JP2004535397A - 心細胞におけるカルシウムチャンネルの活性の調節法及びそのための試薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は一般的には、心細胞のカルシウムチャンネルの活性を調節できる新規ペプチドに関する。更に詳しくは、本発明は、心カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供し、該方法は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）を前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントに接触させ、前記カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。本発明の方法は心機能不全に関連する各種の障害及び疾患、特に心拍出量の減少及び／又は心細胞における興奮収縮連関の異常、カルシウム過負荷、又はカルシウム漏れが関与する疾患及び障害の治療に有用である。
Description
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的には心細胞におけるカルシウムチャンネルの活性を調節できる新規ペプチドに関する。更に詳しくは、本発明は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）を、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、前記カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む心カルシウムチャンネルの活性の調節法を提供する。本発明の方法は、心機能不全に関連する各種の障害及び疾患、特に心拍出量の減少及び／又は心細胞における興奮収縮連関の異常、カルシウム過負荷、又はカルシウム漏れが関与する疾患及び障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
本明細書中に引用した出版物の詳細な書誌的事項は説明の最後にまとめてある。本明細書中では、いずれか一つ以上の先行技術文献を含め、先行技術を参照しているが、そのことを前記先行技術がオーストラリアにおける一般常識である又はオーストラリアにおける一般常識の一部を形成するということの承認又は示唆と受け取るべきでない。
【０００３】
興奮収縮連関は、電気的興奮を機械的活動に連結する心筋及び骨格筋のような横紋筋の機能に不可欠である。興奮収縮連関の重要な要素は、ジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）、横行小管（ＴＴ）の電位依存性Ｃａ2+チャンネル、及び筋小胞体（ＳＲ）から細胞質へのカルシウム放出のために開口する筋小胞体（ＳＲ）膜のＣａ2+放出チャンネル又はリアノジン受容体（ＲｙＲ）である。
【０００４】
ＲｙＲ及びＤＨＰＲとも、異なるアイソフォームが心筋及び骨格筋細胞に存在する。特に、ＲｙＲ１とＤＨＰＲ−アイソフォーム３は骨格筋で、ＲｙＲ２とＤＨＰＲ−アイソフォーム１は心細胞で優位を占めている。ＲｙＲ１とＲｙＲ２のアミノ酸配列の間には約７０％の同一性しかない。
【０００５】
骨格筋では、リアノジン受容体（ＲｙＲ１）は、ＤＨＰＲα−１サブユニットの反復IIとIIIの間の１３８のアミノ酸細胞質ループとのタンパク質−タンパク質相互作用によって活性化される（Ｔａｎａｂｅら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：５６７−５６８）。骨格筋のＲｙＲ１媒介性カルシウム放出を活性化するに足る骨格筋のＤＨＰＲ細胞質ループの領域は、Ｔｈｒ671からＬｅｕ690の２０アミノ酸の範囲の残基にあることが確定されている（Ｅｌ Ｈａｙｅｋら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２１１６−２２１１８；Ｄｕｌｈｕｎｔｙら、１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７７：１８９−２０３；及びＧｕｒｒｏｌａら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７８７９−７８８６）。四つ組構造のＤＨＰＲ中には４個のＤＨＰＲ分子があり、厳密な幾何学的配列で骨格筋中のＲｙＲ１ポリペプチド２つごとに向かい合っている。その厳密な幾何学的配列は、正常の興奮収縮連関に重要と考えられている。電気的刺激などによるＤＨＰＲの興奮時、このタンパク質−タンパク質相互作用は、おそらくＲｙＲ１ポリペプチドにコンホメーションのシフトを引き起こす。これがチャンネルの開口をもたらし、それによってＳＲからのカルシウム放出が起こる。従って、骨格筋における興奮収縮連関は本質的にはカルシウム非依存性プロセスである。
【０００６】
これに対し、心筋における興奮収縮連関はカルシウム誘発性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）機序が関与する（Ｎｉｇｇｌｉ，１９９９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６１：３１１−３３５）。興奮後の心ＤＨＰＲカルシウムチャンネルの開口により、少量の細胞外カルシウムが、各活動電位時に活性化される電位依存性Ｌ型カルシウムチャンネル（すなわち心ＤＨＰＲ）を通じて心筋細胞に流入する。この初期シグナルは、続いて起こるＳＲ中の細胞内カルシウム貯蔵部位からのＣＩＣＲの引き金となる。ＳＲからの二次的カルシウム放出は、心ＲｙＲ２カルシウム放出チャンネルを通じて起こる。ほとんどの哺乳動物では、ＣＩＣＲは初期シグナルの引き金を数倍に増幅するが、これは心ＲｙＲ２分子と心ＤＨＰＲの化学量論が約１６：１であるのと一致する。
【０００７】
心ＣＩＣＲは、ＳＲからのカルシウム放出を引き起こすのに細胞質ゾルのＣａ2+の初期上昇を必要とするにもかかわらず、自動継続するようにはならないようである。これは、ＣＩＣＲは、カルシウム過負荷の心筋細胞間だけには伝播するであろうが、通常は個々の細胞に限局されているためである。また、心筋収縮力は、約３×１０-7Ｍ［Ｃａ2+］i〜約１０-6Ｍ［Ｃａ2+］iの［Ｃａ2+］iに比例して増加し、ＣＩＣＲがオール・オア・ナッシング(all or nothing) の応答でないことを示唆している。
【０００８】
骨格筋細胞における興奮収縮連関とは対照的に、インビボにおける心ＤＨＰＲと心ＲｙＲ２との間に何らかの直接的なタンパク質−タンパク質相互作用があるかどうかわかっていない。しかしながら、ツーハイブリッドアッセイによれば骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループは心ＲｙＲ２に確かに結合し（Ｏｓｔｅｒｌａｎｄら、１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７６：Ａ４６７−（アブストラクト））、表面プラズモン共鳴試験によれば骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）はＲｙＲ２に結合する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ及びＲｏｎｊａｔ，１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７６：Ａ４６６−（アブストラクト））。
【０００９】
有力なデータが示すところによれば、骨格筋及び心筋のＤＨＰＲとＲｙＲチャンネル間の関係は異なる。例えば、骨格筋ＲｙＲ１は欠いているが骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットは含有するｄｙｓｐｅｄｉｃ筋細胞に発現された心ＲｙＲ２は、骨格筋型の興奮収縮連関を支持できない。その上、単離されたＲｙＲ２チャンネルは、心筋又は骨格筋のＤＨＰＲα−１サブユニットの反復IIとIIIの間の全１３８のアミノ酸細胞質ループによって活性化されない（Ｌｕら、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６５１１−６５１６）。さらに、骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）は、骨格筋ＲｙＲ１チャンネルの高親和性アクチベータであるという事実にもかからわず、心ＳＲからのＣａ2+放出を誘発もせず、心ＲｙＲ２チャンネルへの［3Ｈ］リアノジン結合を増強もしないことが示されている（Ｅｌ Ｈａｙｅｋら、１９９５，上記）。さらに、これらの入手可能なデータは、骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）は、例えば開口時間の延長や開口頻度などによって心ＲｙＲ２チャンネルを活性化することができないことを示している。
【００１０】
Ｓｔｅｒｎ（１９９２，ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３０９２−３１００）は、Ｃａ2+シナプス（すなわちＣａ2+流出入部位付近の非常に高いＣａ2+局在ドメイン）が心組織のＤＨＰＲ及びＲｙＲの活性に機能的に連結していることを提唱した。各Ｃａ2+シナプスは、高い局所Ｃａ2+濃度によってＲｙＲ２の局所制御を可能にするので、細胞全体に渡って又は細胞間にＣａ2+放出シグナルを拡散させることなく、観察される高いシグナル増幅を生み出すことができる。その結果、各シグナル時に召集される放出単位数は、引き金のカルシウム放出に応じて定量的に段階的であると思われる。この提唱は、短時間（約５０ｍｓ）のカルシウムスパーク及び心筋細胞刺激時の限局された空間的広がり（約１．５μｍ）といった観察と一致する（Ｃｈｅｎｇら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：７４０−７４４）。
【００１１】
心筋収縮不全は、虚血性心疾患、鬱血性心不全、及び、敗血症のような全身性炎症状態を有する患者のありふれた罹病及び死亡原因となっている。蓄積されつつある証拠によれば、収縮不全は筋細胞質(myoplasmic)カルシウム流の調節不全に伴うことが示されている。筋フィラメントのＣａ2+感度減退、又は例えばカルシウムシナプスの劣化や破壊、ＲｙＲ２の劣化、又はＤＨＰＲの劣化などによるカルシウムシグナリングの劣化は、心収縮力の低下をもたらしうる。いくつかのＣａ2+シグナル経路は心不全又は心肥大（末期の心不全に観察されるカルシウム過負荷を伴う）時に有害作用を受ける。静止Ｃａ2+濃度の上昇、Ｃａ2+の変化振幅の低下、弛緩の緩徐化、及びＳＲ中のＣａ2+ポンプの変化が、心不全又は心肥大の心組織に観察されている。
【００１２】
更に詳しくは、肥大心並びに不全心には、正常の心臓と比べて興奮収縮連関の効率低下も見られる（Ｇｏｍｅｚら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７５５−７５６）。しかしながら、不全又は肥大心における個々のＤＨＰＲ及びＲｙＲは正常のように見えるので、これら２つののカルシウムシグナルタンパク質間の連結に欠陥があることが示唆される。この見解は、β−アドレナリン作動性アゴニストを投与して心ＤＨＰＲの開口時間を延長することにより、肥大細胞又は鬱血性心不全後に正常の興奮収縮連関を取り戻せることから裏付けられる。
【００１３】
さらに、ヒト不全心におけるＲｙＲ２の高リン酸化も、チャンネル機能に欠陥をもたらす。
さらに、心拍出量は、心臓発作後のような急性状況下では、興奮収縮連関を増強する“変力性薬”によって押し上げることができる。虚血発作時に心筋の個々の領域が損傷され、心拍出量の低下を招く。脳のような必須器官への血液供給は残った健常心筋に更に強力に収縮してもらうことによって維持できる。現在ではこれを、β−アドレナリン性刺激を模倣しｃＡＭＰ濃度を増加させることでＤＨＰＲ活性及び興奮収縮連関を刺激する薬物によって行っている。長期的に見ると、増加したｃＡＭＰ濃度は有毒で、カルシウム過負荷をもたらしかねない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本明細書は、参考文献一覧の後に示した、プログラム Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１を用いて用意したヌクレオチド及びアミノ酸配列情報を含有する。各ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、配列表中で数字見出し＜２１０＞とその後の配列識別子（例えば＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって識別される。各ヌクレオチド又はアミノ酸配列の長さ、配列の型（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）及び原料生物は、それぞれ数字見出し項目＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞に提供される情報によって示される。明細書中に引用されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、記述子“配列番号”とその後の数字識別子によって定義される。例えば配列番号１は、＜４００＞１の数字見出し項目中に提供される情報のことである、など。
【００１５】
本明細書中で配列番号１に示したコンセンサス配列への参照は、前記コンセンサス配列を編集するのに用いた配列番号２〜７に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸配列への参照を含むとみなされるべきである。
【００１６】
本明細書全体を通じて、別途記載のない限り、“含む”という語又は“含み”もしくは“含んでいる”などの変形語は、記述したステップ又は構成要素又は完全体又はステップ群又は構成要素群又は完全体群を包含するが、他の任意のステップ又は構成要素又は完全体又は構成要素群又は完全体群を除外しないことを意味すると理解されるべきである。
【００１７】
本明細書中で使用している用語“〜由来の（〜から誘導された）”は、特定の完全体が、必ずしも直接的ではないにしろ、特定の原料から得られうることを示すとみなされるべきである。
【００１８】
本発明に至る研究の中で、発明者らは、心不全及び／又は心肥大の改良された治療計画を提供するため、心組織におけるＣＩＣＲを調節する新規手段を明らかにしようと模索してきた。驚くべきことに、心ＤＨＰＲと心ＲｙＲ間の物理的関係は確立されていないものの、本発明は心ＲｙＲ２チャンネルを活性化できる骨格筋又は心筋のＤＨＰＲポリペプチドの小フラグメント、例えば小さな塩基性荷電ペプチドを提供する。
【００１９】
更に詳しくは、本発明者らは、骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）が、−４０ｍＶ（負の電位はＳＲからのカルシウム放出を誘発する）でＲｙＲ２チャンネルの顕著な活性化と、＋４０ｍＶで強力な阻害を生み出すことを示した。心ＲｙＲ２チャンネルの活性化はわずか１ｎＭのペプチド濃度で観察され、骨格筋ＲｙＲ１の活性化に要するペプチド濃度より著しく低かった。さらに、心ＲｙＲ２チャンネルの阻害は、３×１０-7Ｍの細胞質Ｃａ2+で骨格筋ＲｙＲ１チャンネルに観察されるものより著しく大きかった。
【００２０】
従って、本発明の一側面は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供することであり、該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント、例えば塩基性荷電フラグメントと接触させることを含む。
【００２１】
更に好ましくは、本発明は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供し、該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント、例えば塩基性荷電フラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。
【００２２】
前述の内容から、本発明の一態様は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を増強する方法に関することは明らかであろう。該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を増強するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。本明細書中に示されている通り、そして本発明を何らかの理論又は作用様式又は有効ペプチド濃度に制限することなく、本発明者らは、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２について、チャンネル開口頻度と各チャンネル開口時間の両方が、約１ｎＭペプチド〜約１０μＭペプチドまでの適用によって増強されることを示した。高ペプチド濃度では、最初に開口したチャンネルの活性がわずかに低下するが、他のチャンネルの活性はより高くなる。これはおそらくＲｙＲ２チャンネルのペプチドに対する感度に微細な不均一性があることを反映しているのであろう。
【００２３】
また前述の内容から、本発明の別の態様は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を阻害する方法に関することは明らかであろう。該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を阻害するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルが活性を欠いていることを判定することを含む。本明細書中に示されている通り、そして本発明を何らかの理論又は作用様式又は有効ペプチド濃度に制限することなく、本発明者らは、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２について、特に＋４０ｍＶにおけるチャンネル開口頻度が約１０μＭを上回る濃度のペプチドによって削減されることを示した。これはおそらくＲｙＲ２チャンネルのポア内でのペプチド結合が、チャンネルの活性時に結合している部位とは異なる部位で起きているためであろう。
【００２４】
本発明の第二の側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチドモジュレーターを同定する方法を提供することである。該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチドを、前記機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較し；そして
(iv)好ましくは、(i)と比較して(ii)で比較に値する又は増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチドを選択することを含む。
【００２５】
代替の態様において、本発明の本側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチドモジュレーターを同定認する方法を提供する。該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド及び心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量の前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較し；そして
(iv)好ましくは、(i)と比較して(ii)で比較に値する又は増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチドを選択することを含む。
【００２６】
本発明の第三の側面は、心ＲｙＲ２チャンネルが開口しているか又は高いチャンネル開口確率を有しているかどうかを決定する方法を提供することである。前記方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、ある量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体に、前記チャンネルへの結合が起こるに足る時間及び条件下で接触させ、前記ペプチドの前記チャンネルへの結合を測定することを含み、前記ペプチドの前記チャンネルへの結合は高いチャンネル開口確率を示し、非特異的なペプチドの結合は低いチャンネル開口確率を示す。
【００２７】
本発明の第四の側面は、ヒト又は動物患者における心機能不全の治療法を提供することである。該方法は、有効量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、増強された心収縮が起こるに足る時間及び条件下で投与し、それによって前記心機能不全を矯正することを含む。
【００２８】
本発明の第五の側面は、ジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を１種類以上の製薬上許容しうる希釈剤と共に含む医薬組成物を提供することである。前記ペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチドの少なくとも約５個の連続アミノ酸残基を含む。
【００２９】
本明細書全体を通じて使用している１文字及び３文字略号の定義を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
好適な態様の詳細な説明
本発明の一側面は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供することであり、該方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させることを含む。
【００３２】
更に詳しくは、本発明は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供し、該方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。
【００３３】
本明細書中で使用している用語“リアノジン受容体−２チャンネル”又は“ＲｙＲ２チャンネル”又は“心ＲｙＲチャンネル”とは、ＲｙＲ２ポリペプチドサブユニットを含むカルシウムチャンネルのことを言うものとする。当業者であれば、本明細書中に引用した“ＲｙＲ２チャンネル”又は“心ＲｙＲチャンネル”の物理的構造は周知している。
【００３４】
本明細書中で使用している用語“調節する”とは、ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を増強又は阻害することを意味するものとする。従って、“ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節する”又は類似の用語が一般的に意味するのは、例えば心ＲｙＲ２のカルシウムシナプス又はカルシウム感度、各活動電位時の心ＲｙＲ２チャンネルの開口頻度、又は個々の心ＲｙＲの開口時間を変更することによって、ＣＩＣＲが調節される（すなわち増強又は削減される）ということである。
【００３５】
前述のように、本発明は明らかに、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性の増強法及び心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性の阻害法の両方を包含する。
心ＲｙＲ２チャンネルは、心細胞内の原位置（in situ）にあってもインビボで心筋にあってもよいが、例えば脂質二重層に埋め込まれたような単離されたＲｙＲ２チャンネルであってもよく、あるいは、例えばトランスフェクト細胞（例えばＣＨＯ細胞又はｄｙｓｐｅｄｉｃ筋細胞）の膜に発現されたような組換え又は再構成ＲｙＲ２チャンネルであってもよい。例えばＢｈａｔらが記載しているような標準法（１９９７，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７３：１３２９−１３３６）を用いてトランスフェクト細胞にＲｙＲ２チャンネルを発現させることができる。前記文献は引用によって本明細書に援用する。好ましくは、心ＲｙＲ２チャンネルは心細胞中の原位置（in situ）又はインビボの心組織にある。
【００３６】
本明細書中で使用している用語“フラグメント”は、例えばアルギニン又はリジンのような塩基性アミノ酸残基又は半塩基性アミノ酸残基であるヒスチジンが比較的高割合で存在するため、ペプチドが生理的ｐＨ値で総体的に正電荷を有していることを意味する。好ましくは、フラグメントは少なくとも約２５％の塩基性アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも約５０％の塩基性アミノ酸残基を有することになろう。
【００３７】
本明細書に記載の発明を実施するのに有用なペプチドは、アミノ酸配列：
【００３８】
【化１】
【００３９】
