemented to guarantee Compounds can be further identified as described below.
[0137]
Compounds initially identified by any of the foregoing screening methods can be further tested to confirm overt activity. The basic format of such a method is to administer the lead compound identified in the primary screen to an animal to be used as a human model, followed by T_BTDetermining whether the gene is in fact up-regulated. Animal models used in confirmatory studies are generally mammals. Examples of suitable animals include, but are not limited to, primates, mice, and rats.
[0138]
T identified by the screening method described herein_BTActive test agents that inhibit polypeptide activity and / or tumor growth can be utilized as lead compounds for the synthesis of analog compounds. Typically, analog compounds are synthesized to have a similar electronic configuration and molecular conformation to the lead compound. The identification of analog compounds can be performed by using techniques such as self-consistent field (SCF) analysis, configuration interaction (CI) analysis, and normal mode kinetic analysis. Computer programs are available for performing these techniques. See, for example, Rein et al. (1989) Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York).
[0139]
Antibody conjugate
Anti-T for use in the present invention when the native activity of the brain tumor protein target is altered in tumor cells_BTAntibodies can have utility without binding. Such antibodies, which can be selected as described above, can be used as therapeutics. In another embodiment of the present invention, the T polypeptide may or may not have altered activity of the target polypeptide._BTA specific antibody is conjugated to a cytotoxic or imaging agent that adds functionality to the antibody.
[0140]
Anti-T_BTAntibodies can be coupled or conjugated to one or more therapeutic cytotoxic or imaging moieties. As used herein, a "cytotoxic moiety" is a moiety that inhibits cell growth or promotes cell death when in close proximity to or absorbed by cells. Suitable cytotoxic moieties in this regard include radioisotopes (radionuclides), chemotoxic agents such as differentiation inducers and small chemotoxic drugs, toxin proteins, and derivatives thereof. “Imaging moiety” (I) refers to the contrast of a tumor with surrounding healthy tissue in visualization techniques (eg, radiography, positron emission tomography, nuclear magnetic resonance imaging, direct or indirect visual inspection). A part that can be used to increase. Thus, suitable imaging moieties include radiographic (eg, heavy metal and radiation emitting), positron emitting, magnetic resonance imaging, and optically visible (eg, fluorescent or visible spectrum dyes, visible particles). Etc.) are included. It will be appreciated by those skilled in the art that there is some overlap between the therapeutic portion and the imaging portion. For example,²¹²Pb and²¹²Bi are both useful isotopes for therapeutic compositions, but also high electron densities, thus providing a contrast for X-ray radiographic imaging techniques and can also be used in scintillation imaging techniques .
[0141]
In general, therapeutic or imaging agents can be anti-Tn by any suitable technique, taking into account the need for pharmacokinetic stability and reduced total toxicity to the patient._BTIt can be combined with a part. Therapeutic agents can be directly or indirectly coupled (eg, via a linker group) to the appropriate antibody moiety. A direct reaction between the drug and the antibody is possible if each carries a functional group that can react with each other. For example, nucleophilic groups such as amino or sulfhydryl groups react with carbonyl-containing groups such as anhydrides or acid halides, or alkyl groups containing excellent leaving groups (eg, halides). You may be able to. Alternatively, a suitable chemical linker group may be used. The linker group can function as a spacer to sequester the antibody from the drug to avoid interference with binding capacity. Linker groups can also be utilized to increase the chemical reactivity of the substituents on the moiety or antibody, and thus increase the coupling efficiency. Increased chemical reactivity may also facilitate the use of moieties or functional groups on moieties that would otherwise be impossible.
[0142]
Suitable coupling chemistries include maleimidyl and alkyl halide linkers (reacting with sulfhydryls on the antibody moiety) and succinimidyl linkers (reacting with primary amines on the antibody moiety). Several primary amine and sulfhydryl groups are present on the immunoglobulin, and additional groups may be designed on the recombinant immunoglobulin molecule. A variety of bifunctional or polyfunctional reagents (both homofunctional and heterofunctional) (such as those described in the catalog of Pierce Chemical Co., Rockford, Ill) can be used as the linker group This will be apparent to those skilled in the art. Coupling can be achieved, for example, by an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group, or an oxidized carbohydrate residue. Numerous references describe such methodologies (eg, US Pat. No. 4,671,958). As another coupling method, as described in U.S. Pat.Nos. 5,057,313 and 5,156,840, a cytotoxic moiety or an imaging moiety may have an anti-T carboxyl group at the glycosylation site via an oxidized carbohydrate group._BTIt may be coupled to an antibody moiety. Yet another alternative for coupling an antibody moiety to a cytotoxic or imaging moiety is by using a non-covalent binding pair such as streptavidin / biotin or avidin / biotin. In these embodiments, one member of the pair is covalently coupled to the antibody moiety and the other member of the binding pair is covalently coupled to the cytotoxic or imaging moiety.
