JP2004533985A - アテローム性動脈硬化症の治療または診断のためのグリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼdタンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の予防および治療のためのGPI−PLD使用に関する。ある種の実施形態では、このプロセスは、例えば1型糖尿病などのGPI−PLDの生成不全、あるいはアポリポタンパク質A1が欠乏している患者、あるいはGPI−PLまたはApo−A1に対する自己抗体をもつ患者など、GPI−PLDの送達不全によって引き起こされていてもよい。他の実施形態では、アテローム硬化プロセスは、例えば、その活性に影響を与えるあるいは標的組織への送達に影響を与えるGPI−PLDの遺伝的改変が存在し、それによってアテローム硬化プロセスがもたらされるというような、GPI−PLD活性の喪失に起因していてもよい。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(GPI−PLD)タンパク質の使用、詳細には、アテローム性動脈硬化症の進行によって特徴付けられる状態の治療または診断のためのGPI−PLDの使用に関する。
【0002】
【従来の技術】
多数の細胞表面タンパク質が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーとの共有結合によって細胞膜に付着していることが、研究により示されてきた。酵素GPI−PLDは、グリコシルホスファチジルイノシトールがホスファチジン酸と結合しているホスホジエステル結合を切断し、それによって、固着したタンパク質を遊離させることが示されている。
【0003】
GPI−PLDタンパク質は、ウシおよびヒト血清中に豊富である。これは、膵臓のランゲルハンス細胞およびマスト細胞によって最初に合成され、循環に放出され、アポリポタンパク質A1(ApoA1)との複合体の形で標的組織に運ばれると考えられている(Hoenerら、1993年)。GPI−PLD酵素は、グリコシルホスファチジルイノシトール(多数の細胞表面タンパク質が、これによって細胞膜に接着付着している)を加水分解する能力がある。GPI−PLDは、ジアシルグリセロールを産生するホスホリパーゼC活性と対照的に、ホスホジエステル結合を切断してホスファチジン酸を遊離する。
【0004】
さらに提案されたGPI−PLDの機能は、成長因子またはホルモンがその受容体に結合するのに応答して、原形質膜内の「遊離の」GPIを切断することによって、イノシトールホスホグリカンを生成することである(Rademacher ら、1994年)。GPI−PLDのこの役割は、好塩基球中で実証されており、ここでは、これらの細胞のIgE依存性活性化により、ヒスタミン、すなわち炎症反応のメディエータなどの物質を含めた細胞類粒の内容物が放出される。ヒスタミンは、抗原の存在下で放出されるが、この放出は、IPGの添加によって模倣することができ、抗GPI−PLD抗体の添加によってブロックされる(Linら、1991年)。
【0005】
米国特許第5,418,147号(Huangら)は、ウシの肝臓からのGPI−PLDの精製、およびウシの肝臓、ヒトの肝臓、およびそれに続くヒトの膵臓cDNAライブラリからの3種のGPI−PLD酵素のクローニングを記載している。この特許は、ヒトおよびウシの肝臓からのGPI−PLDの全長cDNAおよびアミノ酸配列、ならびにこの酵素のヒトの膵臓型の部分cDNAおよびアミノ酸配列を報告している。その後、GPI−PLDの膵臓型の全長配列が、Tsangら(1992年)で報告されており、この酵素は、胸、目、脾臓、および扁桃腺からのcDNAライブラリ中に発見されている。これらの3型の酵素は、高度に相同であり、ウシの肝臓GPI−PLDの予想される成熟タンパク質の配列は、ヒトの肝臓の酵素との配列同一性が82%であり、ヒトの膵臓の酵素と配列同一性が81%である。GPI−PLDのヒトの肝臓および膵臓型のアミノ酸配列は、受託番号L11701およびL11702でGenBankに寄託されており、それぞれ841個および840個のアミノ酸からなる。GPI−PLDのヒトの肝臓型と膵臓型は、配列同一性が94.6%である。さらに、GPI−PLDの構造は、Scallonら、1991年に考察されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、GPI−PLD酵素のクローニングおよびこの酵素の生化学的特性に関する研究にもかかわらず、in vivoでの酵素の役割あるいは可能なあらゆる医療使用(medical use)のうちの多くは、未知のままである。
【0007】
O’Brienら(1999年)は、マクロファージによるGPI−PLDの発現を述べ、GPI−PLDの発現の増加が、アテローム性動脈硬化症における炎症および病原を引き起こすことに関与することを示唆している。
【0008】
【課題を解決するための手段】
概して、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の予防および治療のためのGPI−PLDの使用に関する。ある種の実施形態では、このプロセスは、例えば1型糖尿病など、GPI−PLDの生成不全によって引き起こされていてもよく、アポリポタンパク質A1が欠乏した患者、またはGPI−PLDまたはApo−A1に対する自己抗体をもつ患者など、GPI−PLDの送達不全によって引き起こされていてもよい。他の実施形態では、アテローム硬化プロセスは、GPI−PLD活性の喪失、例えば、その活性または標的組織への送達に影響し、それによりアテローム硬化プロセスがもたらされる、GPI−PLDの遺伝的改変が存在することに起因してもよい。したがって、O’Brienら(1999年)とは対照的に、本発明は、GPI−PLDを投与することによって、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態を治療することを提案する。
【0009】
アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の例には、1型糖尿病、ApoA1の欠乏の特徴がある状態、冠状動脈疾患(CAD)などの心血管障害、全身性エリテマトーデス(SLE)、およびシェーグレン症候群がある。
【0010】
したがって、第一の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品の調製のためのGPI−PLDの使用を提供する。
【0011】
他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品の調製のためのGPI−PLDをコードする核酸分子の使用を提供する。
【0012】
他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療のための医薬品の調製における、GPI−PLDを発現および分泌する能力がある宿主細胞の使用を提供する。
【0013】
一実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞によって生成されたGPI−PLDが、患者の免疫系による拒絶が妨げられながら、患者に分泌されるように、例えば生体適合性ポリマー中に封入される。生体適合性ポリマーに細胞を封入するための方法は、WO93/16687およびWO96/31199に記載されている。
【0014】
さらに他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療のためのGPI−PLDを含む組成物を含むキットを提供する。GPI−PLDを含む組成物は、単独で、あるいは同時投与あるいは逐次投与用の、アテローム性動脈硬化症の治療のための他の医薬品と組み合わせて投与してもよい。
【0015】
他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態である、あるいは発生の危険がある患者を診断する方法であって、この患者から得られたサンプル中のGPI−PLDの量および/またはGPI−PLD活性を決定することを含む方法を提供する。
【0016】
一実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態である、あるいは発症する危険性がある患者を診断する方法であって、(a)この患者から得られたサンプルを、GPI−PLDに特異的な結合部位をもつ結合剤を固定した固形支持体と接触させる工程と、(b)この結合剤に結合しているGPI−PLDの量またはGPI−PLDの活性を決定する工程を含む方法を提供する。
【0017】
この方法は、工程(b)で得られた値を、対照被験者から得られた測定値と相関させて、患者が前記状態を有しているか、あるいはそれを発する危険性があるかを決定する追加の工程(c)を含んでもよい。
【0018】
本発明のこれらの態様、および他の態様を、以下により詳細に説明する。本発明の実施形態を、実施例を介して、添付の図面に関して説明する。
【0019】
【発明の実施の形態】
GPI−PLDタンパク質
用語「GPI−PLDの生物活性」は、本明細書では、例えばGPIに固着したタンパク質の遊離など、ホスホジエステル結合の切断によってグリコシルホスファチジルイノシトールからホスファチジン酸を遊離するGPI−PLD酵素活性と定義される。Hellerら(1994年)に記載されるように、この活性は、全長GPI−PLDのN末端39kD部分に局在している。
【0020】
本明細書で述べたGPI−PLDの医療使用は、Huangらによって開示された、また、PCT/GB99/04399に開示されたGPI−PLD変異体(variant)を使用することができる。当分野の技術者であれば、医薬品用に、こうしたタンパク質、またはそれらの断片、活性な部分、変異体、およびアレル(allele)を大量に生成するために、本明細書で述べた技術、および当技術分野でよく知られた他の技術を使用することができる。
【0021】
こうした従来の技術の配列のアミノ酸配列変異体またはアレルであるGPI−PLDタンパク質も、本発明において使用できる。変異体またはアレルであるポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、欠失、および挿入のうちの1つまたは複数によって与えられるものとは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。ある種の実施形態では、このポリペプチドは、上で定義した通りのGPI−PLD酵素機能をもつ。他の実施形態では、GPI−PLDは酵素として不活性、例えばIPGを遊離する活性をもたず、しかも、異常な、または調節障害のあるGPI−PLDと競合することによって、アテローム性動脈硬化症をもたらす恐れのある異常なGPI−PLDの活性を下方制御することができる。
【0022】
図1に示したアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体またはアレルであるGPI−PLDタンパク質は、図1に示されたアミノ酸配列との配列同一性が約70%超、約80%超、約90%超、約95%超、約97%超、約98%超、または約99%であるアミノ酸配列を含むことができる。配列比較および同一性の計算は、Clusterプログラム(Thompsonら、1994年)を用いて、次のパラメータ(Pairwise Alignment Parameters:Weight Matrix:pam series、Gap Open Penalty:10.00、Gap Extension Penalty:0.10)を使用して行うことができる。あるいは、Genetics Computer Group, Oxford Molecular Group, Madison, Wisconsin, USA, Version 9.1から入手できるGCGプログラムを用いることができる。特定のアミノ酸配列変異体は、1アミノ酸、2、3、4個、5〜10個、10〜20個、20〜30個、30〜50個、50〜100個、100〜150個、あるいは150個以上のアミノ酸の挿入、付加、置換、または欠失により、図1に示されているものと異なってもよい。
【0023】
一実施形態では、本発明の変異体GPI−PLDポリペプチドは、その成熟配列の689〜692番目のアミノ酸のリン酸化部位、すなわちアミノ酸モチーフRRFS内で、ヒトGPI−PLDと比較して、アミノ酸配列が異なる。用語「変異体GPI−PLDポリペプチド」は、とりわけ、1つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換および/または挿入によってこの領域内で改変されたポリペプチドを含むものとする。こうした配列の相違は、例えば、このポリペプチドをコードする核酸の操作によって、あるいはこのポリペプチド自体が変化することによって、あるいは変異体タンパク質の新規合成によって、親GPI−PLDポリペプチド、すなわち野生型のGPI−PLDポリペプチドあるいは1つまたは複数の他の改変を含むGPI−PLDポリペプチドの、GPI−PLDアミノ酸配列が変わる結果であり得る。好ましい実施形態では、GPI−PLDは、例えば、機能的N末端ドメインを含むことによって、少なくとも部分的に、その生物活性の1つを保持する。