［Ｘはアミノ酸残基］を含む心筋又は骨格筋のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント由来の、長さが少なくとも約５個のアミノ酸のペプチドである。本発明は、配列番号１と類似の配列を有する任意の原料由来のペプチド、例えば合成又は天然ペプチド、あるいは任意のＤＨＰＲ配列から誘導されたペプチドの使用にも拡大されることは明白である。
【００４０】
本発明を更に説明するために、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、図１に示した通り、いくつかの動物種の骨格筋及び心筋のＤＨＰＲの細胞質II-IIIループの２０量体ペプチドのコンセンサス配列に一致する。本明細書中に例示した通り、本発明者らは、ヒト骨格筋ＤＨＰＲ−３の細胞質II-IIIループの部分はヒツジのＲｙＲ２チャンネルの活性を調節することを示している。図１に示した種々のＤＨＰＲ間の近似した配列関係は、配列番号１の配列又は配列番号１と実質的に同一の配列を有する任意のペプチドはＲｙＲ２チャンネルの活性を調節するであろうことを示している。
【００４１】
従って、本発明は、配列番号１に示したアミノ配列の任意及びすべての相同体、類似体及び誘導体の使用にも拡大されることは明白である。好ましくは、そのような相同体、類似体、又は誘導体は塩基性荷電ペプチドであり、更に好ましくは配列番号１の保存塩基性残基を保持している。
【００４２】
なお更に好ましくは、主題の配列は、配列番号１のアミノ酸位置１１〜１５のモチーフＲＫＲＲＫを含む。
本文脈において、配列番号１〜７のいずれか一つの“相同体”とは、骨格筋又は心筋のＤＨＰＲアミノ酸配列又は他の種のような他の原料由来の類似配列から直接誘導された、あるいは擬似ペプチドをＲｙＲ２チャンネルの調節活性に関してスクリーニングすることによって誘導された天然又は合成の塩基性荷電ペプチドのことを言い、配列番号１又は配列番号２〜７に掲載した特定のアミノ酸配列のいずれか一つに実質的に一致する配列を含む。
【００４３】
例えば、配列番号１〜７のいずれか一つのアミノ酸は、ペプチドの総体的特徴（例えば塩基性電荷又はコンホメーション）が維持されていれば、類似の性質、例えば疎水性、親水性、疎水モーメント、抗原性、電荷、又はα−らせん構造の形成傾向を有する他のアミノ酸で置換することもできる。
【００４４】
置換にはアミノ酸の変化も含まれる。その場合、アミノ酸は天然の異なる又は非従来型のアミノ酸残基で置換されている。そのような置換は“保存的”と分類でき、その場合、アミノ酸残基は類似の性質を有する別の天然アミノ酸で置換されている。例えば、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ⇔Ｍｅｔ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、又はＡｓｎ⇔Ｇｌｎである。アミノ酸置換は典型的には単一の残基の置換であるが、複数の残基（クラスターでも分散でも）の置換であってもよい。
【００４５】
当業者に公知の任意の方法、例えば自動ペプチド合成機でＦｍｏｃアミノ酸を用いて行う固相法によって製造される合成ペプチドである相同体は、本発明で特に意図するものである。そのようなペプチドは、従来法によって環化でき、及び／又は同種ペプチドを実質的に含まないように部分精製してもよい。
【００４６】
配列番号１〜７のいずれか一つの“類似体”は、前記配列又はその相同体と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。その中には一つ以上の非天然アミノ酸類似体があってもよい。特に好適な類似体は、配列番号１〜７のいずれか一つの任意のペプチド又は非ペプチド擬似体を含み、前記配列の特徴、例えば電荷分布又はコンホメーション又は他の構造的特徴を保持しているものである。Ｇｕｒｒｏｌａらによるインペラトキシン(imperatoxin)ペプチド（１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７８７９−７８８６）及び任意の合成非ペプチド擬似体は特に本発明で意図するものである。
【００４７】
配列番号１〜７のいずれか一つに関わる用語“誘導体”は、前記配列又はその相同体もしくは類似体の任意の部分、フラグメント、又はポリペプチド融合のことを言うものとする。誘導体は修飾されたアミノ酸配列又はペプチドを含み、その中に含有される一つ以上のアミノ酸残基にリガンドが結合している。例えば、脂質、リポサッカリド、リポ多糖（ＬＰＳ）、炭水化物、酵素、ペプチド、放射性核種、蛍光化合物、光活性化可能残基（例えばｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、又はグルコシル部分などである。ペプチドの誘導体化法は当該技術分野で周知である。
【００４８】
例えば、好適な誘導体は配列番号１〜７のいずれか一つのフラグメント、又は配列番号１〜７のいずれか一つの相同体もしくは類似体のフラグメントを含みうる。アミノ酸欠失は通常約１〜１５個のアミノ酸残基の長さのオーダーであろう。欠失は、配列番号１のＮ末端又はＣ末端に対してなされるのが好ましい。
【００４９】
あるいは、配列番号１〜７のいずれか一つの誘導体は、追加のアミノ酸残基をペプチド又はその相同体もしくは類似体のＮ末端又はＣ末端に付け加えて有していてもよい。挿入は、一般的にＲｙＲ２への接近の障害にならないよう十分に小さく、例えば１〜４個のアミノ酸残基のオーダーの挿入であろう。
【００５０】
配列番号１〜７のいずれか一つの好適な相同体、類似体及び誘導体は、配列番号１〜７のいずれか一つの少なくとも約５個の連続アミノ酸、更に好ましくは少なくとも約１０個の連続アミノ酸残基、又は更に好ましくは少なくとも約１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む。従ってそのような相同体、類似体及び誘導体は、配列番号２〜７のいずれか一つと比べて全長又は全長未満の配列であり得る。
【００５１】
好適な相同体、類似体又は誘導体は、ＲｙＲ２チャンネルの調節活性に関する限り配列番号１と機能的等価性を所有していることに加え、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことになろう。好ましくは、配列番号１に対する同一性のパーセンテージは、少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約９０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９５％又は少なくとも約９８もしくは９９％であろう。二つのアミノ酸配列が定義のパーセント同一性又は類似性の限界内に入るかどうかを決定する場合、アミノ酸配列を並べて比較することが必要なことは当業者であればわかるであろう。そのような比較又はアラインメントにおいては、アラインメントの実施に使用したアルゴリズムによって非同一アミノ酸残基の位置に相違が生じるであろう。本明細書では、二つ以上のアミノ酸配列間のパーセント同一性及び類似性を言う場合、当業者に公知の任意の標準アルゴリズムを用いて測定した前記配列間のそれぞれ同一及び類似の残基の数を言うことにする。特に、アミノ酸の同一性及び類似性は、米国ウィスコンシン州マディソン、ユニバーシティリサーチパーク、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．のＧＡＰプログラムを用いて計算する（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５）。これは、複数のアラインメントに、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、あるいはＴｈｏｍｐｓｏｎらのＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ アルゴリズム（１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を利用し、アラインメントの中の同一／類似アミノ酸の数を最大にし、配列ギャップの数及び／又は長さを最小にする方法である。
【００５２】
特に好適な配列番号１の相同体、類似体、又は誘導体は、心ＲｙＲ２チャンネルの活性の調節に関して配列番号２〜７のいずれか一つと競合するであろう。標準的競合試験では、異なる濃度の試験されるペプチドを、例えば心ＲｙＲ２チャンネルの活性を増強又は阻害する濃度の配列番号２の存在下で、ＲｙＲ２チャンネルの調節活性について検定する。例えば、心ＲｙＲ２チャンネルの高親和性アクチベーターは、約１０-7Ｍ〜約１０-5Ｍの範囲の細胞質カルシウム濃度で脂質二重層中でのチャンネルの活性をうまく増強し、公知のアクチベーターペプチド（例えば約１ｎＭの配列番号２〜約１００ｎＭの配列番号２）によって誘導されたチャンネルの活性の増強と競合する能力によって判定できる。同様に、心ＲｙＲ２チャンネルの高親和性インヒビターは、約１０-7Ｍ〜約１０-5Ｍの範囲の細胞質カルシウム濃度で脂質二重層でのチャンネルの活性をうまく阻害し、細胞質Ｃａ2+濃度１０-4Ｍまでにおける公知のインヒビターペプチド（例えば３２．５μＭの配列番号２）によって誘導されたチャンネルの活性の阻害と競合する能力によって判定できる。
【００５３】
発明者らは、本発明を決して制限することなく、配列番号２に記載のヒト骨格筋ＤＨＰＲ２０量体ペプチド配列の類似体及び誘導体（本明細書に定義の通り）に一致する３種類のペプチドを作り出した。これらのペプチドの詳細は以下の通りである。
【００５４】
(i)配列番号８は配列番号２の２０量体ペプチドに一致するが、以下に示すようにセリン687（配列番号２の残基１７）がアラニン残基で置換されている。
【００５５】
【化２】
【００５６】
(ii)配列番号９は配列番号２の２０量体ペプチドに一致するが、以下に示すようにアルギニン688（配列番号２の残基１８）がアルギニンのＤ異性体で置換されている。
【００５７】
【化３】
【００５８】
(iii)配列番号１０は配列番号２の２０量体ペプチドに一致するが、以下に示すようにセリン687（配列番号２の残基１７）がアラニン残基で置換され、アルギニン688（配列番号２の残基１８）がアルギニンのＤ異性体で置換されている。
【００５９】
【化４】
【００６０】
本文脈において、例えば、心ＲｙＲ２チャンネルをＤＨＰＲポリペプチドの塩基性ペプチドフラグメントに“接触させる”という用語は、ペプチドをチャンネルに緊密に物理的会合させることを意味するが、必ずしもペプチドのチャンネルへの実際の結合は必要としない。本発明の実施においてＤＨＰＲペプチドはＲｙＲ２チャンネルに結合するかもしれないが、要求されるのは調節されたチャンネルの活性だけなので、そのような結合は本発明の本質的な特徴ではない。この点において、本発明の目的は、心ＲｙＲ２ポリペプチドへの結合を達成することではなく、ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節することである。当業者であれば、結合と活性は必ずしも等価でないことを知っている。なぜならば、ＤＨＰＲポリペプチドは、ＲｙＲ２ポリペプチドの多数の異なる部位のいずれか一つに結合しうるが、ＲｙＲ２チャンネルの活性を必ずしも調節するとは限らないからである。
【００６１】
好ましくは、ペプチドはＲｙＲ２チャンネルの細胞質面と接触させる。
好ましくは、配列番号１〜７のいずれか一つ、又は配列番号１〜７のいずれか一つの相同体、類似体、もしくは誘導体、例えば配列番号８〜１０のいずれか一つは、本発明の方法の実施中に、ＲｙＲ２チャンネルのＲｙＲ２ポリペプチドの部分に結合する。本発明を何らかの理論又は作用様式に制限するつもりはないが、本発明の実施に使用されるペプチド（又はその相同体、類似体、もしくは誘導体）は、チャンネル中のＲｙＲ２ポリペプチドの一つ以上の負荷電残基、例えばアミノ酸配列：
【００６２】
【化５】
【００６３】
中の酸性残基に結合することによって、ＲｙＲ２チャンネルに接近できるようなコンホメーションを取ってもよい。
前述の説明から、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定するには、ペプチド、又はその問題についてのリアノジンの、チャンネル又はＲｙＲ２ポリペプチドへの結合を測定するだけでは不十分であるということが導き出される。もっとも、これも確かに、調節されたチャンネルの活性測定の付属的部分を形成するものではあり得る。チャンネルの活性を測定するための好適な手段は次の群から選ばれる。
【００６４】
(i)当該技術分野で認められている方法を用いて脂質二重層における単一又は複数のＲｙＲ２チャンネル開口を記録する。例えば、Ａｈｅｒｎら（１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５２：３６９−３７４）、Ｌｕら（１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６５１１−６５１６）、Ｌａｖｅｒら（１９９５，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ，．Ｂｉｏｌ．１４７：７−２２）、又はＤｕｌｈｕｎｔｙら（１９９９，上記）に記載の方法による；
(ii)当該技術分野で認められている方法を用いてＳＲ小胞からのカルシウム放出を測定する。例えば、Ｅｌ−Ｈａｙｅｋら（１９９５，上記）、Ｇｕｒｒｏｌａら（１９９９，上記）、又はＤｕｌｈｕｎｔｙら（１９９９，上記）に記載の方法による；
(iii)例えば、Ｚａｌｏｇａら（１９９７）に従って心収縮性を測定することにより心機能を測定する；及び
(iv)当該技術分野で認められている任意の血管緊張測定法を用いて、単離した胸部大動脈輪のペプチド投与後の血管緊張を測定する。
【００６５】
当業者であれば、心機能は、ｄＰ／ｄｔｍａｘ又は−ｄＰ／ｄｔｍａｘ値で査定される収縮性、左室の収縮期圧、及び心拍数からなる群から選ばれる一つ以上のパラメータに対するペプチド投与の濃度依存性を測定することによって容易に判定できることは理解される。心室細動又は他の心不整脈も測定すればペプチドの負の副作用も定量化できる。
【００６６】
増強された心ＲｙＲ２チャンネルの活性について検定する中で、増加したチャンネル開口確率（Ｐｏ）が検出される。より高いチャンネル開口確率は、ＳＲ小胞を含むＳＲからのカルシウム流出又は放出の増強、及び心収縮性の増強、及び弛緩の削減をもたらす。血管緊張も増強されうる。
【００６７】
これに対し、心ＲｙＲ２チャンネルの活性のインヒビターは、チャンネル開口確率の減少、ＳＲからのカルシウム放出の減少、及び心収縮性の低下をもたらすことになる。血管緊張も低下しうる。
【００６８】
調節された心ＲｙＲ２チャンネルの活性のその他の測定法も除外されない。
配列番号１〜７のいずれか一つ、又はその相同体、類似体もしくは誘導体（例えば配列番号８〜１０）、特に配列番号２の、心ＲｙＲチャンネルの活性の調節における効力は、構造及び機能的類似性を共有する化合物のスクリーニングに使用する試薬としてのそのような配列の有用性を明らかにする。そのような試薬は、数千の化合物が迅速にスクリーニングできる、高スループットのスクリーニングアッセイを可能にする。本明細書中に記載の調節活性を有する可能性のあるペプチド擬似体も、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２受容体を用いて、又は別の適切なアッセイフォーマットで、心ＲｙＲ２チャンネルの活性の調節能力について試験することができる。
【００６９】
従って、本発明の第二の側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチド又は非ペプチドモジュレーターの同定法を提供することであり、該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド又は非ペプチド化合物を、前記機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；そして
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較することを含む。
【００７０】
好ましくは、前記フラグメントは配列番号１のペプチド配列の少なくとも５個の連続アミノ酸を含む。
好ましくは、配列番号１又は配列番号１の相同体、類似体もしくは誘導体に匹敵する又はそれより増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチドを選択する。そのようなペプチドは、匹敵する又は増強されたチャンネルの活性の調節によって検出可能であり、それは(i)との比較により(ii)で検出される（上記）。
【００７１】
例えば、心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する決まった量の配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体を機能性受容体に加えてもよい。次に該反応混合物を活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートし、チャンネルの活性を測定する。並行する実験で、候補のペプチド又は非ペプチド化合物を、配列番号１の存在下で活性の調節を可能にする条件下で心チャンネルとインキュベートし、このテストサンプルのチャンネル活性を、配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体の活性と比較して測定する。配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体と比較して匹敵する又は増強された調節活性を有するペプチド又は非ペプチド化合物が選択できる。
【００７２】
代替の態様において、本発明の本側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチド又は非ペプチドモジュレーターの同定法を提供し、該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド又は非ペプチド化合物及び心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量の前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；そして
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較することを含む。
【００７３】
好ましくは、前記フラグメントは配列番号１のペプチド配列の少なくとも５個の連続アミノ酸を含む。
本発明のこれらの側面の最も好適な態様において、前記配列番号１のペプチド又はその相同体もしくは誘導体は、配列番号２〜１０のいずれか一つ以上から選ばれる。
【００７４】
好ましくは、配列番号１又は配列番号１の相同体、類似体もしくは誘導体に匹敵する又はそれより増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチド又は非ペプチド擬似体などを選択する。そのようなペプチド又は非ペプチド化合物は、比較しても遜色のない又は増強されたチャンネルの活性の調節によって検出可能であり、それは(i)との比較により(ii)で検出される（上記）。
【００７５】
例えば、心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する決まった量の配列番号１又は配列番号１の相同体、類似体もしくは誘導体を、調節が起こるのを可能にする条件下で機能性受容体に加える。チャンネルの活性は候補ペプチドの存在下又は不在下で測定し、サンプルのチャンネル活性を比較する。配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体の、心ＲｙＲ２チャンネルの活性に対する影響を調節するペプチド又は非ペプチド化合物が選択できる。
【００７６】
本目的のためには、心ＲｙＲ２チャンネルの活性の調節に基づくアッセイフォーマットであればいかなる従来式アッセイフォーマットでも適当である。好適なアッセイフォーマットでは、試験されるサンプルは、平面の脂質二重層もしくはＳＲ小胞中の再構成されたＲｙＲ２チャンネル又は機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルを有するｄｙｓｐｅｄｉｃ筋細胞である。日常的実験を使用するだけで、当業者は、特定の候補ペプチド又は非ペプチド化合物が心カルシウムチャンネルの活性を調節するかどうかを測定することができる。
【００７７】
本発明は、明らかに、非特異性を多少許容する迅速な高スループットのスクリーニング、及び／又は高い特異性を有する小規模の機能的スクリーニング、及び／又は心ＲｙＲ２チャンネルの化学構造／機能関係を解明する定量的動力学研究、例えば心ＲｙＲ２カルシウムチャンネル機能のアゴニスト又はアンタゴニストであるペプチド又は非ペプチド化合物の決定、又は前記化合物のチャンネルにおけるドッキング部位の解明、を利用するプロセスを意図している。
【００７８】
好ましくは、本発明は、
(i)心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの候補アゴニスト及びアンタゴニストを同定し；
(ii)実際に心ＲｙＲ２チャンネルの活性を活性化又は阻害する(i)の化合物を決定し；
(iii)前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルに対し、(ii)のどの化合物が配列番号１〜１０のいずれか一つよりも高い結合親和性を有しているかを決定し；そして
(iv)場合により、(iii)の化合物と前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネル間の相互作用部位を決定することを含むプロセスを意図している。
【００７９】
心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの候補アゴニスト及びアンタゴニストを同定するための迅速で高スループットのスクリーニングは、好ましくは、心筋のミクロソーム標本中の、又はその代わりにＣＨＯ細胞もしくは他の適切な細胞ベースのアッセイ系に発現させた心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルを用いて実施する。そのような高スループットのスクリーニングは、ミクロソーム標本とインキュベートした、又はＲｙＲ２チャンネルを発現しているトランスフェクト細胞に注入したもしくはそれとインキュベートした多数の化合物のスクリーニングを容易にする。また、高スループットのスクリーニングは、ライブラリーから発現され、ＲｙＲ２チャンネルを発現している細胞にトランスフェクトされた多数のペプチドのスクリーニングも容易にする。
【００８０】
あるいは、又はそれに加えて、候補アゴニスト及びアンタゴニスト分子は、心ＲｙＲ２タンパク質を多数のポリマーピンのような担体に結合させ、その多数のピン上のポリペプチドをスクリーニングされる候補アゴニスト及び／又はアンタゴニスト分子と接触させることによって同定される。スクリーニングされる分子は同位体標識して結合の検出が容易にできるようにしてもよい。あるいは、スクリーニングされる化合物を多数のピンのような固体担体に固定し、それをＲｙＲ２ポリペプチドと反応させてもよい。この場合も結合は、例えば、同位体標識によって、抗体検出によって、又は別のレポーターを使用して測定することができる。
【００８１】
特定の化合物の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルに対する結合親和性は、タンパク質−リガンド相互作用の動力学パラメータの測定に有用な当業者に公知の任意のアッセイによって測定できる。好ましくは、例えば表面プラズモン共鳴法のような結合アッセイが使用される。タンパク質の表面プラズモン共鳴は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アナライザを用いて測定できる。当業者には周知であろうが、この方法は、リガンドの対象のタンパク質への結合に関するオン・オフ率を測定するためのデータを提供する。
【００８２】
多数の候補化合物をスクリーニングするには、化合物を複数のポリマーピン又は基板に固定してもよい。
候補化合物と心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの相互作用部位を決定するには、候補化合物と、天然タンパク質中の一つ以上の部位を削除又は変異アミノ酸配列で置換した種々の変異ＲｙＲ２ポリペプチドとの結合を測定し、前記化合物と野生型又は非変異ＲｙＲ２タンパク質との結合と比較してもよい。ここでも表面プラズモン共鳴法を用いて結合親和性の比較を容易にしてもよい。強力なアゴニスト／アンタゴニスト活性を提供するそれらの相互作用部位に関するデータは、結合親和性が増強されてはいるが、そのような部位に結合する薬物の合理的設計を容易にするのに用いる。
【００８３】
このようなスクリーニング過程を経て検出された化合物は、最終的には例えば心機能不全の治療に使用することができる。
