JP2004535161A - ヒト・セルピン・ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、サイピン、およびヒト・セルピン・ポリペプチドファミリーの他の新規メンバー、サイピン・ポリペプチドを作成する方法、およびこれらのポリペプチドを用いて多様な医学的障害を治療する方法、並びにサイピン・ポリペプチド活性をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズする化合物に関してスクリーニングする方法に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて、米国仮出願第６０／２７４，５１９号、２００１年３月８日提出；および米国仮出願第６０／２７４，５２２号、２００１年３月８日提出の優先権を主張し、前記出願の開示は、本明細書に完全に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、サイピン（Ｔｈｙｐｉｎ）およびヒト・セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）・ポリペプチドファミリーの他の新規メンバー、並びにこうしたセルピン・ポリペプチドを作成し、そして使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
「セルピン」は、一本鎖４０〜６０ｋＤａタンパク質群のメンバーに与えられる名称であり、この多くは、ファミリーの名称が元来由来する活性である、セリンプロテアーゼ阻害剤である（概説には、例えば、Ｂｉｒｄ， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２４：６３−８９（１９９８）；Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ １０（１）：１−１１（１９９７）；Ｗｏｒｒａｌｌら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ２７（４）：７４６−５０（１９９９）；およびＩｒｖｉｎｇら， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １０：１８４５−６４（２０００）を参照されたい）。セルピンは一次アミノ酸配列レベルで保存され、そしてその三次構造においてもまた保存される。セルピン・ファミリーメンバーは、一般的に、約１５〜５０％のアミノ酸配列同一性を共有する。セルピンの三次元コンピューター生成モデルは実質的に重ね合わせ可能である。セルピンは、脊椎動物および動物ウイルス、植物および昆虫で発見され、そしてこのスーパーファミリーの同定されたメンバーは３００近い。
【０００４】
セルピンは、細胞内または細胞外空間に局在することが可能であり、後者は古典的なＮ末端シグナル配列に仲介される。セルピン・ファミリーのサブセット、オボアルブミン様セルピン（または「オブ−セルピン（ｏｖ−ｓｅｒｐｉｎｓ）」）は、Ｎ末端近くに見出される切断不能条件的（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）シグナル配列を有する（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１５：１０５−１０８（１９９３））。この非規範的シグナル配列を所持するオブ−セルピンは、細胞の内側および外側両方に二重局在を示すことが可能であり、そして異なる細胞内および細胞外プロテアーゼを阻害すると推測される。二重局在を持つセルピンの例は、ＰＡＩ−２である。この二重局在の制御は、扁平上皮癌におけるＳＣＣＡなど、多様な病理に関連する血漿レベル上昇を生じる可能性がある（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ、１９９７）。
【０００５】
阻害性セルピンの多くに標的を提供するセリンプロテアーゼは、生物学の多くの側面に関与し、そしてこれらを制御するが、これらの側面には：細胞外マトリックスの分解（エラスターゼなど）、血管止血（凝血におけるトロンビン、血栓溶解におけるプラスミンなど）、補体活性化（補体因子など）、炎症および高血圧における血管拡張（カリクレインなど）、および消化（トリプシンなど）が含まれる。白血球は細胞傷害反応に関与する多くの異なるセリンプロテアーゼ（例えばグランザイム、キマーゼ）を産生し、そして小胞中に貯蔵する。セルピンはまた、細胞遊走にも役割を果たす。
【０００６】
セルピン・ファミリーメンバーは、タンパク質フォールディングのシャペロン、貯蔵タンパク質、および輸送ホルモンとして働くことを含め、多様な細胞内および細胞外プロセスに関与する。阻害性セルピンは、多くの重要な生物学的活性に関与し、これらには：補体活性化；線維素溶解；凝血；細胞分化；腫瘍抑制；および腫瘍生存に関与する選択プロセス（すなわちアポトーシスおよび細胞遊走）が含まれる。セルピン中の突然変異は、いくつかの疾患を引き起こすことが可能であり、このうちいくつかはセルピン重合に関与する（Ｉｒｖｉｎｇら、２０００）。こうした疾患には、例えば凝血障害、肺気腫、肝硬変および痴呆が含まれる。
【０００７】
多くのセルピンは、ヒト血漿中に比較的高レベルで見られる。血漿セルピンは、多様にグリコシル化されているが、このグリコシル化は、活性に必要でない可能性がある（Ｐｏｔｅｍｐａら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１５９５７（１９９４））。これらには、結合組織の再構築に関与するα１アンチトリプシン（α１ＡＴ）；補体活性化を調節するＣ１阻害剤；線維素溶解を調節するのを補助する、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１および２（ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２）；および凝血カスケードを制御するのに関与するアンチトロンビンが含まれる。やはり血液に存在するのは、切断されると、血圧を調節するのを補助する血管収縮性ペプチドを生じるアンギオテンシノーゲンと共に、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）およびコルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）である。ＴＢＧのタンパク質分解切断は、チロキシンの部位特異的放出のための機構を提供するようである（Ｓｃｈｕｓｓｌｅｒ， Ｔｈｙｒｏｉｄ １０（２）：１４１−４９（２０００））。セルピンであるマスピン（ｍａｓｐｉｎ）、ＰＡＩ−２およびα１ＡＴは、特定の状況下で、重合可能である（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ、１９９７）。ＡＴ−ＩＩＩなどのいくつかのセルピンは、ヘパリンなどのポリ硫酸化オリゴ糖に活性化されると、はるかにより高いレベルの阻害活性を達成する（Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９４）。ヘパリン補助因子ＩＩに結合することが示された他のセルピンには、プロテアーゼ、ネキシン−１、活性プロテインＣ阻害剤およびＰＡＩ−１が含まれる（Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９４）。
【０００８】
オブ−セルピンは、ニワトリ・オボアルブミンと比較的高い度合いの相同性を持つことによって特徴付けられる。オブ−セルピンは、例えば、Ｗｏｒｒａｌｌら、１９９９およびＲｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９３に概説される。オブ−セルピンは、一般的に、８つのエクソン、７つのイントロン、および非常に保存されたイントロン−エクソン境界を有するが、オブ−セルピンＰＩ−６は７つのエクソンおよび６つのイントロンしか持たない。オブ−セルピンは、典型的には、他のセルピンに見られる伸長されたＮ末端およびＣ末端領域を欠く。さらに、これらはアミノ末端近くに内部疎水性配列を所持し、該配列は、タンパク質が発現される細胞の種類または細胞の分化状態に応じて、分泌および細胞内保持両方を可能にする。オブ−セルピンは、他のセルピンより、互いにより高い度合いのアミノ酸相同性を有する（例えばセルピンは互いに４０％〜５０％相同であるが、他のセルピンとは約３０％しか相同でない）。さらに、オブ−セルピンは、Ｃ末端に最後から２番目のセリンを有し、そしてほぼ同一のスプライシング−結合部位置を有する。オブ−セルピンは、大部分細胞内であるが、いくつかは分泌されると共に細胞内でも見出される（例えばマスピンおよびＰＡＩ−２）。
【０００９】
セルピンが関連付けられている他の生理学的プロセスには、腫瘍浸潤の防止（マスピン）、貯蔵（オボアルブミン）およびタンパク質フォールディングにおけるシャペロンとしての機能（ＨＳＰ４７）が含まれる（例えば、Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２３（２）：６３−６７（１９９８）；Ｓａｕｋら， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３７（１−２）：１０５−１１９（１９９８）を参照されたい）。熱ショックタンパク質ＨＳＰ４７は、コラーゲン・プロセシングにおける役割に関して主に研究されているが、ときに小胞体から逃れて、そして細胞表面に達し、このことからＳａｕｋらは、癌細胞の発展および／または転移性浸潤中の細胞遊走を変調可能であると提唱した（Ｓａｕｋら、１９９８）。
【００１０】
セルピン機能障害の臨床的表明（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）には、肺気腫および肝硬変が含まれ（Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋら、１９９８；Ｂｉｒｄ、１９９８）、これらは、通常、好中球エラスターゼによる肺胞損傷を調節する、α１−プロテイナーゼ阻害剤（「α１−アンチトリプシン」とも呼ばれる）欠損に関連する。α１−プロテイナーゼ阻害剤突然変異体が肝臓に集積すると、肝炎または肝硬変を生じる可能性がある（Ｂｉｒｄ、１９９８）。再発性血栓塞栓性疾患の根底に、アンチトロンビンＩＩＩ欠損がある可能性があり、そして特定の出血障害は、α２−アンチプラスミン活性欠乏に関連する可能性があり、これはより高いレベルの活性プラスミンを生じ、したがって線維素溶解増加を生じるし、一方、セルピン機能障害の他の臨床的表明には、トロンビンを標的とし、それによって凝血カスケードを阻害するアンチトロンビンに関連する血栓症が含まれる（Ｂｉｒｄ、１９９８）。アンチトロンビンＩＩＩおよびα₂−アンチプラスミンにおける突然変異は、調節されない凝血障害に関連し、そして遺伝性血管神経性浮腫が、Ｃ１エラスターゼを標的とし、そして補体カスケードに関与する酵素であるＣ１阻害剤の欠損に関与することもまた注目されてきている（Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９８；Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋ、１９９８）。
【００１１】
変形性関節炎および慢性関節リウマチの多くの側面が、細胞浸潤、すなわち組織区画を分離する解剖学的バリアを細胞が横断する能力を伴い、そしてプラスミノーゲンアクチベーターおよびマトリックスメタロプロテイナーゼなどのプロテアーゼが、炎症関節において、浸潤および増殖細胞の活性を調節するのに役割を果たすことが注目されてきている（Ｄｅｌ Ｒｏｓｓｏら， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １７：４８５−９８（１９９９））。Ｄｅｌ Ｒｏｓｓｏらは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）が、関節炎関節における細胞外マトリックス破壊および病変形成に役割を果たす証拠を要約する。彼らは、プラスミノーゲン活性化系を薬理学的に調節することが、関節炎における骨病変および関節強直症の発展を防止するのに価値あるアプローチである可能性があると示唆する。
【００１２】
セルピン・ファミリーはまた、ウイルス病原性に役割を果たすウイルスタンパク質もまた含む。例えば牛痘サイトカイン反応修飾因子遺伝子（ＣｒｍＡ）は、多様な刺激によって誘導されるアポトーシスを遮断可能であり、そしていくつかのインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ様システインプロテアーゼ）を阻害することが知られる。ＣｒｍＡは、牛痘ウイルスの病原性因子とみなされる。ＳＥＲＰ１（粘液腫ウイルス）はｕＰＡ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびプラスミンを標的とし、そして粘液腫ウイルス病原性を促進する。
【００１３】
オブ−セルピンは、１８ｑ２１．３の、ＢＣＬ２よりテロメア側の５００ｋｂ領域内にクラスター形成するようである（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ １９：４８０−８７（１９９８））。２つのＳＣＣＡ遺伝子は、この領域において１０ｋｂ未満しか離れておらず、そしてＰＡＩ−２およびマスピン（ＳＥＲＰＩＮＢ５またはＰＩ５とも呼ばれる）をコードする遺伝子と隣接する。１８ｑ２１．３にマッピングされる、さらなるセルピンは、細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２、ＰＩ８とも呼ばれる）、骨髄関連セルピン（ボマピン（ｂｏｍａｐｉｎ）、ＰＩ１０またはセルピンＢ１０とも呼ばれる）、ハーピン（ｈｕｒｐｉｎ）（ＳＥＲＰＩＮＢ１３または「ヘッドピン（ｈｅａｄｐｉｎ）」とも呼ばれる）およびメグシンである。いくつかのこれらのセルピンの順序は、セントロメアからテロメア方向に、マスピン、ハーピン、ＳＣＣＡ−２、ＳＣＣＡ−１、メグシン、ＰＡＩ−２、ボマピンおよびＣＡＰ２である。ＳＣＣＡ−２コード領域がクローニングされており、そしてＷＯ ９７１４４２５に開示される。この遺伝子クラスターを含有するコンティグは、ＮＣＢＩウェブサイトで、ヌクレオチド検索を用い、そして以下のコンティグ番号：ＡＣ０１９３５５；ＡＰ００１４０４；またはＡＣ０１５５３６の１つを入力して、見出すことが可能である。染色体１８ｑは、頭部および頚部の癌、並びに他の悪性腫瘍において、破壊点およびヘテロ接合性の喪失と関連することが知られ、したがって、このクラスター内のセルピン遺伝子機能が損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ことが、腫瘍増殖に不都合である可能性が示唆される（Ｓｐｒｉｎｇら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２６４：２９９−３０４（１９９９））。
【００１４】
セルピンのいくつかは識別可能なプロテアーゼ阻害活性を持たず、一方、他のセルピンはセリンまたはシステインプロテアーゼを阻害することが示されてきている（例えばＰｅｍｂｅｒｔｏｎ、１９９７を参照されたい）。オブ−セルピンの大部分はセリンプロテアーゼを阻害するが、例えばＳＣＣＡ−１は、パパイン、カテプシンＬ、ＳおよびＫなどのシステインプロテアーゼを阻害し、一方、近く関連するＳＣＣＡ−２（９２％アミノ酸配列同一性）は、マスト細胞キマーゼおよびカテプシンＧなどのキモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する。ＳＣＣＡ−１は、主に細胞内部に見出され、一方、より酸性であるＳＳＣＡ−２は、主に扁平上皮癌で発現され、そして細胞の外に放出される（Ｓｕｍｉｎａｍｉら， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ １９：４８８−９３（１９９８））。牛痘ＣｒｍＡタンパク質はまた、システインプロテイナーゼ阻害剤でもある。ハーピンは、この種の活性を所持する他のセルピンとのヒンジ領域相同性に基づいて、阻害性セルピンであると予測される（Ｓｐｒｉｎｇら、１９９９）。
【００１５】
すべてのセルピンに所持される基本骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）には、通常、９つのαらせんおよび３つのβ−プリーツシートが含まれる。プロテイナーゼを阻害するセルピンは、カルボキシ末端から３０〜４０アミノ酸に位置する、約２０〜３０アミノ酸の反応部位ループまたは「ＲＳＬ」を介してプロテイナーゼを阻害する。ＲＳＬは、タンパク質表面に曝露され、そして非標的プロテアーゼによる切断を受けやすい（例えばＰｏｔｅｍｐａら、１９９４を参照されたい）。セルピン分子のコア構造は、３つのβ−シートの西洋ナシ型形状にフォールディングされ、この構造の最上部にＲＳＬが提示される。ＲＳＬは標的プロテイナーゼ基質を模倣すると考えられる「おとり（ｂａｉｔ）」配列を含有する。阻害性セルピンは、特定のセリンプロテアーゼ基質を模倣し、そしてＲＳＬで切断される際にプロテアーゼに共有結合することによって、セリンプロテアーゼ活性を制御する。標的プロテアーゼによる切断に際して、阻害性セルピンは、「圧迫から弛緩（ｓｔｒｅｓｓｅｄ−ｔｏ−ｒｅｌａｘｅｄ）」遷移と呼ばれる劇的なコンホメーション変化を経るが、これには残った反応部位ループのβシートの１つへの挿入が付随する。この遷移中、セルピンは、標的プロテアーゼと安定な熱耐性複合体を形成する。ＲＳＬ配列、並びに特定のＰ１および隣接するアミノ酸残基は、阻害性セルピンのプロテアーゼに関する特異性を決定する。ＲＳＬは、セルピン・ファミリーメンバーの重要な特徴とみなされ、そしてこの構造は、いかなるプロテイナーゼも阻害することが知られていないセルピンにおいてさえ、タンパク質の最上部に曝露された表面ループ中に提示される。
【００１６】
阻害活性を持つセルピンは、標的プロテアーゼへの付着に関連するセルピン・コンホメーション変化を調節し、そして変調するのに重要な、いくつかの領域を所持する。Ｉｒｖｉｎｇら（２０００）に要約されるように、これらはヒンジ領域（ＲＳＬのＰ１５−Ｐ９部分）；裂け目（ｂｒｅａｃｈ）（Ａ β−シートへのＲＳＬの最初の挿入点である、Ａ β−シートの最上部に位置する）；シャッター（Ａ β−シートへのＲＳＬの最初の挿入点である、Ａ β−シートの最上部に位置する）；およびゲート（鎖ｓ３Ｃおよびｓ４Ｃを含む；Ａ β−シートに挿入されるには、ＲＳＬは鎖ｓ３Ｃおよびｓ４Ｃを連結するβ−ターン周囲を通過しなければならない）である。阻害性セルピンは、タンパク質が圧迫から弛緩遷移を経ることを可能にするのに必要と考えられる上記領域に位置する多くの重要なアミノ酸残基で、高い度合いの保存を所持する（例えば、Ｉｒｖｉｎｇら、２０００の表２を参照されたい）。
【００１７】
プロテアーゼ阻害機能を欠くセルピンは、おとり配列内で切断するプロテイナーゼを引きつける「おとり」配列を利用して、生物学的エフェクターを活性化可能である。白血球エラスターゼ阻害剤（ＬＥＩ）は例えば、セリンプロテアーゼであるエラスターゼによって、アポトーシス中にＤＮＡを分解するよう機能するデオキシリボヌクレアーゼに変換されるようである（ＷＯ ９９／５８５６０に論じられる）。別のセルピンであるチロキシン結合グロブリンは、タンパク質分解的に切断されて、体の特定の部位で生物学的に活性であるＴ₄を放出し（Ｓｃｈｕｓｓｌｅｒ、２０００）、そして血清に存在するアンギオテンシノーゲンは、その標的プロテイナーゼによって切断されて、生物学的に活性であるアンギオテンシンタンパク質を生成する。同様に、コルチコステロイド結合タンパク質は、炎症部位でエラスターゼによって切断され、局所的にコルチコール（ｃｏｒｔｉｃｏｌ）を放出する（Ｓｃｈｕｓｓｌｅｒ、２０００）。
【００１８】
セルピンであるＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２は、細胞外マトリックスのタンパク質分解破損を制御するのに関与する。さらに、実験により、ＰＡＩ−２がおそらくプロテアーゼを遮断することによって、ＴＮＦαに誘導されるアポトーシスに対して細胞を防御するが、ＰＡＩ−２は他のアポトーシスシグナルに対しては防御しないことが示されてきている（概説にはＢｉｒｄ、１９９８を参照されたい）。ＰＡＩ−２はまた、抗炎症および増殖制御リポコルチン（アネキシン）に結合することもまた示されてきている。したがって、ＰＡＩ−２は炎症または増殖因子シグナル伝達の制御に関与する可能性がある。
【００１９】
プロテイナーゼ阻害剤−９（ＰＩ−９）は、グランザイムＢへの曝露から生じる自己誘導アポトーシスから細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞を防御することが提唱されているオブ−セルピンであり、グランザイムＢはこれらのリンパ球が産生して標的細胞においてＤＮＡ分解を誘導する酵素である（Ｂｉｒｄ、１９９８）。ＰＩ−９は、分泌されず、そしてリンパ系組織に限定されているようである。別の阻害性セルピン、プロテアーゼ・ネキシンＩ（ＰＮ−１）は分泌され、そして強力なヘパリン依存トロンビンおよびウロキナーゼ阻害剤である（Ｂｉｒｄ、１９９８）。ＰＮ−１がニューロン細胞に対するトロンビンの作用のバランスを取り、それによってそうでなければニューロン表面上の受容体に対するトロンビンの作用によって誘導されるであろうアポトーシスから神経細胞を救出することが提唱されている（Ｂｉｒｄ、１９９８）。
【００２０】
セルピンは、元来、いくつかの腫瘍細胞に産生されるマトリックス分解セリンプロテアーゼｕＰＡおよびプラスミンを直接阻害することによって、腫瘍浸潤を抑制するのに関与することが示された。腫瘍が産生するプロテアーゼは、腫瘍が転移する能力を促進すると考えられ、したがって療法的介入の標的である。カルパインなどのいくつかのシステインプロテアーゼが、腫瘍監視に関与するアポトーシス経路に関連付けられてきている（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ、１９９７）。
【００２１】
腫瘍抑制能が立証されている１つのセルピンは、オブ−セルピン、マスピンである。マスピンは、主に、上皮細胞（乳房および前立腺）の膜分画に見られ、そしてその発現は、乳房腫瘍上皮において下方制御されている（Ｓａｇｅｒら， “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｐｉｎｓ，”中， Ｃｈｕｒｃｈら監修， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９９７， ７７−８８ページに概説される）。マスピンは、乳房および前立腺腫瘍細胞両方の浸潤性を抑制することが示されてきているが、いかなるプロテアーゼも阻害しないようである。それでも、トリプシンを用いてマスピンＲＳＬを切断すると、マスピンは腫瘍を阻害する能力を失う。明らかに、マスピンは、損なわれていないＲＳＬを必要とする、いまだに同定されていない何らかの機構によって腫瘍増殖に干渉する。
【００２２】
いくつかの癌では、特定のセルピンの血漿レベルの上昇は、癌進行のマーカーとして役立つ。例えば、α１ＡＴと複合体を形成している前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルを用いて、前立腺癌の進行を監視する（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ、１９９７）。前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いる別のセルピンは、ＷＯ ９９／５８５６０に記載されるプロスタピン（ｐｒｏｓｔａｐｉｎ）である。オブ−セルピンであるＳＣＣＡ−１およびＳＣＣＡ−２は、実際、元来は扁平上皮癌抗原として同定され、そして通常、両方のＳＣＣＡが反応するモノクローナル抗体を用いてこの種の腫瘍の進行を監視する（Ｂａｒｎｅｓら， Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ７８：６２−６６（２０００））。ＳＣＡＡは、頚管（ｃｅｒｖｉｘ）、肺および食道の扁平上皮癌で上昇し、そしてＳＣＣＡレベルは、これらの腫瘍の進行した症例において、疾患の度合いの血清学的マーカーとして用いられる（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、１９９８；Ｂａｒｎｅｓら、２０００）。Ｓｕｍｉｎａｍｉら（１９９８）は、上皮癌で産生されるＳＣＣＡが、主にＳＣＣＡ−２であると報告し、そしてＳＣＣＡ−２が通常、炎症から上皮細胞を保護すると提唱する。ＳＣＣＡ血清レベルの上昇はまた、炎症構成要素による良性皮膚障害を持つ患者でも観察されてきている。こうした状態には、乾癬および湿疹が含まれる（Ｂａｒｎｅｓら、２０００）。ＳＣＣＡ−１およびＳＣＣＡ−２は、乾癬性の表皮で上昇し、そして「ソリアスタチン（ｐｓｏｒｉａｓｔａｔｉｎ）１」および「ソリアスタチン２」と呼ばれる乾癬マーカーとして開示される（ＷＯ ９７／１４４２５）。別の関連するセルピンであるハーピンもまた、乾癬性皮膚病変で過剰発現され、そして肺腫瘍抗原として開示されている（ＷＯ ９９／４７６７４）。ハーピンは、正常な口粘膜組織、皮膚および培養角化細胞で発現されるが、口腔の扁平上皮癌では過少発現される（Ｓｐｒｉｎｇら、１９９９）。ボマピンは、骨髄で特異的に発現される（ＲｉｅｗａｌｄおよびＳｃｈｌｅｅｆ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２６７５４−５７（１９９５））。
【００２３】
多様なセルピンが体の多くの組織で発現される（例えばＷｏｒｒａｌｌら、１９９９を参照されたい）。血液に高濃度で存在するものは、一般的に肝臓で合成される。例えばＰＡＩ−２およびＬＥＩは、単球で発現される。マスピンは、正常な乳房上皮で発現される（Ｓａｇｅｒら、１９９７）。ＳＣＣＡ−１およびＳＣＣＡ−２は、正常および悪性扁平上皮で発現され、特に表皮の有棘（ｓｐｉｎｏｕｓ）層および顆粒層で、そして子宮膣部上皮の中間層で発現される（Ｓｕｍｉｎａｍｉら、１９９８）。
【００２４】
セルピンおよびその標的に仲介される状態および疾患に対して、より有効な治療を発展させるため、セルピン・ポリペプチドファミリーの同定されていないメンバーに関する、より多くの情報が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
（発明の概要）
本発明は、サイピン（従来「エピピン（ｅｐｉｐｉｎ）」とも称された）を含む、新規ヒト・セルピン・ファミリーメンバーの発見に基づく。サイピン遺伝子は、染色体１８ｑ２１．３の関連セルピン・ファミリーメンバーのクラスター内に位置する。セルピンの中で、サイピンは、ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２およびハーピンに最も近く関連し、これらはすべて、乾癬組織で発現される。
【００２６】
本発明は：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも２０の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）のアミノ酸配列の断片；
（ｃ）少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）のアミノ酸配列の断片；
（ｄ）サイピン・ポリペプチド活性を有する（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）少なくとも２０アミノ酸を含んでなり、そして（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸同一性パーセントが：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、そして少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；
（ｇ）（ｆ）のアミノ酸配列であって、（ｆ）の前記アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドにも結合する抗体に結合する、前記アミノ酸配列；および
（ｈ）サイピン・ポリペプチド活性を有する、（ｆ）または（ｇ）のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、から本質的になる、またはより好ましくは、を含んでなる、単離サイピン・ポリペプチドを提供する。
【００２７】
好ましくは、こうしたポリペプチドは、単離サイピン・ポリペプチド、またはサイピンの変異体である単離ポリペプチドである。本明細書において、「変異体」は、ポリペプチドの療法的、抗原性および／またはプロテアーゼ阻害特性が保持されるように、保存的置換および／または修飾でのみ、配列番号２のアミノ酸配列と異なるポリペプチドである。好ましい態様において、こうした置換または修飾は、サイピンＲＳＬ（配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５）に関与せず、そして５又はそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって配列番号２に定義されるポリペプチドと異なる。好ましいサイピン変異体は、配列番号２と９５％以上のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００２８】
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸、および少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有し、中程度のストリンジェンシー条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸の相補体にハイブリダイズする単離核酸、例えば配列番号１に示すヌクレオチド配列などである。さらに他の態様において、核酸は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする。本発明の好ましい態様において、こうした核酸は、サイピン・ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードするか、または配列番号１のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列同一性を共有するヌクレオチド配列を含んでなり、ヌクレオチド配列同一性パーセントが：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、そして少なくとも９９．５％からなる群より選択される。こうした核酸は、好ましくはサイピン、サイピン変異体、またはその抗原性断片をコードする。やはり含まれるのは、染色体１８ｑにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションするためのプローブとして使用する、少なくとも長さ１５ヌクレオチドの配列番号１のセグメントである。本発明はまた、本発明の核酸に対応する単離ゲノム核酸も提供する。
【００２９】
本発明にさらに提供されるのは、本発明の核酸を少なくとも１つ含んでなる発現ベクターおよび組換え宿主細胞、並びに前記核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれている、好ましい組換え宿主細胞である。他の態様において、ベクター核酸は組み込まれない。
【００３０】
やはり提供されるのは、本発明の核酸にコードされるポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で、組換え宿主細胞を培養することを含んでなり、ここで組換え宿主細胞が本発明の核酸を少なくとも１つ含んでなる、前記方法である。本発明に提供される好ましい方法は、前記ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる。本発明の別の側面において、前記方法によって産生されるポリペプチドが提供される。
【００３１】
本発明のさらなる側面は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する、単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体、やはり好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体であり、そして好ましくは前記ポリペプチドの活性を阻害する、前記抗体である。
【００３２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの阻害剤を設計する方法であって、こうしたポリペプチドいずれかの三次元構造を決定し、基質のありうる結合部位の三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込む分子を合成し、そして該分子のポリペプチド阻害活性を決定する工程を含んでなる、前記方法を提供する。
【００３３】
本発明のさらなる側面において、サイピン・ポリペプチド活性を改変する化合物を同定する方法であって：
（ａ）本発明のポリペプチドと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドのサイピン・ポリペプチド活性を改変するかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００３４】
本発明の別の側面において、サイピン・ポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法であって：
（ａ）本発明のポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される化合物を、少なくとも１つ提供することを含んでなる、プロテアーゼ阻害活性を増加させる方法も提供し；該方法の好ましい態様は、本発明のポリペプチドを少なくとも１つ投与することによって、患者において前記活性を増加させることをさらに含んでなる。
【００３６】
本発明がさらに提供するのは、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを少なくとも１つ提供することを含んでなる、プロテアーゼ阻害活性を減少させる方法であって；該方法の好ましい態様は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを少なくとも１つ投与することによって、患者において前記阻害活性を減少させることをさらに含んでなり、そしてさらに好ましい態様では、アンタゴニストは、前記ポリペプチドいずれかの活性を阻害する抗体である。
【００３７】
本発明はさらに、サイピンおよびその標的に仲介される状態および疾患を治療する方法であって、本発明のポリペプチド、および前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される化合物を少なくとも１つ投与することを含んでなる、前記方法を提供し；好ましい態様において、サイピンまたはその標的に仲介される状態または疾患は、肺気腫、肝硬変、肝炎、凝血障害（血栓症を含む）、腫瘍形成、および腫瘍転移または浸潤より選択される。
【００３８】
本発明の他の側面において、サイピンおよびその標的に仲介される状態および疾患を治療する方法であって、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含んでなる、前記方法を提供し；好ましい態様において、サイピンまたはその標的に仲介される状態または疾患はウイルス病原性である。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、サイピンおよびその標的に仲介される状態および疾患を治療するための医薬品調製における、本発明のポリペプチドの使用を提供し；好ましい態様において、サイピンまたはその標的に仲介される状態または疾患は、肺気腫、肝硬変、肝炎、凝血障害、腫瘍形成、および腫瘍転移または浸潤より選択される。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、サイピン機能障害と関連する医学的状態を治療するための医薬品調製における、本発明のポリペプチドの使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
我々は、新規セルピン・ポリペプチドであって、このポリペプチドファミリーに特徴的な構造特性を有する、サイピン（先に「エピピン」と名づけられた）を同定した。サイピンのスプライシング変異体、ＳＥＲＰＩＮＢ１２（ユコピン（Ｙｕｋｏｐｉｎ）とも呼ばれる）は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４１１１９１として公表されている。代表的なヒト・サイピン・ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に提供し、そしてこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を配列番号２に提供する。サイピンおよびセルピン・ポリペプチド間の配列類似性を示す並列を、以下の実施例１の表２に提示する。アミノ酸配列相同性、予測される三次構造相同性、および染色体１８局在からサイピンがオブ−セルピンであることが明らかである。既知のセルピンのうち、サイピンに最も近く関連するのはＳＣＣＡ−２であり、ＳＣＣＡ−２とサイピンは約５１％のアミノ酸配列相同性を共有する。サイピンのマウス相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＫ００９０１８を有する。マウス・サイピン（ＡＫ００９０１８）は、オブ−セルピン・クラスター中、マウス染色体１に局在し、該クラスターは、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｓｅｒｐｉｎｂ５およびＳｅｒｐｉｎｂ７の既知のマウス・オブ−セルピン遺伝子を含有する（以下の実施例７を参照されたい）。