【0024】
欠失は、この領域内の1、2、3個のアミノ酸、あるいは4個すべてのアミノ酸の欠失の形をとり得る。ある種の実施形態では、欠失は、GPI−PLD分子のより大きな部分を包含する、より大きな欠失の一部であってもよい。好ましい実施形態では、変異体GPI−PLDポリペプチドは、689〜692(両端を含む)残基を含む欠失によって、ヒト野生型GPI−PLDのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をもつ。
【0025】
挿入は、RRFSモチーフ内のアミノ酸の間に、それを中断するように挿入された、1、2、3、4、または5個、あるいはそれ以上の追加のアミノ酸の形をとり得る。
【0026】
置換は、野生型ヒトGPI−PLDの689〜692アミノ酸に相当する領域内の1、2、3個のアミノ酸、または4個すべてのアミノ酸の置換の形をとり得る。この領域内の置換は、GPI−PLDポリペプチドの他の部分を含む、より広範囲な一連の置換の一部であってもよい。特に、実際に使用される可能性のあるGPI−PLDの突然変異形は、野生型の配列とは異なる。これらの突然変異体のいくつかは、下に述べる実験で使用する。
【0027】
こうした配列の相違は、例えば、このポリペプチドをコードする核酸の操作によって、あるいはこのポリペプチド自体が変化することによって、あるいは変異体タンパク質の新規合成によって、親GPI−PLDポリペプチド、すなわち野生型のGPI−PLDポリペプチドあるいは1つまたは複数の他の改変を含むGPI−PLDポリペプチドの、GPI−PLDアミノ酸配列が変わる結果であり得る。好ましい実施形態では、GPI−PLDは、例えば、機能的N末端ドメインの存在によって、少なくとも部分的に、その生物活性の1つを保持する。
【0028】
本発明で使用するためのGPI−PLD変異体は、ホスホジエステル結合の切断によって、グリコシルホスファチジルイノシトールからホスファチジン酸を遊離する、GPI−PLD酵素活性を保持することが好ましい。
【0029】
他の実施形態では、GPI−PLDは、正常でないまたは異常調節されたGPI−PLDの異常活性がこの状態の原因因子であるようなアテローム性動脈硬化症を治療するために使用され得る、酵素として非活性な変異体であってもよい。この場合、この酵素として非活性な変異体は、例えばそのApo−A1担体からの正常でないまたは異常調節されたGPI−PLDと競合するあるいは置き換わり、それによってGPI−PLD活性を下方制御する効果をもつ。こうした拮抗的なアンタゴニストの設計および合成は、本出願で提供するGPI−PLDについての情報を用いて容易に実施できる。
【0030】
本発明はまた、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の予防または治療用の医薬品の調製のためのGPI−PLDタンパク質の活性な部分およびフラグメントの使用も含む。
【0031】
GPI−PLDタンパク質の「活性な部分」は、前記の全長GPI−PLDタンパク質より短いが、少なくともその基本的酵素活性、例えば、上で言及した、酵素のN末端39kD部分に位置することが知られている酵素活性を保持しているポリペプチドである。例えば、GPI−PLDタンパク質の一部は、他のタンパク質と相互作用することによって、封鎖剤(sequestrator)または拮抗的なアンタゴニストとして働く。通常、活性な部分は、例えば、図1に示される配列からの1つまたは複数のモチーフから選択されるアミノ酸など、少なくとも約300個のGPI−PLDのアミノ酸、より好ましくは少なくとも500個のGPI−PLDのアミノ酸、よりいっそう好ましくは少なくとも700個のGPI−PLDのアミノ酸を含む。
【0032】
GPI−PLDタンパク質の「フラグメント」は、少なくとも約5〜7個の連続するアミノ酸、しばしば少なくとも約7〜9個の連続するアミノ酸、通常少なくとも約9〜13個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約20〜30個以上の連続するアミノ酸、より好ましくは40個より多いアミノ酸、より好ましくは100個より多いアミノ酸のアミノ酸残基のひと続きを意味する。
【0033】
本発明によるアテローム硬化状態の予防または治療用の医薬品の調製において使用するためのポリペプチドは、例えば、それをコードする核酸(以下を参照のこと)からの発現によって生成された後に、(例えば、抗体を用いて)単離および/または精製してもよい。本発明によるポリペプチドは、化学合成によって、完全にまたは部分的に作成することもできる。
【0034】
GPI−PLDポリペプチドは、例えばエフェクター分子、標識、薬物、毒素および/または担体、あるいは輸送分子などの結合相手と連結することもできる。本発明のペプチドを、ペプチジルおよび非ペプチジル結合相手のどちらとも結合させるための技術は、当技術分野でよく知られている。一実施形態では、(例えば、「Penetratin」という名前で販売されている)担体分子は、アンテナペディア(Antennapedia)のホメオドメインから得られた16aaペプチド配列であり、これは、末端Cys残基を介してペプチドと結合することができる。「Penetratin」分子およびその性質は、WO91/18981に記載されている。
【0035】
GPI−PLD核酸
「GPI−PLD核酸」には、GPI−PLD活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をもつ核酸分子が含まれる。ヒトおよびウシのGPI−PLD酵素の適当な全長配列は、例えば、Huangらによって、Tsangら(1992)によって、また、PCT/GB99/04399中で提供されている。これらの形のGPI−PLDは、ヒト第6染色体に位置しており、95.95および99.71位置で、D6S1660〜D6S1558の4センチモルガン領域(NCBI GeneMap’98)に含まれる。この遺伝子は、6p22.3に相当する細胞発生(cytogenic)領域に始まり、6p21. 3に伸長する。この領域はまた、IDDM1およびHLA遺伝子座(HLA遺伝子は、隣接するD6S1558〜D6S1616間に位置しているが)も含んでいる。マウスGPI−PLD遺伝子もまた、ヒトでは第6染色体上にみられるfim 1位置の近くの第13染色体に位置している。
【0036】
GPI−PLDコード配列は、上で述べた、発表された配列の1つ、または相補的な核酸配列であってもよく、あるいは、こうした配列の1つの突然変異体、変異体、誘導体、またはアレルであってもよい。この配列は、示された配列のうちの1つまたは複数のヌクレオチドの、付加、挿入、欠失、および置換のうちの1つまたは複数である変化によって示されたものと異なってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化は、タンパク質レベルでのアミノ酸変化、すなわち遺伝コードによって決定されるものではない変化をもたらしてもよい。
【0037】
コードされたポリペプチドは、発表されたGPI−PLDアミノ酸配列の1つと、1つまたは複数のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含んでいてもよい。本発明では、さらに、知られているGPI−PLDアミノ酸配列突然変異体、変異体、またはアレルであるポリペプチドをコードする核酸の使用を想定している。こうしたポリペプチドは、以下に明らかにしている。こうしたポリペプチドをコードする核酸は、上に述べた通りのGPI−PLDタンパク質に対する発表されたコード配列と、約70%超の同一性、約80%超の同一性、約90%超の同一性、約95%超の同一性、約98%超の同一性、あるいは約99%超の同一性を示してもよい。
【0038】
本発明はまた、好ましくは少なくとも長さ12、15、30、45、60、120、または240ヌクレオチドのフラグメントである、GPI−PLD核酸配列のフラグメントの使用も含む。
【0039】
一般に、本発明による使用のための核酸は、単離および/または精製された形の、あるいは、例えば、発現のためのおそらく1つまたは複数の制御配列以外は、ヒトゲノム中のその遺伝子に隣接する核酸がないか、または実質上ないものなど、天然では結合している物質がないか、または実質上ない単離物として提供される。核酸は、完全にまたは部分的に合成でもよく、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAを含んでもよい。本発明による核酸がRNAを含む場合、示された配列に対する言及は、Tの代わりにUを含むRNA等価物に対する言及と解釈されるべきである。
【0040】
GPI−PLD遺伝子および/またはその調節エレメントのすべてまたは一部をコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参考文献、ならびに当技術分野で知られた技術を用いて、当分野の技術者によって容易に調製することができる。例えば、Sambrookら、1989年、およびAusubelら、1992年を参照のこと。これらの技術には、(i)例えばゲノム源(genomic source)などからこうした核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用、(ii)化学合成、あるいは(iii)E.coli中での増幅が含まれる。改変されたGPI−PLDタンパク質の発現を提供するために、例えば部位特異的変異変異(site directed mutagenesis)を用いて、あるいはこの核酸を発現するために使用した宿主細胞中のコドン選択(codon preference)を考慮して、GPI−PLD配列に対する改変を行うことができる。
【0041】
GPI−PLD核酸配列の発現を得ることを目的として、その発現を制御するために、GPI−PLD核酸に作動可能に連結した制御配列を有するベクター中に、その核酸配列を組み込むことができる。発現システムの使用により、技術的工夫が進歩してきた。ベクターは、例えばプロモーターやエンハンサーなどの、挿入された核酸の発現させるための他の配列、GPI−PLDタンパク質が融合体として生成されるような核酸配列、および/または宿主細胞中で生成されたポリペプチドが、この細胞から分泌されるような、分泌シグナルをコードする核酸を含んでいてもよい。その後、ベクターを、このベクターが機能的であるような宿主細胞中で形質転換させし、宿主細胞をGPI−PLDタンパク質が生成されるように培養し、宿主細胞または周囲の培地からGPI−PLDタンパク質を回収することによって、GPI−PLDタンパク質を得ることができる。当技術分野のこの目的のためには、E.coli株、酵母、COSまたはCHO細胞などの真核細胞を含めて、原核細胞および真核細胞が使用できる。宿主細胞を選択することにより、これらの細胞中に発現するGPI−PLDタンパク質の性質を制御する、例えば、宿主細胞中でポリペプチドが蓄積する場所を制御する、あるいはその糖鎖形成およびリン酸化などの性質に影響を与えることができる。
【0042】
核酸の増幅のためのPCR技術は、米国特許第4,683,195号に記載されている。一般に、こうした技術では、フォワード(forward)およびリバース(reverse)オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅のための標的であるポリヌクレオチド配列と同一であるまたは類似であるように設計するために、標的配列の両端の配列情報が分かっている必要がある。PCRは、鋳型核酸の変性(二重鎖の場合)、標的へのプライマーのアニーリング、および重合の工程を含む。増幅反応においてプローブとして、または鋳型として使用される核酸は、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAであり得る。PCRを使用して、ゲノムDNAからの特異的配列、mRNAから転写された特異的RNA配列およびcDNA、バクテリオファージ、またはプラスミド配列を増幅することができる。発表されたGPI−PLDタンパク質核酸配列により、当分野の技術者であれば、容易にPCRプライマーを設計できるであろう。PCR技術の一般使用のための参考文献には、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、51: 263、1987、Ehrlich(編)、PCR Technology、Stockton Press、NY、1989、Ehrlichら、Science、252: 1643−1650、1991、「PCR protocols ; A Guide to Methods and Applications」、Eds. Innisら、Academic Press、New York、1990がある。
【0043】