代替の態様において、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト化合物は合理的薬物設計を用いて同定される。すなわち、三次元構造の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルに結合又は会合する化合物を同定する。本発明は、明らかに、三次元構造の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルから誘導され、前記チャンネルに結合し、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を活性化又は阻害するあらゆる合成化合物を想定している。
【００８４】
心ＲｙＲ２チャンネルの開口確率は配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体とのインキュベーションによって調節されるという観察から、インビトロ及びインビボにおける心ＲｙＲ２チャンネルのポア構造及び調節機構の確立又は決定におけるそのような配列の有用性が明らかである。更に詳しくは、一方ではペプチドのＲｙＲ２への結合と高いチャンネル開口確率との間の相関、及びチャンネルポア内の負荷電残基におけるペプチドの非特異的結合と低い開口確率との間の相関を以てすれば、ペプチド結合試験に基づいて開口確率の予測が可能となる。
【００８５】
そこで、本発明の第三の側面は、心ＲｙＲ２チャンネルが開口しているか又は高いチャンネル開口確率を有しているかどうかを決定する方法を提供することであり、該方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、ある量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体に、ＲｙＲ２への結合が起こるに足る時間及び条件下で接触させ、前記ペプチドのＲｙＲ２への結合を測定することを含む。前記ペプチドのＲｙＲ２への結合は高いチャンネル開口確率を示し、ペプチドのチャンネルポアへの非特異的ペプチド結合は低いチャンネル開口確率を示す。
【００８６】
好ましくは、前記フラグメントは、実質的に配列番号１〜１０のいずれか一つ以上に定義のペプチドである。
ペプチドの結合は当業者に公知の任意の方法によって測定できる。例えば、放射能標識もしくは蛍光標識したペプチド、又はレポーター分子で標識したペプチドを用い、任意の特定のペプチド濃度においてチャンネルに結合した標識又はレポーター分子の量を測定する。この目的のために好適なレポーター分子は、ペプチドのチャンネルへの結合能を障害しない小分子、例えば光活性可能な化合物である。
【００８７】
あるいは、ペプチドの結合は、チャンネルを通してカルシウムを放出するチャンネルの活性を測定することにより間接的に測定することもできる。本明細書中に例示の通り、約１ｎＭ〜約１０μＭペプチドの濃度のペプチドは高いチャンネル開口確率を生じるが、それより高濃度のペプチドは、特に脂質二重層中のチャンネルに対して、低いチャンネル開口確率を示す。
【００８８】
本発明の第四の側面は、ヒト又は動物患者における心機能不全の治療法を提供することであり、該方法は、有効量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその誘導体、相同体もしくは類似体を、増強された心収縮が起こるに足る時間及び条件下で投与し、それによって前記心機能不全を補正することを含む。
【００８９】
好ましくは、前記フラグメントは、実質的に配列番号１〜１０のいずれか一つ以上に定義のようなペプチドの少なくとも５個の連続アミノ酸を含む。
“心機能不全”は、例えば、筋フィラメントのＣａ2+感受性が低下した場合、又はカルシウムシグナリングが、例えばカルシウムシナプスの劣化や破壊、ＲｙＲ２の劣化、もしくはＤＨＰＲの劣化などによって劣化した場合のような心筋収縮障害が関与する状態を意味する。本発明の方法による治療に適しているとして本明細書中で意図している心機能不全は、心筋収縮不全、虚血性心疾患、敗血症のような全身性炎症状態、心肥大（カルシウム過負荷）、催不整脈性右室異形成２型（ＡＲＶＤ２）、及び薬物（例えばコカイン）性心筋症のような心筋症、心筋梗塞、律動異常、鬱血性心不全、又は心臓発作などであるが、これらに限定されない。
【００９０】
“有効量”とは、機能不全の進行を減退又は逆転するに足るペプチドの量のことを意味する。
本発明のこの側面の目的にとって有益又は望ましい臨床結果は、検出可能不可能にかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化、疾患進行の遅延又は鈍化、疾患状態の回復又は一時的緩和、及び寛解（部分的でも全体的でも）などであるが、これらに限定されない。“治療”には、治療を受けていない患者の予想生存期間に比べて生存期間を延長することも含まれる。本明細書中で使用している用語“治療”には予防も含まれる。
【００９１】
疾患の“一時的緩和”は、治療によって疾患状態の程度及び／又は望ましくない臨床症状発現が減少している、及び／又は進行の時間経過が鈍化又は延長されていることを意味する。
【００９２】
予防の文脈において、“患者”は、約４０歳以上の一般人口の各個人である；特に、心肥大、心筋症、心臓発作、高血圧、腎不全、血管高血圧、呼吸器疾患、例えば肺気腫又は嚢胞性線維症、慢性喘息、及び肺結核の既往歴又は発症素因を有する個人などであるが、これらに限定されない。適切な患者には臓器移植患者も含まれる。
【００９３】
本発明の第五の側面は、心リアノジンカルシウムチャンネルの活性を調節し、それによってカルシウムシグナリングの欠陥を調節するための、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を含むジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントの使用を提供することである。
【００９４】
好ましくは、前記カルシウムシグナリングの欠陥は、慢性心肥大、拡張型心筋症又は心不全を誘発する。
本発明の第六の側面は、ヒト又は動物患者の心機能不全治療のための医薬製造における、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を含むジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントの使用を提供することである。
【００９５】
本発明は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節することによって慢性の非治療動物又はヒト患者に慢性心肥大又は拡張型心筋症又はさらには心不全をも誘発するカルシウムシグナリングの欠陥を調節するための、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の使用を含む。
【００９６】
好ましくは、該ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体は、収縮力を増強し、さらに収縮期に細胞内カルシウム濃度（すなわち［Ｃａ2+］i）を増加させ、さらに拡張期に［Ｃａ2+］iを減少させることができる用量で投与される。好ましくは、該ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体は、該ペプチドの不在下、標準のインビトロカルシウム増感アッセイで測定した収縮期の［Ｃａ2+］iに比べて収縮期の［Ｃａ2+］iに少なくとも約３％又は５％の増加を誘導する。好ましくは、該ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体は、該ペプチドの不在下、標準のインビトロカルシウム増感アッセイで測定した拡張期の［Ｃａ2+］iに比べて拡張期の［Ｃａ2+］iに少なくとも約３％又は５％の減少を誘導する。更に好ましくは、該ペプチドの不在下、そのような標準のインビトロカルシウム増感アッセイで測定した、それぞれ収縮期の［Ｃａ2+］i又は拡張期の［Ｃａ2+］iに比べて少なくとも約１０％又は１５％、更に好ましくは少なくとも約２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％、収縮期の［Ｃａ2+］iが増加し、又は拡張期の［Ｃａ2+］iが減少する。
【００９７】
なお更に好ましくは、投与されたペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体は、心収縮の効率を改善する。好ましくは、心収縮は、投与後０．５〜１．０時間以内にプレロード・リクルータブル・ストローク・ワーク（ＰＲＳＷ）に少なくとも約５％又は１０％の増加を誘導することによって増強される。更に好ましくは、心収縮は、健常人と比較した心不全患者のＰＲＳＷの増加による測定で、約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％又は７０％増強される。
【００９８】
例えば、該ペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体は、鬱血性心不全又は心原性ショックに罹患した、又は罹患している患者に直ちに投与できる（例えば、腹腔内又は静脈内）。そのような即時投与は、好ましくは、患者が鬱血性心不全又は心原性ショックに罹患した後、約１、２、４、８、１２又は２４時間、又は１日より多く〜約２もしくは３週間の範囲内でＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を増強するために適切な用量のペプチド投与を伴うであろう。
【００９９】
該ペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を比較的長期間、ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を活性化するために適切な用量で投与することも、増大した運動耐性及び機能的能力を提供するために慢性心不全罹患後の患者に有益であろう。例えば、該ペプチドは、心不全罹患後、機能的能力の増強を促進するため、患者に少なくとも２、４、６、８、１２、１６、１８、２０又は２４週間、又はそれより長く、例えば６ヶ月、１年、２年、３年、又はそれ以上定期的に投与することができる。そのような長期投与には経口用製剤が好適であろう。
【０１００】
該ペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、ヒト又は動物患者の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を阻害する用量で投与することも除外されない。この作用も、例えば心組織の一時的弛緩が必要な場合には適当でありうる。
【０１０１】
該ペプチド、相同体、類似体又は誘導体の毒性及び治療的有効性は、例えばＬＤ50（母集団の５０％が致死となる用量）及びＥＤ50（母集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するための細胞培養物又は実験動物における標準製薬手順によって測定することができる。毒性と治療的有効性間の用量比は治療指数と言い、比ＬＤ50／ＥＤ50で表すことができる。高い治療指数を有する配列番号１〜７のいずれか一つに示したアミノ酸配列、又はその相同体、類似体、もしくは誘導体が好適である。
【０１０２】
有毒副作用を示す、又は高いＬＤ50を有するペプチド、相同体、類似体、又は誘導体はあまり望ましくないが、そうしたペプチドでも送達システムと組み合わせて使用してもよい。すなわち、そのような化合物を患部組織の部位を標的として送達することによって健常組織への損傷の可能性を最小限にする送達システムである。
【０１０３】
細胞ベースのアッセイと動物試験から得られたデータを用いれば、主題のペプチドをヒトに使用するための用量範囲を構築することができる。Ｇｒａｎｔらによる心肥大の動物モデル（ＵＳＳＮ ６，２０１，１６５ ２００１年３月１３日発行）は、この目的のために特に有用である。ペプチド、相同体、類似体又は誘導体の用量は、特定の経路による投与後、ＥＤ50に一致する循環濃度を生じ、毒性がほとんどないし全くない濃度範囲内にあるのが好ましい。該用量は剤形及び投与経路によってこの範囲内で変動しうる。また、各個人の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、及び体重などの要因によっても変動しうる。
【０１０４】
本発明の方法に使用するいずれのペプチド、相同体、類似体、又は誘導体も、治療的有効用量は、まず細胞ベースのアッセイ又は動物モデルから推定することができる。例えば、有効用量は、動物モデルで、細胞ベースのアッセイ及び／又は丸ごとの動物から決定したＩＣ50（すなわち症状の最大阻害の半分を達成するペプチド又は非ペプチド化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように構築できる。このような情報を用いれば、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１０５】
ペプチド、又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の適切な用量は、心室の長期間の迅速ペーシングによって動物モデルに心不全を誘発させ、次いで異なる濃度のペプチドを右心房に約３．３ｍＬ／分の速度で注入し、次に圧−容量の関係及びペプチドに対する動脈圧反応を記録することによって決定することもできる。公知のカルシウム増感剤を用いた対照実験、例えばＭａｒｂａｎ著（ＵＳＳＮ ６，１９１，１３６ ２００１年２月２０日発行）に記載の実験も実施できる。心臓の酸素消費量も測定してもよい。
【０１０６】
本発明のさらに別の側面は、ジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントを含む医薬組成物に関する。該ペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を、１種類以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤と共に含む。
【０１０７】
本発明の方法によって検出された物質の心機能不全治療における治療的効果は、当業者によって公知の診断及び治療原理を用いて達成できる。
治療用組成物は、製造及び保存条件下で無菌及び安定でなければならない。該ペプチドは、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適切な他の整えられた構造として製剤化できる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合は所要の粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、又は塩化ナトリウムを組成物に含めるのが好適であろう。
【０１０８】
ペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体を脂質又はリポサッカリド部分に結合させることによって吸収性の向上が達成できる。
注射用組成物の吸収を延長するには、例えばモノステアリン酸塩又はゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を組成物に含めればよい。さらに、化合物を時間放出製剤にして、例えば、好ましくは疎水性及び／又は両親媒性化合物を含む徐放性又は制御放出ポリマーを含む組成物にして投与することもできる。ペプチドを、化合物を迅速放出から保護するような担体と共に、インプラント及びミクロ被包化送達システムを含む制御放出製剤として製造することもできる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、ポリ乳酸及びポリ乳酸ポリグリコール酸のコポリマー類（ＰＬＧ）のような生分解性、生体適合性ポリマーが使用できる。そのような製剤の製造法は当業者には一般的に知られている。
【０１０９】
例えば、適切な制御放出送達用アンプルは、ペプチド、相同体、類似体又は誘導体を、溶融段階（melt stage）にある生腐食性、生分解性ポリ（ε−カプロラクトン）ポリマーマトリクスに分散させることによって製造できる。ただし、ペプチド又はタンパク質薬は、ポリ（ε−カプロラクトン）ポリマーの融点より高いガラス転移温度を有するガラス状マトリックス相、例えばＷａｎｇらが記載しているように（ＵＳＳＮ ６，１８７，３３０）、ペプチドと適切な熱保護剤（例えば、トレハロース、メレチトース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メリビオース、又はラフィノース）の水溶液を凍結乾燥して製造したガラス状マトリックス相、の中に分散している。
【０１１０】
注射用無菌溶液は、ペプチド、相同体、類似体又は誘導体を、必要に応じて前述の成分の１種類又は組合せと共に適当な溶媒に所要量配合し、次いでろ過滅菌することによって製造できる。一般的に、分散液は、活性ペプチド又は非ペプチド化合物を、塩基性分散媒体及び前述のその他の所要成分を含有する無菌ビヒクルに配合することによって製造する。注射用無菌溶液製造用の無菌粉末の場合、好適な製造法は真空乾燥及び凍結乾燥で、この方法により、活性成分と予めろ過滅菌したその溶液由来の何らかの追加の所望成分とを含む粉末が得られる。
【０１１１】
好ましくは、本発明のペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体は、特に慢性状態の治療用製剤においては、投与後の半減期を延長するように製剤化する。活性ペプチド化合物の半減期を延長する方法は、そのタンパク分解を削減するための直接的改変を含む。例えば架橋又はアミノ酸置換によって公知プロテアーゼのための部位を除去する。あるいは、任意の活性成分の半減期は、それを適切な製剤、例えば徐放製剤に被包化することによって延長できる。投与経路により、該ペプチド、相同体、類似体又は誘導体は、その不活化につながりかねない酵素類、酸類及び他の自然条件の作用から保護するための材料で被覆することができる。
【０１１２】
例えば、該ペプチド、相同体、類似体又は誘導体は、患者に、酵素阻害薬と共投与される適当な担体又は希釈剤に入れて、又はリポソームのような適当な担体に入れて投与できる。製薬上許容しうる希釈剤は、食塩水及び水性緩衝液を含む。酵素阻害薬は、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）及びトラジロールなどである。リポソーム類は、水中油中水型乳剤、並びに従来型リポソーム類である。
【０１１３】
分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール類、及びそれらの混合物中、並びに油中にも製造できる。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防止するために保存剤を含むことができる。
【０１１４】
本発明を以下の非制限的実施例を参照しながら説明する。
【実施例】
【０１１５】
実施例１
心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節する２０量体ペプチド
材料及び方法
材料
化学薬品及び生化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、キャッスルヒル）社から調達した。ＤＨＰＲ II-IIIループペプチド（配列番号１〜７）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａ ペプチド合成機を用いて合成し、ＨＰＬＣ及び質量分析及びＮＭＲを用いて純度≧９８％であることを確認した。ペプチドは、Ｈ2Ｏ中〜２ｍＭのストック溶液に調製し、２０μｌずつ凍結した。正確なストック溶液の濃度は、Ａｕｓｐｅｐ Ｐｔｙ Ｌｔｄにより酸加水分解とその後の標準化ＰＴＣ（フェニルチオカルバミル）プロトコルを用いて測定し、逆相ＨＰＬＣで分析した。
ペプチド
研究に使用した特定のペプチドは以下の通りである。
１．ＤＨＰＲのII-III細胞質ループの２０量体ペプチド（配列番号２）
【０１１６】
【化６】
２．ペプチドＮＢ（II-IIIループのＢセグメントのＮ末端部分；Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＩａｎｕｚｚｏ，１９９１；配列番号１１）
【０１１７】
【化７】
【０１１８】
３．ペプチドＡ１Ｓ（スクランブル化２０量体ペプチド；配列番号１２）
【０１１９】
【化８】
【０１２０】
ＳＲ小胞の調製
ＳＲ小胞は、Ｌａｖｅｒら（１９９５，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４７：７−２２）の記述のように、ヒツジの心臓から単離した。
脂質二重層
実験は、本質的にＡｈｅｒｎら（１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５２：３６９−３７４）及びＬａｖｅｒら（１９９５，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４７：７−２２）に従い、２０℃〜２５℃で実施した。二重層は、１．０ｍｌのＤｅｌｒｉｎカップ（Ｃａｄｉｌｌａｃ Ｐｌａｓｔｉｃｓ、オーストラリア）壁の直径〜１００μｍのアパーチャに渡したホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリン（５：３：２ｗ／ｗ／ｗ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）から形成した。終末槽（ＴＣ）小胞（最終濃度、１０μｇ／ｍｌ）及び薬物を細胞質（すなわちシス）チェンバに加えた。二重層の電位を制御し、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて単一チャンネルの活性を記録した。実験の目的のために、シスチェンバは接地し、管腔（すなわちトランス）チェンバの電圧を制御した。二重層の電位は従来式にＶcis−Ｖtrans（すなわちＶcytoplasm−Ｖlumen）で表される。
二重層の溶液
二重層を前述のように形成し、２３０ｍＭのＣｓメタンスルホネート（ＭＳ）、２０ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2及び１０ｍＭのＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ、ＣｓＯＨでｐＨ７．４）を含有するシス溶液、及び３０ｍＭのＣｓＭＳ、２０ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2及び１０ｍＭのＴＥＳ（ｐＨ７．４）を含有するトランス溶液を用いて、小胞を二重層中に組み込んだ。
【０１２１】
二重層への複数のチャンネルの組込みを防止するために、チャンネルの活性を観察するときはシスチェンバの灌流によりシス溶液を交換した。シス灌流溶液は、［Ｃａ2+］が３×１０-7Ｍで、１ｍＭのＢＡＰＴＡを用いて緩衝した以外は初期のシス溶液と同一であった。ＣｓＭＳ（２００ｍＭ）をチャンネルの組込み後トランスチェンバに加え、対称溶液を作製した。
単一チャンネルの活性の記録とデータ分析
二重層の電位は、シスチェンバへのペプチドの各添加後、２分間にわたって３０秒ごとに変化させた。対照活性は、２００ｍＭのＣｓＭＳをトランスチェンバに添加後２分間記録した。次に活性を、各ペプチド分液（各チャンネルで６種類の異なるペプチド濃度を試験した）のシスへの添加後２分間記録した。ペプチドをシスチェンバから灌流によって取り出し、回収率を記録した。チャンネルは最後に３０μＭのルテニウムレッドに暴露した。
【０１２２】
電流は１ｋＨｚでフィルタにかけ（８極ローパス・ベッセル型フィルタ，−３ｄＢ）、５ｋＨｚでデジタル化した。単一チャンネルの記録の分析（ＰＷ Ｇａｇｅ及びＭ Ｓｍｉｔｈ開発のチャンネル２使用）から、チャンネルの開口確率（Ｐo）、事象頻度（Ｆo）、開口時間、閉鎖時間、及び平均の開口及び閉鎖時間（Ｔo又はＴc）並びに平均電流（Ｉ’）が得られた。事象弁別器は、通常の５０％でなく、最大電流の〜２０％のベースラインノイズ上に設定したので、分析にはサブコンダクタンス及び最大コンダクタンスレベルの両方に対する開口が含まれた。チャンネルの活性は、＋４０ｍＶにおける２回の３０秒間の連続活性と−４０ｍＶにおける２回の３０秒間の連続活性について分析した。
統計分析
平均データは、平均±ＳＥＭで示す。対照値と試験値間の差の有意性は、必要に応じて独立データ又は対応データについて、片側又は両側スチューデントＴ検定を用いて検定した。差は、Ｐ≦０．０５のとき有意であるとみなした。
実施例２
心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節する２０量体ペプチド
結果
２０量体ペプチド（配列番号２）をチャンネルの細胞質（シス）側（１０-7ＭのシスＣａ2+濃度）に加えると、心筋のＲｙＲの活性に増加がみられた。二重層電位が＋４０ｍＶ又は−４０ｍＶでＣｓ+コンダクタンスが〜４５０ｐＳであること、及び実験終了時における３０μＭルテニウムレッドのチャンネル遮断能力により、単一チャンネルはＲｙＲと確認された。
【０１２３】
心ＲｙＲが２０量体ペプチド（配列番号２）によって強く活性化された一つの実験の記録を、−４０ｍＶの場合を図２に、＋４０ｍＶの場合を図３に示す。ペプチドを加える前のチャンネルの活性は、短い断続的な開口から成っていた（図２、パネルＡ；図３、パネルＡ）。６５ｎＭペプチド（配列番号２）の添加１０秒以内に−４０ｍＶではチャンネル開口が増加した。