【００４２】
サイピンは、他のオブ−セルピンに見られるものと類似のドメインを含有する（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９３を参照されたい）。これらの１つがアミノ末端近傍に位置する疎水性領域である。この疎水性領域は、切断はされないが、細胞外空間に侵入するセルピンのシグナル配列として役立つ。サイピンは、こうした疎水性領域を所持し、これはＨｅｉｊｎｅの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４（１１）：４６８３−４６９０（１９８６））にしたがって、シグナル配列と同定された。予測されるサイピン・シグナル配列は、既知のオブ−セルピン・シグナル配列とよく並列し、そして配列番号２のアミノ酸２８〜４２に渡る。大部分の他のオブ−セルピンと比較して、サイピンは、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１０７に位置する挿入を有する。この領域は、２つの保存されるらせん間に存在するため、らせん間可変ループ領域と同定される（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９３を参照されたい）。他のセルピンでは、らせん間可変ループは、長さおよびアミノ酸組成において、非常に多様である。サイピンでは、この領域は挿入のため異常に長いが、この状況は規範的なセルピン・フォールディングに干渉しない。サイピン挿入は、２つの保存されるオブ−セルピンらせん（らせんＣおよびらせんＤ）間に位置する。ＰＡＩ−２もまた、この同じ位置に巨大な挿入を有する。配列番号２のアミノ酸６１〜１０７の挿入はまた、トランス・グルタミン化（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）部位である可能性がある、配列番号２のアミノ酸８２〜１０１のサイピンに特異的な２０のアミノ酸を除き、ＳＥＲＰＩＮＢ１２／ユコピンにも存在する。ＡＫ００９０１８ネズミ・サイピン・ポリペプチドはまた、サイピン特異的な潜在的トランス・グルタミン化残基も含む。サイピンおよびユコピン間の相違は、イントロンＣにおいて、異なる５’スプライシング部位を使用することから生じ；３’スプライシング部位は同一である。イントロンＣのサイピン５’スプライシング部位は、配列番号１のヌクレオチド３０３の後に位置し；ユコピンはエクソン２内の６０ヌクレオチド上流の５’スプライシング部位（配列番号１のヌクレオチド２４３および２４４の間）を用い、脊椎動物スプライシング部位の８％で見られる、非典型的なエクソン側最終アデニンを持つ（Ｐａｄｇｅｔｔら， １９８６， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５５：１１１９−１１５０）：ＡＡＡ／ｇｔｇｃｔｇ（配列番号１のヌクレオチド２４１〜２４９）。ＳＥＲＰＩＮＢ１３変異体がＣ−Ｄらせん間ループにおける挿入を含んで記載されてきたように、オブ−セルピンでは、選択的スプライシングの先例がある（Ｓｐｒｉｎｇら， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２６４：２９９−３０４）。イントロン／エクソンスプライシング部位フェージング（ｐｈａｓｉｎｇ）は、オブ−セルピンにおいて保存され、そしてセルピン・スーパーファミリーメンバーの進化的関連性を予測するのに用いられてきている。オブ−セルピンは、保存部位に存在する６つのイントロンを有する（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）。オブ−セルピンのサブセットに見られるイントロンＣは、Ｃ−Ｄらせん間ループに位置し、そして正確な位置はセルピン間で保存されない。サイピンは、Ｃ−Ｄらせん間ループにおいて、高い比率のグルタミンを所持する（予測値６．２％に比較して、５／４７または１０．６％（ＭｃＣａｌｄｏｎおよびＡｒｇｏｓ， １９８８， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４：９９−１２２；ネズミ・サイピンは、Ｃ−Ｄらせん間ループにおいて、６／４５または１３．３％のグルタミンを有する）。ユコピンにおける欠失は、ヒト・サイピンに存在する５つのグルタミンのうち３つを除去する。サイピンおよびユコピン間のこの相違が、トランス・グルタミン化によって架橋される能力の機能的な相違を生じる可能性があると推測すると興味深い。
【００４３】
超可変領域から移動するとＣＯＯＨ末端に向かって、オブ−セルピンは、比較的高い度合いの保存がある領域を所持する。サイピンにおいて、この領域は、配列番号２のほぼアミノ酸１０８〜アミノ酸３７３に広がる。この比較的保存された領域は、本明細書において「構造的コア」領域と称する。セルピンＲＳＬは、構造的コア領域を過ぎて、さらにＣＯＯＨ末端寄りに位置する。アミノ酸相同性に基づいて、サイピン中のＲＳＬは、長さおよそ２２アミノ酸であり、そして配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５に広がる。既知のセルピンのタンパク質分解切断部位の命名慣例によると、アミノ酸残基３７４はＰ１７アミノ酸、そしてアミノ酸３９５はＰ５’である。これらの指定は、３９０位（Ｐ１）のアルギニンおよび３９１位（Ｐ１’）のセリン間に切れやすい結合を置く。標的プロテアーゼによる切断は、Ｐ１およびＰ１’間で生じると予測される。ＲＳＬに続いて、セルピン・ファミリーメンバーは、非常に保存されるセルピン・サインモチーフを含有する。サイピン・アミノ酸は、配列番号２の残基３９８〜４０８間で、このセルピン・サインモチーフとマッチする。したがって、前述の構造的特徴は、サイピン・ポリペプチドが、他のオブ−セルピンと一致する全体の一次構造を有することを示す。
【００４４】
当業者は、上述のサイピン・ポリペプチド領域の境界はおおよそのものであり、そしてこうしたドメインの正確な境界はまた、セルピン・ポリペプチドファミリー内のメンバー間で異なる可能性があることを認識するであろう。
【００４５】
セルピン構造的ファミリーのメンバーとして、サイピンの分類をさらに確立するため、クエリータンパク質配列をタンパク質データバンク（ＰＤＢ）（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉら， Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ ７：１４３１−４０（１９９８））の構造的代表に重ねる、タンパク質スレッディングプログラムであるＧｅｎｅＦｏｌｄ（Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス；Ｂｅｒｍａｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：２３５−２４２（２０００））に、サイピン配列を提出した。セルピン・ファミリーメンバーは、その多様性にもかかわらず、ＧｅｎｅＦｏｌｄなどのタンパク質スレッディングアルゴリズムを用いることにより、一次アミノ酸配列から予測可能な、非常に特徴的な三次元構造によって特徴付けられる。タンパク質ファミリーの新規メンバーを分類するのにＧｅｎｅＦｏｌｄを使用するため、新規タンパク質配列をプログラムに入力し、その後、ＧｅｎｅＦｏｌｄデータベースに存在する、あらかじめ知られているタンパク質構造（「テンプレート」構造）にどのくらいよくフォールディングするかを反映する確率スコアに割り当てる。スコア決定のため、ＧｅｎｅＦｏｌｄは、一次アミノ酸配列類似性、残基の埋没（ｂｕｒｉａｌ）パターン、局所相互作用および二次構造比較に頼る。ＧｅｎｅＦｏｌｄを用いる際、いくつかのセルピンに関して解明された構造を含む、タンパク質フォールディングのあらかじめ存在するデータベース中のテンプレート構造すべての上に、アミノ酸配列をフォールディング（またはスレッディング）する。各比較のため、プログラムはまず、最適並列を決定し、そしてその後、並列のこの度合いが偶然生じる可能性（Ｐ値）を計算する。各テンプレート構造上にスレッディングしたクエリー配列に関して、Ｐ値の逆数を決定し、そしてこのＰ値逆数をスコアとして報告する。各ヒットに関して、３つの異なるスコアを実際に計算し、そして３つの欄で報告する。これらの３つのスコアは（ｉ）配列のみ；（ｉｉ）配列プラス局所コンホメーション優先性プラス埋没条件；および（ｉｉｉ）配列プラス局所コンホメーション優先性プラス埋没条件プラス二次構造に基づく。上記のスコアすべてに関して、各カラムの関連するテンプレート識別番号と共に、指定された切り捨て値を戻す。したがって、これらのスコアは、新規タンパク質が多様な参照構造とマッチする度合いを反映する。したがって、スコアは、新規タンパク質を既知のタンパク質ファミリーのメンバーに割り当てるのに有用である。ＧｅｎｅＦｏｌｄを用いた、ありうる最高のスコアは９９９．９９９である。ＧｅｎｅＦｏｌｄプログラムにスレッディングした際、オブ−セルピンＬＥＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ第Ｐ３０７４０号）、ＰＡＩ−２（ＧｅｎＢａｎｋ第ＸＰ＿００８７４６号）、ＳＥＲＰＩＮＢ１０（ボマピン）（ＧｅｎＢａｎｋ第ＮＰ＿００５０１５号）、ＳＣＣＡ−１（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ第Ｐ２９５０８号）、ＳＣＣＡ−２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ第Ｐ４８５９４号）およびプロスタピン（ＧｅｎｅＳｅｑ第Ｙ１５１５６号）はすべて、上位５ヒットに比較して、３つの欄すべてで９９９．９９のスコアを有した。各場合で、上位５ヒットはすべてセルピンであり、したがって、この群のタンパク質間で、高い度合いの構造的保存が例示される。
【００４６】
ＧｅｎｅＦｏｌｄデータベース中のすべての構造に対してスレッディングした後、サイピンは、ＧｅｎｅＦｏｌｄデータベース中の５つの異なる既知のセルピンとの３種類のスコアすべて（すなわち３つの欄すべて）で、９９９．９９をスコアした。ＧｅｎｅＦｏｌｄに列挙される順に、ＰＤＢヒットは：１ｏｖａＡ（オボアルブミン）、１ｈｌｅＡ（ウマ白血球エラスターゼ阻害剤）、２ａｎｔＩ（アンチトロンビン）、１ａｔｕ（アルファ−１−アンチトリプシン）、および１ａｓ４Ａ（アンチキモトリプシン）であった。ＧｅｎｅＦｏｌｄの結果は、サイピンがセルピンであるという明らかな指摘を提供する。しかし、１ｏｖａＡに対する並列を抜粋すると、サイピンらせん間可変ループ領域に存在する巨大挿入が示される（配列番号２のアミノ酸８０〜１１１）。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（１０１０ Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ Ｓｔ Ｗ， Ｓｔｅ ９１０， Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｑｕｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ａ ２Ｒ７）の分子操作環境（ＭＯＥ）を用いて、挿入を１ｏｖａＡ構造上にマッピングし、そして二次構造要素から単離されるループ上に見出す。サイピンをセルピンとしてフォールディングするには、単純なループ伸長しか必要でない。
【００４７】
正常な生物活性を持つアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）または生物活性が改変された突然変異体などの、本発明にしたがったサイピン変異体を、ＧｅｎｅＦｏｌｄを用いて解析すると、得られる上位５ヒットはセルピンであり、そして上位５ヒットのスコアは９９９．９９９であろう。９９９．９９９のスコアは、ＧｅｎｅＦｏｌｄに報告される３種類のスコア、すなわち、配列のみ、配列プラス局所コンホメーション優先性プラス埋没条件、または配列プラス局所コンホメーション優先性プラス埋没条件プラス二次構造のいずれかを用いて、これらの５ヒットに関して得られるであろう。こうしたサイピン変異体は、他の既知のセルピンからサイピンを差別化する、特定のアミノ酸配列を含有するため、他のセルピンとは区別される。他のセルピンからサイピンを差別化する特定のアミノ酸領域には、限定されるわけではないが、配列番号２のアミノ酸６１〜１０７のサイピン挿入ループ；配列番号２のアミノ酸１０８〜３７３のサイピン・コア領域；および配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５のサイピンＲＳＬが含まれる。サイピン変異体は、典型的には約４２５アミノ酸を含有するであろうが、こうした変異体は、ほぼ５アミノ酸の欠失または挿入を含有し、それでもなお配列番号２に代表されるサイピン・ポリペプチドに関連する生物活性を保持することが可能である。
【００４８】
ＧｅｎＢａｎｋ ｄｂＥＳＴデータベースの部分的ヒトｃＤＮＡクローン（ＡＡ２４２９６９）は、配列番号２に示すサイピン・ポリペプチドのアミノ酸６９〜２５０に９５％の同一性を有するタンパク質を予測する、オープンリーディングフレームを含有する。このＥＳＴがコードするポリペプチドは、したがって、上に論じるサイピン挿入（配列番号２のアミノ酸６１〜１０７）を含み、そしてサイピン構造的コア（配列番号２のアミノ酸１０８〜３７３）を部分的に含む。このＥＳＴタンパク質は、サイピンと８アミノ酸残基異なり、これは、配列番号２のアミノ酸１０９、１１５、１１８、１２６、１２７、２１６、２４６および２４８の位に対応する。これらの部位でＥＳＴに存在するアミノ酸は、それぞれ、スレオニン、アスパラギン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、イソロイシン、プロリンおよびフェニルアラニンであり、一方、サイピンでは、対応するアミノ酸は、それぞれ、セリン、チロシン、グルタミン、イソロイシン、リジン、リジン、グルタミンおよびチロシンである。本発明の１つの態様は、配列番号２と約９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、そしてさらに以下の少なくとも１つを所持するサイピン変異体を含む：残基１０９のセリン；残基１１５のチロシン；残基１１８のグルタミン；残基１２６のイソロイシン；残基２１６または２４６のリジン；残基２４６のグルタミン；または残基２４８のチロシン。最適には、これらのサイピン変異体は、プロテアーゼ阻害活性を所持するであろう。ＥＳＴ ＡＡ２４２９６９によって予測されるポリペプチドは、ＲＳＬを欠き、したがってセルピン構造にフォールディング不能であるし、またサイピンのプロテアーゼ阻害活性を示すのも不能であることに注目しなければならない。
【００４９】
核酸配列解析は、サイピンがオブ−セルピンであるという結論をさらに支持する。サイピン遺伝子は、ＮＣＢＩヒト染色体コンティグＡＣ０１９３５５、ＡＰ００１４０４およびＡＣ０１５５３６上の染色体１８に位置決定されてきている。これらのコンティグは、サイピンおよびハーピン両方のゲノム配列を含有し、したがってその連鎖を示す。ハーピンの放射ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）マッピングは、この遺伝子を、オブ−セルピン・クラスターに隣接する染色体１８ｑ２１．３／１８ｑ２２に位置決定する（Ｓｐｒｉｎｇら、１９９９）。サイピンのゲノム配列解析は、そのイントロン・スプライシング部位結合部が、他のセルピン・スーパーファミリーメンバーとオブ−セルピン・ファミリーメンバーを区別する特徴である、オブ−セルピン・ファミリーメンバーに保存されるエクソン−イントロン境界にマッチすることを示す（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９３）。
【００５０】
プロテアーゼを阻害するセルピンは、１またはいくつかのプロテアーゼに特異的である傾向がある。阻害性セルピンは、その標的プロテアーゼと１：１化学量論の熱および変性耐性複合体を形成する。ＲＳＬは、阻害性セルピンの重要な構造的決定要因である。Ａシートかららせん開始に導くペプチドストークの配列は、ヒンジ領域（Ｐ１５−Ｐ９）として知られ、阻害性セルピンで非常に保存され、そしてこの領域における突然変異は、阻害活性の喪失を生じる可能性がある（ＨｕｂｅｒおよびＣａｒｒｅｌｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：８９５１（１９８９）；Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９４）。ヒンジ領域内で、Ｐ１２−Ｐ９は、小側鎖を持つ残基の優勢を示し、これらの残基は通常、アラニンまたはグリシンである（Ｓｔｅｉｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３４７：９９−１０２（１９９０））。Ｓｔｅｉｎらは、このアラニンリッチ領域が、ストークの柔軟性に寄与し、そしてストークの可動性が阻害活性に必要であると提唱する。サイピンのヒンジ領域（配列番号２のアミノ酸３７６〜３８２に対応する）は、Ｐｏｔｅｍｐａらが解析した４０の阻害性セルピンのコンセンサスにマッチし（Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９４）、アラニンリッチストークにおける４つの連続するアラニン（配列番号２のアミノ酸３７９〜３８２）を含み、したがってサイピンが阻害性セルピン・サブファミリーのメンバーであることを示す。
【００５１】
ＲＳＬのＰ１位中のアミノ酸に基づいて、どの種類のプロテアーゼがセルピンによって阻害されるかを予測することが可能である。サイピンはＰ１にアルギニンを有し、したがって、１以上のアルギニン切断プロテアーゼを阻害する可能性があることが示される。この予測と一致して、組換えユコピンは、トリプシン様セリンプロテアーゼの阻害剤である（Ａｓｋｅｗら， ２００１， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：４９３２０−４９３３０）。Ｃ−Ｄらせん間ループがプロテアーゼ阻害活性に役割を果たしているようではないため、サイピンは、ユコピンと同じｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有するであろうと期待される（ヒトおよびマウス・サイピン相同体間の興味深い相違は、マウスＲＳＬがアルギニンの代わりにＰ１リジンを有することである）。多くのアルギニン切断プロテアーゼがヒト血清および組織に存在する。Ｐ１にアルギニンを持つ阻害性セルピンには、ｕＰＡおよびｔＰＡを標的とするＰＡＩ−１、ｕＰＡおよびｔＰＡを標的とするＰＡＩ−２、セリンプロテアーゼ、トロンビンを標的とするアンチトロンビン、並びにＣ１エステラーゼを標的とするＣ１阻害剤が含まれる（Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋら、１９９８を参照されたい）。サイピンによる不活性化の潜在的な療法的標的である、Ｐ１アルギニン特異性を持つセリンプロテアーゼには、限定されるわけではないが：トリプシン、トリプターゼ、カリクレイン、トニン、トロンビン、プロテインＣ、ｕＰＡ、ｔＰＡ、プラスミン、凝固因子ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａおよびＸＩＩａ、補体因子１、ＢおよびＤ、補体構成要素Ｃ１およびＣ２、グランザイムＡおよびＫ、ヘプシン、プロスタシン、フォリプシン、アクロシン、および肝細胞増殖因子アクチベーターが含まれる。
【００５２】
組織特異的ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ増幅を行って、サイピンｃＤＮＡ配列を検出した。これらの実験の結果によって、サイピン転写物が非常に多様な胎児細胞および成人細胞で発現することが示され、これらには以下が含まれた：気管支上皮；前立腺上皮；乳房上皮；および小気道上皮。さらに、サイピンは以下の上皮組織で発現される：前立腺；精巣；胸腺；扁桃腺；皮膚；角化細胞；頚管；胎児小腸；および食道。さらに、サイピンは、以下の癌腫および形質転換細胞株で発現される：肺上皮癌腫（Ａ５４９）；Ｂ細胞リンパ腫（Ａｋａｔａ、Ｎａｌｍ６、Ｎａｍａｌｗａ）；単球起源の癌細胞（Ｕ９３７、Ｔｈｐ−１、ＡＭＬ５）；および腫瘍異種移植片（結腸、膵臓、前立腺）。サイピン発現はまた、肺および食道起源の雑多な腫瘍でも観察された。サイピン配列を増幅するのに用いたプライマーは、ユコピンｃＤＮＡもまた増幅するはずであったが、１００を超える、異なる組織ｃＤＮＡのＰＣＲ検査で、２０アミノ酸（６０ヌクレオチド）相違と一致するサイズ多型は同定されなかった。これは、アガロースゲル分解能の限界から、または我々が調べた組織ではユコピンｍＲＮＡが欠如していたことから生じる可能性があった。我々はらせん間ループを通じて、異なる組織由来の９つのＰＣＲ産物の配列を決定し、そして本明細書に記載するサイピン配列しか同定しなかった。
【００５３】
ＳＣＣＡもまた、正常な扁平上皮組織（例えば舌、扁桃腺、食道、胸腺のハッサル小体、および皮膚）で発現され、これはサイピンに関して本明細書で観察される発現パターンと類似である。また、ＳＣＣＡは、頚管、肺および食道の扁平上皮癌で上昇している。サイピンもまた同様に、癌腫組織（すなわちＧＩ１１２結腸腺癌）で発現される。ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ２はどちらも、乾癬性表皮で上昇している（ＷＯ ９７／１４４２５を参照されたい）。別の関連セルピン、ハーピンもまた、乾癬性皮膚病変で過剰発現されており、そして肺腫瘍抗原として記載されている（ＷＯ ９９／４７６７４）。
【００５４】
サイピン発現の上述のパターンは、関連するＳＣＣＡ−２と同様、サイピンの正常な発現が、主に、扁平上皮が豊富な組織に限定されており、したがってサイピンは、上皮組織のマーカーとして、例えば、組織学的調製において、上皮細胞にタグ付けするための上皮特異的抗体を提供する際に、または上皮起源細胞が腫瘍生検に存在するかどうか決定するために、役立つ可能性がある。
【００５５】
いくつかの癌では、通常は細胞内にあるセルピンは、二重位相分布を装うであろう。こうしたセルピンの例はＳＣＣＡ−２であり、ＳＣＣＡ−２は、扁平上皮癌などの病理学的状態と関連してのみ、細胞外区画に多量に存在する。同様に、最初の細胞内位置から二重位相細胞内／細胞外位置へのサイピンの再分布は、特定の種類の癌の示標を提供する可能性がある。Ｂｉｒｄ（１９９８）はまた、ＰＡＩ−２では細胞内型が最も豊富な型である一方、妊娠、炎症および悪性腫瘍中、分泌型レベルが増加することにも注目する。
【００５６】
ＳＣＣＡ−１およびＳＣＣＡ−２同様、サイピンは乾癬マーカーとして有用である可能性があり、またはマスピン同様、サイピンは腫瘍抑制因子として有用である可能性がある。さらに、サイピン発現または活性の変調は、血管止血を制御するのに、肺気腫または嚢胞性線維症を治療するのに、あるいは冠動脈バイパス術の合併症を防止するのに、使用を見出す可能性がある。
【００５７】
上皮細胞株およびＴｈｐ−１細胞株において、サイピン発現は、腫瘍プロモーター、ホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）での誘導に反応して、またはエルシニア・エンテロリティア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｙｔｉａ）での感染によって上昇するようである。後者の知見は、増加したレベルのサイピン転写物の検出または感染組織における増加したレベルのサイピン・タンパク質の検出が、エルシニア感染の迅速な診断法を提供し、したがってエルシニア種に引き起こされる疾患の管理を補助することが可能であると示す。こうした疾患にはペスト（ｐｌａｇｕｅ）および下痢が含まれる。また、増加したサイピン発現の検出は、組織がＰＭＡなどの腫瘍プロモーターに曝露されたことがあるかどうかを決定する診断法として役立つ可能性がある。
【００５８】
上述に加え、プロテアーゼ−サイピン複合体は、好中球および単球の化学誘引物質として役立つ可能性がある。
以下の実施例５に記載するように、サイピン遺伝子は、ヒト染色体１８ｑ２１．３にマッピングされる。したがって、配列番号１に示すサイピン・ヌクレオチド配列は、ヒト染色体の組織学的調製において、染色体１８ｑ２１．３にタグ付けする有用なツールを提供する。サイピン・プローブを用いる、こうした方法は、腫瘍生検中の細胞を解析して、染色体１８のこの位置に破壊点またはヘテロ接合性の喪失があったかどうかを決定するための診断ツールとして役立つ可能性がある。こうした知識は、多様な治療オプションに対する患者の反応を予測するのに有用である可能性がある。染色体へのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための方法が当該技術分野に知られ、そして典型的には、スライドに固定され、そして染色体ＤＮＡを変性するように処理されている、染色体に存在する標的配列と安定な核酸二重鎖を形成するのに十分な長さを持つ標識プローブを使用する。この目的に適したプローブは、配列番号１のヌクレオチド配列に対応し、そして長さ少なくとも１５ヌクレオチドであり、そしてより好ましくは長さ３０ヌクレオチド以上である。
【００５９】
サイピン・ポリペプチドと関連する、典型的な生物学的活性または機能には、プロテアーゼの阻害が含まれる。サイピンは、血清、細胞外マトリックスまたは細胞内空間に見られる１以上のプロテアーゼを阻害するようである。プロテアーゼ阻害活性は、サイピン・ポリペプチドのＲＳＬドメイン（配列番号２のアミノ酸３７６〜３９５）と関連する。したがって、ＲＳＬ活性が必要な使用のため、好ましいサイピン・ポリペプチドには、サイピンＲＳＬドメインを有し、そして血清または細胞外マトリックスに存在するプロテアーゼを阻害する能力を示すものが含まれる。
【００６０】
好ましいサイピン・ポリペプチドは、サイピンＲＳＬを含んでなり、そして配列番号２に示すアミノ酸配列を持つサイピン・タンパク質の特異的プロテアーゼ阻害能を保持する。サイピン・ポリペプチドのプロテアーゼ阻害活性は、例えば、損なわれていない細胞外マトリックスタンパク質または損なわれていない血清タンパク質と精製組換えサイピンのインキュベーションから生じるポリペプチド断片の放出を測定するアッセイにおいて、測定可能である。あるいは、サイピン・プロテアーゼ阻害活性は、サイピンＲＳＬを有する標識精製組換えセルピンを、血清タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質とインキュベーションし、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で、混合物を煮沸し、その後、産物を解析して、標的プロテアーゼと安定な熱耐性複合体を形成したサイピンと一致する変化を、サイピンが経たかどうかを決定することによって、検出可能である。例えば、ＲｉｅｗａｌｄおよびＳｃｈｌｅｅｆ、１９９５に記載されるように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いることによって、煮沸した混合物を解析可能である。こうして同定したサイピン−プロテアーゼ複合体をさらに解析して、プロテアーゼの同一性を決定可能である。血清タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質の混合物を用いる代わりとして、アッセイは、近く関連するセルピンと複合体を形成することが知られる特定のプロテアーゼを使用することが可能である。こうしたプロテアーゼには、限定されるわけではないが：トリプシン、トリプターゼ、カリクレイン、トニン、トロンビン、プロテインＣ、ｕＰＡ、ｔＰＡ、プラスミン、凝固因子ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａおよびＸＩＩａ、補体因子１、ＢおよびＤ、補体構成要素Ｃ１およびＣ２、グランザイムＡおよびＫ、ヘプシン、プロスタシン、フォリプシン、アクロシン、および肝細胞増殖因子アクチベーターが含まれる。
【００６１】
プロテアーゼ阻害活性を示すため、サイピンＲＳＬは、構造最上部のループにおけるＲＳＬの提示を確実にするセルピン三次構造を有するセルピン分子中に存在しなければならない。したがって、活性を示すため、サイピンＲＳＬは、損なわれていないサイピン分子中に存在しなければならず、または異なるセルピン分子を操作して、その天然ＲＳＬの代わりにサイピンＲＳＬを用いることが可能である。
【００６２】
したがって、プロテアーゼ阻害活性を必要とする使用のため、好ましいサイピン・ポリペプチドには、ＲＳＬドメイン（配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５）を有し、そして血清タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質と熱耐性複合体を形成可能なものが含まれる。サイピン・ポリペプチドのプロテアーゼ阻害活性は、例えば、サイピン−プロテアーゼ複合体を測定するアッセイにおいて、または天然標的であるタンパク質を切断する標的プロテアーゼの能力を測定するアッセイにおいて、測定可能である。サイピン・ポリペプチドファミリーの個々のメンバー、並びにこれらのポリペプチドの断片および他の誘導体がこれらの活性を示す度合いは、標準的アッセイ法、特にクロマトグラフィーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動などのアッセイによって、決定可能である。
【００６３】
サイピン・ポリペプチドの生物学的活性の別の側面は、サイピン特異的抗体、標的プロテアーゼ、または通常、サイピンと相互作用する他の生物学的分子いずれかなどの特定の結合パートナーに結合する、このポリペプチドファミリーメンバーの能力である。用語「結合パートナー」は本明細書において、標的プロテアーゼ、リガンド、受容体、基質、抗体、並びに結合パートナーおよびサイピン・ポリペプチドの特定の部分間の接触または近接を通じて、サイピン・ポリペプチドと相互作用する他の分子いずれかを含む。サイピン・ポリペプチドのＲＳＬドメインが、結合パートナー（類）に対するサイピン結合特異性を決定するため、ＲＳＬドメインは、サイピン・ポリペプチドの残りとは別個の断片として、または例えば免疫グロブリンＦｃドメインに融合させた可溶性ポリペプチドとして発現させた際、サイピン・ポリペプチドがその結合パートナーに結合するのを妨げ、したがって、天然標的（類）へのサイピン・ポリペプチドの結合を介して仲介される生物学的活性を阻害可能である可能性がある。サイピン・ポリペプチドおよびその結合パートナー間の結合を検出するかまたは測定する、適切なアッセイには、上述のクロマトグラフィーアッセイが含まれる。
【００６４】
セルピン・ポリペプチドは、多様な疾患または状態に関与する。こうした疾患は、問題のセルピンの過剰発現、またはこのセルピンの異常な型の発現を伴う可能性がある。サイピン・ポリペプチドファミリーメンバーおよびその標的プロテアーゼまたは他の結合パートナー、および／または他の相互作用ポリペプチド間の相互作用を遮断するかまたは阻害することが、本発明の側面であり、そしてこれはサイピン・ポリペプチド活性の阻害剤の使用を通じて、これらの疾患および状態を治療するかまたは寛解させる方法を提供する。あまりにもわずかのサイピン・ポリペプチド活性を伴う状態には、これらの状態を治療するかまたは寛解させる方法は、単離サイピン・ポリペプチドまたは活性断片を提供することによって、あるいは内因性または外因性サイピン・ポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を提供することによって、サイピン・ポリペプチドの量または活性を増加させることを含んでなる。治療が必要な生物、例えば哺乳動物または最も好ましくはヒトにサイピン・ポリペプチドを投与する好ましい方法は、局所または全身投与、注入、緩慢放出移植物、エアロゾル吸入を含み、そしてサイピンのポリエチレングリコール誘導体を伴うことが可能である。
【００６５】
サイピン・ポリペプチドのさらなる使用には、局所的に上昇したサイピン発現によって、またはサイピン血清レベルの上昇によって特徴付けられる癌の診断試薬としての使用が含まれる。
【００６６】
サイピン・ポリペプチド
サイピン・ポリペプチドは、当業者によって、特定の構造ドメインを共有する可能性があり、そして／または配列番号２のサイピン・ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する可能性があり、そして／または他のサイピン・ポリペプチドにも特異的に結合する抗体に結合する可能性があるポリペプチドと同定される、配列番号２のサイピン・ポリペプチドに十分な度合いのアミノ酸同一性または類似性を共有するポリペプチドである。サイピン・ポリペプチドは、天然存在供給源から単離可能であるし、あるいは天然存在サイピン・ポリペプチドと同一の構造を有するか、または天然存在サイピン・ポリペプチドと異なる構造を有するように産生可能である。いかなる種類の改変（例えば限定されるわけではないが、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；ポリペプチドのグリコシル化状態の変化；三次元構造または自己会合状態を変化させるリフォールディングまたは異性化；並びに他のポリペプチドまたは分子との会合の変化）によって、サイピン・ポリペプチドいずれかから派生するポリペプチドもまた、サイピン・ポリペプチドである。したがって、本発明に提供するポリペプチドには、本明細書に記載するサイピン・ポリペプチドのものに類似のアミノ酸配列によって特徴付けられるが、そこに修飾が天然に提供されているかまたは故意に操作されているポリペプチドが含まれる。サイピン・ポリペプチドと共通の生物学的活性を共有するポリペプチドは、サイピン・ポリペプチド活性を有するポリペプチドである。
【００６７】
本発明は、サイピン・ポリペプチドの全長および成熟型両方を提供する。全長ポリペプチドは、最初に翻訳されるようなポリペプチドの完全一次アミノ酸配列を有するものである。全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の翻訳によって、得ることが可能である。その遺伝子座から、選択的スプライシングによって、または多数の翻訳開始部位の使用によって、多数のｍＲＮＡ型が産生される場合、単一の遺伝子座に、いくつかの全長ポリペプチドがコードされることが可能である。ポリペプチドの「成熟型」は、シグナル配列の切断またはプロドメインを除去するタンパク質分解的切断などの、翻訳後プロセシング工程を経たポリペプチドを指す。特定の全長ポリペプチドの多数の成熟型は、例えば、シグナル配列の多数の部位での切断によって、またはポリペプチドを切断するプロテアーゼの差別的制御によって、産生可能である。こうしたポリペプチドの成熟型（類）は、全長ポリペプチドをコードする核酸分子を、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞において発現することによって、得ることが可能である。ポリペプチドの成熟型の配列はまた、シグナル配列またはプロテアーゼ切断部位の同定を通じて、全長型のアミノ酸配列からも決定可能である可能性がある。
【００６８】
本発明のサイピン・ポリペプチドはまた、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が、生物学的に活性であるポリペプチド、例えばポリペプチドの天然存在可溶性型を生じることが可能な、選択的ｍＲＮＡプロセシングなどの転写後または翻訳後プロセシング事象から生じるものも含む。本発明内にやはり含まれるのは、ポリペプチドからの１以上の末端アミノ酸（一般的には約１〜５の末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去による、異なる種類の宿主細胞における発現に際する、ＮまたはＣ末端の相違などのタンパク質分解に起因しうる変異である。
【００６９】
本発明は、結合する天然パターングリコシル化を含むまたは含まないサイピン・ポリペプチドをさらに含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）で発現したポリペプチドは、発現系の選択に応じて、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌発現系での本発明のポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。さらに、既定の調製は、多数の異なってグリコシル化されたポリペプチド種を含む可能性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じて、除去可能である。一般的に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル過剰のグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションすることが可能である。
【００７０】
サイピン・ポリペプチドおよびそれをコードする核酸の種相同体もまた、本発明に提供する。本明細書において、「種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、既定のポリペプチドまたは核酸のものと起源の異なる種であるが、当業者に決定されるように、既定のポリペプチドまたは核酸に有意な配列類似性を持つポリペプチドまたは核酸である。種相同体は、本明細書に提供するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから、適切なプローブまたはプライマーを作成し、そして所望の種由来の適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離し、そして同定することが可能である。本発明はまた、サイピン・ポリペプチドおよびそれをコードする核酸のアリル変異体；すなわち、アミノ酸またはヌクレオチド配列の相違が、遺伝子多型（集団内の個体間のアリル変異体）に起因しうる、こうしたポリペプチドおよび核酸の天然存在型も含む。