本発明による使用のための核酸は、図に示した核酸配列の1種または複数のフラグメント、特に、コドン使用または統計分析に基づいたとき比較的珍しい配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計された1種または複数のオリゴヌクレオチドプローブあるいはプライマーを用いて得ることができる。上の図に示した核酸配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計されたプライマーは、標的核酸をクローニングするクローニングベクター中の配列にハイブリダイズするように設計された1種または複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用してもよく、ライブラリ中のcDNAが、オリゴヌクレオチドリンカーに結合し、図に示したGPI−PLD核酸配列とハイブリダイズするプライマーおよびオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするプライマーを用いて、PCRが実施される、いわゆる「RACE」(cDNA末端の急速増幅)において使用してもよい。
【0044】
こうしたプローブは、試験対象となる個体から得られたサンプルからの標的配列とハイブリダイズするので、こうしたオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびに全長配列(および突然変異体、アレル、変異体、および誘導体)もまた、核酸を含む試験サンプルを、GPI−PLDタンパク質のアレル、突然変異体、および変異体の存在についてスクリーニングするのに有用である。ハイブリダイゼーションの条件を制御して、非特異的な結合を最小限にすることができるが、好ましくはストリンジェントないし中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。当分野の技術者であれば、こうしたプローブを容易に設計し、これを標識し、Sambrookら(1989年)およびAusubelら(1992年)などのテキストを参考として、ハイブリダイゼーション反応のための適当な条件を工夫することができるであろう。
【0045】
「ストリンジェントな条件」の例は、次のようなものである:(1)洗浄には低イオン強度、高温を使用する、例えば0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを50℃で使用する、(2)ハイブリダイゼーション中、ホルムアミドなどの変性剤、例えば42℃で、0.1%BSA+50%(v/v)ホルムアミド/0.1%Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)を、750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムとともに使用する、あるいは(3)50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50mg/ml)、0.1% SDS、および10%デキストラン硫酸を、42℃で使用し、0.2×SSC、55℃の50%ホルムアミド中の洗浄液を42℃で使用し、続いて、55℃の、EDTA を含有する0.1×SSCからなる高度にストリンジェントな洗浄液を使用する。これらのハイブリダイゼーション条件は、GPI−PLD核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を定める状況で使用してもよい。
【0046】
GPI−PLD核酸の使用
GPI−PLD核酸配列は、GPI−PLDを発現する能力をもつ細胞系の調製において使用することができ、かつ、発現ベクター中に含めるかそうでなければ、例えば、遺伝子治療技術における使用するために処方することができる。
【0047】
したがって、本発明は、GPI−PLDをコードする核酸を用いて形質転換され、GPI−PLDを発現および分泌する能力がある、患者に移植するための細胞株を提供する。一実施形態では、細胞株によって生成されたGPI−PLDが、宿主の免疫系による拒絶が妨げられながら患者に分泌されるように、これらの細胞株を例えば生体適合性ポリマー中に封入することができる。細胞を生体適合性ポリマー中に封入するための方法は、WO93/16687およびWO96/31199に記載されている。
【0048】
他の代替法として、GPI−PLDタンパク質をコードする核酸を、遺伝子療法において使用することによって、野生型GPI−PLDタンパク質によってもたらされる作用を提供し、また標的細胞における糖尿病の発生を抑制して、活性なポリペプチドを合成することができない、あるいは活性なポリペプチドを正常レベルで合成することができない患者を治療することができる。
【0049】
ウイルスベクターなどのベクターは、遺伝子を様々な異なる標的細胞に導入するために、従来の技術で使用されてきた。通常、これらのベクターは、所望のポリペプチド発現からの有用な治療または予防効果を提供するために、十分な割合の細胞に形質移入が起こるように、標的細胞に曝される。形質移入された核酸は、標的となる腫瘍細胞のそれぞれのゲノムに永続的に組み込むことができ、長期持続的効果を提供する、あるいは、この治療を周期的に繰り返してもよい。
【0050】
様々なベクター、ウイルスベクターとプラスミドベクターの両方が、当技術分野で知られており、米国特許第5,252,479号およびWO93/07282を参照されたい。具体的には、遺伝子導入ベクターとして、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、HSVおよびEBVを含めたヘルペスウイルス、ならびにレトロウイルスを含めて、多くのウイルスが使用されている。従来の技術の多くの遺伝子治療プロトコルは、無力化したマウスレトロウイルスを使用している。
【0051】
ウイルスベクターの使用に代わるものとして、核酸を細胞に導入する、知られている他の方法には、エレクロトポレーション法、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクションなどの機械技術、リポソームによって仲介される導入、およびDNAの直接取り込み、および受容体が仲介するDNA導入がある。
【0052】
上で言及した通り、GPI−PLDタンパク質をコードする核酸、またはその活性な部分を用いた遺伝子治療の目的は、野生型GPI−PLDタンパク質のレベルが0であるまたは少ないレベルでのみ存在する細胞において、この核酸の発現産物の量を増加させることである。遺伝子治療のための標的細胞には、インシュリンを分泌するβ細胞や、ニューロンから誘導されたあらゆる細胞がある。細胞工学を使用して、その後ヒトに移植することができる形質移入された細胞株中のGPI−PLDタンパク質の過剰発現または抑制をもたらすことができる。組織特異的な方式でGPI−PLDタンパク質を発現させるプロモーターを用いて、遺伝子治療を使用することができる(すなわちGPI−PLD cDNAに連結しているインシュリン・プロモーターは、b細胞中、および一時的に脳内で、GPI−PLDタンパク質を過剰発現することとなる)。GPI−PLDタンパク質の欠陥機能が、神経疾患に関与する場合、GPI−PLDタンパク質は、移植用の形質転換された細胞株中で過剰発現させることができる。
【0053】
GPI−PLD核酸を選択的に標的組織に向ける遺伝子導入技術が好ましい。この例には、この核酸が、標的細胞の表面上に存在する受容体に特異的であるタンパク質リガンドに、ポリリジンを介して連結するものである、受容体が仲介する遺伝子導入が含まれる。
【0054】
薬剤組成物
上で言及した通り、GPI−PLDタンパク質および核酸は、当技術分野でよく知られた技術を用いて、薬剤組成物として配合することができる。
【0055】
経口投与用の薬剤組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体の形状中に入っていてもよい。錠剤は、ゼラチンなどの固形状担体、または補助薬または不活性な希釈剤を含んでもよい。液体の薬剤組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油、あるいは合成油などの液状担体を含む。生理的食塩水、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。こうした組成物および調製物は、一般に、少なくとも0.1重量%の化合物を含有する。
【0056】
非経口投与には、次の経路による投与が含まれる。すなわち、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内、ならびに(経皮、眼、直腸内、経鼻、吸入、およびエアロゾルを含めて)局所、ならびに直腸全身的経路である。静脈内、皮膚、または皮下注射、あるいは苦痛部位での注射については、有効成分は、発熱性物質なしの、pH、等張性、および安定性が適切である、非経口的に許容される水溶液の形状の中に入ることとなる。当分野の技術者であれば、例えば化合物またはその誘導体の、例えば生理的食塩水、グリセロールを用いて調製した分散液、液状ポリエチレングリコール、またはオイルの溶液を用いて、適当な溶液を適切に調製することができるであろう。
【0057】
他の有効成分と任意選択で組み合わせた化合物の1種または複数の他に、組成物は、当分野の技術者によく知られている薬剤として許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、等張化剤、保存剤または酸化防止剤、あるいは他の材料の1種または複数を含むことができる。こうした材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるものであってはならない。担体または他の材料のストリンジェントな性質は、例えば経口的にまたは非経口的になど、投与経路に応じて変わってもよい。
【0058】
液状の薬剤組成物は、通常、pHが約3.0と9.0の間、より好ましくは約4.5と8.5の間、よりいっそう好ましくは約5.0と8.0の間であるように配合される。組成物のpHは、通常、約1mM〜50mMの範囲で使用される酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、Tris、またはヒスチジンなどの緩衝液を使用することによって保つことができる。組成物のpHは、生理的に許容される酸または塩基を用いて別の方法で調整することもできる。
【0059】
一般に、薬剤組成物中には、微生物の成長を遅らせる、組成物の貯蔵寿命を延長させる、また、複数回使用の包装を可能にするために保存剤が含められる。保存剤の例には、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸およびそのエステル、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、ならびに塩化ベンゼトニウムがある。保存剤は通常、約0.1〜1.0(%)(w/v)の範囲で使用される。
【0060】
薬剤組成物は、個体に対する利益を示すのに十分である「予防有効量」または「治療有効量」(場合により、予防を治療とみなすが)で、個体に投与されることが好ましい。通常、これは、個体に対する利益をもたらす、治療的に有用な活性をもたらすこととなる。投与される化合物の実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される状態の種類および重さに依存することとなる。治療の処方箋、例えば用量の決定などは、一般開業医および他の医師に責任があり、通常、治療される障害、それぞれの患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に分かる他の要因を考慮する。上で言及した技術およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、16th edition、Osol、A.(編)、1980に出ている。例として、組成物は、患者に、体重1kgあたり活性な化合物0.01mgと100mgの間の用量で投与されることが好ましく、体重1kgあたり0.5mgと10mgの間であることがより好ましい。
【0061】
組成物は、さらに1種または複数の他の薬剤として活性な薬剤、本発明のさらなる化合物、イノシトールホスホグリカン、インシュリンなどの成長因子、NGFまたは下に列挙する他の成長因子、あるいは下に述べる状態の治療のために使用する薬物など、他の薬物を含んでもよい。
【0062】
医療使用
本発明のGPI−PLDポリペプチドおよび核酸は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態、あるいは自己免疫状態、特に、GPI−PLDまたはApoA1/GPI−PLD複合体に対する自己抗体が存在する特徴がある状態を(予防的または治療的に)治療するための医薬品の調製において使用することができる。こうした状態の例には、冠状動脈疾患(CAD)などの心血管障害およびその合併症、全身性エリテマトーデス(SLE)の治療、特にアテローム硬化病変、シェーグレン症候群、および1型または2型糖尿病に関連する脂質異常がある。
【0063】