【０１２４】
事象頻度の増加、及び非常に長時間の開口の出現は、二重層中の第二のチャンネルの開口に伴うものであった（図２、パネルＢ）。ペプチド濃度が６．５μＭ配列番号２に増加すると、−４０ｍＶでのＲｙＲ２チャンネルの活性はわずかに低下したが、第二のチャンネルの活性はより顕著になった。図２のパネルＣに示されているように、チャンネルは特に６５ｎＭペプチドで高い開口確率（Ｐｏ）を示す（チャンネルが完全開口した場合に期待される主電流レベル、Ｏ）。
【０１２５】
記録は、単一チャンネルの活性の増大は単一チャンネルのコンダクタンスの何らかの変化に関連するものではなかったことを示している。
チャンネルの活性は、二重層の電位が＋４０ｍＶの場合でも、６５ｎＭの２０量体ペプチド（配列番号２）で増加した（図３、パネルＢ）。しかしながら、チャンネルの活性の増大は同じチャンネルで−４０ｍＶで観察されたものより小さかった（図２、パネルＢ）。
【０１２６】
−４０ｍＶの二重層電位におけるチャンネルの活性はペプチド濃度が高くなると増大するが、＋４０ｍＶにおけるチャンネル開口は約１００ｎＭペプチドを超える濃度になると減少し始め、１０μＭペプチドでは低いコンダクタンスレベルのためにほんのわずかな短いチャンネル開口しか観察されなかった（図３、パネルＣ）。本発明をいずれか一つの理論又は作用様式に制限するつもりはないが、チャンネル開口が主に準最大コンダクタンスによる＋４０ｍＶでの活性の低下は、ペプチド（配列番号２）がチャンネルの活性化時に結合する部位とは明らかに異なる低親和性の部位に結合するためと思われる。これらの低親和性部位はおそらくチャンネルポア内にあるのであろう。
【０１２７】
脂質二重層中の心ＲｙＲ２チャンネルの同様の活性化及び阻害は、８個の二重層サンプル中８個で得られた。単一チャンネルの分析は、ほとんどの二重層が１よりも多いチャンネルを含有していたため実施しなかった。すべてのサンプルが、シスチェンバへのペプチド（配列番号２）添加後、＋４０ｍＶ及び−４０ｍＶで高い開口頻度を有していた。さらに、１０-7ＭのシスＣａ2+で、ペプチドの不在下で検出されたものと比べて、ペプチドの存在下−４０ｍＶの電位では延長されたチャンネル開口が生じた。
【０１２８】
平均電流（すなわち、各電位及び各ペプチド濃度における２回の３０秒間の記録中の全データポイントの平均をレコーディング中に見られたチャンネル数で割ったもの）からチャンネル活性の基準が得られた。図４に、正規化平均電流の平均をペプチド濃度の関数として示す。整数Ｉ’ｐ／Ｉ’ｃは、ペプチド存在下の平均電流の、チェンバへのペプチド添加前の平均電流に対する比である。二重層電位−４０ｍＶ又は＋４０ｍＶで、平均電流に顕著な増加（〜２倍）が１０ｎＭペプチド（配列番号２）に検出された。−４０ｍＶにおける平均電流は５０μＭペプチド（配列番号２）でさらに４倍にまで増加した。これに対し、＋４０ｍＶにおける正規化平均電流は１０ｎＭペプチド（配列番号２）で２倍になり、約１０μＭのペプチドまで上昇したままであったが、さらに高いペプチド濃度（すなわち約１０μＭ〜５０μＭの間）で劇的に降下した。
【０１２９】
２０量体ペプチド（配列番号２）による心ＲｙＲ２チャンネルの活性化の特異性についても試験した。１μＭシスペプチドＮＢ（配列番号８）又は１０μＭシスペプチドＮＢでは、＋４０ｍＶ又は−４０ｍＶの二重層電位でチャンネルの活性の調節は観察されなかった（ｎ＝３；図４）。試験の２０量体ペプチドと同じ等電点を持つが非相同配列であるスクランブル化配列（すなわちペプチドＡ１Ｓ；配列番号９）は高濃度（すなわち１μＭシスペプチド又は１０μＭシスペプチド）で存在すると、他の２個の二重層中２個で心ＲｙＲ２チャンネルの活性を低下させた（図４）。
【０１３０】
データは、２０量体ペプチド（配列番号２）による活性化は心ＲｙＲ２チャンネルへの結合を反映していることを強く裏付けている。
本発明を決して制限するつもりはないが、高濃度の２０量体ペプチド（配列番号２）およびペプチドＡ１Ｓの＋４０ｍＶでの心ＲｙＲ活性を阻害する能力は、予期していたことではあるが、心筋及び骨格筋のＲｙＲとも、ポア又はその入口にペプチドの正荷電残基と相互作用できる相当数の負部位を含有することを示唆している。ペプチドＡ１Ｓでは活性化なしに阻害が持続するという事実は、活性化と阻害は２０量体ペプチド（配列番号２）のＲｙＲ２チャンネル上の２つの別の部位への結合によって決まるということの更なる証拠となる。
実施例３
ＤＨＰＲ２０量体フラグメントの誘導体及び類似体の機能分析
材料及び方法
ペプチド
このシリーズの実験では４種類のペプチドを試験した。すなわち：
(i)天然のＤＨＰＲ２０量体ペプチド（配列番号２）；
(ii)配列番号２のペプチドのＳｅｒ687（残基１７）がアラニン残基に置換されてできた配列番号８；
(iii)配列番号２のペプチドのＡｒｇ688（残基１８）がＤ異性体に置換されてできた配列番号９；及び
(iv)配列番号２のペプチドのＳｅｒ687がアラニンに変異し、Ａｒｇ688がＤ異性体に置換されてできた配列番号１０である。
心ＳＲからのＣａ 2+ 放出の測定
心ＳＲ小胞（５０μｇのタンパク質）を、キュベットに、１００，ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ＝７）；４，ＭｇＣｌ2；１，Ｎａ2ＡＴＰ；０．５，アンチピリルアゾ(antipyrylazo)III（以上単位ｍＭ）を含有する最終体積２ｍｌの溶液に加えた。小胞外［Ｃａ2+］をＣａｒｙ５０又はＣａｒｙ１００分光光度計のいずれかを用いて７１０ｎｍでモニタした。７９０ｎｍにおける同一の実験ではＯＤに何の変化もなく、７１０ｎｍで測定されるＣａ2+放出速度を変えるであろう［Ｃａ2+］の変化に無関係であった。小胞に、５ｍＭＣａＣｌ2の３μｌアリコートを４回加えることによってＣａ2+を装填し、最終濃度７．５μＭのＣａ2+とした。次に、タプシガーギン(thapsigargin)（２００ｎＭ）を加えてＳＲのＣａ2+ＡＴＰアーゼを遮断した。最後に、ペプチドを単独で、又は２０μＭのＣａ2+もしくは２ｍＭのカフェインと共に加えた。タプシガーギン存在下でのＣａ2+放出速度は活性化剤添加直前に測定し、初期のＣａ2+放出速度は活性化剤添加直後に測定した。次に、ＲｙＲ活性の特異的ブロッカーである５μＭのルテニウムレッドを加え、Ｃａ2+放出がＲｙＲチャンネルを通じてであることを確認した。Ｃａ2+イオノホアＡ２３１８７（３μｇ／ｍｌ）を実験終了時に加え、ＳＲ小胞に残っているＣａ2+の量を測定した。Ｃａ2+放出完了時に、イオノホア添加後のＣａ2+の変化(transient)は、ＲｙＲチャンネルを通じて放出できなかったＣａ2+を含有する小胞のフラクションを示すものであった（おそらくＲｙＲチャンネルを欠く縦ＳＲ由来の小胞であろう）。結果は、わずか１０〜２０％の心ＳＲ標本しかＲｙＲ調節ストアを含有していなかったことを示した。３個の異なるヒツジ心標本から単離した小胞について実験を繰り返した。
単一チャンネル実験
シス溶液中のＣａ2+濃度は１００ｎＭに緩衝されるか、又はＢＡＰＴＡの不在下でシス溶液にＣａＣｌ2を加えることによって１００μＭに調整した。
実施例４
ＤＨＰＲ２０量体ペプチドフラグメントの誘導体及び類似体の機能分析
結果
まとめ
実施例４の実験は、心ＳＲ小胞からのＣａ2+放出に関する全化合物の試験を含む。加えて、単一の心ＲｙＲチャンネルを配列番号９のペプチドに暴露した。すべてのペプチドは、Ｃａ2+活性化Ｃａ2+放出又はカフェイン活性化Ｃａ2+放出速度を著しく増強した。配列番号９及び１０のペプチドは、＞３０μＭの高濃度で活性化するＣａ2+又はカフェインの不在下、Ｃａ2+の放出速度を辛うじて増強し、またＣａ2+活性化Ｃａ2+放出及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出の両方も増強した。配列番号９のペプチドは、脂質二重層中の実験で心ＲｙＲの活性を低濃度では（１〜１０ｎＭ）増大させたが、高濃度では＋４０ｍＶでチャンネルポアを電位依存的及びＣａ2+依存的に遮断した。従って、適当な生理的条件下では、ジヒドロピリジン受容体フラグメントペプチドは、心Ｃａ2+放出チャンネルに結合し、心ＳＲからのＣａ2+放出を活性化することができる。
心ＳＲからのＣａ 2+ 放出に及ぼすＡペプチドの影響
配列番号２、８、９及び１０で定義されるペプチドの、追加の活性化因子不在下における心ＳＲからのＣａ2+放出能を測定した。ペプチドを小胞外溶液に加え、ペプチド添加直後に初期のＣａ2+放出速度を測定した。４種類のペプチドの平均データを図５に示す（小記号）。３０μＭ及び５０μＭの濃度ですべてのペプチドに放出速度のわずかな増加がみられた。
【０１３１】
ペプチドがＣａ2+活性化Ｃａ2+放出及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出に及ぼす影響を調べた。Ｃａ2+活性化は、心収縮時のインビボにおけるＲｙＲ活性化の主要機序である。Ｃａ2+活性化機序は、ＳＲ小胞からのＣａ2+活性化及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出の両方に関与している。なぜならば、カフェインの主作用はＣａ2+活性化曲線をずっと低いＣａ2+濃度にシフトさせることだからである。１００ｎＭまで（〜１００ｎＭ）の静止Ｃａ2+濃度は、カフェインの存在下でＣａ2+放出を活性化する。２０μＭＣａ2+及び２ｍＭカフェインに誘発される初期Ｃａ2+放出速度は類似しており、これらの実験では１分間当たり１ｍｇのＳＲタンパク質につき〜１０μモルのＣａ2+であった。ペプチドがＣａ2+誘発Ｃａ2+放出及びカフェイン誘発Ｃａ2+放出に及ぼす影響も類似しており、二つの活性化法で得られたデータは図５に示した平均データの中にまとめてある。明らかに、４種類の各ペプチドは、小胞外溶液に加えた場合、心ＳＲ小胞からのＣａ2+／カフェイン活性化Ｃａ2+放出を増加させることができた。すべての実験で、Ｃａ2+の放出はルテニウムレッドの添加で終了し、放出がＲｙＲチャンネルを通してであることを示した。４種類の各ペプチドの最大Ｃａ2+放出速度は対照より２〜２．５倍大きく、２０〜３０μＭペプチドで達成された。４種類のペプチドは、Ｃａ2+放出速度が高ペプチド濃度で低下傾向にあるという点で、二相性の作用があるようであった。
【０１３２】
ペプチドはいずれも、心ＳＲからのＣａ2+放出において、またＣａ2+／カフェイン活性化Ｃａ2+放出の増強において、類似した潜在能力を示した。非Ｃａ2+／カフェイン活性化チャンネルからの放出は小さすぎてペプチド間の差を捉えられないということはあり得る。本発明を決して制限するつもりはないが、ペプチドがＣａ2+／カフェイン活性化Ｃａ2+放出に及ぼす影響間のこの類似性は、ＲｙＲチャンネルは活性化剤だけでほぼ最大限に開口するため、ペプチドによってさらに活性化される許容能力は限られているという事実を反映したものであろう。
単一の心ＲｙＲチャンネルの活性に及ぼすペプチド配列番号９の影響
脂質二重層中の単一の心ＲｙＲチャンネルの活性に及ぼす配列番号９の作用を調べた。ペプチドをまず、１００μＭのシスＣａ2+を有する心ＲｙＲチャンネルの細胞質（シス）側に加えた。該ペプチドはチャンネルを活性化できなかった（図６）。
【０１３３】
ペプチド配列番号９を二重層溶液に加えたときに誘発された心ＲｙＲチャンネルの活性の低下は、−４０ｍＶより＋４０ｍＶで大きく、ペプチド配列番号２による骨格筋ＲｙＲチャンネルの電位依存性（すなわち電流方向依存性）遮断と類似していた。活性の低下は、正荷電の配列番号９のペプチドがイオンチャンネルに入り、ポア内の負電荷と会合するのと合致する。遮断は、電流がシスからトランスへ流れてペプチドをポア内に運ぶと増強されるが、電流がトランスからシスへ流れてペプチドをポアから運び出す傾向にあると部分的に逆転する。
【０１３４】
２ｍＭのＢＡＰＴＡで緩衝した、濃度１００ｎＭのペプチドのシスＣａ2+を使用した。ペプチド配列番号９による心チャンネルの強い活性化によって、正及び負電位の両方で相対平均電流に１０〜２０倍の増加が起こった（図７）。わずか１０ｎＭのペプチドでも活性に顕著な増加があり、１００ｎＭのペプチドで最大の活性化が観察された。＋４０ｍＶでの高いペプチド濃度（１及び１０μＭ）における相対平均電流の降下は、ペプチドの残余遮断作用を示していた。
【０１３５】
このペプチドが、心ＲｙＲの平均単一チャンネルパラメータに及ぼす影響を測定し、平均データを図８に示す。該ペプチドは、−４０ｍＶで〜５０倍の開口確率の増加を、＋４０ｍＶで〜１０倍の増加を引き起こした。この活性の増加は、両方の電位で平均開口時間が８倍に増加したこと、＋４０ｍＶ及び−４０ｍＶで平均閉鎖時間がそれぞれ８０分の１又は１７０分の１に減少したこと、そして対応する事象頻度が増加したことによるものであった。このように、チャンネル開閉に及ぼす該ペプチドの主作用は平均閉鎖時間に対してである。
【０１３６】
従って、ＤＨＰＲ II-IIIループの配列番号２のペプチドは、心ＲｙＲチャンネルと心ＳＲ小胞からのＣａ2+放出を活性化できる。天然ペプチドがＣａ2+を放出するだけでなく、増強されたらせん構造を持ち、好ましくはＲＫＲＲＫ配列を含有するいくつかの他のペプチドもＣａ2+放出に対して同じ作用を示す。
【０１３７】
当業者であれば、本明細書中に記載の本発明は、具体的に記載したもの以外の変形及び修正が可能であることは理解されよう。そのようなすべての変形及び修正も本発明に含まれることは理解されるはずである。本発明はまた、本明細書中に個々に又はまとめて引用した又は提示したすべてのステップ、特徴、組成物及び化合物、並びに、前記ステップ又は特徴の任意の組合せ及びすべての組合せまたはいずれか二つ以上、を含む。
【０１３８】
本発明は、本明細書中に記載した具体的な態様によって発明の範囲を制限されない。記載した具体的な態様は説明を目的としたものである。機能的に等価の生成物、組成物及び方法は、本明細書に記載の通り、明らかに本発明の範囲に含まれる。
【０１３９】
【表２−１】
【０１４０】
【表２−２】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、いくつかの心筋及び骨格筋ＤＨＰＲポリペプチドの細胞質ループの位置合わせしたアミノ酸配列を示した略図である。すなわち、ヒト骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号２；Ｄｒｏｕｅｔら、１９９３）；マウス骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号３；Ｃｈａｕｄｈａｒｉ、１９９２）；ウサギ骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号４；Ｔａｎａｂｅら、１９８７）；ウサギ心筋ＤＨＰＲ−１（配列番号５）；ラット心筋ＤＨＰＲ−１（配列番号６）；及びウシガエル骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号７；Ｚｈｏｕら、１９９８）である。利用可能な配列の比較に基づき、コンセンサス配列（配列番号１）を太字で示す。ＮＢ（配列番号８）及びＡ１Ｓ（配列番号９）で示した非特異的ペプチドのアミノ酸配列も示す。
【図２】図２は、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２の細胞質（シス）側に加えた骨格筋ＤＨＰＲ細胞質ループの２０量体ペプチド（配列番号２）が、−４０ｍＶで測定した場合、シス１０-7ＭのＣａ2+の存在下で心ＲｙＲ２の活性を増大させることを示すグラフ図である。単一チャンネルの活性は、−４０ｍＶで、添加ペプチドの不在下（パネルＡ）又は６５ｎＭペプチド（パネルＢ）もしくは６．５μＭペプチド（パネルＣ）の存在下のいずれかで測定した。
【０１４２】
左側の各パネルで、下方のチャンネル開口は−４０ｍＶで示され、ゼロ電流（閉鎖）レベルは点線“Ｃ”で示され、最大の単一チャンネルコンダクタンスは実線“Ｏ”で示されている。二つのチャンネルはペプチドの添加後、−４０ｍＶで二重層中で活性である。
【０１４３】
右側の各パネルは、３０秒間の記録時間中の全ポイントを示すグラフ図である。ｘ軸上の数字はチャンネル開口の振幅を示し、横座標は各振幅における全開口の割合を示す。負数は−４０ｍＶにおける負（内側）チャンネル電流を示す。
【図３】図３は、細胞質（シス）溶液に加えた骨格筋ＤＨＰＲ細胞質ループの２０量体ペプチド（配列番号２）が、＋４０ｍＶで、シス１０-7ＭのＣａ2+の存在下で心ＲｙＲ２の活性を増大させ、次いで低下させることを示すグラフ図である。単一チャンネルの活性は、＋４０ｍＶで、添加ペプチドの不在下（パネルＡ）又は６５ｎＭペプチド（パネルＢ）もしくは３２．５μＭペプチド（パネルＣ）の存在下のいずれかで測定した。
【０１４４】
左側の各パネルで、上方のチャンネル開口は＋４０ｍＶで示され、ゼロ電流（閉鎖）レベルは点線“Ｃ”で示され、最大の単一チャンネルコンダクタンスは実線“Ｏ”で示されている。チャンネルは６５ｎＭの濃度ではほとんど開口の形態である。これに対し、チャンネルはペプチドの不在下、又は３２．５μＭペプチドではほとんど閉鎖の形態である。
【０１４５】
右側の各パネルは、３０秒間の記録時間中の全ポイントを示すグラフ図である。ｘ軸上の数字はチャンネル開口の振幅を示し、横座標は各振幅における全開口の割合を示す。数字は＋４０ｍＶにおけるチャンネル開口を示す。
【図４】図４は、平均正規化平均電流（横座標）を、−４０ｍＶ（パネルＡ）及び＋４０ｍＶ（パネルＢ）における細胞質溶液中のペプチド濃度（すなわちｌｏｇ10［ペプチド（ｎＭ）］）の関数（ｘ軸）として示すグラフ図である。正規化平均電流（Ｉ’ｐ／Ｉ’ｃ）は、ペプチド存在下の平均電流（すなわちＩ’ｐ）の、ペプチド不在の対照条件下の平均電流（すなわちＩ’ｃ）に対する比である。データは、平均の平均電流±ＳＥＭを示す。サンプルは、配列番号２に示した骨格筋ＤＨＰＲ細胞質ループの２０量体ペプチド（ｎ＝８、●）、又は配列番号８に示した非特異的ペプチドＮＢ（ｎ＝２、▲）、又は配列番号９に示した非特異的ペプチドＡ１Ｓ（ｎ＝３、■）のいずれかを含有する。１．０を超える正規化平均電流は、ペプチドによる心ＲｙＲ２チャンネルの活性化を示す。従って、データは、＋４０ｍＶの場合１０μＭまでのペプチド（配列番号２）によって、又は−４０ｍＶの場合さらに高い濃度によって、心ＲｙＲ２チャンネルが著しく活性化されたことを示す。
【図５】図５は、主題のペプチドが心ＳＲ小胞からのＣａ2+及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出を増加させることを示すグラフ図である。初期のＣａ2+放出速度は、対照条件下、又は横座標に示した濃度の小胞外溶液に、２０μＭのＣａ2+又は２ｍＭのカフェインのいずれかを添加後（ゼロのペプチド濃度で）、及びペプチドのみの添加後（小記号）、又は２０μＭのＣａ2+又は２ｍＭのカフェインとペプチドの添加後（大記号）のものである。Ｃａ2+放出速度は、１分当たり、ＳＲ小胞のタンパク質のｍｇ当たり、Ｃａ2+のμモルで与えられる。データは、配列番号２（黒丸）、配列番号８（黒四角）、配列番号９（白丸）及び配列番号１０（白四角）について示す。結果は、各濃度について少なくとも５回観察した平均±ＳＥＭで与えられている。
【図６】図６は、シス（細胞質）Ｃａ2+濃度１００μＭで、脂質二重層に組み込まれたＲｙＲチャンネルを通って流れる平均電流に及ぼす配列番号９の影響を示すグラフ図である。データは、二重層電位−４０ｍＶ（上のグラフ）及び＋４０ｍＶ（下のグラフ）における６０秒間の記録から得た。データポイントは、６個の実験の平均相対平均電流（ペプチド存在下の平均電流を対照条件下の平均電流で割ったもの）を示し、縦線は±１ｓｅｍを示す。チャンネルの活性は明らかにペプチドによって濃度依存的に抑制され、１００ｎＭのペプチドで最大の影響が見られる。１００ｎＭペプチドでの抑制は−４０ｍＶより＋４０ｍＶ（アスタリスク）で著しく大きかった。
【図７】図７は、シス（細胞質）Ｃａ2+濃度１００ｎＭで、脂質二重層に組み込まれたＲｙＲチャンネルを通って流れる平均電流に及ぼす配列番号９の影響を示すグラフ図である。データは、二重層電位−４０ｍＶ（上のグラフ）及び＋４０ｍＶ（下のグラフ）における６０秒間の記録から得た。データポイントは、７個の実験の平均相対平均電流（ペプチド存在下の平均電流を対照条件下の平均電流で割ったもの）を示し、縦線は±１ｓｅｍを示す。チャンネルの活性は明らかにペプチドによって濃度依存的に増強され、１００ｎＭのペプチドで最大の影響が見られる。＞１００ｎＭペプチドでの抑制が＋４０ｍＶでみられ、何らかのポア遮断を示している。
【図８】図８は、配列番号９が単一チャンネルのパラメータに及ぼす影響をペプチド濃度の関数として示したグラフ図である。データは−４０ｍＶ（左パネル）及び＋４０ｍＶ（右パネル）で示されている。最上部のグラフはチャンネルの開口確率を示し、二番目のグラフは平均開口時間を、その次は平均閉鎖時間を、最後はチャンネルの開口頻度を示している。データポイントは、７個の実験の平均パラメータ値を示し、縦線は±１ｓｅｍを示す。チャンネルの閉鎖時間の減少、及びその結果としての頻度の増加が開口確率の増加に最も強く寄与している。
【０００１】
技術分野
本発明は、一般的には心細胞におけるカルシウムチャンネルの活性を調節できる新規ペプチドに関する。更に詳しくは、本発明は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）を、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、前記カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む心カルシウムチャンネルの活性の調節法を提供する。本発明の方法は、心機能不全に関連する各種の障害及び疾患、特に心拍出量の減少及び／又は心細胞における興奮収縮連関の異常、カルシウム過負荷、又はカルシウム漏れが関与する疾患及び障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
本明細書中に引用した出版物の詳細な書誌的事項は説明の最後にまとめてある。本明細書中では、いずれか一つ以上の先行技術文献を含め、先行技術を参照しているが、そのことを前記先行技術がオーストラリアにおける一般常識である又はオーストラリアにおける一般常識の一部を形成するということの承認又は示唆と受け取るべきでない。
【０００３】
興奮収縮連関は、電気的興奮を機械的活動に連結する心筋及び骨格筋のような横紋筋の機能に不可欠である。興奮収縮連関の重要な要素は、ジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）、横行小管（ＴＴ）の電位依存性Ｃａ2+チャンネル、及び筋小胞体（ＳＲ）から細胞質へのカルシウム放出のために開口する筋小胞体（ＳＲ）膜のＣａ2+放出チャンネル又はリアノジン受容体（ＲｙＲ）である。
【０００４】
ＲｙＲ及びＤＨＰＲとも、異なるアイソフォームが心筋及び骨格筋細胞に存在する。特に、ＲｙＲ１とＤＨＰＲ−アイソフォーム３は骨格筋で、ＲｙＲ２とＤＨＰＲ−アイソフォーム１は心細胞で優位を占めている。ＲｙＲ１とＲｙＲ２のアミノ酸配列の間には約７０％の同一性しかない。
【０００５】
骨格筋では、リアノジン受容体（ＲｙＲ１）は、ＤＨＰＲα−１サブユニットの反復IIとIIIの間の１３８のアミノ酸細胞質ループとのタンパク質−タンパク質相互作用によって活性化される（Ｔａｎａｂｅら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：５６７−５６８）。骨格筋のＲｙＲ１媒介性カルシウム放出を活性化するに足る骨格筋のＤＨＰＲ細胞質ループの領域は、Ｔｈｒ671からＬｅｕ690の２０アミノ酸の範囲の残基にあることが確定されている（Ｅｌ Ｈａｙｅｋら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２１１６−２２１１８；Ｄｕｌｈｕｎｔｙら、１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７７：１８９−２０３；及びＧｕｒｒｏｌａら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７８７９−７８８６）。四つ組構造のＤＨＰＲ中には４個のＤＨＰＲ分子があり、厳密な幾何学的配列で骨格筋中のＲｙＲ１ポリペプチド２つごとに向かい合っている。その厳密な幾何学的配列は、正常の興奮収縮連関に重要と考えられている。電気的刺激などによるＤＨＰＲの興奮時、このタンパク質−タンパク質相互作用は、おそらくＲｙＲ１ポリペプチドにコンホメーションのシフトを引き起こす。これがチャンネルの開口をもたらし、それによってＳＲからのカルシウム放出が起こる。従って、骨格筋における興奮収縮連関は本質的にはカルシウム非依存性プロセスである。
【０００６】
これに対し、心筋における興奮収縮連関はカルシウム誘発性カルシウム放出（ＣＩＣＲ）機序が関与する（Ｎｉｇｇｌｉ，１９９９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６１：３１１−３３５）。興奮後の心ＤＨＰＲカルシウムチャンネルの開口により、少量の細胞外カルシウムが、各活動電位時に活性化される電位依存性Ｌ型カルシウムチャンネル（すなわち心ＤＨＰＲ）を通じて心筋細胞に流入する。この初期シグナルは、続いて起こるＳＲ中の細胞内カルシウム貯蔵部位からのＣＩＣＲの引き金となる。ＳＲからの二次的カルシウム放出は、心ＲｙＲ２カルシウム放出チャンネルを通じて起こる。ほとんどの哺乳動物では、ＣＩＣＲは初期シグナルの引き金を数倍に増幅するが、これは心ＲｙＲ２分子と心ＤＨＰＲの化学量論が約１６：１であるのと一致する。