【００７１】
本発明のサイピン・ポリペプチドの断片が本発明に含まれ、そして該断片は直線型であっても、または例えば、Ｈ．Ｕ． Ｓａｒａｇｏｖｉら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７３−７７８（１９９２）およびＲ．Ｓ． ＭｃＤｏｗｅｌｌら， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：９２４５−９２５３（１９９２）に記載されるように、既知の方法を用いて環状化してもよい。本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、並びにそれらをコードする核酸は、サイピン・ポリペプチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）のアミノ酸またはヌクレオチド配列長を含み、そして配列同一性が、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のポリペプチドのアミノ酸配列の比較によって決定される場合、サイピン・ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸と、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有するポリペプチドおよび核酸を含む。本発明にやはり含まれるのは、好ましくは少なくとも８、または少なくとも１０、または好ましくは少なくとも１５、またはより好ましくは少なくとも２０、またはさらにより好ましくは少なくとも３０、または最も好ましくは少なくとも４０の隣接するアミノ酸を含んでなるセグメントを含有するかまたはコードする、ポリペプチドおよびポリペプチド断片、並びにそれらをコードする核酸である。こうしたポリペプチドおよびポリペプチド断片はまた、配列同一性が、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のポリペプチドのアミノ酸配列の比較によって決定される場合、サイピン・ポリペプチドいずれかのこうしたセグメントいずれかと、少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を共有するセグメントも含有することが可能である。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって、決定可能である。あるいは、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）により記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ．３５３−３５８， １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。配列比較の当業者に使用される他のプログラム、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅウェブサイトを介しての使用に利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．０．９、またはｂｌａｓｔ−ｗｕｓｔｌウェブサイトに記載される標準的デフォルトパラメーター設定を用いる、ＵＷ−ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムなどもまた、使用可能である。さらに、該ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア化マトリックスを用い、そして使用可能な所望によるパラメーターは、以下のとおりである：（Ａ）組成上の複雑さが低いクエリー配列のセグメント（Ｗｏｏｔｔｏｎ ＆ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるようなもの；また、Ｗｏｏｔｔｏｎ ＪＣおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ Ｓ， １９９６， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：５５４−７１も参照されたい）、または短い周期の内部反復からなるセグメント（Ｃｌａｖｅｒｉｅ ＆ Ｓｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３）のＸＮＵプログラムによって決定されるようなもの）をマスクするフィルターの包含、および（Ｂ）データベース配列に対するマッチを報告する、統計的有意性の閾値、またはＥスコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率論モデルによれば、単なる偶然によって見出されるマッチの期待される確率；マッチに割り当てられた統計的有意性がこのＥスコア閾値より高ければ、該マッチは報告されないであろう）；好ましいＥスコア閾値は０．５であり、または優先性を増加させるため、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００７２】
本発明はまた、これらのポリペプチドの特定の断片またはドメインを含んでなる、サイピン・ポリペプチドの可溶性型もまた提供する。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能なサイピン・ポリペプチドである。可溶性サイピン・ポリペプチドにはまた、可溶性サイピン・ポリペプチドが細胞から分泌可能であり、そして好ましくは、サイピン・ポリペプチド活性を保持する限り、配列番号２のアミノ酸２８〜４２に見られる疎水性シグナル配列を含むポリペプチドも含まれる。あるいは、組換え遺伝子発現技術を用いて、分泌を指示可能なシグナル配列をサイピンに融合させることが可能である。分泌された可溶性サイピン・ポリペプチドは、培地から、例えば遠心分離によって、所望のポリペプチドを発現する、損なわれていない細胞を分離し、そして所望のポリペプチドの存在に関して培地（上清）をアッセイすることによって、同定可能である。培地中の所望のポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって、該ポリペプチドの可溶性型であることを示す。可溶性型サイピン・ポリペプチドの使用は、多くの適用に好適である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に、非経口投与に関して、そして多くの酵素的方法に関して、細胞内型より適している。
【００７３】
既知の技術を用いて、ペプチドまたはＤＮＡ配列中のさらなる修飾を行うことが可能である。ポリペプチド配列中の目的の修飾には、選択したアミノ酸残基の改変、置換、交換、挿入、または欠失が含まれる可能性がある。例えば、１以上のシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸と交換して、分子のコンホメーションを改変することが可能であり、この改変は、フォールディングまたは再生に際して、正しくない分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことを伴いうる。こうした改変、置換、交換、挿入または欠失のための技術は、当業者に公知である（例えば米国特許第４，５１８，５８４号を参照されたい）。別の例として、ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位を修飾して、グリコシル化を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失の結果、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合が防止されるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで交換してもよい。ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。本発明の範囲内のさらなる変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学部分と共有または凝集コンジュゲートを形成することによって、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の官能基に、あるいはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の官能基に、化学部分を連結することによって、調製可能である。付着している診断用（検出可能）剤または療法剤を含んでなるコンジュゲートが本明細書に意図される。好ましくは、こうした改変、置換、交換、挿入または欠失は、ポリペプチドまたはその実質的な同等物の所望の活性を保持する。１つの例は、天然型と本質的に同一の結合親和性で結合する変異体である。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして本明細書に示すように、慣用法によって測定可能である。
【００７４】
サイピンの有用な誘導体には、組換え的に発現したサイピンの精製および同定を容易にするため付加するペプチドを含んでなる融合ポリペプチドが含まれる。こうしたペプチドタグには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４， １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ９２５９号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００７５】
サイピン・ポリペプチドをコードする核酸
本発明内に含まれるのは、サイピン・ポリペプチドをコードする核酸である。これらの核酸は、適切な供給源からゲノムまたはｃＤＮＡ分子を単離することを含む、いくつかの方法で同定可能である。核酸単離のためのプローブまたはプライマーとして、あるいはデータベース検索のためのクエリー配列として使用しようとする、本明細書に記載するアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、アミノ酸配列から「逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」することによって、またはコードＤＮＡ配列が同定されているポリペプチドとアミノ酸同一性を持つ領域を同定することによって、得ることが可能である。公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、サイピン・ポリペプチドまたはサイピン・ポリペプチド断片の所望の組み合わせをコードするＤＮＡ配列を単離し、そして増幅することが可能である。ＤＮＡ断片の組み合わせの所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。オリゴヌクレオチドは、発現ベクターに、増幅されたＤＮＡ断片の組み合わせを挿入するのを容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を、さらに含有してもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ， Ｗｕら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， サンディエゴ（１９８９）， ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００７６】
本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡおよびＲＮＡと共に対応する相補配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、およびその組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子と共に、その断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、優先的にヒト供給源由来であるが、本発明は非ヒト種由来のものもまた含む。
【００７７】
「単離核酸分子」は、天然存在供給源から単離されている核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離されているものである。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドなど、テンプレートから酵素的に、または化学的に合成された核酸の場合、こうしたプロセスから生じる核酸は、単離核酸と理解される。単離核酸分子は、別個の断片の形の、またはより大きい核酸構築物の構成要素としての、核酸分子を指す。１つの好ましい態様において、単離核酸は、実質的に、混入内因性成分を含まない。核酸分子は、好ましくは、少なくとも１度は、実質的に純粋な形で、そして標準的生化学法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に概略されるものなど）によって、その構成要素ヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能にする量または濃度で単離されているＤＮＡまたはＲＮＡに由来している。こうした配列は、好ましくは、真核遺伝子に典型的には存在する、内部非翻訳配列、またはイントロンに中断されない、オープンリーディングフレームの形で提供され、そして／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’または３’に存在することが可能であり、ここでは該ＤＮＡは、コード領域の操作または発現に干渉しない。
【００７８】
本発明にはまた、中程度にストリンジェントな条件下、そしてより好ましくは非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載するサイピン・ポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸も含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， およびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， 第９章および第１１章；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ， セクション２．１０および６．３−６．４）によって示されており、そして例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者によって容易に決定可能である。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５ｘＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約６８℃のハイブリダイゼーション温度（または約４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、並びに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中の洗浄条件の使用を伴う。「ＳＳＣ」（１ｘ）は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である。一般的に、高ストリンジェントな条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義されるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。望ましい場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＳＣの代わりに使用することが可能であり、そしてストリンジェンシーに影響を与えることなく、ＳＤＳを上述の緩衝液のいずれから省くことも可能である。洗浄はハイブリダイゼーション完了後、１５分間行う。当業者に知られるように、そして以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、必要に応じて、所望の度合いのストリンジェンシーを達成するよう、洗浄温度および洗浄塩濃度を調整可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。長さ５０塩基対未満であると予測されるハイブリッド二重鎖のハイブリダイゼーション温度は、最適には、二重鎖の融解温度（Ｔ_m）より５〜１０℃低く、Ｔ_mは、以下の等式にしたがって決定する。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔ_m（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）である。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドに関しては、Ｔ_m（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ₁₀［Ｎａ⁺］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ⁺］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ⁺］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸分子は各々、少なくとも１５ヌクレオチド（またはより好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さを有するか、またはハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）の長さを有し、そして配列同一性が、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のハイブリダイズする核酸配列の比較によって決定される場合、ハイブリダイズする本発明の核酸と、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。
【００７９】
本発明はまた、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子も提供する。「対応する遺伝子」または「対応するゲノム核酸」は、転写されて、ｃＤＮＡ核酸配列が由来するｍＲＮＡを産生する、ゲノム領域であり、そしてこうした遺伝子の制御された発現に必要なゲノムの隣接領域を含むことが可能である。したがって、対応する遺伝子には、限定されるわけではないが、コード配列、５’および３’非翻訳領域、選択的スプライシングされるエクソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサーまたはサプレッサー要素が含まれる可能性がある。対応する遺伝子は、例えば、プローブまたはＰＣＲプライマーを設計するため本明細書に開示する配列情報を用いて、既知の方法にしたがい、単離することが可能である。こうした方法には、適切なゲノムライブラリーまたはゲノム材料の他の供給源における、遺伝子の同定および／または増幅のため、開示される配列情報からのプローブまたはプライマーの調製が含まれる。「単離遺伝子」または「単離ゲノム核酸」は、ゲノム核酸を単離する生物のゲノムに存在する、隣接するゲノム配列から分離されているゲノム核酸である。
【００８０】
サイピン・ポリペプチドを作成し、そして精製する方法
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製のための方法は、いかなる適切な技術によって達成してもよく、限定されるわけではないが以下の方法を含む。組換えサイピン・ポリペプチドを産生するのに好ましい宿主細胞は、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、２９３およびＣＨＯ細胞である。これらのサイピン・ポリペプチドのグリコシル化プロフィールはその活性に重要である。サイピン・ポリペプチドを作成するための、他の好ましいポリペプチドプロセシング法は、特定のプロセシング、結合、またはシャペロンポリペプチドの使用を伴う。
【００８１】
ポリペプチドを組換え的に産生するため、Ｋａｕｆｍａｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４４８５−４４９０（１９９１）；およびＰｏｕｗｅｌｓら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク， （１９８５）に開示される、ｐＤＣ４１２またはｐＤＣ３１４ベクター、あるいはｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターなどの発現調節配列に、本発明の単離核酸を機能可能であるように連結することが可能である。多くの適切な発現調節配列が当該技術分野に知られる。Ｒ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， ５３７−５６６（１９９０）に記載されるものなど、組換えポリペプチドを発現させる一般的な方法もまた知られる。本明細書において、「機能可能であるように連結した」は、本発明の核酸および発現調節配列が、構築物、ベクター、または細胞内で、適切な分子（例えばポリメラーゼ）が存在する場合、核酸にコードされるポリペプチドが発現されるような方式で、位置していることを意味する。本発明の１つの態様として、少なくとも１つの発現調節配列が、組換え宿主細胞またはその子孫において、本発明の核酸に、機能可能であるように連結しており、核酸および／または発現調節配列が、例えば形質転換またはトランスフェクションによって、あるいは他の適切な方法いずれかによって、宿主細胞に導入されている。本発明の別の態様として、少なくとも１つの発現調節配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に、機能可能であるように連結しているように、組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれる。本発明のさらなる態様において、少なくとも１つの発現調節配列が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは組換え宿主細胞いずれかにおいて、転写因子などのトランス作用因子の作用を通じて、本発明の核酸に機能可能であるように連結される。
【００８２】
さらに、分泌を促進するシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを産生しようとする宿主細胞の種類などの要因に応じる可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能する、異種シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含んでなる融合ポリペプチドに翻訳されるようにしてもよい。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、その宿主細胞において、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌に際し、ポリペプチドから切断される。当業者はまた、シグナルペプチドが切断される、単数または複数の位は、コンピュータープログラムに予測されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現するのに使用する宿主細胞の種類などの要因にしたがって、多様である可能性があることも認識するであろう。ポリペプチド調製は、１より多い部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なるＮ末端アミノ酸を有するポリペプチド分子の混合物を含む可能性がある。
【００８３】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が、記載されている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９９０， ｐｐ．１５−６９）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬などの商業的に入手可能な試薬を用いた、さらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７， １９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版 Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）におけるもののような慣用法を用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることが可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞傷害性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用いて、行うことが可能である。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１， １９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択計画を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１である（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現しているプラスミドを株ＤＸ−Ｂ１１に導入することが可能であり、そしてプラスミドを含有する細胞のみを適切な選択培地中で増殖させることが可能である。発現ベクターに組込み可能な選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを宿する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択可能である。
【００８４】
あるいは、サイピン遺伝子産物は、相同組換え、または「遺伝子ターゲティング」技術を介して、得ることが可能である。こうした技術は、ゲノム上の特にあらかじめ決定した部位において、外因性転写調節要素（ＣＭＶプロモーター等）の導入を使用して、目的の内因性核酸配列の発現を誘導する（例えば米国特許第５，２７２，０７１号を参照されたい）。宿主染色体またはゲノムへの組込み位置は、遺伝子の既知の位置および配列を考慮すれば、当業者の１人によって容易に決定可能である。好ましい態様において、本発明は、増幅可能遺伝子と組み合わせた外因性転写調節要素を導入して、やはり宿主細胞から遺伝子配列自体を単離する必要なしに、増加した量の遺伝子産物を産生することもまた意図する。
【００８５】
いくつかの細胞種が、ポリペプチドの発現に適した宿主細胞として作用することが可能である。哺乳動物宿主細胞には、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃｅｌｌ ２３：１７５， １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１， １９９１）に記載されるような、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。あるいは、酵母などのより低次の真核生物において、または細菌などの原核生物において、ポリペプチドが産生可能である。適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種または異種ポリペプチドを発現可能ないかなる酵母株も含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または異種ポリペプチドを発現可能ないかなる細菌株も含まれる。ポリペプチドを酵母または細菌で作成する場合、機能するサイピン・ポリペプチドを得るため、そこで産生されるポリペプチドを、例えば適切な部位でのリン酸化またはグリコシル化によって、修飾することが必要である可能性がある。こうした共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を用いて、達成可能である。ポリペプチドはまた、本発明の単離核酸を、１以上の昆虫発現ベクターの適切な調節配列に、機能可能であるように連結し、そして昆虫発現系を使用することによって、産生することも可能である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴからキットの形で（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）商業的に入手可能であるし、そしてこうした方法は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）、並びにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に記載されるように公知である。本明細書において、本発明の外来性核酸を発現するように修飾された昆虫細胞は「形質転換」されたとみなされる。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示する核酸構築物由来のＲＮＡを用いて、ポリペプチドを産生するのに使用可能である。好ましくは、少なくとも１つの発現調節配列に機能可能であるように連結している、本発明の単離核酸を含んでなる宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド発現を支持するのに適した培養条件下で、形質転換宿主細胞を培養することによって、調製可能である。生じた発現ポリペプチドをその後、多様な塩での選択的沈殿、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの、既知の精製法を用いて、こうした培養（すなわち培地または細胞抽出物）から精製することが可能である。ポリペプチドの精製はまた、ポリペプチドに結合するであろう剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上の１又はそれより多くのカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１又はそれより多くの工程；あるいは1以上のサイピン・エピトープに特異的に結合する抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーも含むことが可能である。
【００８７】
あるいは、本発明のポリペプチドは、精製を容易にするであろう型で発現することも可能である。例えば、融合ポリペプチドとして発現することが可能であり、すなわち、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）またはポリＨＩＳと融合させることが可能である。こうした融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ（マサチューセッツ州ビバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）およびＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから、商業的に入手可能である。ポリペプチドはまた、非サイピン・エピトープでタグ付けして、そして続いて、こうしたエピトープに対して向けられる特異的抗体を用いることによって、精製することも可能である。１つのこうしたエピトープ（「Ｆｌａｇ（登録商標）」）は、Ｋｏｄａｋ（コネティカット州ニューヘブン）から商業的に入手可能である。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する、１又はそれより多くのＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチドをさらに精製することが可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてを使用して、実質的に均一な単離組換えポリペプチドを提供することもまた可能である。こうして精製したポリペプチドは、他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まず、そして本発明にしたがって、「単離ポリペプチド」と定義される。上述の精製法を用いて、サイピンおよびサイピン断片と共に、サイピン・ポリペプチドに結合する抗体、断片、変異体、結合パートナー等を単離可能である。本発明のポリペプチドはまた、ヒト・サイピン・ポリペプチドをコードする核酸が挿入されている体細胞または生殖細胞を含有することによって特徴付けられる、トランスジェニック動物の産物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの構成要素として、発現することも可能である。
【００８８】
サイピンに対して、またはその抗原性断片に対して生成したモノクローナル抗体などの、サイピン・ポリペプチドに結合可能なポリペプチドを含んでなるアフィニティーカラムを利用して、発現したサイピン・ポリペプチドをアフィニティー精製することもまた、可能である。これらのサイピン・ポリペプチドは、慣用的な技術を用いて、例えば利用するアフィニティーマトリックスに応じて、高塩溶出緩衝液中で、そしてその後、使用のため、より低塩の緩衝液中に透析することによって、またはｐＨもしくは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムからはずす（ｒｅｍｏｖｅ）ことが可能であるし、あるいは本発明から得られるポリペプチドなどの、アフィニティー部分の天然存在基質を用いて、競合的にはずすことが可能である。本発明のこの側面において、本発明の抗サイピン抗体、またはサイピンもしくはその断片と相互作用可能な他のポリペプチドなどの、サイピン結合ポリペプチドは、その表面上に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定するか、分離するかまたは精製するのに適した、カラムクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体または類似の支持体に結合させることが可能である。固相接触表面への本発明のサイピン結合ポリペプチドの付着は、いかなる手段によって達成してもよく、例えば、磁気微小球体を、これらのポリペプチド結合ポリペプチドでコーディングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を、こうしたポリペプチド結合ポリペプチドを有する固相と接触させる。表面上に本発明のポリペプチドを有する細胞は、固定サイピン結合ポリペプチドに結合し、そして未結合細胞は洗い流される。このアフィニティー結合法は、溶液から、こうしたサイピン発現細胞を精製するか、スクリーニングするか、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から遊離させる方法は、当該技術分野に知られ、そして例えば、酵素の使用を含む。こうした酵素は、好ましくは細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう指示される。あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含有すると推測される細胞混合物を、まず、ビオチン化した本発明のサイピン結合ポリペプチドとインキュベーションすることが可能である。その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性によって、ポリペプチドが結合した細胞がビーズに結合する。アビジンでコーティングしたビーズの使用は当該技術分野に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。未結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は慣用法を用いて行う。
【００８９】
ポリペプチドはまた、既知の慣用的な化学合成によっても産生可能である。合成によって構築されたポリペプチド配列は、ポリペプチドと一次、二次または三次構造および／またはコンホメーション特性を共有するため、ポリペプチド活性を含め、それと共通の生物学的特性を所持する可能性がある。したがって、これらは、療法化合物のスクリーニングにおいて、そして抗体発展のための免疫学的方法において、天然の精製ポリペプチドの生物学的に活性であるまたは免疫学的な置換体として、使用可能である。
【００９０】
所望の純度は、ポリペプチドの意図される使用に応じる。例えば、ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで投与しようとするとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが検出不能であるように精製される。当業者は、異なるグリコシル化、異なる翻訳後プロセシング等のため、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のポリペプチドバンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、または（ポリペプチドが放射標識されている場合）オートラジオグラフィーによって、視覚化可能である。
【００９１】
サイピン・ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニスト
サイピン・ポリペプチドを中和するか、またはサイピン遺伝子の発現（転写または翻訳いずれか）を阻害するいかなる方法を用いて、サイピン・ポリペプチドの生物学的活性を減少することも可能である。特定の態様において、アンタゴニストは、細胞への少なくとも１つのサイピン・ポリペプチドの結合を阻害し、それによって、細胞へのこうしたサイピン・ポリペプチドの結合によって誘導される生物学的活性を阻害する。他の態様において、アンタゴニストは標的プロテアーゼへの少なくとも１つのサイピン・ポリペプチドの結合を阻害する。さらに他の態様において、アンタゴニストを設計して、内因性サイピン遺伝子発現のレベルを減少させることが可能であり、例えばサイピンｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するかまたは妨げる、公知のアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；サイピン遺伝子の転写を阻害する三重らせんアプローチ；あるいは、サイピン遺伝子またはその内因性プロモーターもしくはエンハンサー要素を不活性化するかまたは「ノックアウト」する、標的化相同組換えを用いる。こうしたアンチセンス、リボザイム、および三重らせんアンタゴニストを設計して、損なわれていないサイピン遺伝子活性、または適切な場合、突然変異体サイピン遺伝子活性いずれかを減少させるかまたは阻害することが可能である。こうした分子を産生し、そして使用する技術は、当業者に公知である。
【００９２】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的とする内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するよう作用することが可能である。このアンチセンスアプローチは、サイピンｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、そして翻訳を妨げるであろう。絶対の相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書に称されるような、サイピン核酸に「相補的な」アンチセンス分子は、標的核酸とハイブリダイズし、安定な二重鎖（または適切な場合、三重鎖）を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味する。したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよいし、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の度合いおよび長さ両方に応じるであろう。好ましいオリゴヌクレオチドは、メッセージの５’端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよび該開始コドンを含む、５’非翻訳配列に相補的なものである。しかし、サイピン遺伝子転写物の５’または３’非翻訳、非コード領域、あるいはコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドが使用可能である。
【００９３】
ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、好ましくは、ＡＵＧ開始コドンの相補体が含まれる。アンチセンス核酸は、少なくとも長さ６ヌクレオチドでなければならず、そして好ましくは、長さ６〜約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物またはその誘導体または修飾型であってもよい。本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる種類であることが可能である。これらには、ヌクレオチドの「ギャップ」セグメントが連結ヌクレオシドの５’および３’「ウィング」セグメントの間に位置する第一の種類、並びに「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’または５’末端いずれかに位置する第二の「オープン端」型が含まれる（例えば米国特許第５，９８５，６６４号を参照されたい）。第一の種類のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において、「ギャップマー」またはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の種類のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において、「ヘミマー」または「ウィングマー」としても知られる。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善することが可能である。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば宿主細胞受容体をｉｎ ｖｉｖｏで標的とするため）、または細胞膜を横切る輸送を促進する剤（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号を参照されたい）、あるいはハイブリダイゼーション誘発切断剤または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えばＺｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９を参照されたい）などの他の付随する基を含んでもよい。アンチセンス分子は、サイピン転写物をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞に搬送しなければならない。
【００９４】
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に搬送するために、いくつかの方法が開発されてきている；例えば、アンチセンス分子は、組織または細胞由来部位に直接注入してもよいし、または所望の細胞を標的とするよう設計された、修飾アンチセンス分子（例えば標的細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を、全身投与してもよい。しかし、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンス細胞内濃度を達成するのは、しばしば困難である。したがって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下に置かれる組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者において、標的細胞をトランスフェクションするための、こうした構築物の使用は、内因性サイピン遺伝子転写物と相補的塩基対を形成するであろう一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写を生じ、そしてそれによって、サイピンｍＲＮＡの翻訳を妨げるであろう。例えば、ベクターが細胞に取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、ベクターをｉｎ ｖｉｖｏで導入することが可能である。こうしたベクターは、転写され、所望のアンチセンスＲＮＡを産生することが可能でありさえすれば、エピソームにとどまっても、または染色体に組み込まれてもよい。こうしたベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって、構築することが可能である。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現で用いられる、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または当該技術分野に知られる他のベクターであってもよい。
【００９５】
サイピンｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するよう設計されたリボザイム分子もまた、サイピンｍＲＮＡの翻訳およびサイピン・ポリペプチドの発現を防止するのに使用可能である（例えば、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開；米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。本発明で使用可能なリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１）、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に天然に存在し（ＩＶＳ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）、そして詳細に記載されている（例えばＷＯ ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ， Ｃｅｌｌ， ４７：２０７−２１６（１９８６）を参照されたい）ものなどのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）が含まれる。アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドで構成されていてもよく（例えば改善された安定性、標的化などのため）、そしてｉｎ ｖｉｖｏでサイピン・ポリペプチドを発現する細胞に搬送しなければならない。搬送の好ましい方法は、トランスフェクションされた細胞が、十分な量のリボザイムを産生し、内因性サイピン・メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するであろうように、強い恒常的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にあるリボザイムコードＤＮＡ構築物を用いることを伴う。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるため、有効であるために、より低い細胞内濃度しか必要とされない。
【００９６】
あるいは、標的遺伝子の制御領域（すなわち標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を用いて、標的サイピン遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって、内因性サイピン遺伝子発現を減少させることが可能である（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６（６）， ５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら， １９９２， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０， ２７−３６；およびＭａｈｅｒ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）， ８０７−８１５を参照されたい）。
【００９７】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、並びに三重らせん分子は、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子合成のための、当該技術分野に知られるいかなる方法によって、調製することも可能である。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから商業的に入手可能なものなど）の使用によって、合成することが可能である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら， １９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９の方法によって、合成することが可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：７４４８−７４５１）の使用によって、調製することが可能である。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写によって、生成することが可能である。こうしたＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む、非常に多様なベクターに取り込むことが可能である。あるいは、用いるプロモーターに応じて、恒常的にまたは誘導性に、アンチセンスＲＮＡを合成する、アンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定して導入することが可能である。
【００９８】
内因性標的遺伝子発現はまた、標的化相同組換えを用いて、標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウト」することによって、減少させることも可能である（例えばＳｍｉｔｈｉｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７， ２３０−２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１， ５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ ５， ３１３−３２１を参照されたい）。標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞をトランスフェクションするため、例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または制御領域いずれか）に相同なＤＮＡが隣接する、突然変異体非機能標的遺伝子（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーを伴い、または伴わず、用いることが可能である。標的化相同組換えを介した、ＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。こうしたアプローチは、ＥＳ（胚性幹）細胞への修飾を用いて、不活性な標的遺伝子を持つ動物子孫を生成することが可能な場合の農業分野において（例えばＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、並びにＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８９、上記を参照されたい）、または「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）技術（Ｇｒｉｓｈｏｋ Ａ， Ｔａｂａｒａ Ｈ， およびＭｅｌｌｏ ＣＣ， ２０００， Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ＲＮＡｉ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７（５４６２）：２４９４−２４９７）、または導入遺伝子の導入（Ｄｅｒｎｂｕｒｇ ＡＦ， Ｚａｌｅｖｓｋｙ Ｊ， Ｃｏｌａｉａｃｏｖｏ ＭＰ， およびＶｉｌｌｅｎｅｕｖｅ ＡＭ， ２０００， Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４（１３）：１５７８−１５８３）を用いて、特定の標的遺伝子の発現を阻害する、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）などのモデル生物において、特に適している。このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が、直接投与されるか、またはウイルスベクターなどの適切なベクターを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで必要な部位を標的とするのであれば、ヒトで使用するために、適応させることが可能である。
【００９９】
本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子（類）の、増進した、減少した、または修飾された発現を有する生物を提供する。遺伝子発現の所望の変化は、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡに結合し、そして／または該ｍＲＮＡを切断する、アンチセンス核酸またはリボザイムの使用を通じて達成することが可能である（ＡｌｂｅｒｔおよびＭｏｒｒｉｓ， １９９４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １５（７）：２５０−２５４；Ｌａｖａｒｏｓｋｙら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ６２（１）：１１−２２；およびＨａｍｐｅｌ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５８：１−３９）。好ましくは、形質転換細胞およびその子孫内に安定して維持される遺伝子構築物で、細胞を形質転換することによって産生される、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子（類）を多コピー有するトランスジェニック動物を提供する。遺伝子発現レベルを増加させるかまたは減少させる、あるいは遺伝子発現の時間的または空間的パターンを変化させる、修飾遺伝子調節領域を有する、トランスジェニック動物もまた、提供する（欧州特許第０ ６４９ ４６４ Ｂ１を参照されたい）。さらに、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子（類）が、対応する遺伝子（類）への外来性配列の挿入を通じて、あるいは対応する遺伝子（類）のすべてまたは一部の欠失を通じて、部分的にまたは完全に不活性化されている、生物を提供する。部分的または完全遺伝子不活性化は、挿入、好ましくは、その後の転位因子の不正確な切除を通じて達成可能である（Ｐｌａｓｔｅｒｋ， １９９２， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １４（９）：６２９−６３３；Ｚｗａａｌら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１６）：７４３１−７４３５；Ｃｌａｒｋら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１（２）：７１９−７２２）か、あるいは相同組換えを通じて達成し、好ましくは、陽性／陰性遺伝子選択戦略によって検出することが可能である（Ｍａｎｓｏｕｒら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；米国特許第５，４６４，７６４号；第５，４８７，９９２号；第５，６２７，０５９号；第５，６３１，１５３号；第５，６１４，３９６号；第５，６１６，４９１号；および第５，６７９，５２３号）。改変された遺伝子発現を持つ、これらの生物は、好ましくは真核生物であり、そしてより好ましくは哺乳動物である。こうした生物は、対応する遺伝子（類）に関与する障害の研究のための非ヒトモデルの開発に、そして対応する遺伝子（類）のポリペプチド産物（類）と相互作用する分子の同定のためのアッセイ系の開発に、有用である。
【０１００】
やはり提供されるのは、（１）サイピン変異体が、なおそのパートナー（類）に結合するが、特定の小分子が改変された結合部位に収まり、そしてその相互作用を遮断するであろうように、または（２）特定の小分子が存在しない限り、サイピン変異体がもはやそのパートナー（類）に結合しないであろうように、コンホメーションが改変されている、パートナー結合部位を持つ、サイピン・ポリペプチド変異体である（例えばＢｉｓｈｏｐら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０７：３９５−４０１を参照されたい）。こうした改変サイピン・ポリペプチドをコードする核酸を、本明細書に記載する方法にしたがって、生物に導入して、そして対応するサイピン・ポリペプチドをコードする内因性核酸配列を交換することが可能である。こうした方法は、生物に、全身または局所方式で、小分子化合物を投与することによって、特定のサイピン・ポリペプチドとその結合パートナーとの相互作用が制御されるのを可能にする。
【０１０１】
サイピン・ポリペプチド自体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法で、サイピンの生物学的活性を阻害するのに使用可能である。本発明内に含まれるのは、断片として、または融合ポリペプチドの構成要素として発現した際、天然サイピン・ポリペプチド機能の「優性ネガティブ」阻害剤として作用する、サイピン・ポリペプチドである。例えば、サイピンＲＳＬドメイン（配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５）を含んでなる精製ポリペプチドを用いて、内因性結合パートナーへの内因性サイピン・ポリペプチドの結合を阻害することが可能である。こうした使用は、効果的にサイピン・ポリペプチド相互作用を遮断し、そしてサイピン・ポリペプチド活性を阻害するであろう。
【０１０２】
好ましい態様において、配列番号２に示すサイピン・ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて、サイピンがその標的プロテアーゼ（類）を阻害する能力をアンタゴナイズする。例えば、サイピン・ポリペプチドのエピトープ、またはサイピン・ポリペプチドの保存変異体のエピトープ、またはサイピン・ポリペプチドのペプチド断片の１以上を特異的に認識する抗体を、本発明において用いて、サイピン・ポリペプチド活性を阻害可能である。こうした抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーに産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合断片が含まれる。療法用量において、こうした抗体を投与して、サイピンの過剰発現または異常発現によって特徴付けられる疾患を治療することが可能である。サイピン特異的抗体がサイピン活性をアンタゴナイズする能力は、例えば、抗体の存在下および非存在下で、サイピンのプロテアーゼ阻害活性を測定するアッセイにおいて、決定可能である。
【０１０３】
本発明の精製および修飾サイピン・ポリペプチドを投与して、サイピン・ポリペプチドおよび膜結合型でないサイピン結合パートナー間の相互作用を変調して、例えばサイピン、および細胞外マトリックス、血清またはサイピンが発現される細胞の細胞質中に存在する標的プロテアーゼの相互作用を変調することが可能である。こうした相互作用の変調は、サイピンが影響を及ぼす生物活性修飾の手段を提供することが可能である。
【０１０４】
別の側面において、本発明は、サイピン・ポリペプチド活性の増加が有益である疾患の症状を治療するかまたは寛解するための、サイピン・ポリペプチド活性のアゴニストの使用をさらに含む。好ましい側面において、本発明は、サイピン核酸またはサイピン・ポリペプチドを含んでなる組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞、ｅｘ ｖｉｖｏの細胞、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞、および／または脊椎動物または哺乳動物などの多細胞生物に用いることを含む。サイピンの好ましい療法型は、上述のように可溶性型である。本発明のさらに別の側面において、本発明は、サイピン・ポリペプチド発現用のサイピン・コード核酸を含有する組成物の療法的に有効な量を、疾患治療のため宿主生物に投与すること、あるいは薬学的に許容しうるキャリアーと共に、精製組換えサイピンの療法的に有効な量を投与することを含んでなる方法を含む。こうした方法は、サイピン・ポリペプチド内因性活性の減少と関連する病理学的状態の治療に有用である。さらに、本発明は、サイピン・ポリペプチド内因性活性を増加させることが見出された化合物の細胞および／または生物への投与を含む。
【０１０５】
サイピン・ポリペプチド活性を増加させる化合物の一例は、抗体がサイピンに結合すると、サイピン活性が増加する、アゴニスト抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、こうした抗体は、例えばサイピンがサイピン・ポリペプチド活性の天然阻害剤に結合するのを防止することによって、サイピン・ポリペプチド活性を増加させることが可能である。サイピン特異的抗体がサイピン活性をアンタゴナイズするかまたはアゴナイズする能力は、抗体の存在下および非存在下で、サイピンのプロテアーゼ阻害活性を測定するアッセイにおいて、決定可能である。
【０１０６】
サイピン・ポリペプチドに対する抗体
本発明のポリペプチドと特異的に免疫反応性である抗体を本明細書に提供する。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介して（非特異的結合と対照的に）、サイピン・ポリペプチドに特異的に結合する。本発明において、特異的に結合する抗体は、サイピン・ポリペプチドまたはその下位部分、相同体、および変異体またはサイピン融合タンパク質を特異的に認識して、そしてこれらの分子と結合するが、他の分子とは結合しないであろうものである。１つの好ましい態様において、抗体は、アミノ酸配列が配列番号２に示すものであるポリペプチドなど、本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他のタンパク質とは交差反応しない。本明細書に記載するようなサイピン・ポリペプチド、断片、変異体およびサイピン融合ポリペプチドを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。
【０１０７】
本明細書に記載するポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチドなどは、サイピンと特異的に結合する抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含有する。サイピン特異的抗体は、他の既知のセルピンと結合せず、すなわちこれらの抗体は、その超可変領域結合部位を介して、ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２、ハーピンまたはマスピンなどのオブ−セルピンと結合しない。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもまたはコンホメーション的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分で構成されるが、コンホメーション的または断続的エピトープは、ポリペプチドフォールディングに際してごく近接する、ポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分で構成される（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版， １９９６））。フォールディングしたポリペプチドは複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；が、ポリペプチドのコンホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版， １９９６））。エピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。したがって、本発明の１つの側面は、サイピンの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下にさらに詳細に記載するように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは、アッセイにおいて研究試薬として、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマの上清などの物質から、特異的に結合する抗体を精製するために、使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学または酵素的切断、あるいは組換えＤＮＡ技術の使用など、当該技術分野に公知の技術を用いて、産生可能である。
【０１０８】
配列番号２に示すサイピン・ポリペプチドまたはその下位部分は、サイピン特異的抗体を作成するのに適したタンパク質を提供する。この目的のため、配列番号２の少なくとも１５アミノ酸を含んでなる連続セグメントを用いる。サイピン特異的抗体を作成するのに有用なサイピンの特定の下位領域には、配列番号２のアミノ酸６１〜１０７、１０８〜３７３および３７４〜３９５が含まれる。
【０１０９】
本発明のポリペプチドのエピトープに誘発可能な抗体に関しては、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のどちらも、慣用的技術によって調製可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３００１−３００５；Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）を参照されたい。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養可能である。ｉｎ ｖｉｖｏでは高力価でｍＡｂが産生されるため、これが現在好ましい産生法である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を、少なくとも１つのサイピン特異的エピトープを含むのに十分に大きいサイピン・ポリペプチドで免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そしてポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含んでなる。好ましい態様において、抗体は天然サイピンに結合するであろう。
【０１１０】
別の好ましい態様において、抗体は、サイピンおよびそのプロテアーゼ標的間に形成される複合体に特有のエピトープに特異的に結合するであろう。こうした複合体に特異的な抗体は、サイピンおよびそのプロテアーゼ標的間に形成される複合体を抗原として用いることによって作成する。こうした抗体は、組織、細胞、血清または細胞外マトリックスにおいて、こうした複合体の存在を検出するアッセイにおいて、有用である。
【０１１１】
抗体産生のため、１以上の以下：サイピン・ポリペプチド、サイピン・ポリペプチドの断片、サイピン・ポリペプチドの機能的同等物、またはサイピン・ポリペプチドの突然変異体型を注射することによって、多様な宿主動物を免疫することが可能である。こうした宿主動物には、限定されるわけではないが、ウサギ、モルモット、マウス、およびラットが含まれる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを用いて、免疫学的反応を増加させることが可能であり、こうしたアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい。
【０１１２】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が使用可能である（Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：４５２−４５４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３６４６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−２７０）。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、ブタｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。本発明のモノクローナル抗体にはまた、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型も含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術によって調製可能であり、そして抗体をヒトに投与した際、減少した免疫原性という利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含んでなる。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）と共に定常領域を含んでもよい。キメラおよびさらなる操作モノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， １９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９， １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， １９８９）、並びにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９， Ｃａｎ， １９９３）に記載されるものが含まれる。ヒト化抗体に有用な技術は、米国特許６，０５４，２９７にも論じられる。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びに関連特許に見出すことが可能である。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトであるかまたはヒト化されており；こうしたヒトまたはヒト化抗体を生成する技術もまた公知であり、そして例えばＭｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｎｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）から商業的に入手可能である。別の好ましい態様において、ヒトで使用するための完全ヒト抗体は、ヒト抗体可変ドメインのファージディスプレーライブラリーをスクリーニングすることによって産生する（Ｖａｕｇｈａｎら， １９９８， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６（６）：５３５−５３９；および米国特許第５，９６９，１０８号）。
【０１１３】
特異的エピトープを認識する抗原結合抗体断片は、既知の技術によって生成可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）２断片、および（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易な同定を可能にしてもよい。一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）を適応させ、サイピン遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生することもまた可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｃ領域の重鎖および軽鎖断片を連結して一本鎖抗体を生じることによって形成する。こうした一本鎖抗体はまた、例えばＨＩＶ感染における遺伝子治療に関するＭａｒａｓｃｏら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２２３−２３８， １９９９）に記載されるように、細胞内でも（すなわち「細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」として）有用である可能性がある。さらに、当業者に公知の技術を用いて、今度はサイピン・ポリペプチドに対する抗体を利用して、サイピン・ポリペプチドを「模倣」し、そしてサイピン・ポリペプチドに結合可能な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能である（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ， １９９３， ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【０１１４】