異常脂肪血症は、冠状動脈疾患の古典的(classic)危険因子であると認識されている。早発性のアテローム性動脈硬化症は、全身性エリテマトーデス(SLE)、すなわち広範囲の全身性病態がみられる原因が知られていない自己免疫疾患を患う患者における、重要な罹患の原因である。SLEを患う患者は、アポリポタンパク質A1に対する自己抗体をもつことが報告されている(Merrillら、Arthitis and Rheum.、38: 1655−1659、1995)。
【0064】
特定の理論に拘泥するものではないが、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の患者が、ApoA1によるGPI−PLD送達における欠陥をもつと仮定する。このことは、ApoA1の先天的な欠損があり、糖尿病合併症の徴候を示す患者について整合性がある。
【0065】
ある種の態様では、GPI−PLDを、それがヒトの血清および血液中で結合するアポリポタンパク質A1と組み合わせて投与してもよい。
【0066】
さらなる態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の診断および/または治療において有用な材料を含む製造品を提供する。この製造品は、容器およびラベルを含む。適当な容器には、例えばガラスまたはプラスチックなどの材料から形成されるビン、バイアル、注射器、および試験管がある。容器は、アテローム性動脈硬化症を診断するか、または治療に有効な組成物を入れ、例えば、組成物に接触するために針によって穴を開けることができる栓などの滅菌した接触口を備えていてもよい。この商品をアテローム性動脈硬化症の予防または治療のために使用する場合、組成物はGPI−PLDまたは変異体、活性な部分またはその断片を含んでいてもよい。この商品は、任意選択で、GPI−PLDとの混合物で、あるいは1つまたは複数のさらなる容器に入ったキットの一部として、アテローム性動脈硬化症の治療のための、あるいはGPI−PLDの薬理学的特性を向上するための、1種または複数のさらなる有効成分を含んでいてもよい。この商品をアテローム性動脈硬化症の診断のために使用する場合、容器を、本明細書で述べるアッセイを行うのに有用な1種または複数の試薬を入れるために使用してもよい。容器面の、あるいは添付したラベルに、アテローム性動脈硬化症の診断または治療のためのこの組成物の使用を記載し、使用者に指示するための詳細な指示書を提供してもよい。製造用商品は、薬剤として許容される緩衝液、リンガー溶液および/またはブドウ糖溶液を入れた第2の容器をさらに含んでもよい。
【0067】
診断アッセイ
個体からの生体サンプル中のGPI−PLD活性、あるいはこの酵素の量または濃度を決定するための方法は、当技術分野でよく知られており、個体がアテローム性動脈硬化症または本明細書で述べる他の状態のうちの1つを患っている、あるいはアテローム性動脈硬化症の危険があるかどうか決定するために、本発明のコンテキストで使用することができる。こうした分析の目的を、医師がアテローム性動脈硬化症の重さまたは経過見込みを決定するのを補助するために、かつ/またはその治療を最も効果的にするために、診断または予後のために使用してもよい。
【0068】
胎盤中に存在する正常でないまたは異常調節されたGPI−PLD活性が、アテローム性動脈硬化症の原因の1つであると考えられているので、好ましい診断方法は、GPI−PLD活性の決定に頼るものである。一実施形態では、この方法は、例えば標識した基質に対するGPI−PLDの作用を測定することによって、患者から得られた生体サンプル中のGPI−PLD活性を決定することを含む。あるいは、または追加的に、サンプル中のGPI−PLDの濃度または量を決定してもよい。通常、この方法は、血液、血清、組織サンプル、または尿などの生体サンプルを使用する。サンプルに応じて、例えばサンプルから細胞屑または望ましくない混在物を除去するなど、前処理工程を行うことが好都合である可能性がある。
【0069】
ある種の実施形態では、GPI−PLD活性を決定するためのアッセイ方法は、個体において、GPI−PLDに特異的に結合する能力がある結合部位をもつ結合剤を使用し、また、当技術分野でよく知られており、個体がアテローム性動脈硬化症または本明細書で述べる他の状態の1つを患う、あるいは発生の危険があるかどうか決定するために、本発明において使用することができる。こうした分析の目的を、医師がアテローム性動脈硬化症の重さまたは経過見込みを決定するのを補助するために、かつ/またはその治療を最も効果的にするために、診断または予後のために使用してもよい。
【0070】
胎盤中に存在する異常なまたは調節障害のあるGPI−PLD活性が、アテローム性動脈硬化症の原因の1つであると考えられているので、好ましい診断方法は、GPI−PLD活性の決定に頼るものである。一実施形態では、この方法は、例えば標識した基質に対するGPI−PLDの作用を測定することによって、患者から得られた生体サンプル中のGPI−PLD活性を決定することを含む。あるいは、または追加的に、サンプル中のGPI−PLDの濃度または量を決定してもよい。通常、この方法は、血液、血清、組織サンプル、または尿などの生体サンプルを使用する。サンプルに応じて、例えばサンプルから細胞残渣または望ましくない混在物を除去するなど、前処理工程を行うことが好都合である可能性がある。
【0071】
ある種の実施形態では、GPI−PLD活性を決定するためのアッセイ方法は、他の分子、特にサンプル中に存在する可能性がある他の分子よりも優れて、GPI−PLDに特異的に結合する能力がある結合部位をもつ結合剤を使用する。結合剤の例には、GPI−PLDに特異的に結合する能力がある抗体、受容体、および他の分子がある。好都合には、結合剤は、アッセイ中の扱いを容易にするために、例えば定められた位置で、固体支持体に固定させる。これは、結合剤を固体支持体に化学的に結合させるために、例えばビオチン/アビジンまたはビオチン/ストレプトアビジンを使用するなど、物理吸着や化学吸着などの当技術分野でよく知られた技術を用いて実現できる。
【0072】
サンプルは、一般に、サンプル中に存在するGPI−PLDが、結合剤と結合できるように適切な条件下で結合剤と接触させる。GPI−PLD活性は、GPI−PLDによって切断するホスホジエステル結合をもち、ホスファチジン酸とGPIアンカーを遊離するグリコシルホスファチジルイノシトールなどの適当な基質を使用し、例えば、アッセイ系において、基質あるいは(1種または複数の)反応生成物の量を追跡することによってこの酵素反応をモニターすることによって決定できる。このプロセスは、基質を標識し、基質の標識の減少、または反応生成物中の標識の増加を検出することによって容易になる。
【0073】
サンプル中のGPI−PLDの(活性ではなく)量の決定の場合、顕色剤の1種または複数を用いて、結合剤の結合部位の占有率を決定することができる。結合剤の占有結合部位に対して、顕色剤が分析物と競合する(例えば、この分析物の標識類似体を使用する)拮抗的な方法、あるいは、標識された顕色剤が、結合剤と結合しているか、または占有結合部位に結合している分析物と結合する(例えば適切な結合特異性をもつ抗体を使用する)非拮抗的な方法で、顕色剤を使用することができる。どちらの方法も、分析物によって占有された結合部位の数を示し、またそれにより、例えば濃度が知られている分析物を含有するサンプルを用いて得られた基準値と比較することによって、サンプル中の分析物の濃度を提供する。
【0074】
通常、基質または顕色剤は、検出可能で、好ましくは測定可能なシグナルを直接的または間接的に発生する標識分子またはレポーター分子で標識される。レポーター分子の結合は、直接的または間接的に、例えばペプチド結合を介して共有結合的でもよいし、非共有結合的でもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組み換え体発現の結果であるものであってもよい。抗体を検出可能部分に別々に結合させるためには、Hunterら、Nature 144: 945、1962、Davidら、Biochemistry 13: 1014、1974、Painら、J. Immunol. Meth. 40: 219、1981、およびNygren、J Histochem. and Cytochem. 30: 407、1982によって記載されている方法を含めて、当技術分野で知られたどんな方法を使用してもよい。
【0075】
1つの好ましい方式は、スペクトルとして分離された吸収または発光特性を有する個々の蛍光色素、リン光体、あるいはレーザー色素と、基質または顕色剤の各の種を共有結合することである。適当な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン、フィイコエリトリン、およびTexas Redがある。適当な発色性色素には、ジアミノベンジジンがある。他の検出可能な標識には、3H、14C、32P、35S、126I、または99mTcなどの放射性同位体標識、ならびに、検出可能な反応生成物が触媒反応をもたらし、シグナルを増幅させることが可能である、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素標識がある。
【0076】
他のレポーターには、着色した、磁性の、または常磁性のラテックスビーズ、ならびに検出可能なシグナルを直接的または間接的に、視覚的に観察されるまたは電気的に検出されるまたは他の方法で記録できるようにする、生物学的または化学的に活性な薬剤などの、高分子のコロイド粒子または微粒子状の材料がある。これらの分子は、呈色または変色する、あるいは、例えば、電気的性質を変化させる反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態の間の電子遷移が、特有のスペクトル吸収または発光をもたらすように、分子励起できるものであってもよい。これらには、バイオセンサーと組み合わせて使用される化学物質も含まれる。
【0077】
上で言及した通り、基質または顕色剤は、当技術分野でよく知られた技術を用いて検出できるように、(例えば、放射能、蛍光、または酵素標識で)標識される。したがって、放射能標識は、シンチレーションカウンタまたは他の放射線計数装置を用いて、蛍光標識は、レーザーおよび共焦点顕微鏡を用いて、酵素標識は、通常色の変化を示す、基質上の酵素標識の作用によって検出できる。
【0078】
【実施例】
SLE患者において、Apo−A1に対して自己抗体が存在することが確立されており、SLEは、早発性の冠動脈心疾患についての最良のモデルとみなされている。冠動脈心疾患への連関は、従来の技術では確立されていないが、ApoA1複合体に対する抗体は、GPI−PLDの組織への送達を妨げ、Apo−A1欠乏患者と同様の臨床効果をもつ。これらの連関は、GPI−PLDの欠乏が、インシュリン抵抗性を仲介する他に、その活性が低下すると冠動脈心疾患が引き起こされる、IPGが仲介する成長因子の欠乏も仲介することを示唆する。したがって、糖尿病合併症、SLE、およびApo−A1の先天性異常はすべて、標的組織におけるGPI−PLDの減少を伴うので、これらの間には連関が存在する。
【0079】
この仮説を試験するために、多くの自己免疫異常におけるGPI−PLD血漿濃度の比較を行った。SLEおよびシェーグレン症候群を患う患者のGPI−PLDレベルを測定し、コントロール群、すなわち正常な患者および慢性関節リウマチを患う患者と比較した。図2に示すように、SLEとシェーグレン症候群の両方を患う患者のGPI−PLDレベルは、統計的に上昇し、これらの条件では、自己抗体はGPI−PLDの組織への送達を抑制または予防し、血流中にGPI−PLDを蓄積させるという本明細書で開示したことと整合性があった。したがって、こうした患者は、GPI−PLDの血漿濃度が高く、組織中では対応する欠乏を示すために、逆説的な欠乏を生じる。
【0080】
ここに挙げた参考文献は、その全部が参照としてここに取りこまれるものとする。
【0081】
【参考文献】
【図面の簡単な説明】
【図1A】PCT/GB99/04399に開示されたヒトの肝臓のGPI−PLDの、推定されたアミノ酸配列、ならびに米国特許第5,418,147号(Huangら)に開示されたウシの肝臓およびヒトの肝臓のGPI−PLD配列を並べたものを示す。
【図1B】図1Aの続きである。
【図2】自己免疫異常を患う患者からのサンプル中にみられるGPI−PLDの血漿濃度を、コントロール群(正常な患者および関節リウマチを患う患者)と比較して示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼD(GPI−PLD)タンパク質の使用、詳細には、アテローム性動脈硬化症の進行によって特徴付けられる状態の治療または診断のためのGPI−PLDの使用に関する。
【0002】
【従来の技術】
多数の細胞表面タンパク質が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーとの共有結合によって細胞膜に付着していることが、研究により示されてきた。酵素GPI−PLDは、グリコシルホスファチジルイノシトールがホスファチジン酸と結合しているホスホジエステル結合を切断し、それによって、固着したタンパク質を遊離させることが示されている。
【0003】