[0143]
In the absence of the antibody portion of the immunoconjugate of the invention, if the cytotoxic portion is more potent, it can be degraded during or after entry into the cell, or gradually over time in the extracellular environment. It may be desirable to use linker groups that are degradable. A number of different degradable linker groups have been described. Mechanisms for the intracellular release of cytotoxic moieties from these linker groups include degradation by reduction of disulfide bonds (eg, US Pat. No. 4,489,710) and degradation by radiation of photolabile bonds (eg, US Pat. No. 4,625,014). ), Hydrolytic degradation of derivatized amino acid side chains (eg, US Patent No. 4,638,045), complement mediated hydrolysis in serum (eg, US Patent No. 4,671,958), and acid degradation. Degradation by catalytic hydrolysis (eg, US Pat. No. 4,569,789) is included.
[0144]
Two or more cytotoxic and / or imaging moieties, which may be the same or different, may be conjugated to the antibody. Anti-T_BTBy multiple derivatization of the antibody, several cytotoxic strategies can be implemented simultaneously. Antibodies may be useful as contrast agents for some visualization techniques; or, therapeutic antibodies may be labeled for tracking by visualization techniques. Immune complexes with multiple moieties can be prepared in a variety of ways. For example, multiple moieties may be coupled directly to the antibody molecule, or a linker (eg, a dendrimer) that provides multiple sites for addition may be used. Alternatively, a carrier capable of carrying a plurality of cytotoxic or imaging moieties can be used.
[0145]
The carrier may carry the cytotoxic or imaging moiety in various ways, including covalent attachment, either directly or via a linker group, and non-covalent association. Suitable covalent carriers include proteins such as albumin (e.g., U.S. Pat. No. 4,507,234), peptides, and polysaccharides such as aminodextran (e.g., each having multiple sites for addition of moieties). U.S. Patent No. 4,699,784). The carrier may retain the drug by non-covalent association, such as non-covalent association, or by encapsulation, such as encapsulation in liposome vesicles (eg, US Pat. Nos. 4,429,008 and 4,873,088). . An encapsulated carrier can more easily associate a sufficient amount of the imaging moiety (dye, magnetic resonance imaging reagent, etc.) with the antibody moiety for detection, and thus can be used in the present invention._BTIt is particularly useful for attaching an imaging moiety to an antibody moiety. In addition, encapsulated carriers are also useful in chemotoxic therapeutic embodiments, as they may allow the therapeutic composition to gradually release the chemotoxic moiety over time, while concentrating near the tumor cells.
[0146]
Carriers and linkers specific for the radionuclide drug (both for use as a cytotoxic moiety or for use as a positron emission imaging moiety) include small radioactive halogen molecules and chelating compounds. For example, U.S. Pat. No. 4,735,792 discloses representative radiohalogenated small molecules and their synthesis. Radionuclide chelates may be formed from metals or metal oxides, chelating compounds including those containing nitrogen and sulfur atoms as donor atoms for binding to the radionuclide. For example, US Pat. No. 4,673,562 to Davison et al. Discloses representative chelating compounds and their synthesis. Such chelating carriers are also useful for chelating magnetic spin contrast ions for use in magnetic resonance imaging tumor visualization and heavy metal ions for use in radiographic visualization.
[0147]
Preferred radionuclides for use as cytotoxic moieties are those radionuclides suitable for pharmacological administration. Such radionuclides include:^{one two Three}I,¹²⁵I,¹³¹I,⁹⁰Y,²¹¹At,⁶⁷Cu,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,²¹²Pb, and²¹²Bi is included. Because of the vast body of literature on the use of iodine and astatine, isotopes of iodine and astatine are the more preferred radionuclides for use in the therapeutic compositions of the present invention.¹³¹I is particularly preferred, as are other beta-emitting nuclides that have an effective range of several millimeters.^{one two Three}I,¹²⁵I,¹³¹I, or²¹¹At is iodine, N-succinimidyl 3- [²¹¹At] Astatobenzoate, N-succinimidyl 3- [¹³¹I] iodobenzoate (SIB) and N-succinimidyl 5- [¹³¹I] Any of a number of known binding reagents, including iodo-3-pyridinecarboxylate (SIPC), can be used to conjugate the antibody moiety for use in the compositions and methods. Any iodine isotope may be used in the listed iodine reagents. The radionuclide is anti-T_BTIt may be attached as an antibody moiety.
[0148]
Preferred chemotoxic agents include carboplatin, cisplatin, vincristine, taxanes such as paclitaxel and docetaxel, hydroxyurea, gemcitabine, vinorelbine, irinotecan, tirapazamine, matrilysin, methotrexate, pyrimidines and purines, and analogs known in the art. And other suitable small molecule toxins, such as small toxins. Preferred chemical toxin differentiation inducers include phorbol esters and butyric acid. The chemotoxic moiety is directly linked to the anti-T via a chemical linker._BTIt can be conjugated to an antibody moiety or encapsulated in a carrier,_BTIt may be conjugated to an antibody moiety.