本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体には、二特異性抗体（すなわち第一の抗原結合ドメインを介して本発明のポリペプチドとも免疫反応性であり、そしてまた、第二の抗原結合ドメインを介して異なるポリペプチドと免疫反応性である抗体）が含まれる。多様な二特異性抗体が調製され、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方で有用であることが見出されてきている（例えば米国特許５，８０７，７０６；並びにＣａｏおよびＳｕｒｅｓｈ， １９９８， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ９：６３５−６４４を参照されたい）。二特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、これらには、２つの異なるハイブリドーマを融合させることによって形成するクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）、およびハイブリドーマをリンパ球と融合させることによって形成するトリオーマなどのハイブリッド−ハイブリドーマの使用が含まれる（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５４０；米国特許４，４７４，８９３および米国特許６，１０６，８３３）。米国特許６，０６０，２８５は、二特異性抗体の産生法を開示し、この方法において、少なくとも第一の特異性を有する抗体の軽鎖および重鎖の可変部分の遺伝子を、第二の特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞にトランスフェクションする。抗体断片の化学的カップリングもまた、２つの異なる抗原に対する特異性を有する抗原結合分子を調製するのに用いられてきている（Ｂｒｅｎｎａｎら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３；Ｇｌｅｎｎｉｅら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９８７， １３９：２３６７−２３７５；および米国特許６，０１０，９０２）。二特異性抗体はまた、例えばＫｏｓｔｅｌｎｙら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−４５５３；１９９２）に記載されるように、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質（優先的にヘテロ二量体を形成する）由来のロイシンジッパー部分を用いることによって、組換え手段を介しても産生可能である。米国特許５，５８２，９９６は、二特異性抗体産生において、ヘテロ二量体形成を促進するための相補的相互作用ドメイン（ロイシンジッパー部分または他の錠および鍵相互作用ドメイン構造など）の使用を開示する。四価二特異性分子は、米国特許５，９５９，０８３に記載されるように、抗体のＦ（ａｂ’）２断片の重鎖をコードするＤＮＡを、第二のＦ（ａｂ’）２分子の重鎖をコードするＤＮＡ（ＣＨ１ドメインがＣＨ３ドメインと交換されている）、または抗体の一本鎖ＦＶ断片をコードするＤＮＡと融合させることによって調製可能である。生じた融合遺伝子の哺乳動物細胞における発現は、対応する軽鎖の遺伝子と共に、選択される抗原に対して特異性を有する、四価二特異性分子を生じる。二特異的抗体はまた、米国特許５，８０７，７０６に記載されるようにも産生可能である。一般的に、該方法は、第一のポリペプチドの界面で、隆起（小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖と交換することによって構築する）を、そして第二のポリペプチドの界面で、対応する空洞（大きいアミノ酸側鎖をより小さいものと交換することによって調製する）を導入することを伴う。さらに、一本鎖可変断片（ｓＦｖ）は、２つの可変ドメインを共有結合することによって調製され；生じた抗体断片は、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、二量体または三量体を形成可能である（Ｋｒｏｔｔら， １９９７， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：４２３−４３３）。
【０１１５】
こうした抗体を同定可能なスクリーニング法が公知であり、そして例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴う可能性がある。抗体は、アゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性に関してスクリーニング可能である。アゴニスト抗体を用いて、サイピンが仲介する刺激経路または細胞間コミュニケーションまたはサイピンが仲介する他の生理学的現象を誘導可能である。
【０１１６】
サイピン結合パートナーへの本発明のサイピン・ポリペプチドの結合を遮断可能なこれらの抗体を用いて、こうした結合から生じ、サイピンが仲介する現象を阻害可能である。こうした遮断抗体は、サイピンの、トリプシン様プロテアーゼへの結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて同定することも可能である。あるいは、遮断抗体は、標的へのサイピンの結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定可能である。こうした抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用可能であるし、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与して、サイピンによって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。このように、サイピン結合パートナーとサイピンの相互作用によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、サイピンが仲介する生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。サイピンに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含んでなる組成物を、本明細書に提供する。サイピン・ポリペプチドを含有する組成物に関して、こうした組成物の適切な構成要素を以下に記載する。
【０１１７】
本明細書にやはり提供するのは、抗体に付着した検出可能（例えば診断用）剤または療法剤を含んでなるコンジュゲートである。こうした剤の例を上に記載する。該コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかの、サイピン・ポリペプチドまたはその断片の存在を検出するアッセイにおいても使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【０１１８】
サイピン・ポリペプチドと相互作用する化合物の合理的設計
合理的薬剤設計の目的は、生物学的に活性である目的のポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子、例えば阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等の構造的類似体を産生することである。このアプローチを用いて、ポリペプチドの、より活性であるかまたは安定な型である薬剤、あるいはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を増進するかまたは該機能に干渉する薬剤を形作ることが可能である（Ｈｏｄｇｓｏｎ Ｊ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１）。１つのアプローチにおいて、目的のポリペプチド、またはポリペプチド−阻害剤複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、またはコンピューター相同性モデリングによって、あるいは最も典型的には、これらのアプローチの組み合わせによって、決定する。構造を解明し、そして分子の活性部位（類）を決定するため、ポリペプチドの形状および荷電両方を確定しなければならない。より頻繁でないが、相同ポリペプチドの構造に基づいてモデリングすることによって、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる可能性がある。どちらの場合も、適切な構造情報を用いて、類似のセルピン様分子を設計するか、有効な阻害剤を同定するか、またはセルピンに結合可能である小分子を同定する。合理的薬剤設計の有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ ＳおよびＷｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６−７８０１）に示されるように、改善された活性または安定性を有する分子、あるいはＡｔｈａｕｄａ ＳＢら（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３：７４２−７４６）に示されるように、天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用する分子が含まれる可能性がある。アゴニストまたは阻害剤設計およびアゴニスト−サイピンまたは阻害剤−サイピン・ポリペプチド相互作用を補助するための、分子モデリングソフトウェア系における、サイピン・ポリペプチド構造情報の使用もまた、本発明に含まれる。本発明の特定の方法は、基質のありうる結合部位に関して、サイピン・ポリペプチドの三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込む新規分子を合成し、そして本明細書にさらに記載するように、新規分子をアッセイすることを含んでなる。
【０１１９】
本明細書にさらに記載するような、機能アッセイによって選択される、標的特異的抗体を単離し、そしてその後、結晶構造を解析することもまた可能である。このアプローチによって、原則として、続く薬剤設計の基礎とすることが可能なファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。機能する薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を生成することによって、ポリペプチド結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は、元来の抗原の類似体であると予測されるであろう。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからペプチドを同定し、そして単離することが可能である。その後、単離ペプチドは、ファーマコアとして働くであろう。
【０１２０】
サイピン・ポリペプチド活性のアッセイ
本発明の精製サイピン・ポリペプチド（ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）は、多様なアッセイで有用である。例えば、本発明のサイピン分子を用いて、サイピン・ポリペプチドの結合パートナーが同定可能であり、この結合パートナーをまた用いて、多様な生理学的現象が変調可能である。あるいは、これらを用いて、発生、組織リモデリングなどを変調する、非結合パートナー分子または物質が同定可能である。
【０１２１】
結合パートナーを同定するアッセイ。サイピン・ポリペプチドおよびその断片を用いて、結合パートナーを同定可能である。例えば、これらは、慣用的結合アッセイなどの、いかなる適切なアッセイにおいても、候補結合パートナーに結合する能力に関して、試験可能である。例えば、サイピン・ポリペプチドを検出可能試薬（例えば放射性核種、発色団、および比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、サイピンと相互作用する能力を有すると推測される候補セリンプロテアーゼと接触させる。特異的結合が生じると、標識サイピンはプロテアーゼと熱安定性複合体を形成すると予測される。これらの複合体は、ゲル電気泳動またはカラムクロマトグラフィーを使用可能な慣用法いずれかによって、検出可能である。
【０１２２】
サイピン・ポリペプチドへの結合に関してアッセイ可能な化合物には、限定されるわけではないが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）、Ａｒｑｕｌｅ（マサチューセッツ州ウォバーン）、Ｅｎｚｙｍｅｄ（アイオワ州アイオワシティー）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国・コーンウォール州トレビレット）、ＭＤＳ Ｐａｎｌａｂｓ（ワシントン州ボセル）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ニュージャージー州プリンストン）、およびＴｒｅｇａ（カリフォルニア州サンディエゴ）などの企業から−しばしば大きいコンビナトリアルケミストリー化合物「ライブラリー」の一部として−商業的に入手可能なものなどの、小有機分子が含まれる。これらのアッセイを用いてスクリーニングするのに好ましい小有機分子は、通常、１０ＫＤａ分子量未満であり、そして細胞侵入（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を増進し、分解に抵抗し、そして／またはその生理学的半減期を延長する、いくつかの物理化学的および薬理学的特性を所持することが可能である（Ｇｉｂｂｓ， Ｊ．， １９９４， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｃｅｌｌ ７９（２）：１９３−１９８）。天然産物、無機化学薬品、並びにタンパク質および毒素などの生物学的に活性である物質を含む化合物もまた、サイピン・ポリペプチドに結合する能力に関して、これらの方法を用いてアッセイすることが可能である。
【０１２３】
酵母２ハイブリッドまたは「相互作用トラップ」アッセイ。サイピン・ポリペプチドが、別のポリペプチドに結合するか、または潜在的に結合する場合、サイピン・ポリペプチドをコードする核酸はまた、相互作用トラップアッセイ（例えばＧｙｕｒｉｓら， Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３（１９９３）に記載されるものなど）で使用して、結合が起こる他のポリペプチドをコードする核酸を同定するか、または結合相互作用の阻害剤を同定することも可能である。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドはまた、結合相互作用のペプチドまたは小分子阻害剤またはアゴニストに関して、スクリーニングするのにも使用可能である。
【０１２４】
競合的結合アッセイ。別の種類の適切な結合アッセイは、競合的結合アッセイである。例えば、変異体の生物学的活性は、変異体が、候補結合パートナーへの結合に関して、天然ポリペプチドと競合する能力に関してアッセイすることによって、決定可能である。競合的結合アッセイは、慣用的方法論によって実行可能である。競合的結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識サイピン、およびサイピン（内因性または組換え）を発現する、損なわれていない細胞が含まれる。例えば、放射標識可溶性サイピン断片を用いて、標的プロテアーゼへの結合に関して、天然サイピンと競合させることが可能である。
【０１２５】
細胞増殖、細胞死、細胞分化、および細胞接着アッセイ。
本発明のポリペプチドは、細胞増殖（誘導または阻害いずれか）または細胞分化（誘導または阻害いずれか）活性を示す可能性があり、あるいは特定の細胞集団でサイトカイン産生を誘導する可能性がある。現在までに発見された多くのポリペプチド因子は、１以上の因子依存細胞増殖アッセイにおいて、こうした活性を示してきており、そしてしたがって、該アッセイは、細胞刺激活性の好適な確認として役立つ。本発明のポリペプチドの活性は、限定なしに、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢ Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含む細胞株に関するいくつかの日常的な因子依存細胞増殖アッセイのいずれか１つによって立証される。本発明のサイピン・ポリペプチドの活性は、他の手段の中でも、以下の方法によって測定可能である：
【０１２６】
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖のためのアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（ｐｐ．３．１−３．１９：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第７章：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００， １９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：１７０６−１７１２， １９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３３：３２７−３４１， １９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３７７８−３７８３， １９９２；Ｂｏｗｍａｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１７５６−１７６１， １９９４.に記載されるものが含まれる。
【０１２７】
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖に関するアッセイには、限定なしに：ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ， １９９４， Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修 Ｖｏｌ．１ ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロント；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ， １９９４， Ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修Ｖｏｌ １ ｐｐ．６．８．１−６．８．８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロントに記載されるものが含まれる。
【０１２８】
造血およびリンパ球新生細胞の増殖および分化に関するアッセイには、限定なしに：Ｂｏｔｔｏｍｌｙら， １９９１， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修 Ｖｏｌ １ ｐｐ．６．３．１−６．３．１２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロント；ｄｅＶｒｉｅｓら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：１２０５−１２１１， １９９１；Ｍｏｒｅａｕら， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０−６９２， １９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２９３１−２９３８， １９８３；Ｎｏｒｄａｎ， １９９１， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｖｏｌ １ ｐｐ．６．６．１−６．６．５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロント；Ｓｍｉｔｈら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：１８５７−１８６１， １９８６；Ｂｅｎｎｅｔｔら， １９９１， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １１， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｖｏｌ １ ｐｐ．６．１５．１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロント； Ｃｉａｒｌｅｔｔａら， １９９１， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｖｏｌ １ ｐｐ．６．１３．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロントに記載されるものが含まれる。
【０１２９】
抗原に対するＴ細胞クローン反応に関するアッセイ（例えば、増殖およびサイトカイン産生を測定することによる、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響を与えると共に直接のＴ細胞効果に影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第６章：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；第７章：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：６０９１−６０９５， １９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １１：４０５−４１１， １９８１；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００， １９８６；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２， １９８８に記載されるものが含まれる。
【０１３０】
胸腺細胞または脾臓細胞細胞傷害性に関するアッセイには、限定なしに、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ３．１−３．１９；第７章， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２， １９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８：１９６８−１９７４， １９８２；Ｈａｎｄａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：１５６４−１５７２， １９８５；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００， １９８６；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２， １９８８； Ｈｅｒｒｍａｎｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２， １９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８：１９６８−１９７４， １９８２；Ｈａｎｄａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：１５６４−１５７２， １９８５；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００， １９８６；Ｂｏｗｍａｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２， １９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３３：３２７−３４１， １９９１；Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：３０７９−３０９２， １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１３１】
Ｔ細胞依存免疫グロブリン反応およびアイソタイプスイッチングに関するアッセイ（例えば、Ｔ細胞依存抗体反応を変調し、そしてＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響を及ぼすポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４：３０２８−３０３３， １９９０；並びにＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ， １９９４， Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｖｏｌ １ ｐｐ．３．８．１−３．８．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， トロントに記載されるものが含まれる。
【０１３２】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（例えば、主にＴｈ１およびＣＴＬ反応を生じるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ３．１−３．１９；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００， １９８６；Ｔａｋａｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５０８−５１２， １９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３７７８−３７８３， １９９２に記載されるものが含まれる。
【０１３３】
樹状細胞依存アッセイ（例えば、未処置Ｔ細胞を活性化する樹状細胞に発現されるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｇｕｅｒｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３４：５３６−５４４， １９９５；Ｉｎａｂａら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：５４９−５５９， １９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５０７１−５０７９， １９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：２５５−２６０， １９９５；Ｎａｉｒら， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：４０６２−４０６９， １９９３；Ｈｕａｎｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５， １９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６９：１２５５−１２６４， １９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９４：７９７−８０７， １９９４；およびＩｎａｂａら， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７２：６３１−６４０，１９９０に記載されるものが含まれる。
【０１３４】
リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ（例えば、スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐポリペプチドおよびリンパ球恒常性を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：７９５−８０８， １９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：６５９−６７０， １９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１９４５−１９５１， １９９３；Ｉｔｏｈら， Ｃｅｌｌ ６６：２３３−２４３， １９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：４０３７−４０４５， １９９０；Ｚａｍａｉら， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４：８９１−８９７， １９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １：６３９−６４８， １９９２に記載されるものが含まれる。
【０１３５】
Ｔ細胞拘束および発生の初期段階に影響を与えるポリペプチドに関するアッセイには、限定なしに：Ａｎｔｉｃａら， Ｂｌｏｏｄ ８４：１１１−１１７， １９９４；Ｆｉｎｅら， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：１１１−１２２， １９９４；Ｇａｌｙら， Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７８， １９９５；Ｔｏｋｉら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５１， １９９１に記載されるものが含まれる。
【０１３６】
胚性幹細胞分化に関するアッセイ（例えば、胚性分化造血に影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：１４１−１５１， １９９５；Ｋｅｌｌｅｒら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：４７３−４８６， １９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら， Ｂｌｏｏｄ ８１：２９０３−２９１５， １９９３に記載されるものが含まれる。
【０１３７】
幹細胞生存および分化に関するアッセイ（例えば、リンパ造血を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙｓ， Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， １９９４， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ中， Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修 ｐｐ．２６５−２６８， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク；Ｈｉｒａｙａｍａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５９０７−５９１１， １９９２；Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， ＭｃＮｉｅｃｅおよびＢｒｉｄｄｅｌｌ， １９９４， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ中， Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修 ｐｐ．２３−３９， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク；Ｎｅｂｅｎら， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２２：３５３−３５９， １９９４；Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ， １９９４， Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ ａｒｅａ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ中， Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修 ｐｐ．１−２１， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク；Ｓｐｏｏｎｃｅｒら， １９９４， Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ中， Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修 ｐｐ．１６３−１７９， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ， １９９４， Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ中， Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修 Ｖｏｌ ｐｐ．１３９−１６２， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨークに記載されるものが含まれる。
【０１３８】
組織生成活性に関するアッセイには、限定なしに：国際特許公報第ＷＯ９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）；国際特許公報第ＷＯ９５／０５８４６号（神経、ニューロン性）；国際特許公報第ＷＯ９１／０７４９１号（皮膚、内皮）に記載されるものが含まれる。創傷治癒活性に関するアッセイには、限定なしに：ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｒｔｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７１：３８２−８４（１９７８）に修飾されるような、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ， ｐｐ．７１−１１２（ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏｖｅｅ監修）， Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， シカゴに記載されるものが含まれる。
【０１３９】
アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｖａｌｅら， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９１：５６２−５７２， １９７２；Ｌｉｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７９−７８２， １９８６；Ｖａｌｅら， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７６−７７９， １９８６；Ｍａｓｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６５９−６６３， １９８５；Ｆｏｒａｇｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３０９１−３０９５， １９８６に記載されるものが含まれる。
【０１４０】
細胞運動および接着に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第６．１２章， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂら Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：１３７０−１３７６， １９９５；Ｌｉｎｄら ＡＰＭＩＳ １０３：１４０−１４６， １９９５；Ｍｕｌｌｅｒら Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５８６０−５８６７， １９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１７６２−１７６８， １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１４１】
止血および血栓溶解活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｌｉｎｅｔら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２６：１３１−１４０， １９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ． ４５：４１３−４１９，１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら， Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ５：７１−７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ３５：４６７−４７４， １９８８に記載されるものが含まれる。
【０１４２】
受容体−リガンド活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第７．２８章， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ７．２８．１−７．２８．２２）， Ｔａｋａｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６８６４−６８６８， １９８７；Ｂｉｅｒｅｒら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８：１１４５−１１５６， １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：１４９−１６０ １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５９−６８， １９９４；Ｓｔｉｔｔら， Ｃｅｌｌ ８０：６６１−６７０， １９９５に記載されるものが含まれる。
【０１４３】
カドヘリン接着および浸潤抑制因子活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｈｏｒｔｓｃｈら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０（３２）：１８８０９−１８８１７， １９９５；Ｍｉｙａｋｉら Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１：２５４７−２５５２， １９９５；Ｏｚａｗａら Ｃｅｌｌ ６３：１０３３−１０３８， １９９０に記載されるものが含まれる。
【０１４４】
サイピン・ポリペプチドおよび核酸の診断用および他の使用