GPI−PLDタンパク質は、ウシおよびヒト血清中に豊富である。これは、膵臓のランゲルハンス細胞およびマスト細胞によって最初に合成され、循環に放出され、アポリポタンパク質A1(ApoA1)との複合体の形で標的組織に運ばれると考えられている(Hoenerら、1993年)。GPI−PLD酵素は、グリコシルホスファチジルイノシトール(多数の細胞表面タンパク質が、これによって細胞膜に接着付着している)を加水分解する能力がある。GPI−PLDは、ジアシルグリセロールを産生するホスホリパーゼC活性と対照的に、ホスホジエステル結合を切断してホスファチジン酸を遊離する。
【0004】
さらに提案されたGPI−PLDの機能は、成長因子またはホルモンがその受容体に結合するのに応答して、原形質膜内の「遊離の」GPIを切断することによって、イノシトールホスホグリカンを生成することである(Rademacher ら、1994年)。GPI−PLDのこの役割は、好塩基球中で実証されており、ここでは、これらの細胞のIgE依存性活性化により、ヒスタミン、すなわち炎症反応のメディエータなどの物質を含めた細胞類粒の内容物が放出される。ヒスタミンは、抗原の存在下で放出されるが、この放出は、IPGの添加によって模倣することができ、抗GPI−PLD抗体の添加によってブロックされる(Linら、1991年)。
【0005】
米国特許第5,418,147号(Huangら)は、ウシの肝臓からのGPI−PLDの精製、およびウシの肝臓、ヒトの肝臓、およびそれに続くヒトの膵臓cDNAライブラリからの3種のGPI−PLD酵素のクローニングを記載している。この特許は、ヒトおよびウシの肝臓からのGPI−PLDの全長cDNAおよびアミノ酸配列、ならびにこの酵素のヒトの膵臓型の部分cDNAおよびアミノ酸配列を報告している。その後、GPI−PLDの膵臓型の全長配列が、Tsangら(1992年)で報告されており、この酵素は、胸、目、脾臓、および扁桃腺からのcDNAライブラリ中に発見されている。これらの3型の酵素は、高度に相同であり、ウシの肝臓GPI−PLDの予想される成熟タンパク質の配列は、ヒトの肝臓の酵素との配列同一性が82%であり、ヒトの膵臓の酵素と配列同一性が81%である。GPI−PLDのヒトの肝臓および膵臓型のアミノ酸配列は、受託番号L11701およびL11702でGenBankに寄託されており、それぞれ841個および840個のアミノ酸からなる。GPI−PLDのヒトの肝臓型と膵臓型は、配列同一性が94.6%である。さらに、GPI−PLDの構造は、Scallonら、1991年に考察されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、GPI−PLD酵素のクローニングおよびこの酵素の生化学的特性に関する研究にもかかわらず、in vivoでの酵素の役割あるいは可能なあらゆる医療使用(medical use)のうちの多くは、未知のままである。
【0007】
O’Brienら(1999年)は、マクロファージによるGPI−PLDの発現を述べ、GPI−PLDの発現の増加が、アテローム性動脈硬化症における炎症および病原を引き起こすことに関与することを示唆している。
【0008】
【課題を解決するための手段】
概して、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の予防および治療のためのGPI−PLDの使用に関する。ある種の実施形態では、このプロセスは、例えば1型糖尿病など、GPI−PLDの生成不全によって引き起こされていてもよく、アポリポタンパク質A1が欠乏した患者、またはGPI−PLDまたはApo−A1に対する自己抗体をもつ患者など、GPI−PLDの送達不全によって引き起こされていてもよい。他の実施形態では、アテローム硬化プロセスは、GPI−PLD活性の喪失、例えば、その活性または標的組織への送達に影響し、それによりアテローム硬化プロセスがもたらされる、GPI−PLDの遺伝的改変が存在することに起因してもよい。したがって、O’Brienら(1999年)とは対照的に、本発明は、GPI−PLDを投与することによって、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態を治療することを提案する。
【0009】
アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の例には、1型糖尿病、ApoA1の欠乏の特徴がある状態、冠状動脈疾患(CAD)などの心血管障害、全身性エリテマトーデス(SLE)、およびシェーグレン症候群がある。
【0010】
したがって、第一の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品の調製のためのGPI−PLDの使用を提供する。
【0011】
他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品の調製のためのGPI−PLDをコードする核酸分子の使用を提供する。
【0012】
他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療のための医薬品の調製における、GPI−PLDを発現および分泌する能力がある宿主細胞の使用を提供する。
【0013】
一実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞によって生成されたGPI−PLDが、患者の免疫系による拒絶が妨げられながら、患者に分泌されるように、例えば生体適合性ポリマー中に封入される。生体適合性ポリマーに細胞を封入するための方法は、WO93/16687およびWO96/31199に記載されている。
【0014】
さらに他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療のためのGPI−PLDを含む組成物を含むキットを提供する。GPI−PLDを含む組成物は、単独で、あるいは同時投与あるいは逐次投与用の、アテローム性動脈硬化症の治療のための他の医薬品と組み合わせて投与してもよい。
【0015】
他の態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態である、あるいは発生の危険がある患者を診断する方法であって、この患者から得られたサンプル中のGPI−PLDの量および/またはGPI−PLD活性を決定することを含む方法を提供する。
【0016】
一実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態である、あるいは発症する危険性がある患者を診断する方法であって、(a)この患者から得られたサンプルを、GPI−PLDに特異的な結合部位をもつ結合剤を固定した固形支持体と接触させる工程と、(b)この結合剤に結合しているGPI−PLDの量またはGPI−PLDの活性を決定する工程を含む方法を提供する。
【0017】
この方法は、工程(b)で得られた値を、対照被験者から得られた測定値と相関させて、患者が前記状態を有しているか、あるいはそれを発する危険性があるかを決定する追加の工程(c)を含んでもよい。
【0018】
本発明のこれらの態様、および他の態様を、以下により詳細に説明する。本発明の実施形態を、実施例を介して、添付の図面に関して説明する。
【0019】
【発明の実施の形態】
GPI−PLDタンパク質
用語「GPI−PLDの生物活性」は、本明細書では、例えばGPIに固着したタンパク質の遊離など、ホスホジエステル結合の切断によってグリコシルホスファチジルイノシトールからホスファチジン酸を遊離するGPI−PLD酵素活性と定義される。Hellerら(1994年)に記載されるように、この活性は、全長GPI−PLDのN末端39kD部分に局在している。
【0020】
本明細書で述べたGPI−PLDの医療使用は、Huangらによって開示された、また、PCT/GB99/04399に開示されたGPI−PLD変異体(variant)を使用することができる。当分野の技術者であれば、医薬品用に、こうしたタンパク質、またはそれらの断片、活性な部分、変異体、およびアレル(allele)を大量に生成するために、本明細書で述べた技術、および当技術分野でよく知られた他の技術を使用することができる。
【0021】
こうした従来の技術の配列のアミノ酸配列変異体またはアレルであるGPI−PLDタンパク質も、本発明において使用できる。変異体またはアレルであるポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、欠失、および挿入のうちの1つまたは複数によって与えられるものとは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。ある種の実施形態では、このポリペプチドは、上で定義した通りのGPI−PLD酵素機能をもつ。他の実施形態では、GPI−PLDは酵素として不活性、例えばIPGを遊離する活性をもたず、しかも、異常な、または調節障害のあるGPI−PLDと競合することによって、アテローム性動脈硬化症をもたらす恐れのある異常なGPI−PLDの活性を下方制御することができる。
【0022】
図1に示したアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体またはアレルであるGPI−PLDタンパク質は、図1に示されたアミノ酸配列との配列同一性が約70%超、約80%超、約90%超、約95%超、約97%超、約98%超、または約99%であるアミノ酸配列を含むことができる。配列比較および同一性の計算は、Clusterプログラム(Thompsonら、1994年)を用いて、次のパラメータ(Pairwise Alignment Parameters:Weight Matrix:pam series、Gap Open Penalty:10.00、Gap Extension Penalty:0.10)を使用して行うことができる。あるいは、Genetics Computer Group, Oxford Molecular Group, Madison, Wisconsin, USA, Version 9.1から入手できるGCGプログラムを用いることができる。特定のアミノ酸配列変異体は、1アミノ酸、2、3、4個、5〜10個、10〜20個、20〜30個、30〜50個、50〜100個、100〜150個、あるいは150個以上のアミノ酸の挿入、付加、置換、または欠失により、図1に示されているものと異なってもよい。
【0023】
一実施形態では、本発明の変異体GPI−PLDポリペプチドは、その成熟配列の689〜692番目のアミノ酸のリン酸化部位、すなわちアミノ酸モチーフRRFS内で、ヒトGPI−PLDと比較して、アミノ酸配列が異なる。用語「変異体GPI−PLDポリペプチド」は、とりわけ、1つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換および/または挿入によってこの領域内で改変されたポリペプチドを含むものとする。こうした配列の相違は、例えば、このポリペプチドをコードする核酸の操作によって、あるいはこのポリペプチド自体が変化することによって、あるいは変異体タンパク質の新規合成によって、親GPI−PLDポリペプチド、すなわち野生型のGPI−PLDポリペプチドあるいは1つまたは複数の他の改変を含むGPI−PLDポリペプチドの、GPI−PLDアミノ酸配列が変わる結果であり得る。好ましい実施形態では、GPI−PLDは、例えば、機能的N末端ドメインを含むことによって、少なくとも部分的に、その生物活性の1つを保持する。
【0024】
欠失は、この領域内の1、2、3個のアミノ酸、あるいは4個すべてのアミノ酸の欠失の形をとり得る。ある種の実施形態では、欠失は、GPI−PLD分子のより大きな部分を包含する、より大きな欠失の一部であってもよい。好ましい実施形態では、変異体GPI−PLDポリペプチドは、689〜692(両端を含む)残基を含む欠失によって、ヒト野生型GPI−PLDのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をもつ。
【0025】
挿入は、RRFSモチーフ内のアミノ酸の間に、それを中断するように挿入された、1、2、3、4、または5個、あるいはそれ以上の追加のアミノ酸の形をとり得る。
【0026】
置換は、野生型ヒトGPI−PLDの689〜692アミノ酸に相当する領域内の1、2、3個のアミノ酸、または4個すべてのアミノ酸の置換の形をとり得る。この領域内の置換は、GPI−PLDポリペプチドの他の部分を含む、より広範囲な一連の置換の一部であってもよい。特に、実際に使用される可能性のあるGPI−PLDの突然変異形は、野生型の配列とは異なる。これらの突然変異体のいくつかは、下に述べる実験で使用する。
【0027】
こうした配列の相違は、例えば、このポリペプチドをコードする核酸の操作によって、あるいはこのポリペプチド自体が変化することによって、あるいは変異体タンパク質の新規合成によって、親GPI−PLDポリペプチド、すなわち野生型のGPI−PLDポリペプチドあるいは1つまたは複数の他の改変を含むGPI−PLDポリペプチドの、GPI−PLDアミノ酸配列が変わる結果であり得る。好ましい実施形態では、GPI−PLDは、例えば、機能的N末端ドメインの存在によって、少なくとも部分的に、その生物活性の1つを保持する。