[0149]
Chemotherapy is helpful in controlling high-grade gliomas. A common combination of chemotherapeutic drugs is "PCV," which refers to three drugs: procarbazine, CCNU, and vincristine. Temozolomide (Temodar) has been approved by the FDA for the treatment of anaplastic astrocytomas, and this drug is now widely used for high-grade gliomas. Neuupogen can be administered to patients whose white blood cell count has decreased to very low levels following chemotherapy.
[0150]
Preferred toxin proteins for use as cytotoxic moieties include ricin A and B, abrin, diphtheria toxin, bryodin 1 and 2, momordin, trichokirin, cholera toxin, gelonin. , Pseudomonas exotoxin, Shigella toxin, pokeweed antiviral proteins, and other toxin proteins known in the medical biochemistry arts. The non-toxic ricin B chain is the cell-binding moiety and the A-chain is a toxic moiety that inactivates protein synthesis (but delivered to the cytoplasm by a disulfide-linked B chain that binds to galactose-terminated membrane proteins) Only later). Abrin, diphtheria toxin, and Pseudomonas exotoxin all have similar double-stranded components; one is a chain that mediates cell membrane binding and entry, and the A chain is a toxic enzymatic chain. It is. Cholera has a pentameric binding subunit coupled to a toxic A chain. These toxins can elicit unwanted immune responses in patients, especially when injected intravascularly, and_BTFor coupling with the antibody part, it is preferable to encapsulate the antibody in a carrier.
[0151]
Preferred radiographic moieties for use as imaging moieties in the present invention include compounds and chelates containing relatively large atoms such as gold, iridium, technetium, barium, thallium, iodine, and isotopes thereof. It is preferred that low toxicity radiographic imaging moieties such as iodine or iodine isotopes be used in the compositions and methods of the invention. Examples of such compositions that can be used for X-ray radiography are described in US Pat. No. 5,709,846, which is hereby incorporated by reference in its entirety. Such moieties may be linked to the anti-T with an acceptable chemical linker or chelating carrier._BTIt can be conjugated to an antibody moiety. In addition, radionuclides that emit radiation that can penetrate the skull may be useful for scintillation imaging techniques. Suitable radionuclides for binding include:⁹⁹Tc,¹¹¹In, and⁶⁷Ga is included. Positron emissive moieties for use in the present invention include anti-T, according to the method described in U.S. Patent 6,187,284._BTCan be easily bound by fluorination reaction with the antibody moiety¹⁸F is included.
[0152]
Preferred magnetic resonance contrast portions include chromium (III) ion, manganese (II) ion, iron (II) ion, nickel (II) ion, copper (II) ion, praseodymium (III) ion, neodymium (III) ion, Includes samarium (III) ions and chelates of ytterbium (III) ions. Gadolinium (III), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), erbium (III), and iron (III) ions are particularly preferred because of their extremely strong magnetic moment. Examples of such chelates suitable for magnetic resonance spin imaging are described in US Pat. No. 5,733,522, which is hereby incorporated by reference in its entirety. Nuclear spin contrast chelates can be anti-T_BTIt can be conjugated to an antibody moiety.
[0153]
Optically visible moieties for use as imaging moieties include fluorescent dyes, as well as visible spectral dyes, visible particles, and other visible labeling moieties. Fluorescent dyes such as Alexa (ALEXA) dyes, fluorescein, coumarin, rhodamine, bodipy Texas red, and cyanine dyes are useful if sufficient excitation energy is provided at the site to be visually inspected . Endoscopic visualization methods can be relatively compatible with the use of such labels. For many procedures where imaging agents are useful, such as surgery to remove brain tumors, visible spectrum dyes are preferred. Acceptable dyes include non-toxic FDA approved edible dyes and colorants, with pharmaceutically acceptable dyes approved for internal use being preferred. In a preferred embodiment, such dyes are encapsulated in a carrier moiety and they_BTAllowed to bind to the antibody. Alternatively, visible particles, such as colloidal gold particles or latex particles, are attached to anti-T via an appropriate chemical linker._BTIt can be coupled to an antibody moiety.
[0154]
Pharmaceutical preparations
One strategy for drug delivery across the blood-brain barrier (BBB) is to use the BBB by osmotic means, such as mannitol or leukotriene, or biochemically, by using vasoactive agents such as bradykinin. Requires destruction. The use of BBB opening to target specific drugs to brain tumors is also an option. A BBB disrupting agent can be co-administered with a therapeutic or imaging composition of the present invention when the composition is administered by intravascular injection. Other strategies for penetrating the BBB include carrier-mediated transporters such as glucose carriers and amino acid carriers, receptor-mediated transcytosis for insulin or transferrin, and p-glycoproteins. Requires the use of endogenous transport systems, including active efflux transporters. Active transport moieties can also be associated with therapeutic or imaging compounds for use in the present invention to facilitate transport across the epithelial wall of blood vessels. Alternatively, drug delivery behind the BBB is by intrathecal delivery of a therapeutic or imaging agent directly to the skull, for example by an Omaya reservoir.