本発明が提供するサイピン・ポリペプチドをコードする核酸は、多くの診断または他の有用な目的に使用可能である。本発明の核酸は、解析、性質決定または療法使用のために組換えサイピン・ポリペプチドを発現するため；対応するポリペプチドを（恒常的に、あるいは組織分化もしくは発生の特定の時期にまたは疾患状態において）優先的に発現する組織のマーカーとして；サザンゲル上の分子量マーカーとして；染色体１８を同定するかまたは未知の遺伝子位をマッピングするための染色体マーカーまたはタグとして（標識した場合）；潜在的な遺伝子障害を同定するために患者における内因性ＤＮＡ配列と比較するため；ハイブリダイズしそしてしたがって新規関連ＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを導くための情報供給源として；他の新規核酸を発見する過程において、既知の配列を「取り去る（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」ためのプローブとして；発現パターンの検査のためを含む、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着するオリゴマーを選択し、そして作成するため；ＤＮＡ免疫技術を用いて、抗ポリペプチド抗体を作成するため；抗ＤＮＡ抗体を作成するかまたは別の免疫反応を誘発するための抗原として、そして遺伝子治療のために使用可能である。
【０１４５】
サイピン・ポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：ポリペプチドを精製し、そしてその活性を測定すること；搬送剤；療法および研究用試薬；分子量および等電点電気泳動マーカー；ペプチド断片化用の対照；未知のポリペプチドの同定；並びにサイピン特異的抗体の調製。これらの使用に適したいずれかのまたはすべての核酸は、製品として商品化するため、試薬等級材料またはキット形式に発展させることが可能である。上に列挙する使用を実行する方法は、当業者に公知である。こうした方法を開示する参考文献には、限定なしに、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ． ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ監修， １９８９、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ監修， １９８７が含まれる。
【０１４６】
プローブおよびプライマー。開示するサイピン核酸、およびその断片の組み合わせの使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含んでなる。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含んでなる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示され、そして上に詳細に記載している。遺伝暗号の知識を、上に示すアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することが可能である。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離し、そして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。特定の態様において、非ヒト遺伝子ライブラリー用のプローブとして、縮重プライマーを使用することが可能である。こうしたライブラリーには、限定されるわけではないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、およびエレクトロニックＥＳＴ（発現配列タグ）またはＤＮＡライブラリーさえ含まれるであろう。その後、この方法で同定された相同配列をプローブとして用いて、非ヒト・サイピン相同体を同定するであろう。
【０１４７】
染色体マッピング。当業者は、サイピン・ポリペプチドをコードする核酸、並びにこれらの核酸の開示する断片および組み合わせを、ヒト１８ｑ２１．３の染色体マーカーとして用いることが可能である。さらに、本発明の核酸またはその断片を位置マーカーとして用いて、未知の位置の他の遺伝子をマッピングすることが可能である。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッドマッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞株に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの多様な公知の技術におけるプローブとして、オリゴヌクレオチドを含むサイピン核酸配列または部分を使用することが含まれる。
【０１４８】
放射ハイブリダイゼーションのため、まず、９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う。この方法のため、目的の遺伝子の推定上のエクソン内にあり、そしてヒトゲノムＤＮＡから産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないＰＣＲプライマーを用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、これをワールドワイドウェブ上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト、ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕに提出する。該データはスコア化され、そして放射ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた染色体割り当ておよび配置が提供される。放射ハイブリッドマッピングに関するさらなる情報はまた、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴウェブサイト、ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕでもアクセス可能である。
【０１４９】
診断法および遺伝子治療。当業者は、サイピン・ポリペプチドをコードする核酸、および開示する断片、並びにこれらの核酸の組み合わせを用い、公知の技術を用いて、サイピン遺伝子またはその変異体と関連する異常を解析することが可能である。これによって、このマーカーが再編成されているかまたは欠失している状態を識別することが可能になり、そして特定の医学的障害を診断するためにこの情報が使用可能である。さらに、本発明の核酸に対応する遺伝子の不全または不十分な量によって（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのにも、サイピンＤＮＡが使用可能である。天然ヌクレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、および当該技術分野に知られる遺伝子治療技術を用いて、正常サイピン遺伝子でのその交換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示する天然ヌクレオチド配列と、サイピン遺伝子に不全を宿すると推測されるヒト由来の遺伝子のものとを比較することによって、検出可能である。
【０１５０】
結合パートナーに関するスクリーニング法。サイピン・ポリペプチドおよびその断片を、方法における試薬として用いて、サイピンに阻害される標的プロテアーゼなどのサイピン結合パートナーに関してスクリーニングするか、または該パートナーを同定することが可能である。例えば、精製組換えサイピン・ポリペプチドを固体支持体材料に付着させて、そしてアフィニティークロマトグラフィーと類似の方式で、プロテアーゼ結合パートナー（類）を捕捉する試薬として用いることが可能である。特定の態様において、慣用法によって、ポリペプチドを固体支持体に付着させる。一例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含有するクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、サイピン／Ｆｃポリペプチド（上に論じるようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じて、プロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに付着させる。
【０１５１】
サイピン・ポリペプチドはまた、細胞表面上にサイピン結合パートナーを発現する細胞を同定するのにも使用を見出す。精製サイピン・ポリペプチドを、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは類似の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば磁気微小球体をポリペプチドでコーティングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器に保持することが可能である。潜在的な結合パートナー発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドを有する固相と接触させる。細胞表面上に結合パートナーを発現する細胞は固定ポリペプチドに結合し、そして未結合細胞は洗い流される。あるいは、サイピン・ポリペプチドを検出可能部分にコンジュゲート化し、その後、結合パートナー発現に関して試験しようとする細胞とインキュベーションする。インキュベーション後、未結合標識物質を取り除き、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を決定する。さらなにあるいは、結合パートナーを発現すると推測される細胞の混合物を、ビオチン化したポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性が、所望の細胞のビーズへの結合を提供する。アビジンでコーティングしたビーズの使用法が知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９， １９８６を参照されたい）。非結合成分を取り除く洗浄、および結合細胞の遊離は、慣用法を用いて行う。いくつかの場合、結合パートナーに関してスクリーニングするか、または該パートナーを同定する上記の方法はまた、こうした結合パートナー分子またはそれらを発現する細胞などを用いるかまたは修飾して、単離するかまたは精製することが可能である。あるいは、これらの同じアッセイを用いて、細胞抽出物中のサイピン結合パートナーを検出することが可能である。
【０１５２】
生物学的活性の測定。サイピン・ポリペプチドはまた、結合親和性に関して、サイピン結合ポリペプチドの生物学的活性を測定するのにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異なる条件下でのポリペプチドの貯蔵寿命および安定性を監視するための、「品質保証」研究を行うものによって、使用可能である。例えば、ポリペプチドは、異なる温度で保管されているか、または異なる細胞種で産生された結合パートナーポリペプチドの生物学的活性を測定する、結合親和性研究に使用可能である。サイピン・ポリペプチドはまた、結合パートナーポリペプチドの修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然変異等）後、生物学的活性が保持されているかどうか決定するのにも使用可能である。修飾ポリペプチドの結合親和性を、非修飾結合ポリペプチドのものと比較して、結合ポリペプチドの生物学的活性に対する該修飾のいかなる不利な影響も検出する。例えば研究に用いる前に、こうして結合ポリペプチドの生物学的活性を確かめることが可能である。
【０１５３】
キャリアーおよび搬送剤。該ポリペプチドはまた、付着する剤を、同定された結合パートナーを所持している細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。したがって、該ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞（または、細胞表面上に結合パートナーを発現することが見出された他の細胞種）に搬送するのに使用可能である。ポリペプチドに付着させてもよい検出可能（診断用）および療法剤には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞傷害性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等が、意図する適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の例は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）である。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、および⁷⁶Ｂｒが含まれる。療法使用に適した放射性核種の例は、¹³¹Ｉ、²¹¹Ａｔ、⁷⁷Ｂｒ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁴Ｃｕ、および⁶⁷Ｃｕである。こうした剤は、いかなる適切な慣用法によって、ポリペプチドに付着させてもよい。ポリペプチドは、例えば、所望の剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含んでなる。あるいは、ポリペプチドまたは剤を誘導体化し、所望の反応性官能基を生成するか、または付着させてもよい。誘導体化には、多様な分子をポリペプチドに付着させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの付着を伴ってもよい。ポリペプチドを放射標識するいくつかの技術が知られる。例えば、適切な二官能キレート剤を用いることによって、放射性核種金属をポリペプチドに付着させることが可能である。こうしてポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含んでなるコンジュゲート（好ましくは共有結合）を調製する。該コンジュゲートを、特定の適用に適した量で投与するか、または別の方式で使用する。
【０１５４】
サイピン・ポリペプチドおよびそのアンタゴニストでの疾患の治療
実施例６に示すように、サイピンｍＲＮＡは、皮膚で比較的高レベルに発現される。実施例６は、ＲＮＡ解析前に、肺上皮細胞をＩＬ−４およびＩＬ−１３の組み合わせに曝露すると、サイピン発現が選択的に誘導されることをさらに示す。アレルギーおよび他の肺疾患を含む、特定の疾患は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および他のサイトカインレベルの上昇と関連し、そして組織破壊を引き起こす多様なプロテアーゼレベルの上昇とも関連する。
【０１５５】
したがって、本発明の１つの側面は、肺障害を有する患者においてプロテアーゼレベルを減少させるための、サイピンを含有する生理学的に許容しうる組成物を提供する。これらの組成物は、単独で、あるいは肺障害を治療するのに用いられる他の医薬品または治療と組み合わせて用いることが可能であるし、そして注入またはエアロゾル搬送によって肺に直接投与することが可能である。サイピンを投与することによって治療可能な肺障害には、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺胞タンパク症、ブレオマイシン誘導肺疾患および線維症、放射線誘導肺線維症、嚢胞性線維症、肺におけるコラーゲン集積、およびＡＲＤＳが含まれる。サイピンを投与することによって治療可能な他の肺障害には、慢性気管支炎または肺気腫と関連する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症、特発性肺線維症および放射線誘導肺線維症などの線維性肺疾患；肺サルコイドーシスを含むサルコイドーシス；並びにアレルギー性鼻炎、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎および喘息を含むアレルギーが含まれる。
【０１５６】
サイピンを含有する組成物の投与はまた、限定されるわけではないが、疱疹状皮膚炎（デューリング病）、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、じんま疹（慢性特発性じんま疹を含む）を含む多様な皮膚疾患、並びに尋常性類天疱瘡および水疱性類天疱瘡を含む自己免疫水疱形成疾患を患う患者において、プロテアーゼレベルを減少させるのにも有用である可能性がある。皮膚障害を治療するため、注入によって、エアロゾルを介して、サイピン組成物を全身投与することが可能であるし、または局所注入を介して局所投与することが可能であるし、あるいは、罹患領域にローション、軟膏、クリーム、またはゲル中で直接適用することが可能である。
【０１５７】
さらに、本発明のサイピン・ポリペプチド、断片、変異体、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、および結合パートナーは、限定されるわけではないが、以下の群のものを含む、１以上の医学的状態および疾患を予防し、治療しそして／または診断するのに潜在的に有用である：乾癬；湿疹；染色体１８ｑの破壊点または欠失を伴う癌；肺、頚管および食道の癌腫を含む扁平上皮癌；変形性関節炎および慢性関節リウマチを含む関節炎関節における細胞外マトリックス破壊または病変形成を伴う関節炎；肝硬変；血栓症；肺気腫；血管性浮腫（ａｎｇｉｏｄｅｍａ）；腫瘍増殖；血管止血に関与する障害；補体活性化を伴う障害；腫瘍浸潤および転移などの細胞外マトリックスの異常な分解に関連する障害；消化に関与する障害；線維素溶解の調節に関与する障害；凝血カスケードの障害；炎症および高血圧における血管拡張に関連する障害。
【０１５８】
使用する療法分子または分子類は、治療しようとする異常の病因および関与する生物学的経路に応じるであろうし、そしてサイピン・ポリペプチドの変異体、断片、および結合パートナーは、サイピン・ポリペプチドと類似の影響または異なる影響を有する可能性がある。サイピン・レベルまたは活性を操作するのに有用な分子は、本発明の全長サイピン・ポリペプチドまたはその断片、アリル変異体、突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、および結合パートナーを含むことが可能であり、そして本明細書に記載する生物学的および療法的考慮にしたがって、個々の当業者により、本発明の態様として提供されるものから、特定の分子または分子類を選択することが可能であると理解される。
【０１５９】
サイピン・ポリペプチドおよびそのアンタゴニストの投与
本発明は、医学的障害、そして特に上述の障害などのサイピン仲介障害を患う患者、好ましくは哺乳動物患者、そして最も好ましくはヒト患者を治療するための化合物、組成物、および方法を提供する。こうしたサイピン仲介障害には、サイピンおよびその結合パートナー間の結合によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態が含まれる。本開示の目的のため、用語「疾病」、「疾患」、「医学的状態」、「異常な状態」等は、用語「医学的障害」と交換可能に用いられる。用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、本明細書において、治癒的、防御的（例えば予防的）および対症的または寛解的治療が含まれる。こうした療法的使用のため、サイピン・ポリペプチドおよび断片、サイピン・ポリペプチドをコードするサイピン核酸、並びに／あるいは抗体などのサイピン・ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、公知の手段を通じて、必要な患者に投与することが可能である。本発明の組成物は、天然ポリペプチド、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的活性断片などの、本明細書に記載するいかなる型のポリペプチドを含有してもよい。特定の態様において、組成物は、可溶性ポリペプチド、あるいは可溶性サイピン・ポリペプチドを含んでなるオリゴマーを含んでなる。
【０１６０】
療法的に有効な量。本発明の治療法または使用法を実施する際、本発明の療法剤の療法的有効量を、好ましくはサイピン・ポリペプチドの活性に関連する疾患を治療するかまたは寛解するため、治療しようとする状態を有する被験者に投与する。「療法剤」には、限定なしに、本明細書に記載するサイピン・ポリペプチド、断片、および変異体；サイピン・ポリペプチド、断片、および変異体をコードする核酸；サイピンに特異的なアゴニスト性またはアンタゴニスト性抗体などのサイピン・ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；サイピン・ポリペプチド結合パートナー；並びにサイピン・ポリペプチド、断片、変異体、および結合パートナーで形成される複合体などのいずれかが含まれる。本明細書において、用語「療法的有効量」は、意味がある患者の利益、すなわち相当する医学的状態の治療、治癒、予防または寛解、あるいはこうした状態の治療、治癒、予防または寛解率の増加を示すのに十分な薬剤組成物または方法の各療法剤または他の活性構成要素の総量を意味する。本明細書に提供する療法剤は、他の療法剤と組み合わせて、連続して、交互に、または同時に投与することが可能である。
【０１６１】
本明細書において、句、療法剤の「療法的有効量を投与する」は、障害の重症度を反映する、少なくとも１つの示標において、改善、そして好ましくは持続した改善を誘導するのに十分な量および時間、前記療法剤で患者を治療することを意味する。改善は、患者が、１日以上、またはより好ましくは１週間以上離れた、少なくとも２回の機会に改善を示したならば、「持続した」とみなされる。改善の度合いは、表明または症状に基づいて決定され、そして決定はまた、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ−ｏｆ−ｌｉｆｅ）アンケートなどの、患者に実施されるアンケートを使用することも可能である。患者の疾病の度合いを反映する多様な示標は、治療の量および期間が十分であるかどうか決定するため、評価することが可能である。選択された単数または複数の示標に関するベースライン値は、療法剤の最初の用量の投与前に、患者を検査することによって、確立する。好ましくは、ベースライン検査は、最初の用量投与の約６０日以内に行う。急性症状を治療するために療法剤が投与される場合、最初の用量は、傷害が生じた後、現実的にできるだけ速やかに投与する。患者が、選択された単数または複数の示標のベースラインを越える改善を明示するまで、サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストなどの療法剤を投与することによって、改善を誘導する。慢性状態を治療する際、改善のこの度合いは、少なくとも１ヶ月以上、例えば、１、２、もしくは３ヶ月またはそれ以上の期間、あるいは無期限に、この医薬品を反復投与することによって、得られる。１〜６週間の期間、または単回用量であっても、しばしば、急性状態または傷害を治療するのに十分である。治療後の患者の疾病の度合いが、１以上の示標にしたがって、改善されているように見えたとしても、同一レベル、あるいは減少した用量または頻度で、無期限に治療を続けてもよい。ひとたび治療を減少させるかまたは中断したら、後に、症状が再出現した場合、元来のレベルで再開してもよい。
【０１６２】
投薬量決定。当業者は、適切な投薬量は、治療しようとする障害の性質および重症度、患者の体重、年齢、全身状態、および以前の疾病および／または治療、並びに投与経路などの要因に応じて、多様であろうことを認識するであろう。予備的用量は、動物試験にしたがって決定することが可能であり、そしてヒト投与の投薬量決定は、標準的投薬量決定試験などの、当該技術分野に認められた慣例にしたがって行う。例えば、療法的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから概算することが可能である。投薬量は、化合物の比活性に応じるであろうし、そして日常的な実験によって、容易に決定可能である。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含みつつ、毒性を最小限にする、循環血漿濃度範囲を達成するよう、処方することが可能である。こうした情報を用いて、ヒトにおいて、有用な用量を、より正確に決定することが可能である。最終的には、主治医が、個々の患者各々を治療する、本発明の療法剤の量を決定するだろうし、そして個々の患者が必要とするのに応じて、投与用量および頻度を変調することが可能である。
【０１６３】
サイピンまたはその断片、サイピン・アンタゴニストであるタンパク質またはサイピン・アゴニストであるタンパク質を含んでなる薬剤組成物は、ｋｇ体重あたり、約０．０１ｎｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラム〜約１ｍｇ）のポリペプチドを含有すべきである。本発明の１つの態様において、本明細書に開示する多様な医学的障害を治療するため、こうした組成物を週１回投与し、別の態様において、少なくとも週２回投与し、そして別の態様において、少なくとも週３回投与する。注射する場合、成人用量あたり、有効量のサイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストは体表面積に基づいて計算可能であり、そして１〜２０ｍｇ／ｍ²の用量を含むことが可能であり、そして好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ²を含む。あるいは、均一用量を投与してもよく、その量は、５〜１００ｍｇ／用量の範囲であってもよい。皮下注射によって投与される均一用量の典型的な用量範囲は、５〜２５ｍｇ／用量、２５〜５０ｍｇ／用量および５０〜１００ｍｇ／用量である。本発明の１つの態様において、１、５、１０、２５または５０ｍｇを含有する均一用量で、サイピン・ポリペプチドを含有する注射に許容しうる調製を投与することによって、医学的障害を治療する。１、５、１０、２５または５０ｍｇ用量は、特に慢性状態に対して、反復投与することが可能である。注射以外の投与経路を用いるならば、用量は、標準的な医学的実施にしたがって、適切に調節する。
【０１６４】
投与頻度および治療期間は多様である可能性がある。多くの場合、患者状態の改善は、少なくとも３週間の期間に渡って、週１〜３回、あるいは少なくとも３週間、週１または２回、療法的用量のサイピン・ポリペプチドまたはサイピン・アンタゴニストを注射することによって得られるであろうが、所望の度合いの改善を誘導するのに、より長い期間の治療が必要である可能性がある。不治の慢性状態では、措置は、患者の医師によって、こうしたものが必要だと思われたならば、用量および頻度に調整を行ったうえ、無期限に続けてもよい。前述の用量は、１８歳以上の年齢のヒトである、成体患者に関する例である。
【０１６５】
小児科患者（年齢４〜１７歳）に関しては、１つの適切な措置は、週あたり１回以上の皮下注射によって投与される、最大用量２５ｍｇまでのサイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストの０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射を伴う。サイピン・ポリペプチドに対する抗体を、サイピン・ポリペプチドアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗サイピン抗体の別の好ましい用量範囲は、０．７５〜７．５ｍｇ／体重ｋｇである。ヒト化抗体、すなわち、抗体分子の抗原結合部分が非ヒト供給源由来である抗体が好ましい。こうした抗体は、静脈内注射または投与することが可能である。
【０１６６】
処方。本発明のサイピン・ポリペプチド（限定なしに組換えおよび非組換え供給源を含む、いかなる供給源由来でもよいもの）の有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含んでなる組成物を、本明細書に提供する。用語「薬学的に許容しうる」は、活性成分（類）の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性成分を意味する。投与に適した処方には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液；並びに懸濁剤または粘稠化剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがって、処方可能である。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版， １９８０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。さらに、薬剤組成物用のサイピンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化しているか、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル類、デキストラン等のポリマー化合物に取り込まれているか、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよい。リポソーム処方に適した脂質には、限定なしに、モノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リゾレシチン、リン脂質類、サポニン、胆汁酸類等が含まれる。こうしたリポソーム処方の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号に開示されるように、当該技術分野の技術レベルの範囲内である。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、またはｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって、意図される適用にしたがって選択され、そのため、キャリアーの特性は、選択された投与経路に応じるであろう。本発明の１つの好ましい態様において、サイピン・ポリペプチドの持続放出型を用いる。開示する方法で使用するのに適した持続放出型には、限定されるわけではないが、緩慢溶解生体適合性ポリマー（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸微小粒子など）に被包されたサイピン・ポリペプチド、このようなポリマー（局所適用ヒドロゲル類を含む）と混合されたもの、および／または生体適合性半透性移植物中に入れられたものが含まれる。
【０１６７】
療法化合物の組み合わせ。本発明は、サイピン・ポリペプチド、アンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせて同一患者に投与する１以上の他の薬剤と同時の、サイピン・ポリペプチド、サイピン・アンタゴニストまたはサイピン・アゴニストの投与をさらに提供し、各薬剤は、その医薬品に適した措置にしたがって投与する。一般的に、さらなる薬剤は、そのためにサイピンを投与するのと同一の医学的状態に対して有効なものである。「同時投与」は、組み合わせた構成要素での同時または連続治療と共に、薬剤を交互に投与する措置、または一方の構成要素を長期に投与し、そして単数または複数の他方のものを断続して投与する措置を含む。構成要素は、同一または別個の組成物中で、そして同一または異なる投与経路によって投与してもよい。薬剤組成物はさらに、サイピン・ポリペプチドの活性を増進するか、あるいは治療においてその活性または使用を補足する（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）他の剤を含有することが可能である。こうしたさらなる因子および／または剤を薬剤組成物中に含んで、本発明のポリペプチドとの相乗効果を生じるか、または副作用を最小限にすることが可能である。逆に、本発明のサイピン・ポリペプチド、アンタゴニストまたはアゴニストは、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小限にするため、特定のサイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の処方中に含まれることが可能である。同時に投与すべき薬剤のさらなる例には、限定されるわけではないが、鎮痛剤、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤、ペントキシフィリン、サリドマイド、並びにアザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン硫酸、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、および経口金、金チオリンゴ酸ナトリウム、および金チオグルコースなどの金化合物などの疾患修飾抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）が含まれる。さらに、サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストは、サイピン・ポリペプチドに対する抗体、または天然サイピン・ポリペプチドの競合的阻害剤として作用するサイピン・ポリペプチド由来ペプチドを含む、第二のサイピン・ポリペプチド／アンタゴニストと組み合わせることが可能である。
【０１６８】
投与経路。いかなる有効な投与経路を用いて、核酸を含んでなる組成物を含む、サイピン・ポリペプチドまたはそのアンタゴニストを、療法的に投与してもよい。非経口投与には、例えば、多量（ｂｏｌｕｓ）注射によるか、または連続注入による、関節内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介した、注射が含まれ、そしてまた、例えば疾患または傷害部位での局所投与も含まれる。投与の他の適切な手段には、移植物からの持続放出；エアロゾル吸入および／またはガス注入；点眼剤；膣または直腸座薬；頬側調製；丸剤（ピル）、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製；およびローション、ゲル、スプレー、軟膏または他の適切な技術などの局所調製が含まれる。あるいは、ポリペプチドを発現する培養細胞を移植することによって、例えばサイピン・ポリペプチドまたはタンパク質性アンタゴニストを発現する細胞を移植することによって、サイピン・ポリペプチド、アンタゴニストまたはアゴニストを投与することが可能である。細胞はまた、増殖を変調するため、またはこうした細胞で所望の効果または活性を生じるため、サイピン・ポリペプチドの存在下で、ｅｘ ｖｉｖｏで培養することも可能である。その後、処理した細胞を、療法目的のため、ｉｎ ｖｉｖｏで導入することが可能である。
【０１６９】
別の態様において、サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストをコードするＤＮＡでの、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのトランスフェクションによって、患者自身の細胞が、サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストを産生するよう、誘導する。このＤＮＡは、例えば、サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストをコードする裸のＤＮＡまたはリポソーム被包ＤＮＡを注入することによって、あるいはトランスフェクションの他の手段によって、患者の細胞に導入することが可能である。本発明の核酸はまた、細胞または生物への核酸の導入のための他の既知の方法（限定なしに、ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形でのものが含まれる）によっても、患者に投与することが可能である。サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニストを、１以上の他の生物学的に活性である化合物と組み合わせて投与する際、これらは、同一のまたは異なる投与によって投与可能であり、そして同時に、別個に、または連続して投与可能である。
【０１７０】
経口投与。本発明の療法剤の療法的有効量を経口投与する際、本発明のポリペプチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形であろう。錠剤型で投与する際、本発明の薬剤組成物は、さらに、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体キャリアーを含有してもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、本発明のポリペプチドを約５〜９５％、そして好ましくは本発明のポリペプチドを約２５〜９０％含有する。液体型で投与する際、水、エタノール、石油、ピーナツ油、ミネラルオイル、ダイズ油、またはゴマ油などの動物または植物起源の油、あるいは合成油などの液体キャリアーを添加してもよい。薬剤組成物の液体型はさらに、生理学的生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含有してもよい。液体型で投与する際、薬剤組成物は、本発明のポリペプチドを、重量約０．５〜９０％、そして好ましくは、本発明のポリペプチドを、約１〜５０％含有する。
【０１７１】