【0028】
本発明で使用するためのGPI−PLD変異体は、ホスホジエステル結合の切断によって、グリコシルホスファチジルイノシトールからホスファチジン酸を遊離する、GPI−PLD酵素活性を保持することが好ましい。
【0029】
他の実施形態では、GPI−PLDは、正常でないまたは異常調節されたGPI−PLDの異常活性がこの状態の原因因子であるようなアテローム性動脈硬化症を治療するために使用され得る、酵素として非活性な変異体であってもよい。この場合、この酵素として非活性な変異体は、例えばそのApo−A1担体からの正常でないまたは異常調節されたGPI−PLDと競合するあるいは置き換わり、それによってGPI−PLD活性を下方制御する効果をもつ。こうした拮抗的なアンタゴニストの設計および合成は、本出願で提供するGPI−PLDについての情報を用いて容易に実施できる。
【0030】
本発明はまた、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の予防または治療用の医薬品の調製のためのGPI−PLDタンパク質の活性な部分およびフラグメントの使用も含む。
【0031】
GPI−PLDタンパク質の「活性な部分」は、前記の全長GPI−PLDタンパク質より短いが、少なくともその基本的酵素活性、例えば、上で言及した、酵素のN末端39kD部分に位置することが知られている酵素活性を保持しているポリペプチドである。例えば、GPI−PLDタンパク質の一部は、他のタンパク質と相互作用することによって、封鎖剤(sequestrator)または拮抗的なアンタゴニストとして働く。通常、活性な部分は、例えば、図1に示される配列からの1つまたは複数のモチーフから選択されるアミノ酸など、少なくとも約300個のGPI−PLDのアミノ酸、より好ましくは少なくとも500個のGPI−PLDのアミノ酸、よりいっそう好ましくは少なくとも700個のGPI−PLDのアミノ酸を含む。
【0032】
GPI−PLDタンパク質の「フラグメント」は、少なくとも約5〜7個の連続するアミノ酸、しばしば少なくとも約7〜9個の連続するアミノ酸、通常少なくとも約9〜13個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約20〜30個以上の連続するアミノ酸、より好ましくは40個より多いアミノ酸、より好ましくは100個より多いアミノ酸のアミノ酸残基のひと続きを意味する。
【0033】
本発明によるアテローム硬化状態の予防または治療用の医薬品の調製において使用するためのポリペプチドは、例えば、それをコードする核酸(以下を参照のこと)からの発現によって生成された後に、(例えば、抗体を用いて)単離および/または精製してもよい。本発明によるポリペプチドは、化学合成によって、完全にまたは部分的に作成することもできる。
【0034】
GPI−PLDポリペプチドは、例えばエフェクター分子、標識、薬物、毒素および/または担体、あるいは輸送分子などの結合相手と連結することもできる。本発明のペプチドを、ペプチジルおよび非ペプチジル結合相手のどちらとも結合させるための技術は、当技術分野でよく知られている。一実施形態では、(例えば、「Penetratin」という名前で販売されている)担体分子は、アンテナペディア(Antennapedia)のホメオドメインから得られた16aaペプチド配列であり、これは、末端Cys残基を介してペプチドと結合することができる。「Penetratin」分子およびその性質は、WO91/18981に記載されている。
【0035】
GPI−PLD核酸
「GPI−PLD核酸」には、GPI−PLD活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をもつ核酸分子が含まれる。ヒトおよびウシのGPI−PLD酵素の適当な全長配列は、例えば、Huangらによって、Tsangら(1992)によって、また、PCT/GB99/04399中で提供されている。これらの形のGPI−PLDは、ヒト第6染色体に位置しており、95.95および99.71位置で、D6S1660〜D6S1558の4センチモルガン領域(NCBI GeneMap’98)に含まれる。この遺伝子は、6p22.3に相当する細胞発生(cytogenic)領域に始まり、6p21. 3に伸長する。この領域はまた、IDDM1およびHLA遺伝子座(HLA遺伝子は、隣接するD6S1558〜D6S1616間に位置しているが)も含んでいる。マウスGPI−PLD遺伝子もまた、ヒトでは第6染色体上にみられるfim 1位置の近くの第13染色体に位置している。
【0036】
GPI−PLDコード配列は、上で述べた、発表された配列の1つ、または相補的な核酸配列であってもよく、あるいは、こうした配列の1つの突然変異体、変異体、誘導体、またはアレルであってもよい。この配列は、示された配列のうちの1つまたは複数のヌクレオチドの、付加、挿入、欠失、および置換のうちの1つまたは複数である変化によって示されたものと異なってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化は、タンパク質レベルでのアミノ酸変化、すなわち遺伝コードによって決定されるものではない変化をもたらしてもよい。
【0037】
コードされたポリペプチドは、発表されたGPI−PLDアミノ酸配列の1つと、1つまたは複数のアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含んでいてもよい。本発明では、さらに、知られているGPI−PLDアミノ酸配列突然変異体、変異体、またはアレルであるポリペプチドをコードする核酸の使用を想定している。こうしたポリペプチドは、以下に明らかにしている。こうしたポリペプチドをコードする核酸は、上に述べた通りのGPI−PLDタンパク質に対する発表されたコード配列と、約70%超の同一性、約80%超の同一性、約90%超の同一性、約95%超の同一性、約98%超の同一性、あるいは約99%超の同一性を示してもよい。
【0038】
本発明はまた、好ましくは少なくとも長さ12、15、30、45、60、120、または240ヌクレオチドのフラグメントである、GPI−PLD核酸配列のフラグメントの使用も含む。
【0039】
一般に、本発明による使用のための核酸は、単離および/または精製された形の、あるいは、例えば、発現のためのおそらく1つまたは複数の制御配列以外は、ヒトゲノム中のその遺伝子に隣接する核酸がないか、または実質上ないものなど、天然では結合している物質がないか、または実質上ない単離物として提供される。核酸は、完全にまたは部分的に合成でもよく、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAを含んでもよい。本発明による核酸がRNAを含む場合、示された配列に対する言及は、Tの代わりにUを含むRNA等価物に対する言及と解釈されるべきである。
【0040】
GPI−PLD遺伝子および/またはその調節エレメントのすべてまたは一部をコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参考文献、ならびに当技術分野で知られた技術を用いて、当分野の技術者によって容易に調製することができる。例えば、Sambrookら、1989年、およびAusubelら、1992年を参照のこと。これらの技術には、(i)例えばゲノム源(genomic source)などからこうした核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用、(ii)化学合成、あるいは(iii)E.coli中での増幅が含まれる。改変されたGPI−PLDタンパク質の発現を提供するために、例えば部位特異的変異変異(site directed mutagenesis)を用いて、あるいはこの核酸を発現するために使用した宿主細胞中のコドン選択(codon preference)を考慮して、GPI−PLD配列に対する改変を行うことができる。
【0041】
GPI−PLD核酸配列の発現を得ることを目的として、その発現を制御するために、GPI−PLD核酸に作動可能に連結した制御配列を有するベクター中に、その核酸配列を組み込むことができる。発現システムの使用により、技術的工夫が進歩してきた。ベクターは、例えばプロモーターやエンハンサーなどの、挿入された核酸の発現させるための他の配列、GPI−PLDタンパク質が融合体として生成されるような核酸配列、および/または宿主細胞中で生成されたポリペプチドが、この細胞から分泌されるような、分泌シグナルをコードする核酸を含んでいてもよい。その後、ベクターを、このベクターが機能的であるような宿主細胞中で形質転換させし、宿主細胞をGPI−PLDタンパク質が生成されるように培養し、宿主細胞または周囲の培地からGPI−PLDタンパク質を回収することによって、GPI−PLDタンパク質を得ることができる。当技術分野のこの目的のためには、E.coli株、酵母、COSまたはCHO細胞などの真核細胞を含めて、原核細胞および真核細胞が使用できる。宿主細胞を選択することにより、これらの細胞中に発現するGPI−PLDタンパク質の性質を制御する、例えば、宿主細胞中でポリペプチドが蓄積する場所を制御する、あるいはその糖鎖形成およびリン酸化などの性質に影響を与えることができる。
【0042】
核酸の増幅のためのPCR技術は、米国特許第4,683,195号に記載されている。一般に、こうした技術では、フォワード(forward)およびリバース(reverse)オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅のための標的であるポリヌクレオチド配列と同一であるまたは類似であるように設計するために、標的配列の両端の配列情報が分かっている必要がある。PCRは、鋳型核酸の変性(二重鎖の場合)、標的へのプライマーのアニーリング、および重合の工程を含む。増幅反応においてプローブとして、または鋳型として使用される核酸は、ゲノムDNA、cDNA、またはRNAであり得る。PCRを使用して、ゲノムDNAからの特異的配列、mRNAから転写された特異的RNA配列およびcDNA、バクテリオファージ、またはプラスミド配列を増幅することができる。発表されたGPI−PLDタンパク質核酸配列により、当分野の技術者であれば、容易にPCRプライマーを設計できるであろう。PCR技術の一般使用のための参考文献には、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.、51: 263、1987、Ehrlich(編)、PCR Technology、Stockton Press、NY、1989、Ehrlichら、Science、252: 1643−1650、1991、「PCR protocols ; A Guide to Methods and Applications」、Eds. Innisら、Academic Press、New York、1990がある。
【0043】
本発明による使用のための核酸は、図に示した核酸配列の1種または複数のフラグメント、特に、コドン使用または統計分析に基づいたとき比較的珍しい配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計された1種または複数のオリゴヌクレオチドプローブあるいはプライマーを用いて得ることができる。上の図に示した核酸配列のフラグメントとハイブリダイズするように設計されたプライマーは、標的核酸をクローニングするクローニングベクター中の配列にハイブリダイズするように設計された1種または複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用してもよく、ライブラリ中のcDNAが、オリゴヌクレオチドリンカーに結合し、図に示したGPI−PLD核酸配列とハイブリダイズするプライマーおよびオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするプライマーを用いて、PCRが実施される、いわゆる「RACE」(cDNA末端の急速増幅)において使用してもよい。
【0044】
こうしたプローブは、試験対象となる個体から得られたサンプルからの標的配列とハイブリダイズするので、こうしたオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびに全長配列(および突然変異体、アレル、変異体、および誘導体)もまた、核酸を含む試験サンプルを、GPI−PLDタンパク質のアレル、突然変異体、および変異体の存在についてスクリーニングするのに有用である。ハイブリダイゼーションの条件を制御して、非特異的な結合を最小限にすることができるが、好ましくはストリンジェントないし中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。当分野の技術者であれば、こうしたプローブを容易に設計し、これを標識し、Sambrookら(1989年)およびAusubelら(1992年)などのテキストを参考として、ハイブリダイゼーション反応のための適当な条件を工夫することができるであろう。