[0155]
Pharmaceutical compositions include, depending on the formulation desired, pharmaceutically acceptable vehicles, which are defined as vehicles commonly used to formulate pharmaceutical compositions for administration to animals or humans. A non-toxic diluent carrier may be included. The diluent is chosen so as not to affect the biological activity of the combination. Examples of such diluents are distilled water, aqueous buffer, saline, PBS, Ringer's solution, dextrose solution, and Hanks' solution. In addition, the pharmaceutical compositions or preparations may include other carriers, adjuvants, or non-toxic, non-therapeutic, non-immunogenic stabilizers, excipients, and the like. The composition can include additional substances to approximate physiological conditions, such as pH adjusting buffers, toxicity adjusting agents, wetting agents, and surfactants.
[0156]
The composition can include any of a variety of stabilizers, such as, for example, antioxidants. Where the pharmaceutical composition comprises a polypeptide, the polypeptide enhances the in vivo stability of the polypeptide or enhances its pharmacological properties (eg, increases the half-life of the polypeptide, reduces toxicity, etc.). Reduce, enhance solubility or uptake), and can be complexed with a variety of well-known compounds. Examples of such modifying or complexing agents include sulfate, gluconate, citrate, and phosphate. The polypeptide of the composition may be conjugated to a molecule that enhances in vivo attributes. Such molecules include, for example, carbohydrates, polyamines, amino acids, other peptides, ions (eg, sodium, potassium, calcium, magnesium, manganese), and lipids.
[0157]
Further guidance on formulations suitable for various types of administration can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mace Publishing Company, Philadelphia, PA) 17th edition (1985). For a brief review of methods for drug delivery, see Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
[0158]
Pharmaceutical compositions can be administered for prophylactic and / or therapeutic treatments. The toxicity and therapeutic efficacy of the active ingredient can be determined, for example, by LD₅₀(Lethal dose for 50% of population) and ED₅₀(The dose therapeutically effective in 50% of the population) can be determined according to standard pharmaceutical techniques in cell cultures and / or experimental animals. The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and the ratio LD₅₀/ ED₅₀Can be represented as Compounds that exhibit large therapeutic indices are preferred.
[0159]
The data obtained from cell culture and / or animal studies can be used in formulating a range of dosage for humans. The dosage of the active ingredient is typically ED with low toxicity₅₀In the range of circulating blood concentrations. The dosage may vary within this range depending on the dosage form used and the route of administration used.
[0160]
The pharmaceutical compositions described herein can be administered in a variety of different ways. Examples include pharmaceutically acceptable via oral, nasal, rectal, topical, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, transdermal, intrathecal, and intracranial methods Administration of the composition containing the carrier to be administered.
[0161]
For oral administration, the active ingredients can be administered in solid dosage forms, such as capsules, tablets, and powders, or in liquid dosage forms, such as elixirs, syrups, and suspensions. The active component (s) is an inert component, such as glucose, lactose, sucrose, mannitol, starch, cellulose or a cellulose derivative, magnesium stearate, stearic acid, sodium saccharin, talc, magnesium carbonate. It can be enclosed in gelatin capsules together with a powdered carrier. Examples of additional inert ingredients that can be added to provide a desired color, taste, stability, buffering capacity, dispersion, or other known desirable attributes include, butter, silica gel, sodium lauryl sulfate, titanium dioxide, and It is an edible white pigment. Similar diluents can be used to make compressed tablets. Both tablets and capsules can be manufactured as sustained release products to provide for continuous release of medication over a period of hours. Compressed tablets can be sugar coated or film coated to mask the unpleasant taste and protect the tablet from the environment, or enteric coated for selective disintegration in the gastrointestinal tract. Liquid dosage forms for oral administration can contain coloring and flavoring to increase patient acceptance.
[0162]
The active ingredient, alone or in combination with other suitable components, can be made into an aerosol formulation to be administered via inhalation (ie, "sprayed"). The aerosol formulation can be placed into a pressurized acceptable propellant such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen.
[0163]
For example, formulations suitable for parenteral administration, such as the intra-articular (intra-articular), intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, and subcutaneous routes include antioxidants, buffers, Aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions which may contain bacteriostats and solutes which render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient, and suspending agents, solubilizing agents, thickening agents, stabilizing Aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain agents and preservatives.
[0164]
The components used to formulate the pharmaceutical composition are preferably of high purity and substantially free of potentially harmful contaminants (eg, at least National Food (NF) Grades, generally at least analytical grade, more typically at least pharmaceutical grade). In addition, compositions intended for in vivo use are usually sterile. If a particular compound must be synthesized before use, the resulting product will typically be substantially free of potentially toxic drugs, particularly endotoxins, that may be present during the course of synthesis or purification. Not included. Compositions for parenteral administration are also sterile, substantially isotonic and made under GMP conditions.