【０００７】
心ＣＩＣＲは、ＳＲからのカルシウム放出を引き起こすのに細胞質ゾルのＣａ2+の初期上昇を必要とするにもかかわらず、自動継続するようにはならないようである。これは、ＣＩＣＲは、カルシウム過負荷の心筋細胞間だけには伝播するであろうが、通常は個々の細胞に限局されているためである。また、心筋収縮力は、約３×１０-7Ｍ［Ｃａ2+］i〜約１０-6Ｍ［Ｃａ2+］iの［Ｃａ2+］iに比例して増加し、ＣＩＣＲがオール・オア・ナッシング(all or nothing) の応答でないことを示唆している。
【０００８】
骨格筋細胞における興奮収縮連関とは対照的に、インビボにおける心ＤＨＰＲと心ＲｙＲ２との間に何らかの直接的なタンパク質−タンパク質相互作用があるかどうかわかっていない。しかしながら、ツーハイブリッドアッセイによれば骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループは心ＲｙＲ２に確かに結合し（Ｏｓｔｅｒｌａｎｄら、１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７６：Ａ４６７−（アブストラクト））、表面プラズモン共鳴試験によれば骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）はＲｙＲ２に結合する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ及びＲｏｎｊａｔ，１９９９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７６：Ａ４６６−（アブストラクト））。
【０００９】
有力なデータが示すところによれば、骨格筋及び心筋のＤＨＰＲとＲｙＲチャンネル間の関係は異なる。例えば、骨格筋ＲｙＲ１は欠いているが骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットは含有するｄｙｓｐｅｄｉｃ筋細胞に発現された心ＲｙＲ２は、骨格筋型の興奮収縮連関を支持できない。その上、単離されたＲｙＲ２チャンネルは、心筋又は骨格筋のＤＨＰＲα−１サブユニットの反復IIとIIIの間の全１３８のアミノ酸細胞質ループによって活性化されない（Ｌｕら、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６５１１−６５１６）。さらに、骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）は、骨格筋ＲｙＲ１チャンネルの高親和性アクチベータであるという事実にもかからわず、心ＳＲからのＣａ2+放出を誘発もせず、心ＲｙＲ２チャンネルへの［3Ｈ］リアノジン結合を増強もしないことが示されている（Ｅｌ Ｈａｙｅｋら、１９９５，上記）。さらに、これらの入手可能なデータは、骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）は、例えば開口時間の延長や開口頻度などによって心ＲｙＲ２チャンネルを活性化することができないことを示している。
【００１０】
Ｓｔｅｒｎ（１９９２，ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３０９２−３１００）は、Ｃａ2+シナプス（すなわちＣａ2+流出入部位付近の非常に高いＣａ2+局在ドメイン）が心組織のＤＨＰＲ及びＲｙＲの活性に機能的に連結していることを提唱した。各Ｃａ2+シナプスは、高い局所Ｃａ2+濃度によってＲｙＲ２の局所制御を可能にするので、細胞全体に渡って又は細胞間にＣａ2+放出シグナルを拡散させることなく、観察される高いシグナル増幅を生み出すことができる。その結果、各シグナル時に召集される放出単位数は、引き金のカルシウム放出に応じて定量的に段階的であると思われる。この提唱は、短時間（約５０ｍｓ）のカルシウムスパーク及び心筋細胞刺激時の限局された空間的広がり（約１．５μｍ）といった観察と一致する（Ｃｈｅｎｇら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：７４０−７４４）。
【００１１】
心筋収縮不全は、虚血性心疾患、鬱血性心不全、及び、敗血症のような全身性炎症状態を有する患者のありふれた罹病及び死亡原因となっている。蓄積されつつある証拠によれば、収縮不全は筋細胞質(myoplasmic)カルシウム流の調節不全に伴うことが示されている。筋フィラメントのＣａ2+感度減退、又は例えばカルシウムシナプスの劣化や破壊、ＲｙＲ２の劣化、又はＤＨＰＲの劣化などによるカルシウムシグナリングの劣化は、心収縮力の低下をもたらしうる。いくつかのＣａ2+シグナル経路は心不全又は心肥大（末期の心不全に観察されるカルシウム過負荷を伴う）時に有害作用を受ける。静止Ｃａ2+濃度の上昇、Ｃａ2+の変化振幅の低下、弛緩の緩徐化、及びＳＲ中のＣａ2+ポンプの変化が、心不全又は心肥大の心組織に観察されている。
【００１２】
更に詳しくは、肥大心並びに不全心には、正常の心臓と比べて興奮収縮連関の効率低下も見られる（Ｇｏｍｅｚら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７５５−７５６）。しかしながら、不全又は肥大心における個々のＤＨＰＲ及びＲｙＲは正常のように見えるので、これら２つののカルシウムシグナルタンパク質間の連結に欠陥があることが示唆される。この見解は、β−アドレナリン作動性アゴニストを投与して心ＤＨＰＲの開口時間を延長することにより、肥大細胞又は鬱血性心不全後に正常の興奮収縮連関を取り戻せることから裏付けられる。
【００１３】
さらに、ヒト不全心におけるＲｙＲ２の高リン酸化も、チャンネル機能に欠陥をもたらす。
さらに、心拍出量は、心臓発作後のような急性状況下では、興奮収縮連関を増強する“変力性薬”によって押し上げることができる。虚血発作時に心筋の個々の領域が損傷され、心拍出量の低下を招く。脳のような必須器官への血液供給は残った健常心筋に更に強力に収縮してもらうことによって維持できる。現在ではこれを、β−アドレナリン性刺激を模倣しｃＡＭＰ濃度を増加させることでＤＨＰＲ活性及び興奮収縮連関を刺激する薬物によって行っている。長期的に見ると、増加したｃＡＭＰ濃度は有毒で、カルシウム過負荷をもたらしかねない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本明細書は、参考文献一覧の後に示した、プログラム Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１を用いて用意したヌクレオチド及びアミノ酸配列情報を含有する。各ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、配列表中で数字見出し＜２１０＞とその後の配列識別子（例えば＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって識別される。各ヌクレオチド又はアミノ酸配列の長さ、配列の型（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）及び原料生物は、それぞれ数字見出し項目＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞に提供される情報によって示される。明細書中に引用されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、記述子“配列番号”とその後の数字識別子によって定義される。例えば配列番号１は、＜４００＞１の数字見出し項目中に提供される情報のことである、など。
【００１５】
本明細書中で配列番号１に示したコンセンサス配列への参照は、前記コンセンサス配列を編集するのに用いた配列番号２〜７に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸配列への参照を含むとみなされるべきである。
【００１６】
本明細書全体を通じて、別途記載のない限り、“含む”という語又は“含み”もしくは“含んでいる”などの変形語は、記述したステップ又は構成要素又は完全体又はステップ群又は構成要素群又は完全体群を包含するが、他の任意のステップ又は構成要素又は完全体又は構成要素群又は完全体群を除外しないことを意味すると理解されるべきである。
【００１７】
本明細書中で使用している用語“〜由来の（〜から誘導された）”は、特定の完全体が、必ずしも直接的ではないにしろ、特定の原料から得られうることを示すとみなされるべきである。
【００１８】
本発明に至る研究の中で、発明者らは、心不全及び／又は心肥大の改良された治療計画を提供するため、心組織におけるＣＩＣＲを調節する新規手段を明らかにしようと模索してきた。驚くべきことに、心ＤＨＰＲと心ＲｙＲ間の物理的関係は確立されていないものの、本発明は心ＲｙＲ２チャンネルを活性化できる骨格筋又は心筋のＤＨＰＲポリペプチドの小フラグメント、例えば小さな塩基性荷電ペプチドを提供する。
【００１９】
更に詳しくは、本発明者らは、骨格筋ＤＨＰＲα−１サブユニットの細胞質ループの２０量体ペプチド（すなわちＴｈｒ671〜Ｌｅｕ690）が、−４０ｍＶ（負の電位はＳＲからのカルシウム放出を誘発する）でＲｙＲ２チャンネルの顕著な活性化と、＋４０ｍＶで強力な阻害を生み出すことを示した。心ＲｙＲ２チャンネルの活性化はわずか１ｎＭのペプチド濃度で観察され、骨格筋ＲｙＲ１の活性化に要するペプチド濃度より著しく低かった。さらに、心ＲｙＲ２チャンネルの阻害は、３×１０-7Ｍの細胞質Ｃａ2+で骨格筋ＲｙＲ１チャンネルに観察されるものより著しく大きかった。
【００２０】
従って、本発明の一側面は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供することであり、該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント、例えば塩基性荷電フラグメントと接触させることを含む。
【００２１】
更に好ましくは、本発明は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供し、該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント、例えば塩基性荷電フラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。
【００２２】
前述の内容から、本発明の一態様は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を増強する方法に関することは明らかであろう。該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を増強するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。本明細書中に示されている通り、そして本発明を何らかの理論又は作用様式又は有効ペプチド濃度に制限することなく、本発明者らは、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２について、チャンネル開口頻度と各チャンネル開口時間の両方が、約１ｎＭペプチド〜約１０μＭペプチドまでの適用によって増強されることを示した。高ペプチド濃度では、最初に開口したチャンネルの活性がわずかに低下するが、他のチャンネルの活性はより高くなる。これはおそらくＲｙＲ２チャンネルのペプチドに対する感度に微細な不均一性があることを反映しているのであろう。
【００２３】
また前述の内容から、本発明の別の態様は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を阻害する方法に関することは明らかであろう。該方法は、心ＲｙＲ２を、前記ＲｙＲ２の活性を阻害するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルが活性を欠いていることを判定することを含む。本明細書中に示されている通り、そして本発明を何らかの理論又は作用様式又は有効ペプチド濃度に制限することなく、本発明者らは、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２について、特に＋４０ｍＶにおけるチャンネル開口頻度が約１０μＭを上回る濃度のペプチドによって削減されることを示した。これはおそらくＲｙＲ２チャンネルのポア内でのペプチド結合が、チャンネルの活性時に結合している部位とは異なる部位で起きているためであろう。
【００２４】
本発明の第二の側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチドモジュレーターを同定する方法を提供することである。該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチドを、前記機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較し；そして
(iv)好ましくは、(i)と比較して(ii)で比較に値する又は増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチドを選択することを含む。
【００２５】
代替の態様において、本発明の本側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチドモジュレーターを同定認する方法を提供する。該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド及び心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量の前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較し；そして
(iv)好ましくは、(i)と比較して(ii)で比較に値する又は増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチドを選択することを含む。
【００２６】
本発明の第三の側面は、心ＲｙＲ２チャンネルが開口しているか又は高いチャンネル開口確率を有しているかどうかを決定する方法を提供することである。前記方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、ある量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体に、前記チャンネルへの結合が起こるに足る時間及び条件下で接触させ、前記ペプチドの前記チャンネルへの結合を測定することを含み、前記ペプチドの前記チャンネルへの結合は高いチャンネル開口確率を示し、非特異的なペプチドの結合は低いチャンネル開口確率を示す。
【００２７】
本発明の第四の側面は、ヒト又は動物患者における心機能不全の治療法を提供することである。該方法は、有効量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、増強された心収縮が起こるに足る時間及び条件下で投与し、それによって前記心機能不全を矯正することを含む。
【００２８】
本発明の第五の側面は、ジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を１種類以上の製薬上許容しうる希釈剤と共に含む医薬組成物を提供することである。前記ペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチドの少なくとも約５個の連続アミノ酸残基を含む。
【００２９】
本明細書全体を通じて使用している１文字及び３文字略号の定義を表１に示す。
【００３０】
【表１】
好適な態様の詳細な説明
本発明の一側面は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供することであり、該方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させることを含む。
【００３２】
更に詳しくは、本発明は、心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）カルシウムチャンネルの活性を調節する方法を提供し、該方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、前記ＲｙＲ２の活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメントと接触させ、そして前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定することを含む。
【００３３】
本明細書中で使用している用語“リアノジン受容体−２チャンネル”又は“ＲｙＲ２チャンネル”又は“心ＲｙＲチャンネル”とは、ＲｙＲ２ポリペプチドサブユニットを含むカルシウムチャンネルのことを言うものとする。当業者であれば、本明細書中に引用した“ＲｙＲ２チャンネル”又は“心ＲｙＲチャンネル”の物理的構造は周知している。
【００３４】
本明細書中で使用している用語“調節する”とは、ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を増強又は阻害することを意味するものとする。従って、“ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節する”又は類似の用語が一般的に意味するのは、例えば心ＲｙＲ２のカルシウムシナプス又はカルシウム感度、各活動電位時の心ＲｙＲ２チャンネルの開口頻度、又は個々の心ＲｙＲの開口時間を変更することによって、ＣＩＣＲが調節される（すなわち増強又は削減される）ということである。
【００３５】
前述のように、本発明は明らかに、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性の増強法及び心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性の阻害法の両方を包含する。
心ＲｙＲ２チャンネルは、心細胞内の原位置（in situ）にあってもインビボで心筋にあってもよいが、例えば脂質二重層に埋め込まれたような単離されたＲｙＲ２チャンネルであってもよく、あるいは、例えばトランスフェクト細胞（例えばＣＨＯ細胞又はｄｙｓｐｅｄｉｃ筋細胞）の膜に発現されたような組換え又は再構成ＲｙＲ２チャンネルであってもよい。例えばＢｈａｔらが記載しているような標準法（１９９７，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７３：１３２９−１３３６）を用いてトランスフェクト細胞にＲｙＲ２チャンネルを発現させることができる。前記文献は引用によって本明細書に援用する。好ましくは、心ＲｙＲ２チャンネルは心細胞中の原位置（in situ）又はインビボの心組織にある。
【００３６】
本明細書中で使用している用語“フラグメント”は、例えばアルギニン又はリジンのような塩基性アミノ酸残基又は半塩基性アミノ酸残基であるヒスチジンが比較的高割合で存在するため、ペプチドが生理的ｐＨ値で総体的に正電荷を有していることを意味する。好ましくは、フラグメントは少なくとも約２５％の塩基性アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも約５０％の塩基性アミノ酸残基を有することになろう。
【００３７】
本明細書に記載の発明を実施するのに有用なペプチドは、アミノ酸配列：
【００３８】
【化１】
［Ｘはアミノ酸残基］を含む心筋又は骨格筋のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント由来の、長さが少なくとも約５個のアミノ酸のペプチドである。本発明は、配列番号１と類似の配列を有する任意の原料由来のペプチド、例えば合成又は天然ペプチド、あるいは任意のＤＨＰＲ配列から誘導されたペプチドの使用にも拡大されることは明白である。
【００４０】
本発明を更に説明するために、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、図１に示した通り、いくつかの動物種の骨格筋及び心筋のＤＨＰＲの細胞質II-IIIループの２０量体ペプチドのコンセンサス配列に一致する。本明細書中に例示した通り、本発明者らは、ヒト骨格筋ＤＨＰＲ−３の細胞質II-IIIループの部分はヒツジのＲｙＲ２チャンネルの活性を調節することを示している。図１に示した種々のＤＨＰＲ間の近似した配列関係は、配列番号１の配列又は配列番号１と実質的に同一の配列を有する任意のペプチドはＲｙＲ２チャンネルの活性を調節するであろうことを示している。
【００４１】
従って、本発明は、配列番号１に示したアミノ配列の任意及びすべての相同体、類似体及び誘導体の使用にも拡大されることは明白である。好ましくは、そのような相同体、類似体、又は誘導体は塩基性荷電ペプチドであり、更に好ましくは配列番号１の保存塩基性残基を保持している。
【００４２】
なお更に好ましくは、主題の配列は、配列番号１のアミノ酸位置１１〜１５のモチーフＲＫＲＲＫを含む。
本文脈において、配列番号１〜７のいずれか一つの“相同体”とは、骨格筋又は心筋のＤＨＰＲアミノ酸配列又は他の種のような他の原料由来の類似配列から直接誘導された、あるいは擬似ペプチドをＲｙＲ２チャンネルの調節活性に関してスクリーニングすることによって誘導された天然又は合成の塩基性荷電ペプチドのことを言い、配列番号１又は配列番号２〜７に掲載した特定のアミノ酸配列のいずれか一つに実質的に一致する配列を含む。
【００４３】
例えば、配列番号１〜７のいずれか一つのアミノ酸は、ペプチドの総体的特徴（例えば塩基性電荷又はコンホメーション）が維持されていれば、類似の性質、例えば疎水性、親水性、疎水モーメント、抗原性、電荷、又はα−らせん構造の形成傾向を有する他のアミノ酸で置換することもできる。
【００４４】
置換にはアミノ酸の変化も含まれる。その場合、アミノ酸は天然の異なる又は非従来型のアミノ酸残基で置換されている。そのような置換は“保存的”と分類でき、その場合、アミノ酸残基は類似の性質を有する別の天然アミノ酸で置換されている。例えば、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ⇔Ｍｅｔ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、又はＡｓｎ⇔Ｇｌｎである。アミノ酸置換は典型的には単一の残基の置換であるが、複数の残基（クラスターでも分散でも）の置換であってもよい。
【００４５】
当業者に公知の任意の方法、例えば自動ペプチド合成機でＦｍｏｃアミノ酸を用いて行う固相法によって製造される合成ペプチドである相同体は、本発明で特に意図するものである。そのようなペプチドは、従来法によって環化でき、及び／又は同種ペプチドを実質的に含まないように部分精製してもよい。
【００４６】
配列番号１〜７のいずれか一つの“類似体”は、前記配列又はその相同体と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。その中には一つ以上の非天然アミノ酸類似体があってもよい。特に好適な類似体は、配列番号１〜７のいずれか一つの任意のペプチド又は非ペプチド擬似体を含み、前記配列の特徴、例えば電荷分布又はコンホメーション又は他の構造的特徴を保持しているものである。Ｇｕｒｒｏｌａらによるインペラトキシン(imperatoxin)ペプチド（１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７８７９−７８８６）及び任意の合成非ペプチド擬似体は特に本発明で意図するものである。
【００４７】
配列番号１〜７のいずれか一つに関わる用語“誘導体”は、前記配列又はその相同体もしくは類似体の任意の部分、フラグメント、又はポリペプチド融合のことを言うものとする。誘導体は修飾されたアミノ酸配列又はペプチドを含み、その中に含有される一つ以上のアミノ酸残基にリガンドが結合している。例えば、脂質、リポサッカリド、リポ多糖（ＬＰＳ）、炭水化物、酵素、ペプチド、放射性核種、蛍光化合物、光活性化可能残基（例えばｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、又はグルコシル部分などである。ペプチドの誘導体化法は当該技術分野で周知である。
【００４８】
例えば、好適な誘導体は配列番号１〜７のいずれか一つのフラグメント、又は配列番号１〜７のいずれか一つの相同体もしくは類似体のフラグメントを含みうる。アミノ酸欠失は通常約１〜１５個のアミノ酸残基の長さのオーダーであろう。欠失は、配列番号１のＮ末端又はＣ末端に対してなされるのが好ましい。
【００４９】
あるいは、配列番号１〜７のいずれか一つの誘導体は、追加のアミノ酸残基をペプチド又はその相同体もしくは類似体のＮ末端又はＣ末端に付け加えて有していてもよい。挿入は、一般的にＲｙＲ２への接近の障害にならないよう十分に小さく、例えば１〜４個のアミノ酸残基のオーダーの挿入であろう。