【0045】
「ストリンジェントな条件」の例は、次のようなものである:(1)洗浄には低イオン強度、高温を使用する、例えば0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを50℃で使用する、(2)ハイブリダイゼーション中、ホルムアミドなどの変性剤、例えば42℃で、0.1%BSA+50%(v/v)ホルムアミド/0.1%Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)を、750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムとともに使用する、あるいは(3)50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50mg/ml)、0.1% SDS、および10%デキストラン硫酸を、42℃で使用し、0.2×SSC、55℃の50%ホルムアミド中の洗浄液を42℃で使用し、続いて、55℃の、EDTA を含有する0.1×SSCからなる高度にストリンジェントな洗浄液を使用する。これらのハイブリダイゼーション条件は、GPI−PLD核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を定める状況で使用してもよい。
【0046】
GPI−PLD核酸の使用
GPI−PLD核酸配列は、GPI−PLDを発現する能力をもつ細胞系の調製において使用することができ、かつ、発現ベクター中に含めるかそうでなければ、例えば、遺伝子治療技術における使用するために処方することができる。
【0047】
したがって、本発明は、GPI−PLDをコードする核酸を用いて形質転換され、GPI−PLDを発現および分泌する能力がある、患者に移植するための細胞株を提供する。一実施形態では、細胞株によって生成されたGPI−PLDが、宿主の免疫系による拒絶が妨げられながら患者に分泌されるように、これらの細胞株を例えば生体適合性ポリマー中に封入することができる。細胞を生体適合性ポリマー中に封入するための方法は、WO93/16687およびWO96/31199に記載されている。
【0048】
他の代替法として、GPI−PLDタンパク質をコードする核酸を、遺伝子療法において使用することによって、野生型GPI−PLDタンパク質によってもたらされる作用を提供し、また標的細胞における糖尿病の発生を抑制して、活性なポリペプチドを合成することができない、あるいは活性なポリペプチドを正常レベルで合成することができない患者を治療することができる。
【0049】
ウイルスベクターなどのベクターは、遺伝子を様々な異なる標的細胞に導入するために、従来の技術で使用されてきた。通常、これらのベクターは、所望のポリペプチド発現からの有用な治療または予防効果を提供するために、十分な割合の細胞に形質移入が起こるように、標的細胞に曝される。形質移入された核酸は、標的となる腫瘍細胞のそれぞれのゲノムに永続的に組み込むことができ、長期持続的効果を提供する、あるいは、この治療を周期的に繰り返してもよい。
【0050】
様々なベクター、ウイルスベクターとプラスミドベクターの両方が、当技術分野で知られており、米国特許第5,252,479号およびWO93/07282を参照されたい。具体的には、遺伝子導入ベクターとして、SV40などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、HSVおよびEBVを含めたヘルペスウイルス、ならびにレトロウイルスを含めて、多くのウイルスが使用されている。従来の技術の多くの遺伝子治療プロトコルは、無力化したマウスレトロウイルスを使用している。
【0051】
ウイルスベクターの使用に代わるものとして、核酸を細胞に導入する、知られている他の方法には、エレクロトポレーション法、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクションなどの機械技術、リポソームによって仲介される導入、およびDNAの直接取り込み、および受容体が仲介するDNA導入がある。
【0052】
上で言及した通り、GPI−PLDタンパク質をコードする核酸、またはその活性な部分を用いた遺伝子治療の目的は、野生型GPI−PLDタンパク質のレベルが0であるまたは少ないレベルでのみ存在する細胞において、この核酸の発現産物の量を増加させることである。遺伝子治療のための標的細胞には、インシュリンを分泌するβ細胞や、ニューロンから誘導されたあらゆる細胞がある。細胞工学を使用して、その後ヒトに移植することができる形質移入された細胞株中のGPI−PLDタンパク質の過剰発現または抑制をもたらすことができる。組織特異的な方式でGPI−PLDタンパク質を発現させるプロモーターを用いて、遺伝子治療を使用することができる(すなわちGPI−PLD cDNAに連結しているインシュリン・プロモーターは、b細胞中、および一時的に脳内で、GPI−PLDタンパク質を過剰発現することとなる)。GPI−PLDタンパク質の欠陥機能が、神経疾患に関与する場合、GPI−PLDタンパク質は、移植用の形質転換された細胞株中で過剰発現させることができる。
【0053】
GPI−PLD核酸を選択的に標的組織に向ける遺伝子導入技術が好ましい。この例には、この核酸が、標的細胞の表面上に存在する受容体に特異的であるタンパク質リガンドに、ポリリジンを介して連結するものである、受容体が仲介する遺伝子導入が含まれる。
【0054】
薬剤組成物
上で言及した通り、GPI−PLDタンパク質および核酸は、当技術分野でよく知られた技術を用いて、薬剤組成物として配合することができる。
【0055】
経口投与用の薬剤組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体の形状中に入っていてもよい。錠剤は、ゼラチンなどの固形状担体、または補助薬または不活性な希釈剤を含んでもよい。液体の薬剤組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油、あるいは合成油などの液状担体を含む。生理的食塩水、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。こうした組成物および調製物は、一般に、少なくとも0.1重量%の化合物を含有する。
【0056】
非経口投与には、次の経路による投与が含まれる。すなわち、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内、ならびに(経皮、眼、直腸内、経鼻、吸入、およびエアロゾルを含めて)局所、ならびに直腸全身的経路である。静脈内、皮膚、または皮下注射、あるいは苦痛部位での注射については、有効成分は、発熱性物質なしの、pH、等張性、および安定性が適切である、非経口的に許容される水溶液の形状の中に入ることとなる。当分野の技術者であれば、例えば化合物またはその誘導体の、例えば生理的食塩水、グリセロールを用いて調製した分散液、液状ポリエチレングリコール、またはオイルの溶液を用いて、適当な溶液を適切に調製することができるであろう。
【0057】
他の有効成分と任意選択で組み合わせた化合物の1種または複数の他に、組成物は、当分野の技術者によく知られている薬剤として許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、等張化剤、保存剤または酸化防止剤、あるいは他の材料の1種または複数を含むことができる。こうした材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるものであってはならない。担体または他の材料のストリンジェントな性質は、例えば経口的にまたは非経口的になど、投与経路に応じて変わってもよい。
【0058】
液状の薬剤組成物は、通常、pHが約3.0と9.0の間、より好ましくは約4.5と8.5の間、よりいっそう好ましくは約5.0と8.0の間であるように配合される。組成物のpHは、通常、約1mM〜50mMの範囲で使用される酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、Tris、またはヒスチジンなどの緩衝液を使用することによって保つことができる。組成物のpHは、生理的に許容される酸または塩基を用いて別の方法で調整することもできる。
【0059】
一般に、薬剤組成物中には、微生物の成長を遅らせる、組成物の貯蔵寿命を延長させる、また、複数回使用の包装を可能にするために保存剤が含められる。保存剤の例には、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸およびそのエステル、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、ならびに塩化ベンゼトニウムがある。保存剤は通常、約0.1〜1.0(%)(w/v)の範囲で使用される。
【0060】
薬剤組成物は、個体に対する利益を示すのに十分である「予防有効量」または「治療有効量」(場合により、予防を治療とみなすが)で、個体に投与されることが好ましい。通常、これは、個体に対する利益をもたらす、治療的に有用な活性をもたらすこととなる。投与される化合物の実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される状態の種類および重さに依存することとなる。治療の処方箋、例えば用量の決定などは、一般開業医および他の医師に責任があり、通常、治療される障害、それぞれの患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に分かる他の要因を考慮する。上で言及した技術およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、16th edition、Osol、A.(編)、1980に出ている。例として、組成物は、患者に、体重1kgあたり活性な化合物0.01mgと100mgの間の用量で投与されることが好ましく、体重1kgあたり0.5mgと10mgの間であることがより好ましい。
【0061】
組成物は、さらに1種または複数の他の薬剤として活性な薬剤、本発明のさらなる化合物、イノシトールホスホグリカン、インシュリンなどの成長因子、NGFまたは下に列挙する他の成長因子、あるいは下に述べる状態の治療のために使用する薬物など、他の薬物を含んでもよい。
【0062】
医療使用
本発明のGPI−PLDポリペプチドおよび核酸は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態、あるいは自己免疫状態、特に、GPI−PLDまたはApoA1/GPI−PLD複合体に対する自己抗体が存在する特徴がある状態を(予防的または治療的に)治療するための医薬品の調製において使用することができる。こうした状態の例には、冠状動脈疾患(CAD)などの心血管障害およびその合併症、全身性エリテマトーデス(SLE)の治療、特にアテローム硬化病変、シェーグレン症候群、および1型または2型糖尿病に関連する脂質異常がある。
【0063】
異常脂肪血症は、冠状動脈疾患の古典的(classic)危険因子であると認識されている。早発性のアテローム性動脈硬化症は、全身性エリテマトーデス(SLE)、すなわち広範囲の全身性病態がみられる原因が知られていない自己免疫疾患を患う患者における、重要な罹患の原因である。SLEを患う患者は、アポリポタンパク質A1に対する自己抗体をもつことが報告されている(Merrillら、Arthitis and Rheum.、38: 1655−1659、1995)。
【0064】
特定の理論に拘泥するものではないが、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の患者が、ApoA1によるGPI−PLD送達における欠陥をもつと仮定する。このことは、ApoA1の先天的な欠損があり、糖尿病合併症の徴候を示す患者について整合性がある。
【0065】
ある種の態様では、GPI−PLDを、それがヒトの血清および血液中で結合するアポリポタンパク質A1と組み合わせて投与してもよい。
【0066】
さらなる態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の診断および/または治療において有用な材料を含む製造品を提供する。この製造品は、容器およびラベルを含む。適当な容器には、例えばガラスまたはプラスチックなどの材料から形成されるビン、バイアル、注射器、および試験管がある。容器は、アテローム性動脈硬化症を診断するか、または治療に有効な組成物を入れ、例えば、組成物に接触するために針によって穴を開けることができる栓などの滅菌した接触口を備えていてもよい。この商品をアテローム性動脈硬化症の予防または治療のために使用する場合、組成物はGPI−PLDまたは変異体、活性な部分またはその断片を含んでいてもよい。この商品は、任意選択で、GPI−PLDとの混合物で、あるいは1つまたは複数のさらなる容器に入ったキットの一部として、アテローム性動脈硬化症の治療のための、あるいはGPI−PLDの薬理学的特性を向上するための、1種または複数のさらなる有効成分を含んでいてもよい。この商品をアテローム性動脈硬化症の診断のために使用する場合、容器を、本明細書で述べるアッセイを行うのに有用な1種または複数の試薬を入れるために使用してもよい。容器面の、あるいは添付したラベルに、アテローム性動脈硬化症の診断または治療のためのこの組成物の使用を記載し、使用者に指示するための詳細な指示書を提供してもよい。製造用商品は、薬剤として許容される緩衝液、リンガー溶液および/またはブドウ糖溶液を入れた第2の容器をさらに含んでもよい。