[0165]
The compositions of the present invention can be administered by any medically appropriate technique, such as intravascular (intravenous, intraarterial, intracapillary) administration, injection into cerebrospinal fluid, intracavitary injection, or direct injection into a tumor. Can be used for administration. Intrathecal administration can be performed according to known techniques by use of an Omaya reservoir (F. Balis et al., Am J. Pediatr. Hematol. Oncol. 11, 74, 76 (1989). Imaging compositions of the invention. For, administration via intravascular injection is preferred for pre-operative visualization of the tumor, post-operative or contemporaneous visualization may be by intrathecal or intracavity administration, e.g., with an Omaya reservoir; Or it may be by intravascular administration.
[0166]
One method for the administration of the therapeutic composition of the present invention is direct injection (assisted by stereotactic fixation of an injection syringe, if necessary), or application of the Omayaya reservoir tip to a cavity or cyst for administration. By deposition of the cystic tumor into the lumen by any suitable technique, such as placement. If the tumor is a solid tumor, the antibody can be administered by first creating an excised cavity at the location of the tumor. This procedure differs from conventional craniotomy and tumor resection only in a few minor points. Because tumor resection is a common treatment and is often indicated to relieve pressure, administration of a therapeutic composition of the present invention can be performed after tumor resection. After a standard neurosurgical excision, the cavity is preferably rinsed with saline until all bleeding has been stopped by cauterization. Next, the buffy coat, which surrounds the tumor cavity at the surface, is cauterized to enhance the fibroblast response and the formation of patches in the buffy coat area. As a result, a closed body fluid-filled cavity is formed in the brain tissue where the tumor has been removed. After the cyst has formed, an Ommaya reservoir or microcatheter tip can be placed in the cavity that is connected to a pump device and allows for continuous infusion of the antibody solution into the cavity. See, for example, US Pat. No. 5,558,852, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0167]
Alternatively, a convection enhanced delivery catheter may be implanted directly into a tumor mass, a natural or surgically created cyst, or a normal brain mass. Such a convection-enhancing pharmaceutical composition delivery device greatly improves the diffusion of the composition throughout the brain mass. The implanted catheters of these delivery devices are intended to deliver therapeutic or imaging compositions to the brain and / or tumor mass, rather than diffuse flow, at high flow rate microinjections (ranging from about 0.5 to 15.0 μl / min). Flow rate). Such a device is described in U.S. Patent No. 5,720,720, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0168]
The effective amount of the therapeutic composition to be given to a particular patient will depend on a variety of factors, some of which will vary from patient to patient. A competent physician would be able to delay the growth of tumor cells and promote effective killing of the therapeutic agent to be administered to the patient to facilitate killing, or imaging compositions to be administered to the patient to facilitate tumor visualization. It is believed that an effective amount can be determined. The dosage of the antibody conjugate will depend on the treatment of the tumor, the route of administration, the nature of the therapeutic, the sensitivity of the tumor to the therapeutic, and the like. LD available for attached cytotoxic or imaging moiety₅₀Using animal data and other information, a physician can determine the maximum safe dose for an individual depending on the route of administration. For example, a dose administered intravenously is larger than a dose given intrathecally because more therapeutic fluid is administered to the body fluid. Similarly, compositions that are rapidly cleared from the body can be administered at higher doses or repeatedly to maintain therapeutic concentrations. The imaging moiety is typically less toxic than the cytotoxic moiety and, in some embodiments, can be administered at higher doses. A competent physician will be able to optimize the dosage of a particular therapeutic or imaging composition during routine clinical trials using routine techniques.
[0169]
Typically, the dosage will be from 0.001 to 100 milligrams of conjugate per kilogram of body weight of the subject. In the case of a radionuclide therapeutic composition administered intrathecally, doses in the range of 0.01 to 1 mg per kilogram of patient weight may be used. In the case of imaging conjugates that include a relatively non-toxic imaging moiety, larger doses ranging from 0.1 to 10 mg per kilogram of patient weight may be used. The amount used will depend on the sensitivity of the imaging method and the relative toxicity of the imaging moiety. For example, if the therapeutic composition is¹³¹In examples of treatments that include an I cytotoxic moiety, the dosage for the patient will typically start from a relatively low range of 10 mCi and be raised to 100 mCi, 300 mCi, or even 500 mCi. In other words, the therapeutic agent¹³¹If I, the dosage to the patient will typically be between 5,000 rad and 100,000 rad (preferably at least 13,000 rad, or even at least 50,000 rad). The dose of the other radionuclide is typically¹³¹It is chosen to be equivalent to the range of I. Similarly, the dose of a chemotoxic or toxin protein can be measured accordingly.