注射による投与。ポリペプチドを含んでなる療法剤の場合、注射が好ましい投与経路の１つである。本発明のポリペプチドの療法的有効量を、静脈内、皮膚または皮下注射によって投与する際、本発明のポリペプチドは、発熱物質不含で非経口的に許容しうる水性溶液の形であろう。ｐＨ、等張性、安定性等を十分考慮した、こうした非経口的に許容しうるポリペプチド溶液の調製は、当該技術分野の範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい薬剤組成物は、本発明のポリペプチドに加え、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、乳酸リンゲル注射剤、または当該技術分野に知られるような他のビヒクルを含有すべきである。本発明の薬剤組成物はまた、当業者に知られる、安定化剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、または他の添加物も含有してもよい。本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の期間は、治療する疾患の重症度、並びに個々の患者各々の状態および潜在的な特異体質反応に応じて、多様であろう。本発明のポリペプチドの各適用期間は、連続静脈内投与１２〜２４時間の範囲内であろうと意図される。最終的には、主治医が、本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の適切な期間に関して、決定するであろう。
【０１７２】
骨および組織投与。骨、軟骨、腱または靭帯障害を治療するのに有用な本発明の組成物に関しては、療法は、局所的に、全身性に、あるいは移植物または装置として局在的に、組成物を投与することを含む。投与する際、本発明に使用するための療法組成物は、もちろん、発熱物質不含で、生理学的に許容しうる型である。さらに、組成物は、望ましくは、骨、軟骨または組織損傷部位に搬送するため、粘稠性型で被包または注射してもよい。創傷治癒および組織修復には、局所投与が適している可能性がある。所望により、上述のような組成物中に含まれていてもよい、本発明のポリペプチド以外の療法的に有効な剤が、本発明の方法において、組成物と同時にまたは連続して、代わりにまたはさらに投与されてもよい。好ましくは、骨および／または軟骨形成のため、組成物は、骨および／または軟骨損傷部位に、ポリペプチド含有組成物を搬送し、発展する骨および軟骨のための構造を提供することが可能であり、そして最適には、体に吸収されることが可能であるマトリックスを含むであろう。こうしたマトリックスは、他の移植医学的適用のため、現在用いられる素材で形成されることが可能である。マトリックス素材の選択は、生体適合性、生物分解性、機械的特性、美容的外見および界面特性に基づく。組成物の特定の適用が適切な処方を明確にするであろう。組成物のための潜在的なマトリックスは、生物分解性でそして化学的に定義される、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ無水物であることが可能である。他の潜在的な素材は、骨または真皮コラーゲンなどの生物分解性で生物学的によく定義されるものである。さらなるマトリックスは、純粋ポリペプチドまたは細胞外マトリックス構成要素で構成される。他の潜在的なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどの、非生物分解性でそして化学的に定義されるものである。マトリックスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、上述の種類の素材のいずれかの組み合わせで構成されてもよい。バイオセラミックスは、カルシウム−アルミン酸−リン酸におけるように、組成物が改変されていてもよく、そしてプロセシングして、孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状、および生物分解性などの組成が改変されていてもよい。現在好ましいのは、１５０〜８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔粒子の形の、乳酸およびグリコール酸の５０：５０（モル重量）コポリマーである。いくつかの適用において、カルボキシメチルセルロースまたは自己血餅などの隔絶剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を利用して、ポリペプチド組成物がマトリックスから解離するのを防止することが有用であろう。隔絶剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、およびカルボキシメチル−セルロースを含む、アルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）などのセルロース性素材であり、最も好ましいのは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩である。他の好ましい隔絶剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が含まれる。本明細書において有用な隔絶剤の量は、総処方重量に基づいて、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、これは、ポリマーマトリックスからのポリペプチドの脱離を防止し、そして組成物の適切な取り扱いを提供するのに必要な量であり、それでもなお前駆細胞がマトリックスに浸潤するのを防止するほど多くなく、それによってポリペプチドが前駆細胞の骨形成活性を補助する機会を提供する量に相当する。
【０１７３】
さらなる組成物において、本発明のポリペプチドは、骨および／または軟骨欠損、創傷または問題の組織の治療に有益な他の剤と組み合わせることが可能である。これらの剤には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの多様な増殖因子が含まれる。組織再生に使用すべきポリペプチド含有薬剤組成物の投薬措置は、ポリペプチドの作用を修飾する多様な要因、例えば形成されるのが望ましい組織重量、損傷部位、損傷組織の状態、創傷サイズ、損傷組織の種類（例えば骨）、患者の年齢、性別、および食餌、感染の重症度、投与時間および他の臨床的要因を考慮して、主治医によって決定されるであろう。投薬量は、再構成に用いたマトリックスの種類、および薬剤組成物中の他のポリペプチドの包含に応じて、多様である可能性がある。例えば、ＩＧＦ Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）などの他の既知の増殖因子を最終組成に添加してもまた、投薬量が達成される可能性がある。経過は、組織／骨増殖および／または修復の定期的な評価、例えばＸ線、組織形態計測的測定およびテトラサイクリン標識によって、監視することが可能である。
【０１７４】
獣医学的使用。ヒト患者に加え、サイピン・ポリペプチドおよびアンタゴニストは、ペット（イヌ、ネコ、鳥、霊長類等）、飼育農場動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、鳥類等）などの、非ヒト動物または異常なサイピン発現を伴う状態を患う動物いずれかの疾患状態の治療に有用である。こうした例では、適切な用量は、動物の体重にしたがって決定可能である。例えば、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの用量が使用可能である。あるいは、用量は、動物の表面面積にしたがって決定され、典型的な用量は、０．１〜２０ｍｇ／ｍ²、またはより好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ²の範囲である。イヌまたはネコなどの小動物に関しては、適切な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。好ましい態様において、サイピン・ポリペプチドまたはアンタゴニスト（好ましくは患者と同じ種由来の遺伝子で構築される）は、動物の状態が改善されるまで、週１回以上、注射または他の適切な経路によって投与するか、あるいは無期限に投与可能である。
【０１７５】
医薬品製造。本発明はまた、本明細書に開示する医学的障害の予防または療法的治療のための医薬品製造における、サイピン・ポリペプチド、断片、および変異体；サイピン・ポリペプチド、断片、および変異体をコードする核酸；抗体などのサイピン・ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；サイピン・ポリペプチド結合パートナー；サイピン・ポリペプチド、断片、変異体、および結合パートナーで形成される複合体等の使用にも関する。
【０１７６】
本明細書に開示するサイピン配列の天然存在ゲノム変異体として、サイピン・ポリペプチドの変異を提供する；こうした変異は、個々にまたはいかなる組み合わせで、あるいは上述のような選択的スプライシング変異と組み合わせて、サイピン・ポリペプチドまたは核酸に取り込むことも可能である。
【０１７７】
以下の実施例は、特定の態様を例示することを意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
ヒト・セルピン・ファミリー新規メンバーの同定
以下に記載するように、新規セルピン遺伝子を同定し、そして配列決定した。この新たに発見されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１に示す。この新規セルピン遺伝子は、主に上皮組織で発現されているようである（以下の実施例２を参照されたい）ため、「サイピン」と名づけた。
【０１７９】
サイピンは以下のように発見された。ヒトゲノムにコードされると予測されるアミノ酸配列の列挙を含むデータセットをＣｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックビル）から受け取った。このデータセットをＢＬＡＳＴアルゴリズムで検索して、セルピン・ファミリーポリペプチドを同定した。Ｒ２２ゲノムコンティグ５１８０４５９０に位置するＩＭＸ９６８６７は、新規セルピン遺伝子のエクソン１であると認識された。２つの他のセルピン遺伝子断片、ＩＭＸ９６８６９およびＩＭＸ９６８７４が、同じ新規セルピン遺伝子のエクソン３および６を含有することを見出した。これらの３つのエクソンがＲ２２ゲノムコンティグ５１８０４５９０上で隣接することを見出した。ＳＣＣＡ−２ ｃＤＮＡ配列を用いた電子ゲノムウォーキングによって、この同一コンティグ上で、３つの他の隣接サイピン・エクソン（エクソン４、５および７）を同定した。胸腺ｃＤＮＡを配列決定することによって、エクソン２を発見した。Ｒ２２ゲノムコンティグ５１８０４５９０上、エクソン１および３の間に位置することを決定して、エクソン２であることを確認した。
【０１８０】
胸腺ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、逆転写酵素−ＰＣＲクローニングおよび配列決定によって、この新規セルピンの完全コード配列を決定した。この試みでは、サイピンの５’および３’非翻訳領域に対して設計した以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
配列番号３：５’ ＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＴＣＧＴＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣ ３’
配列番号４：５’ ＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＴＡＣＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＣ ３’
上述の２つのオリゴヌクレオチドは、ヒト胸腺由来の転写物に対応するｃＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマーとして用いた。以下に示す入れ子プライマーを用いた、別の周期のＰＣＲを用いて、開始メチオニンから終結コドンまでのサイピンｃＤＮＡを増幅した。これらの入れ子プライマーは以下の配列を有した：
配列番号５：５’ ＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ ３’
配列番号６：５’ ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＡＴＡＡＡＡＧＡＧ ３’
以下のさらなるＰＣＲプライマーもまた用いて、サイピンのエクソン１、２および３をコードするｃＤＮＡを生成した：
配列番号７：５’ ＡＴＧＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＴＡＣＡＧＣ ３’
配列番号８：５’ ＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＴＴＧＧ ３’
ＰＣＲ研究から得た配列は、最初にＲ２２ゲノムコンティグ５１８０４５９０で同定されたサイピン・エクソン配列を確認した。エクソン２は、エクソン１およびエクソン３に渡るＰＣＲ産物中に同定された。
【０１８１】
サイピンの遺伝子構造は、配列番号１に示すｃＤＮＡ配列とＲ２２ゲノムコンティグ５１８０４５９０を比較することによって決定した。サイピン遺伝子はまた、ゲノムコンティグＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ０１５５３６にも存在することが見出された。ＡＣ０１５５３６コンティグにおいて、サイピン・コード配列を含有するエクソンのおおよその位置を以下の表１に示すと共に、配列番号１において、これらのヌクレオチドの対応する位置を示す。表１はまた、どのアミノ酸が７つのサイピン・エクソン各々にコードされるかも示す。
【０１８２】
表１
【０１８３】
【表１】
【０１８４】
サイピン遺伝子のコード領域には、ＡＣ０１５５３６コンティグ上、およそ１０，９００ヌクレオチドの距離に渡る、７つのエクソンおよび６つのイントロンが含まれる。サイピンの完全オープンリーディングフレームは、１２７５ヌクレオチドからなり、そして４２５アミノ酸を含有するタンパク質をコードする（配列番号１および２）。各イントロンは、その５’および３’境界でコンセンサススプライシング部位を有する。サイピン遺伝子の５’および３’非翻訳領域が、表１に示すような５’および３’端に対応する部分を越えて、コンティグ配列に沿ってさらに伸長可能である可能性がある。
【０１８５】
サイピンのアミノ酸配列（配列番号２）を他のセルピン・ファミリーメンバーのアミノ酸配列と比較した。アミノ酸類似性スコアリングマトリックス＝ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ生成ペナルティ＝８、およびギャップ伸長ペナルティ＝２で、ＧＣＧ「プリティ」多数配列並列プログラムを用いて、並列を行った。サイピンと最も近く関連するいくつかのセルピンは、ＬＥＩ（配列番号９）、ＰＡＩ２（配列番号１０）、ＳＥＲＰＩＮＢ１０（配列番号１１）、ＳＣＣＡ−１（配列番号１２）、ＳＣＣＡ−２（配列番号１３）、およびプロスタピン（配列番号１４）であった。表２のＬＥＩ、ＰＡＩ２、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２およびプロスタピン配列の供給源は、それぞれ：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ第Ｐ３０７４０号；ＧｅｎＢａｎｋ第ＸＰ＿００８７４６号；ＧｅｎＢａｎｋ第ＮＰ＿００５０１５号；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ第Ｐ２９５０８号；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ第Ｐ４８５９４号；およびＧｅｎｅＳｅｑ第Ｙ１５１５６号であった。表２において、並列を容易にするため、提示する並列から配列番号１４のアミノ酸２０７〜４３０のプロスタピン挿入を省いた。表２は、並列中の少なくとも５つのアミノ酸配列間で同一であるコンセンサス残基を含む。表２の大文字の残基は、コンセンサス残基とマッチするものである。表２のアミノ酸残基の番号付けは、サイピン・アミノ酸配列（配列番号２）のこれらの残基の位置に対応する。
【０１８６】
表２
【０１８７】
【表２ａ】
【０１８８】
【表２ｂ】
【０１８９】
【表２ｃ】
【０１９０】
公共データベース中の既知のセルピン間で、サイピンと最も近いマッチが見出されたのはＳＣＣＡ−２であった。配列番号２に示すサイピン・アミノ酸配列および配列番号１３に提供するＳＣＣＡ−２アミノ酸配列を比較するＧＡＰ並列を行った。このＧＡＰ比較は、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックスを使用し、そして８のギャップ加重および２のギャップ長加重を用いた。この並列の結果は、ＳＣＣＡ−２およびサイピン・ポリペプチドが５９．２８％の類似性および５１．０３％の同一性を有することを示した。
【０１９１】
サイピン・アミノ酸配列（例えば配列番号２）に対するアミノ酸置換および他の改変（欠失、挿入など）は、表２に示すようなアミノ酸配列の大文字の残基に対する変化を生じるならば、そして特に、これらの変化が類似の構造のアミノ酸での置換（例えば脂肪族残基−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ−のいずれか１つの、別の脂肪族残基での置換など）でないか、またはその保存される位での他のセルピン・ポリペプチドに存在する残基での置換でないならば、サイピン・ポリペプチド活性を改変するかまたは破壊する可能性がより高いと予測される。逆に、他の表２のセルピン・ポリペプチド配列の１つに由来する、並列中のその位の残基の置換を生じるように、変化がサイピン・アミノ酸配列に行われるならば、こうした改変が改変サイピン・ポリペプチドの機能に影響を及ぼすであろう可能性がより低い。例えば、表２中のサイピンのアミノ酸３８２に対応するコンセンサス残基はアラニンであるが、ＰＡＩ２およびＳＥＲＰＩＮＢ１０はその位でグリシンを有する。したがって、サイピンの３８２位でのアラニンに対するグリシンの置換は、プロリン、トリプトファンまたはチロシンなどの非常に異なるアミノ酸の置換より、ポリペプチドの機能を改変する可能性がより低い。
【０１９２】
さらに、配列番号２に示すサイピン・ポリペプチドのアミノ酸６９〜２５０に９５％の同一性を有する部分的ヒトｃＤＮＡクローン（ＡＡ２４２９６９）が、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｂＥＳＴデータベースに同定された。サイピンのこの領域には、配列番号２のアミノ酸６１〜１０７に位置する上述のサイピン挿入が含まれる。配列番号２のアミノ酸１０８〜３７３に対応するサイピンの領域は、上述のように、オブ−セルピン構造的コアに対応し、したがって、このＥＳＴポリペプチドは、サイピン構造的コア領域と部分的に重複する。このＥＳＴタンパク質は、サイピンと８アミノ酸残基異なり、したがって、ＥＳＴ ＡＡ２４２９６９が、サイピンのアリル変異体のセグメントに対応する可能性があることが示唆される。あるいは、これらの８つの相違の１以上が、対応するＥＳＴ ｃＤＮＡ配列を決定した際の配列決定の誤りのためであった可能性がある。これらの８つの相違の位置は、配列番号２のアミノ酸１０９、１１５、１１８、１２６、１２７、２１６、２４６および２４８に対応する。これらの位置でＥＳＴに存在するアミノ酸は、それぞれ、スレオニン、アスパラギン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、イソロイシン、プロリンおよびフェニルアラニンであり、一方、サイピンでは、対応するアミノ酸は、それぞれ、セリン、チロシン、グルタミン、イソロイシン、リジン、リジン、グルタミンおよびチロシンである。ＥＳＴ ＡＡ２４２９６９に予測されるポリペプチドはＲＳＬを欠き、したがって、セルピン構造にフォールディング不能であるし、また、サイピンＲＳＬと関連するいかなる生物活性も示しえない。
【０１９３】
（実施例２）
サイピンｍＲＮＡの細胞および組織における発現
サイピン・コード配列に基づくオリゴヌクレオチドを逆転写酵素ＰＣＲ反応で用い、ｃＤＮＡパネルを増幅して、サイピンの発現プロフィールを決定した。この目的のため、エクソン１、２および３を増幅するオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー対（配列番号７および配列番号８）を用いた。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡのＣｅｌｅｒａパネルを増幅した（Ｂｉｌｌ Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＶＭ）。逆転写酵素ＰＣＲ産物を解析することによって、サイピン発現が非常に多様な胎児細胞および成人細胞に検出され、これらには以下が含まれた：気管支上皮；前立腺上皮；乳房上皮；および小気道上皮。さらに、サイピンは以下の上皮組織で発現される：前立腺；精巣；胸腺；扁桃腺；皮膚；角化細胞；頚管；胎児小腸；および食道。さらに、サイピンは、以下の癌腫および形質転換細胞株で発現される：肺上皮癌腫（Ａ５４９）；Ｂ細胞リンパ腫（Ａｋａｔａ、Ｎａｌｍ６、Ｎａｍａｌｗａ）；単球起源の癌細胞（Ｕ９３７、Ｔｈｐ−１、ＡＭＬ５）；腫瘍異種移植片（結腸、膵臓、前立腺）。サイピン発現はまた、肺および食道起源の雑多な腫瘍でも観察された。
【０１９４】
（実施例３）
組換えサイピンを発現する宿主細胞
サイピン・タンパク質を発現するため、配列番号５および６に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＳｐｅＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含めて、全長サイピンｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。サイピン遺伝子を中間体クローニングベクターにクローニングし、遺伝子をＩｇカッパ・シグナル配列、短いＦＬＡＧ（登録商標）タグ（ＤＹＫＤ）、およびポリＨＩＳタグの下流に置いた。この全融合構築物をＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片としてｐＤＣ４１２にサブクローニングした。ポリＨＩＳおよびサイピン・コード配列間のスペーサーとして、アミノ酸ＧＴＳＳを用いた。Ｉｄカッパ・シグナルを含んで、細胞外区画に発現タンパク質を導き、すなわち、発現サイピンの分泌を確実にした。サイピンの開始メチオニンまでの融合構築物のアミノ酸配列を以下に示す：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＹＫＤＥＧＳＨＨＨＨＨＨＧＴＳＳ−サイピン
上記左に示す３７アミノ酸のＮ末端融合構築物配列を配列番号１５として提供する。このｐＤＣ４１２−サイピン・プラスミドを、分泌サイピン・ポリペプチド発現のため、ＣＯＳ−１サル腎臓細胞にトランスフェクションした。
【０１９５】
限定されるわけではないが、遠心分離、サイズ排除ろ過およびクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、二次元電気泳動、ウェスタンブロット解析、放射性核種標識、アフィニティータグ標識、免疫沈降およびアフィニティータグ沈降を含む慣用法によって、トランスフェクション細胞溶解物および上清を採取し、精製し、そしてサイピン発現に関して解析した。リン酸化およびグリコシル化を含む翻訳後修飾に関して、精製タンパク質を調べることが可能である。多様なプロテアーゼとの熱および変性耐性複合体形成に関して、精製タンパク質を試験するであろう。サイピンの阻害活性は、Ｐｏｔｅｍｐａら（１９９４）に論じられるように、ポリ硫酸化オリゴ糖などの補因子の添加によって、安定化するかまたは増大させることが可能である。
【０１９６】
（実施例４）
本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体
本実施例は、サイピン・ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を調製する方法を例示する。米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるものなどの他の慣用的技術が使用可能である。こうした抗体を生成するのに使用可能な適切な免疫原には、限定されるわけではないが、精製サイピン・ポリペプチド、その免疫原性断片、および高レベルのサイピン・ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する細胞が含まれる。免疫原性断片は、一般的に少なくとも１２以上のアミノ酸を含有する。例えばＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｌｅｇによって、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：１６５， １９９５に概説されるように、サイピン・ポリペプチドをコードするＤＮＡもまた、免疫原として使用可能である。
【０１９７】
げっ歯類（例えばＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＬｅｗｉｓラット）を、アジュバント（例えば完全または不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、またはＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ、モンタナ州ハミルトン）などの別のアジュバント）中で乳化したサイピン・ポリペプチド免疫原で免疫し、そして１０〜１００μｇの範囲で、皮下または腹腔内注射する。ＤＮＡは皮内（Ｒａｚら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９５１９）または筋内（Ｗａｎｇら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：４１５６）投与することが可能である；ＤＮＡに基づく抗原には、生理食塩水が適切な希釈剤であることが見出されている。１０日〜３週間後、毎週、隔週、または３週間ごとの免疫スケジュールで、さらなる免疫原および定期的な追加免疫で、免疫動物に追加免疫する。
【０１９８】
後眼窩出血または尾先端切除によって、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、免疫沈降、またはサイピン・ポリペプチド結合パートナーへのサイピン・ポリペプチドの結合阻害のＦＡＣＳ解析などの他の適切なアッセイによって、サイピン・ポリペプチド抗体に関して試験する。適切な抗体力価を検出した後、陽性動物に、生理食塩水中のサイピン・ポリペプチドを最後に一度、静脈内注射する。３〜４日後、動物を屠殺し、そして脾臓細胞を採取し、そしてネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）に融合させる。これらの細胞融合によってハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートに蒔く。
【０１９９】
ハイブリドーマ細胞は、Ｅｎｇｖａｌｌら（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ． ８：８７１， １９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、精製したサイピン・ポリペプチドに対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることが可能である。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：４２１２， １９９０）に記載される抗体捕捉技術である。サイピン特異的抗体は、サイピンに結合するであろうが、ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２、ハーピン、プロスタピン、ボマピン、ＰＡＩ２またはＬＥＩを含む他のセルピンには結合しないであろう。サイピン特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、同系げっ歯類に腹腔内注射して、高濃度の（例えばミリリットルあたり１ミリグラムを越える）抗サイピン・ポリペプチドモノクローナル抗体を含有する腹水を産生することが可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によって、フラスコまたはローラーボトル中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿によって、続いてゲル排除クロマトグラフィーによって、精製可能である。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用可能であり、サイピン・ポリペプチドへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも使用可能である。
【０２００】
（実施例５）
染色体マッピング
ＮＣＢＩヒトゲノムマッピング供給源ウェブページ上、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ヒト染色体にサイピン遺伝子をマッピングした。このＢＬＡＳＴ解析の結果は、サイピンがヒト染色体１８ｑ２１．３のセルピン・クラスター内に位置し、そしてハーピン（１８ｑ２１．３−ｑ２２に位置；Ｓｐｒｉｎｇら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ ２６４：２９９（１９９９））およびマスピン遺伝子（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：３１４７（１９９５））の間にマッピングされることを示した。１８ｑ２１．３にマッピングされるセルピンには：ＳｅｒｐｉｎＢ５（ＰＩ−５、マスピン）；ＳｅｒｐｉｎＢ１３（ＰＩ−１３、ハーピン、ヘッドピン）；ＳｅｒｐｉｎＢ３（ＳＣＣＡ−１）；Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ７（ＰＩ−１１、メグシン）；Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ２（ＰＡＩ−２）；Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１０（ＰＩ−１０、ボマピン）；およびＳｅｒｐｉｎＢ８（ＰＩ−８、ＣＡＰ２）が含まれる。これらのセルピンは、遠位からセントロメアに連続した順で、ＮＣＢＩヒトゲノム１８ｑコンティグＮＴ＿０１０９８６．２上に位置する。
【０２０１】
（実施例６）
リアルタイム定量的ＰＣＲによるサイピン発現の解析
多様な組織供給源から、そして多様な化合物で処理した細胞または組織から、ＲＮＡ試料を得た：これらのＲＮＡ試料には、商業的に入手可能なＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）が含まれた。ランダム六量体を用い、製造者の指示にしたがって、ＲＮＡ試料をＤＮアーゼ処理（パーツ＃１９０６、Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）、そしてＴａｑＭａｎ逆転写試薬（パーツ＃Ｎ８０８−０２３４、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、ｃＤＮＡ分子集団に逆転写した。ウェルあたり５ｎｇまたは２０ｎｇいずれかで、ｃＤＮＡ分子の各集団をマルチウェルプレートの特定のウェルに入れ、そして三つ組で実行した。同一組織種および刺激条件を適用したが異なるドナーから収集した場合、プールしたものを用いた。試料の各マルチウェルプレートには陰性対照セルを含んだ。
【０２０２】
Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、サイピン・ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーのセットを設計し、そして合成し、そしてこれらのプローブ／プライマーセットのＰＣＲ条件を最適化して、ほぼ周期２０および周期３６の間のすべての熱周期で、安定で、そして対数増加するＰＣＲ産物を生じた。用いた順方向プライマーは、９００ｎＭの濃度の５’ − ＡＡＣＧＡＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧ − ３’（配列番号１６）
であり；用いた逆方向プライマーは、３００ｎＭの濃度の５’ − ＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣＡ − ３’（配列番号１７）
であった。サイピン用に用いたＦＡＭ標識プローブは、２００ｎＭの濃度の５’ − ＣＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴＣＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＣＣＣＡＧ − ３’（配列番号１８）
であった。１８Ｓ ＲＮＡに、そして特定の「ハウスキーパー」タンパク質−ベータ−アクチン、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＰＫＧ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、およびＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）−をコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーセットを合成し、そしてこれらのプライマーセットに関してもまた、ＰＣＲ条件を最適化した。例えば、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴの順方向および逆方向プライマー濃度は、各々３００ｎＭであり、そしてＶＩＣ標識プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）は２００ｎＭで用いた。サイピンおよびＨＰＲＴプローブ／プライマーセット両方を用いるマルチプレックスＴＡＱＭＡＮ ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出系上、ＴＡＱＭＡＮユニバーサルＰＣＲマスターミックス（パーツ＃４３０４４３７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、２５マイクロリットル体積中にセットアップした。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒソフトウェア１．７ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて、閾値周期値（Ｃ_T）を決定し、そしてサイピンをＨＰＲＴに相対発現比較するため、デルタＣ_T（平均ＦＡＭ値から平均ＶＩＣ値を減じたもの）を計算して、２Ｅ（−ｄＣ_T）、２のマイナスデルタＣ_T乗に変換した。
【０２０３】
多様な成人および胎児ＲＮＡ試料におけるＨＰＲＴ発現に比較したサイピン発現の解析は、サイピンが少数の成人および胎児組織において、ＨＰＲＴより少なく発現されることを示し、成人精巣および子宮において、相対発現は最低であった（以下を参照されたい）；０．００７１０６３９の比は、サイピン発現が、ＨＰＲＴのものの１％未満であることを示す。対照的に、成人皮膚において、サイピンはＨＰＲＴより約２８倍より豊富に発現される。
【０２０４】
【表３】
【０２０５】
骨への分化中のヒト間葉幹細胞由来のＲＮＡ試料において、ＨＰＲＴ発現に比較したサイピン発現の解析は、サイピン発現が分化中に増加するが、なおＨＰＲＴよりはるかにより低いレベルで発現されることを示した（以下を参照されたい）。
【０２０６】
【表４】
【０２０７】
多様なサイトカイン処理（以下を参照されたい）に曝露した、正常ヒト気管支組織（「ＮＨＢＥ」）の肺上皮細胞由来のＲＮＡ試料において、ＨＰＲＴ発現に比較したサイピン発現を解析した。この実験は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）の組み合わせがサイピン発現を増加させる一方、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮｇ）、またはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）の組み合わせでの処理がサイピン発現を減少させたことを示す。さらに、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の組み合わせによるサイピンの特異的上方制御もまた、初代肺小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）で、そして肺腺癌上皮細胞（Ｃａｌｕ３）での実験で、観察された。これらの結果は、プロテアーゼ阻害剤サイピンの上方制御が、炎症誘導プロテアーゼに対する肺上皮反応に関与している可能性があることを示唆する。
【０２０８】
【表５】
【０２０９】
（実施例７）
シンテニー解析によるマウス・オブ−セルピン遺伝子の同定
我々は、１つのマウス・サイピン相同体、並びにヒトＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、およびＳＥＲＰＩＮＢ１３に相同な４つの新規マウス・オブ−セルピン遺伝子を同定した。これらのマウス遺伝子は、ヒト染色体１８と類似の組成を持つ、オブ−セルピンのシンテニークラスター中、マウス染色体１にマッピングされる。図１は、ヒト染色体１８およびマウス染色体１オブ−セルピンの遺伝子マップを示し、染色体間の大規模なシンテニー組成を示す。４つの新規ゲノム・オブ−セルピン配列の同定および先に注釈が付けられていなかったｃＤＮＡが、染色体１上のマウス・オブ−セルピン相同性を拡張し、そして既知のヒト染色体１８のオブ−セルピンの相同分子種提示を完了する。
【０２１０】