【００５０】
配列番号１〜７のいずれか一つの好適な相同体、類似体及び誘導体は、配列番号１〜７のいずれか一つの少なくとも約５個の連続アミノ酸、更に好ましくは少なくとも約１０個の連続アミノ酸残基、又は更に好ましくは少なくとも約１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む。従ってそのような相同体、類似体及び誘導体は、配列番号２〜７のいずれか一つと比べて全長又は全長未満の配列であり得る。
【００５１】
好適な相同体、類似体又は誘導体は、ＲｙＲ２チャンネルの調節活性に関する限り配列番号１と機能的等価性を所有していることに加え、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことになろう。好ましくは、配列番号１に対する同一性のパーセンテージは、少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約９０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９５％又は少なくとも約９８もしくは９９％であろう。二つのアミノ酸配列が定義のパーセント同一性又は類似性の限界内に入るかどうかを決定する場合、アミノ酸配列を並べて比較することが必要なことは当業者であればわかるであろう。そのような比較又はアラインメントにおいては、アラインメントの実施に使用したアルゴリズムによって非同一アミノ酸残基の位置に相違が生じるであろう。本明細書では、二つ以上のアミノ酸配列間のパーセント同一性及び類似性を言う場合、当業者に公知の任意の標準アルゴリズムを用いて測定した前記配列間のそれぞれ同一及び類似の残基の数を言うことにする。特に、アミノ酸の同一性及び類似性は、米国ウィスコンシン州マディソン、ユニバーシティリサーチパーク、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．のＧＡＰプログラムを用いて計算する（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５）。これは、複数のアラインメントに、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、あるいはＴｈｏｍｐｓｏｎらのＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ アルゴリズム（１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を利用し、アラインメントの中の同一／類似アミノ酸の数を最大にし、配列ギャップの数及び／又は長さを最小にする方法である。
【００５２】
特に好適な配列番号１の相同体、類似体、又は誘導体は、心ＲｙＲ２チャンネルの活性の調節に関して配列番号２〜７のいずれか一つと競合するであろう。標準的競合試験では、異なる濃度の試験されるペプチドを、例えば心ＲｙＲ２チャンネルの活性を増強又は阻害する濃度の配列番号２の存在下で、ＲｙＲ２チャンネルの調節活性について検定する。例えば、心ＲｙＲ２チャンネルの高親和性アクチベーターは、約１０-7Ｍ〜約１０-5Ｍの範囲の細胞質カルシウム濃度で脂質二重層中でのチャンネルの活性をうまく増強し、公知のアクチベーターペプチド（例えば約１ｎＭの配列番号２〜約１００ｎＭの配列番号２）によって誘導されたチャンネルの活性の増強と競合する能力によって判定できる。同様に、心ＲｙＲ２チャンネルの高親和性インヒビターは、約１０-7Ｍ〜約１０-5Ｍの範囲の細胞質カルシウム濃度で脂質二重層でのチャンネルの活性をうまく阻害し、細胞質Ｃａ2+濃度１０-4Ｍまでにおける公知のインヒビターペプチド（例えば３２．５μＭの配列番号２）によって誘導されたチャンネルの活性の阻害と競合する能力によって判定できる。
【００５３】
発明者らは、本発明を決して制限することなく、配列番号２に記載のヒト骨格筋ＤＨＰＲ２０量体ペプチド配列の類似体及び誘導体（本明細書に定義の通り）に一致する３種類のペプチドを作り出した。これらのペプチドの詳細は以下の通りである。
【００５４】
(i)配列番号８は配列番号２の２０量体ペプチドに一致するが、以下に示すようにセリン687（配列番号２の残基１７）がアラニン残基で置換されている。
【００５５】
【化２】
(ii)配列番号９は配列番号２の２０量体ペプチドに一致するが、以下に示すようにアルギニン688（配列番号２の残基１８）がアルギニンのＤ異性体で置換されている。
【００５７】
【化３】
(iii)配列番号１０は配列番号２の２０量体ペプチドに一致するが、以下に示すようにセリン687（配列番号２の残基１７）がアラニン残基で置換され、アルギニン688（配列番号２の残基１８）がアルギニンのＤ異性体で置換されている。
【００５９】
【化４】
本文脈において、例えば、心ＲｙＲ２チャンネルをＤＨＰＲポリペプチドの塩基性ペプチドフラグメントに“接触させる”という用語は、ペプチドをチャンネルに緊密に物理的会合させることを意味するが、必ずしもペプチドのチャンネルへの実際の結合は必要としない。本発明の実施においてＤＨＰＲペプチドはＲｙＲ２チャンネルに結合するかもしれないが、要求されるのは調節されたチャンネルの活性だけなので、そのような結合は本発明の本質的な特徴ではない。この点において、本発明の目的は、心ＲｙＲ２ポリペプチドへの結合を達成することではなく、ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節することである。当業者であれば、結合と活性は必ずしも等価でないことを知っている。なぜならば、ＤＨＰＲポリペプチドは、ＲｙＲ２ポリペプチドの多数の異なる部位のいずれか一つに結合しうるが、ＲｙＲ２チャンネルの活性を必ずしも調節するとは限らないからである。
【００６１】
好ましくは、ペプチドはＲｙＲ２チャンネルの細胞質面と接触させる。
好ましくは、配列番号１〜７のいずれか一つ、又は配列番号１〜７のいずれか一つの相同体、類似体、もしくは誘導体、例えば配列番号８〜１０のいずれか一つは、本発明の方法の実施中に、ＲｙＲ２チャンネルのＲｙＲ２ポリペプチドの部分に結合する。本発明を何らかの理論又は作用様式に制限するつもりはないが、本発明の実施に使用されるペプチド（又はその相同体、類似体、もしくは誘導体）は、チャンネル中のＲｙＲ２ポリペプチドの一つ以上の負荷電残基、例えばアミノ酸配列：
【００６２】
【化５】
中の酸性残基に結合することによって、ＲｙＲ２チャンネルに接近できるようなコンホメーションを取ってもよい。
前述の説明から、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を測定するには、ペプチド、又はその問題についてのリアノジンの、チャンネル又はＲｙＲ２ポリペプチドへの結合を測定するだけでは不十分であるということが導き出される。もっとも、これも確かに、調節されたチャンネルの活性測定の付属的部分を形成するものではあり得る。チャンネルの活性を測定するための好適な手段は次の群から選ばれる。
【００６４】
(i)当該技術分野で認められている方法を用いて脂質二重層における単一又は複数のＲｙＲ２チャンネル開口を記録する。例えば、Ａｈｅｒｎら（１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５２：３６９−３７４）、Ｌｕら（１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６５１１−６５１６）、Ｌａｖｅｒら（１９９５，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ，．Ｂｉｏｌ．１４７：７−２２）、又はＤｕｌｈｕｎｔｙら（１９９９，上記）に記載の方法による；
(ii)当該技術分野で認められている方法を用いてＳＲ小胞からのカルシウム放出を測定する。例えば、Ｅｌ−Ｈａｙｅｋら（１９９５，上記）、Ｇｕｒｒｏｌａら（１９９９，上記）、又はＤｕｌｈｕｎｔｙら（１９９９，上記）に記載の方法による；
(iii)例えば、Ｚａｌｏｇａら（１９９７）に従って心収縮性を測定することにより心機能を測定する；及び
(iv)当該技術分野で認められている任意の血管緊張測定法を用いて、単離した胸部大動脈輪のペプチド投与後の血管緊張を測定する。
【００６５】
当業者であれば、心機能は、ｄＰ／ｄｔｍａｘ又は−ｄＰ／ｄｔｍａｘ値で査定される収縮性、左室の収縮期圧、及び心拍数からなる群から選ばれる一つ以上のパラメータに対するペプチド投与の濃度依存性を測定することによって容易に判定できることは理解される。心室細動又は他の心不整脈も測定すればペプチドの負の副作用も定量化できる。
【００６６】
増強された心ＲｙＲ２チャンネルの活性について検定する中で、増加したチャンネル開口確率（Ｐｏ）が検出される。より高いチャンネル開口確率は、ＳＲ小胞を含むＳＲからのカルシウム流出又は放出の増強、及び心収縮性の増強、及び弛緩の削減をもたらす。血管緊張も増強されうる。
【００６７】
これに対し、心ＲｙＲ２チャンネルの活性のインヒビターは、チャンネル開口確率の減少、ＳＲからのカルシウム放出の減少、及び心収縮性の低下をもたらすことになる。血管緊張も低下しうる。
【００６８】
調節された心ＲｙＲ２チャンネルの活性のその他の測定法も除外されない。
配列番号１〜７のいずれか一つ、又はその相同体、類似体もしくは誘導体（例えば配列番号８〜１０）、特に配列番号２の、心ＲｙＲチャンネルの活性の調節における効力は、構造及び機能的類似性を共有する化合物のスクリーニングに使用する試薬としてのそのような配列の有用性を明らかにする。そのような試薬は、数千の化合物が迅速にスクリーニングできる、高スループットのスクリーニングアッセイを可能にする。本明細書中に記載の調節活性を有する可能性のあるペプチド擬似体も、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２受容体を用いて、又は別の適切なアッセイフォーマットで、心ＲｙＲ２チャンネルの活性の調節能力について試験することができる。
【００６９】
従って、本発明の第二の側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチド又は非ペプチドモジュレーターの同定法を提供することであり、該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド又は非ペプチド化合物を、前記機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；そして
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較することを含む。
【００７０】
好ましくは、前記フラグメントは配列番号１のペプチド配列の少なくとも５個の連続アミノ酸を含む。
好ましくは、配列番号１又は配列番号１の相同体、類似体もしくは誘導体に匹敵する又はそれより増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチドを選択する。そのようなペプチドは、匹敵する又は増強されたチャンネルの活性の調節によって検出可能であり、それは(i)との比較により(ii)で検出される（上記）。
【００７１】
例えば、心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する決まった量の配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体を機能性受容体に加えてもよい。次に該反応混合物を活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートし、チャンネルの活性を測定する。並行する実験で、候補のペプチド又は非ペプチド化合物を、配列番号１の存在下で活性の調節を可能にする条件下で心チャンネルとインキュベートし、このテストサンプルのチャンネル活性を、配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体の活性と比較して測定する。配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体と比較して匹敵する又は増強された調節活性を有するペプチド又は非ペプチド化合物が選択できる。
【００７２】
代替の態様において、本発明の本側面は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルのペプチド又は非ペプチドモジュレーターの同定法を提供し、該方法は、
(i)心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド又は非ペプチド化合物及び心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する量の前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；そして
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較することを含む。
【００７３】
好ましくは、前記フラグメントは配列番号１のペプチド配列の少なくとも５個の連続アミノ酸を含む。
本発明のこれらの側面の最も好適な態様において、前記配列番号１のペプチド又はその相同体もしくは誘導体は、配列番号２〜１０のいずれか一つ以上から選ばれる。
【００７４】
好ましくは、配列番号１又は配列番号１の相同体、類似体もしくは誘導体に匹敵する又はそれより増強されたチャンネルの活性の調節を有するペプチド又は非ペプチド擬似体などを選択する。そのようなペプチド又は非ペプチド化合物は、比較しても遜色のない又は増強されたチャンネルの活性の調節によって検出可能であり、それは(i)との比較により(ii)で検出される（上記）。
【００７５】
例えば、心ＲｙＲ２チャンネルの活性を調節する決まった量の配列番号１又は配列番号１の相同体、類似体もしくは誘導体を、調節が起こるのを可能にする条件下で機能性受容体に加える。チャンネルの活性は候補ペプチドの存在下又は不在下で測定し、サンプルのチャンネル活性を比較する。配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体の、心ＲｙＲ２チャンネルの活性に対する影響を調節するペプチド又は非ペプチド化合物が選択できる。
【００７６】
本目的のためには、心ＲｙＲ２チャンネルの活性の調節に基づくアッセイフォーマットであればいかなる従来式アッセイフォーマットでも適当である。好適なアッセイフォーマットでは、試験されるサンプルは、平面の脂質二重層もしくはＳＲ小胞中の再構成されたＲｙＲ２チャンネル又は機能性心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルを有するｄｙｓｐｅｄｉｃ筋細胞である。日常的実験を使用するだけで、当業者は、特定の候補ペプチド又は非ペプチド化合物が心カルシウムチャンネルの活性を調節するかどうかを測定することができる。
【００７７】
本発明は、明らかに、非特異性を多少許容する迅速な高スループットのスクリーニング、及び／又は高い特異性を有する小規模の機能的スクリーニング、及び／又は心ＲｙＲ２チャンネルの化学構造／機能関係を解明する定量的動力学研究、例えば心ＲｙＲ２カルシウムチャンネル機能のアゴニスト又はアンタゴニストであるペプチド又は非ペプチド化合物の決定、又は前記化合物のチャンネルにおけるドッキング部位の解明、を利用するプロセスを意図している。
【００７８】
好ましくは、本発明は、
(i)心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの候補アゴニスト及びアンタゴニストを同定し；
(ii)実際に心ＲｙＲ２チャンネルの活性を活性化又は阻害する(i)の化合物を決定し；
(iii)前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルに対し、(ii)のどの化合物が配列番号１〜１０のいずれか一つよりも高い結合親和性を有しているかを決定し；そして
(iv)場合により、(iii)の化合物と前記心ＲｙＲ２カルシウムチャンネル間の相互作用部位を決定することを含むプロセスを意図している。
【００７９】
心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの候補アゴニスト及びアンタゴニストを同定するための迅速で高スループットのスクリーニングは、好ましくは、心筋のミクロソーム標本中の、又はその代わりにＣＨＯ細胞もしくは他の適切な細胞ベースのアッセイ系に発現させた心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルを用いて実施する。そのような高スループットのスクリーニングは、ミクロソーム標本とインキュベートした、又はＲｙＲ２チャンネルを発現しているトランスフェクト細胞に注入したもしくはそれとインキュベートした多数の化合物のスクリーニングを容易にする。また、高スループットのスクリーニングは、ライブラリーから発現され、ＲｙＲ２チャンネルを発現している細胞にトランスフェクトされた多数のペプチドのスクリーニングも容易にする。
【００８０】
あるいは、又はそれに加えて、候補アゴニスト及びアンタゴニスト分子は、心ＲｙＲ２タンパク質を多数のポリマーピンのような担体に結合させ、その多数のピン上のポリペプチドをスクリーニングされる候補アゴニスト及び／又はアンタゴニスト分子と接触させることによって同定される。スクリーニングされる分子は同位体標識して結合の検出が容易にできるようにしてもよい。あるいは、スクリーニングされる化合物を多数のピンのような固体担体に固定し、それをＲｙＲ２ポリペプチドと反応させてもよい。この場合も結合は、例えば、同位体標識によって、抗体検出によって、又は別のレポーターを使用して測定することができる。
【００８１】
特定の化合物の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルに対する結合親和性は、タンパク質−リガンド相互作用の動力学パラメータの測定に有用な当業者に公知の任意のアッセイによって測定できる。好ましくは、例えば表面プラズモン共鳴法のような結合アッセイが使用される。タンパク質の表面プラズモン共鳴は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アナライザを用いて測定できる。当業者には周知であろうが、この方法は、リガンドの対象のタンパク質への結合に関するオン・オフ率を測定するためのデータを提供する。
【００８２】
多数の候補化合物をスクリーニングするには、化合物を複数のポリマーピン又は基板に固定してもよい。
候補化合物と心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの相互作用部位を決定するには、候補化合物と、天然タンパク質中の一つ以上の部位を削除又は変異アミノ酸配列で置換した種々の変異ＲｙＲ２ポリペプチドとの結合を測定し、前記化合物と野生型又は非変異ＲｙＲ２タンパク質との結合と比較してもよい。ここでも表面プラズモン共鳴法を用いて結合親和性の比較を容易にしてもよい。強力なアゴニスト／アンタゴニスト活性を提供するそれらの相互作用部位に関するデータは、結合親和性が増強されてはいるが、そのような部位に結合する薬物の合理的設計を容易にするのに用いる。
【００８３】
このようなスクリーニング過程を経て検出された化合物は、最終的には例えば心機能不全の治療に使用することができる。
代替の態様において、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト化合物は合理的薬物設計を用いて同定される。すなわち、三次元構造の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルに結合又は会合する化合物を同定する。本発明は、明らかに、三次元構造の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルから誘導され、前記チャンネルに結合し、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を活性化又は阻害するあらゆる合成化合物を想定している。
【００８４】
心ＲｙＲ２チャンネルの開口確率は配列番号１又はその相同体、類似体もしくは誘導体とのインキュベーションによって調節されるという観察から、インビトロ及びインビボにおける心ＲｙＲ２チャンネルのポア構造及び調節機構の確立又は決定におけるそのような配列の有用性が明らかである。更に詳しくは、一方ではペプチドのＲｙＲ２への結合と高いチャンネル開口確率との間の相関、及びチャンネルポア内の負荷電残基におけるペプチドの非特異的結合と低い開口確率との間の相関を以てすれば、ペプチド結合試験に基づいて開口確率の予測が可能となる。
【００８５】
そこで、本発明の第三の側面は、心ＲｙＲ２チャンネルが開口しているか又は高いチャンネル開口確率を有しているかどうかを決定する方法を提供することであり、該方法は、心ＲｙＲ２チャンネルを、ある量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体に、ＲｙＲ２への結合が起こるに足る時間及び条件下で接触させ、前記ペプチドのＲｙＲ２への結合を測定することを含む。前記ペプチドのＲｙＲ２への結合は高いチャンネル開口確率を示し、ペプチドのチャンネルポアへの非特異的ペプチド結合は低いチャンネル開口確率を示す。
【００８６】
好ましくは、前記フラグメントは、実質的に配列番号１〜１０のいずれか一つ以上に定義のペプチドである。
ペプチドの結合は当業者に公知の任意の方法によって測定できる。例えば、放射能標識もしくは蛍光標識したペプチド、又はレポーター分子で標識したペプチドを用い、任意の特定のペプチド濃度においてチャンネルに結合した標識又はレポーター分子の量を測定する。この目的のために好適なレポーター分子は、ペプチドのチャンネルへの結合能を障害しない小分子、例えば光活性可能な化合物である。
【００８７】
あるいは、ペプチドの結合は、チャンネルを通してカルシウムを放出するチャンネルの活性を測定することにより間接的に測定することもできる。本明細書中に例示の通り、約１ｎＭ〜約１０μＭペプチドの濃度のペプチドは高いチャンネル開口確率を生じるが、それより高濃度のペプチドは、特に脂質二重層中のチャンネルに対して、低いチャンネル開口確率を示す。
【００８８】
本発明の第四の側面は、ヒト又は動物患者における心機能不全の治療法を提供することであり、該方法は、有効量のジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）ポリペプチドのフラグメント又はその誘導体、相同体もしくは類似体を、増強された心収縮が起こるに足る時間及び条件下で投与し、それによって前記心機能不全を補正することを含む。
【００８９】
好ましくは、前記フラグメントは、実質的に配列番号１〜１０のいずれか一つ以上に定義のようなペプチドの少なくとも５個の連続アミノ酸を含む。
“心機能不全”は、例えば、筋フィラメントのＣａ2+感受性が低下した場合、又はカルシウムシグナリングが、例えばカルシウムシナプスの劣化や破壊、ＲｙＲ２の劣化、もしくはＤＨＰＲの劣化などによって劣化した場合のような心筋収縮障害が関与する状態を意味する。本発明の方法による治療に適しているとして本明細書中で意図している心機能不全は、心筋収縮不全、虚血性心疾患、敗血症のような全身性炎症状態、心肥大（カルシウム過負荷）、催不整脈性右室異形成２型（ＡＲＶＤ２）、及び薬物（例えばコカイン）性心筋症のような心筋症、心筋梗塞、律動異常、鬱血性心不全、又は心臓発作などであるが、これらに限定されない。
【００９０】
“有効量”とは、機能不全の進行を減退又は逆転するに足るペプチドの量のことを意味する。
本発明のこの側面の目的にとって有益又は望ましい臨床結果は、検出可能不可能にかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化、疾患進行の遅延又は鈍化、疾患状態の回復又は一時的緩和、及び寛解（部分的でも全体的でも）などであるが、これらに限定されない。“治療”には、治療を受けていない患者の予想生存期間に比べて生存期間を延長することも含まれる。本明細書中で使用している用語“治療”には予防も含まれる。
【００９１】
疾患の“一時的緩和”は、治療によって疾患状態の程度及び／又は望ましくない臨床症状発現が減少している、及び／又は進行の時間経過が鈍化又は延長されていることを意味する。
【００９２】
予防の文脈において、“患者”は、約４０歳以上の一般人口の各個人である；特に、心肥大、心筋症、心臓発作、高血圧、腎不全、血管高血圧、呼吸器疾患、例えば肺気腫又は嚢胞性線維症、慢性喘息、及び肺結核の既往歴又は発症素因を有する個人などであるが、これらに限定されない。適切な患者には臓器移植患者も含まれる。
【００９３】
本発明の第五の側面は、心リアノジンカルシウムチャンネルの活性を調節し、それによってカルシウムシグナリングの欠陥を調節するための、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を含むジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントの使用を提供することである。