[0170]
The composition can be administered to the subject in a series of multiple doses. In the case of therapeutic compositions, regular periodic administration (eg, every 2-3 days) may be required or desirable to reduce toxicity. Where the therapeutic composition is used in a repeated dose regimen, those antibody moieties that do not elicit an immune response are preferred. The imaging antibody conjugate composition can be administered at a suitable time prior to the visualization technique. For example, dosing within one hour before direct visual inspection may be appropriate, or dosing within 12 hours prior to an MRI scan may be appropriate. However, care should be taken not to allow too much time between administration and visualization, as the imaging compound will ultimately be excreted from the patient's system.
[0171]
In addition to using imaging antibody conjugates for simple visualization, these compositions can be used as "mock tests" for relatively toxic cytotoxic antibody conjugates. If the same antibody moiety as the therapeutic conjugate is used for the imaging conjugate, doctors first use visualization techniques to accurately determine where in the brain the cytotoxic conjugate is likely to be concentrated can do. If a sufficient degree of tissue selectivity is not achieved (eg, if the tumor cells are excessively dispersed in normal tissue, or if the particular brain tumor protein target selected is sufficiently excessive in the tumor cells of a particular patient) If not, the physician can select another brain tumor protein target. The provision of multiple brain tumor protein targets in accordance with the present invention, in conjunction with both imaging and therapeutic agents, allows for a high degree of flexibility in designing effective treatment regimes for individual patients.
[0172]
Combination therapy
Brain tumors have heterogeneous characteristics and tend to spread throughout brain tissue. Because of this combination, their treatment is often difficult. In some cases, it may be preferable to use different therapeutic or imaging agent combinations to more completely target all cells that exhibit tumoricidal characteristics. Such conjoint treatment is through the administration of a combination of the therapeutic or imaging antibody compositions individually prepared as described above, and the administration of the combined therapeutic to the patient as described. The skilled physician will be able to take into account factors such as combination toxicity and the efficacy of the individual drugs when administering such combination drugs. Furthermore, one of skill in the art could screen for potential mutual cross-reactivity to ensure the full efficacy of each agent.
[0173]
Alternatively, several individual brain tumor protein targeting compositions can be administered simultaneously or sequentially for combination therapy. This may be desirable to avoid toxicity built up from several antibody conjugate reagents, or to more closely monitor possible adverse reactions to individual antibody reagents. Thus, a first antibody therapeutic may be administered on day 1, followed by a second on day 2, and then a re-administration of the antibody therapeutic on different consecutive days after a period of non-administration. Various cycles are included in the present invention.
[0174]
Experiment
The following examples are provided to provide those skilled in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, which limits the scope of what we consider to be the present invention. It is not intended to be performed, nor is it intended to imply that the experiments performed are only those described below. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (eg, amounts, temperature, etc.) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Centigrade, and pressure is at or near atmospheric.
[0175]
All publications and patent applications cited in this specification are herein incorporated by reference as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
[0176]
The present invention has been described in terms of particular embodiments that have been found or suggested by the inventors to include preferred modes for the practice of the invention. It will be appreciated by those skilled in the art, in light of the present disclosure, that many modifications and variations may be made to the particular embodiment illustrated without departing from the intended scope of the invention. For example, codon degeneracy can change the underlying DNA sequence without affecting the protein sequence. In addition, consideration of biofunctional equivalence allows the protein structure to be altered without affecting the type or amount of biological action. All such modifications are intended to be included within the scope of the appended claims.
[0177]
Example 1
Identification of differentially expressed sequences
Brain tumor:
Tumor tissue from an unknown patient, confirmed by neuropathology as glioblastoma grade IV, was snap frozen in the operating room and utilized as an experimental sample. Human whole brain tissue (Clontech Laboratrories, Palo Aloto, USA) was used as a control sample. Poly A prepared from cells⁺ RNA was converted to double-stranded cDNA (dscDNA) and standardized. Subtractive hybridization was performed using dscDNA from the tumor with an excess of dscDNA prepared from the same region of the non-cancerous brain. The differentially expressed gene fragment was cloned into a plasmid vector, and the resulting library was transformed into E. coli cells. The insert of the recombinant clone was amplified by the polymerase chain reaction (PCR). PCR products (fragments 200-2000 bp in size) were sequenced using oligonucleotides complementary to the general vector sequence. The sequence information obtained was compared to public databases using BLAST (blastn) and the Smith Waterman algorithm. The differentially expressed sequences thus identified are listed in Table 1.
[0178]
Example Two :
PTP ζ Two New splicing variant isoforms: PTP ζ SM1 as well as SM2 Identification
The PTPζSM1 mRNA nucleotide sequence was identified in a human fetal brain phage cDNA library and the PTPζSM2 mRNA nucleotide sequence was identified by PCR amplification of adult human brain cDNA.
[0179]
Total RT from either cells (glioblastoma culture system) or tissue using Trizol (Gibco Life Technologies, Inc.) according to the manufacturer's protocol for RT-PCR analysis performed as described below. RNA was isolated. Gibco Life Technologies, Inc. first strand (1^st Strand) synthesis kit and oligo dT₃₀CDNA was generated from total RNA using an anchored primer. 1 μl of cDNA was used for each RT-PCR reaction. PCR reactions were performed using the Advantage 2 kit (Clontech) under standard conditions. The products of the PCR reaction were confirmed via sequencing.