公共（ＮＴ ０１０９８６．２）およびＣｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＨＧＤ Ｒ２６Ｂ、ＧＡ＿Ｘ２ＨＴＢＬ３ＨＬＭＫ）ゲノム骨格のＢＬＡＳＴ解析によって、サイピンは、およそ４００キロ塩基のゲノム領域に渡る、１０の染色体１８オブ−セルピンの隣接クラスター中に位置決定された。同定された１０のオブ−セルピン遺伝子には、公共ドメイン中に注釈が付けられた８つ（ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＰＡＩ２；ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＣＣＡ１；ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＳＣＣＡ２；ＳＥＲＰＩＮＢ５、マスピン；ＳＥＲＰＩＮＢ７、メグシン；ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＰＩ８；ＳＥＲＰＩＮＢ１０、ボマピン；ＳＥＲＰＩＮＢ１３、ハーピン）、Ｄｅｒｗｅｎｔ特許データベースに見出された１つ（ＳＥＲＰＩＮＢ１１、プロスタピン）およびサイピンが含まれる（寄託番号に関しては、表３を参照されたい）。ＮＣＢＩ ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ（ＳＥＲＰＩＮＢ２およびＳＥＲＰＩＮＢ４）およびＢＬＡＳＴ解析を用いて、ヒト染色体１８オブ−セルピンの１０のうち７に対して、相同マウスｃＤＮＡの最適マッチング（アミノ酸同一性％）を編集するか、または同定した（表３）。我々は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースには、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、またはＳＥＲＰＩＮＢ１３に関して、優れたマウスＣＤＮＡマッチを見出さなかった。しかし、我々は、これらの３つのセルピンに関して、Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ由来のマウスゲノムデータベースを検索するＢＬＡＳＴによって、高い度合いのマッチを見出した。翻訳されるマウスタンパク質は、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＥＲＰＩＮＢ１０およびＳＥＲＰＩＮＢ１３にマッチし、それぞれ、Ｇｅｎｏｍｉｃｂ３、Ｇｅｎｏｍｉｃｂ１０、およびＧｅｎｏｍｉｃｂ１３と名づけた。我々はまた、ＳＥＲＰＩＮＢ４に（高い配列類似性のため、ＳＥＲＰＩＮＢ３にも）相同である別のマウスゲノム配列も発見し、これを翻訳して、そしてＧｅｎｏｍｉｃｂ４と名づけた。マウスＧｅｎｏｍｉｃｂ３、Ｇｅｎｏｍｉｃｂ４、Ｇｅｎｏｍｉｃｂ１０、およびＧｅｎｏｍｉｃｂ１３に関して予測されるタンパク質配列を、視覚的にイントロン／エクソン結合部で編集し、ヒト配列と最適にフィットするようにして、それぞれ配列番号１９〜２２に提供する。マウスＧｅｎｏｍｉｃｂ４（配列番号２０）およびＧｅｎｏｍｉｃｂ１３（配列番号２２）のみが完全なようである。Ｇｅｎｏｍｉｃｂ１０マウスタンパク質は、エクソン７のスプライシング部位でコード配列の２５アミノ酸を欠く。Ｇｅｎｏｍｉｃｂ３マウス配列は、配列番号１９のアミノ酸１２３の後で停止コドンを有するようであり；これが配列決定の誤りによる人為的産物であるのかどうかは不明である。これらのマウス・セルピン・ポリペプチド配列は各々、ＲＳＬ中に予測される切断部位を有する：配列番号１９のアミノ酸３５２および３５３の間；配列番号２０のアミノ酸３５２および３５３の間；配列番号２１のアミノ酸３３２および３３３の間；並びに配列番号２２のアミノ酸３５４および３５５の間。我々はいまだに、これらの推定上の遺伝子のいずれがｃＤＮＡをコードすることも確認していない。しかし、これらは、以下に論じる、マウスおよびヒト染色体オブ−セルピン・クラスター解析において、マーカーとして有用である。ＳＥＲＰＩＮＢ３およびＳＥＲＰＩＮＢ４を除いて、染色体１８オブ−セルピンのすべてに関して、ユニークなマウスゲノム相同体が同定された。３つのｃＤＮＡは、ＮＣＢＩ ＬｏｃｕｓＬｉｎｋにおいてＳＥＲＰＩＮＢのマウス相同体として注釈付けされ（ＡＦ０６３９３７、ＡＫ００３２２０およびＡＫ００３６５０）、そしてすべて、少なくとも部分的に、マウスゲノム中に示された。染色体１骨格ＣＭＧＤ Ｒ１２Ｃ ＧＡ＿Ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ５ＶＡＱ（１，９２８，０４０ｂｐ）上のＡＦ０６３９３７の最初の１７６ヌクレオチドに関してしか、正確なゲノムマッチを見出すことができず、これは、開始メチオニンからアミノ酸５６までの完全エクソンをコードする。マウス染色体１ ＣＭＧＤ Ｒ１２ＣコンティグＧＡ＿Ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ２ＴＴＨ（３９，６３３ｂｐ）上のＡＫ００３２２０に関しては、正確なコード配列マッチを、そしてゲノム骨格ＣＭＧＤ Ｒ１２Ｃ ＧＡ＿Ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ４Ｄ６Ｃ（２，０１２，０８３ｂｐ）上のＡＫ００３６５０の大部分の正確なコード配列マッチを同定した。ＡＫ００３６５０の最初の７３アミノ酸ゲノムコード配列は発見しなかった。これは、いまだに結び付けられていない、３つの異なる染色体１領域に、３つの関連するＳｅｒｐｉｎｂ４マウス相同体を置く。ＧＡ＿Ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ５ＶＡＱ上にＧｅｎｏｍｉｃｂ３およびＧｅｎｏｍｉｃｂ４が本明細書で同定されたため、３つのゲノムコンティグ／骨格上に、総数５の異なるマウスＳＥＲＰＩＮＢ３／Ｂ４相同体がある（表３を参照されたい）。
【０２１１】
表３
【０２１２】
【表６】
【０２１３】
ヒト染色体１８オブ−セルピンは、表３において、最高パーセント同一性マウス配列マッチ（ＢＬＡＳＴ：ＧＣＧ、ウィスコンシン州マディソン）と共に提示される。ヒト注釈付きタンパク質配列（ヒト−寄託番号）をマウス翻訳ヌクレオチド配列（マウス−寄託番号）に比較した。ヒト参考文献は、サイピンおよびＹ１５１５５（Ｄｅｒｗｅｎｔデータベース）を除いて、ＮＣＢＩタンパク質クエリー、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｐｒｏｔｅｉｎを通じて入手可能である。マウス配列は、「Ｇｅｎｏｍｉｃ」（^a）と示す場合を除いて、ＮＣＢＩから得た全長ｃＤＮＡである。これらの「Ｇｅｎｏｍｉｃ」配列は、マウスゲノムに同定される、ヒト対応物の予測される全長マウス相同性である（Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、メリーランド州ロックビル）。ヒトおよびマウス配列の全体の並列からの最適概算に基づいて、経験的に、ゲノム配列エクソンをスプライシングした。示した配列同一性パーセントは、翻訳されるｃＤＮＡ配列、または翻訳されるゲノム配列に比較した、注釈付きヒトタンパク質に関してのものである（％ＩＤ）。すべての注釈付きｃＤＮＡに関する完全配列マッチは、３つの独立のマウス染色体１ゲノムコンティグ／骨格（マウス−染色体）上に位置決定された。（^b）ＡＦ０６３９３７、ＡＫ００３２２０、およびＡＫ００３６５０は、すべてマウスＳｅｒｐｉｎＢ４相同体（ＳＣＣＡ２、ＬｏｃｕｓＩＤ ２０２４８）として、ＮＣＢＩ ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ中に注釈付けされる。
【０２１４】
ヒト・オブ−セルピン間で共有される高い配列類似性はまた、マウスメンバーでも保存される（以下の表４を参照されたい）。上部右の対角線（太字）は、全タンパク質の配列同一性パーセントを示す。下部左の対角線は、ＲＳＬ全体（Ｐ１７からＰ４’）の同一性を示す。セルピン・スーパーファミリーに同定される非常に保存される残基の大部分もまた、ヒトおよびマウスタンパク質配列両方で保存される。
【０２１５】
表４ ヒトおよびマウス・オブ−セルピン・アミノ酸配列比較
【０２１６】
【表７】
【０２１７】
（実施例８）
ヒト・セルピン・ファミリーのさらなる新規メンバーの同定
サイピンを同定するのに用いたのと同一の方法を用いて、ヒト・セルピン・ポリペプチドファミリーの５つのさらなる新規メンバー：ＩＭＸ９６５０６、ＩＭＸ９６８６６、ＩＭＸ９６９８３、ＩＭＸ９８２２０、およびＩＭＸ ９６９０９を同定した。これらの新規ヒト・セルピンを各々、以下に順番に記載する。
【０２１８】
ＩＭＸ９６５０６。ＩＭＸ９６５０６ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２３に示す；配列番号２４および配列番号２５は、配列番号２３の下位配列である。配列番号２３は、配列番号２３のアミノ酸３７７〜３７９にＲＳＫ配列を有し；切断部位はＡｒｇ−３７７およびＳｅｒ−３７８の間と予測される。上述のようにＧｅｎｅＦｏｌｄアルゴリズムを用いて解析すると、ＩＭＸ９６５０６ポリペプチドは、すべてのカテゴリーで、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤ＩＩＩおよびアルファ−アンチトリプシンに最大スコア（９９９．９のスコア）を有する。
【０２１９】
ＩＭＸ９６８６６。ＩＭＸ９６８６６ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。らせん間可変ループ領域を有するが、ＲＳＬドメインに伸長していないため、ＩＭＸ９６８６６ポリペプチドのアミノ酸配列は不完全であるようである。しかし、ＧｅｎｅＦｏｌｄアルゴリズムを用いて解析すると、ＩＭＸ９６８６６ポリペプチドもまた、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤ＩＩＩおよびアルファ−アンチトリプシンに最大スコアを有する。また、ＩＭＸ９６８６６は、ラットおよびマウス・カリクレイン結合タンパク質に配列類似性を示す。
【０２２０】
ＩＭＸ９６９８３。ＩＭＸ９６９８３ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２７に示す；配列番号２８は配列番号２７の下位配列である。ＩＭＸ９６９８３ポリペプチドのアミノ酸配列は、オブ−セルピンに比較して、かなりのＮ末端伸長（およそ１９７アミノ酸）を有し；また、「ＶＬＫ」アミノ酸配列（配列番号２７のアミノ酸５４４〜５４６）もまた有し、そしてオブ−セルピンの特徴的なＣ末端残基を欠くようである。しかし、ＧｅｎｅＦｏｌｄアルゴリズムを用いて解析すると、ＩＭＸ９６９８３ポリペプチドもまた、すべてのカテゴリーで、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤ＩＩＩおよびアルファ−アンチトリプシンに最大スコアを有する。ＩＭＸ９６９８３ポリペプチドは、ネキシンおよびニューロセルピンに類似性を示す。
【０２２１】
ＩＭＸ９８２２０。ＩＭＸ９８２２０ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２９に示す；配列番号３０および配列番号３１は配列番号２９の下位配列である。ＩＭＸ９８２２０ポリペプチドは、細胞質アンチ−プロテイナーゼ３（ＣＡＰ−３）に配列類似性を示す。
【０２２２】
ＩＭＸ９６９０９。ＩＭＸ９６９０９ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３２に示す；配列番号３３は配列番号３２に非常に類似のヒトポリペプチド配列である。配列番号３４は、配列番号３２のアミノ酸２５２〜２６２が配列番号３４のアミノ酸２５２〜２５７と交換されている点で、配列番号３２と異なる；この相違は、スプライシング変異または天然存在多型に対応する可能性がある。配列番号３５は配列番号３４の下位配列である。ＧｅｎｅＦｏｌｄアルゴリズムを用いて解析した際、ＩＭＸ９６９０９ポリペプチドは、すべてのカテゴリーで、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤ＩＩＩおよびアルファ−アンチトリプシンに最大スコアを有する。
【０２２３】
（実施例９）
サイピン核酸発現のアンチセンス阻害
本発明にしたがって、オリゴヌクレオチド設計の基礎として、配列番号１のヌクレオチド配列を用いて、サイピンｍＲＮＡ分子の異なる領域を標的とする、一連のオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドは、長さおよそ１０、１２、１５、１８、またはより好ましくは２０ヌクレオチド残基であるように、そして少なくとも３７℃の予測されるハイブリダイゼーション温度を有するように選択する。好ましくは、いくつかがｍＲＮＡ分子の５’領域に向かってハイブリダイズし、他のものがコード領域に、そしてさらに他のものがｍＲＮＡ分子の３’領域にハイブリダイズするであろうように、オリゴヌクレオチドを選択する。
【０２２４】
オリゴヌクレオチドは、全体がホスホロチオエート主鎖（ヌクレオシド間連結）を持つオリゴデオキシヌクレオチドであることが可能であるし、または多様な異なる種類のヌクレオシド間連結を有することが可能である。一般的に、多様な化学的修飾オリゴヌクレオチドの調製、精製、および使用が米国特許第５，９４８，６８０号に記載される。特定の例として、ヌクレオシドホスホロアミダイトの以下の種類をオリゴヌクレオチド合成に使用可能である：デオキシおよび２’アルコキシアミダイト；２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、および２’−フルオロデオキシシチジンなどの２’−フルオロアミダイト；２，２’−アンヒドロ［１−（ベータ−Ｄ−アラビノ−フラノシル）−５−メチルウリジン］、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン、Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン、およびＮ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイトなどの２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−修飾アミダイト；２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ²−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ］エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニル−シリル−５−メチル−ウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルマドクスイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、および５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］などの２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト；並びにＮ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニル−カルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］などの２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト。
【０２２５】
修飾オリゴヌクレオシドもまた、オリゴヌクレオチド合成に使用可能であり、例えば、ＭＭＩ連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれる、メチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオシド；ＭＤＨ連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれる、メチレン−ジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド；アミド−３連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれる、メチレン−カルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド；およびアミド−４連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれる、メチレン−アミノカルボニル連結オリゴヌクレオシドと共に、例えば交互にＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ連結を有する混合主鎖化合物があり、これらは、米国特許第５，３７８，８２５号、第５，３８６，０２３号、第５，４８９，６７７号、第５，６０２，２４０号および第５，６１０，２８９号に記載されるように調製する。ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル連結オリゴヌクレオシドもまた、使用可能であり、そしてこれらは米国特許第５，２６４，５６２号および第５，２６４，５６４号に記載されるように調製し；そして、エチレンオキシド連結オリゴヌクレオシドもまた、使用可能であり、そしてこれは米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるように調製する。上述のオリゴヌクレオチドと同じ方式で、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）が使用可能であり、そしてＰｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ４， ５−２３；並びに米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７００，９２２号、および第５，７１９，２６２号に引用される多様な方法のいずれかにしたがって調製する。
【０２２６】
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる種類であることが可能である。これらには、連結ヌクレオチドの「ギャップ」セグメントが連結ヌクレオシドの５’および３’「ウィング」セグメントの間に位置する第一の種類、並びに「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’または５’末端いずれかに位置する第二の「オープン端」型が含まれる。第一の種類のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において、「ギャップマー」またはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の種類のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において、「ヘミマー」または「ウィングマー」としても知られる。異なる種類のキメラオリゴヌクレオチドのいくつかの例は：［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、および［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドであり、これらはすべて、米国特許第５，９４８，６８０号にしたがって調製可能である。１つの好ましい態様において、両端（５’および３’方向）で４ヌクレオチド「ウィング」が隣接する、１０の２’デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成される、長さ１８ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）を利用する。ウィングは２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間（主鎖）連結は、オリゴヌクレオチド全体でホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は、５−メチルシチジンである。他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、および混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号にしたがって合成する。
【０２２７】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、標準的９６ウェル形式で９６の配列を同時に組み立てることが可能な自動化合成装置上、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学合成を介して合成する。各ウェルのオリゴヌクレオチド濃度は試料希釈およびＵＶ吸光分光法によって評価する。個々の産物の全長完全性はキャピラリー電気泳動によって評価し、そして塩基および主鎖組成は、エレクトロスプレー質量分析を利用した化合物のマス解析によって確認する。
【０２２８】
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な細胞種のいずれで試験することも可能である。これは、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット解析を用いて、日常的に測定可能である。細胞は、供給者に推奨されるように、１０継代まで日常的に維持する。細胞が８０％〜９０％集密に達したら、オリゴヌクレオチドで処理する。９６ウェルプレートで増殖させた細胞に関しては、２００マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１血清減少培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）でウェルを１度洗浄し、そしてその後、３．７５ｇ／ｍｌ ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および最終濃度１５０ｎＭの所望のオリゴヌクレオチドを含有する１３０マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理する。４時間の処理後、培地を新鮮な培地と交換する。オリゴヌクレオチド処理の１６時間後、細胞を採取する。好ましくは、オリゴヌクレオチドが標的核酸分子の異なる部分にハイブリダイズする場合、標的核酸発現を最大の度合いで阻害するオリゴヌクレオチドを同定するため、いくつかの異なるオリゴヌクレオチドの影響を同時に試験すべきである。
【０２２９】
サイピン核酸発現のアンチセンス変調は、当該技術分野に知られる多様な方法でアッセイ可能である。例えば、サイピンｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、定量化可能である。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ解析は、総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して行うことが可能である。ＲＮＡ単離およびノーザンブロット解析法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第１巻， ｐｐ．４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９６に解説される。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーから入手可能な、商業的に入手可能であり、そして製造者の指示にしたがって用いる、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出系を用いて、好適に達成可能である。この蛍光検出系は、ＰＣＲ産物の高処理定量化を可能にする。ＰＣＲが完了した後に増幅産物を定量化する標準的ＰＣＲとは逆に、リアルタイム定量的ＰＣＲの産物は、集積するにつれて定量化される。これは、順方向および逆方向ＰＣＲプライマー間に特異的にアニーリングし、そして２つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に含むことによって、達成される。レポーター色素（例えばＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ、またはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーいずれかから得られる、ＪＯＥまたはＦＡＭ）をプローブの５’端に付着させ、そして消光剤色素（例えばＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ、またはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーいずれかから得られる、ＴＡＭＲＡ）をプローブの３’端に付着させる。プローブおよび色素が損なわれていなければ、レポーター色素発光は、３’消光剤色素が近接していることによって、消光される。増幅中、標的配列へのプローブのアニーリングにより、Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によって切断可能な基質が生じる。ＰＣＲ増幅周期の伸長期中、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断が、残りのプローブから（そしてしたがって消光剤部分から）レポーター色素を放出し、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各周期で、さらなるレポーター色素分子が各プローブから切断され、そしてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出系に内蔵されたレーザー光学装置によって規則的（６秒間）間隔で、蛍光強度を監視する。各アッセイで、未処理対照試料由来のｍＲＮＡの連続希釈を含有する、一連の平行反応によって、標準曲線を生成し、これを用いて、試験試料をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した後の阻害パーセントを定量化する。定量的ＰＣＲ解析の他の方法もまた、当該技術分野に知られる。サイピン・タンパク質レベルは、当該技術分野に公知の多様な方法によって定量化可能であり、これらには、免疫沈降、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ、または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）がある。サイピン・ポリペプチドに向けられる抗体は、本明細書に記載するものなどの慣用的抗体生成法を介して、調製可能である。免疫沈降法、ウェスタンブロット（イムノブロット）解析、および酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、当該技術分野で標準的である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第２巻， ｐｐ．１０．１６．１−１０．１６．１１， １０．８．１−１０．８．２１，および１１．２．１−１１．２．２２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９１を参照されたい）。
【０２３０】
本明細書に引用する刊行物および特許出願はすべて、各個々の刊行物または特許出願が特に、そして個々に、本明細書に援用されると示されたかのように、本明細書に援用される。前述の発明は、理解を明らかにする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の解説に鑑みて、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を施すことが可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】ヒト染色体１８およびマウス染色体１セルピン・クラスターのシンテニー組成。コンティグＮＴ ０１０９８６．２上の染色体１８オブ−セルピンの相対的な位置および転写方向を、線図上の矢印として示す。ヒト相同分子種と最高の相同性を示すマウスｃＤＮＡを、それぞれのゲノム骨格に対して、同様にマッピングする。ヌクレオチド座標は、表の座標欄に開始メチオニンから末端コドンまで示す。サイズ欄は、塩基対（ｂｐ）でこれらの遺伝子の長さを示す。以下のゲノム配列は、完全オープンリーディングフレームをコードしない：^aＧｅｎｏｍｉｃｂ３配列は、ＯＲＦ中央に停止コドンを有する；^bエクソン７スプライシング結合部の配列が失われている；^c短い配列：正確なマッチは、ＡＦ０６３９３７をコードする第二のエクソン、並びにＡＫ００３６５０のエクソン４、６、７、および８に関して存在する。

Claims (28)

1. （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその抗原性断片；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸６１〜１０７、配列番号２のアミノ酸１０８〜３７３、および配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、そしてさらにＧｅｎｅＦｏｌｄを用いて解析した際、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）である少なくとも５つのヒットを生じ、そしてそのスコアが９９９．９９９である、アミノ酸配列を有する、前記ポリペプチド；
   （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するサイピン（Ｔｈｙｐｉｎ）変異体であって、アミノ酸同一性パーセントが：少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、そして少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記変異体；および
   （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか記載のポリペプチドであって、配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有するサイピン・ポリペプチドともまた特異的に結合する抗体と特異的に結合する、前記ポリペプチド
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
2. 非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズ可能な核酸分子にコードされるポリペプチドであって、前記の非常にストリンジェントな条件が、５０％ホルムアミドおよび６ｘＳＳＣ中４２℃でのハイブリダイズ、並びに０．２ｘＳＳＣ中６８℃での洗浄を含んでなり、そしてさらに、前記ポリペプチドがＧｅｎｅＦｏｌｄを用いて解析した際、セルピンである少なくとも５つのヒットを生じ、そしてそのスコアが９９９．９９９である、アミノ酸配列を有する、前記ポリペプチド。
3. 非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズ可能な核酸分子にコードされるポリペプチドであって、前記の非常にストリンジェントな条件が、５０％ホルムアミドおよび６ｘＳＳＣ中４２℃でのハイブリダイズ、並びに０．２ｘＳＳＣ中６８℃での洗浄を含んでなり、そしてさらに、前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸６１〜１０７、配列番号２のアミノ酸１０８〜３７３、および配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、前記ポリペプチド。
4. 配列番号２のアミノ酸６１〜１０７、配列番号２のアミノ酸１０８〜３７３、および配列番号２のアミノ酸３７４〜３９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するサイピン・ポリペプチドと特異的に反応する抗体を誘発することが可能な、前記ポリペプチド
5. 少なくとも１５ヌクレオチドを有する単離核酸分子であって、前記核酸分子が、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体とハイブリダイズ可能であり、そしてさらに、前記の非常にストリンジェントな条件が、５０％ホルムアミドおよび６ｘＳＳＣ中４２℃でのハイブリダイズ、並びに０．２ｘＳＳＣ中６８℃での洗浄を含んでなる、前記単離核酸分子。
6. 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するサイピン・ポリペプチドまたはその変異体をコード可能な、請求項５記載の単離核酸分子。
7. 配列番号１に示すようなヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５記載の核酸分子。
8. 請求項５〜７いずれか１項の核酸に対応する、単離ゲノム核酸。
9. 請求項５〜８のいずれか１項記載の核酸を少なくとも１つ含んでなる、発現ベクター。
10. 請求項５〜８のいずれか１項記載の核酸を少なくとも１つ含んでなる、組換え宿主細胞。
11. 核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれている、請求項１０の組換え宿主細胞。
12. 請求項５〜８いずれか１項の核酸にコードされるポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で、組換え宿主細胞を培養することを含んでなり、ここで組換え宿主細胞が請求項５〜８のいずれか１項記載の核酸を少なくとも１つ含んでなる、前記方法。
13. 前記ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる、請求項１２の方法。
14. 請求項１３の方法によって産生されるポリペプチド。
15. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項記載のポリペプチドと特異的に結合する、単離抗体。
16. モノクローナル抗体である、請求項１５の抗体。
17. ヒト抗体である、請求項１５の抗体。
18. ヒト化抗体である、請求項１５の抗体。
19. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドの活性を阻害する、請求項１５の抗体。
20. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドの阻害剤を設計する方法であって、こうしたポリペプチドの三次元構造を決定し、基質のありうる結合部位の三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込む分子を合成し、そして該分子のポリペプチド阻害活性を決定する工程を含んでなる、前記方法。
21. サイピン・ポリペプチド活性を改変する化合物を同定する方法であって：
    （ａ）請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドと試験化合物を混合し；そして
    （ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドのサイピン・ポリペプチド活性を改変するかどうかを決定する
    ことを含んでなる、前記方法。
22. サイピン・ポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法であって：
    （ａ）請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーと試験化合物を混合し；そして
    （ｂ）試験化合物が前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかどうかを決定する
    ことを含んでなる、前記方法。
23. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドおよび前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される化合物を少なくとも１つ提供することを含んでなる、プロテアーゼ阻害活性を増加させる方法。
24. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドおよび前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される化合物を少なくとも１つ患者に投与することによって、患者におけるプロテアーゼ阻害活性を増加させることを含んでなる、請求項２３の方法。
25. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドのアンタゴニストを少なくとも１つ提供することを含んでなる、プロテアーゼ阻害活性を減少させる方法。
26. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチドのアンタゴニストを少なくとも１つ患者に投与することによって、患者においてプロテアーゼ阻害活性を減少させることを含んでなる、請求項２５の方法。
27. アンタゴニストが、前記ポリペプチドに特異的に結合し、そして前記ポリペプチドの活性を阻害する抗体である、請求項２５の方法。
28. 請求項１〜４または請求項１４のいずれか１項のポリペプチド、前記ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される化合物を少なくとも１つ投与することを含んでなる、サイピン仲介障害を治療する方法。