【００９４】
好ましくは、前記カルシウムシグナリングの欠陥は、慢性心肥大、拡張型心筋症又は心不全を誘発する。
本発明の第六の側面は、ヒト又は動物患者の心機能不全治療のための医薬製造における、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を含むジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントの使用を提供することである。
【００９５】
本発明は、心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節することによって慢性の非治療動物又はヒト患者に慢性心肥大又は拡張型心筋症又はさらには心不全をも誘発するカルシウムシグナリングの欠陥を調節するための、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の使用を含む。
【００９６】
好ましくは、該ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体は、収縮力を増強し、さらに収縮期に細胞内カルシウム濃度（すなわち［Ｃａ2+］i）を増加させ、さらに拡張期に［Ｃａ2+］iを減少させることができる用量で投与される。好ましくは、該ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体は、該ペプチドの不在下、標準のインビトロカルシウム増感アッセイで測定した収縮期の［Ｃａ2+］iに比べて収縮期の［Ｃａ2+］iに少なくとも約３％又は５％の増加を誘導する。好ましくは、該ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体は、該ペプチドの不在下、標準のインビトロカルシウム増感アッセイで測定した拡張期の［Ｃａ2+］iに比べて拡張期の［Ｃａ2+］iに少なくとも約３％又は５％の減少を誘導する。更に好ましくは、該ペプチドの不在下、そのような標準のインビトロカルシウム増感アッセイで測定した、それぞれ収縮期の［Ｃａ2+］i又は拡張期の［Ｃａ2+］iに比べて少なくとも約１０％又は１５％、更に好ましくは少なくとも約２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％、収縮期の［Ｃａ2+］iが増加し、又は拡張期の［Ｃａ2+］iが減少する。
【００９７】
なお更に好ましくは、投与されたペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体は、心収縮の効率を改善する。好ましくは、心収縮は、投与後０．５〜１．０時間以内にプレロード・リクルータブル・ストローク・ワーク（ＰＲＳＷ）に少なくとも約５％又は１０％の増加を誘導することによって増強される。更に好ましくは、心収縮は、健常人と比較した心不全患者のＰＲＳＷの増加による測定で、約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％又は７０％増強される。
【００９８】
例えば、該ペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体は、鬱血性心不全又は心原性ショックに罹患した、又は罹患している患者に直ちに投与できる（例えば、腹腔内又は静脈内）。そのような即時投与は、好ましくは、患者が鬱血性心不全又は心原性ショックに罹患した後、約１、２、４、８、１２又は２４時間、又は１日より多く〜約２もしくは３週間の範囲内でＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を増強するために適切な用量のペプチド投与を伴うであろう。
【００９９】
該ペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を比較的長期間、ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を活性化するために適切な用量で投与することも、増大した運動耐性及び機能的能力を提供するために慢性心不全罹患後の患者に有益であろう。例えば、該ペプチドは、心不全罹患後、機能的能力の増強を促進するため、患者に少なくとも２、４、６、８、１２、１６、１８、２０又は２４週間、又はそれより長く、例えば６ヶ月、１年、２年、３年、又はそれ以上定期的に投与することができる。そのような長期投与には経口用製剤が好適であろう。
【０１００】
該ペプチド又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、ヒト又は動物患者の心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を阻害する用量で投与することも除外されない。この作用も、例えば心組織の一時的弛緩が必要な場合には適当でありうる。
【０１０１】
該ペプチド、相同体、類似体又は誘導体の毒性及び治療的有効性は、例えばＬＤ50（母集団の５０％が致死となる用量）及びＥＤ50（母集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するための細胞培養物又は実験動物における標準製薬手順によって測定することができる。毒性と治療的有効性間の用量比は治療指数と言い、比ＬＤ50／ＥＤ50で表すことができる。高い治療指数を有する配列番号１〜７のいずれか一つに示したアミノ酸配列、又はその相同体、類似体、もしくは誘導体が好適である。
【０１０２】
有毒副作用を示す、又は高いＬＤ50を有するペプチド、相同体、類似体、又は誘導体はあまり望ましくないが、そうしたペプチドでも送達システムと組み合わせて使用してもよい。すなわち、そのような化合物を患部組織の部位を標的として送達することによって健常組織への損傷の可能性を最小限にする送達システムである。
【０１０３】
細胞ベースのアッセイと動物試験から得られたデータを用いれば、主題のペプチドをヒトに使用するための用量範囲を構築することができる。Ｇｒａｎｔらによる心肥大の動物モデル（ＵＳＳＮ ６，２０１，１６５ ２００１年３月１３日発行）は、この目的のために特に有用である。ペプチド、相同体、類似体又は誘導体の用量は、特定の経路による投与後、ＥＤ50に一致する循環濃度を生じ、毒性がほとんどないし全くない濃度範囲内にあるのが好ましい。該用量は剤形及び投与経路によってこの範囲内で変動しうる。また、各個人の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、及び体重などの要因によっても変動しうる。
【０１０４】
本発明の方法に使用するいずれのペプチド、相同体、類似体、又は誘導体も、治療的有効用量は、まず細胞ベースのアッセイ又は動物モデルから推定することができる。例えば、有効用量は、動物モデルで、細胞ベースのアッセイ及び／又は丸ごとの動物から決定したＩＣ50（すなわち症状の最大阻害の半分を達成するペプチド又は非ペプチド化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように構築できる。このような情報を用いれば、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１０５】
ペプチド、又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の適切な用量は、心室の長期間の迅速ペーシングによって動物モデルに心不全を誘発させ、次いで異なる濃度のペプチドを右心房に約３．３ｍＬ／分の速度で注入し、次に圧−容量の関係及びペプチドに対する動脈圧反応を記録することによって決定することもできる。公知のカルシウム増感剤を用いた対照実験、例えばＭａｒｂａｎ著（ＵＳＳＮ ６，１９１，１３６ ２００１年２月２０日発行）に記載の実験も実施できる。心臓の酸素消費量も測定してもよい。
【０１０６】
本発明のさらに別の側面は、ジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントを含む医薬組成物に関する。該ペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を、１種類以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤と共に含む。
【０１０７】
本発明の方法によって検出された物質の心機能不全治療における治療的効果は、当業者によって公知の診断及び治療原理を用いて達成できる。
治療用組成物は、製造及び保存条件下で無菌及び安定でなければならない。該ペプチドは、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適切な他の整えられた構造として製剤化できる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合は所要の粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、又は塩化ナトリウムを組成物に含めるのが好適であろう。
【０１０８】
ペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体を脂質又はリポサッカリド部分に結合させることによって吸収性の向上が達成できる。
注射用組成物の吸収を延長するには、例えばモノステアリン酸塩又はゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を組成物に含めればよい。さらに、化合物を時間放出製剤にして、例えば、好ましくは疎水性及び／又は両親媒性化合物を含む徐放性又は制御放出ポリマーを含む組成物にして投与することもできる。ペプチドを、化合物を迅速放出から保護するような担体と共に、インプラント及びミクロ被包化送達システムを含む制御放出製剤として製造することもできる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、ポリ乳酸及びポリ乳酸ポリグリコール酸のコポリマー類（ＰＬＧ）のような生分解性、生体適合性ポリマーが使用できる。そのような製剤の製造法は当業者には一般的に知られている。
【０１０９】
例えば、適切な制御放出送達用アンプルは、ペプチド、相同体、類似体又は誘導体を、溶融段階（melt stage）にある生腐食性、生分解性ポリ（ε−カプロラクトン）ポリマーマトリクスに分散させることによって製造できる。ただし、ペプチド又はタンパク質薬は、ポリ（ε−カプロラクトン）ポリマーの融点より高いガラス転移温度を有するガラス状マトリックス相、例えばＷａｎｇらが記載しているように（ＵＳＳＮ ６，１８７，３３０）、ペプチドと適切な熱保護剤（例えば、トレハロース、メレチトース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メリビオース、又はラフィノース）の水溶液を凍結乾燥して製造したガラス状マトリックス相、の中に分散している。
【０１１０】
注射用無菌溶液は、ペプチド、相同体、類似体又は誘導体を、必要に応じて前述の成分の１種類又は組合せと共に適当な溶媒に所要量配合し、次いでろ過滅菌することによって製造できる。一般的に、分散液は、活性ペプチド又は非ペプチド化合物を、塩基性分散媒体及び前述のその他の所要成分を含有する無菌ビヒクルに配合することによって製造する。注射用無菌溶液製造用の無菌粉末の場合、好適な製造法は真空乾燥及び凍結乾燥で、この方法により、活性成分と予めろ過滅菌したその溶液由来の何らかの追加の所望成分とを含む粉末が得られる。
【０１１１】
好ましくは、本発明のペプチド、又はその相同体、類似体もしくは誘導体は、特に慢性状態の治療用製剤においては、投与後の半減期を延長するように製剤化する。活性ペプチド化合物の半減期を延長する方法は、そのタンパク分解を削減するための直接的改変を含む。例えば架橋又はアミノ酸置換によって公知プロテアーゼのための部位を除去する。あるいは、任意の活性成分の半減期は、それを適切な製剤、例えば徐放製剤に被包化することによって延長できる。投与経路により、該ペプチド、相同体、類似体又は誘導体は、その不活化につながりかねない酵素類、酸類及び他の自然条件の作用から保護するための材料で被覆することができる。
【０１１２】
例えば、該ペプチド、相同体、類似体又は誘導体は、患者に、酵素阻害薬と共投与される適当な担体又は希釈剤に入れて、又はリポソームのような適当な担体に入れて投与できる。製薬上許容しうる希釈剤は、食塩水及び水性緩衝液を含む。酵素阻害薬は、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）及びトラジロールなどである。リポソーム類は、水中油中水型乳剤、並びに従来型リポソーム類である。
【０１１３】
分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール類、及びそれらの混合物中、並びに油中にも製造できる。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防止するために保存剤を含むことができる。
【０１１４】
本発明を以下の非制限的実施例を参照しながら説明する。
【実施例】
【０１１５】
実施例１
心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節する２０量体ペプチド
材料及び方法
材料
化学薬品及び生化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、キャッスルヒル）社から調達した。ＤＨＰＲ II-IIIループペプチド（配列番号１〜７）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａ ペプチド合成機を用いて合成し、ＨＰＬＣ及び質量分析及びＮＭＲを用いて純度≧９８％であることを確認した。ペプチドは、Ｈ2Ｏ中〜２ｍＭのストック溶液に調製し、２０μｌずつ凍結した。正確なストック溶液の濃度は、Ａｕｓｐｅｐ Ｐｔｙ Ｌｔｄにより酸加水分解とその後の標準化ＰＴＣ（フェニルチオカルバミル）プロトコルを用いて測定し、逆相ＨＰＬＣで分析した。
ペプチド
研究に使用した特定のペプチドは以下の通りである。
１．ＤＨＰＲのII-III細胞質ループの２０量体ペプチド（配列番号２）
【０１１６】
【化６】
【０１１７】
【化７】
３．ペプチドＡ１Ｓ（スクランブル化２０量体ペプチド；配列番号１２）
【０１１９】
【化８】
ＳＲ小胞の調製
ＳＲ小胞は、Ｌａｖｅｒら（１９９５，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４７：７−２２）の記述のように、ヒツジの心臓から単離した。
脂質二重層
実験は、本質的にＡｈｅｒｎら（１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５２：３６９−３７４）及びＬａｖｅｒら（１９９５，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４７：７−２２）に従い、２０℃〜２５℃で実施した。二重層は、１．０ｍｌのＤｅｌｒｉｎカップ（Ｃａｄｉｌｌａｃ Ｐｌａｓｔｉｃｓ、オーストラリア）壁の直径〜１００μｍのアパーチャに渡したホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリン（５：３：２ｗ／ｗ／ｗ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）から形成した。終末槽（ＴＣ）小胞（最終濃度、１０μｇ／ｍｌ）及び薬物を細胞質（すなわちシス）チェンバに加えた。二重層の電位を制御し、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ａ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて単一チャンネルの活性を記録した。実験の目的のために、シスチェンバは接地し、管腔（すなわちトランス）チェンバの電圧を制御した。二重層の電位は従来式にＶcis−Ｖtrans（すなわちＶcytoplasm−Ｖlumen）で表される。
二重層の溶液
二重層を前述のように形成し、２３０ｍＭのＣｓメタンスルホネート（ＭＳ）、２０ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2及び１０ｍＭのＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ、ＣｓＯＨでｐＨ７．４）を含有するシス溶液、及び３０ｍＭのＣｓＭＳ、２０ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2及び１０ｍＭのＴＥＳ（ｐＨ７．４）を含有するトランス溶液を用いて、小胞を二重層中に組み込んだ。
【０１２１】
二重層への複数のチャンネルの組込みを防止するために、チャンネルの活性を観察するときはシスチェンバの灌流によりシス溶液を交換した。シス灌流溶液は、［Ｃａ2+］が３×１０-7Ｍで、１ｍＭのＢＡＰＴＡを用いて緩衝した以外は初期のシス溶液と同一であった。ＣｓＭＳ（２００ｍＭ）をチャンネルの組込み後トランスチェンバに加え、対称溶液を作製した。
単一チャンネルの活性の記録とデータ分析
二重層の電位は、シスチェンバへのペプチドの各添加後、２分間にわたって３０秒ごとに変化させた。対照活性は、２００ｍＭのＣｓＭＳをトランスチェンバに添加後２分間記録した。次に活性を、各ペプチド分液（各チャンネルで６種類の異なるペプチド濃度を試験した）のシスへの添加後２分間記録した。ペプチドをシスチェンバから灌流によって取り出し、回収率を記録した。チャンネルは最後に３０μＭのルテニウムレッドに暴露した。
【０１２２】
電流は１ｋＨｚでフィルタにかけ（８極ローパス・ベッセル型フィルタ，−３ｄＢ）、５ｋＨｚでデジタル化した。単一チャンネルの記録の分析（ＰＷ Ｇａｇｅ及びＭ Ｓｍｉｔｈ開発のチャンネル２使用）から、チャンネルの開口確率（Ｐo）、事象頻度（Ｆo）、開口時間、閉鎖時間、及び平均の開口及び閉鎖時間（Ｔo又はＴc）並びに平均電流（Ｉ’）が得られた。事象弁別器は、通常の５０％でなく、最大電流の〜２０％のベースラインノイズ上に設定したので、分析にはサブコンダクタンス及び最大コンダクタンスレベルの両方に対する開口が含まれた。チャンネルの活性は、＋４０ｍＶにおける２回の３０秒間の連続活性と−４０ｍＶにおける２回の３０秒間の連続活性について分析した。
統計分析
平均データは、平均±ＳＥＭで示す。対照値と試験値間の差の有意性は、必要に応じて独立データ又は対応データについて、片側又は両側スチューデントＴ検定を用いて検定した。差は、Ｐ≦０．０５のとき有意であるとみなした。
実施例２
心ＲｙＲ２カルシウムチャンネルの活性を調節する２０量体ペプチド
結果
２０量体ペプチド（配列番号２）をチャンネルの細胞質（シス）側（１０-7ＭのシスＣａ2+濃度）に加えると、心筋のＲｙＲの活性に増加がみられた。二重層電位が＋４０ｍＶ又は−４０ｍＶでＣｓ+コンダクタンスが〜４５０ｐＳであること、及び実験終了時における３０μＭルテニウムレッドのチャンネル遮断能力により、単一チャンネルはＲｙＲと確認された。
【０１２３】
心ＲｙＲが２０量体ペプチド（配列番号２）によって強く活性化された一つの実験の記録を、−４０ｍＶの場合を図２に、＋４０ｍＶの場合を図３に示す。ペプチドを加える前のチャンネルの活性は、短い断続的な開口から成っていた（図２、パネルＡ；図３、パネルＡ）。６５ｎＭペプチド（配列番号２）の添加１０秒以内に−４０ｍＶではチャンネル開口が増加した。
【０１２４】
事象頻度の増加、及び非常に長時間の開口の出現は、二重層中の第二のチャンネルの開口に伴うものであった（図２、パネルＢ）。ペプチド濃度が６．５μＭ配列番号２に増加すると、−４０ｍＶでのＲｙＲ２チャンネルの活性はわずかに低下したが、第二のチャンネルの活性はより顕著になった。図２のパネルＣに示されているように、チャンネルは特に６５ｎＭペプチドで高い開口確率（Ｐｏ）を示す（チャンネルが完全開口した場合に期待される主電流レベル、Ｏ）。
【０１２５】
記録は、単一チャンネルの活性の増大は単一チャンネルのコンダクタンスの何らかの変化に関連するものではなかったことを示している。
チャンネルの活性は、二重層の電位が＋４０ｍＶの場合でも、６５ｎＭの２０量体ペプチド（配列番号２）で増加した（図３、パネルＢ）。しかしながら、チャンネルの活性の増大は同じチャンネルで−４０ｍＶで観察されたものより小さかった（図２、パネルＢ）。
【０１２６】
−４０ｍＶの二重層電位におけるチャンネルの活性はペプチド濃度が高くなると増大するが、＋４０ｍＶにおけるチャンネル開口は約１００ｎＭペプチドを超える濃度になると減少し始め、１０μＭペプチドでは低いコンダクタンスレベルのためにほんのわずかな短いチャンネル開口しか観察されなかった（図３、パネルＣ）。本発明をいずれか一つの理論又は作用様式に制限するつもりはないが、チャンネル開口が主に準最大コンダクタンスによる＋４０ｍＶでの活性の低下は、ペプチド（配列番号２）がチャンネルの活性化時に結合する部位とは明らかに異なる低親和性の部位に結合するためと思われる。これらの低親和性部位はおそらくチャンネルポア内にあるのであろう。
【０１２７】
脂質二重層中の心ＲｙＲ２チャンネルの同様の活性化及び阻害は、８個の二重層サンプル中８個で得られた。単一チャンネルの分析は、ほとんどの二重層が１よりも多いチャンネルを含有していたため実施しなかった。すべてのサンプルが、シスチェンバへのペプチド（配列番号２）添加後、＋４０ｍＶ及び−４０ｍＶで高い開口頻度を有していた。さらに、１０-7ＭのシスＣａ2+で、ペプチドの不在下で検出されたものと比べて、ペプチドの存在下−４０ｍＶの電位では延長されたチャンネル開口が生じた。
【０１２８】
平均電流（すなわち、各電位及び各ペプチド濃度における２回の３０秒間の記録中の全データポイントの平均をレコーディング中に見られたチャンネル数で割ったもの）からチャンネル活性の基準が得られた。図４に、正規化平均電流の平均をペプチド濃度の関数として示す。整数Ｉ’ｐ／Ｉ’ｃは、ペプチド存在下の平均電流の、チェンバへのペプチド添加前の平均電流に対する比である。二重層電位−４０ｍＶ又は＋４０ｍＶで、平均電流に顕著な増加（〜２倍）が１０ｎＭペプチド（配列番号２）に検出された。−４０ｍＶにおける平均電流は５０μＭペプチド（配列番号２）でさらに４倍にまで増加した。これに対し、＋４０ｍＶにおける正規化平均電流は１０ｎＭペプチド（配列番号２）で２倍になり、約１０μＭのペプチドまで上昇したままであったが、さらに高いペプチド濃度（すなわち約１０μＭ〜５０μＭの間）で劇的に降下した。
【０１２９】
２０量体ペプチド（配列番号２）による心ＲｙＲ２チャンネルの活性化の特異性についても試験した。１μＭシスペプチドＮＢ（配列番号８）又は１０μＭシスペプチドＮＢでは、＋４０ｍＶ又は−４０ｍＶの二重層電位でチャンネルの活性の調節は観察されなかった（ｎ＝３；図４）。試験の２０量体ペプチドと同じ等電点を持つが非相同配列であるスクランブル化配列（すなわちペプチドＡ１Ｓ；配列番号９）は高濃度（すなわち１μＭシスペプチド又は１０μＭシスペプチド）で存在すると、他の２個の二重層中２個で心ＲｙＲ２チャンネルの活性を低下させた（図４）。
【０１３０】
データは、２０量体ペプチド（配列番号２）による活性化は心ＲｙＲ２チャンネルへの結合を反映していることを強く裏付けている。
本発明を決して制限するつもりはないが、高濃度の２０量体ペプチド（配列番号２）およびペプチドＡ１Ｓの＋４０ｍＶでの心ＲｙＲ活性を阻害する能力は、予期していたことではあるが、心筋及び骨格筋のＲｙＲとも、ポア又はその入口にペプチドの正荷電残基と相互作用できる相当数の負部位を含有することを示唆している。ペプチドＡ１Ｓでは活性化なしに阻害が持続するという事実は、活性化と阻害は２０量体ペプチド（配列番号２）のＲｙＲ２チャンネル上の２つの別の部位への結合によって決まるということの更なる証拠となる。
実施例３
ＤＨＰＲ２０量体フラグメントの誘導体及び類似体の機能分析
材料及び方法
ペプチド
このシリーズの実験では４種類のペプチドを試験した。すなわち：
(i)天然のＤＨＰＲ２０量体ペプチド（配列番号２）；
(ii)配列番号２のペプチドのＳｅｒ687（残基１７）がアラニン残基に置換されてできた配列番号８；
(iii)配列番号２のペプチドのＡｒｇ688（残基１８）がＤ異性体に置換されてできた配列番号９；及び
(iv)配列番号２のペプチドのＳｅｒ687がアラニンに変異し、Ａｒｇ688がＤ異性体に置換されてできた配列番号１０である。
心ＳＲからのＣａ 2+ 放出の測定