[0180]
Both clones were confirmed by RT-PCR analysis of glioblastoma cell lines and primary tumors. For PTPζSM1, a primer that produces an identifiable 1116 bp product

as well as

It was used. RT-PCR analysis was performed using portions of the unique 3 'end and 3' untranslated region as the hybridization target of the probe and 11 of 17 different glioblastoma cell lines tested. Expression of SM1 splice variant was confirmed in fetal brain and adult brain. In addition, RT-PCR analysis was performed on 28 primary brain tumor samples, confirming expression of the PTPζSM1 variant in 16 of the 28 tumors.
[0181]
For PTPζSM2, a primer that produces a 130 bp product when extra exon 23a is present and does not produce a product when exon 23a is not present

as well as

It was used. RT-PCR analysis was performed to confirm expression in 6 of the 17 different glioblastoma cell lines tested. In addition, RT-PCR analysis was performed on 28 primary brain tumor samples, confirming expression of the PTPζSM1 variant in 19 of the 28 tumors.
[0182]
For comparison, in 28 brain tumor tissue samples, PTPζ-α (primer

as well as

And PTPζ-β (primer

as well as

Was also subjected to RT-PCR analysis. PTPζ-α was shown to be expressed in 16 of 28 samples, and truncated PTPζ-β was shown to be expressed in 19 of 28 samples.
[0183]
The nucleotide sequence alignment of the two new splice variants with the reference sequence for PTPζ-α is shown in Table 2.
[0184]
[Table 2]

^**Boundaries determined from a draft (NT_007845.3) during human chromosome 7 analysis
^**Nucleotide position refers to position in full length RPTPZ (Accession number M93426)
[0185]
Example Three
Cell migration assays for determining the activity of antibodies against protein targets
Tumor cells are known to migrate relatively quickly to chemoattractants, and the ability to migrate has been treated as a measure of tumorigenicity. Commonly used chemoattractants are fetal calf serum, pleiotrophin, bFGF, and VEGF. This assay is used to determine the migratory capacity of cells in which the target gene has been knocked down or overexpressed.
[0186]
Use the ChemoTx® disposable chemotaxis system (Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD) according to the manufacturer's instructions with minor modifications. Briefly, glioblastoma cell cultures derived from cell line G55T2 are prepared by splitting the cells the day before performing the assay. Use a ChemoTx® chamber with the following specifications: pore size 8 μM, exposed filter area 8 mm^Two, Exposed filter area diameter 3.2mm. Plate layout: 30 μl per well, 96-well plate. The type of membrane is Track-etched polycarbonate.
[0187]
In preparation for the assay, filter membranes are coated overnight at 37 ° C. with 100 ml of PBS containing 0.1% acetic acid and 3.5 ml of Vitrogen 100 (from Cohesion). About 30 minutes before the start of the assay, the coated membrane is washed and rinsed with PBS containing 0.1% BSA. Cells are harvested by using standard techniques (trypsin-EDTA). The cells are washed once with DMEM 10% FBS and then spun at 1000 RPM for 5 minutes at room temperature. The pellet is resuspended in serum-free DMEM (serum-free medium) containing 0.1% BSA. Cells are spun and resuspended in serum-free medium, then spun and resuspended in the required amount of serum-free medium to provide a concentration of 1 mio. Cells / ml or 25,000 cells per 25 ul. Immediately before the assay, an appropriate amount of the antibody to be tested for anti-target functional activity is added to the cell suspension.
[0188]
For assays, standard chemoattractants are used to measure cell mobility. The chemoattractant is diluted in serum-free medium. A suitable non-specific chemoattractant is DMEM with 5% FBS. The chemoattractant solution and the control solution without chemoattractant are pipetted into the lower plate well (29 μl). After placing and fixing the filter plate over the lower well to ensure contact with the solution in the lower well, pipette the serial dilutions of the cell suspension to each site on the filter top. Then cover the plate, 37 ° C, 5% CO_TwoAnd incubate for 3-4 hours.
[0189]
After incubation, the sides of the upper filter are rinsed with PBS, exposed, and the upper filter area is cleaned with a wet cotton ball. Stain the filter using Diff-Quik ™ (VWR) dye kit according to the manufacturer's instructions. Count the cells that have migrated to the side of the lower filter using a microscope (200 × magnification) by counting 5 high power field sections per well.