【0067】
診断アッセイ
個体からの生体サンプル中のGPI−PLD活性、あるいはこの酵素の量または濃度を決定するための方法は、当技術分野でよく知られており、個体がアテローム性動脈硬化症または本明細書で述べる他の状態のうちの1つを患っている、あるいはアテローム性動脈硬化症の危険があるかどうか決定するために、本発明のコンテキストで使用することができる。こうした分析の目的を、医師がアテローム性動脈硬化症の重さまたは経過見込みを決定するのを補助するために、かつ/またはその治療を最も効果的にするために、診断または予後のために使用してもよい。
【0068】
胎盤中に存在する正常でないまたは異常調節されたGPI−PLD活性が、アテローム性動脈硬化症の原因の1つであると考えられているので、好ましい診断方法は、GPI−PLD活性の決定に頼るものである。一実施形態では、この方法は、例えば標識した基質に対するGPI−PLDの作用を測定することによって、患者から得られた生体サンプル中のGPI−PLD活性を決定することを含む。あるいは、または追加的に、サンプル中のGPI−PLDの濃度または量を決定してもよい。通常、この方法は、血液、血清、組織サンプル、または尿などの生体サンプルを使用する。サンプルに応じて、例えばサンプルから細胞屑または望ましくない混在物を除去するなど、前処理工程を行うことが好都合である可能性がある。
【0069】
ある種の実施形態では、GPI−PLD活性を決定するためのアッセイ方法は、個体において、GPI−PLDに特異的に結合する能力がある結合部位をもつ結合剤を使用し、また、当技術分野でよく知られており、個体がアテローム性動脈硬化症または本明細書で述べる他の状態の1つを患う、あるいは発生の危険があるかどうか決定するために、本発明において使用することができる。こうした分析の目的を、医師がアテローム性動脈硬化症の重さまたは経過見込みを決定するのを補助するために、かつ/またはその治療を最も効果的にするために、診断または予後のために使用してもよい。
【0070】
胎盤中に存在する異常なまたは調節障害のあるGPI−PLD活性が、アテローム性動脈硬化症の原因の1つであると考えられているので、好ましい診断方法は、GPI−PLD活性の決定に頼るものである。一実施形態では、この方法は、例えば標識した基質に対するGPI−PLDの作用を測定することによって、患者から得られた生体サンプル中のGPI−PLD活性を決定することを含む。あるいは、または追加的に、サンプル中のGPI−PLDの濃度または量を決定してもよい。通常、この方法は、血液、血清、組織サンプル、または尿などの生体サンプルを使用する。サンプルに応じて、例えばサンプルから細胞残渣または望ましくない混在物を除去するなど、前処理工程を行うことが好都合である可能性がある。
【0071】
ある種の実施形態では、GPI−PLD活性を決定するためのアッセイ方法は、他の分子、特にサンプル中に存在する可能性がある他の分子よりも優れて、GPI−PLDに特異的に結合する能力がある結合部位をもつ結合剤を使用する。結合剤の例には、GPI−PLDに特異的に結合する能力がある抗体、受容体、および他の分子がある。好都合には、結合剤は、アッセイ中の扱いを容易にするために、例えば定められた位置で、固体支持体に固定させる。これは、結合剤を固体支持体に化学的に結合させるために、例えばビオチン/アビジンまたはビオチン/ストレプトアビジンを使用するなど、物理吸着や化学吸着などの当技術分野でよく知られた技術を用いて実現できる。
【0072】
サンプルは、一般に、サンプル中に存在するGPI−PLDが、結合剤と結合できるように適切な条件下で結合剤と接触させる。GPI−PLD活性は、GPI−PLDによって切断するホスホジエステル結合をもち、ホスファチジン酸とGPIアンカーを遊離するグリコシルホスファチジルイノシトールなどの適当な基質を使用し、例えば、アッセイ系において、基質あるいは(1種または複数の)反応生成物の量を追跡することによってこの酵素反応をモニターすることによって決定できる。このプロセスは、基質を標識し、基質の標識の減少、または反応生成物中の標識の増加を検出することによって容易になる。
【0073】
サンプル中のGPI−PLDの(活性ではなく)量の決定の場合、顕色剤の1種または複数を用いて、結合剤の結合部位の占有率を決定することができる。結合剤の占有結合部位に対して、顕色剤が分析物と競合する(例えば、この分析物の標識類似体を使用する)拮抗的な方法、あるいは、標識された顕色剤が、結合剤と結合しているか、または占有結合部位に結合している分析物と結合する(例えば適切な結合特異性をもつ抗体を使用する)非拮抗的な方法で、顕色剤を使用することができる。どちらの方法も、分析物によって占有された結合部位の数を示し、またそれにより、例えば濃度が知られている分析物を含有するサンプルを用いて得られた基準値と比較することによって、サンプル中の分析物の濃度を提供する。
【0074】
通常、基質または顕色剤は、検出可能で、好ましくは測定可能なシグナルを直接的または間接的に発生する標識分子またはレポーター分子で標識される。レポーター分子の結合は、直接的または間接的に、例えばペプチド結合を介して共有結合的でもよいし、非共有結合的でもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組み換え体発現の結果であるものであってもよい。抗体を検出可能部分に別々に結合させるためには、Hunterら、Nature 144: 945、1962、Davidら、Biochemistry 13: 1014、1974、Painら、J. Immunol. Meth. 40: 219、1981、およびNygren、J Histochem. and Cytochem. 30: 407、1982によって記載されている方法を含めて、当技術分野で知られたどんな方法を使用してもよい。
【0075】
1つの好ましい方式は、スペクトルとして分離された吸収または発光特性を有する個々の蛍光色素、リン光体、あるいはレーザー色素と、基質または顕色剤の各の種を共有結合することである。適当な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン、フィイコエリトリン、およびTexas Redがある。適当な発色性色素には、ジアミノベンジジンがある。他の検出可能な標識には、3H、14C、32P、35S、126I、または99mTcなどの放射性同位体標識、ならびに、検出可能な反応生成物が触媒反応をもたらし、シグナルを増幅させることが可能である、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素標識がある。
【0076】
他のレポーターには、着色した、磁性の、または常磁性のラテックスビーズ、ならびに検出可能なシグナルを直接的または間接的に、視覚的に観察されるまたは電気的に検出されるまたは他の方法で記録できるようにする、生物学的または化学的に活性な薬剤などの、高分子のコロイド粒子または微粒子状の材料がある。これらの分子は、呈色または変色する、あるいは、例えば、電気的性質を変化させる反応を触媒する酵素であってもよい。これらは、エネルギー状態の間の電子遷移が、特有のスペクトル吸収または発光をもたらすように、分子励起できるものであってもよい。これらには、バイオセンサーと組み合わせて使用される化学物質も含まれる。
【0077】
上で言及した通り、基質または顕色剤は、当技術分野でよく知られた技術を用いて検出できるように、(例えば、放射能、蛍光、または酵素標識で)標識される。したがって、放射能標識は、シンチレーションカウンタまたは他の放射線計数装置を用いて、蛍光標識は、レーザーおよび共焦点顕微鏡を用いて、酵素標識は、通常色の変化を示す、基質上の酵素標識の作用によって検出できる。
【0078】
【実施例】
SLE患者において、Apo−A1に対して自己抗体が存在することが確立されており、SLEは、早発性の冠動脈心疾患についての最良のモデルとみなされている。冠動脈心疾患への連関は、従来の技術では確立されていないが、ApoA1複合体に対する抗体は、GPI−PLDの組織への送達を妨げ、Apo−A1欠乏患者と同様の臨床効果をもつ。これらの連関は、GPI−PLDの欠乏が、インシュリン抵抗性を仲介する他に、その活性が低下すると冠動脈心疾患が引き起こされる、IPGが仲介する成長因子の欠乏も仲介することを示唆する。したがって、糖尿病合併症、SLE、およびApo−A1の先天性異常はすべて、標的組織におけるGPI−PLDの減少を伴うので、これらの間には連関が存在する。
【0079】
この仮説を試験するために、多くの自己免疫異常におけるGPI−PLD血漿濃度の比較を行った。SLEおよびシェーグレン症候群を患う患者のGPI−PLDレベルを測定し、コントロール群、すなわち正常な患者および慢性関節リウマチを患う患者と比較した。図2に示すように、SLEとシェーグレン症候群の両方を患う患者のGPI−PLDレベルは、統計的に上昇し、これらの条件では、自己抗体はGPI−PLDの組織への送達を抑制または予防し、血流中にGPI−PLDを蓄積させるという本明細書で開示したことと整合性があった。したがって、こうした患者は、GPI−PLDの血漿濃度が高く、組織中では対応する欠乏を示すために、逆説的な欠乏を生じる。
【0080】
ここに挙げた参考文献は、その全部が参照としてここに取りこまれるものとする。
【0081】
【参考文献】
【図面の簡単な説明】
【図1A】PCT/GB99/04399に開示されたヒトの肝臓のGPI−PLDの、推定されたアミノ酸配列、ならびに米国特許第5,418,147号(Huangら)に開示されたウシの肝臓およびヒトの肝臓のGPI−PLD配列を並べたものを示す。
【図1B】図1Aの続きである。
【図2】自己免疫異常を患う患者からのサンプル中にみられるGPI−PLDの血漿濃度を、コントロール群(正常な患者および関節リウマチを患う患者)と比較して示す。
Claims (12)
- アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品を調製するための、GPI−PLDの使用。
- アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品を調製するための、GPI−PLDをコードする核酸分子の使用。
- アテローム性動脈硬化症がGPI−PLDの生成不全、GPI−PLDの送達不全によって、あるいはGPI−PLDまたはApo−A1に対する自己抗体の存在によって引き起こされる、請求項1または2に記載の使用。
- アテローム性動脈硬化症が自己免疫状態の結果である、請求項1または2に記載の使用。
- アテローム性動脈硬化症がGPI−PLD活性の喪失に起因する、請求項1または2に記載の使用。
- アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用の医薬品の調製における、GPI−PLDを発現および分泌する能力がある宿主細胞の使用。
- 前記状態が、1型糖尿病、ApoA1欠乏を特徴とする状態、冠動脈疾患(CAD)などの心血管障害、全身性エリテマトーデス(SLE)、またはシェーグレン症候群である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
- アテローム性動脈硬化症の特徴がある状態の治療用のGPI−PLDを含む組成物を含むキット。
- アテローム性動脈硬化症の特徴があるか、あるいは発症する恐れのある患者を診断する方法であって、この患者から得たサンプル中のGPI−PLDの量および/またはGPI−PLD活性を決定することを含む方法。
- (a)GPI−PLDに特異的な結合部位をもつ結合剤を固定化した固体支持体に、患者から得たサンプルを接触させる工程、(b)結合剤に結合しているGPI−PLDの量またはGPI−PLDの活性を決定する工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 方法が、工程(b)で得られた値を、対照被験者から得られた測定値と相関させて、患者が前記状態を有している、あるいはそれを発症する危険があるか決定する工程(c)をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- その状態が1型糖尿病、ApoA1欠乏を特徴とする状態、冠動脈疾患(CAD)などの心血管障害、全身性エリテマトーデス(SLE)、またはシェーグレン症候群である、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
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