心ＳＲ小胞（５０μｇのタンパク質）を、キュベットに、１００，ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ＝７）；４，ＭｇＣｌ2；１，Ｎａ2ＡＴＰ；０．５，アンチピリルアゾ(antipyrylazo)III（以上単位ｍＭ）を含有する最終体積２ｍｌの溶液に加えた。小胞外［Ｃａ2+］をＣａｒｙ５０又はＣａｒｙ１００分光光度計のいずれかを用いて７１０ｎｍでモニタした。７９０ｎｍにおける同一の実験ではＯＤに何の変化もなく、７１０ｎｍで測定されるＣａ2+放出速度を変えるであろう［Ｃａ2+］の変化に無関係であった。小胞に、５ｍＭＣａＣｌ2の３μｌアリコートを４回加えることによってＣａ2+を装填し、最終濃度７．５μＭのＣａ2+とした。次に、タプシガーギン(thapsigargin)（２００ｎＭ）を加えてＳＲのＣａ2+ＡＴＰアーゼを遮断した。最後に、ペプチドを単独で、又は２０μＭのＣａ2+もしくは２ｍＭのカフェインと共に加えた。タプシガーギン存在下でのＣａ2+放出速度は活性化剤添加直前に測定し、初期のＣａ2+放出速度は活性化剤添加直後に測定した。次に、ＲｙＲ活性の特異的ブロッカーである５μＭのルテニウムレッドを加え、Ｃａ2+放出がＲｙＲチャンネルを通じてであることを確認した。Ｃａ2+イオノホアＡ２３１８７（３μｇ／ｍｌ）を実験終了時に加え、ＳＲ小胞に残っているＣａ2+の量を測定した。Ｃａ2+放出完了時に、イオノホア添加後のＣａ2+の変化(transient)は、ＲｙＲチャンネルを通じて放出できなかったＣａ2+を含有する小胞のフラクションを示すものであった（おそらくＲｙＲチャンネルを欠く縦ＳＲ由来の小胞であろう）。結果は、わずか１０〜２０％の心ＳＲ標本しかＲｙＲ調節ストアを含有していなかったことを示した。３個の異なるヒツジ心標本から単離した小胞について実験を繰り返した。
単一チャンネル実験
シス溶液中のＣａ2+濃度は１００ｎＭに緩衝されるか、又はＢＡＰＴＡの不在下でシス溶液にＣａＣｌ2を加えることによって１００μＭに調整した。
実施例４
ＤＨＰＲ２０量体ペプチドフラグメントの誘導体及び類似体の機能分析
結果
まとめ
実施例４の実験は、心ＳＲ小胞からのＣａ2+放出に関する全化合物の試験を含む。加えて、単一の心ＲｙＲチャンネルを配列番号９のペプチドに暴露した。すべてのペプチドは、Ｃａ2+活性化Ｃａ2+放出又はカフェイン活性化Ｃａ2+放出速度を著しく増強した。配列番号９及び１０のペプチドは、＞３０μＭの高濃度で活性化するＣａ2+又はカフェインの不在下、Ｃａ2+の放出速度を辛うじて増強し、またＣａ2+活性化Ｃａ2+放出及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出の両方も増強した。配列番号９のペプチドは、脂質二重層中の実験で心ＲｙＲの活性を低濃度では（１〜１０ｎＭ）増大させたが、高濃度では＋４０ｍＶでチャンネルポアを電位依存的及びＣａ2+依存的に遮断した。従って、適当な生理的条件下では、ジヒドロピリジン受容体フラグメントペプチドは、心Ｃａ2+放出チャンネルに結合し、心ＳＲからのＣａ2+放出を活性化することができる。
心ＳＲからのＣａ 2+ 放出に及ぼすＡペプチドの影響
配列番号２、８、９及び１０で定義されるペプチドの、追加の活性化因子不在下における心ＳＲからのＣａ2+放出能を測定した。ペプチドを小胞外溶液に加え、ペプチド添加直後に初期のＣａ2+放出速度を測定した。４種類のペプチドの平均データを図５に示す（小記号）。３０μＭ及び５０μＭの濃度ですべてのペプチドに放出速度のわずかな増加がみられた。
【０１３１】
ペプチドがＣａ2+活性化Ｃａ2+放出及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出に及ぼす影響を調べた。Ｃａ2+活性化は、心収縮時のインビボにおけるＲｙＲ活性化の主要機序である。Ｃａ2+活性化機序は、ＳＲ小胞からのＣａ2+活性化及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出の両方に関与している。なぜならば、カフェインの主作用はＣａ2+活性化曲線をずっと低いＣａ2+濃度にシフトさせることだからである。１００ｎＭまで（〜１００ｎＭ）の静止Ｃａ2+濃度は、カフェインの存在下でＣａ2+放出を活性化する。２０μＭＣａ2+及び２ｍＭカフェインに誘発される初期Ｃａ2+放出速度は類似しており、これらの実験では１分間当たり１ｍｇのＳＲタンパク質につき〜１０μモルのＣａ2+であった。ペプチドがＣａ2+誘発Ｃａ2+放出及びカフェイン誘発Ｃａ2+放出に及ぼす影響も類似しており、二つの活性化法で得られたデータは図５に示した平均データの中にまとめてある。明らかに、４種類の各ペプチドは、小胞外溶液に加えた場合、心ＳＲ小胞からのＣａ2+／カフェイン活性化Ｃａ2+放出を増加させることができた。すべての実験で、Ｃａ2+の放出はルテニウムレッドの添加で終了し、放出がＲｙＲチャンネルを通してであることを示した。４種類の各ペプチドの最大Ｃａ2+放出速度は対照より２〜２．５倍大きく、２０〜３０μＭペプチドで達成された。４種類のペプチドは、Ｃａ2+放出速度が高ペプチド濃度で低下傾向にあるという点で、二相性の作用があるようであった。
【０１３２】
ペプチドはいずれも、心ＳＲからのＣａ2+放出において、またＣａ2+／カフェイン活性化Ｃａ2+放出の増強において、類似した潜在能力を示した。非Ｃａ2+／カフェイン活性化チャンネルからの放出は小さすぎてペプチド間の差を捉えられないということはあり得る。本発明を決して制限するつもりはないが、ペプチドがＣａ2+／カフェイン活性化Ｃａ2+放出に及ぼす影響間のこの類似性は、ＲｙＲチャンネルは活性化剤だけでほぼ最大限に開口するため、ペプチドによってさらに活性化される許容能力は限られているという事実を反映したものであろう。
単一の心ＲｙＲチャンネルの活性に及ぼすペプチド配列番号９の影響
脂質二重層中の単一の心ＲｙＲチャンネルの活性に及ぼす配列番号９の作用を調べた。ペプチドをまず、１００μＭのシスＣａ2+を有する心ＲｙＲチャンネルの細胞質（シス）側に加えた。該ペプチドはチャンネルを活性化できなかった（図６）。
【０１３３】
ペプチド配列番号９を二重層溶液に加えたときに誘発された心ＲｙＲチャンネルの活性の低下は、−４０ｍＶより＋４０ｍＶで大きく、ペプチド配列番号２による骨格筋ＲｙＲチャンネルの電位依存性（すなわち電流方向依存性）遮断と類似していた。活性の低下は、正荷電の配列番号９のペプチドがイオンチャンネルに入り、ポア内の負電荷と会合するのと合致する。遮断は、電流がシスからトランスへ流れてペプチドをポア内に運ぶと増強されるが、電流がトランスからシスへ流れてペプチドをポアから運び出す傾向にあると部分的に逆転する。
【０１３４】
２ｍＭのＢＡＰＴＡで緩衝した、濃度１００ｎＭのペプチドのシスＣａ2+を使用した。ペプチド配列番号９による心チャンネルの強い活性化によって、正及び負電位の両方で相対平均電流に１０〜２０倍の増加が起こった（図７）。わずか１０ｎＭのペプチドでも活性に顕著な増加があり、１００ｎＭのペプチドで最大の活性化が観察された。＋４０ｍＶでの高いペプチド濃度（１及び１０μＭ）における相対平均電流の降下は、ペプチドの残余遮断作用を示していた。
【０１３５】
このペプチドが、心ＲｙＲの平均単一チャンネルパラメータに及ぼす影響を測定し、平均データを図８に示す。該ペプチドは、−４０ｍＶで〜５０倍の開口確率の増加を、＋４０ｍＶで〜１０倍の増加を引き起こした。この活性の増加は、両方の電位で平均開口時間が８倍に増加したこと、＋４０ｍＶ及び−４０ｍＶで平均閉鎖時間がそれぞれ８０分の１又は１７０分の１に減少したこと、そして対応する事象頻度が増加したことによるものであった。このように、チャンネル開閉に及ぼす該ペプチドの主作用は平均閉鎖時間に対してである。
【０１３６】
従って、ＤＨＰＲ II-IIIループの配列番号２のペプチドは、心ＲｙＲチャンネルと心ＳＲ小胞からのＣａ2+放出を活性化できる。天然ペプチドがＣａ2+を放出するだけでなく、増強されたらせん構造を持ち、好ましくはＲＫＲＲＫ配列を含有するいくつかの他のペプチドもＣａ2+放出に対して同じ作用を示す。
【０１３７】
当業者であれば、本明細書中に記載の本発明は、具体的に記載したもの以外の変形及び修正が可能であることは理解されよう。そのようなすべての変形及び修正も本発明に含まれることは理解されるはずである。本発明はまた、本明細書中に個々に又はまとめて引用した又は提示したすべてのステップ、特徴、組成物及び化合物、並びに、前記ステップ又は特徴の任意の組合せ及びすべての組合せまたはいずれか二つ以上、を含む。
【０１３８】
本発明は、本明細書中に記載した具体的な態様によって発明の範囲を制限されない。記載した具体的な態様は説明を目的としたものである。機能的に等価の生成物、組成物及び方法は、本明細書に記載の通り、明らかに本発明の範囲に含まれる。
【０１３９】
【表２−１】
【表２−２】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、いくつかの心筋及び骨格筋ＤＨＰＲポリペプチドの細胞質ループの位置合わせしたアミノ酸配列を示した略図である。すなわち、ヒト骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号２；Ｄｒｏｕｅｔら、１９９３）；マウス骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号３；Ｃｈａｕｄｈａｒｉ、１９９２）；ウサギ骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号４；Ｔａｎａｂｅら、１９８７）；ウサギ心筋ＤＨＰＲ−１（配列番号５）；ラット心筋ＤＨＰＲ−１（配列番号６）；及びウシガエル骨格筋ＤＨＰＲ−３（配列番号７；Ｚｈｏｕら、１９９８）である。利用可能な配列の比較に基づき、コンセンサス配列（配列番号１）を太字で示す。ＮＢ（配列番号８）及びＡ１Ｓ（配列番号９）で示した非特異的ペプチドのアミノ酸配列も示す。
【図２】図２は、脂質二重層中の単離した心ＲｙＲ２の細胞質（シス）側に加えた骨格筋ＤＨＰＲ細胞質ループの２０量体ペプチド（配列番号２）が、−４０ｍＶで測定した場合、シス１０-7ＭのＣａ2+の存在下で心ＲｙＲ２の活性を増大させることを示すグラフ図である。単一チャンネルの活性は、−４０ｍＶで、添加ペプチドの不在下（パネルＡ）又は６５ｎＭペプチド（パネルＢ）もしくは６．５μＭペプチド（パネルＣ）の存在下のいずれかで測定した。
【０１４２】
左側の各パネルで、下方のチャンネル開口は−４０ｍＶで示され、ゼロ電流（閉鎖）レベルは点線“Ｃ”で示され、最大の単一チャンネルコンダクタンスは実線“Ｏ”で示されている。二つのチャンネルはペプチドの添加後、−４０ｍＶで二重層中で活性である。
【０１４３】
右側の各パネルは、３０秒間の記録時間中の全ポイントを示すグラフ図である。ｘ軸上の数字はチャンネル開口の振幅を示し、横座標は各振幅における全開口の割合を示す。負数は−４０ｍＶにおける負（内側）チャンネル電流を示す。
【図３】図３は、細胞質（シス）溶液に加えた骨格筋ＤＨＰＲ細胞質ループの２０量体ペプチド（配列番号２）が、＋４０ｍＶで、シス１０-7ＭのＣａ2+の存在下で心ＲｙＲ２の活性を増大させ、次いで低下させることを示すグラフ図である。単一チャンネルの活性は、＋４０ｍＶで、添加ペプチドの不在下（パネルＡ）又は６５ｎＭペプチド（パネルＢ）もしくは３２．５μＭペプチド（パネルＣ）の存在下のいずれかで測定した。
【０１４４】
左側の各パネルで、上方のチャンネル開口は＋４０ｍＶで示され、ゼロ電流（閉鎖）レベルは点線“Ｃ”で示され、最大の単一チャンネルコンダクタンスは実線“Ｏ”で示されている。チャンネルは６５ｎＭの濃度ではほとんど開口の形態である。これに対し、チャンネルはペプチドの不在下、又は３２．５μＭペプチドではほとんど閉鎖の形態である。
【０１４５】
右側の各パネルは、３０秒間の記録時間中の全ポイントを示すグラフ図である。ｘ軸上の数字はチャンネル開口の振幅を示し、横座標は各振幅における全開口の割合を示す。数字は＋４０ｍＶにおけるチャンネル開口を示す。
【図４】図４は、平均正規化平均電流（横座標）を、−４０ｍＶ（パネルＡ）及び＋４０ｍＶ（パネルＢ）における細胞質溶液中のペプチド濃度（すなわちｌｏｇ10［ペプチド（ｎＭ）］）の関数（ｘ軸）として示すグラフ図である。正規化平均電流（Ｉ’ｐ／Ｉ’ｃ）は、ペプチド存在下の平均電流（すなわちＩ’ｐ）の、ペプチド不在の対照条件下の平均電流（すなわちＩ’ｃ）に対する比である。データは、平均の平均電流±ＳＥＭを示す。サンプルは、配列番号２に示した骨格筋ＤＨＰＲ細胞質ループの２０量体ペプチド（ｎ＝８、●）、又は配列番号８に示した非特異的ペプチドＮＢ（ｎ＝２、▲）、又は配列番号９に示した非特異的ペプチドＡ１Ｓ（ｎ＝３、■）のいずれかを含有する。１．０を超える正規化平均電流は、ペプチドによる心ＲｙＲ２チャンネルの活性化を示す。従って、データは、＋４０ｍＶの場合１０μＭまでのペプチド（配列番号２）によって、又は−４０ｍＶの場合さらに高い濃度によって、心ＲｙＲ２チャンネルが著しく活性化されたことを示す。
【図５】図５は、主題のペプチドが心ＳＲ小胞からのＣａ2+及びカフェイン活性化Ｃａ2+放出を増加させることを示すグラフ図である。初期のＣａ2+放出速度は、対照条件下、又は横座標に示した濃度の小胞外溶液に、２０μＭのＣａ2+又は２ｍＭのカフェインのいずれかを添加後（ゼロのペプチド濃度で）、及びペプチドのみの添加後（小記号）、又は２０μＭのＣａ2+又は２ｍＭのカフェインとペプチドの添加後（大記号）のものである。Ｃａ2+放出速度は、１分当たり、ＳＲ小胞のタンパク質のｍｇ当たり、Ｃａ2+のμモルで与えられる。データは、配列番号２（黒丸）、配列番号８（黒四角）、配列番号９（白丸）及び配列番号１０（白四角）について示す。結果は、各濃度について少なくとも５回観察した平均±ＳＥＭで与えられている。
【図６】図６は、シス（細胞質）Ｃａ2+濃度１００μＭで、脂質二重層に組み込まれたＲｙＲチャンネルを通って流れる平均電流に及ぼす配列番号９の影響を示すグラフ図である。データは、二重層電位−４０ｍＶ（上のグラフ）及び＋４０ｍＶ（下のグラフ）における６０秒間の記録から得た。データポイントは、６個の実験の平均相対平均電流（ペプチド存在下の平均電流を対照条件下の平均電流で割ったもの）を示し、縦線は±１ｓｅｍを示す。チャンネルの活性は明らかにペプチドによって濃度依存的に抑制され、１００ｎＭのペプチドで最大の影響が見られる。１００ｎＭペプチドでの抑制は−４０ｍＶより＋４０ｍＶ（アスタリスク）で著しく大きかった。
【図７】図７は、シス（細胞質）Ｃａ2+濃度１００ｎＭで、脂質二重層に組み込まれたＲｙＲチャンネルを通って流れる平均電流に及ぼす配列番号９の影響を示すグラフ図である。データは、二重層電位−４０ｍＶ（上のグラフ）及び＋４０ｍＶ（下のグラフ）における６０秒間の記録から得た。データポイントは、７個の実験の平均相対平均電流（ペプチド存在下の平均電流を対照条件下の平均電流で割ったもの）を示し、縦線は±１ｓｅｍを示す。チャンネルの活性は明らかにペプチドによって濃度依存的に増強され、１００ｎＭのペプチドで最大の影響が見られる。＞１００ｎＭペプチドでの抑制が＋４０ｍＶでみられ、何らかのポア遮断を示している。
【図８】図８は、配列番号９が単一チャンネルのパラメータに及ぼす影響をペプチド濃度の関数として示したグラフ図である。データは−４０ｍＶ（左パネル）及び＋４０ｍＶ（右パネル）で示されている。最上部のグラフはチャンネルの開口確率を示し、二番目のグラフは平均開口時間を、その次は平均閉鎖時間を、最後はチャンネルの開口頻度を示している。データポイントは、７個の実験の平均パラメータ値を示し、縦線は±１ｓｅｍを示す。チャンネルの閉鎖時間の減少、及びその結果としての頻度の増加が開口確率の増加に最も強く寄与している。
Claims (55)
- 心リアノジン受容体カルシウムチャンネルの活性を調節する方法であって、心リアノジンチャンネルを、前記リアノジンチャンネルの活性を調節するに足る量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又は誘導体、相同体もしくは類似体と接触させることを含む方法。
- 前記方法が、前記心リアノジンカルシウムチャンネルの活性を測定する追加のステップを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記調節がアップレギュレーションである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記フラグメントが約１ｎＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で適用される、請求項３に記載の方法。
- 前記調節がダウンレギュレーションである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記フラグメントが約１０μＭを上回る濃度で適用される、請求項５に記載の方法。
- 前記フラグメントが、ペプチド配列：
- 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチド配列がモチーフ：
ＲＫＲＲＫ
を含む、請求項７に記載の方法。 - 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記フラグメントが塩基性荷電フラグメントである、請求項１１に記載の方法。
- 心リアノジンカルシウムチャンネルのペプチド又は非ペプチドモジュレーターを同定する方法であって、
(i)心リアノジンチャンネルの活性を調節する量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を、機能性心リアノジンカルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；
(ii)候補のペプチド又は非ペプチド化合物を、前記機能性心リアノジンカルシウムチャンネルの存在下、カルシウムチャンネルの活性が前記ジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体によって調節されるのに適当な条件下でインキュベートして該チャンネルの活性を測定し；そして
(iii)(i)及び(ii)における活性を比較することを含む方法。 - 前記調節がアップレギュレーションである、請求項１３に記載の方法。
- 前記フラグメントが約１ｎＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で適用される、請求項１４に記載の方法。
- 前記調節がダウンレギュレーションである、請求項１５に記載の方法。
- 前記フラグメントが約１０μＭを上回る濃度で適用される、請求項１６に記載の方法。
- 前記フラグメントが、ペプチド配列：
- 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチド配列がモチーフ：
ＲＫＲＲＫ
を含む、請求項１８に記載の方法。 - 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記フラグメントが塩基性荷電フラグメントである、請求項２２に記載の方法。
- (i)心リアノジンカルシウムチャンネルの候補アゴニスト又はアンタゴニストを同定し；
(ii)実際に心リアノジンチャンネルを活性化又は阻害する(i)の化合物を決定し；
(iii)(ii)のどの化合物が配列番号１〜１０のいずれか一つより前記心リアノジンカルシウムチャンネルに対して高い結合親和性を有しているかを決定し；そして
(iv)場合により、(iii)の化合物と前記心リアノジンカルシウムチャンネル間の相互作用部位を決定することを含むプロセス。 - 心リアノジンチャンネルが開口しているか又は高いチャンネル開口確率を有しているかどうかを決定する方法であって、前記方法は、心リアノジンチャンネルを、ある量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントに、リアノジンへの結合が起こるに足る時間及び条件下で接触させ、前記ペプチドのリアノジンへの結合を測定することを含み、前記ペプチドのリアノジンへの結合は高いチャンネル開口確率を示し、ペプチドのチャンネルポアへの非特異的なペプチドの結合は低いチャンネル開口確率を示す方法。
- 前記フラグメントが、ペプチド配列：
- 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチド配列がモチーフ：
ＲＫＲＲＫ
を含む、請求項２６に記載の方法。 - 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記フラグメントが塩基性荷電フラグメントである、請求項３０に記載の方法。
- ヒト又は動物患者における心機能不全の治療法であって、有効量のジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントを、増強された心収縮が起こるに足る時間及び条件下で投与し、それによって前記心機能不全を矯正することを含む方法。
- 前記心機能不全が、心筋収縮不全、虚血性心疾患、敗血症のような全身性炎症状態、心肥大（カルシウム過負荷）、催不整脈性右室異形成２型（ＡＲＶＤ２）、及び薬物（例えばコカイン）性心筋症のような心筋症、心筋梗塞、律動異常、鬱血性心不全、又は心臓発作である、請求項３０に記載の方法。
- 前記フラグメントが、ペプチド配列：
- 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチド配列がモチーフ：
ＲＫＲＲＫ
を含む、請求項３２又は３３に記載の方法。 - 前記ペプチド配列が以下のペプチド配列：
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記フラグメントが塩基性荷電フラグメントである、請求項３８に記載の方法。
- 心リアノジンカルシウムチャンネルの活性を調節し、それによってカルシウムシグナリングの欠陥を調節するための、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を含むジヒドロピリジン受容体ペプチドのフラグメントの使用。
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項４０に記載の使用。
- 前記カルシウムシグナリングの欠陥が、慢性心肥大、拡張型心筋症又は心不全を誘発する、請求項４０又は４１に記載の使用。
- 前記ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体が、収縮力を増強し、さらに収縮期に細胞内カルシウム濃度（すなわち［Ｃａ2+］i）を増加させ、さらに拡張期に［Ｃａ2+］iを減少させることができる用量として投与される、請求項４０又は４１に記載の使用。
- 前記ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体が、収縮期の［Ｃａ2+］iに比べて収縮期の［Ｃａ2+］iに少なくとも約３％又は５％の増加を誘導する、請求項４３に記載の使用。
- 前記ペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体が、拡張期の［Ｃａ2+］iに比べて拡張期の［Ｃａ2+］iに少なくとも約３％又は５％の減少を誘導する、請求項４３に記載の使用。
- それぞれ収縮期の［Ｃａ2+］i又は拡張期の［Ｃａ2+］iに比べて、少なくとも約１０％又は１５％、更に好ましくは少なくとも約２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％、前記収縮期の［Ｃａ2+］iが増加し、又は拡張期の［Ｃａ2+］iが減少する、請求項４４又は４５の記載の使用。
- 前記投与されたペプチドが、心収縮の効率に改善をもたらす、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の使用。
- 前記心収縮が、投与後０．５〜１．０時間以内にプレロード・リクルータブル・ストローク・ワークの少なくとも約５％又は１０％の増加を誘導することによって増強される、請求項４７に記載の使用。
- 前記心収縮が、約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％又は７０％増強される、請求項４８に記載の使用。
- ヒト又は動物患者における心機能不全の治療のための医薬製造における、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチド又はその相同体、類似体、もしくは誘導体の少なくとも５個の連続アミノ酸残基を含むジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメントの使用。
- 前記心機能不全が、心筋収縮不全、虚血性心疾患、敗血症のような全身性炎症状態、心肥大（カルシウム過負荷）、催不整脈性右室異形成２型（ＡＲＶＤ２）、及び薬物（例えばコカイン）性心筋症のような心筋症、心筋梗塞、律動異常、鬱血性心不全、又は心臓発作である、請求項５１に記載の使用。
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項５０又は５１に記載の使用。
- ジヒドロピリジン受容体ポリペプチドのフラグメント又はその相同体、類似体もしくは誘導体を１種類以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤と共に含む医薬組成物であって、前記ペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか一つに示したペプチドの少なくとも約５個の連続アミノ酸残基を含む、医薬組成物。
- 前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個の連続アミノ酸残基を含む、請求項５３に記載の医薬組成物。
- 請求項３２〜３９のいずれが１項に記載の方法に従って使用される場合の、請求項５３又は５４に記載の医薬組成物。
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