[0190]
Example Two
Endothelial germination assay to determine antibody activity
Cell sprouting morphology has been used as an easily visualized assay to determine the inhibitory effect of candidate antibodies on protein target function for protein targets that stimulate endothelial cell sprouting, such as ARP2. Such assays are well described in the literature (Nehls, V. et al.Histochem.Cell Biol.104: 459-466 (1995); Koblizek, T.I., et al.Curr.Biol.8: 529-532 (1988); and Kwak, H.J. et al.FEBS Lett.448: 249-253). Briefly, endothelial cells from a suitable source, such as HUVEC or PPAEC (porcine pulmonary artery endothelial cells), are grown to confluence on microcarrier (MC) beads (175 μm diameter, available from Sigma). The appropriate effective concentration of protein target (200 ng / ml is a suitable starting point that can be optimized by one skilled in the art), and the appropriate concentration range (this will depend on the antibody titer and affinity for the target). ) And a 2.5 mg / ml fibrinogen gel containing 200 units / ml Trasylol (available from Bayer). The fibrin gel is incubated in M-199, supplemented daily with the same amount of recombinant protein and antibody, 2.0% heat-inactivated fetal calf serum, and 200 units / ml Tragilol. Three days later, the extent of germination is determined using a phase contrast microscope. A decrease in cell germination as compared to a control containing no antibody is indicative of a decrease in protein target activity by the antibody.
[0191]
The foregoing is intended to illustrate embodiments of the present invention and is not intended to limit the invention in any way. Although the invention has been described with respect to particular modifications, the details thereof are not to be construed as limitations and that various equivalents, changes and modifications are possible without departing from the spirit and scope of the invention. And it is understood that such equivalent embodiments are encompassed by the present invention. All publications and patent applications are herein incorporated by reference as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
[Brief description of the drawings]
[0192]
FIG. 1. Schematic representation of two newly discovered splicing variant isoforms of PTPζ. The approximate position of the isoform domain is shown below the isoform, along with the approximate exon size (for size reference, exon 12 is 3.6 kilobases). SM1 fails to undergo correct splicing after exon 9 and gives an mRNA with two extra codons after the normal end of exon 9, followed by a stop codon. SM2 contains a 116 nucleotide insertion between exon 23 and exon 24.

Claims (27)

A method for developing a biologically active agent that modulates the activity of a brain tumor protein target (T _BT ) gene or gene product, comprising:
A candidate bioactive agent,
(A) a polypeptide encoded by any one of the sequences set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7-16;
(B) a cell containing a nucleic acid encoding and expressing a polypeptide encoded by any one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 7-16; or (c) (i ) Knockout of a gene corresponding to any one of the sequences set forth in Table 1; (ii) any one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 7-16 Combining with any one of the non-human transgenic animal models for brain tumor gene function comprising one of the exogenous stably transmitted mammalian gene sequences comprising: and a brain tumor-derived molecule; A method comprising determining the effect of said agent on cell changes. 2. The method of claim 1, wherein the biologically active agent down-regulates or up-regulates expression. 2. The method of claim 1, wherein the biologically active agent is one that inhibits or increases the activity of the polypeptide. A method for diagnosing or staging a brain tumor, comprising determining up-regulation or down-regulation of the expression of any one of the sequences set forth in Table 1. 5. The method according to claim 4, wherein the brain tumor is an astrocytoma. 6. The method according to claim 5, wherein the astrocytoma is a glioblastoma. 5. The method of claim 4, comprising detecting an increase or decrease in the amount of mRNA or polypeptide in the brain tumor cells. An array of nucleic acids comprising two or more nucleic acids comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7-16. Administering to the patient an effective amount of a compound that specifically binds to the protein encoded by the sequence set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 7-16, which is associated with the imaging moiety; A method of imaging a brain tumor, comprising visualizing an imaging portion of a compound. 11. The method of claim 10, wherein the compound is administered by intrathecal administration. 11. The method of claim 10, wherein the compound is administered by intravascular administration. 11. The method of claim 10, wherein the brain tumor is an astrocytoma. 14. The method of claim 13, wherein the astrocytoma is a glioblastoma. 11. The method of claim 10, wherein the compound is an antibody or an antibody fragment. 11. The method of claim 10, wherein the imaging moiety is selected from the group consisting of a radioactive moiety, a positron emitting moiety, an optically visible dye, an optically visible particle, and a magnetic spin contrast moiety. A method for the treatment of a brain tumor, comprising: A compound that specifically binds to a protein encoded by the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7-16, which is associated with one or more cytotoxic moieties, A method for treating a brain tumor, comprising administering an amount. 19. The method of claim 18, wherein the compound is administered by intrathecal administration. 19. The method of claim 18, wherein the compound is administered by intravascular administration. 19. The method of claim 18, wherein the brain tumor is an astrocytoma. 22. The method of claim 21, wherein the astrocytoma is a glioblastoma. 19. The method of claim 18, wherein said compound is an antibody or an antibody fragment. 19. The method of claim 18, wherein the cytotoxic moiety is selected from the group consisting of a radioactive moiety, a chemotoxic moiety, and a toxin protein moiety. An isolated nucleic acid encoding a PTP- □ SM1 or SM2 splice variant. 25. The nucleic acid according to claim 24, wherein PTP- □ is human. 26. The nucleic acid of claim 25 having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. A polypeptide encoded by the nucleic acid of claim 25.

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